ES2293691T3 - Anticuerpo humano natural. - Google Patents

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ES2293691T3 ES98945597T ES98945597T ES2293691T3 ES 2293691 T3 ES2293691 T3 ES 2293691T3 ES 98945597 T ES98945597 T ES 98945597T ES 98945597 T ES98945597 T ES 98945597T ES 2293691 T3 ES2293691 T3 ES 2293691T3
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Masayuki Chugai Seiyaku K.K. TSUCHIYA
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Abstract

El uso de un sistema emulsionante que comprende al menos dos emulsionantes, estando presente cada emulsionante en una cantidad de al menos aproximadamente 0, 05% en peso con respecto al peso total de la composición; en el que cada emulsionante tiene la fórmula (R)a(L)b, en la que "R" representa un grupo hidrofóbico, "L" representa un grupo hidrofílico, y "a" y "b" son independientemente 1-4; para aumentar el flujo de penetración de un agente farmacéutico para la preparación de una composición hidroalcohólica para liberar un agente farmacéutico transdérmicamente en un paciente, en el que la composición hidroalcohólica comprende: (a) un alcohol, seleccionado de etanol, 2-propanol y n-propanol, y agua, en una proporción en peso de al menos aproximadamente 20:80; (b) el agente farmacéutico; y (c) el sistema emulsionante; y en el que cada emulsionante se selecciona de manera tal que la composición, cuando se encuentra libre de espesantes auxiliares, posee una viscosidad de al menos aproximadamente 4000 mPa¿s (4000 centipoises), medida a una temperatura de 23ºC y a presión ambiente en un viscosímetro Brookfield LVDV-I+ equipado con un adaptador Heliopath Brookfield modelo D y rotores T B-F.

Description

Anticuerpo humano natural.
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método de preparación de un anticuerpo humanizado natural y al anticuerpo humanizado natural obtenido por dicho método de preparación. La presente invención también se refiere a un ADN que codifica un anticuerpo humanizado natural, un vector de expresión que comprende dicho ADN, un hospedante que comprende dicho ADN y un método de preparación de anticuerpo humanizado natural a partir de las células en las que se ha introducido dicho ADN.
Antecedentes de la técnica
Los anticuerpos monoclonales de ratón se pueden aislar en forma relativamente fácil por la tecnología ampliamente usada del hibridoma (Kohler, G. y Milstein, C. Nature (1975) 256, 495-497). Por otra parte, una técnica similar para el hibridoma humano aún tiene que generalizarse si bien se espera que así sea. Además, existe la necesidad de anticuerpos para antígenos humanos en aplicaciones clínicas y en consecuencia la generación de anticuerpos monoclonales de ratón es indispensable para el desarrollo de anticuerpos que actúen como productos farmacéuticos.
En efecto, se han aislado varios anticuerpos monoclonales contra células tumorales y virus y se han estudiado en aplicaciones clínicas. Se ha revelado, sin embargo, que los anticuerpos de ratón, que son sustancias extrañas para los seres humanos, inducen HAMA (anticuerpos anti-ratón humanos) debido a la potente antigenicidad y que esto es extremadamente inadecuado para las aplicaciones clínicas a causa de problemas tales como actividad débil de inducción de ADCC (Schroff, R. W., Cancer Res. (1985) 45, 879-885; Shawler, D. L., et al, J. Immunol. (1985) 135, 1530-1535).
Con el fin de resolver este problema, se creó el anticuerpo quimérico (Neuberger, M. S. et al., Nature (1984) 312, 604-608; Boulianne, G. L. et al., Nature (1984) 312, 643-646). El anticuerpo quimérico esta compuesto por la unión de una región variable de un anticuerpo de ratón a una región constante de un anticuerpo humano, es decir, en el anticuerpo quimérico la región constante del anticuerpo de ratón que es responsable de una antigenicidad particularmente potente se ha reemplazado con una contraparte humana. Se espera que esto permita una unión fisiológica con un receptor de Fc humano y que induzca las funciones mediadas por Fc. En efecto, se ha informado una marcada disminución de antigenicidad en un estudio clínico usando anticuerpos quiméricos (LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 4220-4224). No obstante, se comunicaron casos problemáticos que desarrollaron HAMA contra regiones variables de ratón (LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 4220-4224).
Por consiguiente, se han desarrollado métodos, aunque más complicados, para preparar un anticuerpo humanizado que es más cercano a un anticuerpo humano. Esta es una técnica de reconstrucción del sitio de unión del antígeno de un anticuerpo de ratón en un anticuerpo humano (Jones, P. T. et al., Nature (1986) 321, 5225-525; Verhoeyen, M. et al., Scinece (1988) 239, 1534-1536; Riechmann, L. et al., Nature (1988) 332,323-327)). De este modo, una región variable de un anticuerpo, tanto para la cadena H como la cadena L, comprende cuatro regiones estructurales (FR) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR) interpuestas entre ellas.
Se sabe que la CDR es principalmente responsable de la formación de sitios de unión al antígeno y algunos residuos de aminoácidos de la FR están involucrados en esta en forma directa o indirecta. Ya que las estructuras básicas de los anticuerpos son similares entre sí, se pensó que era posible injertar un sitio de unión al antígeno de un anticuerpo a otro anticuerpo. El grupo de investigación conducido por G. Winter, en efecto, ha injertado con éxito CDR de un anticuerpo anti-rhizobium de ratón a un anticuerpo humano (injerto de CDR), obteniendo de este modo un anticuerpo humanizado que tiene una actividad de unión a rhizobium (Jones, P. T. et al., Nature (1986) 321, 522-525).
En algunos casos, no obstante, la humanización por injerto de CDR solo no proporciona un anticuerpo humanizado que tenga una actividad de unión del antígeno similar al anticuerpo de ratón humano. Por consiguiente, como se describió anteriormente, se han realizado intentos por reemplazar algunos residuos de aminoácidos de la FR. Los residuos de aminoácidos de la FR reemplazados se involucran en el mantenimiento de la estructura de los residuos de aminoácidos que constituyen la estructura básica de una molécula de anticuerpo (estructura canónica; Chothia, C. et al., Nature (1989) 342, 877-883; Chothia, C. y Lesk, A. M. J. Malec. Biol. (1987) 196, 901-917) o las CDR, o interactúan en forma indirecta con moléculas de antígeno (ver publicaciones de Patente Internacional WO 91-09967 y WO 90-07861).
De hecho, se ha realizado una sustitución de aminoácidos de la FR para la mayor parte del anticuerpo humanizado, donde se forman las secuencias de la FR artificiales que no se producen naturalmente. A veces, se han realizado demasiadas sustituciones que vuelve dudoso el significado original del injerto de CDR para minimizar la antigenicidad del anticuerpo de ratón (Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 10029-10033; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1991) 88, 2869-2873).
Una solución a este problema es idear métodos de selección de las FR humanas. De este modo, la cantidad de residuos de aminoácidos de la FR a reemplazar depende de la homología entre las FR del anticuerpo humanos seleccionado para el injerto de la CDR y las FR del anticuerpo de ratón original. Por consiguiente, las FR humanas que tienen una alta homología con las FR de ratón se seleccionan usualmente para minimizar el grado de sustitución. (Sato, K. et al., Mol. Immunol. (1994) 31(5), 371-381; Ohtomo, T. et al., Mol. Immunol. (1995), 32(6), 407-416. No obstante, en muchos casos, incluso las FR del anticuerpo humanizado así obtenido presentan secuencias de aminoácidos que no se producen naturalmente, que pueden presentar el problema de antigenicidad. De este modo, existe una necesidad de tecnología de construcción de anticuerpos humanizados que puedan resolver los problemas anteriores, presenten menor probabilidad de inducir antigenicidad y tengan mayor seguridad.
Descripción de la invención
La presente invención es una mejora del método convencional para construir un anticuerpo humanizado y proporciona un método para construir un anticuerpo humanizado que retiene completamente la actividad de unión al antígeno del anticuerpo de ratón humano original y que comprende las FR humanas naturales; en otras palabras, un método para construir un anticuerpo humanizado que no involucra ninguna sustitución de aminoácidos en la FR.
De este modo, la presente invención proporciona un método de preparación de un anticuerpo humanizado natural que comprende realizar una búsqueda de homología para la FR de un anticuerpo de diseño primario y seleccionar una FR humana natural que retiene los residuos de aminoácidos artificiales contenidos en la FR del anticuerpo de diseño primario que tiene homología con ésta. Como se usa en la presente memoria, el anticuerpo de diseño primario es un anticuerpo humanizado (también llamado anticuerpo humano reconfigurado) preparado por injerto de CDR convencional.
La presente invención también proporciona un método para preparar un anticuerpo humanizado natural que comprende realizar una búsqueda de homología para la FR de un anticuerpo de diseño primario y seleccionar una FR humana natural que retiene los residuos de aminoácidos artificiales contenidos en la FR del anticuerpo de diseño primario que tiene homología con ésta e intercambiar uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos diferentes entre la FR del anticuerpo de diseño primario y la FR natural humana seleccionada.
Con preferencia, en el método anterior de preparación, el anticuerpo de diseño primario comprende las CDR derivadas de una primera especie animal y las FR derivadas de una segunda especie animal. Con más preferencia, en el anticuerpo de diseño primario la primera especie animal es un mamífero no humano y la segunda especie animal es hu-
mana. Los ejemplos de la primera especie animal, es decir, un mamífero, incluyen ratón, rata, hámster, conejo y mono.
La presente invención también proporciona un método para preparar un anticuerpo humanizado natural que comprende realizar una búsqueda de homología de la FR de un anticuerpo de diseño primario, seleccionar una FR natural humana que retiene los residuos de aminoácidos derivados de la FR de un anticuerpo no humano contenida en la FR del anticuerpo de diseño primario y que tiene una alta homología con esta e intercambiar una o una pluralidad de residuos de aminoácidos diferentes entre la FR del anticuerpo de diseño primario y la FR natural humana seleccionada.
La presente invención también proporciona un anticuerpo humanizado natural obtenido por el método de preparación anterior.
La presente invención también proporciona un anticuerpo humanizado natural que contiene las CDR derivadas de una primera especie animal y las FR derivadas de una segunda especie animal caracterizado porque dichas FR comprenden una secuencia de aminoácidos que es diferente de las FR usadas para injerto de CDR en uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos y se reemplaza con la FR derivada de la segunda especie animal que tiene los mismos residuos de aminoácidos que dichos residuos de aminoácidos diferentes en las mismas posiciones. Con preferencia la primera especie animal es un mamífero no humano y la segunda especie es humana. Los ejemplos de la primera especie animal, es decir un mamífero, incluyen ratón, rata, hámster, conejo y mono.
La presente invención también proporciona un ADN codifica el anticuerpo humanizado natural anterior.
La presente invención también proporciona un vector de expresión que comprende el ADN anterior.
La presente invención también proporciona un hospedante no humano que comprende el ADN anterior.
La presente invención también proporciona un método para preparar un anticuerpo humanizado natural que comprende cultivar células en las que se ha introducido un vector de expresión que comprende el anterior ADN y recolectar el anticuerpo humanizado natural deseado a partir del cultivo de dichas células.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado natural.
Breve explicación de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra que la intensidad de fluorescencia del anticuerpo quimérico anti-HM1.24 cambia en forma similar a la del anticuerpo anti-HMI.24 de ratón en comparación con el anticuerpo control en el análisis FCM usando una línea celular de mieloma humano KPMM2.
La Figura 2 es un gráfico que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico inhibe la unión del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón biotinilado a las células WISH en una forma dependiente de la dosis de modo similar al anticuerpo anti-HM1.24 de ratón.
La Figura 3 es un gráfico que muestra que anticuerpo anti-HM1.24 quimérico tiene una actividad citotóxica aumentada frente a las células RPMI 8226 con relaciones E/T crecientes mientras la IgG1 control o anticuerpo anti-HM1.24 de ratón no tiene actividad citotóxica en las células RPMI 8226.
La Figura 4 es un diagrama que muestra un método para construir la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado por injerto de la CDR mediante el método de PCR.
La Figura 5 es un diagrama que muestra un método para construir cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado en la que los oligonucleótidos RVH1, RVH2, RVH3 y RVH4 se ensamblan por el método de PCR.
La Figura 6 es un diagrama que muestra un método para construir la cadena H de la región V del anticuerpo anti-HM1.24 híbrido humano-ratón.
La Figura 7 es un diagrama que muestra un método para construir la cadena H de la región V del anticuerpo anti-HM1.24 híbrido ratón-humano.
La Figura 8 es un gráfico que muestra que la versión a de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado tiene una actividad de unión al antígeno de grado similar al del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico. En la figura, -1 y -2 representan lotes diferentes.
La Figura 9 es un gráfico que muestra la actividad de unión al antígeno del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado preparado a partir de una combinación de la versión a de la cadena L y la versión a, b, f o h de la cadena H, y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 10 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado preparado a partir de una combinación de la versión b de la cadena L y la versión a, b, f, o h de la cadena H, y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la actividad de inhibición de unión del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado preparado a partir de una combinación de la versión a de la cadena L y la versión a, b, f, o h de la cadena H, y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 12 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado preparado a partir de una combinación de la versión b de la cadena L y la versión a, b, f, o h de la cadena H, y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 13 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones a, b, c, y d de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 14 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones a y e de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico. En la figura, -1 y -2 representan lotes diferentes.
La Figura 15 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de las versiones a, c, p, y r de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 16 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno del anticuerpo anti-HM1.24 híbrido humano-ratón, anticuerpo anti-HM1.24 híbrido ratón-humano y anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 17 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de la versión a, b, c, y f de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 18 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones a y g de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 19 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de las versiones a y g de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 20 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones h e i de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 21 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones f, h, y j de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 22 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de las versiones h e i de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 23 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de las versiones f, h, y j de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 24 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones de la cadena H h, k, 1, m, n, y o del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 25 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones a, h, p, y q de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 26 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de las versiones h, k, l, m, n, y o de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico a las células WISH.
La Figura 27 es un gráfico que muestra actividad de inhibición de la unión de las versiones a, h, p, y q de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 28 es un gráfico que muestra actividad de unión al antígeno de las versiones a, c, p, y r de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
La Figura 29 es un gráfico que muestra que un anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el anticuerpo de diseño secundario) tiene una actividad de unión al antígeno de un grado similar al del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado (el anticuerpo de diseño primario).
La Figura 30 es un gráfico que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el anticuerpo de diseño secundario) tiene una actividad de inhibición de la unión de grado similar al del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado (el anticuerpo de diseño primario).
La Figura 31 es un gráfico que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado purificado tiene una actividad de unión al antígeno de grado similar al del anticuerpo anti-HM1.24 humano quimérico.
La Figura 32 es un gráfico que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado purificado tiene una actividad de inhibición de un grado similar al del anticuerpo anti-HM1.24 humano quimérico.
La Figura 33 es un gráfico que muestra que el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el anticuerpo de diseño secundario) tiene una actividad citotóxica aumentada para la células KPMM2 con relaciones crecientes de E/T.
Realización para llevar a cabo la invención 1. Secuencia de FR natural
Para producir anticuerpos para una variedad de antígenos de los genes que comprenden regiones variables del anticuerpo limitado, los organismos tienen un mecanismo de introducir mutaciones génicas aleatorias (llamadas mutaciones somáticas) en las regiones variables del anticuerpo. En teoría esto debería formar secuencias de aminoácidos de la FR extremadamente diversas, pero en la práctica los posiciones de los residuos de aminoácidos más propensas a la introducción de mutaciones y las clases de residuos de aminoácidos parecen estar limitadas a un cierto grado determinado por el análisis estructural de muchas FR de anticuerpo humano para el cual se han dilucidado las estructuras reales.
Como se usa en la presente memoria, el término FR se refiere a la FR que ha sido definida en Kabat, E. A. et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1991). De este modo, en la cadena H, FR1 es los aminoácidos Nº 1 a 30, FR2 es los aminoácidos Nº 36 a 49, FR3 es los aminoácidos Nº 66 a 94, y FR4 es los aminoácidos Nº 103 a 113. Por otra parte, en la cadena L FR1 es los aminoácidos Nº 1 a 23, FR2 es los aminoácidos Nº 35 a 49, FR3 es los aminoácidos Nº 57 a 88 y FR4 es los aminoácidos Nº 98 a 107.
2. De la FR humana a FR natural humana
En muchos casos, los anticuerpos humanizados (también conocidos como anticuerpos humanos reconfigurados) producidos por el método de injerto de CDR convencional tienen secuencias de aminoácidos de FR que no se pueden hallar en la naturaleza. No obstante, debido a que se ha hallado una variedad de secuencias de aminoácidos de FR por la mutación somática mencionada anteriormente, es posible que las FR tengan residuos de aminoácidos artificiales creados por humanización que se podrían convertir en las FR humanas que aparecen en la naturaleza.
La presente invención está destinada a crear un anticuerpo humanizado que comprende las FR humanas naturales en lugar de las FR artificiales por el procesamiento del anticuerpo humanizado que fue construido por la tecnología de humanización convencional. Cuando el anticuerpo humanizado que experimentó la sustitución de aminoácidos se somete a la búsqueda de homología mediante las FR del anticuerpo humano y bases de datos conocidas tales como Swiss Plot (base de datos de secuencias de proteínas), GenBank (base de datos de secuencias de ácidos nucleicos), PRF (base de datos de secuencias de proteínas), PIR (base de datos de secuencias de proteínas) y GenPept (secuencia proteica traducida de GenBank), se pueden hallar FR humanas completamente apareadas con las secuencias de aminoácidos o FR humanas que tienen homología.
En el primer caso, se realizó la sustitución de FR cuando se observó la FR humana que fue usada como el aceptor del injerto de la CDR, en la que una primera FR que se había supuesto que era artificial está presente en la FR natural, que puede considerarse un aceptor y en consecuencia se obtuvo una FR que no experimentó una sustitución de FR. En el último caso, al centrarse en la secuencia de aminoácidos de la FR humana que tiene una alta homología con una FR artificial, es posible efectuar una sustitución de aminoácido en la FR artificial que da como resultado el retorno a un anticuerpo humano natural adecuado que de este modo produce una coincidencia completa con la FR natural humana. Este procedimiento representa la humanización en anticuerpos con CDR injertadas.
