CN1277632A - 天然人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

一种重构人抗HM1.24抗体,其包含:(A)各包含(1)人轻链的恒定区,及(2)人轻链的FR,和小鼠抗HM1.24单克隆抗体轻链的CDR的轻链;和(B)各包含(1)人重链恒定区,及(2)人重链FR,和小鼠抗HM1.24单克隆抗体重链CDR的重链。因为重构人抗体的大部分来自人抗体且CDR抗原性较低,所以本发明的重构人抗体抗原性较低,因此在医学和治疗应用中很有前途。

Description

天然人源化抗体
技术领域
本发明涉及制备天然人源化抗体的方法和利用该制备方法获得的天然人源化抗体。本发明还涉及编码天然人源化抗体的DNA、含有所说DNA的表达载体、含所说DNA的宿主以及从引入了该DNA的细胞中制备天然人源化抗体的方法。
背景技术
用广泛使用的杂交瘤技术可相对容易地分离小鼠单克隆抗体(Kohler，G和Milstein，C.自然(1975)256，495-497)。另一方面，尽管期望如此，但用于人杂交瘤的类似技术仍需普及。此外，在临床应用中存在对抗人抗原抗体的需求，因此小鼠单克隆抗体的产生对抗体药品的开发是必不可少的。
实际上，已分离了抗肿瘤细胞和病毒的许多单克隆抗体，并在临床应用中进行了研究。然而，已发现对人来说是外源物质的小鼠抗体由于强抗原性而会诱发HAMA(人抗小鼠抗体)，且因为诸如诱导ADCC活性较弱之类的问题，它极不适于临床应用(Schroff，R.W.，癌症研究(1985)45，879-885；Shawler，D.L.，等人，免疫学杂志(1985)135，1530-1535)。
为了解决这一问题，产生了嵌合型抗体(Neuberger，M.S.等人，自然(1984)312，604-608；Boulianne，G.L.等人，自然(1984)312，643-646)。通过将小鼠抗体可变区与人抗体的恒定区连接，可以制备嵌合型抗体，即在嵌合型抗体中，与极强抗原性有关的小鼠抗体恒定区已被人抗体的相应部分所替代。预计此嵌合型抗体能与人Fc受体生理结合并诱导Fc介导的功能。事实上，在使用嵌合型抗体的临床研究中已报道了其抗原性的显著降低(LoBuglio，A.F.等人，美国国家科学院院报(1989)86，4220-4224)。然而，也报道了一些引起麻烦的情况，其中产生了抗小鼠可变区的HAMA(LoBuglio，A.F.等人，美国国家科学院院报(1989)86，4220-4224)。
因此，尽管更复杂，还是发展了用于制备与人抗体更接近的人源化抗体的方法。这是一项在人抗体上重建小鼠抗体之抗原结合位点的技术(Jones，P.T.等人，自然(1986)321，5225-525；Verhoeyen，M.等人，科学(1988)239，1534-1536；Riechmann，L.等人，自然(1988)332，323-327))。因而，抗体的重链和轻链可变区均包括4个构架区(FRS)及夹在它们之间的3个互补性决定区(CDR)。
已知CDR主要负责抗原结合位点的形成，且FR上一些氨基酸残基直接或间接地参与其中。因为抗体的基本结构相互类似，人们设想有可能将一抗体的抗原结合位点移植到另一抗体上。事实上，由G.Winter带领的研究小组已将小鼠抗根瘤菌抗体的CDR成功地移植至人抗体上(CDR-移植)，从而获得了具根瘤菌结合活性的人源化抗体(Jones，P.T.等人，自然(1986)321，522-525)。
然而，在某些情况中，只通过CDR-移植的人源化没有提供与起始小鼠抗体具相似抗原结合活性的人源化抗体。因此，如上所述，已尝试取代一些FR氨基酸残基。将要取代的FR氨基酸残基涉及组成抗体分子基本结构(规范结构；Chothia，C.等人，自然(1989)342，877-883；Chothia，C.和Lesk，A.M.分子生物学杂志(1987)196，901-917)或CDR或直接与抗原分子相互作用的氨基酸残基结构的维持。
事实上，大部分人源化抗体在FR上已有氨基酸取代，其中形成了非天然人工FR序列。有些时候，进行了太多的氨基酸取代使得为小鼠抗体抗原性最小化而做CDR移植的最初意义变得不明确了(Queen，C.等人，美国国家科学院院报(1989)86，10029-10033；Co，M.S.等人，美国国家科学院院报(1991)88，2869-2873)。
该问题的一个解决办法是设计选择人FR的方法。因此，将要取代的FR氨基酸残基数目取决于选用来进行CDR移植的人抗体FR与起始小鼠抗体FR之间的同源性。因此，通常选择与小鼠FR具高同源性的人FR以使取代的程度最小。然而，在许多情况下，甚至这样获得的人源化抗体之FR也具有非天然氨基酸序列，这可能出现抗原性的问题。因此，需要有一种能解决上述问题、诱发抗原性的可能性较低并有较高安全性的人源化抗体构建技术。
发明内容
本发明是构建人源化抗体常规方法的一种改进，并提供了构建完全保留最初小鼠抗体抗原结合活性且含天然人FR的人源化抗体的方法，或者说构建在FR上无氨基酸取代的人源化抗体的方法。
因而，本发明提供了制备天然人源化抗体的方法，它包括对初级设计抗体之FR进行同源性检索、选择保留有在初级设计抗体的FR中所含人工氨基酸残基并与此具同源性的天然FR。如本文所用，初级设计抗体是通过常规CDR移植方法制备的人源化抗体(也称重构人抗体，reshaped human antibody)。
本发明还提供了制备天然人源化抗体的方法，包括进行初级设计抗体FR的同源性检索、选择保留有初级设计抗体FR中所含人工氨基酸残基并与此具同源性的天然人FR、以及在初级设计抗体FR和所选天然人FR之间交换一个或多个不同的氨基酸残基。
在以上制备方法中，优选初级设计抗体包含来源于第一种动物物种的CDR和来源于第二种动物物种的FR。更优选的是，在初级设计抗体中第一种动物物种是非人哺乳动物而第二种动物物种是人。第一种动物物种的例子，即哺乳动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔子和猴。
本发明也提供了制备天然人源化抗体的方法，它包括进行初级设计抗体FR的同源性检索、选择保留初级设计抗体FR中所含来源于非人抗体FR的人工氨基酸残基并与此具高度同源性的天然人FR、以及在初级设计抗体FR和所选天然人FR之间交换一个或多个不同的氨基酸残基。
本发明还提供了用以上制备方法获得的天然人源化抗体。
本发明还提供了含来自第一种动物物种的CDR和来自第二种动物物种的FR的天然人源化抗体，其特征在于所说的FR含有的氨基酸序列与用于CDR移植的FR有一个或多个氨基酸残基不同，并被来源于第二种动物物种的在相同位点具有与所说不同氨基酸残基相同的氨基酸残基的FR取代。优选第一种动物物种是非人哺乳动物而第二种动物物种是人。第一种动物物种的例子，即哺乳动物，包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔子和猴。
本发明还提供了编码以上天然人源化抗体的DNA。
本发明还提供含以上DNA的表达载体。
本发明还提供含以上DNA的宿主。
本发明还提供制备天然人源化抗体的方法，包括培养已引入含上述DNA之表达载体的细胞并从所说细胞的培养物中收集所需天然人源化抗体。
本发明还提供含天然人源化抗体的药物组合物。
附图简介
图1显示，在用人骨髓瘤细胞系KPMM2进行的FCM分析中，与对照抗体相比较，嵌合型抗HM1.24抗体的荧光强度与小鼠抗HM1.24抗体的强度相似地转变。
图2显示嵌合型抗HM1.24抗体与小鼠抗HM1.24抗体相似地以剂量依赖方式抑制生物素化小鼠抗HM1.24抗体与WISH细胞的结合。
图3显示嵌合型抗HM1.24抗体随着E/T比率增加而对RPMI8226细胞的细胞毒活性增加，而对照IgG1或小鼠抗HM1.24抗体对RPMI8226细胞不具细胞毒活性。
图4显示用PCR方法通过CDR移植构建重构人抗HM1.24抗体之轻链的方法。
图5显示构建重构人抗HM1.24抗体之重链的方法，其中通过PCR方式将寡核苷酸RVH1、RVH2、RVH3和RVH4进行装配。
图6显示构建人-小鼠杂合抗HM1.24抗体重链可变区的方法。
图7显示构建小鼠-人杂合抗HM1.24抗体重链可变区方法。
图8是显示重构人抗HM1.24抗体轻链变体a具有与嵌合型抗HM1.24抗体的该部分相似程度的抗原结合活性。在图中，-1和-2代表不同的份额。
图9是显示制备自轻链变体a和重链变体a、b、f或h组合的重构人抗HM1.24抗体及嵌合型抗HM1.24抗体的抗原结合活性的图解。
图10是显示制备自轻链变体b和重链变体a、b、f或h组合的重构人抗HM1.24抗体及嵌合型抗HM1.24抗体的抗原结合活性的图解。
图11是显示制备自轻链变体a和重链变体a、b、f或h组合的重构人抗HM1.24抗体及嵌合型抗HM1.24抗体的结合抑制活性的图解。
图12是显示制备自轻链变体b和重链变体a、b、f或h组合的重构人抗HM1.24抗体和嵌合型抗HM1.24抗体的结合抑制活性的图解。
图13是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体a、b、c或d及嵌合型抗HM1.24抗体的抗原结合活性的图解。
图14是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体a和e及嵌合型抗HM1.24抗体的抗原结合活性的图解。在图中，-1和-2代表不同的份额。
图15是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体a、c、p和r及嵌合型抗HM1.24抗体的结合抑制活性的图解。
图16是显示人-小鼠杂合抗HM1.24抗体、小鼠-人杂合抗HM1.24抗体和嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图17是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体a、b、c和f及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图18是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体a和g以及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图19是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体a和g以及嵌合型抗HM1.24抗体之结合抑制活性的图解。
图20是显示重构人抗HM1.24抗体的重链变体h和i及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图21是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体f、h和j及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图22是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体h和i及嵌合型抗HM1.24抗体之结合抑制活性的图解。
图23是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体f、h和j及嵌合型抗HM1.24抗体之结合抑制活性的图解。
图24是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体h、k、l、m、n和o及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图25是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体a、h、p和q及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图26是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体h、k、l、m、n和o及嵌合型抗HM1.24抗体对WISH细胞的结合抑制活性的图解。
图27是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体a、h、p和q及嵌合型抗HM1.24抗体之结合抑制活性的图解。
图28是显示重构人抗HM1.24抗体重链变体a、c、p和r及嵌合型抗HM1.24抗体之抗原结合活性的图解。
图29是显示天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)具有与重构人抗HM1.24抗体(初级设计抗体)相似程度之抗原结合活性的图解。
图30是显示天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)具有与重构人抗HM1.24抗体(初级设计抗体)相似程度之结合抑制活性的图解。
图31是显示纯化的重构人抗HM1.24抗体具有与嵌合型人抗HM1.24抗体相似程度之抗原结合活性的图解。
图32是显示纯化的重构人抗HM1.24抗体具有与嵌合型人抗HM1.24抗体相似程度之结合抑制活性的图解。
图33显示随着E/T比率增高而天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)对KPMM2细胞的细胞毒活性增加。
实行本发明的实施方案1.天然FR序列
为了从含有限抗体可变区的基因中产生抗多种抗原的抗体，生物体具有在抗体可变区引入随机基因突变(称体细胞突变)的机制。理论上这将形成极其多变的FR氨基酸序列，但实际中，当用许多实际结构已被阐明的人抗体的结构分析进行测定时，更易于引入突变的氨基酸残基位置和氨基酸残基种类显出局限于一定的程度之内。
此处所用术语FR是指Kabat，E.A.等人在《有免疫学意义的蛋白质序列》(1991)一文中所定义的FR。这样，在重链中，FR1是氨基酸1-30，FR2是氨基酸36-49，FR3是氨基酸66-94，及FR4是氨基酸103-113。另一方面，在轻链中FR1是氨基酸1-23，FR2是氨基酸35-49，FR3是氨基酸57-88，FR4是氨基酸98-107。2.从人FR到天然人FR
在许多情况中，用常规CDR移植方法产生的人源化抗体(也称重构人抗体)具有自然界中不存在的FR氨基酸序列。然而，因为通过上面提到的体细胞突变已发现多种FR氨基酸序列，所以将通过人源化产生的具人工氨基酸残基之FR转换成天然人FR是可能的。
通过进一步加工由常规人源化技术所构建的人源化抗体，本发明意图创造含天然人FR而非人工FR的人源化抗体。当用人抗体FR和诸如Swiss Plot(蛋白质序列数据库)、GenBank(核酸序列数据库)、PRF(蛋白质序列数据库)、PIR(蛋白质序列数据库)和GenPept(从GenBank翻译的蛋白质序列)之类的已知数据库对经过氨基酸取代的人源化抗体进行同源性检索时，可找到具完全匹配的氨基酸序列的人FR或具同源性的人FR。
在前一种情况中，从用作CDR移植接受体的人FR方面来看进行了FR取代，其中据推测为人工FR的已形成FR存在于天然FR中，它可被看作是接受体，因此可得到未经FR取代的FR。在后一种情况中，通过着眼于与人工FR具高度同源性的人FR氨基酸序列，有可能在人工FR中进行氨基酸取代导致恢复成合适的天然人抗体由此与天然人FR完全匹配。此步骤体现了在CDR移植抗体上的人源化。
既然在此情况中进行了人抗体间氨基酸序列的同源性检索，就可能找到与CDR移植中所用人FR属于相同亚型的人FR，并找到具有极其高同源性的氨基酸序列。因此，为每一FR获得的天然人FR尽管来自不同抗体，但它不只满足亚型的共有序列。3.天然序列人源化抗体
本发明中获得的天然人源化抗体包含已认识到在自然界中存在的人抗体FR。尽管FR1至FR4有时来自不同的抗体，人抗体间的同源性检索使得能够选择如上所述只属于相同亚型的抗体。相同亚型中的每一种抗体的FR结构具有互相极相似的结构，且实际上已产生了基于亚型中共有序列的人源化抗体(Kettleborough，C.A.等，蛋白质工程(1991)4，773-783；Satoh，K.等人，分子免疫学(1994)31，371-381)。
如上所述，人们认为在抗体中，极其多样化的氨基酸序列是通过体细胞突变自然发生的。目前只有一些结构已被鉴定。如果在自然界中不能找到所获抗体的FR序列，则此FR是否存在于自然界中是不清楚的。当抗体被认为是药品时，则从本发明减小抗原性的目的这一观点出发，含天然人FR的CDR移植抗体的构建提供了具备优于常规人源化抗体之特性的这样的抗体。4.构建新型人源化抗体的方法
本发明解决了由人源化常规技术构建的人源化抗体相关的问题，即，它消除了由自然界中未发现之人工FR所产生的抗原性。在其他方面，它是通过实际上由自然界中存在的人FR组成的CDR移植构建人源化抗体的技术。人工FR的氨基酸序列指作为一个整体在自然界中找不到的FR的氨基酸序列。FR中所含人工氨基酸序列指FR中那些在自然界中找不到的氨基酸序列。
作为自然界中找不到的FR的氨基酸序列，可提及的有具有其中FR内人氨基酸残基回复到来自非人哺乳动物之抗体FR中存在的氨基酸残基的氨基酸序列的FR，此抗体是用常规抗体人源化技术构建人源化抗体中人源化的模板。或者说，在用常规抗体人源化技术构建的人源化抗体中，可能存在具有在来自人和非人哺乳动物之抗体中找不到的氨基酸序列的FR。
本发明之产生天然人源化抗体的方法描述如下文。
首先，用常规技术选择用于CDR移植中的人抗体FR。将FR进行氨基酸取代以构建具与小鼠抗体相等或更高生物学活性的人源化抗体。在常规方法中这被认为是人源化抗体的终产物，但在本发明中它仅仅是用于构建具天然序列之天然人源化抗体的中间物。在本发明中被称为初级设计抗体。
随后，对初级设计抗体的每一个FR进行同源性检索。具有完全匹配的FR表示FR已包含天然FR。另一方面，列举出一系列与初级设计抗体属于相同亚型并具同源性但与初级设计抗体非完全匹配的天然人FR。从表中可能选择出保持来源于诸如小鼠之类非人哺乳动物、在初级设计抗体构建中比较重要的氨基酸残基、并与初级设计抗体具同源性的最合适天然人FR。
可用已知数据库进行FR的同源性检索。这样的数据库例子包括Swiss Plot、GenBank、PRF、PIR和GenPept。用这些数据库进行同源性检索，其中通过同源检索列举的“与初级设计抗体FR有同源性的FR”指FR在氨基酸序列中同源性至少为80％，优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％或更高，更优选至少97％或更高，更优选至少98％或更高，更优选至少99％或更高。用Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.美国国家科学院院报(1983)80，726-730中所述算法可确定蛋白质的同源性。
对初级设计抗体构建比较重要的非人哺乳动物氨基酸残基指人工FR所含来源于非人FR的氨基酸残基。在负责抗体分子基本结构的氨基酸残基(典型结构)、涉及CDR结构维持的氨基酸残基、或与抗原分子直接相互作用的氨基酸残基中可找到许多这样的氨基酸残基，尽管它们可能随着抗体而变化，但包括例如重链71位氨基酸、重链94位氨基酸，等等。
如上所提级，如果初级设计抗体FR和天然FR之间不同的一个或多个氨基酸残基被取代以产生具有天然人FR之氨基酸残基的人源化抗体，这样得到的人源化抗体(天然人源化抗体；称二级设计抗体)均包含天然FR。在此情况中所有人FR优选属于相同亚型的人FR，更优选来自相同抗体的人FR。此外，不要求所有的人FR属于同一亚型，只要它们被重构到抗体中并提供一定的抗原结合活性即可，因此它们并不局限于属于相同亚型的人FR。按照本发明，多个氨基酸残基意思是氨基酸序列中2个或更多个氨基酸残基，优选2-10个氨基酸残基，更优选2-5个氨基酸残基，更优选2-4个氨基酸残基，更优选2-3个氨基酸残基。
人工FR和天然人FR之间同源性至少为80％，优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，更优选至少93％，更优选至少94％，更优选至少95％，更优选至少96％或更高，更优选至少97％或更高，更优选至少98％或更高，还更优选至少99％或更高。
然后，使二级设计抗体在适合的表达系统中表达，例如在动物细胞中表达，以评估抗原结合活性，等等。
此外，甚至没有初级设计抗体的实际构建也可实施本发明的制备方法。因此，初级设计抗体被常规地设计，没有它的评估也可设计二级设计抗体，并被直接评估。然而，实际上，有时重要的FR残基的鉴定包括实验，而二级设计抗体优选在常规初级设计抗体已被实验构建后构建。
尤其是，在本发明的一方面中，用小鼠抗HM1.24抗体(Goto，T.等人，血液(1994)84，1922-1930)作为模板进行了本发明的天然人源化抗体的生产。
对于如上所述设计的天然人源化抗体，可用已知方法获得编码它们的基因。例如，合成具有与编码所设计天然人源化抗体氨基酸序列之DNA相应的重叠末端的几个寡核苷酸。用这些寡核苷酸作为引物实施PCR方法。然后，用限定编码所设计天然人源化抗体氨基酸序列之DNA两端的引物进行PCR以获得编码所需天然人源化抗体的基因。
编码如上所述构建之天然人源化抗体的基因可以已知方式表达以获得天然人源化抗体。在哺乳动物细胞的情况中，用通常使用的有效启动子/增强子、将表达的抗体基因及polyA信号已与其3′下游有效连接的DNA或用含这些元件的载体可完成表达。启动子/增强子的例子包括人巨细胞病毒立即早期启动子/增强子。
此外，作为本发明中所用可用于抗体表达的启动子/增强子，可用诸如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒及猿猴病毒40(SV40)之类病毒的启动子/增强子及诸如人延伸因子1α(HEF1α)之类来自哺乳动物细胞的启动子/增强子。
例如，当使用SV40启动子/增强子时，可以通过Mulligan等人(自然(1979)277，108)的方法，或当用HEF1α启动子/增强子时，可以通过Mizushima等人(核酸研究(1990)18，5322)的方法容易地完成表达。
在大肠杆菌(E.coli)的情况下，通过将常用有效启动子、抗体分泌的信号序列及待表达抗体基因可操作性地连接可进行表达。例如，作为启动子，可提到的有lacz启动子和araB启动子。用lacz启动子时可用Ward等人(自然(1098)341，544-546；FASEB J.(1992)6，2422-2427)的方法，而用araB启动子时可用Better等人(科学(1988)240，1041-1043)的方法。
当在大肠杆菌周质中生产时，可用pelB信号序列作为抗体分泌的信号序列(Lei，S.P.等人，细菌学杂志(1987)169，4379)。分离产生于周质中的抗体后，在使用前正确重折迭抗体的结构(参阅，例如，国际专利申请公开WO 96/30394，和日本已审专利公开(Kokoku)号7(1995)-93879)。
作为复制起点，可使用那些来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等等的起点。此外，为了在宿主细胞系统中实现基因拷贝数的扩增，表达载体可包括如氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等可选择标记。
为了本发明中所用抗体的生产，可使用任何生产系统。抗体制备的生产系统包括体外或体内生产系统。在体外生产系统中，可提及的有应用真核细胞的生产系统和应用原核细胞的生产系统。
当利用真核细胞时，有应用动物细胞、植物细胞和真菌细胞的生产系统。已知的动物细胞包括(1)诸如CHO细胞(实验医学杂志(J.Exp.Med.)(1995)108，945)、COS细胞、骨髓瘤细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、HeLa细胞及非洲绿猴肾细胞株系细胞之类的哺乳动物细胞，(2)如非洲爪蟾卵母细胞(Valle等人，自然(1981)291，358-340)之类的两栖动物细胞，或(3)如sf9、sf21和Tn5之类的昆虫细胞。作为CHO细胞，可优选使用缺少DHFR基因的dhfr-CHO(美国国家科学院院报(1980)77，4216-4220)和CHO K-1(美国国家科学院院报(1968)60，1275)。
已知的植物细胞包括，例如，那些来自烟草进行愈伤组织培养的细胞。已知的真菌细胞包括如酵母属之类的酵母，例如酿酒酵母，或如曲霉属之类的丝状真菌，例如黑曲霉。
使用原核细胞时，有应用细菌细胞的生产系统。已知的细菌细胞包括大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌。
通过用编码本发明之天然人源化抗体的基因转化这些细胞并体外培养转化细胞，可获得天然人源化抗体。用已知方法进行培养。例如可使用DMEM、MEM、RPMI1640和IMDM作为培养液，并可联合使用诸如胎牛血清(FCS)之类的血清补充物，或可用无血清培养基。此外，通过将已引入抗体基因的细胞移植入动物等的腹腔内可在体内生产抗体。
在体内生产系统中，可提及的有应用动物和应用植物的生产系统。将抗体基因引入动物或植物，在这样的动物或植物内产生抗体然后收集。
使用动物时，有应用哺乳动物和昆虫的生产系统。
作为哺乳动物，山羊、猪、绵羊、小鼠和牛均可使用(Vicki Claser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。在使用哺乳动物时，也可使用转基因动物。
例如，将抗体基因插入编码固有地产生于乳汁中的蛋白质如山羊β酪蛋白的基因中以制备融合基因。将含已插入抗体基因之融合基因的DNA片段注射入山羊胚胎，将此胚胎引入雌性山羊内。从接受胚胎的山羊生产的转基因山羊或其后代生产的乳中可获得所期望的抗体。为了提高转基因山羊所产生之含所期望抗体的奶产量，可在适当时候对转基因山羊施用激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
使用昆虫时，可用蚕。使用蚕时，将已插入所期望之抗体基因的杆状病毒感染蚕，从蚕的体液中能得到所期望之抗体(Susumu，M.等人，自然(1985)315，592-594)。
使用植物时，可用例如烟草等。此外，使用烟草时，将所期望抗体基因插入植物表达载体中，例如pMON530，然后将载体引入根癌土壤杆菌之类的细菌中。随用用此细菌感染烟草以从烟草叶子中获得所期望抗体(Julian，K.-C.Ma等人，欧洲免疫学杂志(1994)24，131-138)。
如上所述，此处所用“宿主”包括产生所需天然人源化抗体的动物和植物。如上所述，当在体外或体内生产系统中生产抗体时，可将编码抗体重链或轻链的DNA分别整合入表达载体中然后同时转化宿主，或可将编码重链的DNA和编码轻链的DNA整合入单个表达载体中再以此转化宿主(参阅国际专利申请公开WO 94-11523)。
作为将表达载体引入宿主的方法，可用磷酸钙方法(病毒学(1973)52，456-467)和电穿孔法(EMBO J.(1982)1，841-845)等等之类的已知方法。
可从细胞内或细胞外或从宿主中分离如上所述产生和表达的天然人源化抗体，然后纯化至均一。可用常规蛋白质分离和纯化方法完成本发明所用天然人源化抗体的分离和纯化，无任何限制。如果合适，可结合使用亲和层析之类的层析、过滤、超滤、盐析、透析等等完成分离和纯化(抗体：实验室手册，Ed Harlow和David Lane，冷泉港实验室，1988)。
