KR102441231B1 - 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 전하 반발을 이용하여 Fc영역의 해리의 촉진 및/또는 회합의 제어를 달성하는, Fc영역의 계면을 형성하는 아미노산에 있어서의 개변 및/또는 중쇄 CH3영역의 안정성을 불안정하게 하는 개변을 중쇄 CH3영역에 도입한 복수 종류의 폴리펩티드의 호모체를 환원 조건하에서 인큐베이트함으로써 이종 다량체를 효율적이고 또한 안정하게 제조하는 방법을 제공한다.

Description

폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법{Method for producing polypeptide heteromultimer}
본 발명은 폴리펩티드 이종 다량체의 제조방법 및 폴리펩티드의 헤테로화가 촉진되도록 Fc영역의 아미노산이 개변된 폴리펩티드 이종 다량체 등에 관한 것이다.
항체는 혈중에서의 안정성이 높고 부작용이 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다(비특허문헌 1, 비특허문헌 2). 그 중에는 2종류의 항원 또는 에피토프를 동시에 인식할 수 있는 이중특이성 항체가 있고, 이들은 표적 특이성의 높음과 복수의 경로를 동시에 저해하는 기능이 기개된다(비특허문헌 3). 예를 들면 이미 시판되고 있는 카투막소맵(Catumaxomab)은 상피세포 접착인자인 EpCAM과, T세포에 발현하고 있는 CD3에 결합하는 이중특이성 항체로, 악성 복수의 치료제로서 사용되고 있다.
IgG형 이중특이성 항체의 제조는 목적으로 하는 이중특이성 항체가 얻어지는 효율의 낮음과, 정제의 곤란함으로부터 난이도가 높으나, 효율적 생산에 관한 지견이 몇 가지 보고되어 있다(비특허문헌 3). 예를 들면 2종류의 가변영역을 갖는 IgG를 구성하는 H쇄 및 L쇄의 유전자, 합계 4종의 유전자를 세포에 도입하고 공발현에 의해 분비하는 경우, 2종류의 H쇄의 공유 결합이나 H쇄와 L쇄의 비공유 결합은 랜덤으로 일어나기 때문에, 목적의 이중특이성 항체의 비율은 매우 적어져 생산 효율이 현저히 저하된다. 이를 해결하는 수단으로서, IgG H쇄의 CH3영역에 아미노산 치환을 행함으로써 H쇄에 대해서 이종인 조합의 IgG를 우선적으로 분비할 수 있는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1 및 비특허문헌 4 및 5). 본 수법은 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob;돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole;공극)로 치환함으로써, 돌기가 공극 내에 배치되도록 하여 이종 H쇄 형성의 촉진 및 동종 H쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다. 또한 각각의 IgG H쇄의 CH3영역에 다른 전하를 도입하는 방법도 보고되어 있다(특허문헌 2). 구체적으로는, 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산을 양전하를 갖는 아미노산으로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환함으로써, 이종 H쇄 형성의 촉진 및 동종 H쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다. 한편 H쇄와 L쇄의 조합을 제어하는 기술도 보고되어 있다(비특허문헌 6). 본 수법은 항체의 한쪽 Fab로서 L쇄 불변영역(CL)과 H쇄 CH1영역을 바꿔 넣은 것을 사용함으로써 목적으로 하는 H쇄와 L쇄의 조합을 효율적으로 야기하는 수법이다. 또한 이 밖에는 양쪽 Fab에서 공통된 L쇄를 사용하는 수법도 존재한다. 이는 공통의 L쇄를 사용함으로써 세포에 도입하는 L쇄 유전자를 1종류로 하여, H쇄와 L쇄의 조합을 고려할 필요 없이 이중특이성 항체를 얻을 수 있는 것이다. 현재는 이종 H쇄 형성 기술, H쇄 L쇄 조합 제어기술을 조합함으로써 높은 효율로 이중특이성 항체를 형성할 수 있다. 그러나, H쇄와 L쇄의 조합을 완전히 제어하는 것은 어려워 복잡한 분자 설계가 된다. 또한 공통의 L쇄에서 2종류의 항원에 대해 높은 친화성을 유지하는 것은 난이도가 높다는 문제도 있다.
한편 상기와 같은 유전자 재조합법이 아니라 사전에 별도로 조제한 단일클론 항체끼리를 사용하여 이중특이성 항체를 제작하는 방법으로서 Fab Arm Exchange로 불리는 수법이 보고되어 있다. 이는 생체 내에서 IgG4의 반분자가 내인성 IgG4의 반분자와 교환하여 이중특이성 항체(Bispecific 항체；BiAb)를 생성한다는 지견(비특허문헌 7)에 기초하여 개발된 기술로, in vitro에서 2종류의 천연형 인간 IgG4를 혼합함으로써 이중특이성 항체가 생산되는 것(특허문헌 3), 더 나아가서는 환원 조건하에 있어서 보다 효율적으로 반응이 일어나는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 8). 또한 IgG4에 특이적인 힌지영역의 228번째와 CH3영역의 409번째 2개소가 이 반응에 중요한 아미노산 잔기인 것이 특정되어, IgG1이라도 이 2개소를 IgG4형의 아미노산으로 치환함으로써 IgG4와 동등한 효율로 반응이 일어나는 것이 발견되어 있다(특허문헌 4). Fab Arm Exchange는 일반적인 방법으로 제작된 단일클론 항체끼리를 in vitro에서 혼합하는 것만으로 목적으로 하는 이중특이성 항체가 얻어지기 때문에 범용성이 높다. 그러나 반분자 교환 반응은 랜덤으로 일어나기 때문에, 2종류의 항체를 혼합하여 얻어지는 이중특이성 항체는 이론상 시스템 내에 존재하는 전 항체량의 50%가 된다. 이 때문에 이중특이성 항체 생성률을 개선하는 방법이 검토되어, 2종류의 항체에 비대칭인 아미노산 개변, 즉, 한쪽 H쇄에 K409R의 개변 및 다른 한쪽 H쇄에 F405L의 개변을 도입함으로써 반응률이 크게 향상되는 것이 보고되어 있는데 반응 효율은 95% 정도에 그치고 있다(특허문헌 5, 비특허문헌 9). 이중특이성 항체의 효율적이고 안정한 제조에 있어서는 정제의 간편함과 로트 간의 불균일성을 가능한 한 저감시키는 것이 필요 불가결하기 때문에, 보다 높은 반응 효율을 실현하는 우수한 수법의 개발이 요망된다.
WO1996/027011 WO2006/106905 WO2005/062916 WO2008/119353 WO2011/131746
Nat Biotechnol., 23, 1073-1078, 2005 Eur J Pharm Biopharm, 59(3), 389-396, 2005 mAbs, 4, 653-663, 2012 Protein Engineering, 9, 617-621, 1996 Nature Biotechnol., 16, 677-681, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 11187-11192, 2011 Immunology, 97, 693-698, 1999 Science, 317, 1554-1557, 2007 Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013
본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 이종 다량체의 효율적이고 또한 안정한 제조를 위해 환원 상황하에 있어서 폴리펩티드의 헤테로화를 촉진하여 목적하는 이종 다량체를 얻는, 보다 반응 효율이 높은 우수한 수법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 이종 다량체에 제공하는 폴리펩티드로서 Fc영역을 갖는 폴리펩티드를 선택하여, Fc영역의 해리 및 회합을 제어하는 방법에 대해서 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 중쇄 CH3영역에 존재하는 특정 아미노산을 치환함으로써 환원 상황하에 있어서 Fc영역의 해리의 촉진 및 회합의 제어가 가능하여, 종래 기술과 비교하여 효율적으로 목적하는 헤테로 분자가 형성되는 것을 발견하였다.
본 발명은 이러한 지견(知見)에 기초하는 것으로, 구체적으로는 아래의 [1] 내지 [25]를 제공한다.
[1] a) 제1 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제1 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
b) 상기 제1 항원 결합 활성과 다른 제2 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제2 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
c) 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 환원 조건하에서, 상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 함께 인큐베이트하는 단계, 및
d) 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체를 얻는 단계
를 포함하고,
상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서,
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
에 나타내는 아미노산 잔기의 조(set)로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 가지며,
상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역 및 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역 양쪽에 있어서, 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 같은 조의 아미노산 잔기가 각각 동종의 전하를 갖는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기가 상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는,
이종 다량체를 제조하기 위한 방법.
[2] [1]의 단계 a)에 있어서 제1 폴리펩티드와 다량체를 형성하는 제3 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하고, 또한 단계 b)에 있어서 제2 폴리펩티드와 다량체를 형성하는 제4 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하는, [1]에 기재된 제조방법.
[3] 상기 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가 아래의 (A) 또는 (B) 중 어느 하나의 군에 포함되는 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 선택되는, [1] 또는 [2]에 기재된 제조방법：
(A) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D)；
(B) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
[4] 제1 및 제2 폴리펩티드에 있어서 각각 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기의 조가 아래의 (1)~(4) 중 어느 한 조의 아미노산 잔기의 조인, [1] 내지 [3] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법：
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
(4) (i) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기, 및
(ii) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기.
[5] 제1 및 제2 폴리펩티드에 있어서 각각 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기의 조가 아래의 조의 아미노산 잔기의 조인, [1] 내지 [4] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법：
(i) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기, 및
(ii) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기.
[6] 제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 CH3영역의 안정성이 불안정해지도록 아미노산이 개변되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[7] 제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 397번 위치 및/또는 392번 위치의 아미노산이 개변되어 있는, [1] 내지 [6] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[8] 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역이 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 타입인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[9] 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역이 마우스 유래의 Fc영역인, [1] 내지 [7] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[10] 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서,
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 360번 위치 및 371번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖고,
상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역 및 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역 양쪽에 있어서, 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 같은 조의 아미노산 잔기가 각각 동종의 전하를 갖는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기가 상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는, [9]에 기재된 이종 다량체를 제조하기 위한 방법.
[11] a) 제1 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제1 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
b) 상기 제1 항원 결합 활성과 다른 제2 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제2 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
c) 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 환원 조건하에서, 상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 함께 인큐베이트하는 단계, 및
d) 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체를 얻는 단계
를 포함하고,
상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 397번 위치 및/또는 392번 위치의 아미노산이 개변되어 있는,
이종 다량체를 제조하기 위한 방법.
[12] 제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서,
EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Met(M), Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있고, 및/또는
EU 넘버링에 의한 392번 위치가 Asp(D), Glu(E), Thr(T), Val(V) 또는 Ile(I)로 개변되어 있는
[1] 내지 [11] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[13] 제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있는, [1] 내지 [12] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[14] 제1 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 356번 위치가 Lys(K)로 개변되어 있고, 또한 EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있으며, 제2 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있고, 또한 EU 넘버링에 의한 439번 위치가 Glu(E)로 개변되어 있는, [1] 내지 [13] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[15] 상기 단계 a) 및 b)가 제1 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주와 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주를 혼합함으로써 실시되고, 상기 단계 c)가 당해 배양상청 중에서 실시되는, [1] 내지 [14] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[16] 상기 이종 다량체가 다중특이성 항체 또는 헤테로 Fc 융합 단백질인, [1] 내지 [15] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[17] 상기 이종 다량체가 이중특이성 항체인, [1] 내지 [16] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[18] [1] 또는 [11]에 기재된 단계 c)가 환원제와의 접촉을 포함하는, [1] 내지 [17] 중 어느 한 항에 기재된 제조방법.
[19] 단계 c)가 글루타티온, L-시스테인, 디티오트레이톨, β-메르캅토-에탄올, TCEP 및 2-MEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용물질의 첨가를 포함하는, [18]에 기재된 제조방법.
[20] 단계 c)가 글루타티온, 2-MEA로부터 선택되는 작용물질의 첨가를 포함하는, [19]에 기재된 제조방법.
[21] [1] 내지 [20] 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 이종 다량체.
[22] 이중특이성 항체인, [21]에 기재된 이종 다량체.
[23] [21] 또는 [22]에 기재된 이종 다량체 및 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
[24] 제1 항원 결합 활성을 갖고 또한 제1 Fc영역을 포함하는 제1 폴리펩티드와, 그 제1 항원 결합 활성과는 다른 제2 항원 결합 활성을 갖고 또한 제2 Fc영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체로서,
상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 환원 조건하에서 함께 인큐베이트함으로써 상기 이종 다량체가 얻어지고,
상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서,
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동정의 전하를 가지며,
상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역 및 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역 양쪽에 있어서, 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 같은 조의 아미노산 잔기가 각각 동종의 전하를 갖는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기가 상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖고,
상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 CH3영역의 안정성이 불안정해지도록 아미노산이 개변되어 있는,
상기 이종 다량체.
[25] a) 제1 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제1 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
b) 상기 제1 항원 결합 활성과 다른 제2 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제2 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
c) 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 환원 조건하에서, 상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 함께 인큐베이트하는 단계, 및
d) 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체를 얻는 단계
를 포함하는 방법으로 제조된 이종 다량체로서, 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서,
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동정의 전하를 갖고,
상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역 및 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역 양쪽에 있어서, 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 같은 조의 아미노산 잔기가 각각 동종의 전하를 갖는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기가 상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 가지며,
상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서 상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 CH3영역의 안정성이 불안정해지도록 아미노산이 개변되어 있는,
상기 이종 다량체.
본 발명에서는 중쇄 CH3영역에 존재하는 특정 아미노산을 치환함으로써, 환원 상황하에 있어서 Fc영역의 해리의 촉진 및 회합의 제어가 가능하여, 종래 기술과 비교하여 효율적으로 목적하는 헤테로 분자가 형성되는 제조방법이 제공되었다.
본 발명의 방법을 이용함으로써, 종래 기술과 비교하여 이중특이성 항체의 정제 시 간편함의 향상과 로트 간의 불균일성을 가능한 한 저감시키는 것이 가능해졌다.
본 발명의 이종 다량체의 제조방법은 중쇄 CH3영역의 아미노산 잔기를 개변하는 것을 특징으로 한다. 이들 영역에 본 발명의 아미노산 잔기의 개변을 도입함으로써 폴리펩티드 간의 해리 및 회합이 촉진되어, 종래 기술과 비교하여 효율적으로 목적하는 이종 다량체를 얻을 수 있다.
도 1은 이온 교환 크로마토그래피에 의한 Fab Arm Exchange 반응산물의 해석결과를 나타내는 도면이다. 도면 중 「BiAb」는 정제한 Bispecific 항체(이중특이성 항체)를, 「H54 homo」는 H54/L28의 가변영역을 갖는 단일클론 항체를, 「MRA homo」는 MRAH/MRAL의 가변영역을 갖는 단일클론 항체를 나타낸다. 도면 중에 백분율로 나타낸 수치는 이중특이성 항체 생성률을 나타내고, 이중특이성 항체에 대응하는 피크의 면적을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적으로 나누고, 100을 곱하여 산출한 것이다.
도 2는 이온 교환 크로마토그래피에 의한 Fab Arm Exchange 반응산물의 해석결과를 나타내는 도면이다. MRAH-G1drP1/MRAL-k0와 H54-G1drN1/L28-k0를 호모체로서 사용하고, 3종류의 환원 조건하에서 반응시킨 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중에 백분율로 나타낸 수치는 이중특이성 항체 생성률을 나타내고, 이중특이성 항체에 대응하는 피크의 면적을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적으로 나누고, 100을 곱하여 산출한 것이다.
도 3은 5 mM GSH를 환원제로서 사용했을 때의 Fab Arm Exchange에 있어서의 이중특이성 항체 생성률과, 사용한 호모체의 CH3 안정성의 상관관계를 나타내는 도면이다. 도면 중 「2종류의 호모체 중 CH3의 Tm이 높은 쪽의 값」이란, 반응에 사용하는 2개의 호모체 중 CH3의 Tm이 높은, 즉 CH3가 보다 안정한 호모체의 CH3의 Tm을 의미한다.
도 4는 인간 IgG1의 V397 주변의 입체구조(PDB code 3DO3)를 나타내는 도면이다.
도 5는 25 mM 2MEA를 환원제로서 사용했을 때의 Fab Arm Exchange에 있어서의 이중특이성 항체 생성률과, 사용한 호모체의 CH3 안정성의 상관관계를 나타내는 도면이다. 도면 중 「2종류의 호모체 중 CH3의 Tm이 높은 쪽의 값」이란, 반응에 사용하는 2개의 호모체 중 CH3의 Tm이 높은, 즉 CH3가 보다 안정한 호모체의 CH3의 Tm을 의미한다.
도 6은 이온 교환 크로마토그래피에 의한 Fab Arm Exchange 반응산물의 해석결과를 나타내는 도면이다. MRAH-G1dP17/MRAL-k0와 H54-G1dN17/L28-k0를 호모체로서 사용하여, 다른 반응 시간으로 반응시킨 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중에 백분율로 나타낸 수치는 이중특이성 항체 생성률을 나타내고, 이중특이성 항체에 대응하는 피크의 면적을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적으로 나누고, 100을 곱하여 산출한 것이다.
도 7은 이온 교환 크로마토그래피에 의한 Fab Arm Exchange 반응산물의 해석결과를 나타내는 도면이다. MRAH-G1mrP1/MRAL-k0와 H54-G1mrN1/L28-k0를 호모체로서 사용하여, 세포 배양상청 중에서 반응시킨 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중에 백분율로 나타낸 수치는 이중특이성 항체 생성률을 나타내고, 이중특이성 항체에 대응하는 피크의 면적을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적으로 나누고, 100을 곱하여 산출한 것이다.
도 8은 마우스 IgG1의 CH3 도메인의 상호작용 계면 주변의 입체구조를 나타내는 도면이다(PDB code 1IGY).
도 9는 CE-IEF에 의한 마우스 IgG형 Fab Arm Exchange 반응산물의 해석결과를 나타내는 도면이다. 도면 중에 백분율로 나타낸 수치는 이중특이성 항체 생성률을 나타내고, 이중특이성 항체에 대응하는 피크의 면적을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적으로 나누고, 100을 곱하여 산출한 것이다.
도 10은 항인간 글리피칸 3/항인간 CD3 이중특이성 항체의 세포상해활성을 비교한 도면이다. 도 10-1은 인간 IgG형 Fab Arm Exchange를 사용하여, 도 10-2는 마우스 IgG형 Fab Arm Exchange를 사용하여 제작한 이중특이성 항체와, CrossMab 기술에 의해 제작한 이중특이성 항체를 비교한 것이다.
도 11은 인간 IgG형 Fab Arm Exchange에 의해 제작한 항인간 글리피칸 3/항인간 CD3 이중특이성 항체 및 Knobs-into-Holes 기술에 의해 제작한 이중특이성 항체의 정상 마우스에 있어서의 혈중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 12는 마우스 IgG형 Fab Arm Exchange에 의해 제작한 항인간 IL-6 수용체 항체와, 천연형 마우스 IgG1의 서열을 갖는 항인간 IL-6 수용체 항체의 혈중 농도 추이를 나타낸 도면이다.
본 발명은 환원 조건하에서, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그 제1 항원 결합 활성과 다른 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드의 각 호모체의 해리를 촉진하고, 헤테로체의 회합을 제어하기 위해, 중쇄 CH3영역의 아미노산 잔기를 개변함으로써 목적하는 이종 다량체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 목적하는 이종 다량체를 선택하는 방법에 관한 것이다.
용어의 정의
본 발명에 있어서의 「폴리펩티드 」란, 아미노산 서열 중에 중쇄 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드(Fc영역 함유 폴리펩티드) 및 단백질(Fc영역 함유 단백질)을 가리킨다. 또한 통상 생물 유래의 폴리펩티드이나 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등 중 어느 것이어도 된다. 또한 상기 폴리펩티드의 단편도 또한 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.
본 명세서에 있어서 「항체」란, 천연의 것이거나 또는 부분적 또는 완전 합성에 의해 제조된 면역글로불린을 말한다. 항체는 그것이 천연으로 존재하는 혈장이나 혈청 등의 천연 자원이나 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 배양상청으로부터 단리될 수 있고, 또는 유전자 재조합 등의 수법을 사용함으로써 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다. 항체의 예로서는 면역글로불린의 아이소타입 및 그들 아이소타입의 서브클래스를 적합하게 들 수 있다. 인간의 면역글로불린으로서 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgM의 9종류의 클래스(아이소타입)가 알려져 있다. 마우스의 면역글로불린으로서 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3의 4종류의 클래스가 알려져 있다. 본 발명의 항체에는 이들 아이소타입 중 인간의 면역글로불린으로서는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4가, 마우스의 면역글로불린으로서는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3가 포함될 수 있다. 마우스의 면역글로불린으로서는 IgG1이 바람직하다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 불변영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링으로 표시되는 356-358번 위치의 아미노산 서열이 DEL이어도 되고 EEM이어도 된다. 또한 인간 Igκ(Kappa) 불변영역과 인간 Igλ(Lambda) 불변영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다.