Ya que la búsqueda de homología de las secuencias de aminoácidos entre los anticuerpos humanos se realiza en este caso, es posible hallar una FR humana que pertenece al mismo subgrupo que la FR humana usada en el injerto del CDR y hallar una secuencia de aminoácidos que tiene una homología extremadamente alta. De este modo, una FR natural humana, obtenida para cada FR, más que satisface la secuencia de consenso del subgrupo aunque esta deriva de diferentes anticuerpos.
3. Anticuerpo humanizado de secuencia natural
El anticuerpo humanizado natural obtenido de la presente invención comprende las FR del anticuerpo humano que han sido reconocidas como de existencia natural. Si bien FR1 a FR4 algunas veces se derivan de anticuerpos diferentes, la búsqueda de homología entre los anticuerpos humanos permite la selección de los anticuerpos que sólo pertenecen al mismo subgrupo descripto anteriormente. La estructura de la FR de cada anticuerpo del mismo subgrupo tiene una estructura muy similar a otra y de hecho se han generado anticuerpos humanizados sobre la base de secuencias de consenso del subgrupo, C. A. et al., Protein Engng. (1991) 4, 773-783; Satoh, K. et al., Molec. Immun. (1994) 31, 371-381).
Se considera que en los anticuerpos, como se describe anteriormente, se producen secuencias de aminoácidos extremadamente diversas en forma natural mediante la mutación somática. Hasta el momento sólo se han caracterizado algunas de las estructuras. Si la secuencia de FR del anticuerpo obtenida no se puede hallar en la naturaleza, no está claro si la FR está presente o no en la naturaleza. Cuando los anticuerpos se consideran como agentes farmacéuticos, la construcción de anticuerpos con injerto de CDR que comprenden FR humanas naturales proporciona un anticuerpo tal que tiene propiedades superiores a los anticuerpos humanizados convencionales desde un punto de vista del objeto de la presente invención para reducir la antigenicidad.
4. Método de construcción del nuevo anticuerpo humanizado
La presente invención resuelve el problema asociado con el anticuerpo humanizado construido por la técnica convencional de humanización, o sea que elimina la antigenicidad que surge de las FR artificiales que no se hallan en la naturaleza. Por el contrario, es una tecnología para construir un anticuerpo humanizado por injerto de CDR compuestas de FR humanas halladas realmente en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos de las FR artificiales se refieren a las secuencias de aminoácidos de las FR que no se pueden hallar en forma completa en la naturaleza. Las secuencias de aminoácidos artificiales contenidas en las FR se refieren a estas secuencias de aminoácidos que no pueden hallar en la naturaleza en las FR.
Como secuencias de aminoácidos de las FR que no se hallan en la naturaleza, se pueden mencionar las FR que tienen secuencias de aminoácidos en las que los residuos de aminoácidos de una FR han reaparecido en los residuos de aminoácidos hallados en la FR del anticuerpo derivado de un mamífero no humano que es un molde de humanización en un anticuerpo humanizado construido por la tecnología de humanización de anticuerpos convencional. Alternativamente, en un anticuerpo humanizado construido por la tecnología de humanización de anticuerpos convencional, se puede mencionar las FR que tienen una secuencia de aminoácidos que no se hallan en los anticuerpos derivados de mamíferos humanos y no humanos.
El método de producción del anticuerpo humanizado natural de la presente invención se describe de aquí en adelante.
Primero, se selecciona una FR del anticuerpo humano para usar en el injerto de CDR por una técnica convencional. La FR se somete a la sustitución de aminoácidos para construir un anticuerpo humanizado que tiene una actividad biológica superior que la del anticuerpo de ratón. Este se considera como un producto final del anticuerpo humanizado en el método convencional, pero en la presente invención es un simple intermediario para la construcción del anticuerpo humanizado natural que tiene una secuencia natural. En la presente invención este se llama el anticuerpo de diseño primario.
Posteriormente, se realiza la búsqueda de homología en cada una de las FR del anticuerpo de diseño primario. Las FR que tienen un apareamiento completo significan que las FR ya han constituido las FR naturales. Por otra parte, se enumera una serie de FR naturales humanas que pertenecen al mismo subgrupo que el anticuerpo de diseño primario y que tiene una homología pero no un apareamiento completo con el anticuerpo de diseño primario. A partir de la lista, se pueden seleccionar las FR naturales humanas más apropiadas que mantienen el residuo de aminoácido de la FR derivada de un mamífero no humano tal como un ratón que fue importante en la construcción del anticuerpo de diseño primario, y que tiene una homología con el anticuerpo de diseño primario.
La búsqueda de homología de las FR se puede realizar mediante bases de datos conocidas. Los ejemplos de tales bases de datos incluyen Swiss Plot, GenBank, PRF, PIR y GenPept. La búsqueda de homología se realiza usando estas bases de datos en la que "la FR que tiene una homología con la FR del anticuerpo de diseño primario" listado por la búsqueda de homología se refiere a la FR que tiene una homología en la secuencia de aminoácidos de por lo menos 80%, con preferencia por lo menos 90%, con más preferencia por lo menos 91%, con más preferencia por lo menos 92%, con más preferencia por lo menos 93%, con más preferencia por lo menos 94%, con más preferencia por lo menos 95%, con más preferencia por lo menos 96% o mayor, con más preferencia por lo menos 97% o mayor, con más preferencia por lo menos 98% o mayor, y con más preferencia por lo menos 99% o mayor. La homología de proteínas se puede determinar por el algoritmo descripto por Wilbur, W. J. y Lipman, D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1983) 80, 726-730.
Los residuos de aminoácidos son de un mamífero no humano que fueron importantes para la construcción del anticuerpo de diseño primario se refieren a los residuos de aminoácidos derivados de una FR no humana contenida en una FR artificial. Muchos de estos residuos de aminoácidos se hallan en los residuos de aminoácidos (estructura canónica) responsable de la estructura básica de la molécula de anticuerpo, los residuos de aminoácidos involucrados en el mantenimiento de la estructura de las CDR, o los residuos de aminoácidos que interactúan en forma directa con la molécula del antígeno incluyen por ejemplo un aminoácido en la posición 71 de la cadena H, un aminoácido en la posición 94 de la cadena H, y similares, aunque estos pueden variar de acuerdo con el anticuerpo.
Como se mencionó anteriormente, si uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos diferentes entre la FR del anticuerpo de diseño primario y la FR natural se reemplazan para producir el anticuerpo humanizado que tiene los residuos de aminoácidos de una FR natural humana, el anticuerpo humanizado (anticuerpo humanizado natural; denominado anticuerpo de diseño secundario) así obtenido comprende todas las FR naturales. En este caso todas las FR humanas son con preferencia FR humanas que pertenecen al mismo subgrupo y con más preferencia se derivan del mismo anticuerpo: Además, no es necesario que todas las FR humanas pertenezcan al mismo subgrupo, siempre que estas sean reconfiguradas en un anticuerpo y proporcionen cierta actividad de unión al antígeno, y de este modo no están limitadas a las FR humanas que pertenecen al mismo subgrupo. De acuerdo con la presente invención, una pluralidad de residuos de aminoácidos significa 2 o más residuos de aminoácidos, con preferencia 2 o más y 10 o menos residuos de aminoácidos, con más preferencia 2 o más y 5 o menos residuos de aminoácidos, con más preferencia 2 o más y 4 o menos residuos de aminoácidos, y con más preferencia 2 o más y 3 o menos residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos.
La homología entre una FR artificial y una FR natural humana es por lo menos 80%, con preferencia por lo menos 90%, con más preferencia por lo menos 91%, con más preferencia por lo menos 92%, con más preferencia por lo menos 93%, con más preferencia por lo menos 94%, con más preferencia por lo menos 95%, con más preferencia por lo menos 96% o mayor, con más preferencia por lo menos 97% o mayor, con más preferencia por lo menos 98% o mayor, y con más preferencia por lo menos 99% o mayor.
Luego, el anticuerpo de diseño secundario se deja expresar en un sistema de expresión adecuado, por ejemplo en una célula animal, para evaluar la actividad de unión al antígeno y similares.
Además, el método de preparación de la presente invención se puede efectuar aun sin la construcción real del anticuerpo de diseño primario. De este modo, el anticuerpo de diseño primario se diseña de forma convencional y se puede diseñar sin la evaluación del diseño de anticuerpo secundario del mismo, el que se puede evaluar directamente. En efecto, sin embargo, la identificación de los residuos de FR importantes algunas veces incluye el experimento y el diseño de anticuerpo secundario se construye con preferencia después de que se ha construido experimentalmente el anticuerpo de diseño primario convencional.
Específicamente, en un aspecto de la presente invención, el anticuerpo humanizado natural de la presente invención se produjo con anticuerpo anti-HM1.24 de ratón (Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1922-1930) como molde.
Para los anticuerpos humanizados naturales diseñados como se mencionó anteriormente, el gen que los codifica se puede obtener por un método conocido. Por ejemplo, se sintetizan varios oligonucleótidos que tienen extremos superpuestos correspondientes al ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado natural diseñado. Se realiza un método PCR usando estos oligonucleótidos como cebadores. Entonces, se realiza un método PCR usando cebadores que definen ambos extremos del ADN que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humanizado natural diseñado para obtener el gen que codifica al anticuerpo humanizado natural deseado.
Los genes que codifican un anticuerpo humanizado natural construido como se describió anteriormente se puede expresar en un método conocido para obtener el anticuerpo humanizado natural. En el caso de las células de mamífero, la expresión se puede lograr mediante un promotor/potenciador útil comúnmente usado, el gen del anticuerpo que se va a expresar y el ADN en el que la señal de poli A se ha unido operativamente en 3' corriente abajo de este o mediante un vector que contiene lo mismo. Los ejemplos del promotor/potenciador incluyen promotor/potenciador temprano inmediato de citomegalovirus humano.
Adicionalmente, como se puede usar el promotor/potenciador que se puede usar para la expresión del anticuerpo para uso en la presente invención, se pueden usar promotores/potenciadores virales tales como retrovirus, polioma virus, adenovirus y virus simio 40 (SV40) y promotores/potenciadores derivados de células de mamífero tales como el factor de elongación 1 a (HEF1 a).
Por ejemplo, la expresión se puede lograr fácilmente por el método de Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108) cuando se usa el promotor/potenciador SV40 o por el método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322) cuando se usa el promotor/potenciador HEF1\alpha.
En el caso de Escherichia coli (E. coli), la expresión se puede efectuar por una unión operativa a un promotor útil comúnmente usado,una secuencia señal para la secreción del anticuerpo y el gen del anticuerpo que se expresa, seguido por la expresión de esta. Como promotor, por ejemplo, se puede mencionar el promotor lacz y el promotor araB. El método de Ward et al. (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) se puede usar cuando se utiliza el promotor lacz y el método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043) se puede usar cuando se utiliza el promotor araB.
Como secuencia señal para la secreción de anticuerpos, cuando se produce en el periplasma de E. coli, se puede usar la secuencia señal pelB (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Después de separara el anticuerpo producido en el periplasma, la estructura del anticuerpo se repliega apropiadamente antes del uso (ver, por ejemplo, publicación de Patente Internacional WO 96/30394, y publicación de Patente examinada Japonesa (Kokoku) No. 7(1995)-93879).
Como origen de replicación, se pueden usar los derivados de SV40, virus polioma, adenovirus, virus del papiloma bovino (BPV) y similares. Además, para la amplificación del número de copias del gen en el sistema de la célula hospedante, los vectores de expresión pueden incluir como marcadores seleccionables el gen de aminoglicósido transferasa (APH), el gen de timidina quinasa (TK), el gen de xantina guaninofosforibosil transferasa de E.coli (Ecogpt), gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) y similares.
Para la producción de anticuerpo para usar en la presente invención, se puede usar cualquier sistema de producción. El sistema de producción de la preparación del anticuerpo comprende el sistema de producción in vitro o in vivo. Como sistema de producción in vitro, se puede mencionar un sistema de producción que emplea células eucariotas y el sistema de producción que emplea células procariotas.
Cuando se usan células eucariotas, existen sistemas de producción que emplean células animales, células de planta y células fúngicas. Las células animales conocidas incluyen (1) células de mamífero tales como células CHO (J. Exp. Med. (1995) 108, 945), células COS, células de mieloma, células renales de hámster bebé (BHK), células HeLa y células Vero, (2) células de anfibios tales como oosytes Xenopus (Valle, et al., Nature (1981) 291, 358-340), o (3) células de insecto tales como sf9, sf21 y Tn5. Como células CHO, se pueden usar con preferencia dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, 4216-4220) que carece del gen DHFR y CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1968) 60, 1275).
Las células de planta conocidas incluyen, por ejemplo, las derivadas de Nicotiana tabacum, que se somete a cultivo de callos. Las células fúngicas conocidas incluyen levaduras tales como el género Saccharomyces, por ejemplo Saccharomyces cereviceae u hongos filamentosos tales como el género Aspergillus, por ejemplo Aspergillus niger.
Cuando se usan células procariotas, existen sistemas de producción que emplean células bacterianas. Las células bacterianas conocidas incluyen Escherichia coli (E. coli), y Bacillus subtilis.
Por transformación de estas células con el gen que codifica el anticuerpo humanizado natural de la presente invención y el cultivo de las células transformadas in vitro, se puede obtener el anticuerpo humanizado natural. El cultivo se lleva a cabo en un método conocido. Por ejemplo, se puede usar como cultivo líquido, DMEM, MEM, RPMII 640 e IMDM, y se pueden usar suplementos de suero tales como suero fetal de ternero (FCS) en combinación o se puede usar medio libre de suero. Además, los anticuerpos se pueden producir in vivo por la implantación de células en las se ha introducido el gen del anticuerpo en la cavidad abdominal de un animal y similares.
Como sistemas de producción in vivo, se pueden mencionar los que emplean animales y los que emplean plantas. El gen del anticuerpo se introduce en un animal o una planta, y se produce el anticuerpo en tal animal o planta y luego se recoge.
Cuando se usan animales, existen sistemas de producción que emplea mamíferos e insectos.
Como mamíferos, se pueden usar cabras, cerdos, ovejas, ratones y ganado vacuno (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Cuando se usan mamíferos, también se pueden usar animales transgénicos.
Por ejemplo, se inserta un gen del anticuerpo en un gen que codifica una proteína que se produce intrínsecamente en la leche tal como la caseína \beta de cabra para preparar genes de fusión. Los fragmentos de ADN que contienen el gen de fusión en el se ha insertado el gen el anticuerpo se inyectan en un embrión de cabra y se introduce el embrión en un cabra hembra. El anticuerpo deseado se obtiene a partir de la leche producida por la transmisión de la cabra transgénica a la cabra que recibió el embrión o sus crías. Con el fin de aumentar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgénica, se pueden dar hormonas a la cabra transgénica si es apropiado (Ebert, K.M. et al., BiolTechnology (1994) 12, 699-702).
Cuando se usan insectos, se pueden utilizar gusanos de seda. Cuando se usan gusanos de seda, el baculovirus en el que ha insertado el gen del anticuerpo deseado se infecta con el gusano de seda y se puede obtener el anticuerpo deseado del fluido corporal del gusano de seda (Susumu, M. et at., Nature (1985) 315, 592-594).
Cuando se usan plantas, se puede emplear, por ejemplo, tabaco. Además, cuando se usa tabaco, se inserta el gen el anticuerpo deseado en un vector de expresión para plantas, por ejemplo pMON 530, y luego el vector se introduce en una bacteria tal como Agrobacterium tumefaciens. La bacteria luego se infecta con el tabaco - tal como Nicotiana tabacum para obtener el anticuerpo deseado a partir de las hojas del tabaco (Julian, K.-C. Ma et at, Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
Como se describió anteriormente, "hospedantes" como se usa en la presente memoria abarca animales y plantas que producen el anticuerpo humanizado natural deseado. Cuando se produce el anticuerpo en sistemas producción in vitro o in vivo, como se describió anteriormente, el ADN que codifica una cadena H o una cadena L de un anticuerpo se integra en forma separada en un vector de expresión y un hospedante se transforma en forma simultánea o un ADN que codifica una Cadena H y ADN que codifica una cadena L se puede integrar en un vector de expresión único y un hospedante se trasforma con el mismo (ver publicación de Patente Internacional WO 94-11523).
Como método para introducir un vector de expresión en un hospedante, se puede usar un método conocido tal como el método del fosfato de calcio (Virology (1973) 52, 456467) y el método de electroporación (EMBO J. (982) 1, 841-845) y similares.
Un anticuerpo humanizado natural producido y expresado como se describió anteriormente, se puede separar del interior o exterior de la célula o del hospedante y luego se puede purificar a hasta la homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo humanizado natural para usar en la presente invención se puede lograr por métodos de separación y purificación convencionales usados para las proteínas, sin ninguna limitación. La separación y purificación se puede lograr por combinación, si es apropiado, cromatografía tal como cromatografía de afinidad, filtración, ultrafiltración, extracción salina, diálisis y similares (Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988),
Como columna usada para tal cromatografía de afinidad, se puede mencionar la columna de proteína A y la columna de proteína G. Como vehículos para usar en la columna de la proteína A se pueden mencionar Hyper D, POROS, Sefarosa F.F. (Pharmacis) y similares.
Cromatografías distintas de la cromatografía de afinidad incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrofóbica, filtración en gel, cromatografía de fase reversa, cromatografía de adsorción y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
Estas cromatografías se pueden realizar mediante una cromatografía líquida tal como HPLC, FPLC y similares.
La concentración del anticuerpo humanizado natural de la presente invención se puede determinar por la medición de absorbancia o por el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y similares. De este modo, cuando se emplea la medición de absorbancia, el anticuerpo humanizado natural obtenido se diluye apropiadamente con PBS y luego se mide la absorbancia a 280 nm, seguido por el cálculo mediante el coeficiente de absorción de DO 1,35 a 1 mg/ml.