可用于这样的亲和层析的柱，可提及的有蛋白A柱和蛋白G柱。用于蛋白A柱中的载体，可提及的有Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacis)等等。
除亲和层析之外的层析包括，例如，离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析、吸附层析等等(蛋白质纯化和鉴定策略：实验室进程手册。Ed Daniel R.Marshak等人，冷泉港实验室出版社，1996)。
用诸如HPLC、FPLC等等液相层析可进行这些层析。
可用吸光度检测或酶联免疫吸附测定(ELISA)等等确定本发明之天然人源化抗体的浓度。这样，在应用吸光度检测时，用PBS恰当稀释得到的天然人源化抗体，然后在280nm处测定吸光度，随后用1mg/ml时为1.35 OD的吸收系数进行计算。
使用ELISA方法时，检测进行如下。这样，将在0.1M碳酸氢盐缓冲液，pH9.6中稀释至1mg/ml的100μl山羊抗人IgG(BIO SOURCE制备)加入96孔板(Nunc生产)中，4℃温育过夜以固定抗体。封闭后，加入本发明之恰当稀释的天然人源化抗体各，或含该抗体的样品，或作为标准的已知浓度人IgG(CAPPEL制备)100μl，室温温育1小时。
洗涤后，加入100μl 5000倍稀释的碱性磷酸酶标记抗人IgG抗体(BIO SOURCE生产)，室温温育1小时。洗涤后，加入底物溶液并保温，随后用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad生产)检测405nm处的吸光度，以计算所期望抗体的浓度。BIAcore(Pharmacia生产)可用于抗体浓度的检测。
用已知方法可评估本发明天然人源化抗体的抗原结合活性、结合抑制活性和中和活性。例如，作为本发明之天然人源化抗体活性测定的方法，可提及的有ELISA、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)或荧光抗体方法。为了进行上述抗体的评估，可使用BIAcore(Pharmacia生产)。
本发明的天然人源化抗体可以是抗体片段或其修饰变体。例如，作为抗体片段，可提到的有Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv(ScFv)。scFv具有重链和轻链Fv通过合适衔接子连接的结构。
为了生产这些抗体，用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶之类的酶处理抗体，或构建编码这些抗体片段的基因并随后引入表达载体中，在合适宿主细胞中表达该载体以表达所述抗体(参阅，例如，Co，M.S.等人，免疫学杂志(1994)152，2968-2976；Better，M.和Horwitz，A.H.，酶学方法(1989)178，476-496，Academic Press Inc.；Plucktrun，A.和Skerra，A.，酶学方法(1989)178，476-496，Academic PressInc.；Lamoyi，E.，酶学方法(1986)121，652-653；Rousseaux，J.酶学方法(1986)121，663-669；Bird，R.E.和Walker，B.W.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
通过连接抗体重链可变区和轻链可变区可得到scFv(参阅，国际专利公开WO 88-09344)。在scFv中，重链可变区和轻链可变区优选通过衔接子连接，优选肽衔接子(Huston，J.S.等人，美国国家科学院院报(1988)85，5879-5883)。scFv中重链可变区和轻链可变区可衍生自任何上述抗体。作为连接可变区的肽衔接子，任何单链肽，包括含有例如12-19个氨基酸残基的单链肽均可用(参阅，美国专利号US5525491)。
以编码以上抗体重链或重链可变区的DNA和编码以上抗体轻链和轻链可变区的DNA为模板，通过用确定其两端之引物对，由PCR技术扩增以上序列中编码所期望氨基酸序列的DNA部分，并用限定待与重链和轻链连接的所说DNA两端的引物对进一步扩增编码肽衔接子部分的DNA联合体，可得到编码scFv的DNA。
一旦构建了编码scFv的DNA，用常规方法可得到含有它们的表达载体和以该表达载体转化的宿主，通过常规方法用产生的宿主可得到scFv。
通过与上述方式类似的方法获得其基因并使其于宿主中表达可产生这些抗体片段。本申请权利要求中所用的“抗体”包括这些抗体片段。
作为修饰抗体，可使用与如聚乙二醇(PEG)之类多种分子结合的抗体。本申请权利要求中所用的“抗体”包括这些修饰抗体。这些修饰抗体可通过化学修饰这样得到的抗体而获得。这些方法在本领域中已建立。
本发明的天然人源化抗体可全身或者局部地口服或肠胃外施用。可从如滴注之类的静脉内注射、肌肉内注射、腹膜内注射和皮下注射中选择肠胃外途径，如果合适，可选的服用方法取决于病人的年龄和状况。
可以足够处理或至少部分阻断病理状况的剂量服用本发明之天然人源化抗体。例如，选择有效剂量为每次用药0.01mg-100mg/kg体重。或者说，可选择的剂量范围是1-1000mg，优选5-50mg/病人。然而，本发明的天然人源化抗体并不局限于这些剂量。
本发明的天然人源化抗体可包含药学可接受载体或添加剂，这取决于服用途径。这样的载体或添加剂的例子包括水、药用可接受有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯钠、藻酸钠、水可溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶(xanthan gum)、阿拉伯胶、酪素、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、Searic acid、人血清清蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药用可接受表面活性剂等等。取决于剂量形式，添加剂可选自，但不局限于以上种类或它们的混合物。
参考实施例
在参照实施例解释本发明之前，作为其前提将描述参考实施例。参考实施例1.编码小鼠抗HM1.24抗体可变区之cDNA的克隆1.信使RNA(mRNA)的分离
按其所附说明书利用Fast Track mRNA分离试剂盒3.2版(Invitrogen生产)，从生产小鼠抗HM1.24抗体的2×108杂交瘤细胞(FERM BP-5233)中分离mRNA。2.用PCR方法扩增编码抗体可变区的基因
用扩增热循环仪(Perkin Flmer Cetus生产)进行PCR。2-1.编码小鼠轻链可变区的基因的扩增和断裂
从这样分离的mRNA，用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Life Science生产)合成单链cDNA并用于PCR。作为用于PCR的引物，使用与小鼠κ型轻链前导序列可杂交的SEQ ID NO：29-39中所示MKV(小鼠κ可变区)引物(Jones，S.T.等人，生物/技术，9，88-89，(1991))。
100μl PCR溶液含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.1mMdNTP(dATP，dGTP，dCTP，dTTP)，1.5mM MgCl2，5个单位的DNA聚合酶Ampli Taq(Perkin Elmer Cetus制备)，SEQ ID NO：29-39中所示0.25mM MKV引物，SEQ ID NO：40中所示3mM MKC引物，及100ng单链cDNA，上覆盖50μl矿物油，再于起始温度94℃加热3分钟，然后依次94℃ 1分钟，55℃ 1分钟，72℃ 1分钟。重复循环30次后，反应混合液72℃保温10分钟。用低熔点琼脂糖(Sigma生产)纯化扩增的DNA片段，在37℃用Xma I(New England Biolabs生产)和Sal I(Takara Shuzo生产)消化。2-2.编码小鼠重链可变区的cDNA的扩增和断裂
用5′-RACE方法(cDNA末端的快速扩增；Frohman，M.A.等人，美国国家科学院院报，85，8998-9002，(1988)，Edwards，J.B.D.M.，等人，核酸研究，19，5227-5232，(1991))扩增编码小鼠重链可变区的基因。用与小鼠IgG2a恒定区特异杂交的引物P1(SEQ ID NO：63)合成cDNA后，用与小鼠IgG2a恒定区特异杂交的引物MHC2a(SEQ IDNO：64)及试剂盒所附的锚定引物(SEQ ID NO：101)通过5′-AmpliFINDER RACE KIT(CLONTECH生产)扩增编码小鼠重链可变区的cDNA。以低熔点琼脂糖(Sigma生产)纯化扩增的DNA片段并用EcoR I(Takara生产)和Xma I(New England Biolabs生产)在37℃消化。3.连接和转化
通过在含50mM Tris-HCl(pH7.6)，10mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，1mM ATP，50mg/ml聚乙二醇(8000)和1个单位T4 DNA连接酶(GIBCO-BRL生产)的反应混和液中16℃反应2.5小时，将如上制备的含编码小鼠K类型轻链可变区之基因的DNA片段与通过Sal I和XmaI消化制备的pUC19载体连接。类似地，将编码小鼠重链可变区的基因与通过EcoR I和Xma I消化制备的pUC19载体在16℃反应和连接3小时。
然后将10μl以上连接混合液加入50μl大肠杆菌DH5的感受态细胞中，冰置30分钟，42℃1分钟，再冰置1分钟。随后将400μl2×YT培养基(分子克隆：实验室手册，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社(1989))加入其中，37℃保温1小时，然后将大肠杆菌铺于含50μg/ml氨苄青霉素的2×YT琼脂培养基(分子克隆：实验室手册，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社(1989))上，再37℃保温过夜以获得大肠杆菌转化子。
转化子在含50μg/ml氨苄青霉素的10ml 2×YT培养基中培养过夜，然后用碱法(分子克隆：实验室手册，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社，(1989))从此培养物中制备质粒DNA。
这样获得的质粒称pUCHMVL9，它含有编码来源于产生抗HM1.24抗体之杂交瘤的小鼠κ型轻链可变区的基因。以上述方法获得的含有编码来源于产生抗HM1.24抗体之杂交瘤的小鼠重链可变区的基因的质粒，称pUCHMVHR16。参考实施例2.DNA核苷酸序列的测定
用自动DNA测序仪(应用生物系统公司生产)和Taq染料脱氧终止子循环测序试剂盒(应用生物系统公司生产)以生产商指定的方案测定上述质粒中cDNA编码区的核苷酸序列。
质粒pUCHMVL9中所含编码小鼠抗HM1.24抗体轻链可变区之基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示。质粒pUCHMVHR16中所含编码小鼠抗HM1.24抗体重链可变区之基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：3中所示。参考实施例3.CDR的测定
轻链和重链可变区的总体结构相互之间具相似性，其中4个构架部分由3个高变区，即互补性决定区(CDR)连接。构架区的氨基酸序列相对比较保守，但氨基酸序列内的变异是极其大的(Kabat，E.A.，等人，“有免疫学价值的蛋白质的序列”，US Dept.Health and HumanServices，1983)。
基于这些事实，将抗HM1.24抗体可变区的氨基酸序列与抗体氨基酸序列数据库配合以调查同源性，CDR区确定如表1所示。
                     表1质粒       序列号    CDR(1)    CDR(2)    CDR(3)pUCHMVL9      5至7     24-34     50-56     89-97pUCHMVHR16    8至10    31-35     50-66     99-109参考实施例4.证实克隆cDNA的表达(嵌合型抗HM1.24抗体的构建)1.表达载体的构建
为了构建表达嵌合型抗HM1.24抗体的表达载体，用PCR方法修饰分别编码小鼠抗HM1.24抗体轻链和重链可变区的cDNA克隆pUCHMVL9和pUCHMVHR16，然后引入HEF表达载体中(国际专利公开号WO 92-19759)。
设计轻链可变区的反向引物ONS-L722S(SEQ ID NO：65)和重链可变区的反向引物VHR16S(SEQ ID NO：66)，以使它们能与编码各自可变区前导序列起始部分的DNA杂交，且它们具有Kozak共有序列(Kozak，M.等人，分子生物学杂志，196，947-950，(1987))和HindIII限制酶识别位点。设计轻链可变区的正向引物VL9A(SEQ ID NO：67)和重链可变区的正向引物VHR16A(SEQ ID NO：68)，以使它们能与编码J区末端的DNA序列杂交，且它们具有剪接供体序列和BamH I限制酶识别位点。
100μl PCR反应混和液含10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.1mM dNTP，1.5mM MgCl2，100pmole各引物，100ng模板DNA(pUCHMVL9或pUCHMVHR16)，5个单位Ampli Taq酶，用50μl矿物油覆盖，然后在94℃预变性后，94℃加热1分钟、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，进行30个循环，最后72℃保温10分钟。
用低熔点琼脂糖凝胶纯化PCR产品，用HindIII和BamH I消化，然后将轻链可变区克隆入HEF-VL-gκ，将重链可变区克隆入HEF-VH-gγl。DNA序列测定后，将含包括正确DNA序列的DNA片段的质粒分别命名为HEF-1.24L-gκ和HEF-1.24H-gγl。
用限制酶HindIII和BamHI消化上述质粒HEF-1-24L-gκ和HEF-1.24H-gγl中编码相应可变区的区域，制备限制性片段，并将其插入质粒载体的HindIII和BamHI位点，所得质粒分别命名为pUC19-1.24L-gκ和pUC19-1.24H-gγl。
分别含质粒pUC19-1.24L-gκ和pUC19-1.24H-gγl的大肠杆菌被命名为大肠杆菌DH5(pUC19-1.24L-gκ)和大肠杆菌DH5(pUC19-1.24H-gγl)，于1996年8月29日根据布达佩斯条约保藏于国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术局，MITI(Higashi 1-Chome1-3，Tsukuba city，Ibalaki县，日本)，保藏号分别为FERM BP-5646和FERM BP-5644。2.转染入COS-7细胞
为了观察嵌合型抗HM1.24抗体的瞬时表达，在COS-7(ATCCCRL-1651)细胞中检测以上表达载体。用基因脉冲装置(BioRad生产)通过电穿孔将HEF-1.24L-gκ和HEF-1.24H-gγl共转化入COS-7细胞。将每种DNA(10μg)加入0.8ml在PBS中有1×107个细胞/ml的等份试样中，在1500V和25μF电容条件下进行脉冲。
在室温10分钟的恢复期后将电穿孔细胞加入含10％无γ球蛋白之胎牛血清的30ml DHEM培养液(GIBCO生产)中。在二氧化碳培养箱BNA120D(TABAI生产)中温育72小时后，收集培养物上清，离心去除细胞碎片，上清用于以下实验。3.FCM分析
用KPMM2细胞通过FCM(流速细胞术)分析调查嵌合型抗HM1.24抗体的抗原结合活性。用PBS(-)洗涤4.7×105KPMM2细胞(日本来审专利申请公开(Kokai)号7(1995)-236475)后，加入可产生上述嵌合型抗HM1.24抗体的COS-7细胞培养物50μl和50μl FACS缓冲液(含2％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的PBS(-))，或5μl 500μg/ml纯化小鼠抗HM1.24抗体和95μl FACS缓冲液，冰浴1小时。
作为对照，加入50μl 2μg/ml嵌合SK2(国际专利申请公开号WO 94-28159)和50μl FACS缓冲液，或5μl 500μg/ml纯化小鼠IgG2aκ(UPC10)(CAPPEL生产)代替小鼠抗HM1.24抗体，还有95μlFACS缓冲液，相似地保温。用FACS缓冲液洗涤后，加入100μl 25μg/ml FITC标记山羊抗人抗体(GAH)(CAPPEL生产)或10μg/ml FITC标记山羊抗小鼠抗体(GAM)(Becton Dickinson生产)，冰置30分钟。用FACS缓冲液洗涤后，悬浮于1ml FACS缓冲液中，用FACScan(BectonDickinson生产)检测每种细胞的荧光强度。
如图1所示，与加入小鼠抗HM1.24抗体的类似对照相比较，在加入嵌合型抗HM1.24抗体的细胞中荧光强度峰转换至右边，这表明嵌合型抗HM1.24抗体结合至KPMM2细胞上。这证实了克隆cDNA编码小鼠抗HM1.24抗体可变区。参考实施例5  稳定生产嵌合型抗HM1.24抗体的CHO细胞系的建立1.嵌合重链的表达载体的构建
用限制酶Pvu I和BamH I消化以上质粒HEF-1.24H-gγl，用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化含EF1启动子和编码小鼠抗HM1.24抗体重链可变区之DNA的约2.8Kbp片段。然后，将上述DNA片段插入约6Kbp的片段中，此片段是通过Pvu I和BamH I消化含DHFR基因及编码人重链恒定区之基因、用作人重链表达载体的表达载体DHFR-ΔE-Rvh-PMlf(参阅国际专利申请公开号WO 92/19759)而制备，以构建嵌合型抗HM1.24抗体重链的表达载体DHFR-ΔE-HEF-1.24-H-gγl。2.将基因引入CHO细胞
为了建立嵌合型抗HM1.24抗体的稳定生产系统，将通过Pvu I消化而线性化的上述表达载体HEF-1.24L-gκ和DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγl的基因在与上述(上述对COS-7细胞的转染)相似条件下用电穿孔方法同时引入CHO细胞DXBII(由Medical Research CouncilCollaboration center赠送)中。3.用MTX扩增基因
在引入基因的CHO细胞中，只有那些轻链和重链表达载体均已引入的CHO细胞能生存于加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)和10％胎牛血清的无核苷α-MEM培养液(GIBCO-BRL生产)中，因而将它们选择出来。随后，将10nM MTX(Sigma生产)加入上述培养液中。在增殖的克隆中，选择那些大量产生嵌合型抗HM1.24抗体的克隆。结果得到生产效率约20μg/ml嵌合型抗体的克隆#8-#13，并称之为嵌合型抗HM1.24抗体生产细胞系。参考实施例6嵌合型抗HM1.24抗体的构建
以下述方法构建嵌合型抗HM1.24抗体。用含5％无γ球蛋白之新生牛血清(GIBCO-BRL生产)的Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium(GIBCO-BRL生产)作为培养基，通过高密度细胞培养装置Verax系统20(CELLEX BIOSCIENCE Inc.生产)将以上嵌合型抗HM1.24抗生产型CHO细胞连续培养30天。
在开始培养13、20、23、26和30天后，用加压滤器装置SARTOBRAN(Sartorius生产)回收培养液，然后用大体积抗体收集系统Afi-Prep系统(Nippon Gaishi生产)和Super Protein A柱(床体积：100ml，Nippon Gaishi生产)亲和纯化嵌合型抗HM1.24抗体，按所附指示用PBS作为吸收/洗涤缓冲液，0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液。立即加入1M Tris-HCl(pH8.0)将洗脱级分调至约pH7.4。用280nm处吸光度检测并以1μg/ml为1.35 OD计算抗体浓度。
参考实施例7嵌合型抗HM1.24抗体活性的测定
用以下结合抑制活性评估嵌合型抗HM1.24抗体。1.结合抑制活性的检测1-1.生物素化抗HM1.24抗体的构建
用0.1M碳酸氢盐缓冲液将小鼠抗HM1.24抗体稀释至4mg/ml后，加入4μl 50mg/ml生物素-N-羟基琥珀酰亚胺(EY LABS Inc.生产)并在室温反应3小时。之后，向其中加入0.2M甘氨酸溶液1.5ml，室温保温30分钟终止反应，然后用PD-10柱(Pharmacia Biotech生产)收集生物素化IgG级分。1-2.结合抑制活性的检测
用人羊膜细胞系WISH细胞(ATCC CCL25)通过细胞-酶联免疫吸附试验检测生物素标记小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性。细胞-ELISA平板制备如下。将用补充有10％胎牛血清之PRMI 1640培养基制备的4×105细胞/ml加入96-孔板上，保温过夜，用PBS(-)洗涤两次后，用0.1％戊二醛(Nacalai Tesque Inc.生产)将其固定。
封闭后，将通过亲和纯化获得的嵌合型抗HM1.24抗体或小鼠抗HM1.24抗体之50μl系列稀释液加入每一孔中并同时加入50μl 2μg/ml的生物素标记小鼠抗HM1.24抗体，室温保温2小时，然后加入过氧化物酶标记的链霉亲和素(DAKO生产)。室温温育1小时后洗涤，加入底物溶液。加入50μl 6N硫酸终止反应后，用微量培养板读数器3550型(Bio-Rad生产)检测490nm处的吸收值。
如图2所示，结果显示嵌合型抗HM1.24抗体与生物素标记小鼠抗-HM1.24抗体对小鼠抗HM1.24抗体具有相似的结合抑制活性。这表明嵌合型抗体具有与小鼠抗HM1.24抗体相同的可变区。参考实施例8嵌合型抗HM1.24抗体ADCC活性的检测
按《免疫学最新方法》，第7章，人体免疫研究，Johan E.Coligan等人编辑，John Wiley&Sons，Inc.，1993中所示方法检测ADCC(抗体依赖型细胞毒性)活性。1.效应细胞的制备
用密度离心法从健康人和多发性骨髓瘤病人的外周血或骨髓中分离单核细胞。这样，向健康人和多发性骨髓瘤病人的外周血和骨髓中加入等量PBS(-)，铺于Ficoll(Pharmacia生产)-Conrey(Daiichi制药有限公司生产)上(比重1.077)，400g离心30分钟。收集单核细胞层，用补充有10％胎牛血清(Witaker生产)的RPMI 1640(Sigma生产)洗两次，用相同的培养液制备成细胞密度5×106/ml。2.靶细胞的制备
通过在补充有10％胎牛血清(Witaker生产)的RPMI 1640(Sigma生产)中与0.1mCi 51Cr-铬酸钠37℃保温60分钟，将人骨髓瘤细胞系RPMI 8226(ATCC CCL155)进行放射性标记。放射性标记后，用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗细胞3次并调至浓度2×105/ml。3.ADCC试验
在96孔U-底平板(Corning生产)中加入50μl的2×105靶细胞/ml，1μg/ml亲和纯化嵌合型抗HM1.24抗体和小鼠抗HM1.24抗体，或对照人IgG(Serotec生产)，平板于4℃放置15分钟。
然后，向其中加入100μl 5×105效应细胞/ml，在二氧化碳培养箱中培养4小时，其中效应细胞(E)对靶细胞(T)的比率为0∶1，5∶1，20∶1或50∶1。
取100μl上清液，并用γ计数器(ARC361，Aloka生产)检测释放入培养物上清液中的放射性。为了检测最大放射性，使用1％ NP-40(BRL生产)。用(A-C)/(B-C)×100计算细胞毒性(％)，其中A是抗体存在时释放的放射性(cpm)，B是NP-40释放的放射性(cpm)，而C是无抗体时培养液释放的放射性(cpm)。
如图3所示，当加入嵌合型抗HM1.24抗体与对照IgG1相比较，细胞毒性随E∶T比率增加而增加，这表明该嵌合型抗HM1.24抗体具ADCC活性。此外，因为甚至当小鼠抗HM1.24抗体加入时也观察不到细胞毒性，这表示当效应细胞是来源于人的细胞时，要获得ADCC活性要求有人抗体的Fc部分。参考实施例9  重构人抗HM1.24抗体的构建1.重构人抗HM1.24抗体可变区的设计
为了构建将小鼠单克隆抗体CDR移植入人抗体中的重构人抗体，优选在小鼠抗体FR和人抗体FR之间有高度同源性。因此，将小鼠抗HM1.24抗体轻链和重链可变区与用蛋白质数据库已阐明其结构的所有已知抗体可变区相比较。
小鼠抗HM1.24抗体轻链可变区与人轻链可变区亚型IV(HSGIV)的共有序列最相似，同源性为66.4％。另一方面，它显示与HSG I、HSGII和HSGIII同源性分别为56.9％、55.8％和61.5％。
当将小鼠抗HM1.24抗体轻链可变区与已知人抗体轻链可变区相比较时，显示它与人轻链可变区亚型I之一——人轻链可变区REI有67.0％的同源性。因此，将REI的FR用作构建重构人抗HM1.24抗体轻链可变区的起始材料。
设计重构人抗HM1.24抗体轻链可变区的变体a。在此变体中，将人FR制成与重构人CAMPATH-1H抗体(参阅Riechmann，L.等人，自然322，21-25，(1988)，“重构人抗PM-1抗体轻链可变区变体a中所含的FR”，描述于国际专利申请公开WO 92-19759)中存在的基于REI的FR相同，将小鼠CDR制成与小鼠抗HM1.24抗体轻链可变区中CDR相同。
小鼠抗HM1.24抗体重链可变区与人重链可变区HSGI的共有序列最相似，同源性为54.7％。另一方面，它显示与HSGII和HSGIII分别有34.6％和48.1％的同源性。当将小鼠抗HM1.24抗体重链可变区与已知人抗体重链可变区相比较时，显示FR1-FR3与人重链可变区亚型I之一——人抗体HG3重链可变区最相似(Rechavi，G.等人，美国国家科学院院报80，855-859)，同源性为67.3％。
因此，将人抗体HG3的FR用作重构人抗HM1.24抗体重链可变区构建的起始材料。然而，因为人HG3的FR4氨基酸序列还未被描述，所以使用与小鼠抗HM1.24抗体重链FR4具最高同源性的人抗体JH6之FR4的氨基酸序列(Ravetch，J.V.等人，细胞，27，583-591)。除一个氨基酸外，JH6的FR与小鼠抗HM1.24抗体重链FR4具有几乎相同的氨基酸序列。
在重构人抗-HM1.24抗体重链可变区的第一变体a中，使FR1至FR3与人HG3的FR1至FR3相同，使CDR与小鼠抗HM1.24抗体重链可变区CDR相同，不同之处只在于使人FR1中的第30位氨基酸和人FR3中第71位氨基酸与小鼠抗HM1.24抗体中的氨基酸相同。2.重构人抗HM1.24抗体轻链可变区的构建