「Fc영역」이라는 용어는 천연서열 Fc영역 및 변이형 Fc영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C말단영역을 정의하기 위해 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc영역의 경계는 변화될 지도 모르지만, 항체 분자 중의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 도메인으로 이루어지는 영역을 말한다. 통상 인간 IgG 중쇄 Fc영역은 Cys 226 위치의 아미노산 잔기로부터 Fc영역의 카르복실 말단까지 신장되는 것으로 정의되나, 이것에 한정되지 않는다. 면역글로불린의 Fc영역은 2개의 불변영역, CH2 및 CH3를 포함한다. 인간 IgG Fc영역의「CH2」도메인은 통상 아미노산 231부터 아미노산 340까지 신전된다. 「CH3」도메인은 Fc영역에 있어서의 카르복실 말단에서 CH2영역까지 신전된다. 즉, IgG의 아미노산 341부터 대략 아미노산 447까지 신전된다.
Fc영역은 IgG 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해 효소로 부분 소화한 후에, 프로테인 A 또는 프로테인 G 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득할 수 있다. 이러한 단백질 분해 효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정함으로써 제한적으로 Fab나 F(ab')2를 생성시키도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면 펩신이나 파파인 등을 예시할 수 있다.
개변 개소 번호에 대해서는 EU 넘버링(Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH)을 채용하였다.
본 발명에 있어서의 폴리펩티드의 「회합(association)」이란, 예를 들면 2 이상의 폴리펩티드 영역이 상호작용하는 상태를 가리키는 것으로 환언할 수 있다.
본 발명에 있어서 「회합을 제어한다」는 것은 목적하는 회합 상태가 되도록 제어하는 것을 말하고, 보다 구체적으로는, 폴리펩티드 간에 있어서의 바람직하지 않은 회합(바람직하게는 동일 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드끼리의 회합)이 형성되기 어렵게 하도록 제어하는 것을 말한다.
본 발명에 있어서의 「계면(interface)」이란 통상 회합(상호작용)할 때의 회합면을 가리키고, 계면을 형성하는 아미노산 잔기란 통상 그 회합에 제공되는 폴리펩티드 영역에 포함되는 1 또는 복수의 아미노산 잔기로, 보다 바람직하게는 회합 시에 접근하여 상호작용에 관여하는 아미노산 잔기를 말한다. 그 상호작용에는, 구체적으로는 회합 시에 접근하는 아미노산 잔기끼리가 수소 결합, 정전적 상호작용, 가교를 형성하고 있는 경우 등이 포함된다.
본 발명에 있어서의 폴리펩티드의 「호모체」란 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드끼리가 회합되어 있는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서의 폴리펩티드의 「헤테로체」란 제1 폴리펩티드와, 아미노산 서열에 있어서 제1 폴리펩티드와는 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 제2 폴리펩티드가 회합되어 있는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서의 폴리펩티드의 「해리」란, 폴리펩티드의 호모체에 있어서 2 이상의 폴리펩티드가 회합된 상태에서 각 폴리펩티드 단체(單體)로 분리된 상태를 말한다.
본 발명에 있어서 「이종 다량체(헤테로 멀티머)」란, 복수 종의 폴리펩티드로 구성되고, 그 폴리펩티드가 서로 회합 가능한 단백질의 다량체를 말한다. 보다 상세하게는 「이종 다량체」는 적어도 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 가지며, 여기에 있어서 제2 폴리펩티드는 아미노산 서열에 있어서 제1 폴리펩티드와는 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 분자이다. 또한 특별히 한정되지 않지만, 상기 이종 다량체는 2종 이상의 다른 리간드, 항원, 수용체, 또는 기질 등에 대해 항원 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 이종 다량체는 제1 및 제2 폴리펩티드에 의해 형성되는 「이종 이량체」에 더하여, 추가로 다른 종의 폴리펩티드가 존재하고 있어도 된다. 즉, 본 발명의 「이종 다량체」는 이종 이량체에 제한되지 않고, 예를 들면 이종 3량체, 이종 4량체 등도 포함된다.
본 발명의 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드 및 1개 또는 2개의 제3 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 제3 폴리펩티드와 다량체(이량체)를 형성할 수 있다. 또한 형성된 이량체끼리가 다량체(4량체)를 형성할 수 있다. 2개의 제3 폴리펩티드는 완전히 동일한 아미노산 서열을 가지고 있어도 된다(동일한 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있어도 된다). 또는 동일한 아미노산 서열이면서 2 이상의 활성이 있어도 된다(예를 들면 2 이상의 다른 항원에 대해 결합 활성을 가지고 있어도 된다). 또한 제3 폴리펩티드가 1개인 경우는, 제3 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드 중 어느 한쪽과 이량체를 형성하여 폴리펩티드 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 다량체에 있어서, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 다른 항원에 대해 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 한편 제3 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 양쪽과 동일한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또는 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드와는 다른 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다.
또는 본 발명의 폴리펩티드 다량체는 제1 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 다량체로 하는 것도 가능하다. 이러한 폴리펩티드 다량체에 있어서, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 각각 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드와 다량체(이량체)를 형성할 수 있다. 예를 들면 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드 사이에서 디설피드 결합을 형성함으로써 이량체를 형성할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 다량체에 있어서는, 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드는 다른 항원에 대해 결합 활성을 갖는 것이 바람직하다. 한편 제3 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드 중 어느 하나 또는 양쪽과 동일한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또는 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드와는 다른 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또한 제4 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드 중 어느 하나와 동일한 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다. 또는 제1 폴리펩티드나 제2 폴리펩티드와는 다른 항원에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드여도 된다.
본 발명에 있어서의 「이종 다량체」가 이중특이성 항체일 때, 예를 들면 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드가 각각 항원 A에 대한 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 항원 B에 대한 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 경우, 제3 폴리펩티드를 항원 A에 대한 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 제4 폴리펩티드를 항원 B에 대한 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 「항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드」란, 항체 중쇄 또는 경쇄의 가변영역, 수용체, 수용체와 Fc영역의 융합 펩티드, 스캐폴드(Scaffold) 및 이들의 단편 등, 항원, 리간드 등의 단백질이나 펩티드에 대해 결합 가능한 도메인(영역)을 갖는 5 아미노산 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 즉 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 항체 가변영역, 수용체, 수용체와 Fc영역의 융합 펩티드, 스캐폴드 또는 이들 단편의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
스캐폴드로서는 하나 이상의 항원에 결합할 수 있는 입체 구조적으로 안정한 폴리펩티드라면 어떠한 폴리펩티드라도 사용할 수 있다. 이러한 폴리펩티드로서는, 예를 들면 항체 가변영역 단편, 피브로넥틴, Protein A 도메인, LDL 수용체 A 도메인, 리포칼린 등 외에, Nygren 등(Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997), Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004)), Binz 등(Nature Biotech 23:1257-1266(2005)), Hosse 등(Protein Science 15:14-27(2006))에 기재된 분자를 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다.
항체의 가변영역, 수용체, 수용체와 Fc영역의 융합 펩티드, 스캐폴드 및 이들 단편의 취득방법은 당업자에게 주지이다. 영역의 아미노산 서열과 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서의 「환원 조건」이란, 중쇄 힌지영역 내의 중쇄 간 디설피드 결합을 형성하는 시스테인 잔기가 산화되는 보다 환원된 상태가 될 가능성이 높은 조건 또는 환경을 가리키고, 바람직하게는 중쇄 간 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 조건 또는 환경을 가리키며, 특히 바람직하게는 힌지영역 외의 시스테인은 디설피드 결합의 유의한 이성화를 일으키지 않으나(즉, 중쇄와 경쇄 간의 디설피드 결합을 보존한 채), 중쇄 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 조건 또는 환경을 가리킨다. 예를 들면 본 발명에 있어서，환원 조건하에서 Fc영역을 포함하는 제1 폴리펩티드의 호모와 Fc영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 함께 인큐베이트하는 시간은 당업자가 적절히 설정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「환원제」란, 그 환경에 있어서 분자를 환원하는 화합물, 즉 그 환경에 있어서 분자를 보다 환원환 상태로 및 보다 환원하고 있는 상태로 바꾸는 화합물을 가리킨다. 환원제는 전자를 공여함으로써 작용하고, 그로 인해 기질의 환원 후에 그 자체는 산화된 상태가 된다. 따라서, 환원제란 전자를 공여하는 작용물질이다. 환원제의 예로는, 디티오트레이톨(DTT), 메르캅토에탄올, 시스테인, 티오글리콜산, 시스테아민(2-메르캅토에틸아민：2-MEA), 글루타티온(GSH), TCEP(트리스(2-카르복시에틸)포스핀) 및 수소화붕소나트륨이 포함된다.
본 발명에 있어서의 「중쇄 간 디설피드 결합의 이성화」란, 다른 중쇄에 포함되는 시스테인 간에서의 디설피드 결합의 교환, 즉 디설피드 결합의 재편성을 가리킨다.
「디설피드 결합 형성」이란, 1개 또는 2개의 폴리펩티드 중에 존재하는 2개의 시스테인 간에서 공유 결합을 형성하는 과정을 가리키고, 이 결합은 「-S--S-」로서 도시화된다.
「디설피드 결합의 환원」이란, 디설피드 결합의 절단에 의해 2개의 티올기(-SH기)가 생성되는 과정을 가리킨다.
본 발명에 있어서의 「FcγR」또는「FcgR」이란 Fcγ 수용체로, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc영역에 결합 가능한 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는 이 패밀리에는, 예를 들면 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)； 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함)를 포함하는 FcγRIII(CD16) 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함된다. FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되는데 이들에 한정되지 않고, 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는, 예를 들면 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), FcγRIV 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함된다.
아미노산 잔기의 전하 반발을 이용한 개변에 의한 이종 다량체의 제조방법
상기 방법의 바람직한 태양에 있어서는, 본 발명은 2종 이상의 다량체를 형성할 수 있는 이종 다량체에 대해서, 제1 및 제2 폴리펩티드의 호모체의 해리를 촉진하여 1종 이상의 다량체를 형성하는 폴리펩티드 간의 회합을 제어하기 위해, 폴리펩티드 간의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변하여 목적하는 폴리펩티드의 헤테로체를 제조하는 방법이다.
또한 본 발명의 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열 또는 항체 Fc영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 Fc영역 또는 항체 중쇄 불변영역의 아미노산 서열로서는, 인간 IgG 타입의 불변영역 또는 Fc영역의 아미노산 서열을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. IgG 타입의 불변영역 또는 Fc영역으로서는, 천연형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 아이소타입 중 어느 것이어도 된다. 또는 이들의 개변체여도 된다. Fc영역의 EU 넘버링 447번 위치의 리신 및 EU 넘버링 446번 위치의 글리신이 이들을 코드하는 핵산을 재조합 유전자 조작함으로써 제거되어도 된다.
또한 본 발명의 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 항체 경쇄 불변영역의 아미노산 서열로서는 인간 kappa, 인간 lambda 타입의 불변영역의 아미노산 서열을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 또는 이들의 개변체여도 된다.
또한 본 발명의 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는, 항체 가변영역의 아미노산 서열(예를 들면 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, FR4의 아미노산 서열)을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 폴리펩티드 간의 해리 및/또는 회합 제어방법의 바람직한 태양에 있어서는, 당해 방법으로서 중쇄의 불변영역의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 중쇄끼리의 회합을 억제시키는 방법을 들 수 있다. 중쇄 불변영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 356번 위치와 439번 위치, 357번 위치와 370번 위치, 399번 위치와 409번 위치에 상당하는 영역을 들 수 있다. 중쇄 불변영역에 대해서는 EU 넘버링에 의해 표시하였다.
후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이들 아미노산 잔기를 개변하고 본 발명의 방법을 실시함으로써, 폴리펩티드 간의 중쇄의 해리 및/또는 회합을 제어하여 목적하는 이종 다량체를 우선적으로 취득할 수 있다. 즉, 바람직한 태양에 있어서 본 발명은 2종 이상의 중쇄 Fc영역을 포함하는 항체 및 Fc영역 함유 단백질(예를 들면 IgG형 항체, minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94), 면역어드헤신(비특허문헌 2) 등)로서, 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
또한 본 발명은 상기 제1 중쇄 Fc영역과는 다른 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기로서, 상기 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 동종의 전하를 갖는 조와 동일한 위치의 아미노산 잔기가 상기 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
상기 폴리펩티드에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면 아래의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다.
(a) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D);
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 폴리펩티드에 있어서 「동종의 전하를 갖는」다는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는」다는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제1 중쇄 CH3영역과 제2 중쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「회합 계면 제어 개변」으로서, 예를 들면 아래의 개변을 들 수 있다：
(1) 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 356번 위치의 Asp(D)의 Lys(K), Arg(R) 또는 His(H)로의 개변, 및 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 439번 위치의 Lys(K)의 Glu(E) 또는 Asp(D)로의 개변；
(2) 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 357번 위치의 Glu(E)의 Lys(K), Arg(R) 또는 His(H)로의 개변, 및 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 370번 위치의 Lys(K)의 Glu(E) 또는 Asp(D)로의 개변；
(3) 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 399번 위치의 Asp(D)의 Lys(K), Arg(R) 또는 His(H)로의 개변, 및 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 409번 위치의 Lys(K)의 Glu(E) 또는 Asp(D)로의 개변.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 마우스 이종 다량체의 제조방법에 관한 폴리펩티드 간의 해리 및/또는 회합 제어방법의 바람직한 태양에 있어서는, 당해 방법으로서 중쇄의 불변영역의 계면에 전하적인 반발을 도입하여 중쇄끼리의 회합을 억제시키는 방법을 들 수 있다. 당해 방법에 있어서는, 중쇄 불변영역의 계면에서 접촉하는 아미노산 잔기로서는, 예를 들면 CH3영역에 있어서의 356번 위치와 439번 위치, 360번 위치와 371번 위치, 399번 위치와 409번 위치에 상당하는 영역을 들 수 있다. 중쇄 불변영역에 대해서는 EU 넘버링에 의해 표시하였다.
후술하는 실시예에서 나타내는 바와 같이, 이들 마우스 유래의 CH3영역에 있어서의 아미노산 잔기를 개변하고 본 발명의 방법을 실시함으로써, 폴리펩티드 간의 중쇄의 해리 및/또는 회합을 제어하여 목적하는 이종 다량체를 우선적으로 취득할 수 있다. 즉, 바람직한 태양에 있어서, 본 발명은 2종 이상의 중쇄 Fc영역을 포함하는 항체 및 Fc영역 함유 단백질(예를 들면 IgG형 항체, minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94), 면역어드헤신(비특허문헌 2) 등)로서, 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 아래의 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
(1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
(2) EU 넘버링에 의한 360번 위치 및 371번 위치의 아미노산 잔기
(3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
또한 본 발명은 상기 제1 중쇄 Fc영역과는 다른 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기로서, 상기 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 동종의 전하를 갖는 조와 동일한 위치의 아미노산 잔기가, 상기 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는 폴리펩티드를 제공한다.
상기 폴리펩티드에 있어서 「전하를 갖는 아미노산 잔기」는, 예를 들면 아래의 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기로부터 선택되는 것이 바람직하다.
(a) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D)；
(b) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
상기 폴리펩티드에 있어서 「동종의 전하를 갖는」다는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 모두가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다. 「반대의 전하를 갖는」다는 것은, 예를 들면 2개 이상의 아미노산 잔기 중 하나 이상의 아미노산 잔기가 상기 (a) 또는 (b) 중 어느 하나의 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 경우에, 나머지 아미노산 잔기가 다른 군에 포함되는 아미노산 잔기를 갖는 것을 의미한다.
바람직한 태양에 있어서, 상기 폴리펩티드는 제1 중쇄 CH3영역과 제2 중쇄 CH3영역이 디설피드 결합에 의해 가교되어 있어도 된다.
본 발명에 있어서의 「회합 계면 제어 개변」으로서, 예를 들면 아래의 개변을 들 수 있다：
(1) 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 356번 위치의 Asp(D)의 Lys(K), Arg(R) 또는 His(H)로의 개변, 및 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 439번 위치의 Lys(K)의 Glu(E) 또는 Asp(D)로의 개변；
(2) 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 360번 위치의 Glu(E)의 Lys(K), Arg(R) 또는 His(H)로의 개변, 및 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 371번 위치의 Lys(K)의 Glu(E) 또는 Asp(D)로의 개변；
(3) 제1 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 399번 위치의 Asp(D)의 Lys(K), Arg(R) 또는 His(H)로의 개변, 및 제2 중쇄 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 409번 위치의 Lys(K)의 Glu(E) 또는 Asp(D)로의 개변
본 발명에 있어서 「개변」에 제공하는 아미노산 잔기로서는, 폴리펩티드의 불변영역의 아미노산 잔기에 한정되지 않는다. 당업자라면 폴리펩티드 변이체 또는 이종 다량체에 대해서 시판의 소프트웨어를 사용한 호모로지 모델링 등에 의해 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 발견할 수 있고, 회합을 제어하도록 해당 부위의 아미노산 잔기를 개변에 제공하는 것이 가능하다.
본 발명의 방법에 있어서의 아미노산 잔기의 「개변」이란, 구체적으로는 원래의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것, 원래의 아미노산 잔기를 결실시키는 것, 새로운 아미노산 잔기를 부가하는 것 등을 가리키는데, 바람직하게는 원래의 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환하는 것을 가리킨다.
397번 위치 및/또는 392번 위치의 아미노산 개변에 의한 이종 다량체의 제조방법
본 발명의 폴리펩티드 간의 해리 및/또는 회합 제어방방법의 더욱 바람직한 태양에 있어서는, 당해 방법은 중쇄 CH3영역의 안정성이 불안정해지도록, 중쇄 Fc영역에 아미노산 잔기의 변이를 도입하는 것을 특징으로 하는 방법이다. 당해 방법은 임의로 상기 전하 반발 등을 이용한 계면 제어에 관한 아미노산 개변을 도입하는 공정을 추가로 포함해도 된다.
본 발명에 있어서의 「CH3영역의 안정성이 불안정」하다는 것은, Fc영역의 아미노산 잔기에 적어도 하나 이상의 개변을 가한 폴리펩티드의 호모체가 미개변의 폴리펩티드의 호모체에 비해 각 폴리펩티드 단체(單體)로 분리되기 쉬워져 있는 상태를 말한다.
본 발명에 있어서의 「CH3영역의 안정성이 불안정」하다는 것은, 바람직하게는 pH 7.4에 있어서의 중쇄 CH3영역의 열변성 중간온도(Tm)가 72.5℃ 이하, 72.0℃ 이하, 71.5℃ 이하, 71.0℃ 이하, 70.5℃ 이하가 되도록, CH3영역의 아미노산 잔기에 개변을 도입한 상태를 말하고, 더욱 바람직하게는 70.4℃ 이하, 70.3℃ 이하, 70.2℃ 이하, 70.1℃ 이하, 70.0℃ 이하, 69.9℃ 이하, 69.8℃ 이하, 69.7℃ 이하, 69.6℃ 이하, 69.5℃ 이하, 69.0℃ 이하, 68.5℃ 이하, 68.0℃ 이하, 67.5℃ 이하가 되도록 CH3영역의 아미노산 잔기에 개변을 도입한 상태를 말한다.
예를 들면 중쇄 CH3영역의 Tm은 본 명세서의 참고예 3에 기재된 방법으로 측정할 수 있고, 측정에 사용하는 완충액 등은 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드 간의 해리 및/또는 회합 제어방법의 더욱 바람직한 태양에 있어서는, 당해 방법은 중쇄 CH3영역의 EU 넘버링 397번 위치 및/또는 392번 위치에 아미노산 잔기의 변이를 도입하는 것을 특징으로 하는 방법이다. 당해 방법은 임의이고, 상기 전하 반발 등을 이용한 계면 제어에 관한 아미노산 개변을 도입하는 공정을 추가로 포함해도 된다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서 마우스 유래의 폴리펩티드 간의 해리 및/또는 회합 제어방법에 있어서도 중쇄 CH3영역의 EU 넘버링 397번 위치 및/또는 392번 위치에 아미노산 잔기의 변이를 도입할 수 있다. 당해 방법은 임의이고, 상기 전하 반발 등을 이용한 계면 제어에 관한 아미노산 개변을 도입하는 공정을 추가로 포함해도 된다.
397번 위치에 변이를 도입하는 아미노산 잔기로서는, 측쇄가 부피가 큰 아미노산 또는 측쇄 분지형 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하다.
392번 위치에 변이를 도입하는 아미노산 잔기로서는, 음전하를 갖는 아미노산, 측쇄가 부피가 큰 아미노산 또는 측쇄 분지형 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서의 「측쇄가 부피가 큰 아미노산」으로서 Met(M), Phe(F)，Tyr(Y)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Trp(W), Arg(R), His(H), Glu(E), Lys(K), Gln(Q), Asp(D), Asn(N), Cys(C), Thr(T) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 Met(M), Phe(F), Thr(T) 및 Tyr(Y)을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「측쇄 분지형 아미노산」으로서 Val(V)，Ile(I)，Leu(L)를 들 수 있고, 바람직하게는 Val(V) 및 Ile(I) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「음전하를 갖는 아미노산」으로서 Asp(D) 및 Glu(E)를 들 수 있다.
