DE69636015T2

DE69636015T2 - Bispezifische antikörper in denen die bindungsfähigkeit durch eine mittels licht spaltbare gruppe reversibel inhibiert wird

Info

Publication number: DE69636015T2
Application number: DE69636015T
Authority: DE
Inventors: Colin H. Ponteland SELF
Original assignee: BIOENHANCEMENTSMENTS Ltd
Current assignee: BIOENHANCEMENTSMENTS Ltd
Priority date: 1995-05-03
Filing date: 1996-05-02
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2016-05-03
Also published as: WO1996034892A1; JPH11505108A; EP0871673B1; DE69636015D1; EP0871673A1; AU5509296A; JP4212111B2

Description

Diese Erfindung betrifft Antikörper, die reversibel inhibiert sind, deren Herstellung und Verwendung.
Es wurde gezeigt, dass bestimmte Proteine von leichten labilen Gruppierungen kovalent gebunden werden können, sodass die Proteine von der Expression ihrer biologischen Aktivität abgehalten werden, bis die leichten labilen Gruppierungen durch Bestrahlung abgespalten werden (siehe beispielsweise S. Thompson et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 201, 1213-1219 (1994), und S. Thompson et al., Biochemical Society Transactions 255S, 23 (1995).
Baxter et al. (Cancer Res. 52, 5838-5844 (1992)) beschreiben die Verwendung von bispezifischen Antikörpern zur Behandlung von Krebs.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Antikörper zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren bereit, worin

(a) der Antikörper mit einem Element eines Bindungspaars markiert ist, das aus einem Liganden und einem Rezeptor besteht, sodass der Antikörper in der Lage ist, sich an das andere Element des Bindungspaars zu binden, wenn an der Oberfläche einer Targetzelle vorhanden, die wünschenswerterweise zu entfernen ist, und
(b) der Antikörper in der Lage ist, sich an ein Enzym, das in der Lage ist, ein Prodrug eines zytotoxischen Wirkstoffs zum zytotoxischen Wirkstoff umzusetzen, oder an eine Zelle des Immunsystems, die die Targetzelle töten kann, zu binden; worin die Bindung des Antikörpers an das Enzym oder die Zelle des Immunsystems durch die Gegenwart einer photospaltbaren Gruppierung reversibel inhibiert ist.

Die Erfindung stellt ferner einen bispezifischen Antikörper zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren bereit, worin der bispezifische Antikörper in der Lage ist,

(a) an eine Targetzelle, die wünschenswerterweise zu entfernen ist; und
(b) an ein Virus zu binden;

Die Erfindung stellt ferner ein Set zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren bereit, umfassend:

(i) eine Zelle, die ein Träger eines zytotoxischen Mittels, eines radioaktiven Isotops, eines Toxins, eines Virus oder von Bor ist; und
(ii) einen Antikörper, der in der Lage ist, sich (a) an ein Element eines Bindungspaares zu binden, das aus einem Liganden oder einem Rezeptor an der Oberfläche einer Targetzelle besteht, die wünschenswerterweise zu entfernen ist; und (b) an die Zelle zu binden, die ein Träger eines zytotoxischen Mittels, eines radioaktiven Isotops, eines Toxins, eines Virus oder von Bor ist;

Die in dieser Erfindung verwendeten Antikörper können polyklonal oder monoklonal erhalten werden.
Die Bezeichnung "Element eines Bindungspaars" bezieht sich auf ein Element eines Paars von Einheiten, die sich aneinander binden, wenn sie in Kontakt miteinander gebracht werden. Fachleute wird bekannt sein, dass übliche und besonders nützliche Bindungspaare Antikörper-Antigen-Paare und Liganden-Rezeptor-Paare sind. Zahlreiche Rezeptoren sind bekannt, an die sich Liganden binden. Somit kann der Antikörper dieser Erfindung mit einem Rezeptor markiert sein oder, was üblicher ist, mit einem Liganden markiert sein, der sich an einen Rezeptor bindet; er kann beispielsweise mit einem Hormon markiert sein, das sich an einen Hormonrezeptor bindet. Eine Liste von Rezeptoren und Liganden ist nachstehend angeführt.
Der Antikörper kann sich an ein Element eines Bindungspaars binden, weil er ein Antikörper gegen dieses Element eines Bindungspaars ist oder weil er mit dem anderen Element des Bindungspaars markiert ist. Somit kann sich beispielsweise ein Antikörper, der mit Östradiol markiert ist, an Östradiolrezeptoren an einer Zelle binden.
Die geeignetsten Elemente eines in Betracht gezogenen Bindungspaars sind zellgebundene Rezeptoren, wie z.B. Tumormarker.
In einer bevorzugten Klasse weist der Antikörper zwei aktive Zentren auf. Dies kann auf beliebige geeignete Weise erreicht werden, es wird jedoch zur Zeit als am besten erachtet, Komponenten von zwei Antikörpern zu verbinden, die gegen zwei verschiedene Epitope erzeugt wurden. Der resultierende Antikörper wird hierin häufig als bispezifischer Antikörper bezeichnet. Auch wenn dieser Typ von Antikörper normalerweise zwei Spezifitäten aufweist, werden auch mehr als zwei in Betracht gezogen, wenn dies auch weniger bevorzugt ist.
Jede Antikörperkomponente kann das ganze Immunglobulin (z.B. IgG) oder, was noch besser geeignet ist, ein Teil davon sein, der die aktive Stelle beibehält, jedoch frei von der Fc-Region ist, beispielsweise ein Fab oder Fab'₂.
In bestimmten Aspekten verwendet diese Erfindung ein Enzym, das in der Lage ist, ein zytotoxisches Mittel aus einem weniger zytotoxischen Mittel zu bilden. Das Enzym und Prodrug sind vorteilhafterweise jene, die dafür bekannt sind, für die Verwendung in ADEPT (Antikörper-gesteuerte Enzym-Prodrug-Therapie) geeignet zu sein (siehe z.B. New Antibody Technology and the Emergence of Useful Cancer Therapy, Richard Begent & Anne Hamblin (Hrsg.), Royal Society of Medicine Press, v.a. 75–77).
Solche Enzyme sind Fachleuten durchwegs bekannt und umfassen:

1. Phosphatase (insbesondere alkalische Phosphatase), die verwendet werden kann, um weniger zytotoxische phosphorylierte Prodrugs zu Wirkstoffen umzusetzen, beispielsweise können Etoposidphosphat, Mitomycinphosphat und Doxorubicinphosphat dephosphoryliert werden, um Etoposid, Mitomycin und Doxorubicin zu ergeben.
2. Carboxypeptidase (insbesondere G2), die in der Lage ist, Glutaminsäurereste von Prodrugs zu entfernen, in denen ein Glutaminsäurerest zur Deaktivierung des Wirkstoffs verwendet wird.
3. β-Glucosidase, die verwendet werden kann, um Cyanid aus Amygdalin zu bilden.
4. β-Lactamasen (insbesondere Penicillinase und Cephalosporinase) können verwendet werden, um durch Hydrolyse des β-Lactamrings eines Prodrugs, in dem der Wirkstoff an Cephalosporin gebunden ist, Vinblastin oder DAVLBHYD zu bilden.
5. Amidase, etwa eine Penicillinamidase, wie z.B. Phenoxymethylpenicillinamidase, die Melphalan oder Doxorubicin aus ihren Acetamid-, z.B. Phenoxyacetamid-Derivaten erzeugen kann.
6. Cytosindeaminase, die 5-Fluorocytosin zu 5-Fluoruracil umsetzen kann.
7. Nitroreductase (insbesondere aus E. coli), die CB 1954 zu einem aktiven Alkylierungsmittelumsetzt.

