KR100473836B1 - 천연 인간형화 항체 - Google Patents

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Abstract

(A) (1) 인간 L쇄 정상영역, 및 (2) 인간 L쇄 FR 및 마우스 항 HM1.24 모노클로날 항체의 L쇄의 CDR를 함유해서 되는 L쇄, 및
(B) (1) 인간 H쇄 정상영역, 및 (2) 인간 H쇄 FR, 및 마우스 항HM1.24 모노클로날 항체의 H쇄 CDR를 함유해서 되는 H쇄:
로 이루어지는 재구성 인간 항HM1.24항체.
재구성 인간항체의 대부분이 인간항체에서 유래하고, CDR은 항원성이 낮으므로, 본 발명의 재구성 인간항체는 항원성이 낮고, 그러므로 의학요법용으로서 기대된다.

Description

천연 인간형화 항체{NATURAL HUMANIZED ANTIBODY}
본 발명은 천연 인간형화 항체를 제조하는 방법 및 이 제조방법에 의해 얻어진 천연 인간형화 항체에 관한 것이다. 또, 본 발명은 또한 천연 인간형화 항체를 코드하는 DNA, 이 DNA를 함유하는 발현 벡타, 이 DNA를 함유하는 숙주 및 이 DNA를 도입한 세포로 부터 천연 인간형화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
마우스 모노클로날 항체는 일반적으로 사용되는 하이브리도마 기술에 의해서 비교적 쉽게 단리할 수 있다(Kohler, G. and Milstein, C. Nature (1975) 256, 495-497). 한편, 인간 하이브리도마도 동일한 기술구축이 기대되기는 했지만 범용기술에는 이르지 못했다. 또한, 임상응용에서는 인간 항원에 대한 항체가 요구되고, 그 때문에, 마우스 모노클로날 항체의 제작은 항체 의약의 개발에 필수적이다.
실제로, 암세포나 바이러스에 대한 많은 모노클로날 항체가 단리되고, 그의 임상응용이 검토되어 왔었다. 그러나, 마우스 항체는 인간에 대하여는 이물질(異物質)이므로, 강한 항원성으로 인한 HAMA(Human Anti-Mouse Antibody)를 유도하는 것이나, ADCC의 유도작용이 약한 등의 임상응용에 극히 부적합한 문제가 밝혀졌다(Schroff, R. W., Cancer Res. (1985) 45, 879-885; Shawler, D. L., et al., J. Immunol. (1985) 135, 1530-1535).
이러한 문제들을 해결하기 위하여, 우선, 키메라 항체가 제작되었다 (Neuberger, M. S. et al., Nature (1984) 312, 604-608; Bo㎕ianne, G. L. et al., Nature (1984) 312, 643-646). 키메라 항체는 마우스 항체의 가변영역을 인간항체의 정상영역과 연결한 것으로, 특히 강한 항원성의 원인이 되는 마우스 항체의 정상영역을 인간형으로 치환해서된다. 이것은, 인간 Fc 수용체와의 생리적인 결합을 가능케해서 Fc로 매개된 기능을 유도할 것으로 기대된다. 실제로, 키메라 항체를 이용한 임상연구는 항원성의 현저한 감소가 보고되었다(LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 4220-4224). 그러나, 마우스 가변영역에 대한 HAMA 생겨서, 문제를 일으키는 경우가 밝혀졌다(LoBuglio, A. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 4220-4224).
그래서, 다소 복잡하지만, 보다 인간 항체에 가까운 인간형화 항체를 제작하기 위한 방법이 개발되었다. 이것은 마우스 항체의 항원결합부위를 인간항체상에 재구축하는 기술이다(Jones, P. T. et al., Nature (1986) 321, 522-525; Verhoeyen, M. et al., Science (1988) 239, 1534-1536; Riechmann, L. et al., Nature (1988) 332, 323-327). 즉, 항체가변영역은 H쇄(heavy chain), L쇄(light chain) 모두에 4개의 프레임워크 영역(FRs)과 이들 사이에 끼워진 3개의 상보성 결정영역(CDRs)으로 이루어진다.
항원결합부위의 형성은 주로 CDR가 담당하고, 또한 FR상의 일부의 아미노산 잔기가 직접, 간접으로 그것에 관여하는 것이 알려져 있다. 각 항체의 기본 구조는 서로 유사하기 때문에, 어떤 항체의 항원 결합부위를 다른 항체에 이식할 수 있다고 생각되었다. 실제로, G. Winter 등의 연구그룹은 마우스항 리조비움 항체의 CDRs를 인간항체에 이식하여(CDR-이식) 리조비움 결합 활성을 가지는 인간형화 항체의 제작에 성공했다(Jones, P. T. et al., Nature (1986) 321, 522-525).
그러나, CDR 이식 만으로 인간형화하면, 원래의 마우스 항체와 유사한 항원결합활성을 가지는 인간형화 항체를 얻을 수 없는 경우가 있다. 그 때문에, 상기한 바와 같이, 일부의 FR 아미노산 잔기의 치환이 행해지고 있다. 치환되는 FR 아미노산 잔기는 항체 분자의 기본 구조를 담당하는 아미노산 잔기(canonical structure; Chothia, C. et al., Nature (1989) 342, 877-883; Chothia, C. and Lesk, A. M. J. Molec. Biol. (1987) 196, 901-917) 또는 CDR의 구조유지에 관여하거나, 또는 직접 항원 분자와 상호작용하는 것이다.
실제로, 대부분의 인간형화 항체에 있어서 FR상의 아미노산 치환이 시행되고 있고, 여기에서는 천연에는 발견되지 않는 인공 FR 서열이 형성된다. 때로는, 많은 아미노산 치환이 시행되고 있고, 마우스 항체의 항원성을 가능한한 없게하기 위한 CDR-이식의 원래 의미가 의심스럽게 된다(Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86, 10029-10033; Co, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1991) 88, 2869-2873).
이러한 문제를 해결하기 위한 방법은, 인간의 FR을 선택하는 방법을 고안하는 것이다. 즉, 치환될 FR 아미노산 잔기의 수는 CDR 이식에 대하여 선택된 인간 항체의 FRs와 원래의 마우스 항체의 FRs와의 상동성에 의존한다. 따라서, 일반적으로, 치환 정도를 최소화하기 위하여 마우스 FRs와 상동성이 높은 인간 FR이 선택된다. 그러나, 이렇게 얻어진 인간형화 항체의 FR 조차도, 많은 경우, 이제까지 천연에는 발견되지 않은 아미노산서열을 갖고 있고, 항원성이 발생하는 가능성이 남아있다. 이 문제를 해결하고, 항원성이 유도되는 확률이 보다 낮은, 안전성이 보다 높은 인간형화 항체를 구축하는 기술이 요구된다.
도 1은 인간 골수종 세포주 KPMM2를 이용한 FCM 해석에 있어서, 콘트롤 항체와 비교했을 때, 키메라 항-HM1.24 항체의 형광강도가 마우스 항-HM1,24 항체와 유사하게 이동된 것을 나타내는 그래프이다.
도 2는 WISH 세포를 이용한 Cell-ELISA에 있어서, 키메라 항HM1.24항체는 마우스 항HM1.24항체와 동일하게, 비오틴화 마우스 항HM1.24항체의 WISH 세포로의 결합을 농도 의존적으로 저해하고 있는 것을 나타낸 그래프이다.
도 3은 콘트롤 인간 IgG1, 또는 마우스 항HM1.24항체는, RPMI 8226 세포에 대한 세포장해활성을 갖지 않는 것에 대해서, 키메라 항HM1.24항체는 E/T비의 상승에 따라서, RPMI 세포에 대한 세포장해활성이 상승하고 있는 것을 나타낸 그래프이다.
도 4는 PCR 법에 의한 CDR 이식에 의해 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄를 제작하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 5는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄의 제작에 있어서, PCR법에 의해 RVH1, RVH2, RVH3 및 RVH4의 올리고뉴클레오티드를 에셈블리하는 방법을 나타낸 모시도이다.
도 6은 PCR법에 의해 인간-마우스 하이브리드 항HM1.24항체 H쇄 V 영역을 제작하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 7은 PCR법에 의해 마우스-인간 하이브리드 항HM1.24항체 H쇄 V 영역을 제작하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 8은 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 버젼 a는 키메라 항HM1.24항체와 같은 정도의 항원결합활성을 가지는 것을 나타낸 그래프이다. 이 도면에 있어서, -1과 -2는 롯트(lot)의 상이를 나타낸다.
도 9는 L쇄 버젼 a와 H쇄 버젼 a, b, f 또는 h를 조합시킨 재구성 인간 항HM1.24항체 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 10은 L쇄 버젼 b와 H쇄 버젼 a, b, f 또는 h를 조합시킨 재구성 인간 항HM1.24항체 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 11은 L쇄 버젼 a와 H쇄 버젼 a, b, f 또는 h를 조합시킨 재구성 인간 항HM1.24항체 및 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 12는 L쇄 버젼 b와 H쇄 버젼 a, b, f 또는 h를 조합시킨 재구성 인간 항HM1.24항체 및 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 13은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, b, c, d 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타낸 그래프이다.
도 14는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, e 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다. 이 도면에 있어서 -1과 -2는 롯트의 상이를 나타낸다.
도 15는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, c, p, r과 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 16은 인간-마우스 하이브리드 항HM1.24항체, 마우스-인간 하이브리드 항HM1.24항체 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 17은 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 a, b, c, f 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 18은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, g 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 19는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, g 및 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 20은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 h, i 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 21은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 f, h, j 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 22는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 h, i 및 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 23은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 f, h, j 및 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 24는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 h, k, l, m, n, o 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 25는 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, h, p, q 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 26은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 h, k, l, m, n, o 및 키메라 항HM1.24항체의 WISH 세포로의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 27은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, h, p, q 및 키메라 항HM1.24항체의 결합저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 28은 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a, c, p, r 및 키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성을 나타내는 그래프이다.
도 29는 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인 항체)가 재구성 인간 항HM1.24항체(1차 디자인 항체)와 같은 정도의 항원결합활성을 가지는 것을 나타내는 그래프이다.
도 30은 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인 항체)가 재구성 인간 항HM1.24항체(1차 디자인 항체)와 같은 정도의 결합저해활성을 가지는 것을 나타내는 그래프이다.
도 31은 정제 재구성 인간 항HM1.24항체가 키메라 항HM1.24항체와 같은 정도의 항원결합활성을 가지는 것을 나타내는 그래프이다.
도 32는 정제 재구성 인간 항HM1.24항체가 키메라 항-HM1.24 항체와 같은 정도의 결합저해활성을 가지는 것을 나타내는 그래프이다.
도 33은 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인 항체)가 E/T 비율의 상승에 따라서, KPMM2 세포에 대한 세포장해활성이 상승하고 있는 것을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 이제까지의 인간형화 항체의 구축법을 개량하여, 원래의 마우스 항체의 항원결합활성을 완전히 유지하고, 또한, 모두 천연에서 발견되고 있는 인간 FR로 구성되는, 환언하면, FR상의 아미노산 치환을 전혀 실시하지 않는 인간형화 항체의 구축법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은, 1차 디자인 항체의 FR에 대한 상동성 검색을 실시하고, 1차 디자인 항체의 FR에 함유된 인공적인 아미노산 잔기를 유지하고, 또한, 상동성을 가지는 천연 인간 FR을 선택하는 것으로 이루어진, 천연 인간형화 항체를 제작하는 방법을 제공하는 것이다. 또한, 1차 디자인 항체는 종래의 CDR 이식에 의하여 제작된 인간형화 항체(재구성 인간 항체)이다.
또한, 본 발명은 1차 디자인 항체의 FR에 대한 상동성 검색을 실시하고, 1차 디자인 항체의 FR에 함유된 인공적인 아미노산 잔기를 유지하고, 또한 상동성을 가지는 천연 인간 FR을 선택하고, 이어서 1차 디자인 항체의 FR과 선택된 천연 인간 FR 사이에서 1개 또는 복수개의 상이한 아미노산 잔기를 치환하는 것으로 이루어진 천연 인간형화 항체를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 제작방법에 있어서, 1차 디자인 항체는 제1 동물종에서 유래된 CDR과 인공적인 아미노산 잔기를 함유하는 제2 동물종에서 유래된 FR로 이루어진다. 더욱 바람직하게는, 1차 디자인 항체에 있어서, 제1 동물종은 비인간 포유동물이고, 제2 동물종은 인간이다. 제1 동물종인 비인간 포유동물로서는마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 원숭이 이다.
본 발명은, 또한 1차 디자인 항체의 FR에 대한 상동성 검색을 실시하고, 1차 디자인 항체의 FR에 함유된 비인간 항체 FR에서 유래하는 인공적인 아미노산 잔기를 유지하고, 높은 상동성을 가지는 천연 인간 FR을 선택하고, 이어서 1차 디자인 항체의 FR과 선택된 천연 인간 FR 사이에서 1개 또는 복수개의 상이한 아미노산 잔기를 치환하는 것으로 이루어진 천연 인간형화 항체를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 또한 상기한 방법으로 얻어진 천연 인간형화 항체를 제공하는 것이다.
본 발명은, 또한 제1 동물종에서 유래된 CDR과 제2 동물종에서 유래된 FR을 함유하는 천연 인간형화 항체를 제공하는 것으로, 상기 FR은 CDR 이식에 사용된 FR와 1개 또는 복수개의 아미노산 잔기를 달리하는 아미노산서열로 구성되는 것이고, 또한 다른 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 잔기를 동일한 위치에 함유하는 제2 동물종 유래의 FR로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 천연 인간형화 항체를 제공한다. 바람직하게는, 제1 동물종은 비인간 포유동물이고 제2 동물종은 인간이다. 제1 동물종인 비인간 포유동물로서는 마우스, 래트, 햄스터, 래빗, 원숭이 이다.
본 발명은 상기한 천연 인간형화 항체를 코드하는 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 상기한 DNA를 함유하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명은, 또한 상기한 DNA를 함유하는 숙주를 제공하는 것이다.
본 발명은, 또한 상기한 DNA를 함유하는 발현벡터를 도입한 세포를 배양하고, 이 세포의 배양물로부터 목적하는 천연 인간형화 항체를 얻는 것을 특징으로하는 천연 인간형화 항체를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은, 또한 천연 인간형화 항체를 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것이다.
1. 천연 FR 서열
제한된 항체 가변영역으로 이루어진 유전자로부터 다양한 항원에 대응하는 항체를 제작하기 위하여, 생체는 소위 체세포 변이(somatic mutation)라고 불리우는 항체 가변영역 내에서 무작위 유전자 변이를 도입하는 기구를 갖추고 있다. 이것에 의해, 계산상으로 극히 다양한 FR 아미노산서열을 생성해야 하지만, 실제로 구조가 밝혀지게 된 많은 인간 항체 FR의 구조 해석에서 알 수 있듯이, 변이의 도입이 쉬운 아미노산 잔기의 위치나 아미노산 잔기의 종류가 어느 정도는 제한되어 있는 것이다.
본 발명에서 사용된 FR은 Kabat, E. A. et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1991)에서 정의된 FR을 의미한다. 즉, H쇄에 있어서, FR1은 아미노산 번호 1 내지 30이고, FR2는 아미노산 번호 36 내지 49이고, FR3는 아미노산 번호 66 내지 94이고, FR4는 아미노산 번호 103 내지 113이다. 또, L쇄에 있어서, FR1은 아미노산 번호 1 내지 23이고, FR2는 아미노산 번호 35 내지 49이고, FR3은 아미노산 번호 57 내지 88이며, FR4는 아미노산 번호 98 내지 107이다.
2. 인공 인간 FR부터 천연 인간 FR로
종래의 CDR 이식 방법에 의해 구축된 인간형화 항체(재구성 인간 항체)는 천연에서 발견할 수 없는 FR 아미노산서열을 갖는 경우가 많다. 그러나, 전술한 바와 같이, 체세포 변이에서 다양한 FR 아미노산서열이 이미 발견되고 있고, 인간형화에 의해 생긴 인공적인 아미노산 잔기를 함유하는 FR을 천연에 존재하는 인간 FR로 변환시킬 수 있는 가능성이 고려되고 있다.
본 발명은 종래의 인간형화 기술로 구축한 인간형화 항체를 더 가공하여 인공적인 FR에서는 없고 천연에서 발견되는 인간 FR로부터 이루어지는 인간형화 항체를 제작하는 것이다. FR 아미노산 치환이 실시된 인간형화 항체를 기지의 인간항체 FR와 기지의 데이타 베이스인 Swiss Plot(단백질 서열 데이타 베이스), GenBank(핵산 서열 데이타 베이스), PRF(단백질 서열 데이타 베이스), PIR(단백질 서열 데이타 베이스), GenPept(GenBank에서 얻어진 번역된 단백질 데이타 베이스) 를 사용해서 상동성 검색을 실시하면, 완전히 일치한 아미노산서열을 가지는 인간 FR 또는 상동성을 가지는 인간 FR을 발견할 수 있다.