본 발명에 있어서의 「이종 다량체」로서 바람직하게는 다중특이성 항체 및 헤테로 융합 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명의 비한정의 일태양으로서는，FcγR로의 결합이 증강되는 이종 다량체의 아미노산 개변을 제공하는 것이다. 바람직한 아미노산 개변 부위로서는, EU 넘버링 397번 위치의 아미노산의 개변을 들 수 있는데 이것에 한정되지는 않는다. 397번 위치에 변이를 도입하는 아미노산 잔기로서는, 측쇄가 부피가 큰 아미노산 또는 측쇄 분지형 아미노산으로 개변하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 더욱 바람직하게는 다중특이성 항체로서 IgG type, scFv-IgG, Tandem scFv-Fc, DVD-Ig, Diabody-Fc, Single chain Diabody-Fc, IgG-scFv, sVD-IgG, Tandemab, scFv light chain C-terminal fusion, Tri-specific C-terminal fusion, Tri-specific N-terminal fusion, IgG-Fab 등을 들 수 있다(Bispecific Antibodies, Roland E. Kontermann, 2011, WO2010034441, WO2010145792).
본 발명에 있어서 「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단일클론 항체, 다중클론 항체, 항체 변이체(키메라 항체, 인간화 항체, 저분자화 항체(항체 단편도 포함한다), 다중특이성 항체 등)가 포함된다. 또한 본 발명에 있어서 「항체」는, 폴리펩티드 또는 이종 다량체 중 어느 것이어도 된다. 바람직한 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 항체 단편 등의 저분자화 항체이다. 본 발명에 있어서는 이들 항체의 취득 (제작) 시에 적합하게 본 발명의 해리 및/또는 회합 제어방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법에 제공되는 바람직한 폴리펩티드 또는 이종 다량체로서는, 예를 들면 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 갖는 폴리펩티드 또는 이종 다량체를 들 수 있다. 또한 보다 바람직하게는 본 발명의 바람직한 태양으로서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이종 다량체가 2종 이상의 중쇄 가변영역과 2종 이상의 경쇄 가변영역을 포함할 때의 당해 폴리펩티드 또는 이종 다량체의 해리 및/또는 회합 제어방법을 들 수 있다.
본 발명의 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 항체 중쇄의 아미노산 서열 또는 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로는, 제1 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 제3 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 및 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드는 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한 목적의 폴리펩티드 다량체가 제1 폴리펩티드와 제3 폴리펩티드로 이량체를 형성하고, 제2 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드로 이량체를 형성하며, 추가로 이들 이량체끼리가 다량체를 형성하는 4량체인 경우에는, 본 발명의 폴리펩티드 다량체로서, 예를 들면 제1과 제2 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 중쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이고, 제3과 제4 항원 결합 활성을 갖는 폴리펩티드가 항체 경쇄의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드인 폴리펩티드 다량체를 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 더욱 바람직하게는 다중특이성 항체로서 이중특이성 항체를 들 수 있다.
즉, 본 발명의 바람직한 태양에 있어서는, 본 발명은 예를 들면 2종의 중쇄(본 발명에 있어서의 폴리펩티드 다량체의 제1 폴리펩티드와 제2 폴리펩티드)와, 2종의 경쇄(본 발명에 있어서의 폴리펩티드 다량체의 제3 폴리펩티드와 제4 폴리펩티드)로 구성되는 이중특이성 항체에 대해서 해리 및/또는 회합을 제어하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양의 「이중특이성 항체」에 대해서 추가로 상세하게 설명하면, 상기 「제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드」란, 항체를 형성하는 2개의 중쇄(H쇄) 중 한쪽 H쇄(제1 H쇄) 및 당해 H쇄와는 상이한 다른 한쪽 H쇄(제2 H쇄)를 말한다. 즉, 2개의 H쇄 중 임의로 어느 한쪽을 제1 H쇄로 하고, 다른 쪽을 제2 H쇄로 할 수 있다. 마찬가지로 「제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드」란, 이중특이성 항체를 형성하는 2개의 경쇄(L쇄) 중 한쪽 L쇄(제1 L쇄) 및 당해 L쇄와는 상이한 다른 한쪽 L쇄(제2 L쇄)를 가리키며, 2개의 L쇄 중 어느 한쪽을 임의로 제1 L쇄로 하고, 다른 쪽을 제2 L쇄로 할 수 있다. 통상 제1 L쇄와 제1 H쇄는 어떤 항원(또는 에피토프)을 인식하는 동일 항체로부터 유래하고, 제2 L쇄와 제2 H쇄도 어떤 항원(또는 에피토프)을 인식하는 동일 항체로부터 유래한다. 여기서, 제1 H쇄·L쇄로 형성되는 L쇄-H쇄쌍을 제1 쌍(또는 제1 HL 분자), 제2 H쇄·L쇄로 형성되는 L쇄-H쇄쌍을 제2 쌍(또는 제2 HL 분자)이라 부른다. 제1 쌍과 제2 쌍이 인식하는 항원은 동일해도 되는데, 바람직하게는 다른 에피토프를 인식한다. 이 경우, 제1 쌍 및 제2 쌍의 H쇄와 L쇄는 서로 다른 아미노산 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 제1 쌍과 제2 쌍이 다른 에피토프를 인식하는 경우, 그 제1 쌍과 제2 쌍은 전혀 다른 항원을 인식해도 되고, 동일 항원 상의 다른 부위(다른 에피토프)를 인식해도 된다(예를 들면 항원이 헤테로 수용체인 경우에는 다중특이성 항체는 헤테로 수용체를 구성하는 다른 도메인을 인식하거나, 또는 항원이 모노머인 경우에는 다중특이성 항체는 모노머 항원의 복수 개소를 인식한다). 통상, 이러한 분자는 2개의 항원과 결합하는 것인데, 그 이상의 (예를 들면 3종류의) 항원에 대해 특이성을 가지고 있어도 된다. 또한 한쪽이 단백질, 펩티드, 유전자, 당 등의 항원을 인식하고, 다른 쪽이 방사성 물질, 화학요법제, 세포 유래 톡신 등의 세포상해성 물질 등을 인식해도 된다. 그러나 특정 H쇄와 L쇄의 조합으로 형성되는 쌍을 갖는 항체를 제작하고자 생각한 경우에는, 그 특정 H쇄와 L쇄를 제1 쌍 및 제2 쌍으로서 임의로 결정할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「융합 단백질」은 2개 이상의 동일 또는 실질적으로 유사한 단백질 분자가 Ig 힌지영역 아미노산 서열 링커를 매개로 접합된 단백질을 설명한다. 1종을 초과하는 단백질을 함유한 융합 단백질을 설명하는 경우, 「헤테로」의 접두어를 사용한다. 예를 들면 「헤테로 융합 단백질」은 1 이상의 잔부 단백질과 다른 1 이상의 단백질을 함께 접합한 2개 이상의 단백질을 함유한다.
본 발명에 있어서의 「항체」에는 전술한 항체에 대해 추가로 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 또는 키메라화나 인간화 등에 의해 그 아미노산 서열이 개변된 것이 포함된다. 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 및 인간화, 키메라화 등의 아미노산 서열의 개변은 당업자에게 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다. 마찬가지로 본 발명에 있어서의 항체를 재조합 항체로서 제작할 때 이용하는 항체의 가변영역 및 불변영역도 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 또는 키메라화나 인간화 등에 의해 그 아미노산 서열을 개변해도 된다.
본 발명에 있어서의 항체는 마우스 항체, 인간 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체 등, 어떠한 동물 유래의 항체여도 된다. 또한 예를 들면 키메라 항체, 그 중에서도 인간화 항체 등의 아미노산 서열을 치환한 개변 항체여도 된다. 또한 각종 분자를 결합시킨 항체 수식물, 항체 단편, 저분자화 항체 등 어떠한 항체여도 된다.
「키메라 항체」란 다른 동물 유래의 서열을 조합하여 제작되는 항체이다. 예를 들면 마우스 항체의 중쇄, 경쇄의 가변(V)영역과 인간 항체의 중쇄, 경쇄의 불변(C)영역으로 이루어지는 항체를 예시할 수 있다. 키메라 항체의 제작은 공지로, 예를 들면 항체 V영역을 코드하는 DNA를 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 키메라 항체를 얻을 수 있다.
「인간화 항체」란 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지는, 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조). 이에 공지의 방법으로, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 결정하고, 그 CDR과 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region；FR)이 연결된 항체를 코드하는 DNA를 취득하여, 인간화 항체를 통상의 발현 벡터를 사용한 시스템에 의해 생산할 수 있다. 이러한 DNA는 CDR 및 FR 양쪽의 말단영역에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 여러 개의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR법에 의해 합성할 수 있다(WO98/13388호 공보에 기재된 방법을 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은 CDR이 양호한 항원 결합 부위를 형성하도록 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록, 항체의 가변영역에 있어서의 FR의 아미노산을 개변해도 된다(Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6). 개변할 수 있는 FR 중의 아미노산 잔기에는 항원에 직접, 비공유 결합에 의해 결합하는 부분(Amit et al., Science (1986) 233: 747-53), CDR 구조에 영향 또는 작용하는 부위(Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) 및 VH-VL 상호작용에 관련된 부분(EP239400호 특허공보)이 포함된다.
본 발명에 있어서의 항체가 키메라 항체 또는 인간화 항체인 경우에는, 이들 항체의 C영역에는 바람직하게는 인간 항체 유래의 것이 사용된다. 예를 들면 H쇄의 경우는, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를, L쇄의 경우는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. 또한 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위해 인간 항체 C영역을 필요에 따라 수식해도 된다. 본 발명에 있어서의 키메라 항체는 바람직하게는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 불변영역으로 이루어진다. 한편, 인간화 항체는 바람직하게는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 CDR과, 인간 항체 유래의 FR 및 C영역으로 이루어진다. 인간 항체 유래의 불변영역은 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD 및 IgE 등의 아이소타입마다 고유의 아미노산 서열을 갖는다. 본 발명에 있어서의 인간화 항체에 사용되는 불변영역은 어느 아이소타입에 속하는 항체의 불변영역이어도 된다. 바람직하게는 인간 IgG의 불변영역이 사용되는데 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 인간화 항체에 이용되는 인간 항체 유래의 FR도 특별히 한정되지 않고, 어느 아이소타입에 속하는 항체의 것이어도 된다.
본 발명에 있어서의 키메라 항체 및 인간화 항체의 가변영역 및 불변영역은 원래의 항체의 결합 특이성을 나타내는 한 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가 등에 의해 개변되어 있어도 된다.
인간 유래의 서열을 이용한 키메라 항체 및 인간화 항체는 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 치료 목적 등으로 인간에 투여하는 경우에 유용할 것으로 생각된다.
등전점 개변 기술 등과의 조합
본 발명의 추가적인 바람직한 태양으로서는 폴리펩티드의 등전점(pI값)을 개변하는 아미노산 변이를 본 발명의 폴리펩티드에 도입함으로써, 목적의 제1~제4 폴리펩티드를 갖는 폴리펩티드 다량체를 보다 고순도로 또한 효율적으로 정제 또는 제조하는 것이 가능하다(WO2007114325, US20130171095). 폴리펩티드의 회합을 촉진하기 위해 도입되는 아미노산 변이로서는 Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21., Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202., J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46., WO2009080254, US20130195849 등에 기재된 중쇄 불변영역의 CH3 도메인의 개변에 의해 2종류의 중쇄 불변영역을 포함하는 폴리펩티드를 헤테로 회합화하는 방법, 및 WO2009080251, WO2009080252, WO2009080253 등에 기재된 중쇄와 경쇄의 특정 조합의 회합화를 촉진하는 방법 등을 사용하는 것도 가능하다.
표적 조직 특이적 항원 결합 분자에 관한 기술과의 조합
본 발명의 비한정의 실시태양으로서는, 표적 조직 특이적으로 존재하는 분자의 농도 의존적으로 항원으로부터 해리·결합하는 항체 기술(WO2013/180200)과의 조합을 들 수 있다.
다른 불변영역 및/또는 가변영역 개변 기술과의 조합
본 발명의 비한정의 실시태양으로서는, FcγR로의 결합 증강을 목적으로 한 불변영역 개변 기술(WO2013047752)과의 조합을 들 수 있다.
본 발명과 다른 불변영역 개변 기술의 기타 조합의 태양으로서 보체로의 결합을 제어하는 기술과의 조합을 들 수 있다. 보체로서는 보체 캐스케이드를 형성하는 폴리펩티드라면 어느 보체 성분도 사용될 수 있는데, 바람직한 보체로서는 옵소닌의 결합에 관여하는 C1q, C1r 또는 C1s의 보체 성분을 적합하게 들 수 있다. Fc영역의 보체에 대한 결합 활성이 보체에 대한 천연형 Fc영역의 결합 활성보다도 높은 Fc영역은 천연형 Fc영역의 아미노산을 개변함으로써 제작될 수 있다. 여기서 말하는 천연형 Fc영역이란, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로 표시되는 Fc영역을 가리킨다. Fc영역의 보체에 대한 결합 활성이 천연형 Fc영역의 보체에 대한 결합 활성보다 높은지 여부는 FACS, ELISA 등의 공지의 면역학적 방법을 사용하여 적절히 실시될 수 있다. Fc영역의 「아미노산의 개변」 또는 「아미노산 개변」이란, 출발 Fc영역의 아미노산 서열과는 다른 아미노산 서열로 개변하는 것을 포함한다. 출발 Fc영역의 수식 개변체가 pH 중성역에 있어서 보체에 결합할 수 있는 한, 어느 Fc영역도 출발 도메인으로서 사용될 수 있다. 또한 이미 개변이 가해진 Fc영역을 출발 Fc영역으로 하여 추가적인 개변이 가해진 Fc영역도 본 발명의 Fc영역으로서 적합하게 사용될 수 있다. 출발 Fc영역이란, 폴리펩티드 그 자체, 출발 Fc영역을 포함하는 조성물, 또는 출발 Fc영역을 코드하는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 출발 Fc영역에는 항체의 항목에서 개설된 재조합에 의해 생산된 공지의 IgG 항체의 Fc영역이 포함될 수 있다. 출발 Fc영역의 기원은 한정되지 않지만 비인간 동물의 임의의 생물 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 임의의 생물로서는 마우스, 랫트, 모르모트, 햄스터, 게르빌루스쥐, 고양이, 토끼, 개, 염소, 양, 소, 말, 낙타 및 비인간 영장류로부터 선택되는 생물을 적합하게 들 수 있다. 다른 태양에 있어서, 출발 Fc영역은 또한 게잡이원숭이, 마모셋, 빨간털원숭이, 침팬지 또는 인간으로부터 취득될 수 있다. 바람직하게는 출발 Fc영역은 인간 IgG1으로부터 취득될 수 있는데, IgG의 특정 클래스에 한정되는 것도 아니다. 이는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 Fc영역을 출발 Fc영역으로서 적절히 사용할 수 있는 것을 의미한다. 마찬가지로 본 명세서에 있어서 상기 임의의 생물로부터의 IgG의 임의의 클래스 또는 서브클래스의 Fc영역을 바람직하게는 출발 Fc영역으로서 사용할 수 있는 것을 의미한다. 천연에 존재하는 IgG의 배리언트 또는 조작된 형의 예는, 공지의 문헌(Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91, Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470, Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202, WO2009086320, WO2008092117, WO2007041635 및 WO2006105338)에 기재되어 있는데 이들에 한정되지 않는다.
아미노산의 개변은 보체에 대한 결합 활성을 갖거나 또는 보체 결합에 대한 결합 활성을 높일 수 있는 한 어떠한 위치의 아미노산도 개변될 수 있다. 항원 결합 분자가 인간 Fc영역으로서 인간 IgG1의 Fc영역을 포함하고 있는 경우, 보체에 대한 결합이 인간 IgG1의 출발 Fc영역의 결합 활성보다 증강되는 효과를 초래하는 개변이 포함되어 있는 것이 바람직하다. 보체에 대한 결합 활성을 개변하기 위한 아미노산으로서는, 예를 들면 Duncan 등(Nature (1988) 332, 738-740), Tao 등(J. Exp. Med.(1993) 178, 661-667), Brekke 등(Eur. J. Immunol. (1994) 24, 2542-2547), Xu 등(Immunol. (1993) 150, 152A), WO1994029351, WO2000042072 및 WO2011091078 등에 있어서 보고되어 있는 C1q에 대한 결합 활성이 개변된 Fc영역의 아미노산이 예시된다.
그러한 C1q에 대한 결합 활성이 증강되는 개변이 가능한 아미노산으로서, 예를 들면 EU 넘버링으로 표시되는 231번 위치에서 238번 위치, 318번 위치에서 337번 위치로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 들 수 있다. 당해 아미노산의 비한정의 일례로서 235번 위치, 237번 위치, 267번 위치, 268번 위치, 276번 위치, 318번 위치, 320번 위치, 322번 위치, 324번 위치, 327번 위치, 331번 위치 및 333번 위치의 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 아미노산을 들 수 있다. 이들 아미노산의 개변에 의해 IgG형 면역글로불린의 Fc영역의 보체에 대한 결합이 증강된다.
특히 바람직한 개변으로서는, 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는；
267번 위치의 아미노산이 Glu,
268번 위치의 아미노산이 Phe 또는 Tyr 중 어느 하나,
276번 위치의 아미노산이 Arg,
324번 위치의 아미노산이 Thr,
327번 위치의 아미노산이 Gly,
331번 위치의 아미노산이 Pro 또는
333번 위치의 아미노산이 Ala, Asp, Gly, Ser 또는 Val 중 어느 하나
를 들 수 있다. 또한 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않고, 1개소만의 아미노산이 개변될 수 있고, 이들이 임의로 조합된 2개소 이상의 아미노산이 개변될 수 있다.
본 발명과 다른 불변영역 개변 기술의 기타 조합의 태양으로서, 산성 pH에서의 FcRn 결합 증강 개변 Fc기술(WO2002060919, WO2004035752, WO2000042072), 중성 pH에서의 FcRn 결합 증강 개변 Fc기술(WO2011122011, WO2012133782), 억제형 Fcγ 수용체 선택적 결합 증강 기술(WO2012115241, WO2013125667), 활성형 Fcγ 수용체 선택적 결합 증강 기술(ADCC 활성 증강 기술)(WO2013002362), 류머티즘 인자(Rheumatoid factor)로의 결합 활성을 저하시키는 기술(WO2013046704) 등의 항체 개변 기술과의 조합을 들 수 있다.
본 발명과 가변영역 개변 기술의 비한정 조합의 태양으로서는, pH 의존성 항체(WO2009125825), 칼슘 의존성 항체(WO2012073992) 등의 개변 기술과의 조합을 들 수 있다.
항체 라이브러리, 면역 및 하이브리도마 제작
본 발명의 방법에 있어서의 변이 도입 전의 항체(본 명세서에 있어서는, 단순히 「본 발명의 항체」로 기재하는 경우 있음)의 H쇄 또는 L쇄를 코드하는 유전자로서 기지의 서열을 사용하는 것도 가능하고, 또한 당업자에게 공지의 방법으로 취득하는 것도 가능하다. 예를 들면 항체 라이브러리로부터 취득하는 것도 가능하고, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 클로닝하여 취득하는 것도 가능하다.
항체 라이브러리에 대해서는 이미 많은 항체 라이브러리가 공지되어 있고, 또한 항체 라이브러리의 제작방법도 공지이기 때문에 당업자는 적절히 항체 라이브러리를 입수하는 것이 가능하다. 예를 들면 항체 파지 라이브러리에 대해서는 Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8, Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97, Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6, Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60, Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14 및 일본국 특허공표 평20-504970호 공보 등의 문헌을 참조할 수 있다. 그 밖에, 진핵세포를 라이브러리로 하는 방법(WO95/15393호 팸플릿)이나 리보솜 제시법 등의 공지의 방법을 사용하는 것이 가능하다. 또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술이 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택할 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 토대로 적당한 발현 벡터를 제작하여 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지로서 WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388을 참고로 할 수 있다.