通过PCR方法中的CDR移植法构建重构人抗HM1.24抗体的轻链。该方法如图4所示。8个PCR引物被用于构建具有衍生自人抗体REI之FR的重构人抗HM1.24抗体(变体a)。设计外围引物A(SEQ ID NO：69)和H(SEQ ID NO：70)，使其能与表达载体HEF-VL-gκ的DNA序列杂交。
CDR移植引物L1S(SEQ ID NO：71)、L2S(SEQ ID NO：72)和L3S(SEQ ID NO：73)具有有义DNA序列。CDR移植引物L1A(SEQ ID NO：74)、L2A(SEQ ID NO：75)和L3A(SEQ ID NO：76)具有反义DNA序列，每一个分别具有与引物L1S、L2S和L3S 5′端DNA序列互补的DNA序列(20-23bp)。
在PCR的第一阶段，进行A-L1A、L1S-L2A、L2S-L3A和L3S-H4个反应以纯化每种PCR产物。使来自第一阶段PCR的4种PCR产物通过其自身互补性相互装配起来(参阅国际专利申请公开号WO 92-19759)。然后，加入外围围引物A和H以扩增编码重构人抗HM1.24抗体轻链可变区的全长DNA(二次PCR)。在上述PCR中，编码基于人抗体REI衍生FR之重构人ONS-M21抗体轻链可变区变体a的质粒HEF-RVL-M21a(参阅国际专利申请公开号WO 95-14041)被用作模板。
在第一阶段PCR中，使用含有10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，0.1mM dNTP，1.5mM MgCl2，100ng模板DNA，100pmole各引物，和5uAmpli Taq的PCR混合液。每个PCR管覆盖50μl矿物油。之后94℃加热预变性，进行94℃ 1分钟、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟的反应循环，然后72℃保温10分钟。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化PCR产物A-L1A(215bp)、L1S-L2A(98bp)、L2S-L3A(140bp)和L3S-H(151bp)并在二次PCR中装配起来。在二次PCR中，将含一次PCR各种产物各1μg和5u Ample Taq的98μl PCR混合液保温2个循环(94℃ 2分钟、55℃ 2分钟和72℃2分钟)，然后加入外围引物各100pmole(A和H)。用50μl矿物油盖住PCR管并在以上相同条件下进行30个循环的PCR。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化二次PCR产生的516bp DNA片段，以BamH I和HindIII消化，将这样得到的DNA片段克隆入HEF表达载体HEF-VL-gκ。DNA序列测定后，将具有重构人抗HM1.24抗体轻链可变区之正确氨基酸序列的DNA片段称为质粒HEF-RVLa-AHM-gκ。此质粒HEF-RVLa-AHM-gκ中所含轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO：11中所示。
通过用PCR诱变构建重构人抗HM1.24抗体轻链可变区的变体b。设计诱变引物FTY-1(SEQ ID NO：77)和FTY-2(SEQ ID NO：78)以使71位苯丙氨酸突变为酪氨酸。
用质粒HEF-RVLa-AHM-gκ为模板扩增以上引物后，通过BamH I和HindIII消化纯化终产物。将得到的DNA片段克隆入HEF表达载体HEF-VL-gκ以获得质粒HEF-RVLb-AHM-gκ。此质粒HEF-RVLb-AHM-gκ中所含轻链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：13所示。3.重构人抗HM1.24抗体重链可变区的构建3-1.重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a至e的构建
编码重构人抗HM1.24抗体重链可变区的DNA设计如下。将编码人抗体HG3之FR1至FR3和人抗体JH6之FR4的DNA序列与编码小鼠抗HM1.24抗体重链可变区CDR的DNA序列连接，设计成编码重构人抗HM1.24抗体重链可变区的全长DNA。
然后，向该DNA的5′-端和3′-端分别添加HindIII识别位点/KOZAK共有序列和BamH I识别位点/剪接供体序列，以使其能插入HEF表达载体。
将这样设计的DNA序列分成4个寡核苷酸。随后，对潜在地阻碍这些寡核苷酸装配的寡核苷酸进行计算机分析其二级结构。这4个寡核苷酸RVH1至RVH4的序列如SEQ ID NO：79-82中所示。这些寡核苷酸具有119-144个碱基的长度和25-26bp长的重迭区。在这些寡核苷酸中，RVH2(SEQ ID NO：80)和RVH4(SEQ ID NO：82)具有有义DNA序列，而RVH1(SEQ ID NO：79)和RVH3(SEQ ID NO：81)具有反义DNA序列。用PCR方法装配这4个寡核苷酸的方式如图所示(参阅图5)。
将含4种寡核苷酸各100ng和5u Ampli Taq的PCR混和液(98μl)首先在94℃加热变性2分钟，然后进行2个循环温育，每个循环包括94℃ 2分钟，55℃ 2分钟和72℃2分钟。加入RHP1(SEQ ID NO：83)和RHP2(SEQ ID NO：84)各100pmole作为外围引物后，用50μl矿物油覆盖PCR管。然后先在94℃变性1分钟，之后进行38个循环，每个循环为94℃ 1分钟、55℃ 1分钟和72℃ 1分钟，最后72℃保温10分钟。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化438bp DNA片段，以HindIII和BamHI消化，然后克隆入HEF表达载体HEF-VH-gγl。碱基序列测定后，将含编码重链正确可变区之氨基酸序列的DNA片段的质粒称为HEF-RVHa-AHM-gγl。该质粒中所含的重链可变区氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：11中所示。
重构人抗HM1.24抗体重链可变区每个变体b、c、d和e构建如下。
利用设计成将第66位精氨酸突变为赖氨酸的BS(SEQ ID NO：85)和BA(SEQ ID NO：86)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，通过PCR方法扩增变体b以获得质粒HEF-RVHb-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHb-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：17中所示。
利用设计成将第73位苏氨酸突变成赖氨酸的CS(SEQ ID NO：87)和CA(SEQ ID NO：88)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，用PCR方法扩增变体C以获得质粒HEF-RVHc-AHM-gγl。质粒HEF-RVHc-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：19中所示。
利用设计成将第66位精氨酸突变为赖氨酸及第73位苏氨酸突变为赖氨酸的DS(SEQ ID NO：89)和DA(SEQ ID NO：90)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，用PCR方法将变体d扩增以获得质粒HEF-RVHd-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHd-AHM-gγl中所含重链可变区氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：21中所示。
利用设计成将第67位缬氨酸突变为丙氨酸和第69位甲硫氨酸突变成亮氨酸的ES(SEQ ID NO：91)和EA(SEQ ID NO：92)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体e以获得质粒HEF-RVHe-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHe-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：23中所示。3-2.重链杂合可变区的构建
构建两个重链杂合可变区。一个是小鼠-人杂合抗HM1.24抗体，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体而FR3和FR4的氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a，另一个是人-小鼠杂合抗HM1.24抗体，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a而FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体。CDR区的氨基酸序列均来自小鼠抗HM1.24抗体。
用PCR方法构建两种重链杂合可变区。此方法如图6和7图解所示。为了两种重链杂合可变区的构建，用了4个引物。设计外围引物a(SEQ ID NO：93)和h(SEQ ID NO：94)使其能与HEF表达载体HEF-VH-gγl的DNA序列杂交。重链杂合体构建引物HYS(SEQ ID NO：95)被设计为具有有义DNA序列而重链杂合体引物HYA(SEQ ID NO：96)被设计为具有反义DNA序列以使DNA序列相互互补。
为了构建其中FR1和FR2氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体而FR3和FR4氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a的重链杂合可变区，在第一阶段PCR中进行利用质粒HEF-1.24H-gγl为模板、外围引物a及重链杂合体引物HYA的PCR，以质粒HEF-RVLa-AHM-gγl为模板、重链杂合体引物HYS(SEQ ID NO：95)和外围引物h(SEQ ID NO：94)为引物的PCR，以纯化各PCR产物。使两种一次PCR产物通过其自身互补性装配(参阅国际专利申请公开号WO 92-19759)。
然后，在二次PCR阶段，加入外围引物a(SEQ ID NO：93)和h(SEQID NO：94)扩增编码重链杂合可变区的全长DNA，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体而FR3和FR4的氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a。
为了构建其中FR1和FR2氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a而FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体的重链杂合可变区，在一次PCR中进行以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板、外围引物a和重链杂合体引物HYA为引物的PCR，和以质粒HEF-1.24H-gγl为模板、重链杂合体引物HYS和外围引物h为引物的PCR，以纯化各PCR产物。使来自一次PCR的两种PCR纯化产物通过其自身互补性装配(参阅国际专利申请公开号WO 92-19759)。
然后，在二次PCR中，加入外围引物a和h扩增编码重链杂合可变区的全长DNA，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a而FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体。
按“实施例9重构人抗HM1.24抗体轻链可变区的构建”中所示方法进行一次PCR、PCR产物纯化、装配、二次PCR及克隆入HEF表达载体HEF-VH-gγl等方法。
DNA序列测定后，将含编码重链杂合可变区正确氨基酸序列的DNA片段的质粒称为HEF-MH-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体，FR3和FR4的氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a。此质粒HEF-MH-RVH-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：97中所示。同样，含编码下述重链杂合可变区正确氨基酸序列之DNA片段的质粒被称为HEF-HM-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体a，FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体。此质粒HEF-HM-RVH-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：99中所示。3-3.重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体f至r的构建
重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q和r中每一个构建如下。
利用设计成将第75位苏氨酸突变为丝氨酸及78位缬氨酸突变为丙氨酸的FS(SEQ ID NO：102)和FA(SEQ ID NO：103)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHe-AHM-gγl为模板DNA，用PCR方法扩增变体f以获得质粒HEF-RVHf-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHf-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：25中所示。
利用设计成将第40位丙氨酸突变为精氨酸的GS(SEQ ID NO：104)和GA(SEQ ID NO：105)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板DNA，扩增变体g得到HEF-RVHg-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHg-AHM-gγl中重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：27中所示。
利用FS(SEQ ID NO：102)和FA(SEQ ID NO：103)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHb-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体h得到质粒HEF-RVHh-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHh-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列及碱基序列如SEQ ID NO：29中所示。
利用设计成将第83位精氨酸突变为丙氨酸而第84位丝氨酸突变为苯丙氨酸的IS(SEQ ID NO：106)和IA(SEQ ID NO：107)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体i得到质粒HEF-RVHi-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHi-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：31中所示。
利用设计成将第66位精氨酸突变为赖氨酸的JS(SEQ ID NO：108)和JA(SEQ ID NO：109)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHf-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体j得到质粒HEF-RVHj-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHj-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQID NO：33中所示。
利用设计成将第81位谷氨酸突变为谷氨酰胺的KS(SEQ ID NO：110)和KA(SEQ ID NO：111)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体k得到质粒HEF-RVHk-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHk-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQID NO：35中所示。
利用设计成将第81位谷氨酸突变为谷氨酰胺和第82B位丝氨酸突变为异亮氨酸的LS(SEQ ID NO：112)和LA(SEQ ID NO：113)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体l得到质粒HEF-RVHl-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHl-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：37中所示。
利用设计成将第81位谷氨酸突变为谷氨酰胺、第82b位丝氨酸突变为异亮氨酸、第87位苏氨酸突变为丝氨酸的MS(SEM ID NO：114)和MA(SEQ ID NO：115)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA扩增变体m得到质粒HEF-RVHm-AHM-gγl。质粒HEF-RVHm-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：39中所示。
利用设计成将第82B位丝氨酸突变为异亮氨酸的NS(SEQ ID NO：116)和NA(SEQ ID NO：117)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体n得到质粒HEF-RVHn-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHn-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQID NO：41中所示。
利用设计成将第87位苏氨酸突变为丝氨酸的OS(SEQ ID NO：118)和OA(SEQID NO：119)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增变体o得到质粒HEF-RVHo-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHo-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQID NO：43中所示。
利用设计成将第78位缬氨酸突变为丙氨酸的PS(SEQ ID NO：120)和PA(SEQ ID NO：121)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，PCR扩增变体p得到质粒HEF-RVHp-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHp-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQID NO：45中所示。
利用设计成将第75位苏氨酸突变为丝氨酸的QS(SEQ ID NO：122)和QA(SEQ ID NO：123)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，用PCR方法扩增变体q得到质粒HEF-RVHq-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHq-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：47中所示。
利用CS(SEQ ID NO：87)和CA(SEQ ID NO：88)作为诱变引物，以质粒HEF-RVHp-AHM-gγl为模板DNA，用PCR方法扩增变体r得到质粒HEF-RVHr-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHr-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID NO：49中所示。
用限制酶HindIII和BamH I消化编码上述各质粒HEF-RVLa-AHM-gκ和HEF-RVHr-AHM-gγl的可变区的区域以得到限制片段。将它们插入质粒载体pUC19的HindIII和BamH I位点。每个质粒被称为pUC19-RVLa-AHM-gκ和pUC19-RVHr-AHM-gγl。
含各质粒pUC19-RVLa-AHM-gκ和pUC19-RVHr-AHM-gγl的大肠杆菌分别被称为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)和大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)，并已根据布达佩斯条约于1996年8月29日国际保藏于国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术机构，MITI(Higashi 1-Chome 1-3，Tsukuba city，Ibalaki prefecture，日本)，保藏号分别为FERM BP-5645和FERM BP-5643。4.重构人抗HM1.24抗体、嵌合型抗HM1.24和重链杂合抗体的构建
为了评估重构人抗HM1.24抗体的每一条链，表达重构人抗HM1.24抗体和作为阳性对照抗体的嵌合型抗HM1.24抗体。在重构人抗HM1.24抗体重链可变区变体b及之后变体之一的构建中，表达重链杂合抗体以研究FR中哪一段氨基酸序列应被取代。此外，将它与嵌合型重链联合表达以评估重构人抗HM1.24抗体轻链变体a。4-1.重构人抗HM1.24抗体的表达
用基因脉冲装置(BioRad生产)通过电穿孔将重构人抗HM1.24抗体重链表达载体(HEF-RVHa-AHM-gγl至HEF-RVHr-AHM-gγl)及重构人抗HM1.24抗体轻链表达载体(HEF-RVLa-AHM-gκ或HEF-RVLb-AHM-gκ)中每一种各10μg共转化进入COS-7细胞。将每种DNA(10μg)加入在PBS中1×107细胞/ml的0.8ml等份试样中，进行1500V和电容25μF脉冲。
在室温10分钟的恢复期后，将电穿孔细胞加入含10％无γ-球蛋白胎牛血清的30ml DHEM培养液(GIBCO生产)中。在37℃和5％二氧化碳条件下于二氧化碳培养箱BNA120D(TABAI生产)温育72小时后，收集培养物上清液，在装备有离心机转头03(HITACHI生产)的离心机15PR-22(HITACHI生产)中1000rpm离心5分钟去除细胞碎片，并用装备有离心机转头JA-20.1(BECKMAN生产)的离心机J2-21(BECKMAN生产)在2000rpm条件下超滤微量浓缩器(Centricon100，Amicon生产)，用于细胞-ELISA。4-2.嵌合型抗HM1.24抗体的表达
用嵌合体人抗HM1.24抗体重链表达载体HEF-1.24H-gγl和嵌合体人抗HM1.24抗体轻链表达载体HEF-1.24L-gκ各10μg，按上述用于重构人抗HM1.24抗体表达的方法制备用于细胞-ELISA的嵌合型抗HM1.24抗体。4-3.含人源化轻链变体a和嵌合体重链的抗HM1.24抗体的表达
用嵌合体人抗HM1.24抗体重链表达载体HEF-1.24H-gγl和重构人抗HM1.24抗体轻链变体a表达载体HEF-RVLa-AHM-gκ和10μg，按上述用于重构人抗HM1.24抗体表达的方法制备用于细胞-ELISA的含人源化轻链变体a和嵌合型重链的抗HM1.24抗体。4-4.重链杂合抗体的表达
用重链杂合体可变区表达载体(HEF-MH-RVH-AHM-gγl或HEF-HM-RVH-AHM-gγl)和重构人抗HM1.24抗体轻链表达载体HEF-RVLa-AHM-gκ各10μg，按上述用于重构人抗HM1.24抗体表达的方法制备用于细胞-ELISA的重链杂合抗体。4-5.抗体浓度的检测
用ELISA检测所获抗体的浓度。通过加入用包被缓冲液(0.1MNaHCO3，0.02％NaH3，pH9.6)制备成浓度1μg/ml的山羊抗人IgG抗体(BIO SOURCE生产)100μl并室温保温1小时而固定96孔ELISA平板(Maxisorp，NUNC生产)中的每一孔。用100μl稀释缓冲液(50mMTris-HCl，1mM MgCl2，0.15M NaCl，0.05％ Tween 20，0.02％ NaN3，1％牛血清清蛋白(BSA)，pH8.1)封闭后，在每孔中加入100μl各系列稀释度的经超滤浓缩的重构人抗HM1.24抗体、嵌合型抗HM1.24抗体和重链杂合抗体并室温保温1小时。然后，洗涤后加入100μl碱性磷酸酶标记的山羊抗人IgG抗体(DAKO生产)。
室温保温1小时并洗涤后，加入溶于底物缓冲液(50mM NaHCO3，10mM MgCl2，pH9.8)的100μl 1μg/ml底物溶液(Sigma 104，对硝基苯磷酸盐，SIGMA生产)，然后用微量滴定板读数器3550型(BioRad生产)检测405nm处的吸光度。用人IgG1κ(The Binding Site生产)作为浓度检测的标准。5.稳定生产人抗HM1.24抗体的CHO细胞系的建立
5-1重构人抗HM1.24抗体重链表达载体的构建
用限制性酶Pvu I和BamH I消化质粒HEF-RVHr-AHM-gγl，用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化含编码EF1启动子和重构人抗HM1.24抗体重链可变区之DNA的约2.8kbp片段。然后，将上述DNA片段插入通过用Pvu I和BamH I消化含DHFR基因和编码人重链恒定区之基因的用作人重链表达载体的DHFR-ΔE-RVh-PMlf(国际专利申请公开号WO 92-19759)而制备的约6Kbp片段中，以构建重构抗HM1.24抗体重链表达载体DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγl。5-2.将基因引入CHO细胞