전자의 경우, CDR 이식의 수용체로서 사용된 인간 FR에서 보았을 때, FR 치환이 실시되었지만, 인공적인 것으로 추정되는 생성된 FR은 천연 FR에 존재하였고, 이것이 수용체인 것으로 고려될 수 있으므로, FR 치환이 실시되지 않는 FR을 얻을 수 있다. 후자의 경우는, 인공적인 FR과 상동성이 높은 인간 FR의 아미노산서열에 주목하여, 인공적인 FR 중에 적당한 천연 인간 항체로 되돌리게 되는 아미노산 치환을 실시하여 그의 천연 인간 FR과 완전히 일치하도록 할 수 있다. 이 조작은 CDR-이식 항체에 대해서 인간형화를 행하는 것을 의미하고 있다.
이 경우, 인간 항체 간의 아미노산서열의 상동성 검색을 실시하였기 때문에, 선택되는 인간 FR은 CDR-이식에서 사용된 인간 FR과 동일한 서브그룹에 속하고, 또한 매우 높은 상동성을 가지는 아미노산서열을 발견할 수 있다. 따라서, 각 FR에서 얻어진 천연 인간 FR은 상이한 항체로 부터 유래되었지만 서브그룹의 컨센서스 서열(consensus sequence)을 충분히 만족하는 것이다.
3. 천연 서열 인간형화 항체
본 발명에서 얻어진 천연 인간형화 항체는 천연에서 존재가 인정되고 있는 인간 항체 FR로 이루어진다. FR1 내지 FR4에서 각각 다른 항체에서 유래하는 경우가 있지만, 상기한 바와 같이, 인간 항체들 간의 상동성을 검색하여 동일한 서브그룹에 속하는 항체 만을 선택할 수 있다. 동일한 서브그룹 내의 각 항체의 FR 구조는 서로 매우 유사한 구조를 가지며, 실제로 서브그룹 내의 컨센서스 서열에 기초한 인간형화 항체가 생성되었다(Kettleborough, C. A. et al., Protein Engng. (1991) 4, 773-783; Satoh, K. et al., Molec. Immun. (1994) 31, 371-381).
상기한 바와 같이, 항체의 경우는 체세포 변이에 의해 극히 다양한 아미노산서열이 천연에 존재하는 것으로 생각되며, 현재 그의 구조가 해석된 것은 그의 일부이다. 얻어진 인간형화 항체의 FR 서열이 천연에 발견되지 않는 경우, 그의 FR가 천연에 존재하는지 여부는 분명하지 않다. 따라서, 의약품으로서 항체를 고려한 경우, 천연에서 발견된 인간 FR로 이루어진 CDR-이식 항체의 제작은, 본래의 인간형화의 목적인 항원성의 저감이라고 하는 관점에서 종래의 인간형화 항체 보다 우수한 성질을 가지는 항체를 제공하는 것이다.
4. 신규 인간형화 항체 구축법
본 발명은, 종래의 인간형화 기술에서 구축된 인간형화 항체의 문제점, 즉, 천연에서 발견되지 않는 인공 FR에 의해서 생기는 항원성을 제거하는 것이고, 실제적으로 천연에 존재하는 인간 FR로 이루어지는 CDR-이식에 의한 인간형화 항체를 구축하는 기술이다. 인공적인 FR의 아미노산서열이란, FR 전체로서 천연에서 발견되지 않는 FR의 아미노산서열을 의미한다. 또, FR에 함유된 인공적인 아미노산 잔기는, FR에 함유되는 천연에서 발견되지 않는 아미노산 잔기를 의미한다.
천연에서 발견되지 않는 FR의 아미노산서열로는 종래의 인간형화 항체 기술에 의해 제작된 인간형화 항체에 있어서, 예를 들면, FR에 있어서 인간·아미노산 잔기로 부터 인간형화의 주형인 비인간 포유동물에서 유래된 항체의 FR에 존재하는 아미노산 잔기로 되돌려진 아미노산서열을 가지는 FR을 들 수 있다. 종래의 인간형화 항체 기술에 의해 제작된 인간형화 항체에 있어서, 예를 들면 FR에 있어서 인간의 아미노산 잔기로 부터 인간 및 비인간 포유동물 유래의 항체에는 발견되지 않는 아미노산서열을 갖는 FR을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 천연 인간형화 항체의 제조방법을 기술한다.
우선, 종래의 방법에 의해 CDR-이식에 사용하는 인간항체 FR를 선택한다. 이 FR에 아미노산 치환을 하고, 마우스 항체와 동등하거나 그 이상의 생물활성을 갖는 인간형화 항체를 구축한다. 종래법에서는 이 것은 인간형화 항체의 최종산물로 되지만, 본 발명에 있어서는 천연배열을 갖는 천연 인간형화 항체 제작을 위한 중간산물에 지나지 않는다. 본 발명에서는 이 것을 1차 디자인 항체로 칭한다.
이어서, 1차 디자인 항체의 각 FR에 대해 상동성 검색을 실시했다. 완전히 일치하는 FR에 대해서는 거의 천연 FR로 구성되어 있는 것을 의미한다. 한편, 완전히 일치하지는 않지만, 상동성을 갖는 1차 디자인 항체 FR와 동일의 서브그룹에 속하는 일련의 천연 인간 FR가 리스트된다. 특히, 1차 디자인 항체의 구축에 있어서 중요한 비인간 포유동물, 예를 들면 마우스 유래의 FR의 아미노산 잔기를 유지하고, 또한 1차 디자인 항체와 상동성을 갖는 가장 적합한 천연 인간FR를 리스트 중에서 선택한다.
FR의 상동성 검색을 행하는데는, 공지의 데이터 베이스를 사용해서 행한다. 이와 같은 데이터 베이스로서는, 예를 들면 SWISS Plot, GenBank, PRF, PIR, Genplpt를 들 수 있다. 이와 같은 데이터 베이스를 사용해서 상동성 검색이 행해지지만, 이 상동성 검색에 의해 리스트되는 [1차 디자인 항체의 FR와 상동성을 갖는 FR]이란, 적어도 80%, 바람직하기로는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 93%, 더욱 바람직하게는 적어도 94%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 이상, 아미노산 배열상의 상동성을 갖는 FR를 의미한다. 단백질의 상동성을 결정하는 데는 Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1983) 80, 726-730에 기재된 알고리듬(algorithm)에 따르면 좋다.
1차 디자인 항체의 구축에 있어서 중요한 비인간 포유동물의 아미노산 잔기라 함은, 인공적인 FR에 함유되는 비인간 FR유래의 아미노산 잔기를 의미한다. 이와 같은 아미노산 잔기는, 항체 분자의 기본구조를 담당하는 아미노산 잔기(canonical structure), CDR의 구조유지에 관여하는 아미노산 잔기 또는 직접 항원분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기에 많이 발견되고, 항체마다 다르지만, 예를 들면 H쇄 71위치의 아미노산, H쇄 94위치의 아미노산 등을 들 수 있다.
상기한 바와 같이, 천연 인간 FR의 아미노산 잔기를 갖는 인간형화 항체 생산을 위하여 1차 디자인 항체 FR와 선택한 천연 FR에서 다른 1또는 복수개의 다른 아미노산 잔기를 치환하면, 얻어지는 인간형화 항체(천연 인간형화 항체; 2차 디자인 항체로 칭함)는 모두 천연 FR로서 구성된다. 이때, 바람직하게는 인간 FR는 모두 동일한 서브 그룹에 속하는 인간 FR이고, 더욱 바람직하게는 동일한 항체에서 유래한다. 또, 인간 FR 모두가 동일의 서브 그룹의 인간 FR는 아니지만, 항체로서 재구성 되고, 적당한 항원결합활성이 얻어지면, 그 것으로도 좋고, 동일 서브그룹에 속하는 인간 FR에 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 복수개의 아미노산 잔기라 함은, 아미노산서열 중의 2개 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 2개 이상 10개 이하의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 2개 이상 5개 이하의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 2개 이상 4개 이하의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 2개 이상 3개 이하의 아미노산 잔기이다.
인공적인 FR와 천연 인간 FR의 상동성은, 적어도 80%, 바람직하기로는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 91%, 더욱 바람직하게는 적어도 92%, 더욱 바람직하게는 적어도 93%, 더욱 바람직하게는 적어도 94%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 96% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 97% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 99% 이상이다.
이어서, 2차 디자인 항체를 적당한 발현계, 예를 들면 동물세포에서 발현시키고, 그의 항원결합활성 등의 평가를 행한다.
또, 본 발명의 제조 방법은 반드시 실제로 1차 디자인 항체를 구축하지 않고도 행할 수 있다. 즉, 종래와 같이, 1차 디자인 항체를 디자인하고, 실제의 항원결합활성은 평가하지 않고, 2차 디자인 항체를 디자인하고, 이 것을 직접 평가해도 좋다. 그러나, 실제로는 중요한 FR잔기의 동정에는 실험을 수반하는 경우가 있고, 종래의 1차 디자인 항체를 시험적으로 제작하면서 2차 디자인 항체를 제작하는 것이 바람직하다.
구체적으로는, 본 발명의 하나의 태양으로서 마우스 항HM1.24 항체(Goto, T.et al., Blood (1994) 84, 1922-1930)를 주형으로서 본 발명의 천연 인간형화 항체를 제조했다.
전술한 바와 같이, 디자인된 천연 인간형화 항체는, 공지의 방법에 의해 이 것을 코드하는 유전자를 얻을 수 있다. 예를 들면, 디자인된 천연 인간형화 항체의 아미노산서열을 코드하는 DNA에 대응하는, 각각 중복하는 말단을 갖는 것과 같은 몇 개의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이들의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용해서 PCR법을 행한다. 이어서, 디자인된 천연 인간형화 항체의 아미노산서열을 코드하는 DNA의 말단을 규정하는 프라이머를 사용해서 PCR법을 행해서 목적하는 천연 인간형화 항체를 코드하는 유전자를 얻을 수 있다.
상기한 바와 같이 구축한 천연 인간형화 항체를 코드하는 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시켜 천연 인간형화 항체를 얻을 수 있다. 포유류 세포를 사용하는 경우, 사용되는 유용한 프로모터/인핸서, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 시그날을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그 것을 함유하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터/인핸서로서는 , 인간 사이토메갈로 바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer)를 들 수 있다.
또, 기타 본 발명의 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스(retrovirus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노바이러스 (adenovirus), 시미안 바이러스(simian virus) 40(SV 40)등의 바이러스성 프로모터/인핸서나 인간 엘롱게이션 팩터(human elongation factor)-1α(HEF 1α)등의 포유류세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 좋다.
예를 들면, SV 40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, Mulligan등의 방법 (Nature (1979)277,108) 또, HEF 1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 미즈시마 등의 방법 (Nucleic Acids Res. (1990)18,5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그날 서열, 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다.
예를 들면, 프로모터로서는 lacZ프로모터, araB프로모토를 들 수가 있다. LacZ프로모터를 사용하는 경우, Ward 등의 방법(Nature(1098) 341,544-546; FASEB J.(1992)6,2422-2427) araB 프로모터를 사용하는 경우, Better 등의 방법(Science (1988)290,1041-1043)에 따르면 좋다.
항체분비를 위한 시그날 서열로서는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 생산시키는 경우, PelB 시그날 서열(Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169,4379)을 사용하면 좋다.
페리플라즘에서 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)해서 사용한다(예를 들면, 국제특허출원 공개번호 WO96-30394, 일본특허출원공고 특개 평 7-93879를 참조).
복제 기원으로서는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소의 파필로마 바이러스 (bovine papilloma virus, BPV)등 유래의 것을 사용할 수 있다. 또한, 숙주세포에서 유전자 복제 수 증폭을 위해, 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트란스퍼라제(APH)유전자, 티미닌 키나제(TK)유전자, 대장균 키산틴 구아닌포스포리보실 트란스퍼라제(Ecogpt)유전자, 디히드로 엽산 환원효소 (dhfr)유전자 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 천연 인간형화 항체를 제조하기 위히여, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체제조를 위한 생산계는 시험관내(in vitro) 및 생체내(in vivo)생산계가 있다. 시험관내 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물세포로서는, (1)포유류 세포, 예를 들면 CHO (J. Exp. Med. (1995) 108,945), COS, 미에로마, BHK (baby hamster kidney) HeLa, Vero, (2) 양서류 세포, 예를 들면 아프리카 쓰메가에루 난모세포 (Xenopus cosytes) (Valle, et. al., Nature (1981) 291,358-340), 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면 sf9, sf21, Tn5가 알려져 있다. CHO 세포로서는 특히 DHFR유전자를 결손한 CHO세포인 dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1980) 77, 4216-4220) CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci, USA (1968) 60,1275)을 적합하게 사용할 수 있다.
식물세포로서는, Nicotiana tabacum 유래의 세포가 알려져 있고, 이 것을 칼루스배양(callus culture)하면 좋다. 진균세포로서는 효모, 예를 들면 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로미세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) 사상균, 예를 들면 아스퍼길루스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스퍼길루스 니거(Aspergillus niger)등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 대장균 (E. coli), 고초균이 알려져 있다.
이들의 세포를, 본 발명의 천연 인간형화 항체를 코드하는 유전자에 의해 형질전환하고, 형질전환된 세포를 시험관내에서 배양함으로써 천연 인간형화 항체가 얻어진다. 배양은, 공지의 방법에 따라서 행한다. 예를 들면 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI 1640, IDM을 사용할 수 있다. 이 때, 소태아혈청(FCS)등의 혈청보액을 병용할 수도 있고, 무혈청 배양해도 좋다. 또, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등에 옮김으로써, 생체내에서 항체를 생산해도 좋다.
한편, 생체내 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 이들의 동물 또는 식물에 항체 유전자를 도입해서, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산시켜 회수한다.
동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 이용하는 생산계가 있다.
포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소를 이용할 수 있다.
(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또, 포유류 동물을 이용하는 경우, 트랜스제닉 동물 (transgenic animals)을 이용할 수 있다.
예를 들면, 염소 β카제인과 같은 유즙 중에서 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 항체 유전자를 삽입해서 융합 유전자를 제조한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 함유하는 DNA 단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙에서 본 발명의 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소에서 생산되는 본 발명의 항체를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위하여, 적당한 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 좋다. (Ebert, K.M. et al., Bio/ Technology (1994) 12,699-702).
또, 곤충으로서는, 예를 들면 누에를 사용할 수 있다. 누에를 사용하는 경우, 목적하는 항체 유전자를 삽입한 바큘로바이러스 (baculovirus)를 누에에 감염시켜, 이 누에의 체액에서 목적하는 항체를 얻는다 (Susumu, M. et al., Nature (1985) 315,592,-594).
또한, 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다.
담배를 사용하는 경우, 목적하는 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 Agrobacterium tumefaciens와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 Nicotiana tabacum에 감염시켜 이 담배의 잎에서 목적하는 항체를 얻는다. (Julian, K-C. Ma et al., Eur. J. Immunol (1994) 24, 131-138).
상기한 바와 같이, 본 발명에 있어서, [숙주]라 함은 목적하는 천연 인간형화 항체를 생산시키는 동물 및 식물도 포함한다. 시험관내 또는 생체내 생산계에서 항체를 생산하는 경우, 항체의 H쇄 또는 L쇄를 코드하는 DNA를 따로 따로 발현 벡타에 통합해서 숙주를 동시에 형질전환시켜도 좋다. 또는, H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일의 벡터에 통합해서 숙주를 형질전환시켜도 좋다 (국제특허출원 공개번호 WO94-11523 참조).
숙주로의 발현 벡타의 도입방법으로서는, 공지의 방법, 예를 들면 인산칼슘법 (Virology (1973) 52,456-467)이나, 일렉트로포레이션법(electroporation method) (EMBO J. (1982) 1,841-845)등이 사용된다.
상기한 바와 같이 생산, 발현된 본 발명의 천연 인간형화 항체는, 세포내외 또는 숙주로 부터 분리해서 균일하게 될 때 까지 정제할 수 있다. 본 발명의 천연 인간형화 항체의 분리,정제는 통상의 단백질의 정제에서 사용되고 있는 분리. 정제법을 사용하면 좋고, 어쨌든 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 아피니티 크로마토그라피 (affinity chromatography)등의 크로마토그라피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석등을 적당히 선택, 조합하면 분리 정제할 수 있다 (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
아피니트 크로마토그라피에 사용하는 칼럼으로서는, 예를 들면 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 프로테인 A 칼럼에 사용하는 담체로서, 예를 들면 Hyper D. PDROS, Sepharose F.F. (Pharmacia) 등을 들 수가 있다.
아피니티 크로마토그라피 이외의 크로마토그라피로서는, 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 소수성 크로마토그라피, 겔여과 ,역상 크로마토그라피, 흡착 크로마토그라피 등을 들 수 있다. (Strategies for Protein Purification and Characterization ; A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996).
이들의 크로마토그라피는 액상 크로마토그라피, 예를 들면 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그라피를 사용해서 행할 수 있다.
얻어진 본 발명의 천연 인간형화 항체의 농도측정은, 흡광도의 측정 또는 효소결합 면역흡착검정법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)등에 의해 행할 수 있다.
즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, 얻어진 천연 인간형화 항체를 PBS로 적당히 희석한 후, 280nm의 흡광도를 측정한다. 예를 들면, 1mg/㎖를 1.35 OD로서 환산하면 좋다.
또, ELISA에 의한 경우는 이하에 기재한 바와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1M 중탄산염 완충액(pH9.6)에서 1mg/㎖로 희석한 염소항인간 IgG항체(TAGO제) 100㎖를 96웰 플레이트 (Nunc 제)에 첨가하고, 4C에서 하룻밤 배양하여 항체를 고정화 한다. 블로킹 후, 적당히 희석한 본 발명의 천연 인간형화 항체 또는 이 항체를 함유한 샘플, 또는 농도 표준품으로서 기지 농도의 인간 IgG (CAPPEL 제) 100㎖를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양한다.
세정후, 5000배로 희석한 알카리 포스파타제 표지항인간 IgG (BIO SOURCE 제) 100㎖를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양한다. 세정 후, 기질용액을 첨가해서 배양한 후, MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad 제)을 사용해서 405mm에서의 흡광도를 측정하여 본 발명의 항체의 농도를 산출한다. 또, 항체의 농도 측정에는 BIAcore (Pharmacia 제)를 사용할 수 있다.
본 발명의 천연 인간형화 항체의 항원결합활성, 결합저해활성, 중화활성의 평가는 통상 알려진 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 천연 인간형화 항체의 활성을 측정하는 방법으로서, ELISA, EIA (효소면역측정법), RIA (방사선 면역 측정법)또는 형광항체법을 사용할 수 있다. 상기 항체의 활성평가에는, BIA core (Pharmacia 제)를 사용할 수 있다.
본 발명의 천연 인간형화 항체는, 항체 단편이나 항체 수식물이어도 좋다. 예를 들면, 항체 단편으로서는 Fab, F(ab')2, Fv 또는 싱글 체인 Fv(scFv)를 들 수 있다. ScFv는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 구조를 갖는다.
이들의 항체단편을 얻기 위해서는, 항체를 효소, 예를 들면 파파인(papain), 펩신으로 처리해서 항체단편을 생성시키던가, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이 것을 발현 벡타에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M, S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M.& Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 參照).
ScFv는, 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다.(국제특허출원 공개번호 WO88-09344 참조). 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통해서 연결시킨다. (Huston, J.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci, U.S.A. (1988) 85,5879-5883). ScFv에 있어서 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은, 상기 항체로서 기재된 것 중 어느 것에서 유래되어도 좋다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들면 아미노산 12-19 잔기로부터 되는 임의의 1본쇄 펩티드가 사용된다 (미국특허 제 5525491 참조).
ScFv를 코드하는 DNA는, 상기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V영역을 코드하는 DNA, 및 L쇄, 또는 L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 주형으로 하고, 이들의 서열 중에서 목적하는 아미노산서열을 코드하는 DNA 부분을 , 그의 양단을 규정하는 프라이머 한쌍을 사용해서 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서, 또한 펩티드 링커 일부분을 코드하는 DNA 및 그의 양단을 각각 H쇄. L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 1쌍을 조합해서 증폭시켜서 얻어진다.
또, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면, 이들을 함유하는 발현 벡타 및 이 발현 벡타에 의해 형질전환된 숙주를 종래의 방법에 따라서 얻을 수 있다. 또, 이 숙주를 사용해서 종래의 방법에 따라서 scFv를 얻을 수 있다.
이들의 항체단편은, 전술한 바와 같이 그의 유전자를 얻어서 발현시키고, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다. 본원 청구의 범위에서 기재된 [항체]에는 이들의 항체단편도 포함된다.
항체수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG)등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다. 본원의 청구의 범위에 기재된 [항체]에는 이들의 항체 수식물도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물을 얻는데는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시해서 얻을 수 있다. 이들의 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
본 발명의 인간형화 항체는 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 비경구적 투여로서는, 예를 들면 점적 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 경폐투여를 선택할 수 있고, 환자의 년령, 증상에 의해 적당한 투여 방법을 선택할 수 있다.
본 발명의 천연 인간형화 항체는, 병을 이미 앓고 있는 환자에, 병의 증상을 치유하던가, 또는 적어도 부분적으로 저지하기 위하여 충분한 양으로 투여된다. 예를 들면, 유효 투여량은 1회에 체중 1kg 당 0.01mg 내지 100㎎의 범위로 선택된다. 또는, 환자당 1-1000mg, 바람직하게는 5-50mg의 투여량을 선택할 수 있다. 그렇지만, 본 발명의 천연 인간형화 항체는 이들의 투여량에 한정되는 것은 아니다. 또, 투여기간은 환자의 년령, 증상에 의해 적당히 선택할 수 있다.
본 발명의 천연 인간형화 항체는, 투여경로에 의존해서 의약적으로 허용되는 담체나 첨가제를 함께 함유한 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가제의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피톨리돈, 카복시비닐폴리머, 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카복시메틸스타치 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 키산탄검, 아라비아 고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 와세린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아린산, 인간혈청 알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 의약첨가제로서 허용되는 계면활성제등을 들 수 있다. 사용되는 첨가제는, 제형에 따라서 상기한 것 중에서 적당히 또는 조합해서 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
참고예
다음에, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하기에 앞서 그의 전제가 되는 참고예를 기재한다.
참고예 1. 마우스 항HM1.24항체 가변영역을 코드하는 cDNA의 클로닝
1. 메신저 RNA(mRNA)의 단리
마우스 항HM1.24항체를 생산하는 2×108개의 하이브리도마세포(FERM BP-5233)로부터 Fast Track mRNA Isolation kit version 3.2 (Invitrogen 사제)를 사용해서 킷트 첨부의 지시서에 따라서, mRNA의 단리를 행했다.
2. 항체가변영역을 코드하는 유전자의 PCR법에 의한 증폭 Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus사제)를 사용해서 PCR를 행했다.
2-1. 마우스 L쇄 V영역을 코드하는 유전자의 증폭 및 단편화
단리한 mRNA로부터 AMV Reverse Transcriptase First-strand (cDNA Synthesis Kit (Life Science사제)를 사용해서 1본쇄 cDNA를 합성하여 PCR에 사용했다. 또, PCR법에 사용하는 프라이머는, 마우스 캅파형(mouse kappa type) L쇄 리더 서열과 하이브리다이즈 (hybridize)하는 서열번호 : 29~39에 나타난 MKV(Mouse Kappa Variable) 프라이머 (Jones, S.T. 등 ,Bio/Technology, 9, 88-89, (1991))을 사용했다.
PCR용액 100㎕는, 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl. 0.1mM dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 1.5mM MgCl2, 5 유닛트의 DNA 폴리메라제 Ampli Taq (Perkin Elmer Cetus사제) 0.25mM의 서열번호 : 29~39에 나타낸 MKV프라이머와 3mM의 서열번호 : 40에 나타낸 MKC 프라이머 및 1본쇄 cDNA 100ng을 함유하고, 이 것을 50㎕의 광유로 덮은 후, 94℃의 초기 온도에서 3분간, 그리고 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간, 이 순서로 가열했다. 이 온도 사이클을 30회 반복한 후, 반응 혼합물을 또한 72℃에서 10분간 배양했다. 증폭한 DNA 단편을 저융점 아가로스 (Sigma사제)로 정제하고, XmaI (New England Biolabs사제)및 SaII (Takara shuzo 사제)에 의해 37℃에서 소화했다.
2-2. 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭 및 단편화
마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자는 5'-RACE법 (Rapid Amplification of cDNA ends: Frohman, M.A. 등 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 85, 8998-9002, (1988), Edwards, J.B.D.M., 등, Nucleic Acids Res., 19, 5227-5232, (1991))에 의해 증폭했다. 마우스 IgG2a 정상영역에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프라이머-P1(서열번호:63)을 사용해서 cDNA를 합성한 후, 5'-AmpliFINDER RACE KIT (CLONETECH사제)를 사용해서 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA의 증폭을 마우스 IgG2a 정상영역에 특이적으로 하이브리다이즈하는 프라이머 MHC2a(서열번호:64) 및 컷트 첨부의 앵커 프라이머 (서열번호:101)를 사용해서 행했다. 증폭한 DNA 단편을 저융점 아가로스(Sigma사제)로 정제하고, 그리고 EcoRI(Takara shuzo사제) 및 XmaI (Vew England Biolabs사제)에 의해 37℃에서 소화했다.
3. 연결 및 형질전환
상기와 같이해서 조제한 마우스 캅파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유해서 되는 DNA 단편을, SalI 및 XmaI로 소화해서 조제한 pUC19 벡타와, 50mM Tris-HCl(pH7.6), 10mM MaCl2, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 50mg/㎖의 폴리에틸렌글리콜(8000)및 1 유닛트 T4 DNA 리가제(GIBCO-BRL사제)를 함유하는 반응혼합물 중에서, 16℃에서 2.5시간 반응시켜 연결했다. 마찬가지로, 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유해서 되는 DNA 단편을, EcoRI및 XmaI로 소화해서 조제한 pUC19벡타와 16℃에서 3시간 반응시켜 연결했다.
다음에, 10㎕의 상기 연결혼합물을 대장균 DH5α의 수용체 세포(Competent cells) 50㎕에 첨가하고, 그리고 이 세포를 얼음 위에서 30분간, 42℃에서 1분간, 그리고 다시 얼음 위에서 1분간 정치했다. 이어서, 400㎕의 2xYT 배지 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))를 첨가하고, 37℃에서 1시간 배양한 후, 50ug/㎖의 암피실린을 함유하는 2xYT한천 배지 (Molec㎕ar Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))상에 이 대장균을 덮고, 37℃에서 하룻 밤 배양해서 대장균 형질전환체를 얻었다.
이 형질전환체를, 50ug/㎖의 암피실린을 함유하는 2xYT 배지 10㎖ 중에서 37 ℃에서 하룻밤 배양하고, 그리고 이 배양물에서 알카리법 (Molec㎕ar Cloning : A Laboratory Manual, Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989))에 따라서 플라스미드 DNA를 조제했다.
이와 같이해서 얻어진, 항HM1.24항체를 생산하는 하이브리도마에서 유래하는 마우스 캅파형 L쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 pUCHMVL9로 명명했다.
상기 방법에 따라서 얻어진, 항HM1.24항체를 생산하는 하이브리도마에 유래하는 마우스 H쇄 V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 플라스미드를 pUCHMVHR16으로 명명했다.
참고 예 2. DNA의 염기서열의 결정
상기 플라스미드 중 cDNA코드 영역의 염기서열을 자동 DNA 시퀀서 (Applied Biosystem Inc. 제) 및 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit (Applied Biosystem Inc.제)를 사용해서 제조업자 지정의 프로토콜에 따라서 염기서열을 결정했다.
플라스미드 pUCHMVL9에 함유되는 마우스 항HM1.24항체의 L쇄V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호 : 1에 나타냈다. 또, 플라스미드 pUCHMVHR16에 함유되는 마우스 항HM1.24항체 H쇄 V영역을 코드하는 유전자의 염기서열을 서열번호 : 3에 나타냈다.
참고예 3. CDR의 결정
L쇄 및 H쇄의 V영역의 전반적인 구조는, 서로 유사성을 갖고 있고, 각각 4개의 프레임 워크 부분이 3개의 초가변영역, 즉 상보성결정영역(CDR)에 의해 연결되어 있다. 프레임 워크의 아미노산서열은 비교적 양호하게 보존되어 있지만, 한편 CDR영역의 아미노산서열의 변이성은 극히 높다 (Kabat, E. A. 등 [Sequences of Proteins of Immunological Interest] US Dept. Health and Human Services, 1983).
이와 같은 사실에 기초해서, 항 HM 1.24항체의 가변영역의 아미노산서열을 Kabat 등에 의해 제작된 항체의 아미노산서열의 데이터 베이스에 맞게하고, 상동성을 조사해서 CDR 영역을 표1에 나타낸 바와 같이 결정했다.
표 1
참고예 4. 클로닝한 cDNA의 발현의 확인 (키메라항 HM1.24항체의 제작)
1. 발현 벡타의 제작
키메라 항HM1.24항체를 발현하는 벡타를 제작하기 위하여, 각각의 마우스 항 HM1.24항체 L쇄 및 H쇄 V영역을 코드하는 cDNA 클로 pUCHMVL9 및 pUCHMVHR16을 PCR법에 의해 수식했다. 그리고, HEF 발현 벡타 (국제특허출원 공개번호 WO92-19759 참조)에 도입했다.
L쇄 V영역의 후방 프라이머 ONS-L722S(서열번호:65) 및 H쇄 V영역의 후방 프라이머 VHR16S (서열번호:66)는, 각각의 V영역의 리더 서열의 최초를 코드하는 DNA에 하이브리다이즈하고, 또한 Kozak콘센서스 서열 (Kozak, M 등, J. Mol. Biol., 196, 947-950 (1987) 및 HindⅢ 제한효소 인식부위를 갖도록 설계했다. L쇄 V영역의 전방 프라이머 VL9A(서열번호:67) 및 H쇄 V영역의 전방 프라이머 VHR16A (서열번호:68)는 J영역의 말단을 코드하는 DNA 서열에 하이브리다이즈하고, 또한 스플라이스 도너 서열(Splice donor sequence)및 BamHI 제한효소 인식부위를 갖도록 설계했다.
10mM Tris-Hcl(pH8.3), 50mM KCl., 0.1mM dNTPs, 1.5mM MgCl2, 100pmole씩의 각 프라이머, 100ng의 주형 DNA (pUCHMVL9 또는 pUCHMVHR16) 및 5 유닛트의 Ampli Taq효소를 함유하는 100㎕의 PCR 반응혼합물을 50㎕의 광유로 덮고, 94℃에서 최초의 변성 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분간의 사이클을 30회 행하고, 최후로 72℃에서 10분간 배양했다.
PCR 생성물을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용해서 정제하고, HindⅢ 및 BamHI로 소화하고, 그리고 L쇄 V영역에 대해서는 HEF-VL-gκ에, H쇄 V영역에 대해서는 HEF-VH-gγ1에 각각 클로닝했다. DNA 서열 결정 후, 정확한 DNA 서열을 갖는 DNA 단편을 함유하는 플라스미드를 각각 HEF-1.24L-gκ 및 HEF-1.24H-gγ1로 명명했다.
상기 플라스미드 HEF-1.24L-gκ 및 HEF-1.24H-gγ1로부터 각각의 가변영역을 코드하는 DNA 영역을 제한효소 HindIII 및 BamHI에 의해 제한단편으로 하고, 이들을 플라스미드 벡타 pUC19의 HindIII 및 BamHI 부위에 삽입하고, 각각 pUC19-1.24L-gκ 및 pUC19-1.24H-gγ1로 명명했다.
또한, 각각의 플라스미드 pUC19-1.24L-gκ 또는 Puc19-1.24H-gγ1을 함유하는 대장균은, 각각 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ) 및 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)로 칭하고, 각각 FERM BP-5646 및 FERM BP-5644로서 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 1996년 8월 29일에 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되었다.
2. COS-7 세포로의 형질감염(transfection)
키메라 항HM1.24항체의 일과성 발현을 관찰하기 위하여, 상기 발현벡타를 COS-7(ATCC CRL-1651) 세포에서 시험했다. HEF-1.24L-gκ 및 HEF-1.24H-gγ1을 Gene Pulser장치 (BioRad사제)를 사용해서 일렉트로포레이션 (electroporation)에 의해 COS-7 세포로 동시형질전환했다. 각DNA (10ug)를 PBS 중 1X107세포/㎖의 0.8㎖의 앨리코트(aliguots)에 첨가하고, 1500V, 25uF의 용량으로 펄스를 부여했다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를, 10%의 r-글로불린프리 소태아혈청을 함유하는 DMEM배양액 (GIBCO사제) 30㎖에 첨가했다. Co2 인큐베이타 BNA 120D (TABAI사제)중에서 72시간의 배양 후, 배양상청액을 모으고, 원심분리에 의해 세포파편을 제거하고, 이 것을 이하의 실험에 사용했다.
3. FCM 해석
키메라 항HM1.24항체의 항원결합활성은, KPMM2 세포를 사용한 FCM (flow cytometry) 해석으로 행했다.
4.7×105개의 KPMM2세포 (특개평 7-236475호)를 PBS(-)로 세정한 후, 상기 키메라항 HM1.24항체 생산 COS-7 세포배양액 50㎕ 및 FACS 완충액(2% 소태아혈청 0.1% 아지드화 나트륨 함유 PBS(-))50㎕, 또는 500ug/㎖의 정제마우스 항HM1.24항체 5㎕및 FACS완충액 95㎕를 첨가하고, 빙온하에서 1시간 동안 배양했다.