하이브리도마로부터 항체를 코드하는 유전자를 취득하는 방법은 기본적으로는 공지 기술을 사용하고, 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포를 감작 항원으로서 사용하여, 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포 융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법으로 단일클론 항체 생산 세포(하이브리도마)를 스크리닝하고, 얻어진 하이브리도마의 mRNA로부터 역전사효소를 사용하여 항체의 가변영역(V영역)의 cDNA를 합성하여, 이를 목적하는 항체 불변영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결함으로써 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는, 특별히 아래의 예시에 한정되는 것은 아니지만, 상기 H쇄 및 L쇄를 코드하는 항체 유전자를 얻기 위한 감작항원은 면역원성을 갖는 완전 항원과 면역원성을 나타내지 않는 합텐 등을 포함하는 불완전 항원 양쪽을 포함한다. 예를 들면 목적 단백질의 전장 단백질 또는 부분 펩티드 등을 사용할 수 있다. 그 밖에, 다당류, 핵산, 지질 등으로 구성되는 물질이 항원이 될 수 있는 것이 알려져 있고, 본 발명의 항체의 항원은 특별히 한정되는 것은 아니다. 항원의 조제는 당업자에게 공지의 방법으로 행할 수 있고, 예를 들면 배큘로바이러스를 사용한 방법(예를 들면 WO98/46777 등) 등에 준하여 행할 수 있다. 하이브리도마의 제작은, 예를 들면 밀스테인 등의 방법(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다. 항원의 면역원성이 낮은 경우에는, 알부민 등의 면역원성을 갖는 거대분자와 결합시켜 면역을 행하면 된다. 또한 필요에 따라 항원을 다른 분자와 결합시킴으로써 가용성 항원으로 하는 것도 가능하다. 수용체와 같은 막관통 분자를 항원으로서 사용하는 경우, 수용체의 세포외영역 부분을 단편으로서 사용하거나 막관통 분자를 세포 표면 상에 발현하는 세포를 면역원으로서 사용하는 것도 가능하다.
항체 생산 세포는 전술한 적당한 감작항원을 사용하여 동물을 면역화함으로써 얻을 수 있다. 또는 항체를 생산할 수 있는 림프구를 인 비트로(in vitro)에서 면역화하여 항체 생산 세포로 하는 것도 가능하다. 면역화하는 동물로서는 각종 포유동물을 사용할 수 있는데, 설치목, 토끼목, 영장목의 동물이 일반적으로 사용된다. 마우스, 랫트, 햄스터 등의 설치목, 토끼 등의 토끼목, 게잡이원숭이, 빨간털원숭이, 망토비비, 침팬지 등의 원숭이 등의 영장목의 동물을 예시할 수 있다. 그 밖에, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물도 알려져 있어, 이러한 동물을 사용함으로써 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56 참조). 이러한 형질전환 동물의 사용 대신에, 예를 들면 인간 림프구를 in vitro에서 목적하는 항원 또는 목적하는 항원을 발현하는 세포로 감작하고, 감작 림프구를 인간 골수종 세포(myeloma cells), 예를 들면 U266과 융합시킴으로써 항원으로의 결합 활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878호 공보 참조). 또한 인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물을 목적하는 항원으로 면역함으로써 목적하는 인간 항체를 취득할 수 있다(WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO96/34096, WO96/33735 참조).
동물의 면역화는, 예를 들면 감작항원을 인산염 완충액(Phosphate-Buffered Saline; PBS) 또는 생리식염수 등으로 적절히 희석, 현탁하고, 필요에 따라 애쥬번트를 혼합하여 유화한 후, 동물의 복강 내 또는 피하에 주사함으로써 행해진다. 그 후, 바람직하게는 프로인트 불완전 애쥬번트에 혼합한 감작항원을 4~21일마다 수 회 투여한다. 항체 생산의 확인은 동물 혈청 중의 목적으로 하는 항체 역가를 관용의 방법으로 측정함으로써 행해질 수 있다.
하이브리도마는 목적하는 항원으로 면역화한 동물 또는 림프구로부터 얻어진 항체 생산 세포를 관용의 융합제(예를 들면 폴리에틸렌글리콜)를 사용하여 골수종 세포와 융합하여 제작할 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). 필요에 따라 하이브리도마 세포를 배양·증식하고, 면역침강, 방사면역분석(RIA), 효소결합 면역흡착 분석(ELISA) 등의 공지의 분석법에 의해 상기 하이브리도마로부터 생산되는 항체의 결합 특이성을 측정한다. 그 후, 필요에 따라 목적으로 하는 특이성, 친화성 또는 활성이 측정된 항체를 생산하는 하이브리도마를 한계희석법 등의 수법으로 서브클로닝하는 것도 가능하다.
계속해서, 선택된 항체를 코드하는 유전자를 하이브리도마 또는 항체 생산 세포(감작 림프구 등)로부터 항체에 특이적으로 결합 가능한 프로브(예를 들면 항체 불변영역을 코드하는 서열에 상보적인 올리고 뉴클레오티드 등)를 사용하여 클로닝할 수 있다. 또한 mRNA로부터 RT-PCR에 의해 클로닝하는 것도 가능하다. 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개의 다른 클래스로 분류된다. 또한 이들 클래스는 몇 개의 서브클래스(아이소타입)(예를 들면 IgG-1, IgG-2, IgG-3 및 IgG-4;IgA-1 및 IgA-2 등)로 나뉘어진다. 본 발명에 있어서 항체의 제조에 사용하는 H쇄 및 L쇄는 이들 어느 클래스 및 서브클래스에 속하는 항체에 유래하는 것이어도 되고 특별히 한정되지 않으나, IgG는 특히 바람직한 것이다.
여기서 H쇄 및 L쇄를 코드하는 유전자를 유전자 공학적 수법으로 개변하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 햄스터 항체, 양 항체, 낙타 항체 등의 항체에 대해서 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라 항체, 인간화 항체 등을 적절히 제작할 수 있다. 키메라 항체는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 H쇄, L쇄의 가변영역과 인간 항체의 H쇄, L쇄의 불변영역으로 이루어지는 항체로, 마우스 항체의 가변영역을 코드하는 DNA를 인간 항체의 불변영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현 벡터에 삽입하고 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻을 수 있다. 인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체로도 칭해지고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementary determining region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩되는 부분을 갖도록 제작한 여러 개의 올리고 뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 불변영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현 벡터에 삽입하고 이를 수주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(EP239400; WO96/02576 참조). CDR을 매개로 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 항체 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 된다(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856).
전술한 인간화 이외에, 예를 들면 항원과의 결합성 등의 항체의 생물학적 특성을 개선하기 위해 개변을 행하는 것도 생각된다. 이러한 개변은 부위 특이적 돌연변이(예를 들면 Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 참조), PCR 변이, 카세트 변이 등의 방법으로 행할 수 있다. 일반적으로 생물학적 특성이 개선된 항체 변이체는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상(예를 들면 95% 이상, 97%, 98%, 99% 등)의 아미노산 서열 상동성 및/또는 유사성을 기초가 된 항체 가변영역의 아미노산 서열에 대해 갖는다. 본 명세서에 있어서 서열의 상동성 및/또는 유사성은 서열 상동성이 최대값을 취하도록 필요에 따라 서열을 정렬화 및 갭 도입한 후, 기초가 된 항체 잔기와 상동(동일한 잔기) 또는 유사(일반적인 아미노산 측쇄의 특성에 기초하여 동일한 그룹으로 분류되는 아미노산 잔기)한 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 통상 천연의 아미노산 잔기는 그 측쇄의 성질에 기초하여 (1)소수성：알라닌, 이소류신, 노르류신, 발린, 메티오닌 및 류신；(2)중성 친수성：아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 트레오닌 및 세린；(3)산성：아스파라긴산 및 글루타민산；(4)염기성：아르기닌, 히스티딘 및 리신；(5)사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기：글리신 및 프롤린；및 (6)방향족성：티로신, 트립토판 및 페닐알라닌의 그룹으로 분류된다.
통상, H쇄 및 L쇄의 가변영역 중에 존재하는 전부 6개의 상보성 결정영역(초가변부;CDR)이 상호작용하여 항체의 항원 결합 부위를 형성하고 있다. 이 중 하나의 가변영역이라도 전체 결합 부위를 포함하는 것보다는 낮은 친화성이 되지만, 항원을 인식하고 결합하는 능력이 있는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명의 H쇄 및 L쇄를 코드하는 항체 유전자는 그 유전자에 의해 코드되는 폴리펩티드가 목적하는 항원과의 결합성을 유지하고 있으면 되고, H쇄 및 L쇄의 각각의 항원 결합 부위를 포함하는 단편 부분을 코드하고 있으면 된다.
폴리펩티드의 활성 및 항원의 예시
본 발명의 해리 및/또는 회합 제어방법을 이용함으로써, 예를 들면 활성을 갖는 항체 또는 폴리펩티드를 효율적으로 제작할 수 있다. 상기 활성으로서는, 예를 들면 결합 활성, 중화 활성, 세포 상해 활성, 아고니스트 활성, 안타고니스트 활성, 효소 활성 등을 들 수 있다. 아고니스트 활성이란, 수용체 등의 항원에 항체가 결합함으로써 세포 내에 시그널이 전달되거나 하여 어떠한 생리학적 활성의 변화를 유도하는 활성이다. 생리학적 활성으로서는, 예를 들면 증식 활성, 생존 활성, 분화 활성, 전사 활성, 막 수송 활성, 결합 활성, 단백질 분해 활성, 인산화/탈인산화 활성, 산화 환원 활성, 전이 활성, 핵산 분해 활성, 탈수 활성, 세포사 유도 활성, 아포토시스 유도 활성을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
또한 본 발명의 방법에 의해 목적하는 항원을 인식하거나 또는 목적하는 수용체와 결합하는 항체 또는 폴리펩티드를 효율적으로 제작할 수 있다.
본 명세서에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로서는, 예를 들면 리간드(사이토카인, 케모카인 등), 수용체, 암 항원, MHC 항원, 분화 항원, 면역글로불린 및 면역글로불린을 일부에 포함하는 면역 복합체를 적합하게 들 수 있다.
사이토카인의 예로서는, 인터류킨 1~18, 콜로니 자극인자(G-CSF, M-CSF, GM-CSF 등), 인터페론(IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등), 성장인자(EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF 등), 종양 괴사 인자(TNF-α, TNF-β), 림포톡신, 에리트로포이에틴, 렙틴, SCF, TPO, MCAF, BMP를 들 수 있다.
케모카인의 예로서는, CCL1~CCL28 등의 CC 케모카인, CXCL1~CXCL17 등의 CXC 케모카인, XCL1~XCL2 등의 C 케모카인, CX3CL1 등의 CX3C 케모카인을 들 수 있다.
수용체의 예로서는, 예를 들면 조혈 인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신키나아제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌키나아제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G 단백질 공액형 수용체 패밀리, GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신포스파타아제형 수용체 패밀리, 접착인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체 및 그 특징에 관해서는 다수의 문헌, 예를 들면 Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14), Ullrich 등(Cell (1990) 61 (2), 203-212), Massague(e에는 아큐트 악센트 기호가 붙는다)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070), Miyajima 등(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga 등(FASEB J. (1992) 6, 3387-3396), Fantl 등(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith 등(Cell (1994) 76 (6) 959-962), Flower DR.(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234) 등에 기재되어 있다.
상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는, 예를 들면 인간 또는 마우스 에리트로포이에틴(EPO) 수용체(Blood (1990) 76 (1), 31-35, Cell (1989) 57 (2), 277-285), 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706, mG-CSFR, Cell (1990) 61 (2), 341-350), 인간 또는 마우스 트롬보포이에틴(TPO) 수용체(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53), 인간 또는 마우스 인슐린 수용체(Nature (1985) 313 (6005), 756-761), 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463), 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식인자(PDGF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439), 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-α, β수용체(Cell (1990) 60 (2), 225-234. 및 Cell (1994) 77 (3), 391-400), 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터류킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 증식인자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스 모양체 신경영양인자(CNTF) 수용체 등이 적합하게 예시된다.
암 항원은 세포의 악성화에 수반하여 발현되는 항원으로, 종양 특이성 항원으로도 불린다. 또한 세포가 암화되었을 때 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 암 항원으로, 암 당쇄 항원으로도 불린다. 암 항원의 예로서는, 예를 들면 상기 수용체로서 GPI 앵커형 수용체 패밀리에 속하는 간암을 비롯한 몇 가지 암에 있어서 발현되고 있는 GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65), 폐암을 비롯한 복수의 암에서 발현되는 EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31), CA19-9, CA15-3, 시리얼 SSEA-1(SLX) 등을 적합하게 들 수 있다.
MHC 항원은 주로 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 분류되고, MHC class I 항원에는 HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, -H가 포함되며, MHC class II 항원에는 HLA-DR, -DQ, -DP가 포함된다.
분화 항원에는 CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130이 포함될 수 있다.
면역글로불린에는 IgA, IgM, IgD, IgG, IgE가 포함된다. 또한 면역 복합체는 적어도 면역글로불린 중 어느 하나의 성분을 포함한다.
기타 항원으로서는 하기와 같은 분자；17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 어드레신, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3(오스테오게닌(Osteogenin)), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 뼈 유래 신경영양인자, BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체인자3(C3), C3a, C4, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리눔균 독소, 웰치균 독소, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔도케팔리나아제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파1, GFR-알파2, GFR-알파3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나아제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, 메탈로프로테아제, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤틴(Muc1), MUC18, 뮐러관 억제물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 어드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴투린, 신경 성장인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리포스파타아제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로릴랙신, 프로테인 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV)F, RSV Fgp, Ret, 류머티즘 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T세포 수용체(예를 들면 T세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI(ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-카드헤린, VE-카드헤린-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰 빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B／13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, 프리칼리크레인, RON, TMEM16F, SOD1, 크로모그라닌 A, 크로모그라닌 B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, 팩터 B, 팩터 D, 팩터 H, 프로페르딘, 스클레로스틴, 피브리노겐, 피브린, 프로트롬빈, 트롬빈, 조직인자, 팩터 V, 팩터 Va, 팩터 VII, 팩터 VIIa, 팩터 VIII, 팩터 VIIIa, 팩터 IX, 팩터 IXa, 팩터 X, 팩터 Xa, 팩터 XI, 팩터 XIa, 팩터 XII, 팩터 XIIa, 팩터 XIII, 팩터 XIIIa, TFPI, 안티트롬빈 III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, 플라스미노겐, 플라스민, PAI-1, PAI-2, GPC3, 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, LPA, S1P, 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다.
본 발명에 있어서의 비한정의 일실시태양에서는, 이중특이성 항체의 하나의 특이성은 암 항원을 표적으로 하고, 다른 쪽의 특이성은 CTL(Cytotoxic T lymphocyte)에 발현하는 항원, 예를 들면 CD3나 TNFRSF(Tumor Necrosis Factor Receptor Super Family)를 표적으로 할 수 있는데, 이 조합에 한정되는 것은 아니다. TNFRSF의 예로서는 TNFRSF9(CD137), TNFRSF5(CD40) 및 TNFRSF4(OX40) 등을 들 수 있다.
핵산의 개변
또한 본 발명의 제조방법의 다른 태양에 있어서는, 본 발명은 폴리펩티드 간의 해리 및/또는 회합이 제어되도록, 폴리펩티드 간의 계면을 형성하는 아미노산 잔기(예를 들면 EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치, 357번 위치 및 370번 위치, 및 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기), 및/또는 EU 넘버링 397번 위치 및/또는 392번 위치의 아미노산 잔기에 변이를 갖는 이종 다량체의 제조방법으로서, (a) 폴리펩티드 간의 해리 및 회합이 제어되도록, 당해 폴리펩티드 간의 계면 등을 형성하는 아미노산 잔기를 코드하는 핵산을 원래의 핵산으로부터 개변하는 공정, (b) 당해 폴리펩티드를 발현하도록 당해 핵산을 갖는 숙주세포를 배양하는 공정, (c) 당해 숙주세포의 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정, 및 (d) 환원 조건하, 각 폴리펩티드를 인큐베이트하여 목적하는 폴리펩티드의 헤테로체를 회수하는 공정을 포함하는, 이종 다량체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명의 전술한 해리 및/또는 회합 제어방법을 이용하여 폴리펩티드 간의 회합이 저해되도록, 당해 폴리펩티드 간의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 코드하는 핵산을 원래의 핵산으로부터 개변하는 공정을 포함하는 방법도 또한 본 발명의 상기 제조방법의 바람직한 태양 중 하나이다.
본 발명의 상기 방법에 있어서 「핵산을 개변한다」는 것은, 본 발명에 있어서의 「개변」에 의해 도입되는 아미노산 잔기에 대응하도록 핵산을 개변하는 것을 말한다. 보다 구체적으로는, 원래의(개변 전의) 아미노산 잔기를 코드하는 핵산에 대해서 개변에 의해 도입되는 아미노산 잔기를 코드하는 핵산으로 개변하는 것을 말한다. 통상, 목적의 아미노산 잔기를 코드하는 코돈이 되도록 원래의 핵산에 대해 적어도 1염기를 삽입, 결실 또는 치환하는 유전자 조작 또는 변이 처리를 행하는 것을 의미한다. 즉, 원래의 아미노산 잔기를 코드하는 코돈은 개변에 의해 도입되는 아미노산 잔기를 코드하는 코돈에 의해 치환된다. 이러한 핵산의 개변은 당업자에게 있어서는 공지의 기술, 예를 들면 부위 특이적 변이 유발법, PCR 변이 도입법 등을 사용하여 적절히 실시하는 것이 가능하다.
또한 본 발명에 있어서의 핵산은 통상 적당한 벡터로 담지(삽입)되어 숙주세포로 도입된다. 상기 벡터로서는 삽입한 핵산을 안정하게 유지하는 것이라면 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 숙주로 대장균을 사용하는 것이라면, 클로닝용 벡터로서는 pBluescript 벡터(Stratagene사 제조) 등이 바람직한데 시판의 각종 벡터를 이용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 목적으로 벡터를 사용하는 경우에는 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는 시험관 내, 대장균 내, 배양세포 내, 생물개체 내에서 폴리펩티드를 발현하는 벡터라면 특별히 제한되지 않는데, 예를 들면 시험관 내 발현이라면 pBEST 벡터(프로메가사 제조), 대장균이라면 pET 벡터(Invitrogen사 제조), 배양세포라면 pME18S-FL3 벡터(GenBank Accession No. AB009864), 생물개체라면 pME18S 벡터(Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)) 등이 바람직하다. 벡터로의 본 발명의 DNA의 삽입은 통상의 방법으로, 예를 들면 제한효소 사이트를 사용한 리가아제 반응에 의해 행할 수 있다(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11).
상기 숙주세포로서 특별히 제한은 없고, 목적에 따라 각종 숙주세포가 사용된다. 폴리펩티드를 발현시키기 위한 세포로서는, 예를 들면 세균세포(예：스트렙토코커스, 스타필로코커스, 대장균, 스트렙토마이세스, 고초균), 진균세포(예：효모, 아스퍼질러스), 곤충세포(예：드로소필라 S2, 스포도프테라 SF9), 동물세포(예：CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells) 및 식물세포를 예시할 수 있다. 숙주세포로의 벡터 도입은, 예를 들면 인산칼슘 침전법, 전기 펄스 천공법(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9), 리포펙타민법(GIBCO-BRL사 제조), 마이크로인젝션법 등의 공지의 방법으로 행하는 것이 가능하다.
숙주세포에 있어서 발현된 폴리펩티드를 소포체의 내강에, 세포 주유강에, 또는 세포 외의 환경에 분비시키기 위해 적당한 분비 시그널을 목적의 폴리펩티드에 삽입할 수 있다. 이들 시그널은 목적의 폴리펩티드에 대해 내인성이어도 되고 이종 시그널이어도 된다.
상기 제조방법에 있어서의 폴리펩티드의 회수는 본 발명의 폴리펩티드가 배지에 분비되는 경우는 배지를 회수한다. 본 발명의 폴리펩티드가 세포 내에 생산되는 경우는, 그 세포를 먼저 용해하고 그 후에 폴리펩티드를 회수한다.
재조합 세포 배양물로부터 본 발명의 폴리펩티드를 회수하여 정제하는 데는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 공지의 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 비한정의 실시태양으로서 각각 제1 및 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 각 세포주를 배양하고, 당해 배양상청을 정제 후에 정제 항체를 사용하여 FAE(Fab Arm Exchange) 반응을 일으키는 방법, 각각 제1 및 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 각 세포주를 배양하고, 당해 배양상청을 정제하지 않고 혼합하여 혼합 배양상청 중에서 FAE 반응을 일으킨 후 정제하는 방법, 제1 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주와 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주를 혼합하여 배양하고, 당해 배양상청을 정제 후에 정제 항체를 사용하여 FAE 반응을 일으키는 방법, 제1 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주와 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주를 혼합하여 배양하고, 당해 배양상청 중에서 FAE 반응을 일으킨 후 정제하는 방법을 들 수 있다.
본 발명은 비한정의 실시태양으로서, 아래의 a)~c)의 공정；
a) 제1 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주와 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주를 혼합하는 단계,
b) 당해 배양상청 중에서 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키도록, 상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 함께 인큐베이트하는 단계, 및
c) 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체를 얻는 단계
를 포함하는, 이종 다량체의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 비한정의 실시태양으로서, 아래의 a)~c)의 공정；
a) 각각 제1 및 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주를 배양하는 단계,
b) 각 세포주의 배양상청을 혼합하고, 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키도록, 상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 함께 인큐베이트하는 단계, 및
c) 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체를 얻는 단계
를 포함하는, 이종 다량체의 제조방법을 제공한다.