Es wird bekannt sein, dass bei der Anwendung dieser Erfindung je nach Wunsch Enzyme mit einer oder mehr als einer Bindungsstelle verwendet werden können.
Auf dem Gebiet der Erfindung gibt es unzählige Verweise auf Targetzellen und die Marker, die sie enthalten, gegen die Antikörper gezüchtet werden können. Da solche Zellen und Marker sowie das Verfahren zum Züchten von Antikörpern allgemein bekannt sind, stellen sie als solche keinen Teil dieser Erfindung dar. Es gilt jedoch anzumerken, dass das bei menschlichem Kolorektalkrebs gefundene karzinoembryonale Antigen monoklonale Antikörper, wie z.B. YPC2/12.1, aufwies, die gegen sie durch Immunisierung mit einem 108KD-Glykoprotein mittels Standardverfahren gezüchtet wurden. Auch wurden bereits Antikörper gegen das allgemeine Leukozyten-Antigen CD45, das in Lymphomen zu finden ist, und gegen Cytokeratine, die von Karzinomzellen exprimiert werden und beispielsweise in Drainage-Lymphknoten von Patienten mit Brustkarzinom gefunden wurden, gezüchtet.
Andere Zelltumormarker umfassen (i) Viren: CBV und HPV, (ii) mutierte oder veränderte Gene: ras, p53, Connexin 37, Rasterverschiebungsmutationen; (iii) von Natur aus stumme Gene: MAGE (Melanom); (iv) unpreduliert: PEM (MUCI-Produkt); verschiedene Antigene: Tyrosinasen, Melan. Mart 1, gp 100, c-erb B2, CEA, HER2, EGFR, CA125, Antikörper aus B-Zell-Lymphomen, T-Zell-Rezeptoren.
Folgendes sollte auch in Betracht gezogen werden: (i) hinsichtlich Anti-CEA, beispielsweise bei Kolorektalkrebsarten, siehe J. Natl. Cancer Inst. 81, 688–696 (1989), und Cancer Immun. Immunother. 25, 10–15 (1987), Cancer Res. 45 5769–5780 (1985), Cancer 63, 1343–1352 (1989); (ii) Anti-C14 (LeY), Ten Feizi, Biosci. Rep. 3, 163–170 (1993); (iii) Anti-791T/36 (TAG 72gp), J. Cancer 43, 6153–6160 (1989), Cancer Res. 46, 5524–5528 (1986), Cancer Res. 49, 6153–6160 (1989) (Xoma); (iv) Anti-CEA (CEM 231), J. Immunol. 141, 1053, 4060 (1988); (v) Anti-TAG 72 (CC49), Cancer Res. 48, 4583–4596 (1988), 50, 1291–1298 (1990), 51, 2965–2972 (1991), 46, 2325–2338 (1986); (vi) Anti-KS1/4, Cancer Res. 50, 3540–3544 (1990), 44, 681–687 (1984), Cancer Immun. Immunther. 28, 171–178; (vii) MAbB3, Cancer Res. 51, 3781–3787; (viii) C242, J. Clin. Invest. 90, 405–411 (1992); (ix) P-Glycoprotein, PNAS 83, 7785–7789 (1986), Cancer Res. 48, 1926–1929 (1988); und (x) die erwähnten Antikörper gegen u.a. Kolorektal-, Magen- und Ovarialkrebsarten, erwähnt in J. Natl. Cancer Inst. 81, 688–696 (1989).
Die Bezeichnung "photospaltbare Gruppierung" bezeichnet jegliches an den Antikörper gebundene Mittel, das bei Aussetzung gegenüber elektromagnetischer Energie, wie z.B. Lichtenergie beliebiger Art, unabhängig davon, ob sichtbar, UV, Röntgen oder dergleichen (z.B. Mikrowellen), entfernt werden kann.
Geeignete photospaltbare Gruppierungen sind auf dem Gebiet der Erfindung durchwegs bekannt und werden beispielsweise in Biological Applications of Photochemical Switches, H. Morrison (Hrsg.), Bioorganic Photochemistry Series, Bd. 2, J. Wiley & Sons, insbesondere Kapitel 1, Abschnitt 4, 34–50, erwähnt.
Welche photospaltbare Gruppierung verwendet wird, kann im Großen und Ganzen beliebig ausgewählt werden, es wurde jedoch erkannt, dass es besonders einfach ist, ein Reagens zu verwenden, das sich an Hydroxy- oder Amino-Reste bindet, die im Antikörper vorhanden sind. Somit können Phosgen, Diphosgen, DCCI oder dergleichen verwendet werden, um photospaltbare Ester, Amide, Carbonate und dergleichen ausgehend von einem breiten Bereich an Alkoholen zu bilden. Im Allgemeinen werden solche verwendet, die mit Arylalkanolen substituiert sind, insbesondere Nitrophenylmethylalkohol, 1-Nitrophenylethan-1-ol und substituierte Analoga. Die Verfahren der Publikationen von S. Thompson et al., auf die bereits oben Bezug genommen wurde, können eingesetzt werden. Im Allgemeinen findet das Ummanteln des Antikörpers in wässriger Lösung bei Umgebungstemperatur statt. Co-Lösungsmittel, wie z.B. Dioxan, können, sofern erwünscht, verwendet werden. Die Chemie ist dem Fachmann, der Makromoleküle wie z.B. Antikörper derivatisiert, vertraut. Die in der oben genannten, hierin aufgenommenen Veröffentlichung genannten Verweise können auf Wunsch konsultiert werden.
Bei der Behandlung von Tumoren unter Verwendung eines Prodrugs wird ein Antikörper, der in der Lage ist, sich an die Tumorzelle und an ein geeignetes Analogon zu binden, der Person verabreicht und bestrahlt, das Enzym (sofern kein endogenes Enzym zu verwenden ist) wird der Person verabreicht, und das Prodrug wird verabreicht (das in vivo zum stärker zytotoxischen Wirkstoff umgesetzt wird).
Der Antikörper wird normalerweise nicht vor der Verabreichung und der Verteilung im Körper bestrahlt, beispielsweise 2 h bis 10 Tage nach Verabreichung, beispielsweise zwischen den Tagen 1 und 8, z.B. an Tag 3 oder 4.
Die Verabreichung des Enzyms erfolgt normalerweise etwa zum Zeitpunkt der Bestrahlung, entweder kurz davor, gleichzeitig oder kurz danach, beispielsweise innerhalb von 2 h Bestrahlung. Das Prodrug wird normalerweise nicht vor der Bestrahlung verabreicht, beispielsweise 2 h bis 7 Tage danach, z.B. an Tag 1 oder 4. Die Zeitverzögerungen nach der Verabreichung des Antikörpers und des Enzyms ermöglichen die Clearance von unerwünschtem maskiertem Material aus anderen Körperteilen. Die Verzögerungen können weggelassen werden, dies wird zur Zeit jedoch nicht als bevorzugt erachtet.
Die zu bestrahlenden Bereiche werden dort gewählt werden, wo der Tumor liegt oder wo eine Stelle einem Risiko ausgesetzt ist (wie etwa ein benachbarter Lymphknoten). Am geeignetsten ist der zu behandelnde Tumor einer, der aufgrund seiner Lage leicht bestrahlt werden kann, beispielsweise einer, der neben einem Bereich liegt, der mittels einer geeigneten Lichtenergiequelle direkt oder über einen Lichtleiter wie eine optische Faser erreichbar ist. Somit sind Tumoren, die in der Lunge, im Magen-Darm-Trakt, in den Harnwegen, Hoden, Ovarien und in Körperhöhlen auftreten, besonders geeignete Stellen. Tumoren in Organen wie z.B. Lunge, Magen, Darm und Prostata sind leicht bestrahlbar, ohne in den Körper eindringen zu müssen, während andere Bereiche, wie z.B. die Leber und die Nieren, über minimal invasive chirurgische Verfahren zugänglich sind, sofern sichtbares oder UV-Licht (wie z.B. UV-A) verwendet wird. Die Verwendung von Röntgenstrahlen ermöglicht auch die Behandlung von lichtundurchlässigem Gewebe.
Da das weniger toxische Prodrug nur an der Stelle des zu behandelten Tumors in den aktiven zytotoxischen Wirkstoff umgewandelt wird, ermöglicht diese Erfindung, dass das kanzerogene Gewebe mit weniger toxischen Wirkungen behandelt wird, als dies der Fall sein würde, wenn eine wirksame Menge an zytotoxischem Wirkstoff verabreicht werden würde.
In dieser Erfindung kann die photospaltbare Gruppierung am oder nahe am aktiven Zentrum des Antikörpers liegen. Dies kann durch Inkorporation einer einzelnen Gruppierung an einem aktiven Zentrum, beispielsweise durch die Verfahren von P. Mendel et al., J. Am. Chem. Soc. 113, 275–2760 (1991), erreicht werden.
Vorzugsweise kann die photospaltbare Gruppierung durch Beschichten des Antikörpers mit einer oder üblicherweise mehr als einer solcher Gruppierungen in den Antikörper eingebaut werden. Geeignete Verfahren umfassen jene der Publikationen von S. Thompson et al., auf die bereits an anderer Stelle Bezug genommen wurde. Somit sind bevorzugte Antikörper (einschließlich Fragmente) dieser Erfindung jene, die mehr als eine photospaltbare Gruppierung enthalten, z.B. 2–25, noch geeigneter 3–15, beispielsweise 4–8. Ist nur eine solche Gruppierung eingebunden, so ist dies im Allgemeinen am aktiven Zentrum.
Bispezifische Antikörper, wie sie in dieser Erfindung verwendet werden, können aus einzelnen Antikörpern, oder vorzugsweise aus den Fab- oder Fab¹2-Fragmenten der einzelnen Antikörper, mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Die Antikörper, wie sie in dieser Erfindung verwendet werden, die auch einen Liganden umfassen, können durch Markieren des Antikörpers mit dem Liganden, entweder bevor oder nachdem die photospaltbare Gruppierung an den Antikörper gebunden wurde, hergestellt werden.
In diesen Fällen, in denen nur die relevante Bindungsstelle durch Beschichten beeinflusst werden kann, kann das Beschichtungsverfahren dann am Antikörper durchgeführt werden. (Dies kann erfolgen, wenn andere reaktive Stellen nicht vorhanden sind oder wenn sie geschützt sind, beispielsweise durch Absorption an einer Immunabsorptionssäule). Im üblicheren Fall, in dem das Beschichten beispielsweise die andere Antikörperkomponente des bispezifischen Antikörpers beeinflussen könnte, wird das Beschichten am besten an einer Komponente vor erfolgter Bindung zur Bildung des bispezifischen Antikörpers durchgeführt.
Der bispezifische Antikörper kann dann durch Binden der ersten Antikörperkomponente an die reversibel inhibierte zweite Antikörperkomponente auf eine Weise, die auf dem Gebiet der Erfindung zur Herstellung bifunktioneller Antikörper bekannt ist, hergestellt werden. Siehe beispielsweise die Offenbarungen bezüglich der Herstellung bifunktioneller Antikörper in "Monoclonal Antibodies, Production, Engineering in Clinical Applications", Postgraduate Medical Science, Man A. Ritter & Heather M. Ladyman (Hrsg.), Cambridge University Press, ISBN 0521473543 (1995); insbesondere den Abschnitt von S. Songsivilai & P. J. Lachmann, 121–135.
Die Position spezifischer biologischer Zellen ist sowohl für Lebenssysteme als auch für industrielle Verarbeitungsprozesse maßgeblich. Körperabwehrmechanismen beispielsweise arbeiten über die Anordnung spezifischer Zellen wie z.B. T-Zellen, polymorphkerniger Zellen, Makrophagen usw. an Stellen, an denen fremde Mittel oder anormale Zellen identifiziert werden. Großes Interesse wurde an der Entwicklung von Mitteln zur Steigerung der Anziehung von Zellen an solche Stellen, insbesondere wenn es sich bei den anormalen Zellen um Tumorzellen oder infizierte Zellen wie z.B. Zellen, die mit dem Immunschwächevirus infiziert sind, handelt, gezeigt (Berg et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88(11), 4723–4727 (1991)). Liganden, wie z.B. Steroide und andere Substanzen, die Zellmembranen, Rezeptoren, Enzyme, Adhäsionsmoleküle, Nucleinsäuren und Antikörper binden, sind alle Klassen von Substanzen, die für eine derartige Zelllokalisierung verwendet werden können.
Bispezifische Reagenzien, die eine Affinität sowohl für die Stelle als auch für die an der Stelle zu lokalisierende Zelle aufweisen, können aus diesen spezifischen Kombinationspartnern hergestellt werden. Tatsächlich wurden spezifische Kombinationsfähigkeiten von spezifischen Antikörpern gegen Tumorzellen einerseits und die für die Lokalisierung beabsichtigten Zellen andererseits in dieser Hinsicht bereits verwendet. Bispezifische (und tispezifische, siehe Tutt et al., Journal of Immunology 147(1), 60–69 (1991)) Antikörper wurden für solche Lokalisierung bereits hergestellt. Diese bestehen aus einer Antikörperbindungsstelle gegen ein antigenes Epitop der Tumorzelle, die, im Fall von Bispezifität, mit einer anderen Antikörperbindungsstelle gegen ein antigenes Epitop am Zelltyp (oder Virus, siehe Mady et al., Journal of Immunology 147(9), 3139–3144 (1991), den es an der Tumorstelle zu lokalisieren gilt, verbunden ist. Die Spezifität der so verwendeten Antikörper ist bei der Erzielung einer Ortung hilfreich, es bleibt jedoch wichtig, die Lokalisierung von Zellen wie zytotoxischen Zellen und Entzündungszellen an Stellen, die nicht jene sind, auf die spezi fisch abgezielt wird, zu minimieren. Ein Mittel zur Erzielung umfassenderer Lokalisierung als jener, die durch Antikörper alleine erzielt werden kann, würde dem Ansatz einen eindeutigen Vorteil bringen. Dies wurde nun wie in dieser Beschreibung offenbart und wie im Folgenden beschrieben erreicht:
Ein bispezifisches Reagens wird hergestellt, das eine Bindungsstelle für die Stelle, auf die die Lokalisierung ausgerichtet werden soll, und eine zweite Bindungsstelle für Zellen, die es an der Stelle zu lokalisieren gilt, aufweist, wobei jedoch zumindest einer dieser Bindungsstellen die Möglichkeit genommen wird, sich zu binden, bevor sie aktiviert wird. Solch eine Inhibierung kann durch Beschichten der zweiten Bindungsstelle mit einem photolytisch spaltbaren Rest, der die Stelle bis zur photolytischen Spaltung an der Zellbindung hindert, erzielt werden. Somit können Reagenzien der folgenden Formen verwendet werden:

(i) das Reagens weist seine spezifische Bindungsaffinität für die Stelle auf, auf die die Lokalisierung ausgerichtet werden soll, die nicht inhibiert ist, während seine Bindungsaffinität für die zu lokalisierenden Zellen reversibel inhibiert ist;
(ii) das Reagens weist seine spezifische Bindungsaffinität für die Stelle auf, auf die die Lokalisierung ausgerichtet werden soll, und auch seine spezifische Bindungsaffinität für die zu lokalisierenden Zellen, die reversibel inhibiert ist.

Ein Beispiel für die Verwendung eines solchen Lokalisierungsreagens lautet wie folgt:
Ein bispezifischer Antikörper wird hergestellt, der eine Antikörperstelle gegen eine Tumorzelle und eine reversibel inhibierte Antikörperstelle gegen eine zytotoxische Zelle wie z.B. eine natürliche Killerzelle umfasst, und wird einer Person mit einer Tumorstelle, an die sich der bispezifische Antikörper bindet, verabreicht. Er wird sich an der Stelle lokalisieren gelassen. Gleich wie bei anderen bispezifischen Antikörpern werden andere Fraktionen auf nicht spezifische Weise in das retikuloendotheliale System und auf spezifische Weise an anderer Stelle aufgenommen, sodass sie in der Milz, Leber, den Nieren usw. vorhanden sind. Die zu behandelnde Stelle wird dann Licht (wie z.B. UV-A-Licht) ausgesetzt, was die Aktivierung der Anti-Zell-Antikörper-Bindungsstelle bispezifischer Antikörper, die an dieser Position gebunden sind, verursacht. Diese Zellen werden dann an dieser Stelle lokalisiert und zeigen ihre Wirkung.
Dieser Ansatz bringt zahlreiche Vorteile mit sich. Es ist durchwegs bekannt, dass Antikörper-gesteuerte Therapie nicht so spezifisch ist, wie erwünscht wäre (K. D. Bagshaw, New Antibody Technology and the Emergence of Useful Cancer Therapy, Begent & Hamblin (Hrsg.), veröffentlicht von der Royal Society of Medicine Press Ltd., S. 79 (1995)). Der Ansatz dieser Beschreibung baut auf dieser Spezifität auf. An Stellen, an denen der bispezifische Antikörper nicht aktiviert ist, werden die Zellen durch den Antikörper nicht spezifisch lokalisiert werden, doch innerhalb der bestrahlten Stellen werden die Antikörper aktiviert werden. Es ist wichtig anzumerken, dass nicht die gesamte bestrahlte Stelle notwendigerweise eine entsprechende Abdeckung mit aktiviertem Antikörper enthalten wird, doch er wird über diese Stelle hinweg relativ zur Dichte des dort gefundenen angiogenen Epitops differenziell vorhanden sein. Ein eingeschränkter Grad an nichtspezifischer Bindung wird erwartet, und Antikörper, der dies innerhalb des bestrahlten Bereichs tut, wird aktiviert. Die nichtspezifische Bindung stellt jedoch einen geringen Anteil jener Bindung dar, bei der ein nichtinhibierter, bispezifischer Antikörper verwendet wurde. Ein anderer Vorteil des Verfahrens ist, dass ein herkömmlicher bispezifischer Antikörper, sobald er in die Person eindringt (beispielsweise durch Injektion in eine Vene), in der Lage ist, sich an die zu lokalisierenden Zellen zu binden. Das wurde bei der Verwendung von Antikörpern, die Anti-CD3-Seezifität enthalten, von Barr et al. (Int. J. Cancer 43, 501–597 (1991)) als Problem aufgezeigt, indem sie feststellten, dass spezifische Antikörper, die Anti-CD3-Spezifität enthielten, zur systemischen Verabreichung in Menschen nicht geeignet sind, da sie von allen peripheren Lymphozyten absorbiert werden. Dies würde die Fähigkeit des Antikörpers, in die zu behandelnden Stellen einzudringen, eindeutig senken.
Die lokalisierenden Zellen dieser Beschreibung umfassen auch Viren. Bezüglich der lokalisierenden Zellen kann gesagt werden, dass sie (i) Zellen sein können, die bereits in der Person vorhanden sind oder sich entweder vor der Behandlung normal vermehren oder zu dieser Vermehrung veranlasst werden, beispielsweise durch Verursachen einer Entzündung in einem Bereich des Körpers, oder (ii) Zellen sein können, die aus einer anderen, immunen oder nicht immunen Person zugesetzt werden können oder vorher der Person selbst entnommen und gegebenenfalls (durch Kultur, um ihre Wirksamkeit zu steigern) behandelt werden, beispielsweise Lymphokin-aktivierte Killer- (LAK-) Zellen (Nippon et al., Journal of the Nippon Medical School 58(6), 663–672)); klonierte Zellen wie T-Zellen können auch verwendet werden. Darüber hinaus können Zellen als Träger von zytotoxischen Mitteln oder Substanzen verwendet werden, beispielsweise durch Einkapselung von rekombinantem menschlichem IFN-γ in menschliche Erythrozyten, die gegen Adenokarzinom gerichtet werden (Chokri et al., Research in Immunology 143(1), 95–99 (1992)). In ähnlicher Weise kann ein radioaktives Isotop, ein Toxin wie z.B. Diphtherietoxin, Bor (für darauf folgende Boreinfangbehandlung) getragen werden, oder die Zelle selbst kann viral infiziert werden.
Die für die fremden Mittel und die Zellen, die es zu lokalisieren gilt, spezifischen Antikörper können durch Standardmittel erhalten werden. In zahlreichen Fällen ist es vorzuziehen, dass sie selbst nur geringe inhärente Immunogenität aufweisen. Humanisierte Antikörper können daher mit guter Wirkung in Verfahren für bispezifische Antikörper verwendet werden (Shalaby et al., Journal of Experimental Medicine 175, 217–225 (1992)). Es ist vorzuziehen, dass es ich um monoklonale Antikörper handelt, doch polyklonale Antikörper können auch verwendet werden. Tumorzelltargets umfassen jene, die in der früheren Patentanmeldung (der Erfinder, hierin aufgenommen) beschrieben werden, von denen manche bereits zum Targeting bispezifischer Antikörper verwendet wurden (Ovarialkarzinom, siehe Segal et al., Immunobiology 185, 390–402 (1992); Brustkrebs, siehe Shi et al., Journal of Immunological Methods 141(2), 165–175; Kolonkarzinom (Anti-CEA), siehe Jantscheff et al., Journal of Immunological Methods 163(1), 91–97 (1993); Kolonkarzinom, siehe Beun et al., Journal of Immunological Methods 150(6), 2305–2315 (1993); leukämische B-Zellen, siehe Boh len et al., Journal of Immunological Methods 173(1), 55–62 (1994); kleinzelliger Lungenkrebs, siehe Azuma & Niitani, Japanese Journal of Thoracic Disease 29(9), 1132–1137 (1991); Adenokarzinom, siehe Chokri et al., Research in Immunology 143(1), 95–99 (1992); Ovarial- und Brustkarzinome, siehe Journal of Experimental Medicine 175, 217–225 (1992)).
In ähnlicher Weise wurden bereits verschiedene Antikörper gegen geeignete Zellen, die es zu lokalisieren gilt, hergestellt, beispielsweise: T-Zellen (Bericht) (Bolhuis et al., Journal of Cellular Biochemistry 47, 306–310 (1991); zytotoxische T-Zellklone (Haagen et al., Clinical and Experimental Immunology 90(3), 368–375 (1992); zytotoxische T-Zellen und aktivierte periphere Blutlymphozyten (van Ravenswaay et al., Gynecological Oncology 52(2), 199–206 (1994); CD3+-Lymphozyten (Malygin et al., Immunology 81(1), 92–95 (1994)), CD16+-Lymphozyten (Nitta et al., Immunology Letters 28(1), 31–37 (1991)); Fc-gamma R111, der niederaffine Fc-γ-Rezeptor für polymorphkernige Leukozyten, Makrophagen und große Körnerlymphozyten (Garcia de Palazzo et al., International Journal of Biological Markers 8(4), 233–239 (1993)), B-Lymphozytenmarker (Demanet et al., International Journal of Cancer – Beilage 7, 67–68 (1992)); Knochenmarkszellen (Ball et al., Journal of Hematotherapy 1(1), 85–94 (1992)); T-Lymphozyten CD2, CD3, CD4, CD8 (Tuff et al., Journal of Immunology 147(1), 60–69 (1991)); Dengue-Virus (Mady et al., Journal of Immunology 147(9), 3139–3144 (1991)); Lymphokin-aktivierte Killer- (LAK-) Zellen (Nippon et al., Journal of the Nippon Medical School 58(6), 663–672); NK-Zellen oder Monozyten (Curnow et al., Scandinavian Journal of Immunology 36(2), 221–231 (1992)).