Cuando se usa el método ELISA, la medición se realiza de la siguiente manera. Así, 100 \mul de IgG anti-humana de cabra (fabricado por BIO SOURCE) diluidos a 1 mg/ml en 0,1 M de tampón bicarbonato, pH 9.6, se agregan a una placa de 96 pocillos (fabricado por Nunc), y se incuba toda a noche a 4ºC para inmovilizar el anticuerpo. Después del bloqueo, se agregan 100 \mul de cada uno de los anticuerpos humanizados naturales apropiadamente diluidos de presente invención o una muestra que contiene el anticuerpo o IgG humana (fabricado por CAPPEL) de una concentración conocida como estándar y se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora.
Tras el lavado, se agregan 100 \mul de anticuerpo IgG anti-humano marcado con fosfatasa diluido 5000 veces (fabricado por BIO SOURCE) e incuban a temperatura ambiente durante 1 hora. Después del lavado, se añade la solución del sustrato y se incuba, seguido por la medición de absorbancia a 405 nm usando el lector de microplacas Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad) para calcular la concentración del anticuerpo deseado. Se puede usar BlAcore (fabricado por Pharmacia) para la medición de la concentración del anticuerpo.
Se puede evaluar la actividad de unión al antígeno, actividad de inhibición de unión y actividad neutralizante del anticuerpo humanizado natural de la presente invención por métodos conocidos. Por ejemplo, como método de determinación de la actividad del anticuerpo humanizado natural de la presente invención, se puede mencionar ELISA, EIA (inmunoensayo enzimático), RIA (radioinmunoensayo), o método del anticuerpo fluorescente. Para la evaluación del anticuerpo anterior se puede usar BlAcore (fabricado por Pharmacia).
El anticuerpo humanizado natural de la presente invención puede consistir en fragmentos de anticuerpo o las versiones modificadas de estos. Por ejemplo, como fragmentos del anticuerpo, se pueden mencionar Fab, F(ab')_{2}, Fv o Fv de cadena única (scFv). El scFv tiene una estructura en la que los Fv de la cadena H y la cadena L se ligan por medio de un conector adecuado.
Para producir estos anticuerpos, los anticuerpos se tratan con una enzima tal como papaína o pepsina, o se construyen genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo y luego se introducen un vector de expresión, que se expresa en una célula hospedante adecuada para expresarlos (ver, por ejemplo, Co, M. S. et al., J. Immune]. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. y Horwitz, A.H., Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press Inc.; Plucktrun, A. y Skerra, A., Methods in Enzymol. (1989) 178, 476-496, Academic Press Inc.; Lamoyi, E., Methods in Enzymol. (1986) 121, 652-663; Rousseaux, J. at al., Methods in Enzymol. (1986) 121, 663-669; Bird, R.E. y walker, B.W., TIBTECH (1991) 9, 132-137).
Se puede obtener scFv por el ligamiento de la región V de la cadena H y la región V de la cadena L del anticuerpo (ver, Publicación Patente Internacional WO 88-09344). En el scFv, la región V de la cadena H y la región V de la cadena L con preferencia se ligan por medio de un conector, con preferencia un conector peptídico (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). La región V de la cadena H y la región V de la cadena L en el scFv se puede derivar de cualquiera de los anticuerpos mencionados anteriormente. Como conector peptídico para ligar las regiones V se puede usar cualquier péptido de cadena única que comprende, por ejemplo, uno que comprende 12 a 19 residuos de aminoácidos (ver, Patente Estadounidense Nº US 5525491).
El ADN que codifica el scFv se puede obtener mediante un ADN que codifica la cadena H o la región V de la cadena H del anterior anticuerpo y ADN que codifica la cadena L o la región V de la cadena L del anterior anticuerpo como molde por amplificación de la porción del ADN que codifica la secuencia de aminoácidos deseadas entre las secuencias anteriores por la técnica de PCR con el par de cebadores que especifica ambos extremos de este y por amplificación adicional de la combinación de ADN que codifica la porción del péptido conector y el par de cebadores que define que ambos extremos de dicho ADN se liguen en la cadena H y la cadena L, respectivamente.
Una vez que se construyen los ADN que codifican el scFv, se puede obtener un vector de expresión que los contiene y un hospedante transformado con dicho vector de expresión por los métodos convencionales y se puede obtener scFv mediante el hospedante resultante por los métodos convencionales.
Estos fragmentos de anticuerpo se pueden producir por la obtención del gen de estos en forma similar a la mencionada anteriormente y permitiendo que se exprese en un hospedante. "Anticuerpo" como se usa en la reivindicación de la presente solicitud abarca estos fragmentos de anticuerpos.
Como anticuerpos modificados, se pueden usar los anticuerpos asociados con varias moléculas tales como polietilenglicol (PEG). "Anticuerpo" como se usa en la reivindicación de la presente solicitud abarca estos anticuerpos modificados. Estos anticuerpos se pueden obtener por la modificación química de los anticuerpos obtenidos de este modo. Estos métodos ya han sido establecidos en la técnica.
El anticuerpo humanizado natural de la presente invención se puede administrar por vía oral o parenteral, tanto sistémica como tópica. La vía parenteral se puede seleccionar de inyección intravenosa tal como infusión por goteo, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal e inyección subcutánea y el método de administración se puede elegir, si es apropiado, dependiendo de la edad y el estado del paciente. El anticuerpo humanizado natural de la presente invención se puede administrar a una dosis que es suficiente para tratar o bloquear por lo menos parcialmente la afección patologiaza. Por ejemplo, la dosis efectiva se elige de un rango de 0,01 mg a 100 mg por kg de peso corporal por administración. Alternativamente, se puede elegir la dosis del rango de 1 a 1000 mg, con preferencia 5 a 50 mg por paciente. No obstante, el anticuerpo humanizado natural de la presente invención no se limita a estas dosis.
El anticuerpo humanizado natural de la presente invención puede contener vehículos o aditivos aceptables para uso farmacéutico que dependen de la vía de administración. Los ejemplos de tales vehículos o aditivos incluyen agua, un solvente orgánico aceptable para uso farmacéutico, colágeno, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, un polímero de carboxivinilo, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilato de sodio, alginato de sodio, dextrano hidrosoluble, carboximetil almidón sódico, pectina, metilcelulosa, etilcelulosa, goma xántica, goma arábiga, caseína, gelatina, agar, diglicerina, propilenglicol, polietilenglicol, Vaselina, parafina, alcohol estearílico, ácido esteárico, albúmina sérica humana (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, un tensioactivo aceptable para uso farmacéutico y similares. Los aditivos usados se eligen, pero sin limitación, entre los anteriores o sus combinaciones dependiendo de la forma de
dosificación.
Ejemplos de referencia
Antes de explicar la presente invención con referencia a los ejemplos de trabajo, se describirán ejemplos de referencia como premisa de los mismos.
Ejemplo de Referencia 1
Clonación de cADN que codifica la región variable de un anticuerpo anti-HM1.24 de ratón 1. Aislamiento del ARN mensajero (ARNm)
Usando el kit de aislamiento de ARNm Fast Track versión 3.2 (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas a este, se aisló ARNm de 2 x 10^{8} células de hibridoma (FERM PB-5233) que producen un anticuerpo anti-HM1.24 de ratón
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2. Amplificación del gen que codifica la región variable del anticuerpo por el método de PCR
Se realizó PCR mediante la amplificación con Termal Cycler (fabricado por Perkin Elmer Cetus).
2-1. Amplificación y fragmentación del gen que codifica la región V de una cadena L de ratón
Del ARNn aislado de este modo, se sintetizó ADNc de cadena única mediante el kit de síntesis de ADNc de la primera cadena de transcriptasa reversa AMV (fabricado por Life Science) y usó para PCR. Como cebadores usados para PCR, se utilizaron cebadores MKV (Variable Kappa de ratón) (Jones, S.T. et al, Bio/Technology, 9, 88-89, (1991)) mostrado en la SEQ ID NO: 29 a 39 que hibrida con la secuencia líder de una cadena L tipo kappa de ratón.
Cien microlitros de la solución de PCR que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 0,1 mM de dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1,5 mM de MgCl2, 5 unidades de ADN polimerasa Ampli Taq (fabricada por Perkin Elmer Cetus), 0,25 mM de cebadores MKV mostrados en la SEQ ID NO: 29 a 39, 3 mM del cebadores MKC mostrado en la SEQ ID NO: 40, y 100 ng de ADNc de cadena simple se cubrieron con 50 \mul de aceite mineral y luego se calentaron a una temperatura inicial de 94ºC durante 3 minutes y luego a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto en este orden. Después de repetir este ciclo durante 30 veces, la mezcla de reacción se incubó a 72ºC durante 10 minutos. El fragmento de ADN amplificado se purificó por agarosa de punto de fusión bajo (fabricado por Sigma) y se digirió con XmaI (fabricado por New England Biolabs) y SalI (fabricado por Takara Shuzo) a 37ºC.
2-2. Amplificación y fragmentación de ADNc que codifica la región V de una cadena H de ratón
El gen que codifica que codifica la región V de una cadena H de ratón se amplificó por el método 5'-RACE (Amplificación rápida de extremos de ADNc; Frohman, M.A. et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85, 8998-9002, (1988), Edwards, J.B.D.M., et al., Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232, (1991)). Después de ADNc se sintetizó mediante el cebador P1 (SEQ ID NO: 63) que específicamente hibrida con la región constante de IgG2a de ratón, el ADNc que codifica la región V de una cadena H de ratón se amplificó por el kit 5'-AmpliFINDER RACE KIT (fabricado por CLONTECH) usando el cebador MHC 2a (SEQ ID NO: 64) que específicamente hibrida con la región constante de IgG2a de ratón y el cebador de anclaje (SEQ ID NO: 101) adjunto en el kit. El fragmento de ADN amplificado se purificó con la agarosa de punto de fusión bajo (fabricado por Sigma) y digerido con EcoRI (fabricado por Takara) y XmaI (fabricado por New England Biolabs) a 37ºC.
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3. Conexión y transformación
El fragmento de ADN que comprende el gen que codifica la región V de una cadena L tipo kappa de ratón preparado anteriormente se ligó al vector pUC19 preparado por la digestión con SalI y XmaI por la reacción en una mezcla de reacción que contiene 50 mM de Tris-HCL (pH 7,6), 10 mM de MgCl_{2}, 10 mM de ditiotreitol, 1 mM de ATP, 50 mg/ml de polietilenglicol (8000) y una unidad de T4 ADN ligasa (fabricado por GIBCO-BRL) a 16ºC durante 2,5 horas. De modo similar, el gen que codifica la región V de una cadena H de ratón se hizo reaccionar y ligar con el vector pUC19 preparado por la digestión con EcoRI y XmaI a 16ºC durante tres horas.
Luego se agregaron 10 \mul de la mezcla de ligación anterior a 50 \mul de las células competentes de Escherichia coli DH5, que se dejaron en hielo durante 30 minutos, a 42ºC durante un minuto, y otra vez en hielo durante un minuto. Posteriormente, se añadieron 400 \mul de medio 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))a estos, se incubaron a 37ºC durante una hora, y luego la E coli se incubó en el medio agar 2xYT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y luego se incubó toda la noche a 37ºC para obtener el transformante de E. coli.
El transformante se cultivó toda la noche a 37ºC en 10 ml del medio 2xYT que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y luego a partir de este cultivo se preparó ADN plásmido usando el método del álcali (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)).
El plásmido así obtenido que contiene el gen que codifica la región V de una cadena L tipo kappa de ratón derivado del hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 se denominó pUCHMVL9. El plásmido obtenido en el método anteriormente mencionado que contiene el gen que codifica la región V de una cadena H de ratón derivada del hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 se denominó pUCHMVHR16.
Ejemplo de Referencia 2
Determinación de secuencia de nucleótidos de ADN
Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc de la región codificadora del plásmido mencionado anteriormente mediante el secuenciador automático de ADN (fabricado por Applied Biosystem Inc.) y el kit de secuenciación del ciclo terminador desoxi Taq Dye (fabricado por Applied Biosystem Inc.) en el protocolo indicado por el fabricante.
La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón contenido en el plásmido pUCHMVL9 se muestra en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos del gen que codifica la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón contenido en el plásmido pUCHMVHR16 se muestra en la SEQ ID NO: 3.
Ejemplo de Referencia 3
Determinación de CDR
Las estructuras totales de las regiones V de una cadena L y una cadena H tienen una semejanza entre sí en la que cuatro porciones de la estructura están conectadas por tres regiones hipervariables, es decir, regiones determinantes de complementariedad (CDR). La secuencia de aminoácidos de la estructura está relativamente bien conservada pero la variación de la secuencia de aminoácidos es extremadamente alta (Kabat, E.A., et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Dept. Health y Human Services, 1983).
Sobre la base de estos hechos, la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo anti-HM1.24 fue ajustada con la base de datos de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos para investigar la homología y se determinó la región CDR como se muestra en la Tabla 1.
TABLA 1
1
Ejemplo de Referencia 4
Confirmación de la expresión del ADNc clonado (Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico) 1. Construcción de un vector de expresión
Para construir un vector de expresión que expresa un anticuerpo anti-HM1.24 quimérico, clones de ADNc pUCHMVL9 y pUCHMVHRI6 que codifican las regiones V de la cadena L y la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón, respectivamente, se modificaron por el método PCR y luego introdujeron en el vector de expresión HEF (publicación de Patente Internacional Nº WO 92-19759).
El cebador trasero ONS-L722S (SEQ ID NO: 65) para la región V de una cadena L y el cebador trasero VHR16S (SEQ ID NO: 66) para la región V de una cadena H se diseñaron de tal modo que hibriden al ADN que codifica el comienzo de la secuencia líder de la región V de cada uno y tengan una secuencia de consenso Kozak (Kozak, M. at al., J. Mol. Biol., 196, 947-950, (1987)) y el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción HindIII. El cebador delantero VL9A (SEQ ID NO: 67) para la región V de una cadena L y el cebador delantero para la VHR16A (SEQ ID NO: 68) para la región V de una cadena H se diseñaron de modo que hibriden la secuencia de ADN que codifica el extremo de la región J y tengan una secuencia dadora de empalme y el sitio de reconocimiento para la enzima de restricción BamHI.
Cien \mul de la mezcla de reacción de PCR que contiene 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 0,1 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl_{2}, 100 pmol de cada cebador, 100 ng de ADN molde (pUCHMVL9 o pUCHMVHRI6), y 5 unidades de la enzima Ampli Taq se cubrieron con 50 \mul de aceite mineral y luego después de la desnaturalización inicial a 94ºC se calentaron a una temperatura inicial de 94ºC durante 3 minutes y luego a 94ºC durante 1 minuto, a 55ºC durante 1 minuto y a 72ºC durante 1 minuto en este orden. Después de repetir este ciclo durante 30 ciclos y finalmente se incubó a 72ºC durante 10 minutos.
El producto de PCR se purificó mediante un gel de agarosa de punto de fusión bajo y se digirió con HindIII y BamHI, y luego se clonó a HEF-VL-g\kappa para la región V de la cadena L y a HEF-VH-g\gamma1 para la región V de la cadena H. Después de determinar la secuencia de ADN, los plásmidos que contienen el fragmento de ADN que porta la secuencia de ADN correcta se denominaron HEF-1,24L-g\kappa y HEF-1,24H-g\gamma1, respectivamente.
Las regiones que codifican la región variable respectiva de los plásmidos anteriores HEF-1.24L-g\kappa y HEF-1.24H-g\gamma1 se digirieron con las enzimas de restricción HindIII y BamHI para formar los fragmentos de restricción, que se insertaron en los sitios HindIII y BamHI del vector del plásmido pUC19 y estos se denominaron como pUC19-1.24L-g\kappa y pUC19-1.24H-g\gamma1, respectivamente.
Las bacterias Escherichia coli que contenían los plásmidos respectivos pUC19-1.24L-g\kappa y pUC19-1.24H-g\gamma1 se denominaron Escherichia coli DH5 (pUC19-1.24L-g\kappax) y Escherichia coli DH5 (pUC19-1.24H-g\gamma1), y se depositaron en forma internacional el 29 de agosto de 1996, en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Ibalaki prefecture, Japón) con los números de acceso FERM PB-5646 y FERM PB-5644, respectivamente, según las provisiones del Tratado de Budapest.
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2. Transfección en células COS-7
Con el fin de observar la expresión transitoria del anticuerpo quimérico anti-HM1.24, se ensayaron los vectores de expresión anteriores en las células COS-7 (ATCC CRL-1651). HEF-1,24L-g\kappa y HEF-1,24H-g\gamma1 se cotransfomaron en células COS-7 por electroporación mediante el instrumento Gene Pulser (fabricado por BioRad). Cada ADN (10 \mug) se agregó a alícuotas de 0,8 ml de 1 x 10^{7} células en PBS, y se sometió a pulsos de 1500 V y una capacidad de 25 \muF.
Después de un período de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, se agregaron células electroporadas a 30 ml del líquido de cultivo DHEM (fabricado por GIBCO) que contiene 10% de suero fetal bovino libre de \gamma-globulina. Después de la incubación de 72 horas en el incubador CO_{2} BNAl20D (fabricado por TABAI), se recolectó el sobrenadante del cultivo, se eliminaron los desechos celulares por centrifugación, y el sobrenadante se usó en el experimento posterior.
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3. Análisis FCM
La actividad de unión al antígeno del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico se investigó por análisis FCM (citometría de flujo) usando las células KPMM2. Después de lavar 4,7 x 10^{5} células KPMM2 (publicaron de Patente no examinada Japonesa (Kokai) Nº 7 (1995)-236475) con PBS(-), se agregaron 50 \mul del cultivo de la células COS-7 que producen el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico anteriormente mencionado y 50 \mul de tampón FACS (PBS(-) que contiene 2% de suero fetal bovino y 0,1% de azida sódica), ó 5 \mul de 500 \mug/ml de anticuerpo anti-HM1.24 de ratón purificado y 95 \mul del tampón FACS y se incubaron a la temperatura del hielo durante una hora.