목적하는 이종 다량체를 선택하는 방법
또한 본 발명은 목적하는 이종 다량체를 선택하는 방법을 제공한다. 바람직한 태양으로서는, 당해 방법은 아래의 단계를 포함하는 목적하는 특성을 갖는 이종 다량체를 선택하는 방법이다：
a) 제1 폴리펩티드의 조 및 제2 폴리펩티드의 조를 제공하는 단계로서, 제1 조를 구성하는 각 폴리펩티드가 제2 조를 구성하는 각 폴리펩티드와 다른 표적 특이성을 가지며, 또한 제1 및 제2 조를 구성하는 각 폴리펩티드가 상기 전하 반발을 이용한 계면 제어에 관한 아미노산 개변 및/또는 CH3영역의 안정성을 불안정하게 하는 아미노산 개변을 포함하는 단계,
b) 환원 조건하에서, 상기 제1 조를 구성하는 각 폴리펩티드를 상기 제2 조를 구성하는 각 폴리펩티드와 함께 인큐베이트함으로써 복수 종의 이종 다량체의 혼합물을 제작하는 단계,
c) 결과로서 얻어진 복수 종의 이종 다량체의 혼합물을 목적하는 특성에 대해서 어세이하는 단계, 및
d) 목적하는 특성을 갖는 이종 다량체를 선택하는 단계.
의약 조성물
또한 본 발명은 본 발명의 이종 다량체 및 의약적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물(약제)에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 의약 조성물이란 통상 질환의 치료 또는 예방, 또는 검사·진단을 위한 약제를 말한다.
본 발명의 의약 조성물은 당업자에게 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제인 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 설정한다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제(예를 들면 D-소르비톨, D-만나오스, D-만니톨, 염화나트륨)을 포함하는 등장액을 들 수 있다. 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80(TM), HCO-50 등)를 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 콩기름을 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산벤질 및/또는 벤질알코올을 병용해도 된다. 또한 완충제(예를 들면 인산염 완충액 및 초산나트륨 완충액), 무통화제(예를 들면 염산프로카인), 안정제(예를 들면 벤질알코올 및 페놀), 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전한다.
본 발명의 의약 조성물은 바람직하게는 비경구 투여에 의해 투여된다. 예를 들면 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여형의 조성물로 할 수 있다. 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
투여방법은 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량은, 예를 들면 1회에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎~1,000 ㎎의 범위로 설정하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면 환자당 0.001~100,000 ㎎의 투여량으로 하는 것도 가능한데, 본 발명은 반드시 이들 수치에 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중, 연령, 증상 등에 따라 변동되는데, 당업자라면 그들 조건을 고려하여 적당한 투여량 및 투여방법을 설정하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서는 상기 본 발명의 이종 다량체는 암에 대한 치료제 또는 예방제의 유효성분으로서 유용하다. 암은 다음의 것을 포함하는데, 단 이들에만 한정되는 것은 아니다：폐암(소세포폐암, 비소세포폐암, 폐선암 및 폐편평상피암을 포함한다), 대장암, 직장암, 결장암, 유방암, 간암, 위암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 갑상선암, 담관암, 복막암, 중피종, 편평상피암, 자궁경부암, 자궁체암, 방광암, 식도암, 두경부암, 비인두암, 타액선종양, 흉선종, 피부암, 기저세포종, 악성 흑색종, 항문암, 음경암, 정소암, 빌름스종양, 급성 골수성 백혈병(급성 골수구성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병 및 급성 단구성 백혈병을 포함한다), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종(버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 맨틀 세포 림프종, 여포성 림프종, 비만성 대세포형 림프종, 변연대 림프종, 모양세포 백혈병 형질세포종, 말초성 T세포 림프종 및 성인 T세포 백혈병/림프종), 랑게르한스 세포조직구증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 뇌종양(신경교종, 성상교종, 교아세포종, 수막종 및 상의 세포종을 포함한다), 신경아세포종, 망막아세포종, 골육종, 카포시 육종, 유윙 육종, 혈관육종, 혈관외피세포종.
또한 필요에 따라 본 발명의 폴리펩티드 또는 이종 다량체를 그 밖의 의약 성분과 조합하여 제제화하는 것도 가능하다.
또한 본 발명은 적어도 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 이종 다량체, 또는 본 발명의 의약 조성물을 포함하는 본 발명의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트에는 그 밖에 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키징해두는 것도 가능하다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드의 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 명세서에서 사용되고 있는 아미노산의 3문자 표기와 1문자 표기의 대응은 아래와 같다.
알라닌：Ala：A
아르기닌：Arg：R
아스파라긴：Asn：N
아스파라긴산：Asp：D
시스테인：Cys：C
글루타민：Gln：Q
글루타민산：Glu：E
글리신：Gly：G
히스티딘：His：H
이소류신：Ile：I
류신：Leu：L
리신：Lys：K
메티오닌：Met：M
페닐알라닌：Phe：F
프롤린：Pro：P
세린：Ser：S
트레오닌：Thr：T
트립토판：Trp：W
티로신：Tyr：Y
발린：Val：V
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
〔실시예 1〕항체의 회합 계면 제어 개변의 도입에 의한 Fab Arm Exchange 효율의 향상 검토
Fab Arm Exchange의 경우는, 2종류의 호모항체를 환원제 존재하에서 혼합하고, 생성된 4개의 항체 분자 편완(반분자 또는 HL분자라 칭하는, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄로 이루어지는 분자)이 재결합됨으로써 이중특이성 항체(Bispecific antibody)가 생성된다. HL분자의 재결합은 랜덤으로 일어나기 때문에 목적의 이중특이성 항체는 이론상 시스템 중에 존재하는 전체 항체량의 50%밖에 얻어지지 않는다. 그러나 2종류의 호모항체에 사전에 다른 전하를 도입해 둠으로써, 생성된 HL분자끼리가 재결합될 때 호모 이량화보다도 헤테로 이량화가 보다 우선적으로 일어나 높은 효율로 이중특이성 항체를 제작할 수 있을 가능성이 있다. 이에 WO2006/106905에서 보고되어 있는 항체의 CH3영역에 있어서의 회합 계면을 제어하는 개변(2종류의 H쇄를 CH3영역의 전하적 상호작용 및 반발을 이용하여 헤테로 회합화시키는 개변)을 사용함으로써 Fab Arm Exchange의 반응 효율(이중특이성 항체 생성률)이 향상되는지 여부를 검증하였다.
항체 H쇄 가변영역에는 WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 H쇄 가변영역인 WT(H)(서열번호 1：이후 MRAH로 기재) 및 H54(서열번호 2)를 사용하였다. 이들 H쇄 가변영역에 대해 항체 H쇄 불변영역으로서 인간 IgG1의 H쇄 불변영역의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d를 갖는 MRAH-G1d(서열번호 3) 및 H54-G1d(서열번호 4), 및 인간 IgG4의 H쇄 불변영역의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 wtG4d를 갖는 MRAH-wtG4d(서열번호 5) 및 H54-wtG4d(서열번호 6)를 제작하였다. 다음으로 MRAH-G1d와 H54-G1d에 대해 IgG4형 힌지 서열, CH3 도메인 서열이 되도록 P228S 및 K409R의 개변을 도입한 MRAH-G1dsr(서열번호 7), H54-G1dsr(서열번호 8)을 제작하였다. 또한 회합 계면 제어 개변으로서 MRAH-G1dsr에 D356K를 도입한 MRAH-G1dsrP1(서열번호 9), H54-G1dsr에 K439E를 도입한 H54-G1dsrN1(서열번호 10), MRAH-wtG4d에 E356K를 도입한 MRAH-wtG4dP1(서열번호 11), H54-wtG4d에 K439E를 도입한 H54-wtG4dN1(서열번호 12)을 제작하였다. H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0(서열번호 13)를, H54인 경우는 L28-k0(서열번호 14)를 항체 L쇄로서 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1dsr/MRAL-k0, H54-G1dsr/L28-k0, MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0, H54-G1dsrN1/L28-k0, MRAH-wtG4d/MRAL-k0, H54-wtG4d/L28-k0, MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0, H54-wtG4dN1/L28-k0를 발현, 정제하였다.
다음으로 얻어진 호모체 2종류를 아래에 나타내는 조합으로 혼합하고, 반응산물을 참고예 2의 방법에 따라 평가하였다.
(1) MRAH-wtG4d/MRAL-k0와 H54-wtG4d/L28-k0
(2) MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0와 H54-wtG4dN1/L28-k0
(3) MRAH-G1dsr/MRAL-k0와 H54-G1dsr/L28-k0
(4) MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0와 H54-G1dsrN1/L28-k0
반응 조건：PBS(Sigma, pH 7.4) 중 [각 mAb] = 0.2 ㎎/㎖, [GSH(Sigma)] = 0.5 mM, 0.05% Tween 20 (Junsei), 37℃, 24시간.
본 검토에서 사용한 2종류의 항체 가변영역 MRAH/MRAL과 H54/L28은 pI가 크게 상이하기 때문에, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 각각의 호모체 및 생성된 이중특이성 항체에 대응하는 피크가 용이하게 분리되어 반응 효율을 평가할 수 있다. 도 1은 이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응산물을 평가한 결과이다. 회합 계면 제어 개변을 도입하지 않는 MRAH-wtG4d/MRAL-k0와 H54-wtG4d/L28-k0를 반응시킨 wtG4d, 또는 MRAH-G1dsr/MRAL-k0와 H54-G1dsr/L28-k0를 반응시킨 G1dsr의 이중특이성 항체 생성률은 각각 50.5%, 52.7%였다. 한편으로 회합 계면 제어 개변을 도입한 MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0와 H54-wtG4dN1/L28-k0를 반응시킨 wtG4dP1/N1의 이중특이성 항체 생성률은 99.0%, 또한 MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0와 H54-G1dsrN1/L28-k0를 반응시킨 G1dsrP1/N1의 경우는 98.5%로 매우 높은 효율로 이중특이성 항체가 생성되고 있는 것이 명확해졌다. 이상의 결과로부터, WO2006/106905에서 보고되어 있는 회합 계면 제어 개변을 도입한 2종류의 호모체를 환원제 존재하에서 혼합함으로써 매우 높은 효율로 이중특이성 항체를 제작할 수 있는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 2〕인간 천연형 IgG1의 힌지 서열을 갖는 호모체에서의 Fab Arm Exchange
실시예 1에서는 힌지영역의 서열을 천연형 인간 IgG4형으로 하기 위해 IgG1에 대해 P228S 개변을 도입하여 Fab-Arm Exchange를 행하였다. 그러나 생체 내에 투여된 천연형 IgG4는 내인성 IgG4와의 반분자 교환이 일어나는 것이 보고되어 있다. 또한 그 원인은 힌지영역 중 EU 넘버링 228번째에 위치하는 Ser로, 이를 IgG1형의 Pro로 함으로써 안정성이 향상되고, 생체 내에서의 교환이 일어나지 않게 되는 것이 보고되어 있다(Labrijn AF et al. Nat. Biotechnol. 2009, 27, 767-771). 따라서 생체 내에 투여하는 것을 고려한 경우, 제작한 이중특이성 항체의 힌지 서열은 226C-227P-228P-229C로 되어 있는 것이 바람직하다. 이에 본 검토에서는 회합 계면 제어 개변이 도입되어 있는 것으로 인해 천연형 인간 IgG1의 힌지 서열이더라도 효율적으로 Fab Arm Exchange가 일어나는지 여부에 대해서 검증하였다.
먼저 MRAH-G1d에 대해 K409R 및 D356K를 도입한 MRAH-G1drP1(서열번호 15), H54-G1d에 대해 K409R 및 K439E를 도입한 H54-G1drN1(서열번호 16)을 제작하였다. H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0를, H54인 경우는 L28-k0를 항체 L쇄로서 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1drP1/MRAL-k0, H54-G1drN1/L28-k0를 발현, 정제하였다. 다음으로, 얻어진 호모체 2종류를 아래의 반응 조건 하에서 혼합하고, 반응산물을 참고예 2의 방법에 따라 평가하였다.
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.2 ㎎/㎖, 0.05% Tween 20 (Junsei), 37℃, 24시간. 환원제는 [GSH(Sigma)] = 0.5 mM 또는 5 mM 또는 [2-MEA(Sigma)] = 25 mM의 3 조건에서 검토하였다.
참고예 2의 방법에 따라 반응산물을 해석한 결과를 도 2에 나타낸다. 실시예 1과 동일한 GSH(0.5 mM)의 조건하에서는 이중특이성 항체 생성률은 21.8%가 되어, EU 넘버링 228번째 아미노산 잔기가 Ser인 경우와 비교하여 효율이 대폭 저하되었다. 그러나 2-MEA(25 mM) 및 GSH(5 mM)의 환원 조건하에서는 이중특이성 항체의 생성률이 99% 이상이 되었다. 이상의 결과로부터, 힌지의 서열이 인간 천연형 IgG1의 서열이었다 하더라도, 회합 계면 제어 개변을 도입하고 적절한 환원 조건을 사용함으로써 높은 효율로 이중특이성 항체를 제작할 수 있는 것이 명확해졌다.
〔실시예 3〕인간 천연형 IgG1의 CH3를 사용한 Fab Arm Exchange
여기까지의 검토에 있어서 인간 IgG1에 대해 CH3를 IgG4형으로 하는 K409R 개변과, 회합 계면 제어 개변(D356K 및 K439E)을 도입하여 Fab Arm Exchange를 행함으로써 매우 높은 효율로 목적의 이중특이성 항체가 얻어지는 것이 나타내어졌다.
한편 409번째 아미노산 잔기가 Arg이면 항체의 산성 조건하에 있어서의 안정성이 저하되는 것이 알려져 있다(WO/2009/041613). 의약품으로서의 항체의 제조를 위해서는 산성 조건하에 항체를 폭로하는 바이러스 불활성화 공정이 필수이고, 그때 항체의 품질을 유지하기 위해 항체의 산성 조건하에 있어서의 안정성이 높은 것이 바람직하다. 따라서 409번째 아미노산 잔기는 Arg가 아닌 것이 바람직하다. 한편 Fab Arm Exchange 반응을 효율적으로 일으킬 수 있는 것으로 보고되어 있는 개변은 K409R의 개변을 사용하고 있어, 409번째 아미노산 잔기가 Arg인 것으로부터 산성 조건하에 있어서의 안정성에 과제가 있는 것으로 생각된다. 이에 다음으로 K409R 개변을 포함하지 않는 완전히 인간 천연형 IgG1의 항체에 대해 WO2006/106905에서 보고되어 있는 회합 계면 제어 개변만으로 Fab Arm Exchange가 야기되는지 여부를 검증하였다.
검토한 회합 계면 제어 개변의 조합을 표 1에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00001
H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0를, H54인 경우는 L28-k0를 항체 L쇄로서 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1dP1/MRAL-k0, H54-G1dN1/L28-k0, MRAH-G1dP3/MRAL-k0, H54-G1dN3/L28-k0, MRAH-G1dP4/MRAL-k0, H54-G1dN4/L28-k0, MRAH-G1dP5/MRAL-k0, H54-G1dN5/L28-k0, MRAH-G1dP6/MRAL-k0, H54-G1dN6/L28-k0를 발현, 정제하였다.
다음으로 얻어진 호모체 2종류를 아래에 나타내는 조합으로 혼합하고, 반응산물을 참고예 2의 방법에 따라 평가하였다.
(1) MRAH-G1dP1/MRAL-k0와 H54-G1dN1/L28-k0
(2) MRAH-G1dP3/MRAL-k0와 H54-G1dN3/L28-k0
(3) MRAH-G1dP4/MRAL-k0와 H54-G1dN4/L28-k0
(4) MRAH-G1dP5/MRAL-k0와 H54-G1dN5/L28-k0
(5) MRAH-G1dP6/MRAL-k0와 H54-G1dN6/L28-k0
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.2 ㎎/㎖, 0.05% Tween 20 (Junsei), [GSH(Sigma)] = 5 mM, 37℃, 24시간.
얻어진 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00002
표 중의 「약칭」이란, 반응에 사용한 호모체의 조합의 약칭을 나타내는 것이다. 예를 들면 약칭이 G1dP1/N1으로 되어 있었던 경우, MRAH-G1dP1/MRAL-k0와 H54-G1dN1/L28-k0를 반응시킨 것을 나타낸다. 또한 「사용한 MoAb1의 H쇄 불변영역명」이란, MRAH의 가변영역을 갖는 항체의 불변영역명을 나타낸 것이고, 「사용한 MoAb2의 H쇄 불변영역명」이란, H54의 가변영역을 갖는 항체의 불변영역명을 나타낸 것이다. 「도입한 개변」이란, MRAH-G1d 또는 H54-G1d에 대해 도입한 개변을 나타낸다.
한쪽 호모체에 D356K를, 다른 한쪽 호모체에 K439E를 도입한 G1dP1/N1에서는 이중특이성 항체 생성률이 1.7%였다. 도 2에 있어서 같은 반응 조건하(5 mM GSH)에서 K409R 개변과 회합 계면 제어 개변(D356K 및 K439E)을 갖는 G1drP1/N1의 이중특이성 항체 생성률은 99.3%였던 것에 반하여, EU 넘버링 409번째 아미노산 잔기가 Lys가 된 G1dP1/N1에서 반응 효율이 대폭 저하되는 것이 나타내어졌다. 그러나 한쪽 호모체에 회합 계면 제어 개변 D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D를 도입한 G1dP3/N3, 한쪽 호모체에 D356K/D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D/K439E를 도입한 G1dP5/N5는 각각 93.4%, 98.1%로 매우 높은 이중특이성 항체 생성률을 나타내었다. 따라서 CH3 도메인을 IgG4형으로 하는 K409R 개변을 사용하지 않고 회합 계면 제어 개변만으로 높은 효율로 Fab Arm Exchange를 야기할 수 있는 것이 나타내어졌다.
다음으로 반응 효율이 높았던 G1dP3/N3와 G1dP5/N5에 대해서 3종류의 환원 조건하에서 반응 효율을 비교하였다. 이때 비교 대상으로서 실시예 2에서 사용한 G1drP1/N1 및 Fab Arm Exchange에 의한 효율적인 이중특이성 항체 제작 개변으로서 Labrijn 등에 의해 보고되어 있는, 한쪽 항체에 K409R을 다른 한쪽 호모체에 F405L을 도입한 개변체의 조합에 대해서도 검증하였다(Labrijn AF et al. Proc. Natl., Acad. Sci., 2013. 110. 5145-5150).
MRAH-G1d에 대해 K409R을 도입한 MRAH-G1dr(서열번호 27), H54-G1d에 대해 F405L을 도입한 H54-G1dl(서열번호 28)을 제작하였다. H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0를, H54인 경우는 L28-k0를 항체 L쇄로서 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1drP1/MRAL-k0, H54-G1drN1/L28-k0, MRAH-G1dP3/MRAL-k0, H54-G1dN3/L28-k0, MRAH-G1dP5/MRAL-k0, H54-G1dN5/L28-k0, MRAH-G1dr/MRAL-k0, H54-G1dl/L28-k0를 발현, 정제하였다.
다음으로 얻어진 호모체 2종류를 아래에 나타내는 조합으로 혼합하고, 반응산물을 참고예 2의 방법에 따라 평가하였다.
(1) MRAH-G1drP1/MRAL-k0와 H54-G1drN1/L28-k0
(2) MRAH-G1dP3/MRAL-k0와 H54-G1dN3/L28-k0
(3) MRAH-G1dP5/MRAL-k0와 H54-G1dN5/L28-k0
(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0와 H54-G1dl/L28-k0
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.2 ㎎/㎖, 0.05% Tween 20 (Junsei), 37℃, 24시간. 환원제는 [GSH(Sigma)] = 0.5 mM 또는 5 mM 또는 [2-MEA(Sigma)] = 25 mM의 3 조건에서 검토하였다.
얻어진 결과를 표 3에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00003
표 중의 「약칭」이란, 반응에 사용한 호모체의 조합의 약칭을 나타내는 것이다. 예를 들면 약칭이 G1dP1/N1으로 되어 있었던 경우, MRAH-G1dP1/MRAL-k0와 H54-G1dN1/L28-k0를 반응시킨 것을 나타낸다. 또한 「사용한 MoAb1의 H쇄 불변영역명」이란, MRAH의 가변영역을 갖는 항체의 불변영역명을 나타낸 것이고, 「사용한 MoAb2의 H쇄 불변영역명」이란, H54의 가변영역을 갖는 항체의 불변영역명을 나타낸 것이다. 「도입한 개변」이란, MRAH-G1d 또는 H54-G1d에 대해 도입한 개변을 나타낸다.
5 mM GSH의 환원 조건하에서는 Labrijn 등에 의해 보고되어 있는 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변을 사용한 G1dr/l의 이중특이성 항체 생성률은 87.3%였다. 이때 한쪽 호모체에 D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D를 도입한 G1dP3/N3의 경우는 85.2%, 한쪽 호모체에 D356K/D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D/K439E를 도입한 G1dP5/N5의 경우는 99.1%였다. 또한 IgG4형의 K409R 개변에 더하여 한쪽 호모체에 D356K를 다른 한쪽 호모체에 K439E를 갖는 G1drP1/N1의 이중특이성 항체 생성률은 99.3%였다.