为了建立重构抗HM1.24抗体的稳定生产系统，用电穿孔方法在与上述例子(转染进入上述COS-7细胞)相似的条件下将用Pvu I消化而线性化的上述表达载体DHFR-ΔE-RVHr-AHM-gγl和HEF-RVLa-AHM-gκ的基因同时引入CHO细胞DXB-11。5-3.用MTX进行的基因扩增
在已引入基因的CHO细胞中，只有那些已引入了轻链和重链表达载体二者的CHO细胞能生存于加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)和10％胎牛血清的无核苷α-MEM培养液(GIBCO-BRL生产)中，因此将它们选择出来。随后，将10nM MTX(Sigma生产)加入以上培养液中。在增殖的克隆中，选择那些大量产生重构抗HM1.24抗体的克隆。结果得到生产效率为约3μg/ml重构抗HM1.24抗体的克隆#1并称之为重构抗HM1.24抗体生产细胞系。5-4.重构人抗HM1.24抗体的构建
在以下方法中构建重构抗HM1.24抗体。用加入含10％无γ球蛋白胎牛血清(GIBCO-BRL生产)之500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)的无核苷α-MEM培养液(GIBCO-BRL生产)为培养基，在二氧化碳培养箱BNAS120D(TABAI生产)于37℃和5％二氧化碳的条件下将以上生产重构抗HM1.24抗体的CHO细胞培养10天。在开始培养后的第8天和第10天回收培养液，用装备有TS-9转头的离心机RL-500SP(Tomy Seiko生产)于2000rpm离心10分钟去除细胞碎片，然后用具有孔直径0.45μm的膜的瓶顶滤器(FALCON生产)无菌过滤。
将等量PBS(-)加入产生重构人抗HM1.24抗体的CHO细胞培养液中，然后按所附指示以PBS(-)为吸附/洗涤缓冲液、以0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)为洗脱缓冲液，采用高速抗体纯化系统ConSep LC100(MILLIPORE生产)和Hyper D蛋白A柱(Nippon Gaishi生产)亲和纯化重构抗HM1.24抗体。立即加入1M Tris-HCl(pH8.0)将洗脱级分调至约pH7.4，然后用离心超滤浓缩器Centriprep 10(MILLIPORE生产)进行浓缩和换成PBS(-)缓冲液，并用孔径0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(MILLIPORE生产)无菌过滤得到纯化的重构人抗HM1.24抗体。经280nm吸光度检测并按1μg/ml为1.35 OD计算抗体浓度。参考实施例11.重构抗HM1.24抗体活性的测定
评估重构抗HM1.24抗体的以下抗原结合活性和结合抑制活性。1.抗原结合活性和结合抑制活性的检测方法
1-1抗原结合活性的检测
用WICH细胞通过细胞ELISA检测抗原结合活性。细胞-ELISA平板制备如以上实施例7.1-2中所述。
封闭后，将获自COS-7细胞培养物上清液浓缩物或纯化自CHO细胞培养物上清液的100μl系列稀释度的重构人抗HM1.24抗体加入每一孔中。室温保温2小时并洗涤后，加入过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(DAKO生产)。室温温育2小时并洗涤后，加入底物溶液并保温。然后加入50μl 6N硫酸终止反应，并用微量培养板读数器3550型(Bio-Rad生产)检测490nm处的吸光度。1-2.结合抑制活性的检测
用WISH细胞通过细胞-ELISA检测生物素标记小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性。如上所述制备细胞ELISA平板。封闭后，将获自COS-7细胞培养物上清液浓缩物或纯化自CHO细胞培养物上清液的50μl系列稀释度的重构人抗HM1.24抗体加入每一孔中，同时加入50μl 2μg/ml生物素标记小鼠抗HM1.24抗体。室温温育两小时并洗涤后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素(DAKO生产)。室温温育1小时并随之洗涤后，加入底物溶液并温育。然后加入50μl 6N硫酸终止反应，用微量平板读数器Model 3550(Bio-Rad生产)检测490nm处的吸光度。2.重构人抗HM1.24抗体的评估2-1.轻链
按以上就抗原结合活性的检测所述及的方法评估重构人抗HM1.24抗体轻链变体a。如图8所示，当轻链变体a与嵌合体重链联合表达时，它显示了相似水平的抗原结合活性。然而，考虑到活性的进一步提高和与重链的相容性，构建了轻链变体b。同时评估轻链变体a和b与重链变体a、b、f或h结合时的抗原结合活性和结合抑制活性。如图9、10、11和12所示，在重链所有变体a、b、f和h中，轻链变体a两种活性均较变体b高。因此，将重构人抗HM1.24抗体轻链变体a用于以下实验。2-2.重链变体a至e
按以上就抗原结合活性和结合抑制活性的检测所述的方法评估与轻链变体a结合的重构人抗HM1.24抗体的重链变体a至e。如图11、13、14和15中所示，结果显示与嵌合型抗HM1.24抗体相比较所有变体两种活性均较弱，表明需要进一步的氨基酸取代。2-3.重链杂合抗体
按以上就抗原结合活性的检测所述的方法评估重链杂合抗体。如图16中所示，结果表明人-小鼠杂合抗HM1.24抗体显示与嵌合型抗HM1.24抗体相似的抗原结合活性，而小鼠-人杂合抗HM1.24抗体具有较嵌合型抗HM1.24抗体更弱的活性。这表明，为了构建具有与嵌合型抗HM1.24抗体相似抗原结合活性的重构人抗HM1.24抗体，必需转换含重链可变区的FR3或FR4中所包括的氨基酸。2-4.重链变体f至r
按以上就抗原结合活性的检测所述的方法评估重构人抗HM1.24抗体重链变体f。如图17中所示，结果表明与嵌合型抗HM1.24抗体相比较它的抗原结合活性降低了，但与以上变体a至c相比较则增高了，表示变体中第67、69、75和78位4个氨基酸中新改变的任一个与重构人抗体活性有关。
按以上就抗原结合活性的检测所述的方法评估重构人抗HM1.24抗体重链变体g。如图18和19中所示，显示此变体呈现至多与以上变体a相似水平的活性，表明如对于以上重链人-小鼠杂合抗体所示，此变体中转换的第40位氨基酸不负责重构人抗体活性的提高。
按以上就抗原结合活性和结合抑制活性的检测所述的方法评估重构人抗HM1.24抗体重链变体h至j。如图20、21、22和23中所示，结果显示与嵌合型抗HM1.24抗体相比较所有变体两种活性均较弱并与上文提及的f相似，表明变体f里新转换的4个氨基酸中第67和69位氨基酸不负责重构人抗体活性的提高。
按以上就抗原结合活性和结合抑制活性的检测所述的方法评估重构人抗HM1.24抗体重链变体k至p。如图24、25、26和27中所示，结果显示与嵌合型抗HM1.24抗体相比较所有变体两种活性均较弱并与上文所述h相似，表明在此6个变体中新转换的第80位及其后之氨基酸不负责重构人抗体活性的提高。
按以上就抗原结合活性和结合抑制活性的检测所述的方法评估重构人抗HM1.24抗体重链变体q。如图25和27中所示，结果显示与以上变体h或变体p相比较，此变体两种活性均较弱，且至多与上述变体a活性相似，表明第78位的氨基酸取代对重构人抗体活性的提高是必需的。
用以上提及的方法评估重构人抗HM1.24抗体的重链变体r。如图15和28中所示，结果显示变体r具有与嵌合型抗HM1.24抗体相似水平的抗原结合活性和结合抑制活性。
以上结果表明，为使重构人抗HM1.24抗体具有与小鼠抗HM1.24抗体或嵌合型抗HM1.24抗体相似水平的抗原结合活性，其所需最小转换是第30、71和78位及此外第73位氨基酸。
重构人抗HM1.24抗体重链变体a至r的抗原结合活性及结合抑制活性总结于表2中。
                          表2
  重链变体            抗原结合活性       结合抑制活性
      a                    +                  +
      b                    +                  +
      c                    +                  +
      d                    +                  未测
      e                    +                  未测
      f                    ++                 ++
      g                    +                  +
      h                    ++                 ++
      i                    ++                 ++
      j                    ++                 ++
      k                    ++                 ++
      l                    ++                 ++
      m                    ++                 ++
      n                    ++                 ++
      o                    ++                 ++
      p                    ++                 ++
      q                    +                  +
      r                    +++                +++
此外，重构人抗HM1.24抗体和轻链变体a和b的氨基酸序列如表3中所示，而重构人抗HM1.24抗体重链变体a至r的氨基酸序列如表4至6中所示。
                        表3
               轻链可变区的氨基酸序列
        FR1                     CDR1        FR2
               1         2          3          4
      12345678901234567890123 45678901234 567890123456789AHM       DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVNTAVA WYQQKPGQSPKLLIYHuSG I    DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC             WYQQKPGKAPKLLIYREI       DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC             WYQQKPGKAPKLLIYRVLa      ----------------------- ----------- ---------------RVLb      ----------------------- ----------- ---------------
       CDR2     FR3
      5          6         7         8
      0123456 78901234567890123456789012345678AHM       SASNRYT GVPDRITGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYCHuSG I            GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCREI               GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCRVLa      ------- --------------------------------RVLb      ------- --------------Y-----------------
        CDR3      FR4
       9         10
      901234567 8901234567AHM       QQHYSTPFT FGSGTKLEIKHuSG I              FGQGTKVEIKREI                 FGQGTKVEIKRVLa      --------- ----------RVLb      --------- ----------
                     表4
           重链可变区的氨基酸序列(1)
        FR1                           CDR1   FR2
               1         2         3           4
      123456789012345678901234567890 12345 67890123456789AHM       QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT PYWMQ WVKQRPGQGLEWIGHuSG I    EVQLVQSGADVKKPGXSVXVSCKASGYTFS       WVRQAPGXGLDWVGHG3       QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN       WVRQAPGQGLEWMGRVHa      -----------------------------T ----- --------------RVHb      -----------------------------T ----- --------------RVHc      -----------------------------T ----- --------------RVHd      -----------------------------T ----- --------------RVHe      -----------------------------T ----- --------------RVHf      -----------------------------T ----- --------------RVHg      -----------------------------T ----- ----R---------RVHh      -----------------------------T ----- --------------RVHi      -----------------------------T ----- --------------RVHj      -----------------------------T ----- --------------RVHk      -----------------------------T ----- --------------RVHl      -----------------------------T ----- --------------RVHm      -----------------------------T ----- --------------RVHn      -----------------------------T ----- --------------RVHo      -----------------------------T ----- --------------RVHp      -----------------------------T ----- --------------RVHq      -----------------------------T ----- --------------RVHr      -----------------------------T ----- --------------
                   表5
          重链可变区的氨基酸序列(2)
       CDR2              FR3
     5          6          7         8            9
     012A3456789012345 67890123456789012ABC345678901234AHM      SIFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSILAFEDSAVYYCARHuSG I                      RVTXTXDXSXNTAYMELSSLRSEDTAVYYCARHG3                        RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRVHa     ----------------- -----A--------------------------RVHb     ----------------- K----A--------------------------RVHc     ----------------- -----A-K------------------------RVHd     ----------------- K----A-K------------------------RVHe     ----------------- -A-L-A--------------------------RVHf     ----------------- -A-L-A---S--A-------------------RVHg     ----------------- -----A--------------------------RVHh     ----------------- K----A---S--A-------------------RVHi     ----------------- K----A---S--A-------AF----------RVHj     ----------------- KA-L-A---S--A-------------------RVHk     ----------------- K----A---S--A--Q----------------RVHl     ----------------- K----A---S--A--Q--I-------------RVHm     ----------------- K----A---S--A--Q--I-----S-------RVHn     ----------------- K----A---S--A-----I-------------RVHo     ----------------- K----A---S--A-----------S-------RVHp     ----------------- -----A------A-------------------RVHq     ----------------- -----A---S-----------------------RVHr     -----------------  ----A-K----A-------------------
                     表6
            重链可变区的氨基酸序列
                       CDR3         FR4
                         10              11
                      57890ABJK12  34567890123
            AHM       GLRRGGYYFDY  WGQGTTLTVSS
            HuSG I                 WGQGTLVTVSS
            JH6                    WGQGTTVTVSS
            RVHa      ----------- ------------
            RVHb      ----------- ------------
            RVHc      ----------- ------------
            RVHd      ----------- ------------
            RVHe      ----------- ------------
            RVHf      ----------- ------------
            RVHg      ----------- ------------
            RVHh      ----------- ------------
            RVHi      ----------- ------------
            RVHj      ----------- ------------
            RVHk      ----------- ------------
            RVHl      ----------- ------------
            RVHm      ----------- ------------
            RVHn      ----------- ------------
            RVHo      ----------- ------------
            RVHp      ----------- ------------
            RVHq      ----------- ------------
            RVHr      ----------- ------------3.纯化的重构人抗HM1.24抗体的评估
评估纯化的重构人抗HM1.24抗体的上述抗原结合活性和结合抑制活性。如图31和32所示，结果显示重构人抗HM1.24抗体具有与嵌合型抗HM1.24抗体相似水平的抗原结合活性和结合抑制活性。该事实表明重构人抗HM1.24抗体具有与小鼠抗HM1.24抗体相同的抗原结合活性。参考实施例12产生小鼠抗HM1.24单克隆抗体之杂交瘤的构建
按Goto，T.等人，血液(1994)84，1992-1930中所述方法制备生产小鼠抗HM1.24单克隆抗体的杂交瘤。
每6个星期给BALB/C小鼠(Charles River生产)腹膜内注射两次来自多发性骨髓瘤病人骨髓的EB病毒核抗原(EBNA)阴性浆细胞系KPC-32(1×107细胞)(Goto，T.等人，Jpn.J.Clin.Hematol.(1991)32，1400)。
为了进一步提高抗体生产量，在处死动物前3天将1.5×106KPC-32细胞注射入小鼠脾(Goto，T.等人，Tokushima J.Exp.Med.(1990)37，89)。处死小鼠后，取出脾，将按Groth，de St.&Schreidegger(癌症研究(1981)41，3465)获得的脾细胞用于与骨髓瘤细胞SP2/O进行细胞融合。
用KPC-32细胞包被平板通过ELISA(Posner，M.R.等人，免疫学方法杂志(1982)48，23)筛选杂交瘤培养物上清中的抗体。将5×104KPC-32细胞悬浮于50ml的PBS中并分配于96孔板中(U-底，Corning，Iwaki生产)。用含1％牛血清清蛋白(BSA)的PBS封闭后，加入杂交瘤上清液并于4℃保温2小时。随后，将过氧化物酶标记抗小鼠IgG山羊抗体(Zymed生产)4℃反应1小时，洗涤一次，与邻苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite生产)室温反应30分钟。
用2N硫酸终止反应后，用ELISA读数器(Bio-Rad生产)检测492nm处吸光度。为了除去生产抗人免疫球蛋白抗体的杂交瘤，阳性杂交瘤培养物上清液先已吸附至人血清上，并筛选它对其它亚细胞组分的反应性。选择阳性杂交瘤，用流式细胞仪分析它们对多种细胞系和人样品的反应活性。将最后选择的杂交瘤克隆克隆两次，注射入降植烷处理过的BALB/C小鼠腹腔，然后从中收获腹水。
用硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析试剂盒(Ampure PA，Amersham生产)从小鼠腹水中纯化单克隆抗体。用Quick Tag FITC偶联试剂盒(Boehringer Mannheim生产)将纯化的抗体偶联至异硫氰酸荧光素上。
结果由30个杂交瘤克隆产生的单克隆抗体可与KPC-32和RPMI8226细胞反应。克隆后，分析这些杂交瘤上清液与其它细胞系和来自外周血的单核细胞的反应性。
在它们之中，有3个克隆是与浆细胞特异反应的单克隆抗体。从这三个克隆中，挑选出具有用流速细胞仪分析最有效并有补体依赖性细胞毒性之克隆的杂交瘤克隆，并称之为HM1.24。用亚型特异性抗小鼠兔抗体(Zymed生产)通过ELISA测定此杂交瘤产生的单克隆抗体的亚型。抗HM1.24抗体属于IgG2aκ亚型。产生抗HM1.24抗体的杂交瘤于1995年9月14日根据布达佩斯条约保藏于国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术机构，MITI(Higashi 1-Chome 1-3，Tsukuba城，Ibaraki区，日本)，保藏号为FERM BP-5233。参考实施例13编码HM1.24抗原多肽之cDNA的克隆1.cDNA文库的构建1)总RNA的制备
将编码小鼠单克隆抗体HM1.24所特异识别的抗原多肽HM1.24抗原之cDNA分离如下。
按Chirgwin等人(生物化学，18，5294(1979))的方法从人多发性骨髓瘤细胞系KPMM2中制备总RNA。这样，将2.2×108KPMM2细胞完全匀浆于20ml 4M异硫氰酸胍(Nacalai Tesque Inc.生产)中。
将匀浆物置于离心管中的5.3M氯化铯层上成层，然后用BeckmanSW40转头在31,000rpm 20℃离心24小时以沉淀RNA。用70％乙醇洗涤RNA沉淀并溶于300μl含1mM EDTA和0.5％SDS的10mM Tris-HCl(pH7.4)中。在其中加入终浓度0.5mg/ml的链霉蛋白酶(Boehringer生产)后，37℃保温30分钟。用酚和氯仿抽提混合物以沉淀RNA。然后，将RNA沉淀溶于200μl含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.4)中。2)poly(A)+RNA的制备