대조로서 키메라항HM1.24항체 생산 COS 세포배양액 대신에, 2ug/㎖의 키메라 SK2(국제특허출원 공개번호 WO94-28159) 50㎕ 및 FACS 완충액 50㎕, 또는 정제 마우스 항HM1.24항체 대신에 500ug/㎖의 정제 마우스 IgG2ak (UPC10) (CAPPEL사제) 5㎕ 및 FACS 완충액 95㎕를 첨가하고, 동일하게 배양했다. FACS 완충액으로 세정한 후, 25ug/㎖의 FITC 표지 염소항인간항체(GAH) (CAPPEL사제), 또는 10ug/㎖의 FITC표지 염소항마우스항체 (GAM) (Becton Dickinson사제) 100㎕를 첨가하고, 빙온하에서 30분간 배양했다. FACS완충액으로 세정한 후, 1㎖의 FACS 완충액에 현탁하고, FACScan (Becton Dickinson 사제)으로 각 세포의 형광강도를 측정했다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 키메라 항HM1.24항체를 첨가한 세포에서는, 마우스 항HM1.24항체를 첨가한 경우와 마찬가지로, 대조와 비교해서 형광강도의 피크가 우측으로 이동했으므로, 키메라항 HM1.24항체가 KPMM2 세포와 결합한 것이 밝혀졌다. 이 것에 의해, 클로닝한 cDNA는 마우스 항HM1.24항체의 V영역을 코드하고 있는 것이 확인되었다.
참고예 5. 키메라항 HM1.24항체 안정생산 CHO 세포의 수립
1. 키메라 H쇄 발현벡타의 제작
전기 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1을 제한효소, PvuI 및 BamHI로 소화하고, EF1 프로모터 및 마우스항HM1.24항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 약 2.8kbp의 단편을 1.5%저융점 아가로스겔을 사용해서 정제했다. 다음에, DHFR 유전자 및 인간H쇄 정상영역을 코드하는 유전자를 함유하는 인간 H쇄 발현벡타 DHFR-ΔE-RVh-PM1f(국제특허출원공개번호 WO92/19759참조)에 사용되고 있는 발현벡타를 PvuI 및 BamHI로 소화해서 조제한 약6kbp의 단편내에 상기 DNA단편을 삽입하여, 키메라항 HM1.24항체 H쇄 발현벡타DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγ1을 구축했다.
2. CHO 세포로의 유전자 도입
키메라항HM1.24항체 안정생산계를 수립하기 위하여, PvuI로 소화해서 직쇄상으로 한 상기 발현벡타 HEF-1.24L-gκ 및 DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγ1을 일렉트로포레이션법에 의해 상기한 것과 동일한 (상기 COS-7 세포로의 형질감염)조건하에서, 동시에 CHO세포 DXB11(Medical Research Council Collaboration Center로부터 공여)에 유전자 도입했다.
3. MTX에 의한 유전자 증폭
유전자 도입한 CHO세포는 500ug/㎖의 G418 (GIBCO-BRL사제) 및 10% 소태아혈청을 첨가한 뉴클레오시드를 함유하지 않는 α-MEM배양액 (GIBCO-BRL사제)중에서는 L쇄 및 H쇄 발현벡타가 함께 도입된 CHO세포만이 생존할 수 있고, 이들을 선별했다. 다음에, 상기 배양액 중에 10nM의 MTX(Sigma사제)를 첨가하고, 증식한 클론 중에서, 키메라항 HM1.24항체의 생산량이 높은 것을 선택한 결과, 약 20ug/㎖의 키메라항체 생산효율을 나타내는 클론 #8-13을 얻고, 키메라항 HM1.24항체 생산 세포주로 했다.
참고예 6. 키메라항 HM1.24항체의 제작
키메라항 HM1.24항체의 제작은 이하의 방법으로 행했다. 상기 키메라 항HM1.24항체 생산CHO세포를, 배지로서 5% γ-글로블린프리 신생 소혈청(GIBCO-BRL 사제)함유 Iscove’s Modified D㎕becco’s Medium (GIBCO-BRL 사제)을 사용하고, 고밀도 세포배양장치 Verax system 20 (CELLEX BIOSCIENCE Inc. 사제)으로 30일간 연속배양했다.
배양개시 후, 제 13일, 20일, 23일, 26일 및 30일째에 배양액을 회수하고, 가압식 여과 필타 유닛트 SARTOBRAN (Sartorius사제)를 사용해서 여과한 후, 항체대량분취 시스템 Afi-Prep System (일본가이시사제) 및 Super Protein A Column (bed volume ; 100㎖, 일본가이시사제)을 사용하고, 부속 설명서에 기초해 흡착/세정완충액으로서, PBS(-), 용출완충액으로서 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH3)을 사용해서 키메라항 HM1.24항체를 아피니티정제했다. 용출분획은 즉시로 1M Tris-HCl(pH8.0)을 첨가해서, pH7.4 부근으로 조정했다. 항체농도는 280nm의 흡광도를 측정하고, 1mg/㎖를 1.35 OD로서 산출했다.
참고예 7. 키메라항HM1.24항체의 활성 측정
키메라항HM1.24항체는 하기의 결합저해활성으로 평가를 행했다.
1. 결합저해활성의 측정
1-1.비오틴 표지 항HM1.24항체의 제작
마우스항HM1.24항체를 0.1M 중탄산염 완충액으로 4mg/㎖로 희석한 후, 50mg/㎖의 비오틴-N-히드록시 숙신이미드(EY LABS Inc.사제) 4㎕를 첨가하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 그 후, 0.2M 글리신 용액 1.5㎖를 첨가하고, 실온에서 30분간 배양해서 반응을 정지시키고, PD-10 칼럼 (Pharmacia Biotech사제)을 사용해서 비오틴화 IgG획분을 분취했다.
1-2. 결합저해활성의 측정
비오틴 표지 마우스항HM1.24항체에 의한 결합저해활성은 인간양막세포주 WISH 세포(ATCC CCL25)를 이용한 Cell-ELISA로 행했다. Cell-ELISA 플레이트는 다음과 같이해서 조제했다. 96웰 플레이트에 10%소태아혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지에 의해 4×105 세포/㎖로 조제한 WISH세포현탁액 100㎕를 첨가하고, 하룻밤 배양한 후, PBS(-)에서 2회 세정 후, 0.1% 글루타르알데히드 (Nacalai Tesque Inc.제)로 고정했다.
블로킹 후, 아피니티 정제에 의해 얻어진 키메라 항HM1.24항체 또는 마우스항HM1.24항체를 단계적으로 희석해서 각 웰(well)에 50㎕첨가하고, 동시에 2ug/㎖의 비오틴 표지 마우스 항HM1.24항체 50㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 배양 및 세정한 후, 퍼옥시다제 표지 스트렙타비딘(Streptavidin) (DAKO 사제)을 첨가했다. 실온에서 1시간 배양한 후, 세정하고, 기질용액을 첨가해 배양한 후, 6N 황산 50㎕로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad사제)을 사용해서 490nm에서의 흡광도를 측정했다.
그 결과, 도2에 나타낸 바와 같이. 비오틴 표지 마우스 항HM1.24항체에 대해서 키메라항HM1.24항체는 마우스항HM1.24항체와 동등한 결합저해활성을 나타냈다. 이 것에 의해, 키메라 항체는 마우스항HM1.24항체와 동일한 V영역을 갖는 것으로 나타났다.
참고예 8. 키메라항HM1.24항체의 ADCC활성의 측정
ADCC (Antibody-dependent Cellular Cytotoxicity)활성의 측정은 Current Protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic Studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993 의 방법에 따랐다.
1. 이펙타 세포( effector cells)의 조제
건강인 및 다발성 골수종 환자의 말초혈 및 골수로 부터 비중원심법으로 단핵구를 분리했다. 즉,건강인 및 다발성 골수종 환자의 말초혈 및 골수에 등량의 PBS(-)를 첨가하고, Ficoll (Pharmacia 사제) -Conrey (제일제약사제) (비중1.077)에 적층하고, 400g으로 30분간 원심분리했다. 단핵구층을 분취하고, 10% 소태아혈청 (Witaker사제)을 함유하는 RPMI 1640 (Sigma사제)으로 2회 세정 후, 같은 배양액으로 세포수가 5×106 /㎖가 되도록 조제했다.
2. 표적세포의 조제
인간골수종세포주 RPMI 8226(ATCC CCL 155)을 0.1m Ci의 51Cr-크롬산 나트륨과 함께 10% 소태아혈청 (Witaker사제)을 함유하는 RPMI 1640(Sigma사제)중에서 37℃에서 60분간 배양해서 방사성 표지했다. 방사성 표지 후, 세포를 Hanks balanced salt solution (HBSS)으로 3회 세정하여, 2×105/㎖로 조제했다.
3. ADCC 평가 (assay)
96웰 U지 바닥 플레이트(Corning사제)에 방사성 표지한 2×105/㎖의 표적세포를 50㎕와, 아피니티 정제에 의해서 얻어진 1ug/㎖의 키메라항 HM1.24항체, 마우스항HM1.24항체, 또는 대조인간 IgG1(Serotec사제)50㎕를 첨가하고, 4℃에서 15분간 반응시켰다.
그 후, 5×106/㎖의 이펙타 세포를 100㎕를 첨가하고, 탄산가스 배양기내에서 4시간 배양했다. 이 때, 이펙타 세포(E)와 표적세포(T)의 비(E:T)를 0:1, 5:1, 20:1 또는 50:1로 했다.
100㎕의 상청액을 취하고, 감마 카운터(ARC 361, Aloka사제)로 배양 상청액 중에 유리된 방사활성을 측정했다. 최대 유리방사능 측정용에는 1% NP-40 (BRL사제)을 사용했다. 세포장해활성(%)은 (A-C)/(B-C)X100으로 계산했다. 또, A는 항체 존재하에서 유리된 방사활성 (cpm), B는 NP-40에 의해 유리된 방사활성 (cpm) 및 C는 항체를 함유하지 않고, 배양액만으로 유리된 방사활성 (cpm)을 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와같이, 인간대조 IgG1과 비교해서 키메라항HM1.24항체를 첨가한 경우, E:T 비의 상승에 따라 세포장해활성이 상승했으므로, 이 키메라 항HM1.24항체가 ADCC활성을 갖는 것으로 나타났다. 또한, 마우스항HM1.24항체를 첨가해서도 세포장해활성은 전혀 발견되지 아니하므로, 이펙타 세포가 인간유래의 세포의 경우, ADCC활성을 얻기 위해서는 인간항체의 Fc부분이 필요한 것으로 나타났다.
참고예 9. 재구성 인간 항HM1.24항체의 제작
1. 재구성 인간 항HM1.24항체 V영역의 설계
마우스 모노클로날 항체의 CDR가 인간항체에 이식되어 있는 재구성 인간항체를 제작하기 위해서는, 마우스 클로날 항체의 FR와 인간항체의 FR와의 사이에 높은 상동성이 존재하는 것이 바람직하다. 따라서, 마우스항HM1.24항체의 L쇄 및 H쇄의 V영역을 Protein Data Bank를 사용해서 구조가 해명되고 있는 모든 기지 항체의 V영역과 비교했다.
마우스 항HM1.24항체의 L쇄 V영역은 인간 L쇄 V영역의 서브그룹 IV (HSGIB)의 콘센서스 서열에 가장 유사하며, 66.4%의 상동성이 존재한다. 한편, HSGI, HSGⅡ 및 HSGⅢ과는 각각 56.9%, 55.8% 및 61.5%의 상동성을 나타냈다.
마우스항HM1.24항체의 L쇄 V영역은 기지의 인간항체 L쇄 V영역과 비교할 때, 인간 L쇄 V영역의 서브그룹 I의 하나인 인간 L쇄 V영역 REI에 67.0%의 상동성을 나타냈다. 따라서, 재구성 인간항 HM1.24 항체 L쇄 V영역을 제작하기 위한 출발물질로서 REI의 FR를 사용했다.
재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 V영역의 버전a를 설계했다. 이 버전에 있어서는, 인간 FR는 재구성 인간 CAMPATH-1H항체중에 존재하는 REI에 기초한 FR(Riechmann, L등, Nature 322, 21-25, (1988)참조. 국제특허출원공개번호 WO92-19759에 기재된 재구성 인간PM-1의 L쇄 V영역의 버전a에 함유되는 FR)과 동일하고, 그리고 마우스 CDR는 마우스항HM1.24항체의 L쇄 V영역중의 CDR와 동일한 것으로 했다.
마우스 항HM1.24항체의 H쇄 V영역은 인간 H쇄 V영역의 HSGI의 콘센서스 서열에 가장 유사하며, 54.7%의 상동성이 존재한다. 한편, HSGII 및 HSGIII과는 각각 34.6% 및 48.1%의 상동성을 나타냈다. 마우스항HM1.24항체의 H쇄 V영역은 기지의 인간항체 H쇄 V영역과의 비교에 있어서, FR1로부터 FR3까지는, 인간 H쇄 V영역의 서브그룹I의 하나인 인간항체 HG3의 H쇄 V영역 (Rechavi, G. 등, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80,855-859)에 대단히 유사하고, 그의 상동성은 67.3%이였다.
이를 위해, 인간항체 HG3의 FR를, 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역을 제작하기 위한 출발물질로서 사용했다. 그렇지만, 인간항체 HG3의 FR4의 아미노산서열은 기재되어 있지 않기 때문에, 이번에 FR4에 관해서는 마우스항HM1.24항체의 H쇄의 FR4와 가장 높은 상동성을 나타내는 인간항체 JH6 (Ravetch, J.V.등. Cell, 27, 583-591)의 FR4의 아미노산서열을 사용했다. JH6의 FR4는 하나의 아미노산을 제외하고 마우스 항HM1.24항체의 H쇄의 FR4와 동일의 아미노산서열을 갖는다.
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 제1버전 a에 있어서, 인간 FR1중의 30위치 및 인간 FR3 중의 71위치의 아미노산을 마우스 항HM1.24항체의 아미노산과 동일하게 한 것 이외, FR1로부터 FR3까지는 인간 HG3의 FR1로부터 FR3과 동이하며, 그리고 CDR는 마우스 항HM1.24항체의 H쇄 V영역 중의 CDR와 동이하게 했다.
2. 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 V영역의 제작
재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄를, PCR법에 의한 CDR이식에 의해 제작했다. 이 방법을 도4에 모식적으로 나타냈다. 인간항체 REI 유래의 FR을 갖는 재구성 인간 항HM1.24항체(버전 a)를 제작하기 위하여 8개의 PCR프라이머를 사용했다. 외부 프라이머 A(서열번호:69) 및 H(서열번호:70)는, HEF발현벡타 HEF-VL-gκ의 DNA서열과 하이브리다이즈 하도록 설계했다.
CDR이식 프라이머 L1S(서열번호:71), L2S(서열번호:72) 및 L3S(서열번호:73)는 센스DNA서열을 갖고, 그리고 CDR이식 프라이머 L1A(서열번호:74), L2A(서열번호:75) 및 L3A(서열번호:71)는 안티-센스 DNA서열을 갖고, 그리고 각각 프라이머 L1S, L2S 및 L3S의 5'-말단의 DNA서열에 대한 상보적 DNA서열(20~23bp)을 갖는다.
제 1PCR단계에 있어서 4개의 반응 A-L1A, L1S-L2A, L2S-L3A 및 L3S-H를 행하여 각 PCR생성물을 정제했다. 제 1PCR로부터 4개의 PCR생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다(국제특허출원공개번호 WO 92-19759 참조). 다음에, 외부 프라이머 A 및 H를 첨가해서, 재구성 인간항 HM 1.24항체 L쇄 V영역을 코드하는 전장 DNA를 증폭했다(제 2PCR). 상기 PCR에 있어서는, 인간항체 REI로부터 FR에 기초한 재구성 인간 ONS-M21항체 L쇄 V영역 버전a를 코드하는 플라스미드 HEF-RVL-M21a(국제특허출원공개번호 WO 95-14041참조)를 주형으로서 사용했다.
제 1PCR단계에 있어서는, 10mM Tri-HCL(pH8.3), 50mM KCL, 0.1mM dNTPs, 1.5mM MgCL2, 100ng의 주형 DNA, 100pmole의 각 프라이머 및 5μ의 Ampli Taq를 함유하는 PCR혼합물을 사용했다. 각 PCR 튜브는 50㎕의 광유로 덮었다. 최초에 94℃에서 변성한 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간의 반응 사이클을 행하고, 다음에 72℃에서 10분간 배양했다.
PCR생성물 A-L1A(215bp), L1S-L2A(98bp), L2S-L3A(140bp) 및 L3S-H(151bp)를 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용해서 정제하고, 제2PCR로 어셈블리했다. 제2PCR에 있어서는, 1㎍의 각 제 1PCR의 생성물 및 5㎍의 Ampli Taq를 함유하는 98㎕의 PCR혼합물을 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간으로 2사이클로 배양하고, 다음에 100pmole의 각 외부 프라이머(A 및 H)를 첨가했다. PCR튜브를 50㎕의 광유로 덮고, 상기한 것과 동일한 조건으로 30사이클의 PCR을 행했다.