25 mM 2MEA의 환원 조건하에서는 Labrijn 등에 의해 보고되어 있는 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변을 사용한 G1dr/l의 이중특이성 항체 생성률은 95.6%였다. 이때 한쪽 호모체에 D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D를 도입한 G1dP3/N3의 경우는 92.8%, 한쪽 호모체에 D356K/D399K를 다른 한쪽 호모체에 K409D/K439E를 도입한 G1dP5/N5의 경우는 100%, 또한 IgG4형의 K409R 개변에 더하여 한쪽 호모체에 D356K를 다른 한쪽 호모체에 K439E를 갖는 G1drP1/N1의 이중특이성 항체 생성률은 99.7%였다.
0.5 mM GSH의 환원 조건하에서는 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변을 사용한 G1dr/l의 이중특이성 항체 생성률은 9.5%였다. 이때 한쪽 호모체에 D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D를 도입한 G1dP3/N3의 경우는 4.8%, 한쪽 호모체에 D356K/D399K를 다른 한쪽 호모체에 K409D/K439E를 도입한 G1dP5/N5의 경우는 75.4%, 또한 IgG4형의 K409R 개변에 더하여 한쪽 호모체에 D356K를 다른 한쪽 호모체에 K439E를 갖는 G1drP1/N1의 이중특이성 항체 생성률은 21.8%가 되어, 모두 다른 환원 조건과 비교하여 대폭 저하되었다.
이상의 결과로부터, 어느 반응 조건하에 있어서도 한쪽 호모체에 D356K/D399K를, 다른 한쪽 호모체에 K409D/K439E를 도입한 G1dP5/N5는 Labrijn 등에 의해 보고되어 있는 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변보다도 높은 이중특이성 항체 생성률을 나타내는 것이 명확해졌다. 높은 이중특이성 항체 생성률은 실제로 의약품으로서의 이중특이성 항체의 제조에 있어서 매우 중요하여, 본 개변은 기존의 개변과 비교하여 유용성이 높은 것으로 생각된다.
〔실시예 4〕CH3 도메인 불안정화 개변을 이용한 고효율 Fab Arm Exchange의 개발
지금까지의 실시예에 있어서, 회합 계면 제어 개변에 의해 각각의 호모체에 다른 차지의 전하를 도입함으로써 환원제에 의해 생성된 반분자가 우선적으로 다른 호모체 유래의 반분자와 결합하여 높은 효율로 이중특이성 항체가 생성되는 것이 나타내어졌다. 한편 Fab Arm Exchange에 의해 이중특이성 항체가 생성되는 과정에 있어서는, 2종류의 호모체가 환원제로 개열된 후에 CH3 도메인이 해리되어 반분자(HL분자)를 생성하는 과정이 율속단계가 되는 것이 보고되어 있다(Rispens T et al. J. Am. Chem. Soc., 2011. 133. 10302-10311). 즉, 각각의 호모체의 CH3 도메인을 과도하게 불안정화함으로써 CH3 도메인의 해리를 촉진시킬 수 있다면 보다 효율적으로 Fab Arm Exchange를 야기할 수 있을 것으로 기대된다. 이에 먼저 표 2, 표 3에 나타낸 5 mM GSH 존재하에서의 이중특이성 항체 생성률과, 각각의 호모체의 CH3 도메인의 안정성의 관계를 평가하였다. CH3 도메인의 안정성은 참고예 3의 방법에 따라 측정한 Tm(열변성 중간온도)을 지표로 하였다.
이중특이성 항체 생성률과 사용한 2종류의 호모체 중 CH3의 Tm이 높은 쪽의 값의 관계를 도 3에 나타낸다. 이중특이성 항체 생성률이 낮았던 G1dP1/N1이나 G1dP4/N4의 경우는 CH3의 Tm이 76℃ 이상으로 높았던 한편, 반응 효율이 높은 G1dP5/N5, G1dP3/N3, G1drP1/N1에서의 호모체의 CH3의 Tm은 각각 65.1℃, 69.6℃, 69.5℃였다. 이상의 결과로부터 Fab Arm Exchange에서의 이중특이성 항체 생성률과, 호모체의 CH3의 안정성에는 명확하게 상관관계가 있는 것이 나타내어졌다. 또한 높은 반응 효율을 달성하기 위해서는 사용하는 2종류의 호모체 중 안정한 쪽 호모체의 CH3의 Tm이 70℃ 등을 밑돌도록 CH3영역의 안정성을 불안정하게 하는 것이 바람직한 것이 나타내어졌다. 여기서 같은 조건에서 측정한 천연형 인간 IgG1의 서열을 갖는 MRAH-G1d/MRAL-k0의 CH3영역의 Tm은 83.6℃였던 것으로부터, Fab Arm Exchange에 있어서 높은 반응 효율을 달성하기 위해서는 천연형 인간 IgG1으로부터 CH3영역의 Tm을 예를 들면 13℃ 이상 저하시키도록, CH3영역의 안정성을 불안정하게 할 필요가 있는 것을 알 수 있었다.
이에 다음으로 사용하는 호모체의 CH3 도메인의 Tm을 저하시킴으로써 이중특이성 항체 생성률이 향상되는지 여부에 대해서 검토하였다. CH3의 안정성을 저하시키는 개변으로서는 IgG2형의 개변인 V397M을 사용하였다. IgG2에서는 EU 넘버링 397번째 아미노산 잔기가 Met가 되어 있어, 이를 IgG1형의 Val로 치환하는 개변을 도입함으로써 CH3영역의 안정성(Tm)이 향상되는 것이 보고되어 있다(WO2009/041613). 따라서 IgG1형의 CH3 도메인에 대해 V397M 개변을 도입함으로써 CH3 도메인이 불안정화되어 해리되기 쉬워질 것으로 기대되었다.
이에 표 2에 있어서 이중특이성 항체 생성률이 낮았던 G1dP1/N1, G1dP4/N4, G1dP6/N6에 대해 양쪽 호모체에 V397M 개변을 도입한 G1dP8/N8, G1dP9/N9, G1dP10/N10을 검토하였다. 구체적으로는, MRAH-G1dP1, MRAH-G1dP4, MRAH-G1dP6, H54-G1dN1, H54-G1dN4, H54-G1dN6에 대해 V397M을 도입한 MRAH-G1dP8(서열번호 29), MRAH-G1dP9(서열번호 30), MRAH-G1dP10(서열번호 31), H54-G1dN8(서열번호 32), H54-G1dN9(서열번호 33), H54-G1dN10(서열번호 34)을 제작하였다. H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0를, H54인 경우는 L28-k0를 항체 L쇄로서 사용하고, 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1dP8/MRAL-k0, H54-G1dN8/L28-k0, MRAH-G1dP9/MRAL-k0, H54-G1dN9/L28-k0, MRAH-G1dP10/MRAL-k0, H54-G1dN10/L28-k0를 발현, 정제하였다. 또한 참고예 3의 방법에 따라 얻어진 항체의 Tm을 측정하였다.
다음으로 얻어진 호모체 2종류를 아래에 나타내는 조합으로 혼합하고, 반응산물을 참고예 2의 방법에 따라 평가하였다.
(1) MRAH-G1dP8/MRAL-k0와 H54-G1dN8/L28-k0
(2) MRAH-G1dP9/MRAL-k0와 H54-G1dN9/L28-k0
(3) MRAH-G1dP10/MRAL-k0와 H54-G1dN10/L28-k0
(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0와 H54-G1dl/L28-k0
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.2 ㎎/㎖, 0.05% Tween 20 (Junsei), [GSH(Sigma)] = 5 mM, 37℃, 24시간.
얻어진 결과를 표 4에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00004
표 중의 「MoAb1의 CH3의 Tm」이란 MRAH의 가변영역을 갖는 호모체의 CH3의 Tm을, 「MoAb2의 CH3의 Tm」이란 H54의 가변영역을 갖는 호모체의 CH3의 Tm을 나타낸다.
G1dP1/N1 양쪽 호모체에 V397M 개변을 도입한 G1dP8/N8의 경우는 MoAb1의 CH3의 Tm이 6.6℃ 저하되어 70.1℃가, MoAb2의 경우는 4.2℃ 저하되어 70.5℃가 되고, 이중특이성 항체가 1.7%에서 73.2%로 향상되었다. G1dP4/N4 양쪽 호모체에 V397M 개변을 도입한 G1dP9/N9의 경우는 MoAb1의 CH3의 Tm이 1.5℃ 저하되어 67℃가, MoAb2의 경우는 5.5℃ 저하되어 71℃가 되고, 이중특이성 항체가 4.4%에서 67.3%로 향상되었다. G1dP6/N6 양쪽 호모체에 V397M 개변을 도입한 G1dP10/N10의 경우는 MoAb2의 CH3의 Tm에 변화는 없었지만, MoAb1의 CH3의 Tm이 2.2℃ 저하되어 63.8℃가 되고, 이중특이성 항체가 29.3%에서 96.9%로 향상되었다. 이상의 결과로부터, V397M 개변을 가하여 호모체의 CH3의 Tm을 저하시킴으로써 Fab Arm Exchange로의 이중특이성 항체 생성 효율을 향상시킬 수 있는 것이 나타내어졌다. 또한 이때 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변을 사용한 G1dr/l의 이중특이성 항체 생성률은 88.1%로, G1dP10/N10은 이보다도 우수한 이중특이성 항체 생성률을 나타내었다.
이에 다음으로 효과가 있었던 EU 넘버링 397번째 주변에 대해 보다 큰 CH3 불안정화 효과가 기대되는 개변을 도입하고, 추가로 이중특이성 항체 생성률이 향상되는지 여부를 검토하였다. 도 4는 보고되어 있는 IgG1의 X선 결정구조 해석 데이터(PDB:3DO3)를 사용하여 CH3 도메인의 EU 넘버링 397번째 주변을 나타낸 것이다.
먼저 A쇄의 D399는 B쇄의 K392와 정전 상호작용하고 있는 것으로 생각되기 때문에, V397M 개변에 더하여 K392를 Asp 또는 Glu로 치환함으로써 양쇄의 정전 반발이 일어나, 양쇄의 상호작용을 보다 불안정화할 수 있는 가능성이 있다. 또한 K392를 측쇄 분지형 아미노산으로 치환함으로써 M397과의 입체장애에 의해 양쇄의 회합을 보다 불안정화할 수 있는 것도 기대된다. 또한 EU 넘버링 397번째 아미노산 잔기를 보다 부피가 큰 아미노산으로 치환함으로써 V397M 개변보다도 더 CH3의 회합을 억제할 수 있는 가능성도 기대되었다. 이상과 같은 관점에서 MRAH-G1dP1 및 H54-G1dN1을 베이스로 하여 표 5에 나타낸 7종류의 항체 H쇄 유전자를 새롭게 제작하였다.
Figure 112016038698342-pct00005
H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0를, H54인 경우는 L28-k0를 항체 L쇄로서 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1dP14/MRAL-k0, H54-G1dN14/L28-k0, MRAH-G1dP15/MRAL-k0, H54-G1dN15/L28-k0, MRAH-G1dP16/MRAL-k0, H54-G1dN16/L28-k0, MRAH-G1dP17/MRAL-k0, H54-G1dN17/L28-k0, MRAH-G1dP18/MRAL-k0, H54-G1dN18/L28-k0, MRAH-G1dP19/MRAL-k0, H54-G1dN19/L28-k0, MRAH-G1dP20/MRAL-k0, H54-G1dN20/L28-k0를 발현, 정제하였다. 또한 참고예 3의 방법에 따라 얻어진 항체의 Tm을 측정하였다.
다음으로 얻어진 호모체 2종류를 아래에 나타내는 조합으로 혼합하고, 반응산물을 참고예 2의 방법에 따라 평가하였다.
(1) MRAH-G1dP14/MRAL-k0와 H54-G1dN14/L28-k0
(2) MRAH-G1dP15/MRAL-k0와 H54-G1dN15/L28-k0
(3) MRAH-G1dP16/MRAL-k0와 H54-G1dN16/L28-k0
(4) MRAH-G1dP17/MRAL-k0와 H54-G1dN17/L28-k0
(5) MRAH-G1dP18/MRAL-k0와 H54-G1dN18/L28-k0
(6) MRAH-G1dP19/MRAL-k0와 H54-G1dN19/L28-k0
(7) MRAH-G1dP20/MRAL-k0와 H54-G1dN20/L28-k0
(8) MRAH-G1dr/MRAL-k0와 H54-G1dl/L28-k0
(9) MRAH-G1dP1/MRAL-k0와 H54-G1dN1/L28-k0
(10) MRAH-G1dP8/MRAL-k0와 H54-G1dN8/L28-k0
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.2 ㎎/㎖, 0.05% Tween 20 (Junsei), [2-MEA(Sigma)] = 25 mM, 37℃, 24시간.
얻어진 결과를 표 6에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00006
G1dP1/N1 양쪽 호모체에 V397M 개변을 도입한 G1dP8/N8의 경우는 이중특이성 항체가 73.2%였던 것에 대해, 이 양쇄에 K392D를 도입한 G1dP14/N14의 경우는 96.5%, K392E를 도입한 G1dP15/N15의 경우는 96.9%, K392T를 도입한 G1dP18/N18의 경우는 98.9%로 크게 이중특이성 항체 생성률이 향상되었다. 또한 G1dP1/N1에 대해 V397M 대신에 V397F를 도입한 G1dP16/N16의 경우는 96.5%, V397Y를 도입한 G1dP17/N17의 경우는 98%로 V397M보다도 이중특이성 항체 생성률이 향상되었다. 이는 V397M을 포함하는 G1dP8/N8의 MoAb1과 MoAb2의 CH3의 Tm이 각각 70.1℃와 70.5℃인 것에 대해, G1dP16/N16의 경우는 69.1℃와 69.7℃, G1dP17/N17의 경우는 69.2℃와 69.8℃인 것으로부터, 목적하는 바대로 V397M 개변보다도 호모체의 CH3 도메인의 상호작용이 약해져 해리되기 쉬워졌기 때문으로 생각된다. 이때 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변을 사용한 G1dr/l의 이중특이성 항체 생성률은 91.7%이고, G1dP14/N14, G1dP15/N15, G1dP16/N16, G1dP17/N17, G1dP18/N18은 이보다도 우수한 이중특이성 항체 생성률을 나타내었다.
의약품 제조로의 응용성을 고려한 경우, 기존의 Fab Arm Exchange 효율 향상 개변보다도 이중특이성 항체 생성률이 높고, 헤테로 성분이 적은 G1dP16/N16(D356K/V397F 및 V397F/K439E) 및 G1dP17/N17(D356K/V397Y 및 V397Y/K439E)은 매우 유용하다.
또한 표 3 및 표 6에서 검토한 개변체의 CH3의 안정성과 25 mM의 2MEA를 환원제로서 사용했을 때의 이중특이성 항체 생성률의 관계를 도 5에 나타낸다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 사용하는 호모체의 CH3의 안정성과 Fab Arm Exchange에 있어서의 효율은 명백하게 상관관계가 있어, 사용하는 2종류의 호모체 중 CH3의 안정성이 높은 쪽의 호모체의 Tm이 70℃ 등을 밑돌도록 CH3영역의 안정성을 불안정화함으로써 높은 이중특이성 항체 생성률이 달성된다.
〔실시예 5〕반응 시간의 검토
실시예 4에 있어서 발견된 G1dP17/N17을 사용하여 반응 시간과 반응 효율의 관계를 검토하였다.
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 1.0 ㎎/㎖, [2-MEA(Sigma)] = 25 mM, 37℃, 전량 50 ㎕.
90분, 3시간, 24시간에서 4℃로 냉각한 25 mM MES 완충액(pH 5.0)을 450 ㎕ 첨가하고, 추가로 4℃에 보존함으로써 반응을 정지하였다. 그 후 참고예 2의 방법에 따라 반응 효율을 평가하였다(도 6).
도 6에 나타내어지는 바와 같이, G1dP17/N17의 이중특이성 항체 생성률은 25 mM 2-MEA 존재하, 90분에서 94.6%, 3시간에서 95.2%, 24시간에서 97.4%가 되어, 90분간의 반응 시간에서 약 95%였다. 이 결과로부터, 편쇄에 K409R의 개변을 다른 쪽 편쇄에 F405L의 개변을 도입한 G1dr/l의 이중특이성 항체 생성률과 비교하여(표 6), 충분히 높은 반응 효율을 나타내는 것이 명확해졌다.
〔실시예 6〕고효율 Fab Arm Exchange를 나타내는 개변체의 인간 FcgR 및 인간 FcRn으로의 결합 평가
실시예 4에 있어서 고효율 FAE 효율을 나타낸 개변체 G1dP17/N17에 대해서 인간 FcgR 및 인간 FcRn으로의 결합 평가를 실시하였다. 먼저 천연형 IgG1의 서열을 갖는 MRAH-G1d/MRAL-k0 및 Fab-Arm Exchange 후의 개변체 MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0의 인간 FcRn과의 결합을 참고예 5의 방법에 따라 실시하였다. 인간 FcRn으로의 결합 해석 결과를 표 7에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00007
표 7에 나타낸 결과로부터 Fab-Arm Exchange로 제작한 개변체 MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0는 인간 FcRn에 대해 천연형 IgG1과 동등한 결합 활성을 갖는 것이 명확해졌다.
다음으로 인간 FcgR에 대한 결합 활성을 참고예 4의 방법에 따라 평가하였다. 여기에서는 천연형 IgG1의 서열을 갖는 MRAH-G1d/MRAL-k0, Fab-Arm Exchange 후의 개변체 MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0에 더하여 Fab-Arm Exchange 반응 전의 2종류의 호모체(MRAH-G1dP17/MRAL-k0와 H54-G1dN17/L28-k0) 및 CH3 도메인을 불안정화하는 개변인 V397Y를 뺀 2종류의 호모체(MRAH-G1dP1/MRAL-k0와 H54-G1dN1/L28-k0)에 대해서도 함께 평가하였다. 표 8에 있어서 KD fold hFcgRIa, KD fold hFcgRIIaR, KD fold hFcgRIIaH, KD fold hFcgRIIb, KD fold hFcgRIIIaV란, G1d의 각각의 FcgR에 대한 KD를 1로 한 경우의 각 개변체의 상대적 결합 활성을 나타낸 값이다.
Figure 112016038698342-pct00008
천연형과 비교하여 Fab-Arm Exchange 후의 개변체 G1dP17/N17은 hFcgRIa로의 결합이 1.1배, hFcgRIIaR로의 결합이 2.7배, hFcgRIIaH로의 결합이 2.3배, hFcgRIIb로의 결합이 2.5배, hFcgRIIIaV로의 결합이 2.5배 증강되어 있었다. 여기에서 CH3 도메인을 불안정화하는 V397Y를 도입하기 전의 호모체 G1dP1 및 G1dN1에서는 어느 FcgR에 대해서도 천연형과 동등한 것, 또한 여기에 V397Y가 도입된 호모체(G1dP17 및 G1dN17)의 경우는 각 FcgR에 대한 결합이 증강되어 있는 것으로부터, V397Y 개변에 의해 hFcgR로의 결합이 증강된 것을 알 수 있다.
이상의 결과로부터, 높은 Fab-Arm Exchange 효율을 발현하는 G1dP17/N17은 천연형과 비교하여 인간 FcRn, 인간 FcgR에 대한 결합을 손상시키지 않는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 7〕배양상청 중에 있어서의 Fab-Arm Exchange의 검토
Fab-Arm Exchange에 의한 이중특이성 항체의 제조에서는, 2종류의 호모체를 따로 따로 배양, 정제한 후에 Fab-Arm Exchange를 행하는 것이 상정되는데, 만일 배양상청 중에서 반응을 일으킬 수 있다면 호모체의 정제단계를 생략할 수 있기 때문에 커다란 이점이 된다. 이에 2종류의 호모체를 배양상청 중에서 환원제와 함께 혼합하여, Fab-Arm Exchange가 높은 효율로 일어나는지 여부를 검증하였다.
먼저 MRAH-G1d 및 H54-G1d의 356번째 아미노산 잔기를 E로 358번째 아미노산 잔기를 M으로 치환한 MRAH-G1m(서열번호 49), H54-G1m(서열번호 50)을 각각 제작하였다. 다음으로 MRAH-G1m에 대해 E356K 및 K409R을 도입한 MRAH-G1mrP1(서열번호 51), H54-G1m에 대해 K439E 및 K409R을 도입한 H54-G1mrN1(서열번호 52)을 제작하였다. H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-k0를, H54인 경우는 L28-k0를 항체 L쇄로서 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-G1mrP1/MRAL-k0, H54-G1mrN1/L28-k0를 발현, 정제하였다.
또한 FreeStyle293세포(Invitrogen)를 FreeStyle 293 Expression medium에서 배양한 후, 원심하여 상청을 회수하고 0.22 ㎛의 여과막으로 여과한 것을 MocK CM으로서 Fab-Arm Exchange에 사용하였다.