用约500μg如上制备之总RNA为原材料，按试剂盒所附指示用Fast Track 2.0m RNA分离试剂盒(Invitrogen生产)纯化poly(A)+RNA。3)cDNA文库的构建
以10μg上述poly(A)+RNA为原材料，用cDNA合成试剂盒Timesaver cDNA合成试剂盒(Pharmacia生产)按试剂盒所附指示合成双链cDNA，并用Directional Cloning Toolbox(Pharmacia生产)按试剂盒所附指示将EcoR I衔接子连接其上。按试剂盒所附指示进行EcoR I衔接子的激酶处理和限制酶Not I消化。此外，用1.5％琼脂糖凝胶(SIGMA生产)分离和纯化大小约500bp或更大的衔接子连接双链cDNA，以获得约40μl衔接子连接双链cDNA。
用事先已用限制酶EcoR I和Not I及碱性磷酸酶(Takara Shuzo生产)处理的pCOS1载体(日本未审专利申请公开(Kokai)号8(1996)-255196)和T4 DNA连接酶(GIBCO BRL生产)连接由此制备的衔接子连接双链cDNA，以构建cDNA文库。将该构建的cDNA文库转导入大肠杆菌菌株DH5(GIBCO BRL生产)，其总大小估计约为2.5×106个独立细胞。2.通过直接表达进行克隆
通过将约5×105个克隆的上文转导之大肠杆菌培养于含50μg/ml氨苄青霉素的2-YT培养基(分子克隆：实验室手册，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社，(1989))中扩增cDNA，并用碱法从大肠杆菌中回收质粒DNA(分子克隆：实验室手册，Sambrook等人，冷泉港实验室出版社，(1989))。用基因脉冲装置(BioRad生产)通过电穿孔将所获质粒DNA转染入COS-7细胞。
这样，将10μg纯化质粒DNA加入以1×107个细胞/ml浓度悬浮于PBS的0.8ml COS-7细胞中，并于1500V和电容25μF进行脉冲。室温10分钟的恢复期后，将电穿孔细胞在补充有10％胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO BRL生产)中于37℃和5％二氧化碳条件下培养3天。2)淘选皿的制备
用B.Seed等人(美国国家科学院院报，84，3365-3369(1987))的方法制备以小鼠抗HM1.24抗体包被的淘选皿。如此，将小鼠抗HM1.24抗体加入50mM Tris-HCl，pH9.5中至浓度为10μg/ml。将3ml由此制备的抗体溶液加入直径60mm的组织培养皿中并室温保温2小时。用含0.15M NaCl的PBS洗涤3次后，加入5％胎牛血清、1mM EDTA和0.02％NaN3，封闭后，用于以下克隆过程。3)cDNA文库的克隆
用含5mM EDTA的PBS分离如上所述转染的COS-7细胞，然后用含5％胎牛血清之PBS洗一次。然后将其悬浮于含5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS中至浓度为约1×106细胞/ml，将它加入如上制备的淘选皿中并室温保温2小时。用含5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS洗3次后，用含0.6％SDS和10mM EDTA的溶液从结合于淘选皿的细胞中回收质粒DNA。
将回收的质粒DNA再次转导入大肠杆菌DH5α。如上扩增质粒DNA后，用碱法将其回收。用电穿孔方法将回收质粒DNA转染入COS-7细胞中，以从上述结合细胞中回收质粒DNA。再重复此同一步骤一次，用限制酶EcoR I和Not I消化回收的质粒DNA。结果进一步确定了约0.9kbp大小的插入物的浓度。将以部分回收质粒DNA转导的50μg大肠杆菌接种于含50μg/ml氨苄青霉素的2-YT琼脂板上。培养过夜后，回收单菌落所含质粒DNA。用限制酶EcoR I和Not I消化，得到具0.9kbp插入物的克隆p3.19。
用PRISM，终止子循环测序试剂盒(Perkin Elmer生产)按试剂盒所附指示通过反应测定此克隆的碱基序列。氨基酸序列及其碱基序列如SEQ ID NO：128中所示。
将编码具如SEQ ID NO：128中所述氨基酸序列之多肽的cDNA插入pUC19载体的Xba I裂解位点，制备为质粒pRS38-pUC19。含此质粒pRS38-pUC19的大肠杆菌为大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)已于1993年10月5日根据布达佩斯条约国际保藏于生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术机构，MITI(Higashi 1-Chome 1-3，Tsukuba city，Ibaraki区，日本)作，保藏号为FERM BP-4434(参阅日本未审专利申请公开(Kokai)号7(1995)-196694)。实施例
作为含本发明天然FR序列之天然人源化抗体的实例，描述了基于人源化抗HM1.24抗体之天然人源化抗体的制备实例。实施例1
象重构人抗HM1.24抗体一样如参考实施例中所述用CDR移植法将小鼠单克隆抗HM1.24抗体人源化。选择人抗体HG3的各FR作为FR1至FR3，人抗体JH6的FR4为FR4，用于人源化重链的构建。FR氨基酸残基研究结果表明在4个位点(FR1/30，FR3/71，73，78)需要氨基酸取代。此人源化抗体具有与起始抗体相似的抗原结合活性。此人源化抗体(含RVLa/RVHr的人源化抗体)被用作初级设计抗体。
                      天然人源化抗体可变区的设计A)轻链                FR1                     CDR1        FR2            CDR2
                         1         2          3          4          5HM1.24              12345678901234567890123 45678901234 567890123456789 0123456HuSG I              DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVNTAVA WYQQKPGQSPKLLIY SASNRYTREI                 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC             WYQQKPGKAPKLLIY
                DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC             WYQQKPGKAPKLLIY初级设计(RVLa)      ----------------------- ----------- --------------- -------二级设计            ----------------------- ----------- --------------- -------
                  FR3                              CDR3      FR4
                   6         7         8          9         10HM1.24              78901234567890123456789012345678 901234567 8901234567HuSG I              GVPDRITGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYC QQHYSTPFT FGSGTKLEIKREI                 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC           FGQGTKVEIK
                GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC           FGQGTKVEIK初级设计(RVLa)      -------------------------------- --------- ----------二级设计            -------------------------------- --------- ----------
                 天然人源化抗体可变区的设计B)重链               FR1                           CDR1   FR2            CDR2
                         1         2         3           4          5          6HM1.24              123456789012345678901234567890 12345 67890123456789 012A3456789012345HuSGI               QVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT PYWMQ WVKQRPGQGLEWIG SIFPGDGDTRYSQKFKGHG3                 EVQLVQSGADVKKPGXSVXVSCKASGYTFS       WVRQAPGXGLDWVG
                QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN       WVRQAPGQGLEWMG初级设计(RVHr)      -----------------------------T ----- -------------  ----------------二级设计(2ndRVH)
                -----------------------------T ----- -------------- ----------------
                 FR3                             CDR3          FR4
                    7         8            9        10             11HM1.24              67890123456789012ABC345678901234 57890ABJK12 34567890123HuSG I              KATLTADKSSSTAYMQLSILAFEDSAVYYCAR GLRRGGYYFDY WGQGTTLTVSSHG3/JH6             RVTXTXDXSXNTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR             WGQGTLVTVSS
                RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAR             WGQGTTVTVSS初级设计(RVHr)      -----A-K----A------------------- ----------- -----------二级设计(2ndRVH)    ---I-A-K----A------------------- ----------- -----------
(1)重链的构建
对于初级设计抗体的FR，用诸如SeissPlot、GenBank、PRF、PIR和GenPept之类的数据库对自然中发现的人FR进行同源性检索。首先为FR1找到了50个具有完全匹配氨基酸序列的人FR。因而，初级设计抗体的FR1已有天然序列。因为对FR2和FR4未进行氨基酸取代，所以找到了各50个和100个天然FR，分别包括天然人抗体HG3和JH6。
另一方面，发现对FR3无完全的匹配。作为具有最高同源性的FR3，发现具有96.875％的同源性的S46463，1921296C，HUMIGHRF1，U005831等等(符号是数据库的所有登记号)。
因而，在初级设计抗体中，FR3是含自然中未找到之人工氨基酸残基的FR。此氨基酸序列与具有最高同源性的人抗体S46463相比较于表9中。
初级设计抗体的FR3
S46463抗体的FR3
第70位的氨基酸残基在初级设计抗体FR3中是甲硫氨酸，在人抗体S46463 FR3中是异亮氨酸。其它氨基酸序列已显示完全匹配。因此，用异亮氨酸置换初级设计抗体中第70位的氨基酸残基以将其转换为天然FR3。从而，所获二级设计抗体是含人抗体S46463之天然人FR的CDR-移植抗体。因此构建的二级设计抗体含有均在自然界中存在的FR。
(2)天然人源化抗HM1.24抗体重链可变区的构建
用PCR通过诱变构建天然人源化抗HM1.24抗体重链可变区。设计诱变引物SS(SEQ ID NO：124)和SA(SEQ ID NO：125)以将第69位甲硫氨酸突变为异亮氨酸。
用质粒HEF-RVHr-AHM-gγl为模板扩增以上引物后，纯化终产物，用BamH I和HindIII消化，将获得的DNA片段克隆入表达载体HEF-VH-gγl得到质粒HEF-RVHs-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHs-AHM-gγl中所含重链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO：126中所示。
用限制酶HindIII和BamH I消化编码上述质粒HEF-RVHs-AHM-gγl可变区的区域以制备限制片段。将其插入质粒载体pUC19的BamH I和HindIII位点。所获质粒称pUC19-RVHs-AHM-gγl。
含pUC19-RVHs-AHM-gγl的大肠杆菌被称为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)，并已于1997年9月29日根据布达佩斯条约国际保藏于国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术机构，MITI(Higashi 1-Chome 1-3，Tsukuba city，Ibaraki区，日本)，保藏号为FERM BP-6127。
2)轻链的分析
尽管在初级设计抗体轻链的构建中未置换FR的氨基酸，对这些FR也进行了同源性检索，因为所用人抗体是已进行氨基酸取代的重构FR(Riechmann，L.等人，自然(1988)332，323-327)。结果证实了有与重构FR相应的天然序列存在。因此，这证明了对轻链FR无需氨基酸取代。实施例2天然人源化抗HM1.24抗体的生产(1)天然人源化抗HM1.24抗体的表达
用基因脉冲装置(BioRad生产)通过电穿孔将天然人源化抗HM1.24抗体重链表达载体(HEF-RVHs-AHM-gγl)和重构人抗HM1.24抗体轻链表达载体(HEF-RVLa-AHM-gκ)各10μg共转化入COS细胞。将各DNA(10μg)加入于PBS中1×107细胞/ml的0.8ml等份试样中，在1500V和电容25μF进行脉冲。
室温10分钟的恢复期后，将电穿孔细胞加入含10％无γ球蛋白胎牛血清的30ml DHEM培养液(GIBCO生产)中。在二氧化碳培养箱BNA120D(TABAI生产)中于37℃和5％二氧化碳条件下培养72小时后，收集培养物上清液，在装备有离心机转头03(HITACHI生产)的离心机505PR-22(HITACHI生产)中1000rpm离心5分钟除去细胞碎片。然后用装备有离心机转头JA-20.1(BECKMAN生产)的离心机J2-21(BECKMAN生产)在2000rpm的条件下与微量浓缩器(Centricon 100，Amicon生产)一起进行超滤，并用滤器Milex GV 13mm(Millipore生产)进行过滤除菌以获得用于细胞-ELISA的产物。(2)抗体浓度的检测
用ELISA检测所获抗体浓度。往96孔ELISA皿(Maxisorp，NUNC生产)的每一孔中加入用包被缓冲液(0.1M NaHCO3，0.02％NaN3，pH9.6)制备成1μg/ml浓度的100μl山羊抗人IgG抗体(BIO SOURCE生产)，并将该平皿室温保温1小时。用100μl稀释缓冲液(50mM Tris-HCl，1mM MgCl2，0.15M NaCl，0.05％ Tween 20，0.02％ NaN3，1％牛血清清蛋白(BSA)，pH8.1)封闭后，将天然人源化抗HM1.24抗体连续稀释液每种浓度各100μl加入每一孔中，并将平皿室温保温1小时。随之洗涤后，加入100μl碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG抗体(DAKO生产)。
室温保温1小时并洗涤后，加入100μl 1mg/ml溶于底物缓冲液(50mM碳酸氢钠，10mM氯化镁，pH9.8)的底物溶液(Sigma 104，对硝基苯磷酸盐，SIGMA生产)，然后用微量平皿读数器3550型(BioRad生产)检测405nm处吸光度。用人IgG1κ(The Binding Site生产)作为浓度检测的标准。(3)稳定生产天然人源化抗HM1.24抗体的CHO细胞系的建立
稳定生产天然人源化抗HM1.24抗体的CHO细胞系可按以下方法建立。
(3)-1.天然人源化抗HM1.24抗体重链表达载体的构建
以限制酶Pvu I和BamH I消化质粒HEF-RVHs-AHM-gγl，用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化含编码EF1启动子和天然人源化抗HM1.24抗体重链可变区之DNA的约2.8kbp片段。然后，将以上DNA片段插入通过用Pvu I和BamH I消化用作人重链表达载体的表达载体DHFR-ΔE-RVh-PMlf(国际专利申请公开号WO 92-19759)而制备的约6kbp片段中，此表达载体含DHFR基因和编码人重链恒定区的基因，结果是构建了天然人源化抗HM1.24抗体重链表达载体DHFR-ΔE-HEF-RVHs-AHM-gγl。
(3)-2.将基因引入CHO细胞
为了建立天然人源化抗HM1.24抗体的稳定生产系统，用电穿孔方法在与上述例子(转导入上述COS-7细胞)相似的条件下将通过Pvu I消化而线性化的上述表达载体DHFR-ΔE-RVHs-AHM-gγl和HEF-RVLa-AHM-gκ的基因同时引入CHO细胞DXB-11中。
(3)-3.用MTX进行基因扩增
在引入基因的CHO细胞中，只有轻链和重链表达载体均已引入的那些CHO细胞可生存于加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)和10％胎牛血清的无核苷α-MEM培养液(GIBCO-BRL生产)中，因此将它们选择出来。随后，将10nM MTX(Sigma生产)加入以上培养物中。在增殖的克隆中，选择那些大量生产天然人源化抗HM1.24抗体的克隆。
(3)-4.天然人源化抗HM1.24抗体的构建
按以下方法生产天然人源化抗HM1.24抗体。用已加入含10％无γ球蛋白胎牛血清(GIBCO-BRL生产)和500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)的无核苷α-MEM培养基(GIBCO-BRL生产)将上述产生天然人源化抗HM1.24抗体的CHO细胞在二氧化碳培养箱BNAS120D(TABAI生产)中于37℃和5％二氧化碳条件下培养10天。在开始培养后的第8和第10天回收培养基，用装备有TS-9转头的离心机RL-500SP(Tomy Seiko生产)于2000rpm离心10分钟去除细胞碎片，然后用具有孔直径为0.45μm的膜的瓶顶滤器(FALCON生产)过滤除菌。
将等量PBS(-)加入产生天然人源化抗HM1.24抗体之CHO细胞的培养液中后，用高速抗体纯化系统ConSep LC100(MILLIPORE生产)和Hyper D蛋白A柱(Nippon Gaishi生产)亲和纯化天然人源化抗HM1.24抗体，其中用PBS(-)为吸附缓冲液，0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)为洗脱缓冲液，按所附指示进行。立即加入1M Tris-HCl(pH8.0)调节洗脱级分至约pH7.4，然后用离心超滤浓缩器Centriprep 10(MILLIPORE生产)进行浓缩和更换成PBS(-)缓冲液，并用孔径0.22μm的膜滤器MILLEX-GV(MILLIPORE生产)将产物过滤除菌以获得纯化的天然人源化抗HM1.24抗体。通过280nm处吸光度检测并按每1.35 OD为1μg/ml计算纯化抗体的浓度。实施例3  天然人源化抗HM1.24抗体活性的测定
评估天然人源化抗HM1.24抗体的以下抗原结合活性、结合抑制活性和ADCC活性。
(1)抗原结合活性和结合抑制活性的测量方法
(1)-1.抗原结合活性的检测
用WICH细胞通过细胞-ELISA检测抗原结合活性。如上参考实施例7.1-2所述制备细胞ELISA平皿。
封闭后，将获自COS-7细胞培养物上清液浓缩物的100μl连续稀释天然人源化抗HM1.24抗体加入每一孔中。室温保温2小时并洗涤后，加入过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体(DAKO生产)。室温保温2小时并洗涤后，加入底物溶液并温育。然后加入50μl6N硫酸终止反应，用微量平皿读数器3550型(Bio-Rad生产)检测490nm处吸光度。
(1)-2.结合抑制活性的检测
用WISH细胞通过细胞-ELISA检测生物素标记小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性。细胞-ELISA平皿制备如上。封闭后，将获自COS-7细胞培养物上清液浓缩物的连续稀释天然人源化抗HM1.24抗体50μl加入每一孔中，同时加入50μl 2μg/ml生物素标记小鼠抗HM1.24抗体。室温保温两小时并洗涤后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素(DAKO生产)。室温保温1小时并洗涤后，加入50μl 6N硫酸终止反应，用微量平板读数器3550型(Bio-Rad生产)检测490nm处的吸光度。
(2)抗原结合活性和结合抑制活性
通过结合上述轻链变体a测量上述抗原结合活性和结合抑制活性，进行天然人源化抗HM1.24抗体重链的评估。如图29和30中所示，结果表明天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)具有与初级设计抗体(重构人抗HM1.24抗体：重链变体r)相似程度的抗原结合活性和结合抑制活性。
(3)ADCC活性的检测
按参考实施例8所述方法检测ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性。
1.效应细胞的制备
往建康人受试验者外周血中加入等量PBS(-)，在其上加Ficoll-Paque(Pharmacia生产)分层，再500g离心30分钟。从中取单核细胞层并用补充有10％胎牛血清(GIBCO BRL生产)的RPMI 1640(GIBCO BRL生产)洗两次，用相同的培养液调节至5×106/ml的细胞密度。
2.靶细胞的制备
通过在补充有10％胎牛血清(GIBCO BRL生产)的RPMI1640(GIBCOBRL生产)中与0.1mCi 51Cr-铬酸钠37℃温育60分钟，将人骨髓瘤细胞系KPMM2(保藏号P-14170，专利申请号6-58082)进行放射性标记。放射性标记后，用相同缓冲液洗细胞3次并调至浓度为2×105/ml。
3.ADCC试验的检测
往96孔U-底平板(Corning生产)中加入50μl 2×105靶细胞/ml和事先制备的4μg/ml、0.4μg/ml、0.04μg/ml和0.004μg/ml抗体溶液50μl，4℃反应15分钟。相似地制备不含天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)的溶液，用作对照。
然后，往其中加入100μl 5×105效应细胞/ml，在二氧化碳培养箱中培养4小时，其中效应细胞(E)对靶细胞(T)的比率(E∶T)设为0∶1，20∶1和50∶1。鉴于每种抗体的终浓度均为4倍稀释，它们的浓度分别是1μg/ml、0.1μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml以及无抗体加入对照。
取100μl上清液并用γ计数器(ARC316，Aloka生产)检测释放入培养物上清液的放射性。为测量最大放射性，使用1％NP-40(NacalaiTesque Inc.生产)。用(A-C)/(B-C)×100计算细胞毒性(％)，其中A是抗体存在时释放的放射性(cpm)，B是NP-40释放的放射性(cpm)，C是无抗体时由培养基释放的放射性(cpm)。
4.结果
如图33所示，加入天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)时，与无抗体加入的对照相比较，特异铬释放率依赖于抗体浓度而随E∶T比率增加而增加。因此，这表明此天然人源化抗HM1.24抗体(二级设计抗体)有ADCC活性。
本发明涉及制备天然人源化抗体的方法和用该制备方法获得的天然人源化抗体。这是一种解决G.Winter创造之CDR移植法(Jones，P.T.等人，自然(1986)321，522-525)相关问题的非常优秀的人源化技术。初级设计抗体的构建可看作是含天然人FR之人源化抗体构建的中间阶段。当开发抗体作为含重组蛋白质的药用产品时，从抗原性和安全性方面来说含天然人FR的天然人源化抗体是更好的。
发明效果
因为用本发明制备方法获得的天然人源化抗体不含有用常规人源化技术生产之人源化抗体中所含的非天然的人工FR氨基酸残基，故预计它具有更低抗原性。此外，已显示用本发明制备方法获得的天然人源化抗体具有与用作人源化模板的来自非人哺乳动物的抗体相似的活性。因此，用本发明制备方法获得的天然人源化抗体可治疗性地应用于人类。
有关按专利合作条约第13-2条保藏的微生物及保藏机构名称的内容如下：保藏机构名称：国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术机构地址：1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-Shi，Ibaraki，日本生物(1)
命名：大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)
登记号：FERM BP-4434
保藏日期：1993年10月5日生物(2)
命名：杂交瘤HM1.24
登记号：FERM BP-5233
保藏日期：1995年9月14日生物(3)
命名：大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)
登记号：FERM BP-5643
保藏日期：1996年8月29日生物(4)