So genannte bispezifische Antikörper-"Gabeln" wurden von Ring et al. (Cancer Immunol. Immunotherapy 39, 41–48 (1994)) beschrieben. Diese sind Antikörper, die zwei Spezifitäten gegen zwei verschiedene Marker auf einer Tumorzelle aufweisen. Dass die Gabel sich an eine Tumorzelle bindet, erfordert höhere Spezifität, als eine einzelne Stelle erfordern würde, und auch die Avidität des Antikörpers für die Zelle würde höher sein als im Falle einfacher Bindung.
Durch die Verwendung des Beschichtungsverfahrens der vorliegenden Anmeldung würde es möglich gemacht werden, eine oder beide Bindungsstellen zu beschichten, die die Lokalisierung der Gabel stören könnten, und sie nur an der Stelle der Tumorzelle freizulegen. Dies würde die Wahrscheinlichkeit reduzieren, dass der Antikörper durch bindende Zellen, die eine einzige Spezifität binden, auf dem Weg zu den Tumorzellen entfernt wird.
Bispezifische Antikörper können auf zahlreiche verschiedene Arten hergestellt werden, beispielsweise:
Durch chemisches Binden eines Antikörpers einer Spezifität an einen anderen Antikörper der anderen Spezifität durch jedes beliebige, aus zahlreichen verschiedenen Mitteln ausgewählte Mittel für derartige Bindung (wie z.B. Glutaraldehyd, oder vorzugsweise einen der zahlreichen, spezifischeren Linker wie z.B. SPDP (N-Succinimidyl-3-[2-pyridyldithio]propionat)). In dieser Beschreibung bezeichnet Antikörper einen intakten Antikörper, der die übliche Anzahl an Bindungsstellen und eine Fc-Region enthält, oder jedes beliebige Fragment davon, das die Antigenbindungsstelle enthält (wie z.B. Fv, Fab, (Fab')). Geeignete Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper werden von H. Paulus, Behring Inst. Mitt. 78, 118–132 (1985), beschrieben. Kleine Antikörperfragmente weisen bestimmte Vorteile auf und können wie von Holliger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90(14), 6444–6448 (1993), beschrieben hergestellt werden.
Darüber hinaus können bispezifische Antikörper durch Zusammenbringen von zwei oder mehr Antikörpern mittels Vernetzungsbindemittel wie Anti-Antikörper, Lectine oder Reagenzien wie Protein A hergestellt werden (Ghetie & Mota, Mol. Immunol. 17, 395–401 (1980)).
Die Schwer- und Leichtketten der Antikörper können getrennt und wieder miteinander kombinieren gelassen werden, wobei sich dadurch manche Ketten mit Ketten des anderen Antikörpers kombinieren und bispezifische Antikörper bilden (Paulus, Behring Inst. Mitt. 78, 118–132 (1985); Lebegue et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Serie 111(310), 377–382 (1990)).
Durch die Bildung von Quadromen aus den zwei Hybridomen, welche die zwei Antikörper synthetisieren, aus denen ein bispezifischer Antikörper erhalten werden soll (Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 211 (1986); Bos R., Nieuwenhuitzen W., Hybridoma 11(1), 41–51 (1992));
Durch genetische Rekombinationsmittel, wie sie bezüglich COS-1-Zellen für die Herstellung eines bifunktionellen chimären Murin/Human-Antikörpers beschrieben werden (De Sutter & Fiers, Molecular Immunology 31(4), 261–267).
Das bispezifische Reagens kann einen beliebigen spezifischen Bindungspartner als eine seiner Spezifitäten aufweisen. Die von einem spezifischen Bindungspartner erforderten Eigenschaften, die im Sinne dieser Erfindung nützlich sind, lauten wie folgt: Er soll von einem anderen Bindungspartner gebunden werden können und stets signifikante spezifische Bindungsaffinität für das andere Element seines Bindungspaars aufrechterhalten; er oder ein Bindungspartner, an den er gebunden werden soll, soll reversibel an der Bindung an das Element seines eigenen Bindungspaars gehindert werden können.
Klassen solcher spezifischer Bindungspartner umfassen beispielsweise: Antikörper, Enzyme, Liganden und Rezeptoren, einschließlich Biotin und Avidin, Adhäsionsmoleküle (wie ICAM-1, E-Selectin, VCAM-1, 1-SELECTIN und Endothelin-1), Lectine, Nucleinsäuren (wie DNA und RNA).
Das beschichtete Reagens kann jede beliebige Anzahl über eins an Stellen aufweisen, die reversibel inhibiert werden. Soll eine oder mehrere Stellen nicht inhibiert verbleiben, so kann dies durch Behandeln der zu inhibierenden Stellen vor dem anschließenden Binden dieser Stellen an nicht inhibierte Stellen erreicht werden, oder durch Profitieren von der unterschiedlichen Empfindlichkeit auf Inhibierung von verschiedenen Stellen, entweder als Resultat ihrer natürlichen Formation oder durch spezifisches Reduzieren der Wahrscheinlichkeit, dass eine Stelle durch Zusatz der Inhibierungssubstanz in Gegenwart eines spezifischen Kombinationspartners für die Stelle inhibiert wird. Beispielsweise könnte im Fall, in dem ein bispezifisches Reagens zwischen einem Antikörper der Spezifität K für einen Tumorzellmarker und der Spezifität L für eine T-Zelle erforderlich ist und in dem die L-Spezifität inhibiert werden soll, während die K-Spezifität dies nicht werden sollte, ein bispezifischer Antikörper durch jedes beliebige der auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren hergestellt und dieser bispezifische Antikörper mit Antigen K gebunden werden, während die Stellen gegen L inhibiert werden. Das Reagens, das zur Verursachung von Inhibierung der Stellen verwendet wird, könnte dann entzogen und der bispezifische Antikörper von Antigen K getrennt werden, um die erforderliche Spezies bereitzustellen.
Die hierin beschriebenen Antikörper sind in der Lage, sich an eine erste Zelle, beispielsweise eine Tumorzelle, Zelle eines Parasiten wie des Malariaparasiten oder dergleichen zu binden. Am wünschenswertesten ist die erste Zelle eine Tumorzelle, beispielsweise wie hierin bereits genannt.
Die hierin beschriebenen Antikörper können auch in der Lage sein, sich an eine Zelle zu binden, die in der Lage ist, die erste Zelle zu töten, wenn sie in der Umgebung der ersten Zelle angeordnet wird. Auch wenn die Bezeichnung Zelle eine umfassende Bedeutung hat und auch Viren einbindet, ist die Zelle geeigneterweise eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle und ist am günstigsten eine Säugetierzelle und am bevorzugtesten eine menschliche Zelle. Am meisten bevorzugt sind Zellen aus dem menschlichen Immunsystem, die unerwünschte Zellen töten können, wie beispielsweise jene Killerzellen, die hierin bereits zuvor genannt wurden.
Die Antikörper binden sich an die erste Zelle über einen zellgebundenen Rezeptorliganden, wie z.B. Tumormarker, sodass sich der Antikörper an eine Tumorzelle bindet, die diesen Marker aufweist.
Beispiel A
Verwendung eines reversibel inhibierten, bispezifischen Antikörpers zur Spezifikation der Stelle, an der die Abtötung von Tumorzellen erfolgt
Der monoklonale Antikörper Anti-CD-3 OKT3 (von der American Type Culture Collection) gegen T-Zellen wird herangezogen und mit 1-(2-Nitrophenyl)ethanol (NPE) wie folgt behandelt:
Zuerst wurden 0,66 g 2-Nitroacetoacetophenon in einem Rundkolben in 7 ml industriellem Methanol in Gegenwart von NaBH₄ gelöst. Der Inhalt wurde kontinuierlich gewirbelt und 60 min lang vermischt. Zehn ml H₂O wurden dann zum Kolben mit einem Tropfen 1 M HCl zugesetzt. 10 ml Ethylacetat wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde gründlich in einem Scheidetrichter geschüttelt. Die untere, wässrige Phase wird abgelassen und verworfen. Die Waschschritte werden mit weiteren 10 ml H₂O wiederholt. Die obere Phase wird abgenommen und zusammen mit MgSO₄ in einen Eindampfkolben gefüllt, um sämtliche Wasserspuren zu entfernen. Das Präparat wird durch Filterpapier filtriert, und das reine NPE-Eluat wird gewonnen. Das Methanol wird dann an einem Rotationsverdampfer bei 60 °C entfernt, wodurch eine geringe Menge an viskosem Material zurückbleibt. Dies wird offen über Nacht im Abzug stehen gelassen. 31,3 μl Diphosgen werden zu einer Lösung von 44 mg NPE und 20,6 μl Pyridin in 1 ml trockenem Dioxan zugesetzt. Es bildet sich unmittelbar ein weißer Niederschlag, und die Reaktion wird 15 min lang bis zu ihrer Beendigung ablaufen gelassen. Das Reaktionsgemisch wird dann unter einem Stickstoffstrom 45 min lang eingedampft, um nichtumgesetztes Material zu entfernen, und das weißliche Nitrobenzyloxycarbonylchlorid (NPE-COCl) wird in 1 ml Dioxan resuspendiert. Die folgenden Schritte in diesem Beispiel werden dann unter Lichtschutz der auf Licht hochempfindlichen Reagenzien durchgeführt. 100 μl davon wurden dann zu 15 ml des Anti-CD-3-OKT3-Antikörpers zugesetzt, in einer Konzentration von 0,5 mg/ml gegen 0,1 M NaHCO₃ bei einem pH von 8,3 dialysiert und 4 h lang sanft zentrifugiert. Die Lösung wurde dann gegen 0,9 % NaCl dialysiert. Antikörper, der Bindung an T-Zellen beibehält, wird dann durch Aussetzen des behandelten Antikör pers gegenüber einer Suspension von T-Zellen bei 4 °C, Inkubieren, Entfernen der Überstandslösung und anschließendes Reinigen durch HPLC-Chromatographie entfernt. Der Antikörper wird dann mit einem monoklonalen Antikörper gegen menschliche Kolonkarzinomzellen LoVo mittels Standardbehandlung mit einem heterobifunktionellen Vernetzer wie z.B. (N-Succinimidyl-3-[2-pyridydithio]propionat) (SPDP) konjugiert und anschließend gereinigt, um durch HPLC ein gereinigtes Präparat von 1:1-Konjugaten zu erhalten.
Gemäß dem Ansatz von Barr (Int. J. Cancer 43, 501–507 (1991)) wird die Zytotoxizität des bispezifischen Antikörpers gegen ⁵¹Cr-markierte LoVo-Zellen anschließend in Mikrotiterplatten mittels des Standard-Zytotoxizitätstests von Brunner et al. (B. Bloom & J.R. David (Hrsg.), In vitro methods in cell-mediated and tumour-immunity, Academic Press, New York, 423 (1976)) ausgewertet. Jene Wells, die zytotoxische T-Zellen, markierte LoVo-Zellen, NPE-inhibierten bispezifischen Antikörper aufnehmen und 15 min lang mit UV-A-Licht durch Aussetzen gegenüber einer Spectroline EN-16/F- UV-Lampe (Spectronics Corporation, Westbury, New York) bestrahlt werden, zeigen höhere Zytotoxizität als dasselbe Gemisch ohne Bestrahlung oder das Gemisch ohne den NPE-inhibierten Antikörper, jedoch mit 15-minütiger Bestrahlung. Gesteigerte Zytotoxizität wird auch an den Kontrollen beobachtet, wenn der bispezifische Antikörper zuerst 15 min lang, gehalten in Quarzglas-Küvetten, der UV-A-Quelle ausgesetzt wird, bevor er zu den Zytotoxizitäts-Testwells zugesetzt wird.
Beispiel B
Verwendung eines reversibel inhibierten, bispezifischen Antikörpers zur raschen Bestimmung von geringen Konzentrationen von Mikroorganismen in einer Wasserprobe
Zwei monoklonale Antikörper (P & Q) werden durch Standardmittel gegen den Mikroorganismus E. coli erhalten, für die gezeigt wurde, dass sie in der Lage sind, sich beide gleichzeitig an den Mikroorganismus zu binden. Dies erfolgte durch ein Standardverfahren, das kurz zusammengefasst folgende Schritte umfasst: (1) Beschich ten einer Mikrotiterplatte mit monoklonalem Antikörper P, (2) Zusetzen einer Suspension des Mikroorganismus, Inkubieren der Reaktion und anschließendes Abwaschen von ungebundenem Material und (3) Zusetzen des monoklonalen Antikörpers Q [der auf geeignete Weise mit alkalischer Phosphatase mittels des Pierce & Warriner (UK) Maleimide Alkaline Phosphatase Conjugation Kit (1995, Kat.-Nr. 31492) markiert worden war], der die Bindung davon ermöglicht, Abwaschen von ungebundenem Material und (4) Bestimmen der verbleibenden alkalischen Phosphatase. Eine wesentliche Enzymreaktivität im Vergleich zu anderen Immuntests, die dieses Matrixformat verwenden, beweist, dass die zwei Antikörper den Mikroorganismus gleichzeitig binden können.
Der folgende Teil dieses Beispiels wird dann unter Lichtschutz des lichtempfindlichen Reagens durchgeführt. Ein monoklonaler Antikörper R gegen Rinderserumalbumin (BSA) wird erhalten und mit NPE wie in Beispiel 1 dieser Beschreibung konjugiert. Antikörper, der stets in der Lage ist, mit BSA zu reagieren, wird dann mittels Aussetzung gegenüber einem Immunabsorptionsmittel, BSA-Kügelchen-Agarose (Sigma Chemical Co. Ltd., Kat.-Nr. A3790 (1995)), entfernt. Das verbleibende Konjugat wird dann an monoklonalen Antikörper P unter Verwendung von SPDP und durch Reinigen der 1:1-Konjugate mittels HPLC, wiederum wie in Beispiel 1 dieser Beschreibung beschrieben, gebunden. Dieses Konjugat Z wird dann im Test wie folgt verwendet:
Polypropylenküvetten mit einer Dicke von 1 cm, einer Breite von 2 cm und einer Höhe von 5 cm wurden herangezogen, und 1 ml einer 1 %igen Lösung von BSA wurde in einem Beschichtungspuffer von 50 mM Bicarbonat, pH 9,3, 5 min lang, sodass Beschichtung stattfinden konnte, auf den Boden zugesetzt. Die Lösungen wurden dann mittels einer Pasteur-Pipette entnommen, und die Küvetten wurden sechsmal mit einer Waschlösung aus 50 mM tris pH 7,4 plus 0,02 % Tween 20 gewaschen. 0,2 ml einer 20 μg/ml-Lösung von Konjugat Z wurden dann in die Küvetten gegeben, gefolgt von 8 ml der zu testenden Wasserproben und Standards, die eine bekannte Anzahl an E.-coli-Organismen enthielten, unter permanentem Vermischen. Die Gemische wurden dann 5 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, um Bindung zwischen vorhandenem E. coli und Konjugat Z zu ermöglichen. Nach dieser Zeitspanne wur den die breiten Seiten der Küvetten UV-A-Licht derselben Intensität wie oben weitere 15 min lang unter leichtem Schütteln ausgesetzt. Weiterer Lichtschutz war dann nicht mehr erforderlich. Die Lösungen wurden entfernt und die Küvetten sechsmal mit Waschlösung gewaschen. 2 ml einer 10-mM-Lösung von Substrat p-Nitrophenolphosphat in 50 mM Bicarbonatpuffer, pH 10,3, der 3,3 mM MgCl₂ enthielt, wurden dann zugesetzt und die Küvetten inkubiert, bis eine geeignete Änderung ihrer Absorption bei 405 nm für die Küvette mit dem höchsten Standard stattgefunden hatte. Ein Diagramm der Absorptionsänderung über der E.-coli-Menge für die Standards wurde erstellt, und die unbekannten Proben wurden hiergegen abgelesen. Die Resultate liegen über jenen, die aus einem Parallelbeispiel erhalten wurden, in dem nicht inhibierter, bispezifischer Antikörper zugesetzt wurde, da sich in diesem Fall ein gewisser Teil des bispezifischen Antikörpers vor E. coli mit dem BSA in der Küvette kombiniert, was im Gegensatz zu dem Fall mit dem inhibierten bispezifischen Antikörper steht, wo er ausreichend lange in Lösung bleibt, sodass E.-coli-Bindung im günstigen Lösungsumfeld stattfinden kann.
BEISPIEL 1
Inhibierter Antikörper gegen alkalische Phosphatase und CEA