반응 조건：Mock CM(pH 7.6) 중 [각 mAb] = 1.0 ㎎/㎖, [2-MEA(Sigma)] = 25 mM, 37℃, 90분
반응 후의 반응용액에 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어)를 첨가하여 정제한 후에, 참고예 2의 방법에 따라 반응 효율을 평가하였다(도 7).
도 7에 나타낸 바와 같이, 배양상청 중이라도 25 mM 2-MEA 존재하, 37℃, 90분간 반응시킴으로써 98% 이상의 반응 효율로 이중특이성 항체가 생성되는 것이 명확해졌다.
〔실시예 8〕마우스 IgG1에서의 Fab-Arm Exchange의 개발
지금까지의 실시예에 있어서, 인간 IgG1 또는 인간 IgG4에서 효율적으로 Fab-Arm Exchange가 야기되는 것이 나타내어졌다. 다음으로 마우스 IgG1에서도 동일하게 Fab-Arm Exchange에 의해 이중특이성 항체가 생성되는지 여부를 검증하였다.
보고되어 있는 결정구조(Harris LJ et al. J. Mol. Biol., 1998. 275. 861-872)로부터, EU 넘버링 399번째 D와 409번째 K가 CH3 도메인의 사슬 간 상호작용에 기여하고 있는 것으로 추측되었다(도 8). 이에 그 부위에 대해 인간 IgG1과 마찬가지로 헤테로 이량화를 촉진하기 위한 전하를 도입하여 Fab-Arm Exchange가 야기되는지 여부를 검증하였다.
항체 H쇄 가변영역에는 WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 H쇄 가변영역인 WT(H)(서열번호 1：이후 MRAH로 기재) 및 H54(서열번호 2)를 사용하였다. 이들 H쇄 가변영역에 대해 항체 H쇄 불변영역으로서 마우스 IgG1의 H쇄 불변영역을 갖는 MRAH-mIgG1(서열번호 53) 및 H54-mIgG1(서열번호 54)을 제작하였다. 또한 회합 계면 제어 개변으로서 MRAH-mIgG1에 D399K를 도입한 MRAH-mIgG1mP3(서열번호 55), D399R을 도입한 MRAH-mIgG1mP4(서열번호 56), H54-mIgG1에 K409D를 도입한 H54-mIgG1mN3(서열번호 57), K409E를 도입한 H54-mIgG1mN4(서열번호 58)를 제작하였다. L쇄로서 마우스 κ쇄 불변영역의 서열을 갖는 MRAL-mk1(서열번호 59) 및 L28-mk1(서열번호 60)을 제작하고, H쇄 가변영역이 MRAH인 경우는 MRAL-mk1을, H54인 경우는 L28-mk1을 항체 L쇄로서 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1, MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1, H54-mIgG1mN3/L28-mk1, H54-mIgG1mN4/L28-mk1을 발현, 정제하였다.
다음으로 아래의 조합으로 Fab-Arm Exchange를 실시하였다.
(1) MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1과 H54-mIgG1mN3/L28-mk1
(2) MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1과 H54-mIgG1mN4/L28-mk1
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 2 ㎎/㎖, [2-MEA(Sigma)] = 25 mM, 37℃, 19시간.
반응 후, 참고예 5의 방법에 따라 CE-IEF에 의해 반응 효율을 결정하였다(도 9).
그 결과, MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1과 H54-mIgG1mN3/L28-mk1을 반응시킨 경우에서는 89.2%, MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1과 H54-mIgG1mN4/L28-mk1의 경우는 89.9%로 모두 높은 효율로 이중특이성 항체가 생성되고 있는 것이 확인되었다. 인간 IgG1 또는 인간 IgG4를 사용한 Fab-Arm Exchange와 비교하여 반응 효율이 약간 저하되는 것은 마우스 IgG1의 경우는 힌지영역의 디설피드 결합이 3개 존재하여 인간 IgG1 또는 인간 IgG4의 힌지보다도 2개의 중쇄가 보다 강고하게 결합되어 있기 때문으로 예상된다(Harris LJ et al. J. Mol. Biol., 1998. 275. 861-872).
〔실시예 9〕마우스 IgG1의 Fab Arm Exchange로 제작한 이중특이성 항체의 마우스 FcgR 및 마우스 FcRn에 대한 결합 활성의 평가
참고예 4-3에 따라 마우스 IgG형 Fab-Arm Exchange로 제작한 2종류의 이중특이성 항체(MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN3/L28-mk1 및 MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN4/L28-mk1)의 마우스 FcgR 및 마우스 FcRn으로의 결합을 평가하였다. 또한 MRAH-mIgG1/MRAL-mk1을 참고예 1에 따라 제작하여 비교 대상으로서 측정하였다. 측정 결과를 표 9에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00009
제작한 2종류의 이중특이성 항체는 모두 천연형 mIgG1과 동일한 결합 프로파일을 나타내었다. 구체적으로는, mFcgRI 및 mFcgRIV에는 결합하지 않고, mFcgRII 및 mFcgRIII에 대해서는 천연형 mIgG1과 비교하여 1.2배의 결합 활성을 나타내었다.
다음으로 참고예 4-4에 따라 mFcRn으로의 결합을 평가한 결과를 표 10에 나타낸다.
Figure 112016038698342-pct00010
제작한 2종류의 이중특이성 항체는 모두 mFcRn에 대해 천연형 mIgG1과 동등한 결합을 유지하고 있는 것이 나타내어졌다.
〔실시예 10〕세포상해활성의 측정
Fab-Arm Exchange에 의해 제작된 인간 IgG형 이중특이성 항체, 마우스 IgG형 이중특이성 항체가 기존의 수법에 의해 제작된 이중특이성 항체와 동등한 기능을 유지하고 있는지 여부를, 항인간 글리피칸 3 및 항인간 CD3의 이중특이성 항체에 의한 세포상해활성을 측정함으로써 평가하였다. 먼저 대조로서 Schaefer 등에 의해 보고되어 있는 CrossMab 기술(Proc Natl Acad Sci, 2011, 108, 11187-11192)에 의해 인간 IgG4의 불변영역을 갖는 항인간 GPC3/항인간 CD3 이중특이성 항체가 제작되었다. CrossMab 기술에 의해 제작된 본 분자는 WO2012/073985에 기재되어 있는 인간 GPC3에 대한 Fab의 VH 도메인과 VL 도메인이 치환된 분자가 되어 있다. 또한 항체 H쇄 불변영역에는 헤테로 회합을 촉진하기 위해 Knobs-into-Holes 기술을 사용하였다. Knobs-into-Holes 기술은 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(Knob;돌기)로 치환하고, 다른 한쪽 H쇄의 CH3영역에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(Hole;공극)로 치환함으로써 돌기가 공극 내에 배치되도록 하여 H쇄의 헤테로 이량화를 촉진하여 목적의 헤테로 이량화 항체를 효율적으로 취득할 수 있는 기술이다(Nature, 1994, 372, 379-383). 또한 FcgR에 대한 결합을 감약시키는 개변으로서 WO2011/108714에 기재되어 있는 개변이 사용되었다. 구체적으로는 EU 넘버링 234번째, 235번째, 297번째 아미노산 잔기를 Ala로 치환하는 개변이 도입되었다. 항체 H쇄의 C말단으로부터는 EU 넘버링 446번째 Gly 및 447번째 Lys를 제거하고, 이에 대해 추가로 항체 발현 후의 정제를 용이하게 하기 위해 항인간 GPC3측 H쇄의 C말단에 히스티딘 태그를, 항인간 CD3측 H쇄의 C말단에 FLAG 태그를 부가하였다. 이상의 개변을 도입한 항인간 GPC3측 H쇄로서 GC33(2)H-G4dKnHS(서열번호 61)가 제작되었다. 또한 항인간 CD3측 H쇄로서 rCE115H-G4dHlFS(서열번호 62)가 제작되었다. 항체 L쇄로서는 항인간 GPC3측으로서 GC33(2)L-k0(서열번호 63)를, 항인간 CD3측으로서 rCE115L-k0(서열번호 64)를 사용하였다. 이들 항체의 발현은 참고예 1에 따라 FreeStyle293 세포에서 일과성 발현시켰다. 얻어진 배양상청이 MabSelect SuRe 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 50 mM 초산에 의한 용출이 실시되었다. 항체를 포함하는 분획이 HisTrap HP 칼럼(GE Healthcare사) 또는 Ni Sepharose FF 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 당해 칼럼의 세정 후, 이미다졸에 의한 용출이 실시되었다. 항체를 포함하는 분획이 한외여과막으로 농축된 후, 농축액이 Superdex 200 칼럼(GE Healthcare사)에 첨가되고, 그 용출액 단량체의 항체만을 회수함으로써 정제 항체 GPC3 ERY22-rCE115가 얻어졌다.
다음으로 Fab Arm Exchange에 의해 인간 IgG1형, 인간 IgG4형, 마우스 IgG1형의 불변영역을 갖고, 가변영역이 항인간 GPC3/항인간 CD3인 이중특이성 항체가 제작되었다. 인간 IgG1형 및 인간 IgG4형의 H쇄 불변영역에는 Fab Arm Exchange용 개변을 포함하는 G1dP17, G1dN17, G1drP1, G1drN1, G4dP1, G4dN1에 대해 FcgR 결합 저감 개변으로서 EU 넘버링 235번째 아미노산 잔기를 Arg로 239번째 아미노산 잔기를 Lys로 치환하는 개변을 도입한 F760P17, F760N17, F760G1drP1, F760G1drN1, F760G4dP1, F760G4dN1이 각각 제작되었다. 마우스 IgG1형의 H쇄 불변영역에는 실시예 8에서 사용한 mIgG1mP4, mIgG1mN4에 대해 FcgR 결합 저감 개변으로서 EU 넘버링 235번째, 239번째 아미노산 잔기를 Lys로 치환하는 개변을 도입한 mF18mP4, mF18mN4가 제작되었다. 가변영역으로서는 WO2012/073985에 기재되어 있는 항인간 GPC3의 서열을 사용하여, H0000-F760N17(서열번호 65), H0000-F760G1drN1(서열번호 66), H0000-F760G4dN1(서열번호 67), H0000-mF18mN4(서열번호 68)가 제작되었다. 한편 인간 CD3측 H쇄로서 rCE115H-F760P17(서열번호 69), rCE115H-F760G1drP1(서열번호 70), rCE115H-F760G4dP1(서열번호 71), rCE115H-mF18mP4(서열번호 72)가 제작되었다. 인간 IgG1형 및 인간 IgG4형의 항체 L쇄로서는 항인간 GPC3측으로서 GL4-k0(서열번호 79)를, 항인간 CD3측으로서 rCE115L-k0(서열번호 64)를 공통으로 사용하였다. 또한 마우스 IgG1형의 항체 L쇄로서는 항인간 GPC3측으로서 GL4-mk1(서열번호 80)을, 항인간 CD3측으로서 rCE115L-mk1(서열번호 81)을 사용하였다. 이들 호모체를 참고예 1의 방법에 따라 발현, 정제하여 rCE115H-F760P17/rCE115L-k0, H0000-F760N17/GL4-k0, rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0, H0000-F760G1drN1/GL4-k0, rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0, H0000-F760G4dN1/GL4-k0, rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1, H0000-mF18mP4/GL4-mk1을 얻었다.
다음으로 얻어진 호모체 2종류를 아래에 나타내는 조합으로 혼합하고, FAE 반응을 일으켰다.
(1) rCE115H-F760P17/rCE115L-k0와 H0000-F760N17/GL4-k0
(2) rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0와 H0000-F760G1drN1/GL4-k0
(3) rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0와 H0000-F760G4dN1/GL4-k0
(4) rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1과 H0000-mF18mP4/GL4-mk1
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.36 ㎎/㎖, [2-MEA(Sigma)] = 25 mM, 37℃, 18시간.
반응 후의 산물을 PBS에 투석하고, 세포상해활성의 평가에 사용하였다.
세포상해활성의 평가는 참고예 6에 기재된 방법으로 실시되었다. 결과를 도 10-1, 도 10-2에 나타낸다.
도 10-1에 나타낸 바와 같이, 인간 IgG1형 및 인간 IgG4형의 Fab Arm Exchange로 제작된 이중특이성 항체는 모두 기존의 이중특이성 항체 제작기술로 제작된 대조 항체(GPC3 ERY22-rCE115)와 동등한 세포상해활성을 나타내었다. 또한 도 10-2에 나타낸 바와 같이, 마우스 IgG형 Fab Arm Exchange로 제작된 이중특이성 항체도 기존의 이중특이성 항체 제작기술로 제작된 대조 항체(GPC3 ERY22-rCE115)와 동등한 세포상해활성을 나타내었다.
〔실시예 11〕정상 마우스 PK 시험
(11-1) 정상 마우스를 사용한 인 비보(in vivo) 시험
인간 IgG형 및 마우스 IgG형 Fab Arm Exchange에 의해 제작된 항체가 기존의 수법에 의해 제작된 항체와 동등한 혈중 농도 추이를 나타내는지 여부에 대해서 정상 마우스를 사용한 in vivo 시험에 의해 평가하였다.
인간 IgG형 항체로서는 3종류의 항인간 글리피칸 3/항인간 CD3 이중특이성 항체：TR-G1drP1/N1, TR-G1dP17/N17, TR-G4dP1/N1을 인간 IgG형 Fab Arm Exchange에 의해 제작하였다. 또한 대조 항체로서는 가변영역은 상기와 동일하게 항인간 글리피칸 3/항인간 CD3를 갖고, 불변영역으로서는 MRAH-G1d(서열번호 3)의 EU 넘버링 118번째 Ala부터 시작되는 불변영역 G1d 및 MRAH-wtG4d(서열번호 5)의 EU 넘버링 118번째 Ala로부터 시작되는 불변영역 wtG4d에서 추가로 228번째 아미노산 잔기를 Ser에서 Pro로 치환하여 IgG1형의 힌지로 한 G4d에 대해 Knobs-into-Holes 개변(Nature, 1994, 372, 379-383)을 도입하여 제작한 이중특이성 항체 TR-G1dKiH, TR-G4dKiH를 사용하였다. 여기서 불변영역명 G1dKiH 및 G4dKiH란, 불변영역 G1d 또는 G4d에 대해 Knob 개변(349번째 아미노산 잔기를 Cys로, 366번째 아미노산 잔기를 Trp로 치환하는 개변)을 도입한 Knob쇄와, G1d 또는 G4d에 대해 Hole 개변(356번째 아미노산 잔기를 Cys로, 366번째 아미노산 잔기를 Ser로, 368번째 아미노산 잔기를 Ala로, 407번째 아미노산 잔기를 Val로 치환하는 개변)을 도입한 Hole쇄를 사용하여, 각각의 Knob쇄와 Hole쇄의 조합으로 발현된 불변영역을 나타낸다.
한편 마우스 IgG형 항체로서는 WO2009/125825에 기재되어 있는 항인간 IL-6 수용체 항체의 H쇄 가변영역인 H237의 서열을 갖고, 불변영역은 천연형 mIgG1의 서열인 H237-mIgG1(서열번호 73)에 대해, Fab-Arm Exchange용 개변을 도입한 H237-mIgG1mP3(서열번호 74), H237-mIgG1mN3(서열번호 75), H237-mIgG1mP4(서열번호 76), H237-mIgG1mN4(서열번호 77)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 항인간 IL-6 수용체 L쇄 가변영역인 L104의 서열을 사용하고, 이와 마우스 κ쇄의 불변영역인 mk1으로 이루어지는 L104-mk1(서열번호：78)을 사용하였다. 참고예 1의 방법에 따라 발현하여, H237-mIgG1mP3/L104-mk1, H237-mIgG1mN3/L104-mk1, H237-mIgG1mP4/L104-mk1, H237-mIgG1mN4/L104-mk1을 얻었다. 얻어진 호모체를 사용해서 Fab Arm Exchange를 행하여 SA-mIgG1mP3/mN3(H237-mIgG1mP3/L104-mk1과 H237-mIgG1mN3/L104-mk1의 조합), SA-mIgG1mP4/mN4(H237-mIgG1mP4/L104-mk1과 H237-mIgG1mN4/L104-mk1의 조합)를 얻었다. 또한 대조 항체로서는 H237-mIgG1과 L104-mk1을 사용하여 발현한 SA-mIgG1을 사용하였다.
Fab Arm Exchange는 모두 아래의 반응 조건에서 행하고, 반응 후 PBS에 투석하여 in vivo 시험에 사용하였다.
반응 조건：TBS(Takara, pH 7.6) 중 [각 mAb] = 0.225 ㎎/㎖, [2-MEA(Sigma)] = 25 mM, 37℃, 17시간.
정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 인간 IgG형 항인간 글리피칸 3/항인간 CD3 이중특이성 항체(TR-G1dKiH, TR-G1drP1/N1, TR-G1dP17/N17, TR-G4dKiH, TR-G4dP1/N1), 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체(SA-mIgG1, SA-mIgG1mP3/mN3 및 SA-mIgG1mP4/mN4)를 투여한 후의 각 항체의 체내동태를 평가하였다. 항체는 0.1 ㎎/mL로 조제된 것을 10 mL/㎏으로 꼬리정맥에 투여하였다. 항체 투여 후 5분, 2시간, 1일, 2일, 3일, 7일, 14일, 21일, 28일이 경과한 후에 당해 마우스로부터 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심 분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리한 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.
(11-2) ECLIA법에 의한 혈장 중 이중특이성 항체 농도의 측정
마우스 혈장 중의 이중특이성 항체 농도는 ECLIA법으로 측정되었다. 먼저 가용형 인간 글리피칸 3를 MULTI-ARRAY 96well Plate(Meso Scale Discovery)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 가용형 인간 글리피칸 3 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 ng/mL의 이중특이성 항체를 포함하는 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되었다. 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL가 각 웰에 분주된 가용형 인간 글리피칸 3 고상화 플레이트를 실온에서 2시간 교반시켰다. 계속해서 항인간 CD3 항체에 대한 토끼형 이디오타입 항체를 실온에서 1시간 교반시켰다. 그 후, Anti-Rabbit IgG-Sulfotag antibody(Meso Scale Discovery)를 실온에서 1시간 반응시키고, Read Buffer T(Meso Scale Discovery)를 첨가 후의 발광이 SECTOR Imager 2400(Meso Scale Discovery)으로 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항체 농도는 검량선의 발광 시그널로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 그 결과를 도 11에 나타내었다. 또한 PK 파라미터를 표 11에 나타낸다. 도 11 및 표 11에 나타내어진 결과로부터, 인간 IgG형 Fab Arm Exchange에 의해 제작된 이중특이성 항체는 모두 기존의 이중특이성 항체 제작기술인 Knobs-into-Holes 기술을 사용하여 제작된 대조 항체와 동등한 혈중 농도 추이를 나타내는 것이 명확해졌다.
Figure 112016038698342-pct00011
(11-3) ELISA법에 의한 혈장 중 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체 농도의 측정
마우스 혈장 중의 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체 농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 가용형 인간 IL-6 수용체를 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)에 분주하고, 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 가용형 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도로서 2.50, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156, 0.078, 0.039 ㎍/mL의 항인간 IL-6 수용체 마우스 항체를 포함하는 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정시료가 조제되었다. 이들 검량선 시료 및 혈장 측정시료 100 μL가 각 웰에 분주된 가용형 인간 IL-6 수용체 고상화 플레이트를 실온에서 2시간 교반시켰다. 그 후 Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody(SIGMA)를 실온에서 2시간 반응시킨 반응액의 발색반응이 TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용해서 행해졌다. 1N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 첨가함으로써 반응이 정지된 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 마이크로플레이트 리더로 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항체 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 그 결과를 도 12에 나타내고, 그의 항체 파라미터를 표 12에 나타낸다. 도 12 및 표 12에 나타내어진 결과로부터, 마우스 IgG형 Fab Arm Exchange로 제작된 항체는 천연형 mIgG1의 서열을 갖는 대조 항체와 동등한 혈중 농도 추이를 나타내는 것이 명확해졌다.
Figure 112016038698342-pct00012
〔참고예 1〕항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제
항체의 H쇄 및 L쇄의 염기서열을 코드하는 전장의 유전자의 합성은 Assemble PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 제작하였다. 아미노산 치환의 도입은 PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하였다. 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen사) 또는 FreeStyle293 세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore) 또는 0.45 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어) 또는 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
〔참고예 2〕이온 교환 크로마토그래피에 의한 이중특이성 항체 생성률의 평가
Priminence UFLC(시마즈 제작소)를 사용한 이온 교환 크로마토그래피 정제법에 있어서, 각 검체의 분리가 평가되었다. 이동상에는 25 mM MES 완충액, pH 5.0 및 500 mM의 염화나트륨을 포함하는 25 mM MES 완충액, pH 5.0를, 칼럼은 ProPac WCX-10(Thermo Scientific)을 사용하여 2액 혼합 그라디언트법에 의해 이중특이성 항체가 분리되었다. 데이터의 취득은 215 nm의 파장에서 실시하고, Empower2(Waters)를 사용하여 용출결과가 평가되었다.