命名：大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24H-gγl)
登记号：FERM BP-5644
保藏日期：1996年8月29日生物(5)
命名：大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)
登记号：FERM BP-5645
保藏日期：1996年8月29日生物(6)
命名：大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)
登记号：FERM BP-6127
保藏日期：1997年9月29日
                       序列表(100)Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha(120)天然人源化抗体(130)F885/PCT(150)JP 9-271726(151)1997-10-03(160)129(210)1(211)394(212)DNA(213)小鼠(223)编码抗HM1.24抗体轻链可变区的cDNA(400)1atg ggc ttc aag atg gag tca cat ttt ctg gtc ttt gta ttc gtg ttt         48Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Phe Leu Val Phe Val Phe Val Phe
            -20                 -15                 -10ctc tgg ttg tct ggt gtt gac gga gac att gtg atg acc cag tct cac         96Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His
         -5              -1   1               5aaa ttc atg tcc aca tca gta gga gac agg gtc agc atc acc tgc aag        144Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys
 10                  15                  20gcc agt cag gat gtg aat act gct gta gcc tgg tat caa caa aaa cca        192Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro25                  30                  35                  40gga caa tcg cct aaa cta ctg att tac tcg gca tcc aac cgg tac act        240Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
             45                  50                  55gga gtc cct gat cgc atc act ggc agt gga tct ggg acg gat ttc act        288Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
         60                  65                  70ttc acc atc agc agt gtg cag gcg gaa gac ctg gca ctt tat tac tgt        336Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys
     75                  80                  85cag caa cat tat agt act cca ttc acg ttc ggc tcg ggg aca aag ttg        384Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
 90                  95                 100gaa ata aaa c                                                          394Glu Ile Lys105(210)2(211)131(212)PRT(213)小鼠(223)小鼠抗HM1.24抗体轻链可变区的氨基酸序列(400)2Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Phe Leu Val Phe Val Phe Val Phe
            -20                 -15                 -10Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His
         -5              -1   1               5Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys
 10                  15                  20Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro25                  30                  35                  40Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
             45                  50                  55Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
         60                  65                  70Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys
     75                  80                  85Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu
 90                  95                 100Glu Ile Lys105(210)3(211)418(212)DNA(213)小鼠(223)编码小鼠抗HM1.24抗体重链可变区的cDNA(400)3atg gaa tgt aac tgg ata ctt cct ttt att ctg tca gta act tca ggt         48Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly
            -15                 -10                  -5gcc tac tca cag gtt caa ctc cag cag tct ggg gct gag ctg gca aga         96Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg
     -1   1               5                  10cct ggg gct tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30                 35                  40                  45gaa tgg att ggg tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gca gat aaa tcc tcc agt        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg caa ctc agc atc ttg gca ttt gag gac tct gcg gtc        336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gca aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g                           418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)4(211)139(212)PRT(213)小鼠(223)小鼠抗HM1.24抗体重链可变区的氨基酸序列(400)4Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly
            -15                 -10                  -5Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg
     -1   1              5                   10Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Sar
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
         65                  70                  75Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)5(211)11(212)人工序列(220)抗HM1.24抗体轻链可变区的CDR(1)(223)(400)5Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala1               5                  10(210)6(211)7(212)人工序列(220)抗HM1.24抗体轻链可变区的CDR(2)(223)(400)6Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr1               5(210)7(211)9(212)人工序列(220)抗HM1.24抗体轻链可变区的CDR(3)(223)(400)7Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr1               5(210)8(211)5(212)人工序列(220)抗HM1.24抗体重链可变区的CDR(1)(223)(400)8Pro Tyr Trp Met Gln1               5(210)9(211)16(212)PRT(220)抗HM1.24抗体重链可变区的CDR(2)(223)(400)9Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly1               5                  10                  15(210)10(211)11(212)PRT(220)抗HM1.24抗体重链可变区的CDR(3)(223)(400)10Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr1               5                  10(210)11(211)379(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化轻链可变区的DNA(223)(400)11atg gga tgg agc tgt atc atc ctc tcc ttg gta gca aca gct aca ggt         48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
            -15                 -10                 -5gtc cac tcc gac atc cag atg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc         96Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
     -1   1               5                  10agc gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aag gct agt cag gat gtg        144Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
 15                  20                  25aat act gct gta gcc tgg tac cag cag aag cca gga aag gct cca aag        192Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys30                  35                  40                  45ctg ctg atc tac tcg gca tcc aac cgg tac act ggt gtg cca agc aga        240Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
             50                  55                  60ttc agc ggt agc ggt agc ggt acc gac ttc acc ttc acc atc agc agc        288Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
         65                  70                  75ctc cag cca gag gac atc gct acc tac tac tgc cag caa cat tat agt        336Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser
     80                  85                  90act cca ttc acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa c              379Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
 95                 100                 105(210)12(211)126(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化轻链可变区(223)(400)12Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
            -15                 -10                  -5Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
     -1   1              5                   10Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
 15                  20                  25Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys30                  35                  40                  45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
             50                  55                  60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser
         65                  70                  75Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser
     80                  85                  90Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
 95                 100                 105(210)13(211)379(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化轻链可变区的DNA(223)(400)13atg gga tgg agc tgt atc atc ctc tcc ttg gta gca aca gct aca ggt         48Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
            -15                 -10                  -5gtc cac tcc gac atc cag atg acc cag agc cca agc agc ctg agc gcc         96Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
     -1   1               5                  10agc gtg ggt gac aga gtg acc atc acc tgt aag gct agt cag gat gtg        144Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
 15                  20                  25aat act gct gta gcc tgg tac cag cag aag cca gga aag gct cca aag        192Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys30                  35                  40                  45ctg ctg atc tac tcg gca tcc aac cgg tac act ggt gtg cca agc aga        240Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
             50                  55                  60ttc agc ggt agc ggt agt ggt acc gac tac acc ttc acc atc agc agc        288Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser
         65                  70                  75ctc cag cca gag gac atc gct acc tac tac tgc cag caa cat tat agt        336Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser
     80                  85                  90act cca ttc acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa c              379Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
 95                 100                 105(210)14(211)126(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化轻链可变区(223)(400)14Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Ser Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
            -15                 -10                  -5Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
     -1   1               5                 10Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val
 15                  20                  25Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys30                  35                  40                  45Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg
             50                  55                  60Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser
         65                  70                  75Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser
     80                  85                  90Thr Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
 95                 100                 105(210)15(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体a)的DNA(223)(400)15atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atg acc gca gac acg tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)16(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体a)(223)(400)16Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)17(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体b)的DNA(223)(400)17atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gtc acc atg acc gca gac acg tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)18(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体b)(223)(400)18Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)19(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体重链可变区(变体c)的DNA(223)(400)19atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
    -1    1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc act atg acc gca gac aag tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)20(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的重链可变区(变体c)(223)(400)20Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)21(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体d)的DNA(223)(400)21atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gtc acc atg acc gca gac aag tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)22(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的重链可变区(变体d)(223)(400)22Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)23(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体e)的DNA(223)(400)23atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gcc acc ctg acc gca gac acg tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)24(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的重链可变区(变体e)(223)(400)24Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Va1 Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