a) Ein polyklonaler Antikörper gegen alkalische Phosphatase (Sigma Chem. Co. Ltd. (1994), Kat.-Nr. p5521), hergestellt mittels Standardverfahren und schließlich gereinigt mittels alkalische Phosphatase-Affinitätschromatographiesäule.
b) 1-(2-Nitrophenyl)ethanol wurde mit Diphosgen in Dioxan behandelt, um Nitrophenethyloxycarbonylchlorid zu erhalten (S. Thompson et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 201, 1213-1219 (1994)).
c) Ein monoklonaler Antikörper gegen Tumorantigen CEA wurde auf herkömmliche Weise aus einer Hybridomzelllinie erhalten.
d) Aliquoten von Nitrophenethyloxycarbonylchlorid wurden zu 1 mg gereinigtem Anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper in 1 ml von 0,1 M NaHCO₃-Lösung zugesetzt. Das resultierende Material wurde gegen 0,9 % Natriumchloridlösung dialysiert.
e) Der monoklonale Antikörper gegen Tumorantigen CEA wurde an den reversibel inhibierten Anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper mittels des heterobifunktionellen Vernetzers 3-(2-Pyridyldithio)propionsäure-N-hydroxysuccinimidester (SPDP, Sigma Chemical Co. Ltd (1994), Kat.-Nr. P3415) wie folgt konjugiert: der Antialkalische-Phosphatase-Antikörper (2 mg, 12 mg/ml) und der monoklonale Antikörper (4,6 ml, 5,2 mg/ml) wurden jeweils gegen 0,1 M Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH 7,5 (Bindungspuffer) dialysiert und getrennt voneinander 2 h lang bei Raumtemperatur mit achtfachem molaren Überschuss an SPDP (125 μl einer 3,2mg/ml-Lösung von SPDP in Ethanol wurden zu jeder Probe zugesetzt) inkubiert. Der monoklonale Antikörper wurde neuerlich gegen Bindungspuffer dialysiert, und der Anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper wurde gegen 0,1 M Natriumacetat, 0,1 M NaCl, pH 4,5, dialysiert. Dithiothreitol wurde dann zum Anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper in einer Endkonzentration von 0,02 M zugesetzt. Nach 30 min bei Raumtemperatur wurde der Anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper über eine Pharmacia-PD10-Säule, äquilibriert mit Bindungspuffer, hgeführt und unmittelbar zum monoklonalen Antikörper zugesetzt. Nach 4-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde 1 mg Iodacetamid zugesetzt, und das Protein wurde an einer Ultrogel AcA 22- Säule (2,5 × 90 cm) in Borat-gepufterter Kochsalzlösung, pH 8,5, eluiert. Polymerisiertes Material wurde in zwei Fraktionen eluiert und unter Verwendung einer eintauchbaren Millipore-CX-100-Membran eingeengt.