제 2PCR에 의해 생긴 516bp의 DNA단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔로 정제하고, BamHI 및 HindⅢ으로 소화하여 얻어진 DNA단편을 HEF발현벡타 HEF-VL-gκ에 클로닝했다. DNA서열 결정 후, 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 V영역의 정확한 아미노산서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-RVLa-AHM-gκ로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ에 함유되는 L쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호: 11에 나타냈다.
재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 V영역의 버전b를, PCR을 사용하는 변이유발법에 의해서 제작했다. 변이원 프라이머 FTY-1(서열번호:57) 및 FTY-2(서열번호:78)는 71위치의 페닐알라닌이 티로신으로 변이하도록 설계했다.
플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용해서 증폭한 후, 최종 생성물을 정제하고, BamHI 및 HindⅢ로 소화하여 얻어진 DNA 단편을 HEF 발현벡터 HEF-VL-gκ에 클로닝하여, 플라스미드 HEF-RVLb-AHM-gκ를 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVLb-AHM-gκ에 함유되는 L쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호: 13에 나타냈다.
3. 재구성 인간항 HM1.24 항체 H쇄 V영역의 제작
3-1. 재구성 인간항 HM1.24 항체 H쇄 V영역 버전 a-e의 제작
재구성 인간항 HM1.24 항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 다음과 같이 설계했다.
인간항체 HG3의 FR1~3 및 인간항체 JH6의 FR4를 코드하는 DNA서열을, 마우스 항HM1.24항체 H쇄 V영역의 CDR을 코드하는 DNA 서열과 연결해서 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역을 코드하는 전장 DNA를 설계했다.
다음에, 이 DNA 서열의 각각 5' 측 및 3' 측에 HindⅢ 인식부위/Kozak 콘센서스 서열 및 BamHI인식 부위/스플라이스 도너 서열을 부가해서 HEF발현 벡터에 삽입할 수 있도록 했다.
이와 같이 해서 설계한 DNA 서열을 4개의 올리고뉴클레오티드로 나누고, 다음에 이들의 올리고뉴클레오티드의 어셈블리를 방해할 가능성이 있는 올리고뉴클레오티드 중의 2차 구조에 대해서 컴퓨터 해석을 했다. 4개의 올리고뉴클레오티드 서열 RVH1~RVH4를 서열번호:79∼82에 나타낸다. 이들의 올리고뉴클레오티드는 119~144 염기의 길이를 갖고, 25~26bp의 오버랩 영역(overlapping region)을 갖는다. 올리고뉴클레오티드 중 RVH2(서열번호:80), RVH4(서열번호:82)는 센스 DNA 서열을 갖고, 그리고 다른 RVH1(서열번호:79), RVH3(서열번호:81)는 안티센스 DNA 서열을 갖는다. 이들 4개의 올리고뉴클레오티드의 PCR법에 의한 어셈블리의 방법을 도면에 나타냈다(도5 참조).
100ng씩의 4종류의 올리고뉴클레오티드 및 5μ의 Ampli Taq를 함유하는 98㎕의 PCR혼합물을, 94℃에서 2분간 최초로 변성한 후, 94℃에서 2분간, 55℃에서 2분간 및 72℃에서 2분간의 2사이클의 배양을 행했다. 100pmole씩의 RHP1(서열번호:83) 및 RHP2(서열번호:84)를 외부 프라이머로서 첨가한 후, PCR 튜브를 50㎕의 광유로 덮고, 그리고 94℃에서 1분간 최초로 변성한 후, 94℃에서 1분간, 55℃에서 1분간 및 72℃에서 1분간의 38사이클을 행하고, 다음에 72℃에서 10분간 배양했다.
438bp의 DNA단편을 1.5%저융점 아가로스 겔을 사용해서 정제하고, BamHI 및 HindⅢ에 의해 소화하고, 다음에 HEF발현 벡타 HEF-VH-gγ1에 클로닝했다. DNA서열 결정 후, 정확한 H쇄 V영역의 아미노산서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-RVHa-AHM-gγ1으로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:15에 나타냈다.
재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역의 각 버전 b, c, d 및 e를 이하와 같이하여 제작했다.
버전 b는, 변이원 프라이머로서 66위치의 알기닌이 리신으로 변이하도록 설계한 BS(서열번호:85) 및 BA(서열번호:86)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형DNA로서, PCR법에 의해 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:17에 나타낸다.
버전 c는, 변이원 프라이머로서 73위치의 트레오닌이 리신으로 변이하도록 설계한 CS(서열번호:87) 및 CA(서열번호:88)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형DNA로서, PCR법에 의해 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHc-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHc-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:19에 나타낸다.
버전 d는, 변이원 프라이머로서 66위치의 알기닌이 리신으로, 73위치의 트레오닌이 리신으로 변이하도록 설계한 DS(서열번호:89) 및 DA(서열번호:90)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형 DNA로서, 플라스미드 HEF-RVHd-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHd-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:21에 나타낸다.
버전 e는, 변이원 프라이머로서 67위치의 발린이 알라닌으로, 69위치의 메티오닌이 류신(leucine)으로 변이하도록 설계한 ES(서열번호:91) 및 EA(서열번호:92)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1를 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역에 함유되는 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:23에 나타낸다.
3-2. H쇄 하이브리드 V영역의 제작
H쇄 하이브리드 V영역을 2종류 구축했다. 하나는 FRI과 FR2의 아미노산서열이 마우스 항HM1.24항체 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼a 유래로 되는 마우스·인간 하이브리드 항 HM1.24 항체, 또 하나는 FR1과 FR2의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼a 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 마우스 항HM1.24항체 유래로 되는 인간·마우스 하이브리드 항 HM1.24항체 이다. CDR영역의 아미노산서열은 모두 마우스 항HM1.24항체 유래이다.
2종류의 H쇄 하이브리드 V영역은 PCR법에 의해 제작했다. 이 방법을 도 6 및 도 7에 모식적으로 나타냈다. 2종류의 H쇄 하이브리드 V영역을 제작하기 위하여, 4종류의 프라이머를 사용했다. 외부 프라이머 a(서열번호:93) 및 h(서열번호:94)는, HEF 발현 벡타 HEF-VH-Gγ1의 DNA 서열과 하이브리다이즈 하도록 설계되었다. H쇄 하이브리드 제작 프라이머 HYS(서열번호:95)은 센스 DNA 서열을 갖고, H쇄 하이브리드 프라이머 HYA(서열번호:96)는 안티센스 DNA서열을 갖고, 서로 상보적인 DNA서열이 되도록 설계되었다.
FR1과 FR2의 아미노산서열이 마우스항HM1.24항체 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼a 유래로 되는 H쇄 하이브리드 V영역을 제작하기 위하여, 제1PCR 단계에 있어서 플라스미드 HEF-1.24-gγ1을 주형으로 하고, 외부 프라이머 a와 H쇄 하이브리드 프라이머 HYA를 사용한 PCR와, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형으로 해서 H쇄 하이브리드 프라이머 HYS(서열번호:95)와 외부 프라이머 h(서열번호:94)를 사용한 PCR를 행하고, 그리고 각 PCR 생성물을 정제했다. 제 1PCR로 부터 2개의 PCR 생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다(국제특허출원공개번호 WO92-19759참조).
다음에, 외부 프라이머 a(서열번호:93) 및 h(서열번호:94)를 가해서, FR1과 FR2의 아미노산서열이 마우스 항HM1.24항체 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼a 유래로 되는 H쇄 하이브리드 V영역을 코드하는 전장 DNA를 제 2 PCR단계에서 증폭했다.
FR1과 FR2의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼a 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 마우스 항HM1.24항체 유래로 되는 H쇄 하이브리드 V영역을 제작하기 위하여, 제 1PCR 단계에서 플라스미드 HEF-RVHA-AHM-gγ1을 주형으로 하여 외부 프라이머 a와 H쇄 하이브리드 프라이머 HYA를 사용한 PCR와, 플라스미드 HEF-1.24H-gγ1을 주형으로 해서 H쇄 하이브리드 프라이머 HYS와 외부 프라이머 h를 사용한 PCR를 행하고, 그리고 각 PCR 생성물을 정제했다. 제 1PCR로 부터 2개의 PCR 생성물을 그들 자체의 상보성에 의해 어셈블리시켰다(국제특허출원공개번호 WO92-19759 참조).
다음에, 외부 프라이머 a 및 h를 가해서, FR1과 FR2의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼 a유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 마우스항HM1.24항체 유래로 되는 H쇄 하이브리드 V영역을 코드하는 전장 DNA를 제2 PCR단계에서 증폭했다.
제1 PCR, PCR 생성물의 정제, 어셈블리, 제2 PCR, 및 HEF 발현벡타 HEF-VH-gγ1으로의 클로닝의 방법은 실시예 9, 재구성 인간HM1.24항체 L쇄 V영역의 제작에 나타낸 방법에 따라서 행했다.
DNA 서열 결정 후, FR1과 FR2의 아미노산서열이 마우스항HM1.24항체 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 버젼 a 유래로 되는 H쇄 하이브리드 V영역의 정확한 아미노산서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-MH-RVH-AHM-gγ1으로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-MH-RVH-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:97에 나타낸다. 또, FR1과 FR2의 아미노산서열이 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역의 버젼 a 유래이고, FR3과 FR4의 아미노산서열이 마우스항체HM1.24항체 유래로 되는 H쇄 하이브리드 V영역의 정확한 아미노산서열을 코드하는 DNA단편을 함유하는 플라스미드를 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1로 명명했다. 이 플라스미드 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:99에 나타낸다.
3-3. 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역 버젼 f-r의 제작
재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역의 각 버젼 f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q, r를 이하와 같이해서 제작했다.
버젼 f는, 변이원 프라이머로서 75위치의 트레오닌이 세린으로, 78위치의 발린이 알라닌으로 변이하도록 설계한 FS(서열번호:102) 및 FA(서열번호:103)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHe-AHM-gγ1을 주형 DNA로 해서, PCR법에 의해 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:25에 나타낸다.
버젼 g는, 변이원 프라이머로서 40위치의 알라닌이 알기닌으로 변이하도록 설계한 GS(서열번호:104) 및 GA(서열번호:105)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHg-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHg-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:27에 나타낸다.
버젼 h는, 변이원 프라이머로서 FS(서열번호:102) 및 FA(서열번호:103)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHb-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:29에 나타낸다.
버젼 i는, 변이원 프라이머로서 83위치의 알기닌이 알라닌으로, 84위치의 세린이 페닐알라닌으로 변이하도록 설계한 IS(서열번호:106) 및 IA(서열번호:107)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 주형으로서 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHi-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHi-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:31에 나타낸다.
버젼 j는, 변이원 프라이머로서 66위치의 알기닌이 리신으로 변이하도록 설계한 JS(서열번호:108)와 JA(서열번호:109)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHf-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHj-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHj-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:33에 나타낸다.
버젼 k는, 변이원 프라이머로서 81위치의 글루타민산이 글루타민으로 변이하도록 설계한 KS(서열번호:110) 및 KA(서열번호:111)을 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여, 플라스미드 HER-RVHk-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHk-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:35에 나타낸다.
버젼 l는, 변이원 프라이머로서 81위치의 글루타민산이 글루타민으로, 82B 위치의 세린이 이소로이신으로 변이하도록 설계한 LS(서열번호:112) 및 LA(서열번호:113)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVH1-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHl-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:37에 나타낸다.
버젼 m은, 변이원 프라이머로서 81위치의 글루타민산이 글루타민으로, 82b 위치의 세린이 이소로이신으로, 87위치의 트레오닌이 세린으로 변이하도록 설계한 MS(서열번호:114)와 MA(서열번호:115)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHm-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHm-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:39에 나타낸다.
버젼 n은, 변이원 프라이머로서 82B 위치의 세린이 이소로이신으로 변이하도록 설계한 NS(서열번호:116) 및 NA(서열번호:117)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHn-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHn-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:41에 나타낸다.
버젼 o는, 변이원 프라이머로서 87위치의 트레오닌이 세린으로 변이하도록 설계한 OS(서열번호:118) 및 OA(서열번호:119)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHh-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHo-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:43에 나타낸다.
버젼 p는, 변이원 프라이머로서 78위치의 발린이 알라닌으로 변이하도록 설계한 PS(서열번호:120) 및 PA(서열번호:121)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 PCR법에 의해 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:45에 나타낸다.
버젼 q는, 변이원 프라이머로서 75위치의 트레오닌이 세린으로 변이하도록 셀계한 QS(서열번호:122) 및 QA(서열번호:123)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHa-AHM-gγ1을 주형 DNA로서, PCR법에 의해 증폭하여 플라스미드 HEF-RVHq-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHq-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:47에 나타낸다.
버젼 r는, 변이원 프라이머로서 CS(서열번호:87) 및 CA(서열번호:88)를 사용하고, 플라스미드 HEF-RVHp-AHM-gγ1을 주형 DNA로서 PCR법에 의해 증폭하여, 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:49에 나타낸다.
또한, 상기 플라스미드 HEF-RVLa-AHM-gκ 및 HEF-RVHr-AHM-gγ1로 부터 각각의 가변영역을 코드하는 영역을 제한효소 HindⅢ 및 BamHI에 의해 제한단편으로 하고, 이들을 플라스미드 벡타 pUC19의 HindⅢ 및 BamHI 부위에 삽입했다. 각각의 플라스미드는 pUC19-RVLa-AHM-gκ 및 pUC19-RVHr-AHM-gγ1으로 명명했다.
또한, 각각의 플라스미드 pUC19-RVLa-AHM-gκ 및 pUC19-RVHr-AHM-gγ1을 함유하는 대장균은, 각각 Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ) 및 Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)로 칭하고, 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 1996년 8월 29일에 각각 FERM BP-5645 및 FERM BP-5643으로서 부다페스트 조약에 기초해서 국제기탁했다.
4. 재구성 인간 항HM1.24항체, 키메라항HM1.24항체, 및 H쇄 하이브리드 항체의 제작
재구성 인간 항HM1.24항체의 각 쇄를 평가하기 위하여, 재구성 인간 항HM1.24항체와 포지티브 콘트롤 항체로서 키메라 항HM1.24항체를 발현시켰다. 그리고, 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역의 버젼b 이하의 각 버젼을 제작할때, 어느 FR내의 아미노산 잔기를 치환할 것인가를 검토하기 위하여 H쇄 하이브리드 항체를 발현시켰다. 또, 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 버젼a의 평가를 위하여 키메라 H쇄와 조합해서 발현시켰다.
4-1. 재구성 인간 항HM1.24항체의 발현
재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄를 위한 발현벡타(HEF-RVHa-AHM-gγ1~HEF-RVHr-AHM-gγ1)와 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄를 위한 발현벡타(HEF-RVLa-AHM-gκ 또는 HEF-RVLb-AHM-gκ) 각 10㎍을 Gene P㎕ser 장치(Biorad사제)를 사용해서 일렉트로포레이션에 의해 COS-7 세포로 동시형질전환했다. 각 DNA(10㎍)를, PBS 중 1×107 세포/㎖의 0.8㎖의 앨리코트에 가하고, 1500V, 25㎌의 용량으로 펄스를 부여했다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10%의 γ-글로블린프리 소태아혈청을 함유하는 DMEM 배양액 30㎖(G1BCO사 제)에 첨가했다. 37℃, 5% CO2의 조건하에서 72시간의 배양을 CO2 인큐베이타 BNA120D(TABAI사제)를 사용해서 행한 후, 배양 상청액을 모으고, 원심로타 03(히타찌사제)을 장착한 원심기 15PR-22(히타찌사제)에 의해 1000 rpm, 5분간의 원심분리를 행하여 세포 파편을 제거하고, 마이크로콘센트레이타(microconcentrator, Centricon 100, Amicon사제)를 원심로타 JA-20.1(BECKMAN사제)을 장착한 원심기 J2-21(BECKMAN사제)에 의해 2000 rpm의 조건하에서 한외여과농축을 행하여, Cell-ELISA에 사용했다.
4-2. 키메라항HM1.24항체의 발현
키메라항HM1.24항체 H쇄를 위한 발현벡타 HEF-1.24H-gγ1과 키메라항HM1.24항체 L쇄를 위한 발현벡타 HEF-1.24L-gκ 각 10㎍을 사용하여, 상기 재구성 인간 항HM1.24항체의 발현방법에 따라서 Cell-ELISA에 사용하기 위한 키메라항HM1.24항체를 조제했다.
4-3. 인간형화 L쇄 버젼 a와 키메라 H쇄로 부터 되는 항HM1.24항체의 발현
키메라항HM1.24항체 H쇄를 위한 발현벡타 HEF-1.24H-gγ1과 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄 버젼 a를 위한 발현 벡타 HEF-RVLa-AHM-gκ 각 10㎍을 사용하여, 상기 재구성 인간 항HM1.24항체의 발현 방법에 따라서, Cell-ELISA에 사용하기 위한 인간형화 L쇄 버젼 a와 키메라H쇄로 부터 되는 항HM1.24항체를 조제했다.