    -1    1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)25(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体f)的DNA(223)(400)25atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gcc acc ctg act gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)26(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体f)(223)(400)26Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)27(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体g)的DNA(223)(400)27atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag cgc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atg acc gca gac acg tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Set Ser110                 115                 120(210)28(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体g)(223)(400)28Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)29(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体h)的DNA(223)(400)29atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gtc acc atg acc gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
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     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
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     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gcc acc ctg act gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)35(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体k)的DNA(223)(400)35atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
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         65                  70                  75aca gcc tac atg cag ctg agc agc cta aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
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            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gtc acc atg acc gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg cag ctg agc atc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
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            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)39(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体m)的DNA(223)(400)39atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gtc acc atg acc gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg cag ctg agc atc ctg aga tct gag gac tcg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val
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 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
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             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aaa gtc acc atg acc gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac tcg gcc gta        336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)44(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体o)(223)(400)44Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
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     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atg acc gca gac acg tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)47(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体q)的DNA(223)(400)47atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atg acc gca gac acg tcc tcg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
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            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
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 15                 20                   25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
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         65                  70                  75aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)50(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体r)(223)(400)50Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)51(211)40(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)51actagtcgac atgaagttgc ctgttaggct gttggtgctg                       40(210)52(211)39(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)52actagtcgac atggagwcag acacactcct gytatgggt                        39(210)53(211)40(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)53actagtcgac atgagtgtgc tcactcaggt cctggsgttg                       40(210)54(211)43(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)54actagtcgac atgaggrccc ctgctcagwt tyttggmwtc ttg                   43(210)55(211)40(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)55actagtcgac atggatttwc aggtgcagat twtcagcttc                       40(210)56(211)37(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)56actagtcgac atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrgg                          37(210)57(211)41(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)57actagtcgac atgggcwtca agatggagtc acakwyycwg g                     41(210)58(211)41(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)58actagtcgac atgtggggay ctktttycmm tttttcaatt g                     41(210)59(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)59actagtcgac atggtrtccw casctcagtt ccttg                            35(210)60(211)37(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)60actagtcgac atgtatatat gtttgttgtc tatttct                         37(210)61(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)61actagtcgac atggaagccc cagctcagct tctcttcc                         38(210)62(211)27(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)62ggatcccggg tggatggtgg gaagatg                                     27(210)63(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)63tagagtcacc gaggagccag ttgta                                       25(210)64(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)64ggatcccggg agtggataga ccgatg                                      26(210)65(211)34(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)65gataagcttc caccatgggc ttcaagatgg agtc                             34(210)66(211)34(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)66gataagcttc caccatggaa tgtaactgga tact                             34(210)67(211)34(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)67ggcggatcca ctcacgtttt atttccaact ttgt                             34(210)68(211)34(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)68ggcggatcca ctcacctgag gagactgtga gagt                             34(210)69(211)18(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)69cagacagtgg ttcaaagt                                               18(210)70(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)70gaattcggat ccactcacgt ttgatt                                      26(210)71(211)48(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)71agtcaggatg tgaatactgc tgtagcctgg taccagcaga agccagga              48(210)72(211)39(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)72gcatccaacc ggtacactgg tgtgccaagc agattcagc                        39(210)73(211)45(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)73caacattata gtactccatt cacgttcggc caagggacca aggtg                 45(210)74(211)47(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)74gcagtattca catcctgact ggccttacag gtgatggtca ctctgtc               47(210)75(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)75acaccagtgt accggttgga tgccgagtag atcagcag                         38(210)76(211)41(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)76gtgaatggag tactataatg ttgctggcag tagtaggtag c                     41(210)77(211)31(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)77ggtaccgact acaccttcac catcagcagc c                                31(210)78(211)31(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)78ggtgaaggtg tagtcggtac cgctaccgct a                                    31(210)79(211)144(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)79atgccttgca ggaaaccttc actgaggccc caggcttctt cacctcagcc  ccagactgca    60ccagctgcac ctgggagtga gcacctggag ctacagccag caagaagaag accctccagg    120tccagtccat ggtggaagct tatc                                           144(210)80(211)130(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)80tcagtgaagg tttcctgcaa ggcatctgga tacaccttca ctccctactg gatgcagtgg     60gtgcgacagg cccctggaca agggcttgag tggatgggat ctatttttcc tggagatggt    120gatactaggt                                                           130(210)81(211)131(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)81aatacacggc cgtgtcctca gatctcaggc tgctcagctc catgtagact gtgctcgtgg     60acgtgtctgc ggtcatggtg actctgccct tgaacttctg actgtaccta gtatcaccat    120ctccaggaaa a                                                         131(210)82(211)119(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)82gagatctgag gacacggccg tgtattactg tgcgagagga ttacgacgag gggggtacta     60ctttgactac tgggggcaag ggaccacggt caccgtctcc tcaggtgagt ggatccgac     119(210)83(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)83gataagcttc caccatggac tggac                                           25(210)84(211)25(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)84gtcggatcca ctcacctgag gagac                                           25(210)85(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)85aagttcaagg gcaaagtcac catgac                                      26(210)86(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)86gtcatggtga ctttgccctt gaactt                                      26(210)87(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)87atgaccgcag acaagtccac gagcac                                      26(210)88(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)88gtgctcgtgg acttgtctgc ggtcat                                      26(210)89(211)47(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)89aagttcaagg gcaaagtcac catgaccgca gacaagtcca cgagcac               47(210)90(211)47(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)90gtgctcgtgg acttgtctgc ggtcatggtg actttgccct tgaactt               47(210)91(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)91aagttcaagg gcagagccac cctgaccgca gacacgtc                         38(210)92(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)92gacgtgtctg cggtcagggt ggctctgccc ttgaactt                             38(210)93(211)18(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)93cagacagtgg ttcaaagt                                                   18(210)94(211)17(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)94gccccaaagc caaggtc                                                    17(210)95(211)23(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)95atttttcctg gagatggtga tac                                             23(210)96(211)23(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)96gtatcaccat ctccaggaaa tat                                             23(210)97(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(天然/变体a混合体)
 的DNA(223)(400)97atg gaa tgt aac tgg ata ctt cct ttt att ctg tca gta act tca ggt       48Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly
            -15                 -10                  -5gcc tac tca cag gtt caa ctc cag cag tct ggg gct gag ctg gca aga       96Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg
     -1   1               5                  10cct ggg gct tca gtg aag ttg tcc tgc aag gct tct ggc tac acc ttt        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15                   20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gta aaa cag agg cct gga cag ggt ctg        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gaa tgg att ggg tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atg acc gca gac acg tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gtc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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            -15                 -10                  -5Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg
     -1   1                   5              10Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
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     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
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 的DNA(223)(400)99atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aag gcc aca ttg act gca gat aaa tcc tcc agt        288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg caa ctc agc atc ttg gca ttt gag gac tct gcg gtc        336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gca aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)100(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化C链可变区(天然/变体a混合体)(223)(400)100Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
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         65                  70                  75Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)101(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)101ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag                             38(210)102(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)102gcagacacgt cctcgagcac agcctacatg gagct                            35(210)103(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)103agctccatgt aggctgtgct cgaggacgtg tctgc                            35(210)104(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)104tgggtgcgac agcgccctgg acaagg                                      26(210)105(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)105ccttgtccag ggcgctgtcg caccca                                      26(210)106(211)41(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)106tacatggagc tgagcagcct ggcatttgag gacacggccg t                     41(210)107(211)41(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)107acggccgtgt cctcaaatgc caggctgctc agctccatgt a                     41(210)108(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)108aagttcaagg gcaaagccac cctgac                                      26(210)109(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)109gtcagggtgg ctttgccctt gaactt                                      26(210)110(211)23(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)110gcctacatgc agctgagcag cct                                         23(210)111(211)23(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)111aggctgctca gctgcatgta ggc                                         23(210)112(211)38(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)112gcctacatgc agctgagcat cctgagatct gaggacac                         38(210)113(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)113gatctcagga tgctcagctg catgtaggct gtgct                            35(210)114(211)50(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)114gcctacatgc agctgagcat cctgagatct gaggactcgg ccgtgtatta            50(210)115(211)50(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)115acggccgagt cctcagatct caggatgctc agctgcatgt aggctgtgct            50(210)116(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)116gagctgagca tcctgagatc                                             20(210)117(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)117gatctcagga tgctcagctc catgta                                      26(210)118(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)118agatctgagg actcggccgt                                             20(210)119(211)20(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)119acggccgagt cctcagatct                                             20(210)120(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)120gcagacacgt ccacgagcac agcctacatg gagct                            35(210)121(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)121agctccatgt aggctgtgct cgtggacgtg  tctgc                           35(210)122(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)122gcagacacgt cctcgagcac agtctacatg gagct                            35(210)123(211)35(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)123agctccatgt agactgtgct cgaggacgtg  tctgc                           35(210)124(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)124agagtcacca  tcaccgcaga  caagtc                                    26(210)125(211)26(212)DNA(213)人工序列(220)引物(223)合成DNA(400)125gacttgtctg cggtgatggt gactct                                      26(210)126(211)418(212)DNA(213)人工序列(220)编码抗HM1.24抗体人源化重链可变区(变体s)的DNA(223)(400)126atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt         48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5gct cac tcc cag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag         96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10cct ggg gcc tca gtg aag gtt tcc tgc aag gca tct gga tac acc ttc        144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
 15                  20                  25act ccc tac tgg atg cag tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt        192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45gag tgg atg gga tct att ttt cct gga gat ggt gat act agg tac agt        240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60cag aag ttc aag ggc aga gtc acc atc acc gca gac aag tcc acg agc        288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75aca gcc tac atg gag ctg agc agc ctg aga tct gag gac acg gcc gtg        336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90tat tac tgt gcg aga gga tta cga cga ggg ggg tac tac ttt gac tac        384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca g                          418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)127(211)139(212)PRT(213)人工序列(220)抗HM1.24抗体的人源化重链可变区(变体s)(223)(400)127Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly
            -15                 -10                  -5Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
     -1   1               5                  10Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
15                   20                  25Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30                  35                  40                  45Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser
             50                  55                  60Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser
         65                  70                  75Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
     80                  85                  90Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr
 95                 100                 105Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110                 115                 120(210)128(211)1013(212)DNA(213)人(220)编码HM1.24抗原蛋白的DNA(223)(400)128gaattcggca cgagggatct gg atg gca tct act tcg tat gac tat tgc            49
                     Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys
                       1               5aga gtg ccc atg gaa gac ggg gat aag cgc tgt aag ctt ctg ctg ggg         97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10                  15                  20                  25ata gga att ctg gtg ctc ctg atc atc gtg att ctg ggg gtg ccc ttg        145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu
             30                  35                  40att atc ttc acc atc aag gcc aac agc gag gcc tgc cgg gac ggc ctt        193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu
         45                  50                  55cgg gca gtg atg gag tgt cgc aat gtc acc cat ctc ctg caa caa gag        241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu
     60                  65                  70ctg acc gag gcc cag aag ggc ttt cag gat gtg gag gcc cag gcc gcc        289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala
 75                  80                  85acc tgc aac cac act gtg atg gcc cta atg gct tcc ctg gat gca gag        337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90                  95                 100                 105aag gcc caa gga caa aag aaa gtg gag gag ctt gag gga gag atc act        385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr
            110                 115                 120aca tta aac cat aag ctt cag gac gcg tct gca gag gtg gag cga ctg        433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu
        125                 130                 135aga aga gaa aac cag gtc tta agc gtg aga atc gcg gac aag aag tac        481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr
    140                 145                 150tac ccc agc tcc cag gac tcc agc tcc gct gcg gcg ccc cag ctg ctg        529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu
155                 160                 165att gtg ctg ctg ggc ctc agc gct ctg ctg cag  tga gatcccagga            575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln ***170                 175                 180agctggcaca tcttggaagg tccgtcctgc tcggcttttc gcttgaacat tcccttgatc      635tcatcagttc tgagcgggtc atggggcaac acggttagcg gggagagcac ggggtagccg      695gagaagggcc tctggagcag gtctggaggg gccatggggc agtcctgggt ctggggacac      755agtcgggttg acccagggct gtctccctcc agagcctccc tccggacaat gagtcccccc      815tcttgtctcc caccctgaga ttgggcatgg ggtgcggtgt ggggggcatg tgctgcctgt      875tgttatgggt tttttttgcg gggggggttg cttttttctg gggtctttga gctccaaaaa      935aataaacact tcctttgagg gagagcacac cttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa      995aaaattcggg cggccgcc                                                   1013(210)129(211)180(212)PRT(213)人(220)HM1.24抗原蛋白(223)(400)129Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys Arg Val Pro Met Glu Asp Gly1               5                  10                  15Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu
         20                  25                  30Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala
     35                  40                  45Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu Arg Ala Val Met Glu Cys Arg
 50                  55                  60Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly65                  70                  75                  80Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala Thr Cys Asn His Thr Val Met
             85                  90                  95Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys
        100                 105                 110Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr Thr Leu Asn His Lys Leu Gln
    115                 120                 125Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu
130                 135                 140Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser145                 150                 155                 160Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser
            165                 170                 175Ala Leu Leu Gln
        180

Claims (13)

1.用于制备天然人源化抗体的方法，该方法包括对初级设计抗体FR进行同源性检索及选择保留有初级设计抗体FR中所含人工氨基酸残基并与其具同源性的天然人FR。
2.根据权利要求1的制备天然人源化抗体的方法，该方法包括对初级设计抗体FR进行同源性检索，选择保留有初级设计抗体FR中所含人工氨基酸残基并与其具同源性的天然人FR，并置换初级设计抗体FR和所选天然人FR之间一个或多个不同的氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2的制备方法，其中初级设计抗体包括来自第一动物物种的CDR和来自第二动物物种并具人工氨基酸残基的FR。
4.根据权利要求3的制备方法，其中第一动物物种是鼠，而第二动物物种是人。
5.根据权利要求1至4中任一项的制备方法，其中所述人工氨基酸残基来自非人抗体FR。
6.用权利要求1至5中任一项的制备方法获得的天然人源化抗体。
7.含来自第一动物物种之CDR及来自第二动物物种之FR的天然人源化抗体，其特征在于该FR所含氨基酸序列具有与用于CDR-移植的FR中一个或多个氨基酸残基不同的氨基酸残基，并且该FR已被来自第二动物物种、在相同位置具有与所说不同氨基酸残基相同的氨基酸残基的FR所取代。
8.根据权利要求7的天然人源化抗体，其中第一动物物种是鼠，而第二动物物种是人。
9.编码权利要求6至8中任一项所述的天然人源化抗体的DNA。
10.含权利要求9之DNA的表达载体。
11.含权利要求10之DNA的宿主。
12.制备天然人源化抗体的方法，该方法包括培养已导入含权利要求9之DNA的表达载体的细胞并从该细胞的培养物中回收所期望的天然人源化抗体。
13.含天然人源化抗体的药物组合物。
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