BEISPIEL 2
Reduktion der Lebensfähigkeit von Tumorzellen
Eine Zelllinie, erhalten aus einem menschlichen Karzinom, wurde gezüchtet, und Aliquoten wurden in zwei Mikrotiterplatten in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Well in inkomplettem modifiziertem Dulbecco's Medium mit 10 % fötalem Kälberserum (IMDM) platziert. Die Wells beider Platten erhielten dann 200 μl einer 5μg/ml-Lösung von cAb in IMDM, unter Ausnahme einer Serie, die nur IMDM erhielt (die "Nullkontrolle"). Die Platten wurden dann eine Stunde lang bei 4 °C inkubiert, und ungebundener Antikörper wurde mittels dreimaligen Austauschens der Kulturmediums entfernt. Eine Platte wurde dann auf ähnliche Weise wie in S. Thompson et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 201, 1213-1219 (1994), beschrieben UV-A-Licht ausgesetzt. Das Prodrug-Etoposidphosphat wurde wie in P.D. Senter, M.G. Saulner, G.J. Schreiber, D.L. Hirschberg, J.P. Brown, K.E. Helstrom, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842–4846 (1988), beschrieben aus der verwandten Verbindung Etoposid (Sigma Chemical Co. Ltd. (1994), Kat.-Nr. E 1383) hergestellt, wurde in einem bestimmten Konzentrationsbereich zu den Wellgruppen zugesetzt und bei 37 °C 6 h lang inkubiert. Die Zellen wurden dann weitere 12 h lang gewaschen. Die Zellen in den einzelnen Wells wurden dann auf ihre Lebensfähigkeit getestet, und es wurde erkannt, dass die Zellen in den Wells, die davor mit UV-A-Licht bestrahlt worden waren, nicht lebensfähig waren. Dass dies eine Konsequenz der Bindung von alkalischer Phosphatase in den bestrahlten Wells und infolge dessen einer stärkeren Aktivierung des Prodrugs in diesen Wells war, wurde durch die Zellen in der Nullkontrolle bewiesen, die nach Aussetzung gegenüber der UV-A-Strahlung lebensfähig blieben.
BEISPIEL 3
Beispiel 1 wurde durch Herstellen des bispezifischen F(ab')2-Konjugats aus F(ab')2-Fragmenten der beiden Antikörper gemäß dem in M.J. Glennie, D.M. Brennand, F. Bryden, F. Stirpe, A.T. Woth & G.T. Stephenson, Preparation and performance of bispecific F(ab'γ)2 antibody containing thioether-lined Fab'γ fragments, Journal of Immunology 139, 2367–2375 (1987), beschriebenen Verfahren wiederholt.
BEISPIEL 4
Das Verfahren aus Beispiel 1 wurde wiederholt, wobei der Linker M2C2H aus dem Katalog von Pierce & Warriner (1995), Kat.-Nr. 22304, anstelle von SPDP verwendet wurde.
BEISPIEL 5
Das Verfahren aus Beispiel 3 wurde unter Verwendung des Linkers M2C2H aus dem Katalog von Pierce & Warriner (1995), Kat.-Nr. 22304 (d.h. 4-(N-Maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylhydrazid), anstelle von SPDP wiederholt.
Beispiel 1A
Assoziierung von alkalischer Phosphatase an Kolonkarzinomzellen mittels eines bispezifischen Antikörpers dessen Enzymbindungsaktivität durch Bestrahlung mittels Ultraviolettlicht modulierbar war
Herstellung des bispezifischen Antikörperkonjugats
Monoklonale Antikörper gegen karzinoembryonales Antigen (CEA) und alkalische Phosphatase (AP) (Zymed Laboratories Inc., Klon Nr. ZAP1, Kat.-Nr. 03–2200) wurden erhalten. Der monoklonale Anti-AP-Antikörper wurde zuerst mit NPE beschichtet. Der Antikörper wurde, in einer Konzentration von 0,5 mg/ml, zuerst über Nacht gegen 0,1 M NaHCO₃ dialysiert. Während der Dialyse wurde das Volumen von 3 auf 4 ml erhöht. 1 ml wurde als eine Kontrolle zurückbehalten, und zwei 1,5-ml-Fraktionen wurden abgenommen. Nitrobenzylcarbonylchlorid wurde durch Behandeln von NPE mit Diphosgen in Dioxan (P.D. Senter, J.M. Tansey, J.M. Lambert & W.A. Blattler, Photochem. Photobiol. 42, 213–237 (1985)) hergestellt, und 10 μl hiervon wurden zu einer 1,5-ml-Fraktion und 20 μl zur anderen Fraktion zugesetzt. Die Proben wur den unter leichtem Schütteln 4 h lang umsetzen gelassen und wurden dann gegen 0,9 M NaCl dialysiert. Die Endkonzentration der Kontrollprobe betrug 0,21 mg/ml, und jene der behandelten Proben belief sich auf 0,135 und 0,105 mg/ml. Für die Proben wurde erkannt, dass sie zu etwa demselben Ausmaß gebunden waren (im Mittel 8 und 12 NPE-Reste pro Antikörpermolekül), und sie wurden daraufhin vermischt. Der beschichtete Antikörper wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Sowohl der NPE-beschichtete Anti-AP-Antikörper als auch der Anti-CEA-Antikörper wurden bei 0,18 ml/ml mit SPDP derivatisiert: 1-ml-Aliquoten beider Antikörper wurden in einer Konzentration von 0,1 ml/ml gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, der 0,1 M NaCl enthielt, derivatisiert. 25 μl SPDP (0,63 ml/ml in Ethanol) wurden dann zu jedem Antikörper zugesetzt. Die Antikörper wurden dann 30 min lang reagieren gelassen. Der Anti-AP-Antikörper wurde gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, und den Anti-CEA-Antikörper dialysiert und 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Präparat wurde gegen zwei Chargen von 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, dialysiert. Der Anti-CEA-Antikörper wurde dann reduziert und zum NPE-Anti-AP-Antikörper zugesetzt und 24 h lang bei 20 °C reagieren gelassen. Das Konjugat wurde dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, um unerwünschte Reaktionsprodukte zu entfernen. Mittels Elektrophorese wurde gezeigt, dass sich die Ausbeute auf etwa 80 % belief, wobei zumindest 75 % der Antikörper konjugiert waren.
Targeting von AP auf CEA-beschichtete ELISA-Platten
Nunc-Mikrotiterplatten wurden mit 10 μg/ml CEA (Calbiochem 1994/5, Kat.-Nr. 219368) beschichtet. Das bispezifische Antikörperkonjugat wurde dann 6 min lang mit UV-Licht bestrahlt oder nicht, und 50 μl von jedem Konjugat wurden bei 10 μg/ml auf 1 ml in Tris-Puffer, pH 7,4, der 0,05 % Tween enthielt, verdünnt und Doppel-Verdünnungen zu den Wells über die gesamte Platte hinweg zugesetzt. Die nativen Anti-CEA- und Anti-AP-Antikörper wurden beide in ähnlicher Weise als Kontrollen behandelt. Nach zwei Stunden wurde die Platte gewaschen, und 100 μl AP bei 2 μg/ml oder, in den Kontrollwells, ein Anti-Maus-IgG, markiert mit alkalischer Phosphatase (bei einer 1:1.000-Verdünnung) wurden in Tris-Tween-Puffer zugesetzt. Die AP (Bio genesis, Kat.-Nr. 0300–1004) wurde zugesetzt, um die Gegenwart von aktivem Konjugat, das sich an das CEA gebunden hatte, nachzuweisen, und Anti-IgG(AP) wurde als positive Kontrolle verwendet, um zu bestätigen, dass sich der SPDP-beschichtete Anti-CEA-Antikörper (entweder konjugiert oder nicht) stets an das CEA an der Platte binden konnte. Die AP wurde in allen Wells durch den Zusatz von Nitrophenolphosphat-Substrat unter Standardbedingungen sichtbar gemacht und die Reaktion spektralphotometrisch bei 405 nm verfolgt. Dies zeigte, dass eine Bestrahlung des bispezifischen Antikörpers dazu führte, dass mehr AP an die Mikrotiterplattenwells gebunden war als im Fall des nicht bestrahlten bispezifischen Antikörpers.
Targeting von AP auf Kolonkrebszellen, die CEA exprimieren
CEA-produzierende Kolonkrebszellen wurden in Mikrotiterplatten auf etwa 90 % Konfluenz gezüchtet, dieses Mal in 200 μl DMEM-Medium pro Well, das 10 % fötales Kälberserum enthielt. 100 μl Medium wurden dann entfernt und mit freiem serumfreiem Medium 1 h lang ersetzt, um die Zellen an serumfreies Medium (SFM) zu gewöhnen. Alle Medien wurden dann entfernt, und 100 μl SFM, das die bispezifischen Antikörperkonjugate bei 2,5 μg/ml enthielt, wurden zugesetzt, wobei die Konjugate entweder nicht bestrahlt worden waren oder 2 ml der bispezifischen Antikörperkonjugatprobe in Kochsalzlösung 6 min lang in einer Quarzküvette in einer Entfernung von einer Spectroline-EN/16/F-UV-Lampe (Spectronics Corporation, Westbury, New York) von 0,5 cm und einem Emissionspeak von 365 nm bestrahlt worden waren. Der Test wurde in beiden Fällen mit 10fach ausgeführten Wells durchgeführt. Nach 2 h wurde das gesamte Medium wiederum entfernt, und 100 μl SFM, das AP (2 μg/ml) enthielt, wurden zugesetzt. Nach einer abschließenden, 2-stündigen Inkubation wurden die Zellen ausführlich (fünfmal) mit gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und 100 μl Substratpuffer, der AP-Substrat pNPP enthielt, wurden zugesetzt, und die AP-Aktivität wurde dann bei 405 nm mit einem Mikrotiterplattenleser beobachtet. Kontrollen wurden zugesetzt, zu denen kein bispezifisches Konjugat zugesetzt worden war, und auch solche, in denen bispezifisches Konjugat zugesetzt worden war, jedoch keine AP. Dies stellte eine Messung der natürlichen Konzentrationen von AP in den Zellen bereit und ermöglichte auch den Beweis, dass die Zellen, zu denen AP zugesetzt worden war, ausreichend gewaschen worden waren, um die gesamte, nicht spezifisch absorbierte AP zu entfernen.
Die Resultate zeigten, dass die Wells, die nicht bestrahltes, bispezifisches Konjugat enthielten, nur ein Hintergrundniveau von AP aufzeigten, das jenem der Wells entsprach, die keinen bispezifischen Antikörper oder zugesetzte AP erhalten hatten. Hingegen zeigten die Wells, die das bestrahlte bispezifische Antikörperkonjugat erhalten hatten, sehr viel höhere Niveaus an AP-Aktivität, was eine Folge der Bindung hiervon an die CEA-produzierenden Zellen durch das aktive bispezifische Antikörperkonjugat war.
Beispiel 2A
Bestrahlung in Kulturmedium
Beispiel 1A (letzter Abschnitt) wurde mit einem Enzym-amplifizierten System, das ein AMPAK-Set verwendet, gemäß den Anleitungen des Herstellers zur Detektion von AP in Mikrotiterplattentests (Dako Diagnostics Ltd. UK), wiederholt, das eine leicht identifizierbare rote Färbung an der Stelle von p-Nitrophenolphosphat zur Untersuchung jeder möglichen Wirkung von Kulturmedium während der Bestrahlung von bispezifischem Antikörperkonjugat hervorbrachte. Hierbei wurde das Konjugat bei 40 μg/ml in Quarzküvetten in 0,9 % Kochsalzlösung oder SFM 6 min lang bestrahlt. Die Antikörper wurden dann auf 5 μg/ml entweder in SFM oder Medium, das 10 % FCS enthielt, verdünnt, bevor sie zu 10fach ausgeführten Wells, die die CEA-produzierenden Kolonkrebszellen enthielten, zugesetzt wurden. Tabelle 1 zeigt die sichtbar verzeichneten Resultate hiervon, aus denen eindeutig hervorging, dass viel mehr AP durch die Wells gebunden wurde, die bestrahltes bispezifisches Antikörperkonjugat erhalten hatten, unabhängig davon, ob die Bestrahlung in SFM oder Kochsalzlösung durchgeführt worden war, als durch jene, die unbestrahltes bispezifisches Antikörperkonjugat erhalten hatten.
Tabelle 1
Die sichtbaren Resultate wurden von 0 bis maximal 10 bewertet