4-4. H쇄 하이브리드항체의 발현
H쇄 하이브리드 V영역을 위한 발현 벡타(HEF-MH-RVH-AHM-gγ1 또는 HEF-HM-RVH-AHM-gγ1)과 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄를 위한 발현 벡터 HEF-RVLa-AHM-Gκ 각 10㎍을 사용하고, 상기 재구성 인간 항HM1.24항체의 발현 방법에 따라서 Cell-ELISA에 사용하기 위한 H쇄 하이브리드 항체를 조제했다.
4-5. 항체농도의 측정
얻어진 항체의 농도측정은 ELISA에 의해 행했다. ELISA용 96웰 플레이트(Maxisorp, NUNC사제)의 각 웰에 코팅 완충액(coating buffer)(0.1M NaHCO3, 0.02% NaN3, pH 9.6)에 의해 1㎍/㎖의 농도로 조제한 염소항인간 IgG항체(BIO SOURCE사제) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양해서 고상화했다. 100㎕의 희석 완충액(50mM Tris-HCl, 1mM MgCl2, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN3, 1% 소혈청알부민(BSA), pH8.1)으로 블로킹한 후, 한외여과농축을 행한 재구성 인간 항HM1.24항체, 키메라항HM1.24항체, 및 H쇄 하이브리드 항체를 순차단계희석해서 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 알카리 포스파타제 표지 염소 항인간 IgG항체(DAKO사제) 100㎕를 첨가했다.
실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 기질 완충액(50mM NaHCO3, 10mM MgCl2(pH 9.8))에 용해한 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, P-니트로페닐 포스페이트, SIGMA사제) 100㎕를 첨가하고, 405nm에서의 흡광도를 MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad사제)을 사용해서 측정했다. 농도측정의 표준품으로서 인간 IgG1(The Binding Site사제)를 사용했다.
5. 재구성 인간 항HM1.24항체 안정생산 CH0세포주의 수립
5-1. 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 발현 벡타의 제작
플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 제한효소 PvuI 및 BamHI로 소화하고, EF1 프로모터 및 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 약 2.8kbp의 단편을 1.5% 저융점 아가로스겔을 사용해서 정재했다. 다음에, DHFR 유전자 및 인간 H쇄 정상영역을 코드하는 유전자를 함유하는 인간 H쇄 발현 벡타 DHFR-ΔE-RVh-PM1f(국제특허출원공개번호 WO92-19759)에 사용되고 있는 발현 벡타를 PvuI 및 BamHI로 소화해서 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 발현 벡타 DHER-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγ1을 구축했다.
5-2. CH0 세포로의 유전자 도입
재구성 인간 항HM1.24항체 안정생산계를 수립하기 위하여, PvuI로 소화해서 직쇄상으로 한 상기 발현 벡타 DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγ1 및 HEF-RVLa-AHM-gκ를 일텍트로포레이션법에 의해 전술한 것과 동일한 (상기 COS-7 세포로의 형질감염) 조건하에서 동시에 CHO세포 DXB-11에 유전자 도입했다.
5-3. MTX에 의한 유전자 증폭
유전자 도입한 CHO 세포는 500㎍/㎖D㎖ G418 (GIBCO-BRL사제) 및 10% 소태아혈청을 첨가한 뉴클레오시드를 함유하지 않는 α-MEM 배양액 (GIBCO-BRL사제)중에서는 L쇄 및 H쇄 발현 벡타가 함께 도입된 CHO 세포만이 증식할 수 있고, 이들을 선별했다. 다음에, 상기 배양액 중에 10nM의 MTX(Sigma사제)를 첨가하여 증식한 클론 중 재구성 인간 항HM1.24항체의 생산량이 높은 것을 선택한 결과, 약 3㎍/㎖의 재구성 인간 항HM1.24항체 생산율을 나타내는 클론#1을 얻고, 재구성 인간 항HM1.24항체 생산세포주로 했다.
5-4. 재구성 인간 항HM1.24항체의 제작
재구성 인간 항HM1.24항체의 제작은 이하의 방법으로 행했다. 상기 재구성 인간 항HM1.24항체 생산 CHO세포를, 배지로서 10% γ-글로불린프리 소태아혈청(GIBCO-BRL사제)을 함유하는 500㎍/㎖의 G418(GIBCO-BRL사제)을 첨가한 뉴클레오시드를 함유하지 않는 α-MEM배양액(GIBCO-BRL사제)을 사용하여, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 10일 동안 배양을 CO2 인큐베이타 BNA 120D (TABAI사제)를 사용해서 행했다. 배양 개시 후, 제8일 및 제10일째에 배양액을 회수하여, TS-9 로타를 장착한 원심기 RL-500SP(Tomy Seiko 사제)를 사용해서 2000 rpm, 10분간의 원심분리를 행하여 배양액 중의 세포 파편을 제거한 후, 0.45㎛ 직경의 멤브레인을 갖는 보틀 탑 필터(bottle top filter)(FALCON사제)에 의해 여과 멸균했다.
이 재구성 인간 항HM1.24항체 생산 CHO세포 배양액에 같은 양의 PBS(-)를 첨가한 후, 고속 항체정제장치 ConSep LC100(MILLIPORE사제) 및 Hyper D Protein A 칼럼(일본 가이시사제)을 사용하여, 부속 설명서에 기초하여 흡착완충액으로서 PBS(-), 용출완충액으로서 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH3)을 사용해서 재구성 인간 항HM1.24항체를 아피니티 정제했다. 용출획분은 즉시 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해서 pH7.4 부근에 조정한 후, 원심한외농축기 Centriprep 10(MILLIPORE사제)을 사용해서 농축 및 PBSC-)로의 완충액 치환을 행하여 구공 직경 0.22㎛의 멤브레인 필터 MILLEX-GV(MILLIPORE사제)를 사용해서 여과멸균하여, 정제 재구성 인간 항HM1.24항체를 얻었다. 정제 항체의 농도는 280nm의 흡광도를 측정하여, 1㎎/㎖를 1.35 OD로서 산출했다.
참고예 11. 재구성 인간 항HM1.24항체의 활성 측정
재구성 인간 항HM1.24항체는 하기 항원결합활성 및 결합저해활성으로 평가했다.
1. 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정법
1-1. 항원결합활성의 측정
항원결합활성의 측정은, WISH 세포를 사용한 Cell-ELISA로 행했다. Cell-ELISA 플레이트는 상기 참고예 7. 1-2에 기재된 바와 같이 제작했다.
블로킹 후, COS-7 세포의 배양 상청액을 농축해서 얻은, 또는 CHO세포의 배양 상청액에 의해 정제된 재구성 인간 항HM1.24항체를 단계적으로 희석해서 각 웰에 100㎕씩 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양 및 세정한 후, 퍼옥시다제 표지 래빗항인간 IgG항체(DAKO사제)를 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 기질용액을 첨가해 배양한 후, 6N 황산 50㎕로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad사제)을 사용해서 490㎜에서의 흡광도를 측정했다.
1-2. 결합저해활성의 측정
비오틴 표지 마우스항HM1.24항체에 의한 결합저해활성은, WISH세포를 사용한 Cell-ELISA로 행했다. Cell-ELISA 플레이트는 전술한 바와 같이 제작했다. 블로킹 후, COS-7 세포의 배양 상청액을 농축해서 얻은, 또는 CHO 세포의 배양 상청액에 의해 정제된 재구성 인간 항HM1.24항체를 단계적으로 희석해서 각 웰에 50㎕씩 첨가하고, 동시에 2㎍/㎖의 비오틴 표지 마우스항HM1.24항체 50㎕를 첨가하여, 실온에서 2시간 동안 배양 및 세정한 후, 퍼옥시다제 표지 스트렙타비딘(DAKO사제)를 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후 세정하고, 기질용액을 첨가해 배양한 후, 6N 황산 50㎕로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad사제)을 사용해서 490nm에서의 흡광도를 측정했다.
2. 재구성 인간 항HM1.24항체의 평가
2-1. L쇄
재구성 인간 항HM1.24항체의 L쇄 버젼 a의 평가는 전기 항원결합활성의 측정에 의해서 행했다. 도 8에 나타낸 바와 같이, L쇄 버젼 a는 키메라 H쇄와 조합해서 발현시키면, 키메라항HM1.24항체와 같은 정도의 항원결합활성을 나타냈다. 그러나, 한층 더 활성의 상승 또는 H쇄와의 상용성을 고려하여, 새로이 L쇄 버젼 b를 제작했다. 그리고, H쇄의 버젼 a, b, f 또는 h와 조합시켰을 때의 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정을 행하여 L쇄 버젼 a, b를 함께 평가했다. 도 9, 도 10, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, H쇄 a, b, f 및 h의 모든 버젼에서, L쇄 버젼 a가 버젼 b에 비해서 양활성도 강했다. 따라서, 재구성 인간 항HM1.24항체의 L쇄 버젼 a를 이하의 실험에 사용했다.
2-2. H쇄 버젼 a-e
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 a-e의 평가는 L쇄 버젼 a와 조합해서, 전기 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 11, 도 13, 도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 모든 버젼에 있어서 키메라항HM1.24항체와 비교해서 양활성도 약하고, 한층 더 아미노산의 변환이 필요한 것으로 생각되었다.
2-3. H쇄 하이브리드 항체
H쇄 하이브리드 항체의 평가는 전기 항원결합활성의 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, 항원결합활성은 인간-마우스 하이브리드항HM1.24항체에서는 키메라항HM1.24항체와 동등한 활성을 갖고 있는 한편, 마우스·인간 하이브리드항HM1.24항체는 키메라항HM1.24항체와 비교해서 그의 활성이 약했다. 따라서, 마우스항HM1.24항체, 또는 키메라항HM1.24항체와 동등한 항원결합활성을 갖는 재구성 인간HM1.24항체를 제작하기 위해서는, H쇄 V영역 중, FR3 또는 FR4에 함유되는 아미노산을 변환할 필요가 있는 것으로 나타났다.
2-4. H쇄 버젼 f-r
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼f의 평가는 전기 항원결합활성의 측정에 의해서 행했다. 그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, 항원결합활성은 키메라항HM1.24항체와 비교하면 떨어지지만, 상기 버젼 a-c와 비교해서 활성이 향상했으므로, 이 버젼에서 새로이 변환한 67, 69, 75 및 78번째의 4개의 아미노산 중 어느 것이 재구성 인간항체의 활성에 관여하고 있는 것이 시사되었다.
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 g의 평가는 전기 항원결합활성, 및 결합저해활성의 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 18 및 도 19에 나타낸 바와 같이, 이 버젼은 상기 버젼 a와 같은 정도의 활성밖에 나타내지 아니했으므로, 상기 H쇄 인간·마우스 하이브리드 항체의 평가에서 나타낸 바와 같이, 이 버젼에서 변환한 40번째의 아미노산은 재구성 인간항체의 활성의 향상에는 기여하지 아니하는 것으로 나타났다.
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 h-j의 평가는 전기 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 20, 도 21, 도 22, 도 23에 나타낸 바와 같이, 모든 버젼에서 양활성도 키메라항HM1.24항체와 비교하면 약하고, 상기 버젼 f와 같은 정도이므로, 버젼 f에서 새로이 변환한 4개의 아미노산 중, 67 및 69번째의 아미노산은 재구성 인간항체의 활성의 향상에 기여하지 아니한 것이 시사되었다.
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 k-p의 평가는 전기 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 24, 도 25, 도 26 및 도 27에 나타낸 바와 같이, 모든 버젼에서 양활성도 키메라항HM1.24항체와 비교하면 약하고, 상기 버젼 h와 같은 정도이므로, 이들 6개의 버젼에서 새로이 변환한 80번째 이하의 아미노산은 재구성 인간항체의 활성의 향상에 기여하고 있지 아니한 것이 시사되었다.
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 q의 평가는 상기 항원결합활성,및 결합저해활성의 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 25 및 도 27에 나타낸 바와 같이, 이 버젼은 양활성도 상기 버젼 h 또는 버젼 p와 비교하면 약하고, 상기 버젼 a와 같은 정도의 활성밖에 갖지 아니했으므로, 78번째의 아미노산의 치환이 재구성 인간항체의 활성의 향상에 필수인 것이 시사되었다.
재구성 인간 항HM1.24항체의 H쇄 버젼 r의 평가는 상기 측정에 의해 행했다. 그 결과, 도 15 및 도 28에 나타낸 바와 같이, 버젼 r은 키메라항HM1.24항체와 같은 정도의 항원결합활성 및 결합저해활성을 갖는 것으로 나타났다.
이상의 결과로 부터, 재구성 인간 항HM1.24항체가 마우스항HM1.24항체 또는 키메라항HM1.24항체와 같은 정도의 항원결합능을 갖기 위하여 H쇄에 있어서 필요한 최소의 변환은 30번째, 71번째 및 78번째, 또한 73번째의 아미노산인 것으로 나타냈다.
또한, 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a-r에 대해서, 그의 항원결합활성 및 결합저해활성을 하기 표 2에 요약했다.
표 2
또, 재구성 인간 항HM1.24항체, L쇄 버젼 a 및 b의 아미노산의 서열을 표 3에 나타냈고, 재구성 인간 항HM1.24항체 H쇄 버젼 a-r의 아미노산서열을 표 4~6에 나타냈다.
표 3
표 4
표 5
표 6
3. 정제 재구성 인간 항HM1.24항체의 평가
상기 정제 재구성 인간 항HM1.24항체는 상기 항원결합활성 및 결합저해활성으로 평가를 행했다. 그 결과, 도 31 및 도 32에 나타낸 바와 같이, 재구성 인간 항HM1.24항체는 키메라항HM1.24항체와 같은 정도의 항원결합활성 및 결합저해활성을 갖는 것으로 나타냈다. 이 것에 의해서, 재구성 인간 항HM1.24항체는 마우스항HM1.24항체와 동일한 항원결합활성을 갖는 것으로 나타났다.
참고예 12. 마우스항HM1.24 모노클로날 항체생산 하이브리도마의 조제
Goto, T. et. al., Blood(1994)84, 1992-1930에 기재된 방법으로, 마우스항HM1.24 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 조제했다.
인간 다발성 골수종 환자의 골수에서 유래하는 엡스타인-바 바이러스 핵 항원(Epstein-Barr virus nuclear antigen)(EBNA)-음성 형질 세포주 KPC-32(1×107개) (Goto, T. et al., Jpn.j. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400)를 BALB/C 마우스 (Charles River제)의 복강내에 6주간 걸러 2회 주사했다.
이 마우스를 도살하기 3일 전에 마우스의 항체 생산가를 더욱 상승시키기 위하여 1.5×106개의 KPC-32세포를 마우스의 비장내에 주사했다(Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med.(1990) 37,89). 마우스를 도살한 후에, 비장을 적출하여, Groth, de St. & Schreidegger의 방법(Cancer Research (1981) 41.3465)에 따라 적출한 비장세포와 미엘로마 세포(myeloma cells) SP 2/0을 세포융합시켰다.
KPC-32 세포를 코트한 플레이트를 사용하는 ELISA(Posner, M.R.et al., J.lmmunol. Methods (1982) 48,23)에 의해 하이브리도마 배양 상청액 중의 항체의 스크리닝을 행했다. 5×104개의 KPC-32 세포를 50㎖의 PBS에 현탁하고, 96웰 플레이트(U자 바닥형, Corning, Iwaki제)에 분주했다. 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양 상청액을 첨가하고 4℃에서 2시간 동안 배양했다. 이어서, 4℃에서 1시간 동안 퍼옥시다제 표지 항마우스 IgG 염소항체(Zymed제)를 반응시켜, 한번 세정하고, 실온에서 30분간 o-페닐렌디아민 기질용액(Sumitomo Bakelite 제)과 반응시켰다.
2N 황산으로 반응을 정지시키고, ELISA reader(Bio-Rad 제)로 492nm에 있어서 흡광도를 측정했다. 인간면역 글로블린에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 제거하기 위하여, 양성 하이브리드도마 배양 상청액을 인간 혈청에 미리 흡착시키고, 다른 세포 하부에 대한 반응성을 ELISA로 스크리닝했다. 양성의 하이브리도마를 선택하고, 여러가지 세포주 및 인간의 표본에 대한 반응성을 플로우 사이토메트리(flow cytometry)로 조사했다. 최후에 선택된 하이브리도마 클론을 2회 클론하고, 이것을 프리스탄(pristane)으로 처리한 BALB/C 마우스의 복강에 주사하여 복수(腹水)를 얻었다.
모노클로날 항체는, 황산 암모늄에 의한 침전과 프로테인 A 아피니티 크로마토그라피 킷트(Ampure pA, Amersham 제)에 의해 마우스 복수로 부터 정제했다. 정제 항체는 Quick Tag FITC 결합 킷트(Boehringer Manheim 제)를 사용해서 플루오레스세인 이소시아네이트(fluorescein isocianate)(FITC)와 결합시켰다.
그 결과, 30개의 하이브리도마 클론이 생산하는 모노클로날 항체가 KPC-32 및 RPMI 8226 세포와 반응했다. 클로닝 후, 이들의 하이브리도마의 배양 상청액을 다른 세포주와 말초혈 유래 단핵구와의 반응성을 조사했다.