이중특이성 항체 생성률(%)은 이중특이성 항체의 면적값을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적값으로 나누고, 100을 곱한 값을 사용하였다. 한쪽 호모체의 회수율이 나쁜 경우에는, 다른 한쪽 호모체 면적의 2배값을 이중특이성 항체의 면적값과 합친 값을 전 항체의 면적값으로서 계산하였다.
〔참고예 3〕Tm의 측정
CH3 도메인의 Tm의 측정은 Rotor-gene Q(QIAGEN)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하였다. 항체 농도 0.1 ㎎/mL, SYPRO orange 농도 10X concentrate로 혼합한 샘플을 30도에서 99도까지 승온하여 형광강도(여기파장 470 nm, 형광파장 555 nm)를 0.4도마다 측정하였다. 측정은 PBS(Sigma, pH 7.4) 중에서 행하였다. 해석은 Rotor-gene Q series software를 사용하여 행하고, 형광강도의 1차 미분에 의해 구한 변곡점을 Tm으로 하였다. MRAH의 Tm은 CH2가 70℃ 부근, Fab가 95℃ 부근, H54의 Tm은 CH2가 70℃ 부근, Fab가 90℃ 부근인 것을 이용하여 CH3 도메인의 Tm이 산출되었다.
〔참고예 4〕SPR에 의한 상호작용 해석
(4-1) FcγR의 조제방법 및 개변 항체와 FcγR의 상호작용 해석방법
FcγR의 세포외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcγR의 세포외 도메인의 유전자의 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 이때 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는, FcγRI에 대해서는 NCBI의 허가번호 NM_000566.3의 서열, FcγRIIa에 대해서는 NCBI의 허가번호 NM_001136219.1의 서열, FcγRIIb에 대해서는 NCBI의 허가번호 NM_004001.3의 서열, FcγRIIIa에 대해서는 NCBI의 허가번호 NM_001127593.1의 서열, FcγRIIIb에 대해서는 NCBI의 허가번호 NM_000570.3의 서열을 토대로 제작하고, C말단에 His 태그를 부여하였다. 또한 FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb에 대해서는 다형이 알려져 있는데, 다형 부위에 대해서는 FcγRIIa에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25, FcγRIIIa에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcγRIIIb에 대해서는 J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691을 참고로 하여 제작하였다.
얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질을 발현시켰다. 배양하고 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙에 따라 다음의 4스텝으로 정제하였다. 제1 스텝은 양이온 교환 칼럼크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제2 스텝은 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 스텝은 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 스텝은 무균 여과를 실시하였다. 단, FcγRI에 대해서는 제1 스텝에 Q sepharose FF를 사용한 음이온 교환 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
Biacore T100(GE 헬스케어), Biacore T200(GE 헬스케어), Biacore A100, Biacore 4000을 사용하여 각 개변 항체와 상기에서 조제한 Fcγ 수용체의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고, 측정 온도는 25℃로 하였다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어) 또는 Series S sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민 커플링법에 의해 항원 펩티드, Protein A(Thermo Scientific), Protein A/G(Thermo Scientific), Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)을 고정화한 칩 또는 Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해 둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩을 사용하였다.
이들 센서 칩에 목적의 항체를 챕쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 Fcγ 수용체를 상호작용시켜 항체에 대한 결합량을 측정하고 항체 간에 비교하였다. 단, Fcγ 수용체의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 Fcγ 수용체의 결합량을 나눈 보정값으로 비교하였다. 또한 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서 칩에 캡쳐한 항체를 세정하고, 센서 칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
또한 각 개변 항체의 FcγR에 대한 KD값을 산출하기 위해 속도론적인 해석은 아래의 방법으로 실시하였다. 먼저 상기 센서 칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝 버퍼로 희석한 Fcγ 수용체를 상호작용시켜, 얻어진 센서그램에 대해 Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
(4-2) FcRn의 조제방법 및 개변 항체와 FcRn의 상호작용 해석방법
FcRn은 FcRn과 β2-마이크로글로불린의 복합체이다. 공표되어 있는 인간 FcRn 유전자 서열을 토대로 올리고 DNA 프라이머를 조제하였다(J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81). 유전자 전체를 코드하는 DNA 단편은 조제한 프라이머 및 주형으로서 인간 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로서 사용하고, 시그널영역(Met1~Leu290)을 함유하는 세포외 도메인을 코드하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하여 포유동물 세포 발현 벡터에 삽입하였다. 마찬가지로 공표되어 있는 인간 β2-마이크로글로불린 유전자 서열(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002))을 토대로 올리고 DNA 프라이머를 조제하였다. 유전자 전체를 코드하는 DNA 단편은 조제한 프라이머 및 주형으로서 인간 cDNA(Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech)를 사용하여 PCR에 의해 조제하였다. 얻어진 DNA 단편을 주형으로서 사용하고, 시그널영역(Met1~Met119)을 함유하는 단백질 전체를 코드하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하여 포유동물 세포 발현 벡터에 삽입하였다.
가용형 인간 FcRn을 아래의 순서로 발현시켰다. 인간 FcRn(서열번호：30) 및 β2-마이크로글로불린(서열번호：31)을 발현시키기 위해 구축한 플라스미드를 PEI(Polyscience)를 사용한 리포펙션법에 의해 인간 태아 신장암 유래 세포주 HEK293H(Invitrogen)의 세포에 도입하였다. 얻어진 배양상청을 회수하고, IgG Sepharose 6 Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 정제한 후에 HiTrap Q HP(GE Healthcare)(J Immunol. 2002 Nov 1; 169(9): 5171-80)를 사용함으로써 FcRn을 추가로 정제하였다.
Biacore를 사용한 항체와 FcRn의 상호작용을 평가하는 측정 시스템으로서, J Immunol. 2009;182(12):7663-71.에 기재된 센서 칩으로 항체를 고정화하여 인간 FcRn을 애널라이트로 하는 시스템이 보고되어 있다. 그 목적을 위해 인간 FcRn을 참고예 4에 기재된 바와 같이 조제하였다. 본 시스템을 사용하여 Fv4-IgG1, Fv4-IgG1-v1 및 Fv4-IgG1-v2의 pH 6.0 및 pH 7.4에 있어서의 인간 FcRn으로의 결합 활성(해리상수 KD)의 평가를 행하였다. 피험물질인 항체는 Series S 센서 칩 CM5에 직접 고정화하여 시험에 제공하였다. 센서 칩으로의 항체의 고정화는 러닝 버퍼로서 50 mmol/L 인산나트륨/150 mmol/L NaCl, 0.05%(v/v%) Surfactant P20 pH 6.0을 사용하고, 아민 커플링 키트를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 고정화량 500RU를 목표로 실시하였다.
러닝 버퍼로서 50 mmol/L 인산나트륨/150 mmol/L NaCl, 0.05% Surfactant P20 pH 6.0, 또는 50 mmol/L 인산나트륨/150 mmol/L NaCl, 0.05% Surfactant P20 pH 7.4를 사용하여 제작한 센서 칩을 사용해서 측정을 실시하였다. 측정은 모두 25℃에서 행하였다. 인간 FcRn 희석액과 러닝 버퍼(대조 용액으로서)를 유속 5 μL/min로 10분간 인젝트하고, 센서 칩 상의 항체에 인간 FcRn을 상호작용시켰다. 그 후 유속 5 μL/min로 1분간 러닝 버퍼를 흘리고 FcRn의 해리를 관찰한 후, 20 mmol/L Tris-HCl/150 mmol/L NaCl, pH 8.1을 유속 30 μL/min로 15초간 인젝트를 2회 반복해서 센서 칩을 재생하였다.
또한 각 개변 항체의 FcRn에 대한 KD값을 산출하기 위해 속도론적인 해석은 아래의 방법에 따라 실시하였다. 먼저, 상기 센서 칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝 버퍼로 희석한 FcRn을 상호작용시켜, 얻어진 센서그램에 대해 Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
(4-3) mFcγR의 조제방법 및 개변 항체와 mFcγR의 상호작용 해석방법
마우스의 FcγR의 세포외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcγR의 세포외 도메인의 유전자의 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 이때, 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는, mFcγRI에 대해서는 NCBI Reference Sequence: NP_034316.1, mFcγRII에 대해서는 NCBI Reference Sequence: NP_034317.1, mFcγRIII에 대해서는 NCBI Reference Sequence: NP_034318.2, mFcγRIV에 대해서는 NCBI Reference Sequence: NP_653142.2의 서열을 토대로 제작하고, C말단에 His 태그를 부가하였다.
얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙에 따라 다음의 4스텝으로 정제하였다. 제1 스텝은 이온 교환 칼럼크로마토그래피, 제2 스텝은 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 스텝은 겔 여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 스텝은 무균 여과를 실시하였다. 제1 스텝의 이온 교환 칼럼크로마토그래피에 대해서 mFcγRI는 Q Sepharose HP, mFcγRII 및 mFcγRIV는 SP Sepharose FF, mFcγRIII는 SP Sepharose HP를 사용하였다. 또한 제3 스텝 이후에서 사용한 용매는 D-PBS(-)로 하였으나, mFcγRIII에 대해서는 0.1M Arginine을 포함하는 D-PBS(-)로 하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
Biacore T100(GE 헬스케어), Biacore T200(GE 헬스케어), Biacore A100, Biacore 4000을 사용하여 각 개변 항체와 상기에서 조제한 Fcγ 수용체의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고, 측정 온도는 25℃로 하였다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어) 또는 Series S sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민 커플링법에 의해 항원 펩티드, Protein A(Thermo Scientific), Protein A/G(Thermo Scientific), Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)을 고정화한 칩 또는 Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해 둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩을 사용하였다.
이들 센서 칩에 목적의 항체를 챕쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 FcγR을 상호작용시켜 항체에 대한 결합량을 측정하고 항체 간에 비교하였다. 단, FcγR의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 FcγR의 결합량을 나눈 보정값으로 비교하였다. 또한 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서 칩에 캡쳐한 항체를 세정하고, 센서 칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
또한 각 개변 항체의 FcγR에 대한 KD값을 산출하기 위해 속도론적인 해석은 아래의 방법에 따라 실시하였다. 먼저 상기 센서 칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝 버퍼로 희석한 FcγR을 상호작용시켜, 얻어진 센서그램에 대해 Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
(4-4) mFcRn의 조제방법 및 개변 항체와 mFcRn의 상호작용 해석방법
Biacore T100, Biacore T200, Biacore A100, Biacore 4000(GE Healthcare)을 사용하여 마우스 FcRn과 항체의 속도론적 해석을 행하였다. 센서 칩 CM4(GE Healthcare) 상에 아민 커플링법으로 프로테인 L(ACTIGEN)을 적당량 고정화하고, 거기에 목적의 항체를 포착시켰다. 다음으로 FcRn 희석액과 러닝 버퍼(대조 용액으로서)를 인젝트하고, 센서 칩 상에 포착시킨 항체에 마우스 FcRn을 상호작용시켰다. 러닝 버퍼에는 50 mmol/L 인산나트륨, 150 mmol/L NaCl, 0.05% (w/v) Tween20, pH 6.0을 사용하고, FcRn의 희석에도 각각의 버퍼를 사용하였다. 칩의 재생에는 10 mmol/L 글리신-HCl, pH 1.5를 사용하였다. 측정은 모두 25℃에서 실시하였다. 측정으로 얻어진 센서그램으로부터 키네틱스 파라미터인 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값을 토대로 각 항체의 마우스 FcRn에 대한 KD(M)를 산출하였다. 각 파라미터의 산출에는 Biacore Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하였다.
〔참고예 5〕CE-IEF
CE-IEF의 측정은 PA800 Plus(Beckman Coulter)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하였다. Pharmalyte는 broad range가 5-8과 8-10.5인 것을 등량 혼합하여 pI range 5-10.5에서 분석을 행하였다. 4 ㎎/mL의 항체용액을 사용하여 분석하고, 결과는 32 karat software(Beckman Coulter)를 사용하여 해석하였다. 이중특이성 항체 생성률(%)은 이중특이성 항체의 면적값을 시스템 중에 존재하는 전 항체의 면적값으로 나누고, 100을 곱한 값을 사용하였다.
〔참고예 6〕세포상해활성의 측정
(6-1) 인간 말초혈 단핵구(PBMC)용액의 조제
1,000 단위/mL의 헤파린용액(노보·헤파린 주사 5천 단위，노보·노르디스크사)을 사전에 100 μL 주입한 주사기를 사용하여, 건강한 정상인 자원봉사자(성인)로부터 말초혈 50 mL가 채취되었다. PBS(-)로 2배 희석한 후에 4등분된 말초혈이 15 mL의 Ficoll-Paque PLUS를 사전에 주입하여 원심조작이 행해진 Leucosep 림프구 분리관(Cat. No. 227290, Greiner bio-one사)에 첨가되었다. 당해 분리관의 원심분리(2,150 rpm, 10분간, 실온) 후 단핵구 분획층이 분취되었다. 10% FBS를 포함하는 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(SIGMA사, 이하 10% FBS/D-MEM)로 1회 단핵구 분획의 세포가 세정된 후, 당해 세포는 10% FBS/D-MEM을 사용하여 그 세포밀도가 4×106 cells/mL로 조제되었다. 이와 같이 조제된 세포용액이 인간 PBMC용액으로서 이후의 시험에 사용되었다.
(6-2) 세포상해활성의 측정
세포상해활성은 xCELLigence 실시간 셀 애널라이저(료슈 다이아그노스틱스사)를 사용한 세포 증식 억제율로 평가되었다. 표적 세포에는 SK-HEP-1 세포주에 인간 GPC3를 강제 발현시켜 수립한 SK-pca13a 세포주가 사용되었다. SK-pca13a를 접시로부터 박리하여 1×104 cells/well이 되도록 E-Plate 96(료슈 다이아그노스틱스사) 플레이트에 100 μL/well로 뿌리고, xCELLigence 실시간 셀 애널라이저를 사용하여 생세포의 측정이 개시되었다. 다음날 xCELLigence 실시간 셀 애널라이저로부터 플레이트를 꺼내, 당해 플레이트에 각 농도(0.004, 0.04, 0.4, 4 ㎍/㎖)로 조제한 각 항체 50 μL가 첨가되었다. 실온에서 15분간 반응시킨 후에 (6-1)에서 조제된 인간 PBMC용액 50 μL(2×104 cells/well)가 첨가되고, xCELLigence 실시간 셀 애널라이저에 당해 플레이트를 재세팅함으로써 생세포의 측정이 개시되었다. 반응은 5% 탄산가스, 37℃ 조건하에서 행해지고, 인간 PBMC 첨가 72시간 후의 Cell Index값으로부터, 하기 식에 의해 세포 증식 억제율(%)이 구해졌다. 또한 계산에 사용한 Cell Index값은 항체 첨가 직전의 Cell Index값이 1이 되도록 정규화한 후의 수치가 사용되었다.
세포 증식 억제율(%)＝(A-B)×100/(A-1)
A는 항체를 첨가하지 않은 웰에 있어서의 Cell Index값의 평균값(표적 세포와 인간 PBMC만), B는 각 웰에 있어서의 Cell Index값의 평균값을 나타낸다.
본 발명의 방법을 사용함으로써 환원 조건하에 있어서 종래 기술보다 높은 효율로 이중특이성 항체를 제작하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> METHOD FOR PRODUCING POLYPEPTIDE HETEROMULTIMERS <130> C1-A1307P <150> JP 2013-200845 <151> 2013-09-27 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Arg Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Val Thr Met Leu Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 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Lys 325 330 335 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 340 345 350 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 355 360 365 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 370 375 380 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 385 390 395 400 Phe Val Tyr Ser Glu Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 405 410 415 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 420 425 430 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 78 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 78 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Thr Asp Ile Ser Ser His 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Gly Ser His Leu Leu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly Asn Arg Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 79 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 79 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 80 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 80 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 81 <211> 219 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> An artificially synthesized sequence <400> 81 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Met Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Ile Gln Lys Pro Ser Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Pro Asp Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

Claims (23)

  1. a) 제1 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제1 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
    b) 상기 제1 항원 결합 활성과 다른 제2 항원 결합 활성을 갖고, Fc영역을 포함하는 제2 폴리펩티드의 호모체를 제공하는 단계,
    c) 힌지영역 내의 시스테인이 디설피드 결합의 이성화를 일으키는 것을 가능하게 하는 환원 조건하에서, 상기 제1 폴리펩티드의 호모체 및 상기 제2 폴리펩티드의 호모체를 함께 인큐베이트하는 단계, 및
    d) 제1 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 이종 다량체를 얻는 단계
    를 포함하고,
    상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서,
    (1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
    (2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
    (3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
    에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 가지며,
    상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역 및 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역 양쪽에 있어서, 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 같은 조의 아미노산 잔기가 각각 동종의 전하를 갖는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기가 상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖고,
    상기 제1 및 제2 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 397번 위치의 아미노산이 Met(M), Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있고,
    상기 제1 및 제2 폴리펩티드의 Fc영역이 인간 IgG1 또는 IgG4 타입인
    이종 다량체를 제조하기 위한 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    제1항의 단계 a)에 있어서 제1 폴리펩티드와 다량체를 형성하는 제3 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하고, 또한 단계 b)에 있어서 제2 폴리펩티드와 다량체를 형성하는 제4 폴리펩티드를 제공하는 단계를 포함하는 제조방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기가 아래의 (A) 또는 (B) 중 어느 하나의 군에 포함되는 하나 이상의 아미노산 잔기로부터 선택되는 제조방법：
    (A) 글루타민산(E), 아스파라긴산(D)；
    (B) 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H).
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 및 제2 폴리펩티드에 있어서 각각 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기의 조가 아래의 (1)~(4) 중 어느 한 조의 아미노산 잔기의 조인 제조방법：
    (1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
    (2) EU 넘버링에 의한 357번 위치 및 370번 위치의 아미노산 잔기
    (3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
    (4) (i) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기, 및
    (ii) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 및 제2 폴리펩티드에 있어서 각각 동종의 전하를 갖는 아미노산 잔기의 조가 아래의 조의 아미노산 잔기의 조인 제조방법：
    (i) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기, 및
    (ii) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 CH3영역의 안정성이 불안정해지도록 아미노산이 개변되어 있는 제조방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서,
    (1) EU 넘버링에 의한 356번 위치 및 439번 위치의 아미노산 잔기
    (2) EU 넘버링에 의한 360번 위치 및 371번 위치의 아미노산 잔기
    (3) EU 넘버링에 의한 399번 위치 및 409번 위치의 아미노산 잔기
    에 나타내는 아미노산 잔기의 조로부터 선택되는 1조 내지 3조의 아미노산 잔기가 동종의 전하를 갖고,
    상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역 및 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역 양쪽에 있어서, 상기 (1)~(3)에 나타내는 아미노산 잔기의 조 중 같은 조의 아미노산 잔기가 각각 동종의 전하를 갖는 경우, 상기 제2 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기가 상기 제1 폴리펩티드의 CH3영역에 있어서의 당해 조의 아미노산 잔기와는 반대의 전하를 갖는
    이종 다량체를 제조하기 위한 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 제1 및/또는 제2 폴리펩티드의 Fc영역에 포함되는 CH3영역에 있어서의 EU 넘버링에 의한 392번 위치의 아미노산이 개변되어 있는 제조방법.
  12. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 폴리펩티드에 있어서
    EU 넘버링에 의한 392번 위치가 Asp(D), Glu(E), Thr(T), Val(V) 또는 Ile(I)로 개변되어 있는
    제조방법.
  13. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    제1 및 제2 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있는 제조방법.
  14. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    제1 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 356번 위치가 Lys(K)로 개변되어 있고, 또한 EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있으며, 제2 폴리펩티드에 있어서 EU 넘버링에 의한 397번 위치가 Phe(F) 또는 Tyr(Y)로 개변되어 있고, 또한 EU 넘버링에 의한 439번 위치가 Glu(E)로 개변되어 있는 제조방법.
  15. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    상기 단계 a) 및 b)가 제1 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주와 제2 폴리펩티드의 호모체를 생산하는 세포주를 혼합함으로써 실시되고, 상기 단계 c)가 당해 배양상청 중에서 실시되는 제조방법.
  16. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    상기 이종 다량체가 다중특이성 항체 또는 헤테로 Fc 융합 단백질인 제조방법.
  17. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    상기 이종 다량체가 이중특이성 항체인 제조방법.
  18. 제1항 또는 제11항에 있어서,
    단계 c)가 환원제와의 접촉을 포함하는 제조방법.
  19. 제18항에 있어서,
    단계 c)가 글루타티온, L-시스테인, 디티오트레이톨, β-메르캅토-에탄올, TCEP 및 2-MEA로 이루어진 군으로부터 선택되는 작용물질의 첨가를 포함하는 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    단계 c)가 글루타티온, 2-MEA로부터 선택되는 작용물질의 첨가를 포함하는 제조방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
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