Como control, se agregaron 50 \mul de 2 \mug/ml de quimera SK2 (publicación de Patente Internacional Nº WO 94-28159) y 50 \mul del tampón FACS, ó 5 \mul de 500 \mug/ml de IgG2a\kappa de ratón purificado (UPC10) (fabricado por CAPPEL) en vez de anticuerpo anti-HM1.24 de ratón purificado y 95 \mul de tampón FACS y se incubaron en forma similar. Después de la lavar con el tampón FACS, se agregaron 100 \mul de anticuerpo anti-humano de cabra 25 \mug/ml marcado con FITC (GAH) (fabricado por CAPPEL) o 10 \mug/ml anticuerpo anti-ratón de cabra marcado con FITC (GAM) (fabricado por Becton Dickinson) y se incubaron a la temperatura del hielo durante 30 minutos. Después de lavar con el tampón FACS, se suspendió en un ml del tampón FACS y se midió la intensidad de fluorescencia de cada célula por FACScan (fabricado por Becton Dickinson).
Como se muestra en la Fig. 1, se reveló que el anticuerpo anti-HM1.24 se unió a las células KPMM2 porque el pico de intensidad de fluorescencia se desvió a la derecha de las células agregadas al anticuerpo anti-HM1.24 quimérico en comparación con el control en forma similar al caso en que se agregó anticuerpo anti-HM1.24 de ratón. Esto confirmó que el ADNc clonado codifica la región variable del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón.
Ejemplo de Referencia 5
Establecimiento de la línea celular CHO que produce en forma estable un anticuerpo anti-HM1.24 quimérico 1. Construcción de un vector de expresión para la cadena H quimérica
Por digestión del plásmido anterior HEF-1,24H-g\gamma1 con las enzimas de restricción PvuI y BamHI, un fragmento de aproximadamente 2,8 kpb que contiene el promotor EF1 y el ADN que codifica la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se purificó usando de gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%. Luego, se insertó el fragmento de ADN anterior en un fragmento de aproximadamente 6 kpb preparado por digestión del vector de expresión usado para el vector de expresión de la cadena H, DHFR-\DeltaE-Rvh-PM1f (ver publicación de Patente Internacional Nº WO 92/19759), que contiene el gen DHFR y el gen que codifica la región constante de una cadena H humana con PvuI y BamHI para construir un vector de expresión, DHFR-\DeltaE-HEF-1,24-H-g\gamma1, para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
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2. Introducción del gen en las células CHO
Para establecer un sistema de producción estable del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico, los genes de los vectores de expresión anteriormente mencionados, HEF-1,24L-g\kappa y DHFR-\DeltaE-HEF-1,24-H-g\gamma1, que se linealizaron por digestión con PvuI se introdujeron en forma simultánea en la célula CHO DXBII (donado por el Medical Research Council Collaboration Center) por el método de electroporación en condiciones similares al mencionado anteriormente (la transfección mencionada anteriormente en células COS-7).
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3. Amplificación génica por MTX
Entre las células CHO con gen introducido, sólo aquellas células CHO en las que se han introducido los vectores de expresión de la cadena L y la cadena H pueden sobrevivir en un líquido de cultivo \alpha-MEM libre de nucleósidos (fabricado por GIBCO-BRL) al que se agregaron 500 \mug/ml de G418 (fabricado por GIBCO-BRL) y 10% de suero fetal bovino y de esta manera se seleccionaron. Posteriormente, se agregaron 10 nM de MTX (fabricado por Sigma) al líquido de cultivo anterior. Entre los clones que se propagaron, se seleccionaron los que se producen el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico en grandes cantidades. Como resultado, se obtuvieron los clones #8 a #13 que exhibieron una eficiencia de producción de aproximadamente 20 \mug/ml del anticuerpo quimérico y se denominaron líneas celulares productoras del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
Ejemplo de Referencia 6
Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico
El anticuerpo anti-HM1.24 quimérico se construyó con el siguiente método. Las líneas celulares CHO productoras del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico se sometieron a un cultivo continuo durante 30 días usando como medio el medio de Dulbecco modificado por Iscove (fabricado por GIBCO-BRL) que contiene 5% de suero bovino de neonato libre de \gamma-globulina (fabricado por GIBCO-BRL) por el sistema Verax instrumental de cultivo celular de alta densidad (fabricado por CELLEX BIOSCIENCE Inc.).
En el día 13, 20, 23, 26, y 30 después del comienzo del cultivo, se recuperó el liquido del cultivo usando una unidad de filtro presurizado SARTOBRAN (fabricado por Sartorius), y luego el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico se purificó por afinidad mediante un sistema de recolección de anticuerpo de columna grande Afi-Prep System (fabricado por Nippon Gaishi) y una columna Super Proteína A (volumen de lecho: 100 ml, fabricado por Nippon Gaishi) usando PBS como tampón de absorción/lavado y 0,1 M de tampón de citrato de sodio (pH 3) como tampón de elución de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Las fracciones eluidas se ajustaron a aproximadamente pH 7,4 por agregado inmediato de Tris 1 M-HCl (pH 8,0). La concentración de anticuerpo se midió por absorbancia a 280 nm y se calculó con 1 \mug/ml como DO 1,35.
Ejemplo de Referencia 7
Determinación de la actividad del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico
Se evaluó el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico por la siguiente actividad de inhibición de la unión.
1. Medición de actividad de inhibición de unión 1-1. Construcción de un anticuerpo anti-HM1.24 biotinilado
Después de diluir el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón con tampón bicarbonato 0,1 M a 4 mg/ml, se agregaron 4 \mul de 50 mg/ml de Biotin-N-hidroxisuccinimida (fabricada por EY LABS Inc.) y se hicieron reaccionar a temperatura ambiente durante 3 horas. De aquí en adelante, se agregaron 1,5 ml de solución de glicina 0,2 M, se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para detener la reacción, y luego se recogieron las fracciones de IgG biotiniladas usando la columna PD-10 (fabricada por Pharmacia Biotech).
1-2. Medición de la actividad de inhibición de unión
La actividad de inhibición de unión por el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón marcado con biotina se midió por el Cell-ELISA usando las células WISH de la línea celular de membrana amniótica humana (ATCC CCL 25). Se prepararon las placas de Cell-ELISA de la siguiente manera. A una placa de 96 pocillos se agregaron 4 x 10^{5} células/ml preparadas con medio PRMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino, se incubó toda la noche, y después de lavar dos veces con PBS (-), se inmovilizaron con 0,1% de glutaraldehído (fabricado por Nacalai Tesque Inc.).
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Después del bloqueo, 50 \mul de las diluciones seriadas del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico o el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón obtenidos por purificación de afinidad se agregaron a cada pocillo y en forma simultánea se agregaron 50 \mul de anticuerpo anti-HM1.24 2 \mug/ml de ratón marcado con biotina, se incubó a temperatura ambiente durante dos horas, y luego se agregó estreptavidina marcada con peroxidasa (fabricada por DAKO). Después de incubar a temperatura ambiente durante una hora y luego de lavar, se agregó la solución del sustrato. Después de detener la reacción por agregado de 50 \mul de ácido sulfúrico 6 N, se midió la absorbancia a 490 nm mediante el lector de microplacas Modelo 3550 (fabricado por Bio-Rad).
El resultado, como se muestra en la Fig. 2, demostró que el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico tiene una actividad de inhibición de unión similar a la del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón como el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón marcado con biotina. Esto indica que el anticuerpo quimérico presentó la misma región V que el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón.
Ejemplo de Referencia 8
Medición de la actividad de ADCC del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico
La actividad de ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo) se midió de acuerdo con el método expuesto en Current Protocols in Immunology, Capítulo 7, Immunologic studies in humans, Editor, Johan E. Coligan et at., John Wiley & Sons, Inc., 1993.
1. Preparación de células efectoras
Se separaron los monocitos de la sangre periférica o médula ósea de seres humanos sanos y pacientes con mieloma múltiple por el método de centrifugación por densidad. Así, se agregó una cantidad igual de PBS(-) a la sangre periférica y la médula ósea de seres humanos sanos y pacientes con mieloma múltiple, que estaba recubierta en Ficoll (fabricado por Pharmacia)-Conrey (fabricado por Daiichi Pharmaceutical Co. Ltd.) (densidad específica, 1,077), y se centrifugó a 400 g durante 30 minutos. Se recogió la capa de monocitos y se lavó dos veces con RPMI 1640 (fabricado por Sigma) suplementado con 10% de suero fetal bovino (fabricado por Witaker), y se preparó a un densidad celular de 5 x 10^{6}/ml con el mismo líquido de cultivo.
2. Preparación de células blanco
La línea celular de mieloma humano RPMI 8226 (ATCC CCL 155) se marcó con radiactividad por incubación en el RPMI 1640 (fabricado por Sigma) suplementado con 10% de suero fetal bovino (fabricado por Witaker) junto con 0,1 mCi de ^{51}Cr-cromato de sodio a 37ºC durante 60 minutos. Después del radiomarcado, las células se lavaron tres veces con solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y se ajustaron a una concentración de 2 x 10^{5}/ml.
3. Ensayo de ADCC
En una placa de extremo inferior en U de 96 pocillos (fabricada por Corning) se agregaron 50 \mul de 2 x 10^{5} de células blanco/ml, 1 \mug/ml de anticuerpo anti-HM1.24 quimérico purificado por afinidad y anticuerpo anti-HM1.24 de ratón o IgG humna control (fabricada por Serotec) y la placa se mantuvo a 4ºC durante 15 minutos.
Luego, se agregaron 100 \mul de 5 x 10^{5} células efectoras/ml y el resultado se cultivó en un incubador de CO_{2} durante 4 horas, con lo cual la relación (E:T) de las células efectoras (E) a las células blanco (T) se estableció en 0:1, 5:1, 20:1, o 50:1.
Se tomaron cien \mul del sobrenadante y la radiactividad liberada en el sobrenadante del cultivo se midió con un contador gamma (ARC361, fabricado por Aloka). Para la medición de la radiactividad máxima, se usó 1% de NP-40 (fabricado por BRL). La citotoxicidad (%) se calculó por medio de (A-C)/(B-C)x 100, donde A es la radioactividad (cpm) liberada en presencia del anticuerpo, B es la radioactividad (cpm) liberada con NP-40, y C es la radioactividad (cpm) liberada por el líquido de cultivo solo sin anticuerpo.
Como se muestra en la Fig. 3, cuando se agregó el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico en comparación con IgG1 control, la citotoxicidad aumentó con el aumento de la relación E:T, que indicó que este anticuerpo anti-HM1.24 quimérico tiene actividad ADCC. Además, ya que no existió citotoxicidad observada incluso cuando se agregó el anticuerpo anti-HM1.24, se demostró que la porción Fc del anticuerpo humano es necesaria para obtener la actividad ADCC cuando la célula efectora es una célula derivada humana.
Ejemplo de Referencia 9
Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado 1. Diseño de la región V del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado
Para construir el anticuerpo humano reconfigurado en el que se trasplantado la CDR del anticuerpo monoclonal de ratón a un anticuerpo humano, se prefiere que haya una alta homología entre la FR del anticuerpo de ratón y la FR del anticuerpo humano. Las regiones V de la cadena L y la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se compararon con las regiones V de todos los anticuerpos conocidos cuya estructura ha sido dilucidad usando el Ptotein Data Bank.
La región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón es más similar a la secuencia de consenso del subgrupo IV (HSGIV) de la región V de la cadena L humana con una homología de 66,4%. Por otra parte, se ha demostrado una homología de 56,9%, 55,8% y 61,5% con HSGI, HSGII y HSGIII, respectivamente.
Cuando la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se compara con la región V de la cadena L de los anticuerpos conocidos, se ha mostrado una homología de 67,0% con la región V REI de una cadena L humana, uno de los subgrupos I de la región V de una cadena L humana. De este modo, la FR de REI se usó como material de partida para la construcción de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
Se diseñó la Versión a de la región de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado. En esta versión, la FR humana fue preparada en forma idéntica con la FR basada en REI presente en el anticuerpos CAMPATH-1H humano reconfigurado (ver Riechmann, L. et al., Nature 322, 21-25, (1988), la FR contenida en la versión de la región V de la cadena L del anticuerpo anti PM-1 humano reconfigurado descripto en la publicación Patente Internacional Nº WO 92-19759), y la CDR de ratón fue preparada en forma idéntica con la CDR de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón.
La región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón es más similar a la secuencia de consenso del HSGI de la región V de una cadena H humana con una homología de 54,7%. Por otra parte, esta muestra una homología de 34,6% y 48,1% con HSGII y HSGIII, respectivamente. Cuando la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se compara con la región V de la cadena H de los anticuerpos humanos conocidos, FR1 a FR3 fueron más similares a la región V de la cadena H del anticuerpo humano HG3, uno del subgrupo I de la región V de una cadena H humana (Rechavi, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8D, 855-859), con una homología de 67,3%.
En consecuencia, se usó la FR del anticuerpo humano HG3 como material de partida para la construcción de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado. Sin embargo, ya que la secuencia de aminoácidos de la FR4 del HG3 humano no se ha descripto, se usó la secuencia de aminoácidos de la FR4 del anticuerpo humano JH6 (Ravetch, J.V. et al., Cell, 27, 583-591) que muestra la más alta homología con la FR4 de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón. La FR4 de JH6 tiene la misma secuencia de aminoácidos que la de la FR4 de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón excepto para un aminoácido.
En la primera versión de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, FR1 a FR3 se prepararon idénticas con la FR1 a FR3 del HG3 humano, y la CDR se preparó en forma idéntica con la CDR de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón, excepto que los aminoácidos en posición 30 en la FR1 humana y la posición 71 en la FR3 humana se prepararon idénticas con los aminoácidos del anticuerpos anti-HM1.24 de ratón.
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2. Construcción de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado
La cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se construyó por el injerto de CDR con el método PCR. El método se muestra en la Fig. 4. Se usaron ocho cebadores de PCR para la construcción del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado (versión a) que tiene la FR derivada del anticuerpo humano REI. Los cebadores externos A (SEQ ID NO: 69) y H (SEQ ID NO: 70) se diseñaron para hibridar con la secuencia de ADN del vector de expresión HEF-VL-g\kappa.
Los cebadores del injerto de CDR L1S (SEQ ID NO: 71), L2S (SEQ ID NO: 72), y L3S (SEQ ID NO: 73) tienen la secuencia de ADN homosentido. Los cebadores del injerto de CDR L1A (SEQ ID NO: 74), L2A (SEQ ID NO: 75), y L3A (SEQ ID NO: 76) tienen la secuencia de ADN antisentido, teniendo cada una de ellas una secuencia de ADN complementaria (20 a 23 pb) con la secuencia de ADN en el extremo 5' de los cebadores L1S, L2S, y L3S, respectivamente.
En la primera etapa de PCR, se realizaron cuatro reacciones A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A, y L3S-H para purificar cada producto de PCR. Los cuatro productos de PCR del primer PCR se dejaron ensamblar con otros por su propia complementariedad (ver Publicación Patente Internacional No. WO 92-19759). Luego, se agregaron cebadores externos A y H para amplificar el ADN de longitud completa que codifica la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado (la segundo PCR). El la PCR mencionada anteriormente, el plásmido HEF-RVL-M21a (ver publicación de Patente Internacional Nº WO 95-14041) que codifica la versión a de la región V de la cadena L del anticuerpo ONS-M21 reconfigurado humano sobre la base de la FR derivada del anticuerpo RE1 se empleó como molde.
En la primera etapa de la PCR, se usó la mezcla de PCR que contiene Tris 10 mM-HCL (pH 8,3), 50 mM de KCl, 0,1 mM de dNTP, 1,5 mM de MgCl2, 100 ng del ADN molde, 100 pmol de cada cebador y 5 u de Ampli Taq. Cada tubo de PCR se cubrió con 50 \mul de aceite mineral. Luego después de desnaturalizar primero con calentamiento a 94ºC, se sometió a un ciclo de reacción de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y luego se incubó a 72ºC durante 10 minutos.
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Los productos de PCR A-LIA (215 pb), LIS-L2A (98 pb), L2S-L3A (140 pb) y L3S-H (151 pb) se purificaron mediante gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5% y se ensamblaron en la segunda PCR. En la segunda PCR, 98 \mul de la mezcla de PCR que contiene 1 \mug de cada productos de la PCR de primer etapa y 5 u de Ample Taq se incubó durante 2 ciclos de 94ºC durante 25 minutos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos y luego se agregaron 100 pmol de cada cebador externo (A y H). El tubo de PCR se recubrió con 50 \mul de aceite mineral y se realizaron 30 ciclos de PCR en las mismas condiciones anteriores.
Un fragmento de ADN de 516 pb que proviene de la segunda PCR se purificó mediante gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%, se digirió con BamHI y HindIII y los fragmentos de ADN así obtenidos se clonaron en el vector de expresión de HEF HEF-VL-g\kappa. Después de determinar la secuencia de ADN, el fragmento de ADN que tiene la secuencia de aminoácidos correcta de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se diseñó como plásmido HEF-RVLa-AHM-g\kappa. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la región V de la cadena L contenido en este plásmido HEF-RVLa-AHM-g\kappa se muestran en la SEQ ID NO: 11.
La versión b de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se construyó por mutagénesis mediante PCR. Los cebadores del mutágeno FTY-1 (SEQ ID NO: 77) y FTY-2 (SEQ ID NO: 78) se diseñaron de modo de mutar la fenilalanina en la posición 71 a tirosina.
Después de amplificar los cebadores anteriores mediante el plásmido HEF-RVLa-AHM-g\kappa como molde, el producto final se purificó por digestión con BamHI y HindIII. Los fragmentos de ADN obtenidos se clonaron en el vector de expresión de HEF HEF-VL-g\kappa para obtener el plásmido HEF-RVLb-AHM-g\kappa. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena L contenida en este plásmido HEF-RVLb-AHM-g\kappa muestran en la SEQ ID NO; 13.
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3. Construcción de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado 3-1. Construcción de la versiones a á e de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado
El ADN que codifica la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se diseñó de la siguiente manera. Por conexión de la secuencia de ADN que codifica la FR1 a 3 del anticuerpo humano HG3 y la FR4 del anticuerpo humano JH6 ala secuencia de ADN que codifica la CDR de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón, se diseñó el ADN de longitud completa que codifica la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
Luego, se unieron al extremo 5' y al extremo 3' de esta secuencia de ADN, la secuencia del sitio de reconocimiento HindIII/secuencia de consenso KOZAK y sitio de reconocimiento BamHI/secuencia dadora de empalme, respectivamente, de modo de permitir la inserción del vector de expresión HEF.