이 중, 3개의 클론이 형질세포에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체이였다. 이들 3개의 클론 중, 가장 플로우 사이토메트리분석에 유용하고, 또한 RPMI 8226 세포에 대한 보체의존성 세포장해활성을 갖는 하이브리도마 클론을 선택하여 HM1.24로 명명했다. 이 하이브리도마가 생산하는 모노클로날항체의 서브클라스를, 서브클라스 특이적 항마우스 래빗항체(Zymed 제)를 사용한 ELISA로 결정했다. 항HM1.24항체는, IgG2ak의 서브클라스를 갖고있다. 항HM1.24항체를 생산하는 하이브도마 HM1.24는 공업기술원생명공학공업연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에, 1995년 9월 14에 FERM BP-5233으로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되었다.
참고예 13. HM1.24항원 폴리펩티드를 코드하는 cDNA의 클로닝
1. cDNA 라이브라리(library)의 제작
1) 전체 RNA의 조제
마우스 모노클로날 항체 HM1.24가 특이적으로 인식하는 항원 폴리펩티드인 HM1.24 항원을 코드하는 cDNA를 이하와 같이 단리했다.
인간 다발성 골수종 세포주 KPMM2로 부터, 전체 RNA를 Chirgwin 등 (Biochemistry, 18, 5294(1979))의 방법에 따라서 조제했다. 즉, 2.2×108개의 KPMM2를 20㎖의 4M 구아니딘 이소시아네이트(Nacalai Tesque Inc. 제) 중에서 완전히 호모나이즈시켰다.
호모지네이트(homogenate)를 원심관 중에서 5.3M 염화 세슘용액층 상에 중층하고, 다음에 이것을 Beckman SW40로타 중에서 31,000rpm으로 20℃에서 24시간 원심분리해서 RNA를 침전시켰다. RNA 침전물을 70% 에탄올에 의해 세정하고, 그리고 1mM EDTA 및 0.5% SDS를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.4)300㎕ 중에 용해하고, 여기에 프로나제(Pronase)(Boehringer 제)를 0.5㎎/㎖가 되도록 첨가한 후, 37℃에서 30분간 배양했다. 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, RNA를 에탄올로 침전시켰다. 다음에, RNA 침전물을 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.4) 200㎕에 용해시켰다.
2) poly(A) + RNA의 조제
상기와 같이해서 조제한 전체 RNA의 약 500㎍을 원료로해서 Fast Track 2.0m RNA Isolation Kit(Invitrogen 제)를 사용해서 킷트에 첨부한 처방에 따라서 poly(A) + RNA를 정제했다.
3) cDNA 라이브라리의 구축
상기 poly(A) + RNA 10㎍을 원료로 해서, cDNA 합성 킷트 TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia 제)를 사용해서 킷트에 첨부한 처방에 따라서 2본쇄 cDNA를 합성하고, 또한 Directional Cloning Toolbox(Pharmacia 제)를 사용해서 킷트 부속의 EcoRI 어댑터(adapter)를 킷트에 첨부한 처방에 따라서 연결했다. EcoRI 어댑터의 카이네이션(kination) 및 제한효소 NotI 처리는 킷트에 첨부한 처방에 따라서 행했다. 또한, 약 500bp 이상의 크기의 어댑터-부가 2본쇄 cDNA를 1.5% 저융점 아가로스겔(Sigma 제)을 사용해서 분리, 정제하여 어댑터-부가 2본쇄 cDNA 약 40㎕를 얻었다.
이와 같이해서 제작한 어댑터-부가 2본쇄 cDNA를, 미리 제한효소 EcoRI, NotI 및 알카리 포스파타제(다까라 슈 조제) 처리한 pCOS1 벡타(일본특허출원 평8-255196호)와 DNA리가제(GIBCO-BRL 제)를 사용해서 연결하여, cDNA 라이브라리를 구축했다. 구축한 cDNA 라이브라리는, 대장균 세포주 DH5α(GIBCO-BRL 제)에 형질도입되고, 전체의 사이즈는 약 2.5×106개의 독립한 클론인 것으로 추정되었다.
2. 직접 발현법에 의한 클로닝
1) COS-7 세포로의 형질감염
상기 형질도입한 대장균 약 5×105 클론을 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 2-YT배지(Molec㎕ar Cloning:A Laboratory Mannual. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))로 배양해서 cDNA의 증폭을 행하고, 알카리법(Molecualr Cloning:A Laboratory Mannual. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))에 의해 대장균으로 부터 플라스미드 DNA를 회수했다. 얻어진 플라스미드 DNA는 Gene P㎕ser 장치(Bio-Rad 제)를 사용해서 일렉트로포레이션법에 의해 COS-7 세포에 형질감염했다.
즉, 정제한 플라스미드 DNA 10㎍을 1×107 세포/㎖로 PBS 중에서 현탁한 COS-7 세포액 0.8㎖에 첨가하고, 1500V, 25μFD의 용량으로 펄스를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포는, 10% 소태아혈청 (GIBCO-BRL 제)를 함유하는 DMEM 배양액(GOBCO-BRL 제)으로, 37℃, 5% CO2 조건하에서 3일간 배양했다.
2) 판닝 디쉬(panning dish)의 조제
마우스항 HM1.24 항체를 코팅한 판닝 디쉬를 B.Seed 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84,3365-3369(1987))의 방법에 따라서 조제했다. 즉, 마우스항 HM1.24 항체를 10㎍/㎖가 되도록 50mM Tris-HCL(pH9.5)에 첨가했다. 이와 같이해서 조제한 항체용액 3㎖를 직경 60㎜의 세포배양플레이트에 가하고, 실온에서 2시간 동안 배양했다. 0.15M NaCl 용액으로 3회 세정한 후, 5% 소태아혈청, 1mM EDTA, 0.02% NaN3를 함유하는 PBS를 가하여 블로킹한 후, 하기 클로닝에 사용했다.
3) cDNA 라이브라리의 클로닝
전술한 바와 같이, 형질감염한 COS-7 세포는, 5mM EDTA를 함유하는 PBS로 벗기고, 5% 소태아혈청을 함유하는 PBS로 1회 세정한 후, 약 1×106 세포/㎖가 되도록 5% 소태아혈청 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS에 현탁하고, 상기와 같이 조제한 판닝 디쉬에 가하고, 실온에서 약 2시간 동안 배양했다. 5% 소태아혈청 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS로 3번 완만하게 세정한 후, 0.6% SDS 및 10mM EDTA를 함유하는 용액을 사용해서 판닝 디쉬에 결합한 세포로부터 플라스미드 DNA의 회수를 행했다.
회수한 플라스미드 DNA를 다시 대장균 DH5α에 형질도입하고, 전술한 바와 같이 플라스미드 DNA를 증폭한 후, 알카리법으로 회수했다. 회수한 플라스미드 DNA를 COS-7 세포에 일렉트로포레이션법에 의해 형질감염하여 전술한 것과 동일하게 결합한 세포로부터 플라스미드 DNA를 회수했다. 동일한 조작을 또한 1회 반복하여, 회수한 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRI 및 NotI로 소화한 결과, 약 0.9κbp의 사이즈의 인서트(insert)의 농축이 확인되었다. 또한, 회수한 플라스미드 DNA의 일부를 형질도입한 대장균을 50㎍/㎕의 암피실린을 함유하는 2-YT 아가 플레이트(agar plate)에 접종하고, 하룻 밤 배양한 후, 단일의 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 회수했다. 제한효소 EcoRI 및 NotI로 소화하고, 인서트의 사이즈가 약 0.9κbp를 나타내는 클론 p3.19를 얻었다.
이 클론에 대해서는, PRISM, Dye Terminater Cycle Sequencing kit(Perkin Elmer 제)를 사용하고, 킷트에 첨부한 처방에 따라 반응을 행하고, ABI 373A DNA Sequencer(Perkin Elmer 제)로 염기서열의 결정을 행했다. 이 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:128에 나타낸다.
서열번호:128에 나타낸 아미노산서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 cDNA는 pUC19 벡타의 XbaI 절단부위의 사이에 삽입되어 플라스미드 pRS38-pUC19로서 조제되고 있다. 이 플라스미드 pRS38-pUC19를 함유하는 대장균(E.coli)은 1993년 10월 5일자로 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)로서, 수탁번호 FERM BP-4434로서 부다페스트 조약에 기초해서 국제기탁 되어있다(특개평 7-196694).
이하에, 본 발명의 천연 FR서열로 구성되는 천연 인간형화 항체의 하나의 예로서 인간형화 항HM1.24항체에 기초한 천연 인간형 항체의 제조예를 나타낸다.
실시예 1
마우스 클로날항HM1.24항체는, 참고예에 기재된 바와 같이 CDR 이식에 의해 재구성 인간 항HM1.24항체로서 인간형화 되었다. 그 때, 인간형화 H쇄 구축을 위해 FR1로부터 FR3까지는 인간항체 HG3의 각 FR가 선택되고, 또한 FR4에 대해서는 인간항체 JH6의 FR4가 선택되었다. FR 아미노산 잔기에 대해서 검토를 행한 결과, 4개소(FR1/30, FR3/71,73,78)의 아미노산 치환이 필요했다(표 7 및 표 8). 이 인간형화 항체는 원래의 마우스 항체와 동등한 항원결합활성을 가졌다. 이 인간형화 항체(RVLa/RVHr로부터 되는 인간형화 항체)를 1차 디자인 항체로 했다.
(1) H쇄의 구축
1차 디자인 항체의 FR에 대해서 천연에서 발견되고 잇는 인간 FR에 대한 상동성 검색을 Swiss Plot, GenBank, PFR, PIR, GenPept의 데이터 베이스를 사용해서 실시했다. 우선, FR1에 대해서는 완전히 아미노산서열이 일치하는 50개의 인간 FR가 발견되었다. 즉, 이 1차 디자인 항체의 FR1은 거의 천연서열을 갖고 있다. FR2 및 FR4에 대해서는, 원래 아미노산 치환은 행해지지 아니하므로, HG3 및 JH6를 비롯해서 각각 50개 및 100개의 천연의 인간항체 FR가 존재했다.
한편, FR3에 대해서는 완전히 일치한 것은 발견되지 아니했다. 가장 높은 상동성을 갖는 FR3으로서, 96.875%의 상동성을 갖는 S46463, 1921296C, HUMIGHRF1, UOO583 1 등(기호는 어느 것도 데이터 베이스의 등록번호)이 발견되었다.
따라서, 이 1차 디자인 항체에 있어서는 FR3가 천연에서 발견되지 않는 인공적인 아미노산 잔기를 함유하는 FR이였다. 최대의 상동성을 나타내는 인간항체 S46463과의 아미노산서열의 비교를 표 9에 나타냈다.
표 9
1차 디자인 항체의 FR3에서는 70위치의 아미노산 잔기가 메티오닌이고, 한편 인간항체 S46463의 FR3에서는 이소로이신 이였다. 기타 아미노산서열은 완전히 일치했다. 따라서, 1차 디자인 항체의 70위치의 아미노산 잔기를 이소로이신으로 치환하고, 천연에 존재하는 FR3으로 변환했다. 따라서, 얻어지는 2차 디자인 항체는 인간항체 S46463의 천연인간FR로 구성된 CDR 이식항체이다. 이와 같이해서 구축된 2차 디자인항체는 모두 천연에 존재하는 FR로부터 구성된다.
(2) 천연 인간형화 항HM1.24항체 H쇄 V영역의 제작
천연 인간형화 항HM1.24항체 H쇄 V영역을, PCR를 사용하는 변이유발법에 의해서 제작했다. 변이원 프라이머 SS(서열번호:124) 및 SA(서열번호:125)는 69위치의 메티오닌이 이소로이신으로 변이하도록 설계했다.
참고예에 기재한 플라스미드 HEF-RVHr-AHM-gγ1을 주형으로 하고, 상기 프라이머를 사용해서 증폭한 후, 최종생성물을 정제하고, BamHI 및 HindⅢ으로 소화하여 얻어진 DNA단편을 HEF발현 벡타 HEF-VH-gγ1에 클로닝하여, 플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1을 얻었다. 이 플라스미드 HEF-RVHs-AhM-gγ1에 함유되는 H쇄 V영역의 아미노산서열 및 염기서열을 서열번호:126에 나타낸다.
또한, 상기 플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1로 부터의 가변영역을 코드하는 영역을 제한효소 HindⅢ 및 BamHI에 의해 제한단편으로하고, 이것을 플라스미드 벡타 pUC19의 BamHI 및 HindⅢ 부위에 삽입했다. 얻어진 플라스미드를 pUC19-RVHs-AHM-gγ1로 명명했다.
플라스미드 pUC19-RVHs-AHM-gγ1을 함유하는 대장균은, Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)로 칭하고, 공업기술원생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 1997년 9월 29일에 FERM BP-6127로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되었다.
2) L쇄의 해석
1차 디자인 항체의 L쇄의 구축에서는 FR의 아미노산은 치환되지 아니했지만, 사용한 인간항체 REI는 거의 아미노산 치환이 행해져 있는 개변 FR(Riechman, L.et al., Nature (1988) 332,323-327)이였으므로, 이들 FR에 대해서도 동일하게 상동성을 검색했다. 그 결과, 이 개변 FR에 상당하는 천연서열은 존재했다. 따라서, L쇄 FR의 아미노산 치환은 필요하지 않은 것으로 판명되었다.
실시예 2. 천연 인간형화 항HM1.24항체의 제작
(1) 천연 인간형화 항HM1.24항체의 발현
천연 인간형화 항HM1.24항체 H쇄를 위한 발현 벡타(HEF-RVHs-AHM-gγ1)와 재구성 인간 항HM1.24항체 L쇄를 위한 발현 벡타(HEF-RVLa-AHM-gκ) 각 10㎍을 Gene P㎕ser 징치(BioRad 제)를 사용해서 일렉트로포레이션에 의해 COS 세포를 동시형질전환했다. 각 DNA(10㎍)를 PBS 중에서 1×107세포/㎖의 0.8㎖의 앨리코트에 가하고, 1500V, 25uF의 용량으로 필스를 주었다.
실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포를 10% γ-글로블린-프리 소태아혈청을 함유하는 DMEM 배양액 30㎖(GIBCO 사제)에 첨가했다. 37℃, 5% CO2 조건하에서 72시간의 배양을 CO2 인큐베이터 BNA 120D(TABAI 사제)를 사용해서 행한 후, 배양 상청액을 모으고, 원심로타 03(HITACHI 사제)을 장착한 원심기 05PR-22(HITACHI 사제)에 의해 1000rpm, 5분간의 원심분리를 행하여 세포파편을 제거하고, 마이크로콘센트레이터(Centricon 100, Amicon 사제)를 원심로타 JA-20.1(BECKMAN 사제)을 장착한 원심기 J2-21(BECKMAN 사제)에 의해 2000rpm의 조건하에서 한외여과농축을 행하여, 여과 필터, 마일렉스(Milex) GVB13(Millipore 사제)을 사용해서 여과멸균한 것을 Cell-ELISA에 사용했다.
(2) 항체농도의 측정
얻어진 항체의 농도측정은 ELISA에 의해 행했다. ELISA용 96웰 플레이트(Maxisorp, NUNC사제)의 각 웰에 코팅 완충액(0.1M NaHCO3, 0.02% NaN3, pH9.6)에 의해 1㎍/㎖의 농도로 조제한 염소항인간 IgG항체(BIO SOURCE 사제) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 배양해서 고상화했다. 100㎕의 희석 완충액(50mM Tris-HCl, 1mM MgCl2, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, 0.02% NaN3 1% 소혈청 알부민(BSA), pH8.1)으로 블로킹한 후, 한외여과농축을 행한 천연 인간형화 항HM1.24항체를 순차단계 희석해서 각 웰에 100㎕씩 가해서 실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 알카리 포스파타제 표지 염소항인간 IgG항체(DAKO사제) 100㎕를 가했다.
실온에서 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 기질 완충액(50mM NaHCO3, 10mM MgCl2(pH9.8))에 용해한 1㎎/㎖의 기질용액(Sigma 104, p-니트로페닐 포스페이트, Sigma 사제) 100㎕를 첨가하여, 405nm에서의 흡광도를 MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 사제)을 사용해서 측정했다. 농도측정의 표준품으로서 인간IgG1k(The Binding Site 사제)를 사용했다.
(3) 천연 인간형화 항HM1.24항체 안정생산 CHO 세포주의 수립
천연 인간형화 항HM1.24항체를 안정적으로 생산하는 CHO 세포주는 하기 방법에 따라서 수립할 수가 있다.
(3)-1. 천연 인간형화 항HM1.24항체 H쇄 발현 벡타의 제작
플라스미드 HEF-RVHs-AHM-gγ1을 제한효소 PvuI 및 BamHI로 소화하고, EF1 프로모터 및 천연 인간형화 항HM1.24항체 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 약 2.8κbp의 단편을 1.5% 저융점 아가로스 겔을 사용해서 정제한다. 다음에 DHFR 유전자 및 인간 H쇄 정상영역을 코드하는 유전자를 함유하는 인간 H쇄 발현 벡타 DHFR-ΔE-RVh-PM1f(국제특허출원공개번호 WO92-19759)에 사용되고 있는 발현 벡타를 PvuI 및 BamHI로 소화해서 조제하는 약 6κbp의 단편내에 상기 DNA 단편을 삽입하여, 천연 인간형화 항HM1.24항체 H쇄 발현 벡타 DHFR-ΔE-HEF-RVHs-AHM-gγ1을 구축한다.