Las secuencias de ADN así diseñadas se dividieron en cuatro oligonucleótidos. Posteriormente, los oligonucleótidos que potencialmente dificultan el ensamblaje de estos oligonucleótidos se sometieron al análisis de computadora para la estructura secundaria. Las secuencias de los cuatro oligonucleótidos RVH1 a RVH4 se muestran en la SEQ ID NO: 79 a 82. Estos oligonucleótidos tienen una longitud de 119 a 144 bases y tienen la región de superposición de 25 a 26 pb. Entre los oligonucleótidos, RVH2 (SEQ ID NO: 80) y RVH4 (SEQ ID NO: 82) tiene la secuencia homosentido, y RVH1 (SEQ ID NO: 79) y RVH3 (SEQ ID NO: 81) tiene la secuencia de ADN antisentido. El método para ensamblaje de estos cuatro oligonucleótidos por el método PCR se muestra en la Figura (ver Fig. 5).
La mezcla de PCR (98 \mul) que contiene 100 ng de cada uno de los cuatro oligonucleótidos y 5 u de Ampli Taq se desnaturalizó primero con calentamiento a 94ºC durante 2 minutos, se sometió a a dos ciclos de incubación que comprende 94ºC durante 2 minutos, 55ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 2 minutos. Después se agregaron 100 pmoles de cada uno de RHP1 (SEQ ID NO: 83) y RHP2 (SEQ ID NO: 84) como cebador externo, el tubo de PCR se recubrió con 50 \mul de aceite mineral. Luego se desnaturalizó primero por calentamiento a 94ºC durante 1 minuto, y luego se sometió a 38 ciclos de 94ºC durante 1 minuto, 55ºC durante 1 minuto y 72ºC durante 1 minuto, y luego se incubó a 72ºC durante 10 minutos.
El fragmento de ADN de 438 pb se purificó mediante gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%, se digirió con HindIII y BamHI, y luego se clonó en el vector de expresión de HEF HEF-VH-g\gamma1. Después de la determinación de la secuencia base, el plásmido que contiene el fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de región V correcta de la cadena H como HEF-RVHa-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 11.
Cada una de las versiones b, c, d, y e de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se construyó de la siguiente manera.
Mediante el cebador mutágeno BS (SEQ ID NO: 85) y BA (SEQ ID NO: 86) diseñado para mutar arginina en la posición 66 a lisina y como ADN molde, el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1 por el método de PCR, se amplificó la versión b para obtener el plásmido HEF-RVHb-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHb-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 17.
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Usando como cebador mutágeno CS (SEQ ID NO: 87) y CA (SEQ ID NO: 88) diseñado para mutar treonina en la posición 73 a lisina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1 por el método de PCR, se amplificó la versión c para obtener el plásmido HEF-RVHc-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHc-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 19.
Usando como cebador mutágeno DS (SEQ ID NO: 89) y DA (SEQ ID NO: 90) diseñado para mutar arginina de la posición 66 a lisina y treonina la posición 73 a lisina y como ADN molde el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1 por el método de PCR, se amplificó la versión de para obtener el plásmido HEF-RVHd-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHd-AHM-g\gammal se muestran en la SEQ ID NO: 21.
Usando como cebador mutágeno ES (SEQ ID NO: 91) y EA (SEQ ID NO: 92) diseñado para mutar valina de la posición 67 a alanina y metionina de la posición 69 a leucina y como ADN molde el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1, se amplificó la versión e para obtener el plásmido HEF-RVHe-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHe-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 23.
3-2. Construcción de la región V del híbrido de cadena H
Se construyeron dos regiones V híbridas de cadena H. Una es un anticuerpo anti-HM1.24 híbrido ratón-humano en el que las secuencias de aminoácidos de FR1 y FR2 derivan del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón y las de FR3 y FR4 son de la versión a de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el otros es el anticuerpo anti-HM1.24 híbrido humano-ratón en el que las secuencias de aminoácidos de la FR1 y FR2 derivan de la versión a de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y las de FR3 y FR4 son del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón. Todas las secuencias de aminoácidos de las regiones de CDR derivan del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón.
Se construyeron dos regiones V híbridas de cadena H por el método de PCR. El método se muestra esquemáticamente en las Fig. 6 y 7. Para la construcción de dos regiones V híbridas de cadena H, se usaron cuatro cebadores. Los cebadores externos a (SEQ ID NO: 93) y h (SEQ ID NO: 94) se diseñaron para hibridar con la secuencia de ADN del vector de expresión HEF HEF-VH-g\gamma1. El cebador de la construcción híbrida de cadena H HYS (SEQ ID NO: 95) se diseño para tener la secuencia de ADN homosentido y el cebador del híbrido de cadena H HYA (SEQ ID NO: 96) tiene la secuencia de ADN antisentido de modo que las secuencias de ADN sean complementarias entre sí.
Para la construcción de la región V híbrida de cadena H dentro de las secuencias de aminoácidos de la FR1 y FR2 se derivan del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón y las de FR3 y FR4 de una versión de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, se realizaron la PCR mediante el plásmido HEF-1,24H-g\gamma1 como molde, el cebador externo a y el cebador del híbrido de cadena H y la PCR mediante el plásmido HEF-RVLa-AHM-g\gamma1 como molde, el cebador del híbrido de cadena H HYS (SEQ ID NO: 95), y el cebador externo h (SEQ ID NO: 94) en la primera etapa de la PCR para purificar cada producto de PCR. Los dos productos de PCR de la primera PCR se dejaron ensamblar por su propia complementariedad (ver publicación de Patente Internacional Nº WO 92-19759).
Luego, por el agregado de los cebadores externos a (SEQ ID NO: 93) y h (SEQ ID NO: 94), un ADN de longitud completa que codifica la región V híbrida de cadena H en la que las secuencias de aminoácidos de FR1 y FR2 derivan del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón y los de las FR3 y FR4 son de una versión a de la región V de la cadena H del anti-HM1.24 humano reconfigurado, se amplificó en la segunda etapa de la PCR.
Para la construcción de la región V híbrida de cadena H en la que las secuencias de aminoácidos de FR1 y FR2 derivan de la versión a de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y las de FR3 y FR4 son del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón, se realizaron las PCR mediante el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1 como molde, el cebador externo a, y el cebador del híbrido de la cadena H HYA, y PCR mediante el plásmido HEF-1,24H-g\gamma1 como molde, el cebador del híbrido de la cadena H HYS, y el cebador externo h en la primera etapa de PCR para purificar cada producto de PCR. Los dos productos PCR purificados de la primera PCR se dejaron ensamblar por propia complementariedad (ver publicación de Patente Internacional Nº WO 92-19759).
Luego, por el agregado de los cebadores externos a y h, un ADN de longitud completa que codifica la región V híbrida de cadena H en la que las secuencias de aminoácidos de FR1 y FR2 derivan de la versión de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y las de FR3 y FR4 son del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se amplificó en la segunda etapa de la PCR.
Los métodos de la primera PCR, purificación de los productos de PCR, ensamblaje, la segunda PCR y la clonación en el vector de expresión de HEF HEF-VH-g\gamma1 de acuerdo con los métodos mostrados en el "Ejemplo 9. Construcción de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado".
Después de la secuenciación de la secuencia de ADN, el plásmido que contiene el fragmento de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos correcta de la región V híbrida de cadena H en las secuencias de aminoácidos de FR1 y FR2 derivan del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón y las de FR3 y FR4 son de una versión a de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 se denominó HEF-MH-RVH-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-MH-RVH-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 97. Asimismo, el plásmido que contiene el fragmento de ADN, que codifica la secuencia de aminoácidos correcta de la región V híbrida de cadena H, en la que las secuencias de aminoácidos de FR1 y FR2 derivan de la versión a de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y las de FR3 y FR4 son del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se denominó HEFHM-RVH-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-HM-RVH-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 99.
3-3. Construcción de las versiones f a r de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
Cada una de las versiones f, g, h, i, j, k, I, m, n, o, p, q, y r de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se construyeron de la siguiente manera.
Usando como cebador mutágeno FS (SEQ ID NO: 102) y FA (SEQ ID NO: 103) diseñado para mutar treonina de la posición 75 a serina y valina de la posición 78 a alanina y como ADN molde el plásmido HEF-RVHe-AHM-g\gamma1 por el método de PCR, la versión f se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHf-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHf-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 25.
Usando como cebador mutágeno GS (SEQ ID NO: 104) y GA (SEQ ID NO: 105) diseñado para mutar alanina de la posición 40 a arginina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1, la versión g se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHg-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHg-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 27.
Usando como cebador mutágeno FS (SEQ ID NO: 102) y FA (SEQ ID NO: 103) y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHb-AHM-g\gamma1, la versión h se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base f la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 29.
Usando como cebador mutágeno IS (SEQ ID NO: 106) y IA (SEQ ID NO: 107) diseñado para mutar arginina en la posición 83 a alanina y serina de la posición 84 a fenilalanina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1, la versión i se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHi-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHi-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 31.
Usando como cebador mutágeno JS (SEQ ID NO: 100) y JA (SEQ ID NO: 109) diseñado para mutar arginina de la posición 66 a lisina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHf-AHM-g\gamma1, la versión j se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVFj-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHj-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 33.
Usando como cebador mutágeno KS (SEQ ID NO: 110) y KA (SEQ ID NO: 111) diseñado para mutar ácido glutámico de la posición 81 a glutamina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1, la versión k se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHk-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHk-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 35.
Usando como cebador mutágeno LS(SEQ ID NO: 112) y LA (SEQ ID NO: 113) diseñado para mutarácido glutámico de la posición 81 a glutamina y serina de la posición 82B a isoleucina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1, la versión 1 se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHI-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHI-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 37.
Usando como cebador mutágeno MS (SEQ ID NO: 114) y (SEQ ID NO: 115) diseñado para mutar ácido glutámico de la posición 81 a glutamina y serina de la posición 82b a isoleucina, y treonina de la posición 87 a serina y como ADN molde, el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1, la versión m se amplificó para obtener el plásmido RVHm-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHm-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 39.
Usando como cebador mutágeno NS (SEQ ID NO: 116) y NA (SEQ ID NO: 117) diseñado para mutar serina de la posición 82B a isoleucina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1, la versión n se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHn-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHn-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 41.
Usando como cebador mutágeno OS (SEQ ID NO: 118) y OA (SEQ ID NO: 119) diseñado para mutar treonina de la posición 87 a serina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHh-AHM-g\gamma1, la versión o se amplificó para obtener el plásmido HEF-RVHo-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHo-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 43.
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Usando como cebador mutágeno PS (SEQ ID NO: 120) y PA (SEQ ID NO: 121) diseñado para mutar valina de la posición 78 a alanina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1, la versión p se amplificó por el método de PCR para obtener el plásmido HEF-RVHp-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHp-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 45.
Usando como cebador mutágeno QS (SEQ ID NO: 122) y QA (SEQ ID NO: 123) diseñado para mutar treonina de la posición 75 a serina y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHa-AHM-g\gamma1, la versión q se amplificó por el método de PCR para obtener el plásmido HEF-RVHq-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHq-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 47.
Usando como cebador mutágeno CS (SEQ ID NO: 87) y CA (SEQ ID NO: 88) y, como ADN molde, el plásmido HEF-RVHp-AHM-g\gamma1, la versión r se amplificó por el método de PCR para obtener el plásmido HEF-RVHr-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia base de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHr-AHM-g\gamma1 se muestran en la SEQ ID NO: 49.
Las regiones que codifican la región variable de cada uno de los plásmidos anteriormente mencionados HEF-RVLa-AHMg\kappa yHEF-RVH-AHM-g\gamma1 se digirieron para preparar los fragmentos de restricción con las enzimas de restricción HindIII y BamHI. Estos se insertaron en los sitios HindIII y BamHI del vector del plásmido pUCI9. Cada plásmido se denominó pUC19-RVLa-4HM-g\kappa y pUC19-RVHr-AHM-g\gamma1.
La Escherichia coli que contiene cada uno de los plásmidos pUC19-RVLa-4HM-g\kappa y pUC19-RVHr-AHM-g\gamma1 se denominó Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVLa-4HM-g\kappa) y Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHM-g\gamma1), respectivamente y se han depositado en forma internacional el 29 de Agosto de 1996, con el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, lbalaki prefecture, Japón) con los números de acceso FERM PB-5645 y FERM PB-5643, respectivamente, bajos las condiciones del Tratado de Budapest.
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4. Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, el anticuerpo antiHM1.24 quimérico y el anticuerpo híbrido de cadena H
Con el fin de evaluar cada cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, se dejaron expresar el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico como anticuerpo de control positivo. En la construcción de cada una de las versiones b y después de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, se dejó expresar el anticuerpo híbrido de cadena H para investigar que secuencia de aminoácidos de la FR se debería sustituir. Además, esta se expresó en combinación con la cadena H quimérica con el fin de evaluar la versión a de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
4-1. Expresión del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado
Diez \mug de cada vector de expresión (HEF-RVHa-AHM-g\gamma1 a HEF-RVHr-AHM-g\gamma1) para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y el vector de expresión (HEF-RVLa-AHM-g\kappa o HEF-RVLb-AHM-g\kappa) para la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se cotransformaron en las células COS-7 por electroporación usando el instrumento Gene Pulser (fabricado por BioRad). Cada ADN (10 \mug) se agregó a alícuotas de 0,8 ml de 1 x 10^{7} células/ml en PBS y se sometió a pulsos a 1500 V y una capacidad de 25 \muF.
Después del período de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, se agregaron las células sometidas a electroporación a 30 ml del líquido de cultivo DHEM (fabricado por GIBCO) que contiene 10% de suero fetal bovino libre de \gamma-globulina. Después de la incubación de 72 horas en el de incubador de CO_{2} BNAl20D (fabricado por TABAI) en la condición de 37ºC y 5% de CO_{2}, se recogió el sobrenadante del cultivo, se eliminaron los desechos celulares por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga 15PR-22 (fabricada por HITACHI) equipada con un rotor de centrífuga 03 (fabricado por HITACHI), y un microconcentrador (Centricon 100, fabricado por Amicon) se ultrafiltró mediante una centrífuga J2-21 (fabricada por BECKMAN) equipada con un rotor de centrífuga JA-20,1 (fabricado por BECKMAN) a una condición de 2000 rpm, y se usó para el Cell-ELISA.
4-2. Expresión del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico
Mediante ten \mug de cada vector de expresión HEF-1.24H-g\gamma1 para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano quimérico y el vector de expresión HEF-1,24L-g\kappa para la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano quimérico, el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico usado para el Cell-ELISA se preparó de acuerdo con el método e mencionado anteriormente para la expresión del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
4-3. Expresión del anticuerpo anti-HM1.24 que comprende la versión a de la cadena L humanizada y la cadena H quimérica
Mediante diez \mug de cada vector de expresión HEF-1.24H-g\gamma1 para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano quimérico y el vector de expresión HEF-RVLa-AHM-g\kappa para la versión a de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, el anticuerpo anti-HM1.24 que comprende la versión a de la cadena L humanizada y cadena H quimérica usada en el Cell-ELISA se preparó de acuerdo con el método mencionado anteriormente para la expresión del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
4-4. Expresión del anticuerpo híbrido de cadena H
Mediante diez \mug de cada vector de expresión (HEF-MH-RVH-AHM-g\gamma1 o HEF-HM-RVH-AHM-g\gamma1) para la región V híbrida de la cadena H y el vector de expresión HEF-RVLa-AHM-g\kappa para la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, el anticuerpo híbrido de la cadena H usado para el Cell-ELISA se preparó de acuerdo con el método mencionado anteriormente para la expresión del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado.
4-5. Medición de la concentración del anticuerpo
La concentración del anticuerpo obtenido se midió por ELISA. Cada pocillo de la placa ELISA de 96 pocillos (Maxisorp, fabricado por NUNC) se inmovilizó por el agregado de 100 \mul de anticuerpo IgG anti-humana de cabra (fabricado por BIO SOURCE) preparado a una concentración de 1 \mug/ml con el tampón de revestimiento (NaHCO_{3} 0,1 M, NaN_{3} 0,02%, pH 9,6) e incubación a temperatura ambiente durante una hora. Después del bloqueo con 100 \mul del tampón de dilución (50 mM de Tris-HCL, 1 mM de MgCl_{2}, 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20, 0,02% de NaN_{3}, 1% de albúmina sérica bovina (BSA), pH 8,1), 100 \mul de cada dilución seriada del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, anti-HM1.24 quimérico y el anticuerpo híbrido de cadena H que se concentraron por ultrafiltración, se agregaron a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Luego, después del lavado, se agregó 100 \mul de anticuerpo IgG anti-humana de cabra marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por DAKO).
Después de incubar a temperatura ambiente durante una hora y lavar, se agregaron 100 \mul de 1 \mug/ml de solución sustrato (Sigmal 04, fosfato de p-nitrofenilo, fabricado por SIGMA) disuelto en el tampón del sustrato (NaHCO_{3} 50 mM, MgCl_{2} 10 mM, pH 9,8) y luego se midió la absorbancia a 405 nm usando el lector de microplaca Model 3550 (fabricado por Bio Rad). Como estándar para la medición de la concentración, se usó IgG1\kappa humana (fabricado por Binding Site).
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5. Establecimiento de la línea celular CHO que produce en forma estable el anticuerpo anti-HM1.24 humano 5-1. Construcción del vector de expresión para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado
Por digestión del plásmido HEF-RVHr-AHM-g\gamma1 con las enzimas de restricción PvuI y BamHI, un fragmento de aproximadamente 2,8 kpb que contiene el ADN que codifica el promotor EF1 y la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se purificaron mediante gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%. Luego, el fragmento de ADN anterior se insertó en un fragmento de aproximadamente 6 kpb preparado por digestión del vector de expresión usado para un vector de expresión de la cadena H, DHFR-\DeltaE-RVh-PM1f (publicación de Patente Internacional Nº WO 92-19759), que contiene el gen DHFR y el gen que codifica la región constante de una cadena H humana con PvuI y BamHI para construir un vector de expresión, DHFRAE-HEF-RVHr-AHM-g\gamma1, para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado.
5-2. Introducción del gen en las células CHO
Para establecer un sistema de producción estable del anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado, los genes de los vectores de expresión mencionados anteriormente, DHFR-AE-RVHr-AHM-g\gamma1 y HEF-RVLa-AHM-g\kappa, linealizados por digestión con PvuI se introdujeron simultáneamente en la célula CHO DXB-11 por el método de electroporación en la condición similar mencionada anteriormente (transfección en las células COS-7 mencionadas anteriormente).
5-3. Amplificación génica por MTX
Entre las células CHO con el gen introducido CHO, solo las células CHO en las que se han introducido ambos vectores de expresión de la cadena L y la cadena H pueden sobrevivir en un líquido de cultivo \alpha-MEM libre de nucleósidos (fabricado por GIBCO-BRL) al que se agregaron 500 \mug/ml de G418 (fabricado por GIBCO-BRL) y 10% de suero fetal bovino y de este modo se realizó la selección. Posteriormente, se agregaron 10 nM de MTX (fabricado por Sigma) al líquido de cultivo anterior. Entre los clones que se propagaron, se seleccionaron los que producen el anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado en grandes cantidades. Como resultado, se obtuvo el clon #1 que exhibe una eficiencia de producción de aproximadamente 3 \mug/ml del anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado y denominado línea celular productora de anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado.
5-4. Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado
El anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado se construyó con el siguiente método. Las células CHO anteriores producen el anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado se cultivaron durante 10 días mediante el medio líquido de cultivo \alpha-MEM libre de nucleósidos (fabricado por GIBCO-BRL) al que se agregaron 500 pg/ml G418 (fabricado por GIBCO-BRL) que contiene 10% de suero fetal bovino libre de \gamma-globulina (fabricado por GIBCO-BRL) mediante el incubador de CO_{2} BNAS120D (fabricado por TABAI) en la condición de 37ºC y 5% de CO_{2}. En el día 8 y 10 después del comienzo del cultivo se recuperó el líquido de cultivo, se eliminaron los desechos celulares por centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm usando la centrífuga RL-500SP (fabricado por Tomy Seiko) equipada con el rotor TS-9, y luego se filtró en forma esterilizada mediante un frasco con filtro superior (fabricado por FALCON) que tiene una membrana con poros de 0,45 \mum de diámetro.
Después del agregado de una cantidad igual de PBS(-) al líquido de cultivo de las células CHO que producen el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado, el anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado se purificó por afinidad usando el sistema de purificación de anticuerpo de alta velocidad ConSep LC100 (fabricado por MILLIPORE) y columna de proteína A Hyper D (fabricado por Nippon Gaishi) usando PBS(-) como tampón de absorción/lavado y tampón citrato de sodio 0,1 M (pH 3) como tampón de elución de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Las fracciones eluidas se ajustaron a aproximadamente pH 7,4 por la adición inmediata de Tris 1 M-HCl (pH 8,0) y luego se usa el concentrador de ultrafiltración por centrifugado Centriprep 10 (fabricado por MILLIPORE), se realizó la concentración y sustitución a PBS() y se filtró en forma esterilizada mediante un filtro de membrana MILLEX-GV (fabricado por MILLIPORE) con un tamaño de poro de 0,22 \mum para obtener el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado purificado. Se midió la concentración del anticuerpo por la absorbancia a 280 nm y se calculó con 1 pg/ml como DO 1,35.
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Ejemplo de Referencia 11
Determinación de actividad del anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado
Se evalúo el anticuerpo anti-HM1.24 reconfigurado para determinar la actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión.
1. El método de medición de la actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión 1-1. Medición de actividad de unión al antígeno
La actividad de unión al antígeno se midió por el Cell-ELISA mediante células WICH. Las placas Cell-ELISA se prepararon como se describió en el Ejemplo anterior 7.1-2.
Después del bloqueo, se agregaron 100 \mul de las diluciones seriadas del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado obtenido del concentrado del sobrenadante del cultivo de las células COS-7 o se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo de las células CHO a cada pocillo. Después de incubar durante 2 horas a temperatura ambiente y lavar, se agregó anticuerpo IgG anti-humano de conejo marcado con peroxidasa (fabricado por DAKO). Después de incubar durante 1 horas a temperatura ambiente y lavar se agregó solución del sustrato y se incubó. Luego la reacción se detuvo por la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 6 N y se midió la absorbancia a 490 usando el lector de microplaca Model 3550 (fabricado por Bio-Rad),
1-2. Medición de la actividad de inhibición de unión
Se midió la actividad de inhibición de unión por el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón marcado con biotina por el Cell-ELISA usando células WISH. Las placas Cell-ELISA se prepararon como se describió. Después del bloqueo, se agregaron 50 \mul de las diluciones seriadas del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado obtenido del concentrado del sobrenadante del cultivo de las células COS-7 o se purificaron a partir del sobrenadante del cultivo de las células CHO a cada pocillo y se agregaron simultáneamente 50 \mul de 2 \mu,g/ml de anticuerpo anti-HM1.24 de ratón marcado con biotina. Después de incubar a temperatura ambiente durante dos horas y lavar, se agregó estreptavidina marcada con peroxidasa (fabricada por DAKO). Después de incubar a temperatura ambiente durante una hora y luego se lavó, se agregó la solución del sustrato y se incubó. Luego la reacción se detuvo por la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 6 N y se midió la absorbancia a 490 usando el lector de microplaca Model 3550 (fabricado por Bio-Rad).
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2. Evaluación del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado 2-1. Cadena L
La versión a de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se evaluó como se mencionó anteriormente para la medición de la actividad de unión al antígeno. Como se muestra en la Fig. 8, cuando la versión a de la cadena L se expresa en combinación con la cadena H quimérica se demostró que tenía un nivel similar de actividad de unión al antígeno. No obstante, en consideración de un aumento adicional de la actividad y de la compatibilidad con la cadena H, se construyó la versión b de cadena L. Las versiones a y b de la cadena L se evaluaron juntas para determinar la actividad de unión al antígeno y de la actividad de inhibición de unión cuando se combina con las versiones a, b, f o h de la cadena H. Como se muestra en la Fig. 9, 10, 11, y 12, la versión a de la cadena L presentó una actividad mayor que la versión b en ambas actividades en todas las versiones a, b, f, y h de la cadena H. En consecuencia, la versión a de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se usó para el siguiente experimento.
2-2. Versiones de la cadena H a hasta e
Las versiones a hasta e de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se evaluaron en combinación con la versión a de la cadena L como se mencionó anteriormente para la medición de la actividad de unión al antígeno y para la actividad de inhibición de unión. El resultado, como se muestra en las Fig. 11, 13, 14, y 15, indicaron que todas las versiones eran más débiles en ambas actividades en comparación con el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico, lo que sugiere que se requiere una sustitución de aminoácido adicional.
2-3. Anticuerpo híbrido de cadena H
Se evaluó el anticuerpo híbrido de cadena H como se mencionó anteriormente para la medición de la actividad de unión al antígeno. El resultado, como se muestra en la Fig. 16, indicó que el anticuerpo anti-HM1.24 híbrido humano-ratón ha mostrado una actividad similar a la del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico para la actividad de unión al antígeno, mientras que el anticuerpo anti-HM1.24 híbrido ratón-humano presentó una actividad mas débil que la del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico. Esto indicó que, para construir el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado que presenta la actividad de unión al antígeno similar a la del e anticuerpo anti-HM1.24 quimérico, es necesario convertir aminoácidos incluidos en la FR3 o FR4 entre los que están contenidos en la región V de la cadena H.
2-4. Versiones f a r de la cadena H
Se evaluó la versión f de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado como se mencionó anteriormente para la medición de actividad de unión al antígeno. El resultado, como se muestra en Fig. 17, indicó que su actividad de unión al antígeno está disminuida en comparación con el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico, pero está aumentada en comparación con las anteriores versiones a hasta c, lo que sugiere que ninguno de los cuatro aminoácidos de las posiciones 67, 69, 75, y 78 que fueron convertidas recientemente en esta la versión es responsable por la actividad del anticuerpo humano reconfigurado.
La versión g de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se evaluó como se mencionó anteriormente para la medición de actividad de unión al antígeno. El resultado, como se muestra en las Fig. 18 y 19, indicó que esta versión ha presentado un nivel similar de actividad a la de la versión anterior a que a lo sumo, revela que, como se demostró para la cadena H del anticuerpo híbrido humano-ratón anterior, el aminoácido de la posición 40 que fue convertido en esta versión no es responsable del aumento de la actividad del anticuerpo humano reconfigurado.
Se evaluaron las versiones h a j de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado como se mencionó anteriormente para la medición de actividad de unión al antígeno y de la actividad de inhibición de unión. El resultado, como se muestra en las Fig. 20, 21, 22, y 23, indicó que todas las versiones fueron más débiles para ambas actividades en comparación con el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico y fueron similares a la mencionada anteriormente f, lo que sugiere que los aminoácidos de las posiciones 67 y 69 entre los cuatro aminoácidos que fueron convertidos recientemente en la versión f no son responsables del aumento de la actividad del anticuerpo humano reconfigurado.
Las versiones k a p de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se evaluaron como se mencionó anteriormente para la medición de actividad de unión al antígeno y de la actividad de inhibición de unión. El resultado, como se muestra en las Fig. 24, 25, 26, y 27, indicó que todas las versiones fueron más débiles para ambas actividades en comparación con el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico y fueron similares a la mencionada anteriormente h, lo que sugiere que los aminoácidos de la posición 80 y después que fueron convertidos en esta seis versiones no eran responsables del aumento de la actividad del anticuerpo humano reconfigurado.
La versión q de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se evaluó como se mencionó anteriormente para la medición de actividad de unión al antígeno y de la actividad de inhibición de unión. El resultado, como se muestra en las Fig. 25 y 27, indicó que esta versión fue más débil para ambas actividades en comparación con la versión h anterior o la versión p y a lo sumo fue similar a la de la mencionada anteriormente a, lo que sugiere que la sustitución del aminoácido de la posición 78 es esencial para el aumento de la actividad del anticuerpo humano reconfigurado.
La versión r de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se evaluó por el método mencionado anteriormente. El resultado, como se muestra en las Fig. 15 y 28, indicó que la versión r tiene un nivel similar de actividad de unión al antígeno y de actividad de inhibición de unión a la del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico.
Los resultados anteriores indicaron que la conversión mínima necesaria para que el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado tenga un nivel similar de actividad de unión al antígeno a la del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón o el anticuerpo anti-HM1.24 quimérico es la de los aminoácidos de las posiciones 30, 71 y 78 y, además, 73.
La actividad de unión al antígeno y la actividad de inhibición de unión para las versiones de la cadena H a a r del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se sintetizan en la Tabla 2.
TABLA 2
2
Además, las secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado y las versiones a y b de la cadena L se muestran en la Tabla 3, y las de las versiones a a r de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado se muestran en las Tablas 4 a 6.
TABLA 3 La secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L 
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3
TABLA 4 La secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H (1)
4 
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TABLA 5 La secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H (2)
5
TABLA 6 La secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena H
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3. Evaluación del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado purificado
Se evaluó la actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión mencionadas anteriormente de anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado purificado. El resultado, como se muestra en Fig. 31 y 32, indicó que el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado tiene un nivel similar de actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión a la del anticuerpo anti-HM1.24 quimérico. Este hecho indicó que el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado tiene la misma actividad de unión al antígeno que el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón.
Ejemplo de Referencia 12
Construcción del hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 monoclonal de ratón
Se preparó el hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-HM1.24 de ratón de acuerdo con el método descripto en Goto, T. et al., Blood (1994) 84, 1992-1930.
Se aplicó la línea celular KPC-32 de plasma negativo para el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr (1 x 10^{7} células) derivadas de médula ósea de pacientes humanos con mieloma múltiple (Goto, T. et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (11991) 32, 1400) por vía intraperitoneal dos veces a ratones BALB/c (producidos por Charles River) cada seis semanas.
Para elevar adicionalmente el título de la producción de anticuerpos, se inyectaron 1,5 x 10^{6} células KPC-32 en el bazo de los ratones tres días antes de sacrificar a los animales (Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Después de sacrificar a los ratones, se extirpó el bazo y se retiraron las células del bazo de acuerdo con el método de Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465) se sometieron a la fusión celular con las células de mieloma SP2/0.
Se detectó el anticuerpo en el sobrenadante del cultivo del hibridoma por ELISA (Posner, M.R. et at., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23) mediante las placas recubiertas con células KPC-32. Se suspendieron 5 x 10^{4} células KPC-32 en 50 ml de PBS y se dispensaron en placas de 96 pocillos (extremo inferior en U Corning, fabricado por Iwaki). Después del bloqueo con 1% de albúmina sérica bovina (BSA) que contiene PBS, se agregó el sobrenadante del hibridoma y se incubó a 4ºC durante 2 horas. Posteriormente, se hizo reaccionar anticuerpo IgG de cabra anti-ratón marcada con peroxidasa (fabricado por Zymed) a 4ºC durante 1 hora, se lavó una vez y se hizo reaccionar con la solución del sustrato o-fenilendiamina (fabricado por Sumitomo Bakelite) a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de detener la reacción con ácido sulfúrico 2 N, se midió la absorbancia a 492 nm usando el lector de ELISA (fabricado por Bio-Rad). Para eliminar el hibridoma que produce anticuerpo contra la inmunoglobulina humana, el sobrenadante del cultivo del hibridoma positivo se había adsorbido previamente en suero humano y se detectó la reactividad de otros componentes subcelulares. Se seleccionaron los hibridomas positivos y se investigó su reactividad con diversas líneas celulares y muestras humanas por medio de citometría de flujo. Los clones del hibridoma finalmente seleccionado se clonaron dos veces, se inyectaron en la cavidad abdominal de los ratones BALB/c tratados con pristano y luego se obtuvo el líquido ascítico de ellas.
Se purificó el anticuerpo monoclonal a partir de la ascitis del ratón por precipitación con sulfato de amonio y el kit de cromatografía de afinidad de la Proteína A (Ampure PA, fabricado por Amersham). El anticuerpo purificado se conjugó a isocianato de fluoresceína (FITC) usando el kit de conjugación Quick Tag FITC (fabricado por Boehringer Mannheim).
Como resultado, el anticuerpo monoclonal producido por 30 clones de hibridoma se hizo reaccionar con células KPC-32 y RPMI 8226. Después de la clonación, se investigó la reactividad del sobrenadante de estos hibridomas con otras líneas celulares y monocitos derivados de sangre periférica.
De éstos, tres clones fueron anticuerpos monoclonales que reaccionan específicamente con células plasmáticas. De estos tres clones, se seleccionó el clon del hibridoma que tiene el clon que es más útil para la citometría de flujo y que tiene citotoxicidad dependiente del complemento y se denominó HM1.24. La subclase de anticuerpo monoclonal producido por este hibridoma se determinó por ELISA usando anticuerpo de conejo anti-ratón específico de la subclase (fabricado por Zymed). El anticuerpo anti-HM1.24 presentó una subclase de IgG2a \kappa. El hibridoma que produce el anticuerpo anti-HM1.24 se depositó internacionalmente el 14 de Septiembre de 1995, con el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Prefectura de Ibaraki, Japón) bajo el número de acceso FERM PB-5233 según las condiciones del Tratado de Budapest.
Ejemplo de Referencia 13
Clonación de ADN que codifica el polipéptido antigénico HM1.24 1. Construcción de la genoteca de ADNc 1) Preparación del ARN total
El ADNc que codifica el antígeno HM1.24 que es un polipéptido antigénico reconocido específicamente por el anticuerpo HM1.24 monoclonal de ratón se aisló de la siguiente manera.
A partir de la línea celular KPMM2 del mieloma múltiple humano, se preparó el ARN total de acuerdo con el método de Chirgwin et al. (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). De este modo, 2,2 x 10^{8} de células KPMM2 se homogenizaron completamente en 20 ml de isocianato de guanidina 4 M (fabricado por Nacalai Tesque Inc.).
El homogenato se recubrió con una capa de cloruro de cesio 5,3 M en el tubo de centrífuga, que luego se centrifugó mediante un rotor Beckman SW40 a 31.000 rpm a 20ºC durante 24 horas para precipitar el ARN. El precipitado del ARN se lavó con 70% de etanol y disolvió en 300 \mul de Tris 10 mM-HCl (pH 7,4) que contiene 1 mM de EDTA y 0,5% de SDS. Después de agregar Pronasa (fabricado por Boehringer) al mismo a una concentración de 0,5 mg/ml, se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La mezcla se extrajo con fenol y cloroformo para precipitar el ARN. Luego, el precipitado de ARN se disolvió en 200 \mul de Tris 10 mM-HCl (pH 7,4) que contiene EDTA 1 mM.
2) Preparación de poli(A)+ARN
Usando aproximadamente 500 \mug del ARN total preparado anteriormente como material bruto, se purificó poli(A)+ARN usando el kit de asilamiento de ARN Fast Track 2,0m (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit.
3) Construcción de genoteca de ADNc
Usando 10 \mug del poli(A)+ARN anterior como material bruto, se sintetizó ADNc de doble hebra usando el kit de síntesis ADNct TimeSaver (fabricado por Pharmacia) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit y, usando Directional Cloning Toolbox (fabricado por Pharmacia), adaptadora EcoRI se unió al mismos de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit. Se realizaron la quinación y el tratamiento de enzima de restricción NotI del adaptador de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit. Además, el ADNc de doble hebra unida al adaptador que tiene un tamaño de aproximadamente 500 pb o mayor se aisló y purificó mediante gel de agarosa 1,5% (fabricado por SIGMA) para obtener aproximadamente 40 \mul del ADNc de doble hebra unida al adaptador.
El ADNc de doble hebra unido al adaptador así preparado se unió mediante el vector pCOSI (Publicación de Patente no examinada japonesa (Kokai) No. 8(1996)-255196) y T4 ADN ligasa (fabricado por GIBCO BRL) que habían sido tratado previamente con las enzimas de restricción EcoRI y NotI y fosfatasa alcalina (fabricado por Takara Shuzo) para construir una genoteca de ADNc. La genoteca construida de ADNc se transdujo en la cepa de Escherichia coli DH5 (fabricado por GIBCO BRL) y se estimó que el tamaño total es aproximadamente 2,5 x 10^{6} de células independientes.