(3)-2. CHO 세포로의 유전자 도입
천연 인간형화 항HM1.24항체 안정생산계를 수립하기 위하여, PvuI로 소화해서 직쇄상으로 한 상기 발현 벡타 DHFR-ΔE-HEF-RVHs-AHM-gγ1 및 HEF-RVLa-AHM-gκ를 일렉트로포레이션법에 의해 전술한 것과 동일한(전기 COS-7 세포로의 형질감염) 조건하에서 동시에 CHO 세포 DXB-11에 유전자 도입한다.
(3)-3. MTX에 의한 유전자 증폭
유전자 도입한 CHO 세포는 500㎍/㎖의 G418(GIBCO-BRL 사제) 및 10% 소태아혈청을 첨가한 뉴클레오시드를 함유하지 않는 α-MEM 배양액 중(GIBCO-BRL 사제)에서는 L쇄 및 H쇄 발현 벡터가 함께 도입된 CHO 세포만이 증식할 수 있고, 그들을 선별한다. 다음에, 상기 배양액 중에 10nm의 MTX(Sigma 사제)를 첨가하여, 증식하는 클론 중 천연 인간형화 항HM1.24항체의 생산량이 높은 것을 선택한다.
(3)-4. 천연 인간형화 항HM1.24항체의 제작
천연 인간형화 항HM1.24항체의 제작은 이하의 방법으로 행한다. 상기 천연 인간형화 항HM1.24항체 생산 CHO 세포를, 배지로서 10% γ-글로불린-프리 소태아혈청(GIBCO-BRL 사제)을 함유하는 500㎍/㎕의 G418(GIBCO-BRL 사제)을 첨가한 뉴클레오시드를 함유하지 않는 α-MEM 배양액(GIBCO-BRL 사제)을 사용하여, 37℃, 5% CO2 조건하에서 10일간 배양을 CO2 인큐베이터 BNA 120D(TABA 사제)를 사용해서 행한다. 배양 개시 후, 제 10일째에 배양액을 회수하고, TS-9 로타를 장착한 원심기 RL-500SP(Tomy Seiko 사제)를 사용해서 2000rpm, 10분간의 원심분리를 행하여 배양액 중의 세포 파편을 제거한 후, 0.45㎛ 직경의 멤브레인을 갖는 보틀 탑 필타(bottle top filter)(FALCON 사제)에 의해서 여과멸균한다.
이 천연 인간형화 항HM1.24항체 생산 CHO 세포 배양액에 등량의 PBS(-)를 첨가한 후, 고속 항체정제장치 ConSep LC100(MILLIPORE 사제) 및 Hyper D Protein A 칼럼(일본 가이샤제)을 사용하고, 부속 설명서에 기초해 흡착완충액으로서 PBS(-), 용출완충액으로서 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH3)을 사용해서 천연 인간형화 항HM1.24항체를 아피니티 정제한다. 용출획분은 즉시 1M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가해서 pH 7.4 부근으로 조정한 후, 원심한외농축기 Centriprep 10(MILLIPORE 사제)을 사용해서 농축 및 PBS(-)으로의 완충액 치환을 행하고, 구공 직경 0.22㎛의 멤브레인 필타 MILLEX-GV(MILLIPORE 사제)를 사용해서 여과멸균하여 정제 천연 인간형화 항HM1.24항체를 얻는다. 정제항체의 농도는 280nm의 흡광도를 측정하여, 1㎎/㎖를 1.35OD로서 산출한다.
실시예 3. 천연 인간형화 항체의 활성측정
천연 인간형화 항 HM1.24항체는 하기 항원결합활성, 결합저해활성 및 ADCC 활성으로 평가를 행했다.
(1) 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정법
(1)-1. 항원결합활성의 측정
항원결합활성의 측정은, WISH 세포를 사용한 Cell-ELISA로 행했다. Cell-ELISA 플레이트는 전기 참고예 7.1-2에서 기재한 바와 같이 제작했다.
블로킹 후, COS-7 세포의 배양 상청액을 농축해서 얻어진 천연 인간형화 항HM1.24항체를 단계희석하여 각 웰에 100㎕ 가하고, 실온에서 2시간 동안 배양 및 세정한 후, 퍼옥시다제 표지 래빗 항인간 IgG항체(DAKO 사제)를 첨가했다. 실온으로 1시간 동안 배양 및 세정한 후, 기질용액을 첨가해서 배양한 후, 6N 황산 50㎕로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 사제)을 사용해서 490nm에서의 흡광도를 측정했다.
(1)-2. 결합저해활성의 측정
비오틴 표지 마우스항HM1.24항체에 의한 결합저해활성은, WISH 세포를 사용한 Cell-ELISA로 행했다. Cell-ELISA 플레이트는 전술한 바와 같이 제작했다. 블로킹 후, COS-7 세포의 배양 상청액을 농축해서 얻어진 천연 인간형화 항HM1.24항체를 단계희석하여 각 웰에 50㎕ 가하고, 동시에 2㎍/㎖의 비오틴 표지 마우스 항HM1.24항체 50㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 배양 및 세정한 후, 퍼옥시다제 표지 스트렙토아비딘(DAKO 사제)을 첨가했다. 실온에서 1시간 동안 배양한 후 세정하고, 기질용액을 첨가해 배양한 후, 6N 황산 50㎕로 반응을 정지시키고, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 사제)을 사용해서 490nm에서의 흡광도를 측정했다.
(2) 항원결합활성 및 결합저해활성
천연 인간형화 항HM1.24항체의 H쇄의 평가는, L쇄 버전 a와 조합해서 전기 항원결합활성 및 결합저해활성의 측정에 의해서 행했다. 그 결과, 도 29, 도 30에 나타낸 바와 같이, 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인항체)는 1차 디자인항체 (재구성 인간 항HM1.24항체:H쇄 버전r)와 같은 정도의 항원결합활성 및 결합저해활성을 갖는 것이 나타났다.
(3) ADCC 활성의 측정
ADCC(Antibody-dependent Cell㎕ar Cytotoxicity)활성의 측정을 참고예 8의 방법에 따라서 행했다.
1. 이펙타 세포의 조제
건강인의 말초혈에 등량의 PBS(-)를 첨가하고, Ficoll-Paque(Pharmacia Biotech 사제)에 적층하고, 500g에서 30분간 원심분리했다. 단핵구층을 분취하고, 10% 소태아혈청(GIBCO-BRL 사제)을 함유하는 RPMI 1640(GIBCO-BRL 사제)으로 2회 세정 후, 같은 배양액으로 세포수가 5×106/㎖가 되도록 조제했다.
2. 표적세포의 조제
인간 골수종 세포주 KPMM2(기탁번호 P-14170, 일본특허출원 평 6-58082)를 0.1mCi의 51Cr-소듐 크로메이트와 함께 10% 소태아혈청(GIBCO-BRL 사제)을 함유하는 RPMI 1640(GIBCO-BRL 사제) 중에서 37℃에서 60분간 배양해서 방사성 표지했다. 방사성 표지 후, 세포를 같은 배양액으로 3회 세정하여, 2×105/㎖로 조제했다.
3. ADCC 활성의 측정
96웰 U자 바닥 플레이트(Corning 사제)에 방사성표지 2×105/㎖의 표적세포 50㎕와, 아피니티 정제에 의해 얻어진 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인 항체)를 4㎍/㎖, 0.4㎍/㎖, 0.04㎍/㎖ 및 0.004㎍/㎖로 미리 조제한 항체용액 50㎕를 가하고, 4℃에서 15분간 반응시켰다. 또한, 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인 항체)를 함유하지 않는 용액을 동일하게 조제하여서 대조로 했다.
그 후, 5×106/㎖의 이펙타세포를 100㎕ 가하고, 탄산가스 배양기 내에서 4시간 배양했다. 그 때, 이펙타세포(E)와 표적세포(T)와의 비(E:T)를 0:1, 20:1 및 50:1로 했다. 각 항체의 최종 농도는 4배로 희석되기 때문에, 각각 1㎍/㎖, 0.1㎍/㎖, 0.01㎍/㎖, 0.001㎍/㎖ 및 항체무첨가 했다.
100㎕의 상청액을 취하고, 감마 카운터(ARC361, Aloka 사제)로 배양 상청액 중에 유리된 방사활성을 측정했다. 최대유리 방사능 측정용에는 1% NP-40(Nacalai Tesque 사제)을 사용했다. 세포장해활성(%)은 (A-C)/(B-C)×100으로 계산했다. 또한, A는 항체 존재하에서 유리된 방사활성(cpm), B는 NP-40에 의해 유리된 방사활성(cpm) 및 C는 항체를 함유하지 않고, 배양액만으로 유리된 방사활성(cpm)을 나타낸다.
4. 결과
도 33에 나타낸 바와 같이, 항체 무첨가와 비교해서, 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인항체)를 첨가한 경우, E:T비의 상승에 따르고, 항체의 농도에 의존해서 특이적 크롬 유리율이 상승했으므로, 천연 인간형화 항HM1.24항체(2차 디자인항체)가 ADCC 활성을 갖는 것이 나타났다.
본 발명은, 천연 인간 FR로 구성되는 천연 인간형화 항체의 제조방법 및 이 방법에 의해 얻어진 천연 인간형화 항체에 관한 것이다. 이 기술은, G.Winter에 의해서 고안된 CDR이식(Jones, P.T. et al., Nature(1986) 321, 522-525)의 문제점을 해결함으로써 완성도가 높은 인간형화 기술이다. 1차 디자인 항체의 구축은, 천연 인간 FR로 구성되는 인간형화 항체 제작을 위한 중간단계로서 고려될 수 있다. 재조합 단백질에 의한 의약품으로서 항체를 개발하는 경우, 천연에서 발견되고 있는 인간 FR로 구성되는 천연 인간형화 항체는, 항원성이나 안전성의 점에서 보다 우수하다.
발명의 효과
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 천연 인간형화 항체는, 종래의 인간형화 항체기술에서 얻어지는 인간형화 항체를 함유하는, 천연에 존재하지 않는 인공적인 FR의 아미노산 잔기를 함유하지 않기 때문에, 인간에 있어서 항원성이 낮은 것으로 추측된다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 얻어진 천연 인간형화 항체는, 인간형화의 주형으로 된 비인간 포유동물 유래의 항체와 같은 정도의 활성을 갖는 것이 나타났다. 따라서, 본 발명의 천연 인간형화 항체는 인간에 대한 치료적인 투여를 위하여 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110>Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120>Natural Humanized Antibody <150>JP1997271726 <151>1997-10-03 <160>128 <170>KopatentIn 1.71 <210>1 <211>394 <212>DNA <213> <220> <221>CDS <222> <400>1 atg ggc ttc aag atg gag tca cat ttt ctg gtc ttt gta ttc gtg ttt 48 Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Phe Leu Val Phe Val Phe Val Phe -20 -15 -10 CTC TGG TTG TCT GGT GTT GAC GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC 96 Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His -5 -1 1 5 AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG 144 Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys 10 15 20 GCC AGT CAG GAT GTG AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAT CAA CAA AAA CCA 192 Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 25 30 35 40 GGA CAA TCG CCT AAA CTA CTG ATT TAC TCG GCA TCC AAC CGG TAC ACT 240 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 45 50 55 GGA GTC CCT GAT CGC ATC ACT GGC AGT GGA TCT GGG ACG GAT TTC ACT 288 Gly Val Pro 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65 70 75 ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210>99 <211>418 <212>DNA <213> <220> <221>CDS <222> <400>99 atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC AGT 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC ATC TTG GCA TTT GAG GAC TCT GCG GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCA AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210>101 <211>38 <212>DNA <213> <400>101 ctggttcggc ccacctctga aggttccaga atcgatag 38 <210>102 <211>35 <212>DNA <213> <400>102 gcagacacgt cctcgagcac agcctacatg gagct 35 <210>103 <211>35 <212>DNA <213> <400>103 agctccatgt aggctgtgct cgaggacgtg tctgc 35 <210>104 <211>26 <212>DNA <213> <400>104 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20 <210>117 <211>26 <212>DNA <213> <400>117 gatctcagga tgctcagctc catgta 26 <210>118 <211>20 <212>DNA <213> <400>118 agatctgagg actcggccgt 20 <210>119 <211>20 <212>DNA <213> <400>119 acggccgagt cctcagatct 20 <210>120 <211>35 <212>DNA <213> <400>120 gcagacacgt ccacgagcac agcctacatg gagct 35 <210>121 <211>35 <212>DNA <213> <400>121 agctccatgt aggctgtgct cgtggacgtg tctgc 35 <210>122 <211>35 <212>DNA <213> <400>122 gcagacacgt cctcgagcac agtctacatg gagct 35 <210>123 <211>35 <212>DNA <213> <400>123 agctccatgt agactgtgct cgaggacgtg tctgc 35 <210>124 <211>26 <212>DNA <213> <400>124 agagtcacca tcaccgcaga caagtc 26 <210>125 <211>26 <212>DNA <213> <400>125 gacttgtctg cggtgatggt gactct 26 <210>126 <211>418 <212>DNA <213> <220> <221>CDS <222> <400>126 atg gac tgg acc tgg agg gtc ttc ttc ttg ctg gct gta gct cca ggt 48 Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly -15 -10 -5 GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys -1 1 5 10 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 15 20 25 ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192 Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 30 35 40 45 GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240 Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser 50 55 60 CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser 65 70 75 ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 80 85 90 TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr 95 100 105 TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 <210>128 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90 95 100 105 AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT 385 Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr 110 115 120 ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG 433 Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu 125 130 135 AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC 481 Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr 140 145 150 TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG 529 Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu 155 160 165 ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575 Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln *** 170 175 180 AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635 TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695 GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT CTGGGGACAC 755 AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815 TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875 TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935 AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995 AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013

Claims (15)

  1. 천연 인간형화 항체의 제조방법으로,
    (1)(a) 비인간 포유동물종 유래의 상보성 결정영역(CDR); 및 (b) 인간 유래의 프레임워크 영역(FR)으로, 당해 FR중의 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 상기 비인간 포유동물종의 FR의 대응하는 위치의 아미노산 잔기 (「인공적인 아미노산 잔기」)로 치환되어 있는 FR;을 포함하는 인간형화 항체 (1차 디자인 항체)를 얻고,
    (2) 상기 1차 디자인 항체의 FR에 대해서 천연에서 발견되는 인간항체 FR(천연 인간 FR)의 서열 데이터를 사용하여 상동성 검색을 행하고;
    (3) 상기 1차 디자인 항체의 FR과 상동성을 갖는 천연 인간 FR의 리스트를 작성하고;
    (4) 상기 리스트로부터 아미노산 서열 상의 대응하는 위치에 상기 1차 디자인 항체의 FR에 함유되어 있는 「인공적인 아미노산 잔기」와 동일한 아미노산 잔기를 갖는 천연 인간 FR로서, 상기 1차 디자인 항체의 FR과 일치하거나 또는 80% 이상의 상동성을 갖는 천연 인간 FR을 선택하고;
    (5) 상기 1차 디자인 항체의 FR 중에, 아미노산 서열 상의 대응하는 위치에 (4)에서 선택한 천연 인간 FR과 다른 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 있는 경우에는, 당해 1차 디자인 항체의 FR 중의 당해 아미노산 잔기를 상기 천연 인간 FR의 대응하는 위치의 아미노산 잔기로 치환하고;
    (6) 단계 (1) ~ (5)를 거쳐서 얻어진 항체의 아미노산 서열을 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡타를 구축하고;
    (7) 상기 발현 벡타를 도입한 세포를 배양하고; 그리고
    (8) 상기 세포의 배양물로부터, 상기 단계 (1) ~ (5)를 거쳐서 얻어진 아미노산 서열을 갖는 천연 인간형화 항체를 단리·정제하는 것으로 이루어지는 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 비인간 포유동물종이 마우스 또는 랫트인 제조방법.
  5. 제 1항에 있어서, 천연 인간 FR이 모두 동일한 서브그룹에 속하는 천연 인간 FR인 제조방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 1개 이상 내지 10개 이하의 아미노산 잔기인 제조방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (5)에서 1 또는 복수개의 아미노산 잔기가 1개 이상 내지 10개 이하의 아미노산 잔기인 제조방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 「인공적인 아미노산 잔기」가 항체구조를 담당하는 아미노산 잔기 (canonical structure), CDR의 구조유지에 관여하는 아미노산 잔기, 및/또는 직접적으로 항원분자와 상호 작용하는 아미노산 잔기를 포함하는 제조방법.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 「인공적인 아미노산 잔기」가 H쇄71 위치의 아미노산 잔기, 및/또는 H쇄94 위치의 아미노산 잔기를 포함하는 제조방법.
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