2. Clonación por expresión directa 1) Transfección en las células COS-7
Se amplificó el ADNc por cultivo de aproximadamente 5 x 10^{5} clones de la Escherichia coli transducida anteriormente en el medio 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)) que contiene 50 \mug/ml de ampicilina y se recuperó el ADN plásmido de la Escherichia coli por método alcalino (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)). El ADN plásmido obtenido se transfectó en células COS-7 por electroporación usando el instrumento Gene Pulser (fabricado por BioRad).
De este modo, se agregaron 10 \mug del ADN plásmido purificado a 0,8 ml de células COS-7 que se suspendieron en PBS a una concentración de 1 x 10^{7} células/ml y se sometieron con pulsos a 1500 V y una capacidad de 25 \muF. Después de 10 minutos del período de recuperación a temperatura ambiente, las células sometidas a electroporación se cultivaron en el medio DMEM (fabricado por GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero fetal bovino en la condición de 37ºC y 5% de CO_{2} durante tres días.
2) Preparación de la placa de separación
Una placa de separación recubierta con el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón se preparó por el método B. Seed et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). De este modo, se agregó el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón a 50 mM de Tris-HCl, pH 9,5, a una concentración de 10 \mug/ml. Se agregaron tres ml de la solución de anticuerpo así preparada a una placa de cultivo de tejido con un diámetro de 60 mm y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBS que contiene 0,15 M de NaCl, 5% de suero fetal bovino, 1 mM de EDTA, y se agregó 0,02% de NaN_{3} y después del bloqueo, se usó para la clonación siguiente.
3) Clonación de la genoteca de ADN
Las células COS-7 transfectadas como se describió anteriormente se desprendieron con PBS que contiene 5 mM de EDTA, y luego se lavó una vez con PBS que contiene 5% de suero fetal bovino. Luego se suspendió en PBS que contiene 5% de suero fetal bovino y 0,02% de NaN_{3} a una concentración de aproximadamente 1 x 10^{6} células/ml, que se agregó a la placa de separación preparada anteriormente y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de lavar tres veces con PBS que contiene 5% de suero fetal bovino y 0,02% de NaN_{3}, se recuperó el ADN plásmido de las células unidas a la placa de separación mediante una solución que contiene 0,6% de SDS y 10 mM de EDTA.
El ADN plásmido recuperado se transdujo otra vez a Escherichia coli DH5\alpha. Después de amplificar el plásmido ADN como anteriormente, se recuperó por el método alcalino. El ADN plásmido recuperado se transfectó en células COS-7 por método de electroporación para recuperar el ADN plásmido de las células unidas como se describió anteriormente. El mismo procedimiento se repitió una vez más y el ADN plásmido recuperado se digirió con enzimas de restricción EcoRI y NotI. Como resultado, se confirmó la concentración del inserto con un tamaño de aproximadamente 0,9 kpb. Se inocularon cincuenta \mug de Escherichia coli transducido con parte del ADN plásmido recuperado a la placa de agar 2-YT, que contiene 50 \mug/ml de ampicilina. Después de cultivar toda la noche, se recuperó el ADN plásmido que contiene a colonia única. Se digirió con enzimas de restricción EcoRI y NotI y se obtuvo el clon p3.19 que tiene un inserto de 0,9 kpb.
La secuencia base de este clon se determinó por la reacción mediante el kit de secuenciación del ciclo terminador PRISM, (fabricado por Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit. La secuencia de aminoácidos y su secuencia base se muestran en la SEQ ID NO: 128.
El ADNc que codifica el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 128 se insertó en el sitio de escisión XbaI del vector pUC19 y se ha preparado como plásmido pRS38-pUC19. La Escherichia coli que contiene este plásmido pRS38-pUC19 ha sido depositado internacionalmente el 5 de Octubre de 1993, como Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19), con el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, MITI (Higashi 1-chome 1-3, Tsukuba city, Prefectura de lbaraki, Japón) bajo el número de acceso FERM PB-4434 según las condiciones del Tratado de Budapest (ver publicacide Patente no examinada Japonesa (Kokai) Nº 7(1995)-196694).
Ejemplos
Como ejemplo de anticuerpos humanizados naturales compuestos de las secuencias naturales de la FR de la presente invención, se describe un ejemplo de preparación de un anticuerpo humanizado natural basado en el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado.
Ejemplo 1
El anticuerpo anti-HM1.24 monoclonal de ratón se humanizó como el anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado por injerto de la CDR descripto en los Ejemplos de Referencia. Cada una de las FR del anticuerpo HG3 humano para FR1 a FR3 y la FR4 del anticuerpo humano JH6 para FR4 se seleccionaron de la construcción de la cadena H humanizada. El resultado del estudio de los residuos de aminoácidos de la FR indicó que se necesitó la sustitución de aminoácidos en cuatro sitios (FR1/30, FR3/71, 73, 78) (Tablas 7 y 8). Este anticuerpo humanizado presentó una actividad de unión al antígeno similar a la del anticuerpo original. Este anticuerpo humanizado (anticuerpo humanizado que comprende RVLa/RVHr) se usó como anticuerpo de diseño primario.
7
8
(1) La construcción de la cadena H
Para la FR del anticuerpo de diseño primario, se realizó la búsqueda de homología en las FR humanas halladas en la naturaleza mediante tales bases de datos como SeissPlot, GenBank, PRF, PIR y GenPept. Primero, se hallaron 50 FR humanas que presentaban el apareamiento completo de las secuencias de aminoácidos para FR1. De este modo, la FR1 del anticuerpo de diseño primario ya tenía una secuencia natural. Debido a que no se habían realizado sustituciones de aminoácidos para FR2 y FR4, se halaron 50 y 100 FR naturales que incluyen HG3 y JH6 respectivamente del cuerpo humano natural.
Por otra parte, se hallaron apareamientos completos en FR3. Como FR3 que tenía la mayor homología, se hallaron S46463 que tiene una homología de 96,875%, 1921296C, HUMIGHRF 1, U00583 1 y similares (los símbolos son todos los números de acceso para la base de datos).
De este modo, en el anticuerpo de diseño primario, la FR3 fue la FR que contiene residuos de aminoácidos artificiales que no se hallaron en la naturaleza. La secuencia de aminoácidos se compara con la del anticuerpo humano S46463 que presentó la mayor homología en la Tabla 9.
9
El residuo de aminoácido de la posición 70 fue metionina en la FR3 del anticuerpo de diseño primario y fue isoleucina en la FR3 del anticuerpo humano S46463. Las otras secuencias de aminoácidos han demostrado apareamientos completos. De este modo, el residuo de aminoácidos de la posición 70 del anticuerpo de diseño primario se reemplazó con isoleucina para convertirla en una FR3 natural. Por consiguiente, el diseño de anticuerpo secundario obtenido es un anticuerpo con injerto de CDR que comprende la FR natural humana el anticuerpo humano S46463. El diseño de anticuerpo secundario construido de este modo comprende las FR que se hallan en la naturaleza.
(2) Construcción de la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural
La región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se construyó por mutagénesis mediante PCR. Los cebadores mutágenos SS (SEQ ID NO: 124) y SA (SEQ ID NO: 125) se diseñaron para mutar metionina de la posición 69 a isoleucina.
Después que el cebador anterior se amplificó usando el plásmido HEF-RVHr-AHM-g\gamma1 como molde, se purificó el producto final, se digirió con BamHI y HindIII, y el fragmento de ADN obtenido se clonó en un vector de expresión HEFVH-g\gamma1 para obtener un plásmido HEF-RVHs-AHM-g\gamma1. La secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la región V de la cadena H contenida en este plásmido HEF-RVHs-AHM-gV1 se muestran en la SEQ ID NO: 126.
La región que codifica la región variable del plásmido mencionado anteriormente HEF-RVHs-AHM-g\gamma1 se digirió con enzimas de restricción HindIII y BamHI para preparar un fragmento de restricción. Este se inserté en los sitios de BamHI y HindIII del vector del plásmido pUC19. El plásmido obtenido se denominó pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1.
La Escherichia coli que contiene pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1 se designó Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1) y ha sido depositado internacionalmente el 29 de Setiembre de 1997, con el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, MITI (Higashi 1-Chome 1-3, Tsukuba city, Prefectura de Ibaraki, Japón) bajo el número de acceso FERM PB-6127 según las condiciones del Tratado de Budapest.
2) Análisis de la cadena L
Si bien los aminoácidos de las FR no se sustituyeron en la construcción de la cadena L del anticuerpo de diseño primario, se realizó búsqueda de homología también para estas FR, ya que el anticuerpo REI humano fue una FR reconfigurada (Riechmann, L. et al., Nature (1988) 332, 323-327), que ya había sido sometido a la sustitución de aminoácidos. El resultado confirmó la presencia de secuencias naturales que corresponden a las FR reconfigurados. De este modo, se demostró que se no necesita sustitución de aminoácidos para las FR de la cadena L.
Ejemplo 2 Producción del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (1) Expresión del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural
Se cotransformaron diez \mug del vector de expresión (HEF-RVHs-AHM-g\gamma1) para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural y el vector de expresión (HEF-RVLa-AHM-g\kappa) para la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado en células COS por electroporación usando el instrumento Gene Pulser (fabricado por BioRad). Cada ADN (10 \mug) se agregó a alícuotas de 0,8 ml de 1 x 10^{7} células/ml en PBS, y se sometió a los pulsos a 1500 V y una capacidad de 25 \muF.
Después de un período de recuperación de 10 minutos a temperatura ambiente, las células sometidas a electroporación se agregaron a 30 ml de líquido de cultivo DHEM (fabricado por GIBCO) que contiene 10% de suero fetal bovino libre de \gamma-globulina. Después de la incubación de 72 horas en un incubador de CO_{2} BNAl20D (fabricado por TABAI) en la condición de 37ºC y 5% de CO_{2}, se recogió el sobrenadante del cultivo y se retiraron los desechos celulares por centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga 505PR-22 (fabricado por HITACHI) equipado con un rotor de centrífuga 03 (fabricado por HITACHI). Luego se realizó la ultrafiltración con un microconcentrador (Centricon 100, fabricado por Amicon) mediante una centrífuga J2-21 (fabricado por BECKMAN) equipado con un rotor de centrífuga JA-20.1 (fabricado por BECKMAN), en una condición de 2000 rpm, y se llevó a cabo la esterilización con filtro mediante un filtro Milex GV13mm (fabricado por Millipore) para obtener un producto que se usó para el Cell-ELISA.
(2) Medición de la concentración del anticuerpo
Se midió la concentración del anticuerpo obtenido por ELISA. A cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Max-isorp, fabricado por NUNC) se agregaron 100 \mul de anticuerpo IgG anti-humano de cabra (fabricado por BIO SOURCE) preparado a una concentración de 1 \mug/ml con el tampón de revestimiento (0,1 M de NaHCO_{3}, 0,02% ed NaN_{3}, pH 9,6) y se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Después del bloqueo con 100 \mul de tampón de dilución (50 mM de Tris-HCL, 1 mM de MgCl_{2}, 0,15 M de NaCl, 0,05% de Tween 20, 0,02% de NaN_{3}, 1% de albúmina sérica bovina (BSA), pH 8,1), se agregaron 100 \mul de cada una de las diluciones seriadas del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural a cada pocillo y se incubó la placa a temperatura ambiente durante una hora. Luego del lavado, se agregaron 100 \mul de anticuerpo IgG anti-humano de cabra marcado con fosfatasa alcalina (fabricado por DAKO).
Después de incubar a temperatura ambiente durante una hora y el lavado, se agregaron 100 \mul de una solución del sustrato 1 mg/ml (Sigma 104, fosfato de p-nitrofenilo, fabricado por SIGMA) disuelto en tampón sustrato (50 mM de NaHCO_{3}, 10 mM de MgCl_{2}, pH 9,8) y luego se midió la absorbancia a 405 nm usando el lector de microplaca Model 3550 (fabricado por Bio Rad). Como estándar para la medición de concentración, se usó IgG1\kappa (fabricado por The Binding Site).
(3) Establecimiento de la línea celular CHO que produce en forma estable anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural
La línea celular CHO que produce en forma estable anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se puede establecer de acuerdo con el método siguiente.
(3)-1. Construcción de un vector de expresión para una cadena H de un anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural
Por digestión del plásmido HEF-RVHS-AHM-g\gamma1 con enzimas de restricción PvuI y BamHI, un fragmento de aproximadamente 2,8 kpb que contiene ADN que codifica un promotor EF1 y una región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se purificó mediante de gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,5%. Entonces, el fragmento de ADN anterior se inserta en un fragmento de aproximadamente 6 kpb que se preparó por la digestión con PvuI y BamHI, el vector de expresión usado para un vector de expresión de la cadena H humana, DHFR-\DeltaE-RVh-PM1f (publicación de Patente Internacional Nº WO 92-19759), que contiene un gen DHFR y un gen que codifica una región constante de una cadena H humana, de modo de construir un vector de expresión, DHFR-\DeltaE-HEF-RVHs-AHM-g\gamma1, para la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural.
(3)-2. Introducción del gen en las células CHO
Para establecer un sistema de producción estable del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural, los genes de los vectores de expresión mencionados anteriormente, DHFR-\DeltaE-HEF-RVHs-AHM-g\gamma1 y HEF-RVLa-AHM-g\kappa, que fueron linealizados por digestión con PvuI, se introdujeron simultáneamente en las células CHO DXB-11 por le método de electroporación en una condición similar a la mencionada anteriormente (transfección en las células COS-7 mencionadas anteriormente).
(3)-3. Amplificaron del gen por MTX
De las células CHO con el gen introducido, solo las que células CHO en las que han introducido los vectores de expresión de la cadena L y la cadena H pueden sobrevivir en un líquido de cultivo \alpha-MEM libre de nucleósidos (fabricado por GIBCO-BRL) al que se agregaron 500 \mug/ml de G418 (fabricado por GIBCO-BRL) y 10% de suero fetal bovino y de esta manera se seleccionaron. Posteriormente, se agregaron 10 nM de MTX (fabricado por Sigma) al líquido de cultivo anterior. De los clones que se propagaron, se seleccionaron los que se producen el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural en grandes cantidades.
(3)-4. Construcción del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural
El anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se produjo por el siguiente método. La células CHO anteriores que producen el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se cultivaron durante 10 días usando el medio de cultivo \alpha-MEM libre de nucleósido (fabricado por GIBCO-BRL) al que se han agregado 500 \mug/ml Gde 418 (fabricado por GIBCO-BRL) que contiene 10% de suero fetal bovino libre de \gamma-globulina (fabricado por GIBCO-BRL) mediante un incubador de CO_{2} BNAS120D (fabricado por TABAI) en la condición de 37ºC y 5% CO_{2}. En el día 8 y 10 después del comienzo del cultivo se recuperó el líquido de cultivo, se eliminaron los desechos celulares por centrifugación durante 10 minutos a 2000 rpm usando la centrífuga RL-500SP (fabricado por Tomy Seiko) equipada con el rotor TS-9, y luego se filtró en forma esterilizada mediante un frasco con filtro superior (fabricado por FALCON) que tiene una membrana con poros de 0,45 \mum de diámetro.
Después se agregó una cantidad igual de PBS(-) al líquido de cultivo de las células CHO que producen anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural, luego el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se purificó por afinidad usando el sistema de purificación de anticuerpo de alta velocidad ConSep LC100 (fabricado por MILLIPORE) y columna de proteína A Hyper D (fabricado por Nippon Gaishi) usando PBS(-) como tampón de absorción y tampón citrato de sodio 0,1 M (pH 3) como tampón de elución de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Las fracciones eluidas se ajustaron a aproximadamente pH 7,4 por la adición inmediata de Tris 1 M-HCl (pH 8,0) y luego se usa el concentrador de ultrafiltración por centrifugado Centriprep 10 (fabricado por MILLIPORE), se realizó la concentración y sustitución a PBS(-) y se filtró en forma esterilizada mediante un filtro de membrana MILLEX-GV (fabricado por MILLIPORE) con un tamaño de poro de 0,22 \mum para obtener el anticuerpo anti-HM1.24 humano natural. La concentración del anticuerpo purificado se midió por la absorbancia a 280 nm y se calculó como 1 \mug/ml para la DO 1,35.
Ejemplo 3 Determinación de actividad del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural
El anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se evaluó para determinar las siguientes actividad de unión al antígeno, actividad de inhibición de unión y actividad de ADCC.
(1) El método de medición de actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión (1)-1. Medición de actividad de unión al antígeno
La actividad de unión al antígeno se midió por Cell-ELISA usando células WICH. Las placas de Cell-ELISA se prepararon como se describió en el Ejemplo de Referencia 7.1-2.
Después del bloqueo, 100 \mul de las diluciones seriadas del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural obtenido del concentrado del sobrenadante del cultivo de las células COS-7 O a cada pocillo. Después de incubar durante 2 horas a temperatura ambiente y lavar, se agregó anticuerpo IgG anti-humano de conejo marcado con peroxidasa (fabricado por DAKO). Después de incubar durante 2 horas a temperatura ambiente y lavar se agregó solución del sustrato y se incubó. Luego la reacción se detuvo por la adición de 50 \mul de ácido sulfúrico 6 N y se midió la absorbancia a 490 usando el lector de microplacas Model 3550 (fabricado por Bio-Rad),
(1)-2. Medición de actividad de inhibición de unión
Se midió la actividad de inhibición de unión por el anticuerpo anti-HM1.24 de ratón marcado con biotina por el Cell-ELISA usando células WISH. Las placas Cell-ELISA se prepararon como se describió. Después del bloqueo, se agregaron 50 \mul de las diluciones seriadas del anticuerpo anti-HM1.24 humano natural obtenido del concentrado del sobrenadante del cultivo de las células COS-7 a cada pocillo y se agregaron simultáneamente 50 \mul de 2,8 \mug/ml de anticuerpo anti-HM1.24 de ratón marcado con biotina. Después de incubar a temperatura ambiente durante dos horas y lavar, se agregó estreptavidina marcada con peroxidasa (fabricada por DAKO). Después de incubar a temperatura ambiente durante dos horas y luego el lavado, se agregó estreptavidina marcada con peroxidasa (fabricada por DAKO). Después de incubar a temperatura ambiente durante dos horas y luego de lavar, se detuvo la reacción por agregado de 50 \mul de ácido sulfúrico 6 N, se midió la absorbancia a 490 nm mediante el lector de microplacas Model 3550 (fabricado por Bio-Rad).
(2) Actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión
La evaluación de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural se realizo por la medición de la actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de unión mencionadas anteriormente en combinación con la versión de la cadena L a. El resultado, como se muestra en las Figuras 29 y 30, indicó que el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el diseño de anticuerpo secundario) tiene actividad de unión al antígeno y actividad de inhibición de la unión de un grado similar al del anticuerpo de diseño primario (anticuerpo anti-HM1.24 humano reconfigurado: versión r de la cadena H).
(3) Medición de la actividad de ADCC
La actividad de ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo) se midió de acuerdo con el método descripto en el Ejemplo de Referencia 8.
1. Preparación de células efectoras
A la sangre periférica del sujeto humano sano se agregó una cantidad igual de PBS(-), sobre la cual se colocó Ficoll-Paque (fabricado por Pharmacia) y se centrifugó a 500 g durante 30 minutos. Se tomó la capa de monocitos y se lavó dos veces con RPMI 1640 (fabricado por GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero fetal bovino (fabricado por GIBCO BRL), y se ajusto a un densidad celular de 5 x 10^{6}/ml con el mismo líquido de cultivo.
2. Preparación de células blanco
La línea celular de mieloma humano KPMM2 (Depósito No. P-14170, Solicitud de patente No. 6-58082) se radiomarcó por incubación en el RPMI 1640 (fabricado por GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero fetal bovino (fabricado por GIBCO BRL) junto con 0,1 mCi de ^{51}Cr-cromato de sodio a 37ºC durante 60 minutos. Después del radiomarcado las células se lavaron tres veces con el mismo tampón y ajustado a una concentración de 2 x 10^{5}/ml.
3. Medición del ensayo de ADCC
En una placa de extremo inferior en U de 96 pocillos (fabricada por Corning) se agregaron 50 \mul de 2 x 10^{5} de células blanco/ml, 50 \mul de la solución de anticuerpo preparada previamente a 4 \mug/ml, 0,4 \mug/ml, 0,04 \mug/ml, y 0,004 \mug/ml y se hicieron reaccionar a 4ºC durante 15 minutos. Una solución que no contiene el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el diseño de anticuerpo secundario) se preparó de manera similar y se usó como control.
Luego, se agregaron 100 \mul de 5 x 10^{5} células efectoras/ml y se cultivaron un incubador de CO_{2} durante 4 horas, con lo cual la relación (E:T) de las células efectoras (E) a las células blanco (T) se estableció en 0:1, 5:1, 20:1, o 50:1. Debido a que la concentración final de cada anticuerpo se diluyó cuatro veces, estas fueron de 1 \mug/ml, 0,1 \mug/ml, 0,01 \mug/ml, y 0,001 \mug/ml además de de control sin adición de anticuerpo.
Se tomaron cien \mul del sobrenadante y la radiactividad liberada en el sobrenadante del cultivo se midió con un contador gamma (ARC361, fabricado por Aloka). Para la medición de la radiactividad máxima, se usó 1% de NP-40 (fabricado por Nacalai Tesque inc.). La citotoxicidad (%) se calculó por (A-C)/(B-C)x 100, donde A es la radioactividad (cpm) liberada en presencia del anticuerpo, B es la radioactividad (cpm) liberada con NP-40, y C es la radioactividad (cpm) liberada por el medio de cultivo solo sin anticuerpo.
4. Resultado
Como se muestra en la Fig. 33, cuando se agregó el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el diseño de anticuerpo secundario), aumentó la tasa de liberación de cromo específico con el aumento de de la relación E:T que depende de la concentración del anticuerpo en comparación con el control son anticuerpo agregado. Esto, en consecuencia, indicó que el anticuerpo anti-HM1.24 humanizado natural (el diseño de anticuerpo secundario) presenta actividad ADCC.
La presente invención se refiere a un método para preparar anticuerpo humanizado natural y el anticuerpo humanizado natural obtenido por dicho método de preparación. Esta es una tecnología de humanización de excelencia que ha resuelto los problemas asociados con el injerto de CDR (Jones, P. T. et al., Nature (1986) 321, 522-525) creado por G. Winter. La construcción del anticuerpo de diseño primario se puede considerar como una etapa intermedia para la construcción del anticuerpo humanizado que comprende las FR naturales humanas. Cuando se desarrolla el anticuerpo como producto farmacéutico que comprende proteína recombinante, el anticuerpo humanizado natural que comprende FR humanas naturales es de mayor excelencia en términos de antigenicidad y seguridad
Efectos de la invención
Ya que el anticuerpo humanizado natural obtenido por el método de preparación de la presente invención no contiene los residuos de aminoácidos de las FR no naturales artificiales que están contenidos en el anticuerpo humanizado producido por la tecnología de humanización convencional, se espera que tenga baja antigenicidad. Además, se demostró que el anticuerpo humanizado natural obtenido por el método de preparación de la presente invención tiene una actividad similar a la del anticuerpo derivado de un mamífero no humano que se usó como molde para la humanización. En consecuencia, el anticuerpo humanizado natural obtenido por el método de preparación de la presente invención es útil para la administración terapéutica a seres humanos.
Referencia a los microorganismos depositados según el Tratado de Cooperación de Patentes, Regla 13-2, y el nombre del Instituto Depositario
Instituto Depositario
Nombre: Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial
Domicilio: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, lbaraki, Japón
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo (1)
Indicación: Escherichia coli DH5\alpha (pRS38-pUC19)
Número de acceso: FERM PB-4434 20
Fecha de depósito: 5 de octubre de 1993
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo (2)
Indicación: Hibridoma HM1.24
Número de acceso: FERM PB-5233
Fecha de depósito: 14 de Septiembre de 1995
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo (3)
Indicación: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHr-AHM-g\gamma1)
Número de acceso: FERM PB-5643
Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo (4)
Indicación: Escherichia coli DH5\alpha (pUCI9-1.24H-g\gamma1)
Número de acceso: FERM PB-5644
Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo (5)
Indicación: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVLa-AHM-g\kappa)
Número de acceso: FERM PB-5645
Fecha de depósito: 29 de Agosto de 1996
\vskip1.000000\baselineskip
Organismo (6)
Indicación: Escherichia coli DH5\alpha (pUC19-RVHs-AHM-g\gamma1)
Número de acceso: FERM PB-6127 50
Fecha de depósito: 29 de Septiembre de 1997
\global\parskip0.000000\baselineskip
Secuencia: 1
Longitud de la secuencia: 394
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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10 
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Secuencia: 3
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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11 
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Secuencia: 5
Longitud de la secuencia: 11
Tipo de secuencia: Aminoácido
Topología: Lineal
Tipo de molécula: Péptido 
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Secuencia: 
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500 
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Secuencia: 6
Longitud de la secuencia: 7
Tipo de secuencia: Aminoácido
Topología: Lineal
Tipo de molécula: Péptido 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
501 
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Secuencia: 7
Longitud de la secuencia: 9
Tipo de secuencia: Aminoácido
Topología: Lineal
Tipo de molécula: Péptido 
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\hskip0.46cm
Secuencia:
502 
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Secuencia: 8
Longitud de la secuencia: 5
Tipo de secuencia: Aminoácido
Topología: Lineal
Tipo de molécula: Péptido 
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\hskip0.46cm
Secuencia:
503 
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Secuencia: 9
Longitud de la secuencia: 16
Tipo de secuencia: Aminoácido
Topología: Lineal
Tipo de molécula: Péptido 
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Secuencia:
504 
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Secuencia: 10
Longitud de la secuencia: 11
Tipo de secuencia: Aminoácido
Topología: Lineal
Tipo de molécula: Péptido 
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Secuencia:
505 
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Secuencia: 11
Longitud de la secuencia: 379
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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12 
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Secuencia: 13
Longitud de la secuencia: 379
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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\hskip0.46cm
Secuencia: 
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13 
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Secuencia: 15
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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14 
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Secuencia: 17
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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15
16 
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Secuencia: 19
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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17
18 
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Secuencia: 21
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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\hskip0.46cm
Secuencia: 
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19
20 
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Secuencia: 23
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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\hskip0.46cm
Secuencia: 
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21
22 
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Secuencia: 25
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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23
24 
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Secuencia: 27
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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\hskip0.46cm
Secuencia: 
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25
26 
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Secuencia: 29
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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\hskip0.46cm
Secuencia: 
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27
28 
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Secuencia: 31
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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29 
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Secuencia: 33
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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30 
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Secuencia: 35
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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31 
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Secuencia: 37
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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32 
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Secuencia: 39
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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33
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Secuencia: 41
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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35
36 
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Secuencia: 43
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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Secuencia: 
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37
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Secuencia: 45
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
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\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
39
40 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 47
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
41
42 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 49
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
43
44 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 51
Longitud de la secuencia: 40
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
506
Secuencia: 52
Longitud de la secuencia: 39
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
507
Secuencia: 53
Longitud de la secuencia: 40
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
508
Secuencia: 54
Longitud de la secuencia: 43
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
509
Secuencia: 55
Longitud de la secuencia: 40
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
510
Secuencia: 56
Longitud de la secuencia: 37
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
511
Secuencia: 57
Longitud de la secuencia: 41
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
512
Secuencia: 58
Longitud de la secuencia: 41
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
513
Secuencia: 59
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
514
Secuencia: 60
Longitud de la secuencia: 37
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
515
Secuencia: 61
Longitud de la secuencia: 38
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
516
Secuencia: 62
Longitud de la secuencia: 27
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
517
Secuencia: 63
Longitud de la secuencia: 25
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
518
Secuencia: 64
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
519
Secuencia: 65
Longitud de la secuencia: 34
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
520
Secuencia: 66
Longitud de la secuencia: 34
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
521
Secuencia: 67
Longitud de la secuencia: 34
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
522
Secuencia: 68
Longitud de la secuencia: 34
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
523
Secuencia: 69
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
524
Secuencia: 70
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
525
Secuencia: 71
Longitud de la secuencia: 48
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
526
Secuencia: 72
Longitud de la secuencia: 39
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
527
Secuencia: 73
Longitud de la secuencia: 45
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
528
Secuencia: 74
Longitud de la secuencia: 47
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
529
Secuencia: 75
Longitud de la secuencia: 38
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
530
Secuencia: 76
Longitud de la secuencia: 41
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
531
Secuencia: 77
Longitud de la secuencia: 31
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
532
Secuencia: 78
Longitud de la secuencia: 31
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
533
Secuencia: 79
Longitud de la secuencia: 144
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
45 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 80
Longitud de la secuencia: 130
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
46 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 81
Longitud de la secuencia: 131
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
47 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 82
Longitud de la secuencia: 119
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
48 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 83
Longitud de la secuencia: 25
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
534 
\newpage
Secuencia: 84
Longitud de la secuencia: 25
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
535
Secuencia: 85
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
536
Secuencia: 86
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
537
Secuencia: 87
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
538
Secuencia: 88
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
539
Secuencia: 89
Longitud de la secuencia: 47
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
540
Secuencia: 90
Longitud de la secuencia: 47
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
541
Secuencia: 91
Longitud de la secuencia: 38
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
542
Secuencia: 92
Longitud de la secuencia: 38
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
543
Secuencia: 93
Longitud de la secuencia: 18
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
544
Secuencia: 94
Longitud de la secuencia: 17
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
545
Secuencia: 95
Longitud de la secuencia: 23
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
546
Secuencia: 96
Longitud de la secuencia: 23
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
547
Secuencia: 97
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
49 
\newpage
Secuencia: 99
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
50
Secuencia: 101
Longitud de la secuencia: 38
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
548
Secuencia: 102
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
549
Secuencia: 103
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
550
Secuencia: 104
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
551
Secuencia: 105
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
552
Secuencia: 106
Longitud de la secuencia: 41
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
553
Secuencia: 107
Longitud de la secuencia: 41
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
554
Secuencia: 108
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
555
Secuencia: 109
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
556
Secuencia: 110
Longitud de la secuencia: 23
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
557
Secuencia: 111
Longitud de la secuencia: 23
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
558
Secuencia: 112
Longitud de la secuencia: 38
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
559
Secuencia: 113
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
560
Secuencia: 114
Longitud de la secuencia: 50
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
561
Secuencia: 115
Longitud de la secuencia: 50
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
562
Secuencia: 116
Longitud de la secuencia: 20
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
563
Secuencia: 117
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
564
Secuencia: 118
Longitud de la secuencia: 20
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
565
Secuencia: 119
Longitud de la secuencia: 20
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
566
Secuencia: 120
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
567
Secuencia: 121
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
568
Secuencia: 122
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
569
Secuencia: 123
Longitud de la secuencia: 35
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
570
Secuencia: 124
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
571
Secuencia: 125
Longitud de la secuencia: 26
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: ADN sintético 
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.46cm
Secuencia:
572
Secuencia: 126
Longitud de la secuencia: 418
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia: 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia: 128
Longitud de la secuencia: 1013
Tipo de secuencia: Ácido nucleico
Catenariedad: Sencilla
Topología: Lineal
Tipo de molécula: cADN 
\newpage
\hskip0.46cm
Secuencia:
52
53 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<100> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpo humanizado natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 41706
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/JP98/04469
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 02-10-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> JP 9-271726
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 03-10-1997
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 129
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 394
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cADN que codifica la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
55
56 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 418
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cADN que codifica la región V de la cadena H del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
57 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
58
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> CDR(1) de la región V de la cadena L del anticuerpo anti-HM1.24
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<223> ADN que codifica la región V de la cadena C (natural/ versión a) del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado
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<212> PRT
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<223> Región V de la cadena C (natural/versión a) del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado
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<211> 20
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 116
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<210> 117
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador de ADN sintético
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<212> ADN
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 120
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640 
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 121
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641 
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<210> 122
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 122
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 123
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643 
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<210> 124
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 124
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644 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador de ADN sintético
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<400> 125
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> ADN que codifica la región V de la cadena H (versión s) del anticuerpo HM1.24 humanizado
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<400> 126
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<211> 139
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Región V de la cadena H (versión s) del anticuerpo anti-HM1.24 humanizado
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<400> 127
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111 
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<210> 128
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<211> 1013
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> ADN que codifica la proteína antigénica HM1.24
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<400> 128
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112 
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<210> 129
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<211> 180
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<223> Proteína antigénica HM1.24
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<400> 129
113

Claims (10)

1. Un método para preparar un anticuerpo humanizado natural, en el que una región estructural (FR) del anticuerpo humanizado es una FR natural de anticuerpos humanos, que comprende los pasos de:
(i)
obtener un anticuerpo de diseño primario que se humaniza por injerto de regiones determinantes de complementariedad (CDR) y que está sustituido en uno o más residuos de aminoácidos de las FR para formar una secuencia de aminoácidos que no se produce en la naturaleza;
(ii)
realizar una búsqueda de homología mediante una base de datos de secuencias de aminoácidos de FR naturales que aparecen en anticuerpos humanos (FR naturales) en comparación con una secuencia de FR del anticuerpo de diseño primario;
(iii)
preparar una lista de secuencias de aminoácidos de las FR naturales que tienen elevada homología con la secuencia de la FR del anticuerpo de diseño primario;
(iv)
seleccionar, de la lista del paso (iii), una FR natural que contiene una secuencia que se aparea con las secuencias de aminoácidos sustituidas del paso (i), y comprende una secuencia de aminoácidos que es la igual a o que tiene elevada homología con la secuencia de FR del anticuerpo de diseño primario;
(v)
si la secuencia de la FR del anticuerpo de diseño primario tiene uno o más aminoácidos que son diferentes de los aminoácidos de la FR natural seleccionada en el paso (iv), reemplazar dichos aminoácidos diferentes en la secuencia de FR del anticuerpo de diseño primario con los aminoácidos correspondientes de la FR natural;
(vi)
construir un vector de expresión que expresa una secuencia de aminoácidos del anticuerpo obtenido mediante los pasos (i) a (v):
(vii)
cultivar las células que comprenden un vector de expresión construido en el paso (vi) y
(viii)
recuperar el anticuerpo humanizado que comprende la FR natural del cultivo.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo de diseño primario comprende CDR de un anticuerpo de un mamífero no humano y FR de un anticuerpo de un ser humano y que tiene una secuencia de aminoácidos artificial que no se produce en la naturaleza.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los residuos de aminoácidos son residuos que aparecen en las FR de un anticuerpo de mamífero no humano.
4. Un anticuerpo humanizado natural, en el que una región estructural (FR) del anticuerpo humanizado es una FR natural de anticuerpos humanos, que contiene CDR derivadas de un mamífero no humano y FR derivadas de un ser humano, caracterizado porque dicha FR comprende una secuencia de aminoácidos que tiene residuo(s) de aminoácido(s) diferentes de los de la FR de un anticuerpo de diseño primario por uno o una pluralidad de residuos de aminoácidos y porque dicha FR del anticuerpo de diseño primario ha sido reemplazada por una FR derivada de un ser humano y que tiene los mismos residuos de aminoácidos que dichos residuos de aminoácidos diferentes en las mismas posiciones.
5. El anticuerpo humanizado natural de acuerdo la reivindicación 4, en el que el mamífero no humano es un ratón.
6. ADN que codifica el anticuerpo humanizado natural de acuerdo con la reivindicación 4 o 5.
7. Un vector de expresión que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Una célula hospedante no humana que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un método para preparar un anticuerpo humanizado natural, que comprende cultivar las células en las que se ha introducido un vector de expresión que comprende el ADN de acuerdo con la reivindicación 6 y recuperar el anticuerpo humanizado natural deseado a partir del cultivo de dichas células.
10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado natural, donde una región estructural (FR) del anticuerpo humanizado es una FR que aparece naturalmente en anticuerpos humanos.
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