Reine Platte 1

Keine Bestrahlung 3

Bestrahlung in Kochsalzlösung 10

Bestrahlung in SFM 10
Beispiel 3A
Dauer der Bestrahlung
Beispiel 1A (letzter Abschnitt) wurde wiederholt, wobei hier jedoch wie in Beispiel 2A das Enzym-amplifizierte System verwendet wurde, und auch das unbestrahlte bispezifische Antikörperkonjugat in Konzentrationen von 2,5 μg/ml und 5,0 μg/ml wurde direkt zu allen Wells der Platte zugesetzt, wonach die Zellen von unterhalb der Platte 0, 3, 6, 9 und 12 min lang bestrahlt wurden. Wie die Resultate in Tabelle 2 zeigen, stand sogar bei der Abschwächung der Bestrahlung durch die Kunststoffplatte der Anstieg von AP-Einfang stark mit der ansteigenden Bestrahlungsdauer in Zusammenhang.
Tabelle 2
Die Resultate wurden von 0 bis maximal 10 wie folgt bewertet:
Beispiel 3B
Phosphoryliertes Etoposid wird wie von Haisma et al. in: Cancer Immunol. Immunother. 34, 343–348 (1992), beschrieben gewonnen. Beispiel 2A wird wiederholt, wobei jedoch anstelle des Zusatzes des Enzym-amplifizierten Systems Etoposidphosphat, wie von Haisma et al. beschrieben wird, zugesetzt wird. Tumorzelltod ist in jenen Kulturen, die dem bestrahlten bispezifischen Konjugat nicht ausgesetzt waren, größer als in jenen, die dem unbestrahlten bispezifischen Konjugat ausgesetzt waren.
Die CEA-produzierenden Zellen werden in Kolben gezüchtet und wie in Beispiel 1A an serumfreies Medium gewöhnt. Anschließend werden sie in Mikrotiterplatten ausplattiert, und eine Lösung von 100 μg/ml in serumfreier Kulturflüssigkeit wird zur einen Hälfte der Wells zugesetzt. Die andere Hälfte erhält dasselbe bispezifische Antikörperpräparat, das jedoch durch 2 ml der NPE-beschichteten bispezifischen Antikörperprobe, bestrahlt in serumfreier Kulturflüssigkeit 6 min lang in einer Quarzküvette in einer Entfernung von 0,5 cm von der Spectroline-Lampe, bestrahlt wurde. Die Zellen werden 1 h lang bei 37 °C inkubiert, wonach sie durch leichtes Zentrifugieren und Austausch von Medium gewaschen werden. 100 μl SFM, das alkalische Phosphatase in einer Konzentration von 2 μg/ml enthält, werden zu jedem Well zugesetzt und 30 min lang bei 37 °C inokuliert, wonach sie durch leichtes Zentrifugieren und mit einer zu jedem Well zugesetzten Lösung von 100 μl Etoposidphosphat (10 μM), hergestellt gemäß Senter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842 (1988), in SFM gewaschen und bei 37 °C 3 h lang inkubiert werden. Die Zellen werden neuerlich gewaschen und drei Tage lang gezüchtet, wobei ihre Lebensfähigkeit durch den Sulforhodamin-B-Test bewertet wird. Es wird erkannt, dass jene Wells, die bestrahlten bispezifischen Antikörper erhalten hatten, geringere Zelllebensfähigkeit als jene aufweisen, die unbestrahlten Antikörper erhalten hatten.
In-situ-Bestrahlung
Die CEA-produzierenden Zellen werden in Kolben gezüchtet und wie in Beispiel 1A an serumfreies Medium gewöhnt. Sie werden dann in Mikrotiterplatten ausplattiert, und eine Lösung von 100 μl NPE-beschichtetem, bispezifischem Antikörper, hergestellt wie in Beispiel 1, in einer Konzentration von 10 μg/ml in serumfreier Kulturflüssigkeit wird zu den Wells zugesetzt. Eine Hälfte der Wells wird wie in Beispiel 3A beschrieben bestrahlt. Die Zellen werden 1 h lang bei 37 °C inkubiert, wonach sie durch leichtes Zentrifugieren und Austausch von Medium gewaschen werden. 100 μl SFM, das alkalische Phosphatase in einer Konzentration von 2 μg/ml enthält, werden zu jedem Well zugesetzt und 30 min lang bei 37 °C inokuliert, wonach sie neuerlich gewaschen werden und eine Lösung von 100 μl Etoposidphosphat (10 μM), hergestellt gemäß Senter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842 (1988), in SFM zu jedem Well zugesetzt und bei 37 °C 3 h lang inkubiert wird. Die Zellen werden neuerlich gewaschen und drei Tage lang gezüchtet, wobei ihre Lebensfähigkeit bewertet wird. Kontrollwells werden auch erstellt, die weder den NPE-bispezifischen Antikörper, noch alkalische Phosphatase noch Etoposidphosphat noch Kombinationen der drei erhalten. Wird die Zelllebensfähigkeit durch den Sulforhodamin-B-Test, wie von Skehan et al., New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening, J. Natl. Cancer Inst. 82, 1107 (1990), beschrieben, bewertet, so zeigen jene Wells, denen der NPE-spezifische Antikörper, alkalische Phosphatase und Etoposidphosphat zugesetzt wurden und die anschließend UV-Licht ausgesetzt wurden, höheren Zelltod als jene unbestrahlten Wells oder Kontrollwells, unabhängig davon, ob bestrahlt oder nicht.
Beispiel 4A
Verwendung eines bispezifischen Antikörpers mit einer reversibel inhibierten Bindungsstelle für alkalische Phosphatase und Bindungsaffinität für karzinoembryonales Antigen zur Lokalisierung von an alkalische Phosphatase gebundenen Teilchenkügelchen mit Zellen, die karzinoembryonales Antigen tragen, nachdem die Inhibierung des bispezifischen Antikörpers durch Bestrahlung mit ultraviolettem Licht aufgehoben worden war
Herstellung des bispezifischen Antikörperkonjugats
Es wurden monoklonale Antikörper gegen karzinoembryonales Antigen (CEA) und alkalische Phosphatase (AP) (Zymed Laboratories Inc., Klon-Nr. ZAP1, Kat.-Nr. 03-2200) erhalten.
Der monoklonale Anti-AP-Antikörper wurde zuerst mit NPE beschichtet. Der Antikörper, in einer Konzentration von 0,5 mg/ml, wurde zuerst über Nacht gegen 0,1 M NaHNO₃ dialysiert. Während der Dialyse wurde das Volumen von 3 auf 4 ml erhöht. 1 ml wurde als Kontrolle zurückbehalten, und zwei 1,5-ml-Fraktionen wurden abgenommen. Nitrobenzylcarbonylchlorid wurde durch Behandeln von NPE mit Diphosgen in Dioxan (P.D. Senter, J.M. Tansey, J.M. Lambert & W.A. Blattler, Photochem. Photobiol. 42, 213–237 (1985)) hergestellt, und 10 μl hiervon wurden zu einer 1,5-ml-Fraktion und 20 μl zur anderen Fraktion zugesetzt. Die Proben wurden unter leichtem Rotieren 4 h lang umsetzen gelassen und wurden dann gegen 0,9 M NaCl dialysiert. Die Endkonzentration der Kontrollprobe betrug 0,21 mg/ml, und jene der behandelten Proben belief sich auf 0,135 und 0,105 mg/ml. Für die Proben wurde erkannt, dass sie in etwa demselben Ausmaß gebunden waren (im Mittel 8 und 12 NPE-Reste pro Antikörpermolekül), und sie wurden daraufhin vermischt. Der beschichtete Antikörper wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Sowohl der NPE-beschichtete Anti-AP-Antikörper als auch der Anti-CEA-Antikörper bei 0,18 ml/ml wurden mit SPDP derivatisiert: 1-ml-Aliquoten beider Antikörper wurden in einer Konzentration von 0,1 ml/ml gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, der 0,1 M NaCl enthielt, derivatisiert. 24 μl SPDP (0,63 ml/ml in Ethanol) wurden dann zu jedem Antikörper zugesetzt. Die Antikörper wurden dann 30 min lang reagieren gelassen. Der Anti-AP-Antikörper wurde gegen 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, und der Anti-CEA-Antikörper wurde gegen 0,1 M Natriumacetat, pH 4,5, dialysiert, wobei beide über Nacht bei 4 °C dialysiert wurden. Nach der Dialyse wurden 100 μl von 0,5 M DL-Dithiothreitol (DTT) zum Anti-CEA-Antikörper zugesetzt und 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Präparat wurde gegen zwei Chargen von 0,1 M Phosphatpufter, pH 7,5, dialysiert. Der Anti-CEA-Antikörper wurde dann reduziert und zum NPE-Anti-AP-Antikörper zugesetzt und 24 h lang bei 20 °C reagieren gelassen. Das Konjugat wurde dann gegen destilliertes Wasser dialysiert, um unerwünschte Reaktionsprodukte zu entfernen. Mittels Elektrophorese wurde gezeigt, dass sich die Ausbeute auf etwa 85 % belief, wobei zumindest 75 % der Antikörper konjugiert waren.
Herstellung der Kügelchen
Carboxylat-modifizierte, intensiv blau gefärbte Polystyrolkügelchen drei verschiedener Größen (0,22 mm, 0,4 mm und 0,8 mm) wurden erhalten. Die Kügelchen wurden mit alkalischer Phosphatase (AP) zuerst durch dreimaliges Waschen durch Resuspendieren von 100 ml mit 10% Kügelchen in 1 ml destilliertem Wasser gebunden und durch Zentrifugation bei 10.000 U/min 10 min lang pelletiert. Die Kügelchen wurden dann in 120 ml MES-Puffer in 770 ml destilliertem Wasser mit 230 ml N-Hydroxysuccinimid bei 50 mg/ml in destilliertem Wasser (NHS) resuspendiert, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid (EDAC) wurde mit 50 mM/ml hergestellt und 100 μl unmittelbar zu dem Kügelchenpräparat zugesetzt. Die Kügelchen wurden dann 2 h lang stehen gelassen und einmal mit 0,1 MES-Puffer, pH 4,7, und dann mit 0,1 M Bicarbonat, pH 8,4, gewaschen. 500 μl AP bei 2 mg/ml wurden dann zu den pelletierten Kügelchen zugesetzt. Das Volumen wurde auf 1 ml im selben Puffer eingestellt und über Nacht reagieren gelassen. Am nächsten Tag wurden die Kügelchen dreimal gewaschen, in Mikrozentrifugationsröhrchen zentrifugiert und in 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert.
Die Proteinkonzentration wurde für jede Serie von Kügelchen berechnet. Für 80 % der zugesetzten AP wurde erkannt, dass sie sich an jede Serie gebunden hatte.
Einfangen von AP-markierten Kügelchen durch aktiviertes bispezifisches Antikörperkonjugat an Zellen
CEA-produzierende Kolonkrebszellen wurden in Mikrotiterplatten auf eine Konfluenz von etwa 90 % gezüchtet, dieses Mal in 200 μl DMEM-Medium pro Well, das 10 % fötales Kälberserum enthielt. 100 μl des Mediums wurden dann entfernt und durch serumfreies Medium 1 h lang ersetzt, um die Zellen an serumfreies Medium (SFM) zu gewöhnen. Das gesamte Medium wurde dann entfernt, und 100 μl SFM, das die bispezifischen Antikörperkonjugate bei 2,5 μg/ml enthielt, die entweder nicht bestrahlt worden waren oder durch 2 ml der bispezifischen Antikörperkonjugatprobe, bestrahlt in Kochsalzlösung 6 min lang in einer Quarzküvette bei einer Distanz von 0,5 cm von einer Spectroline EN/16/F- UV-Lampe (Spectronics Corporation, Westbury, New York) mit einem Emissionspeak von 365 nm, bestrahlt worden waren, wurden zugesetzt. Der Test wurde mit 10fach ausgeführten Wells für beide Konjugatarten durchgeführt. Nach 2 h wurde das gesamte Medium neuerlich entfernt, und 10 μl von jeder Kügelchensuspension, gefolgt von 90 μl serumfreiem Medium, wurden zu ihren Wells zugesetzt und 24 h lang stehen gelassen. Die Platte wurde geleert, fünfmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, und 100 μl von 5 mM p-Nitrophenolphosphat in 50 mM Bicarbonatpuffer, pH 10,3, der 3,3 mM MgCl₂-Puffer enthielt, wurden zugesetzt und das Enzymprodukt bei 405 nm mit einem Mikrotiterplattenleser gemessen. Dies wurde durch eine Messung der alkalischen Phosphataseaktivität auf die Kügelchen bestätigt, worin bei allen drei Kügelchengrößen mehr Aktivität in Verbindung mit jenen Wells gefunden wurde, die bestrahltes Konjugat erhalten hatten, als mit jenen, die kein bestrahltes Konjugat erhalten hatten.
Beispiel 5A
Ein monoklonaler Anti-CD3-Antikörper (mit T-Lymphozyten-aktivierendem Marker) wird mit NPE beschichtet und an den monoklonalen Anti-CEA-Antikörper gebunden, wie dies mit dem Anti-alkalische-Phosphatase-Antikörper aus Beispiel 1A geschah: Dies wird dann in zwei Aliquoten aufgeteilt, wobei eine wie in Beispiel 1A bestrahlt und die andere unbehandelt belassen wird. Anschließend werden sie bezüglich ihrer Fähigkeit, sich gegen gewonnene T-Zellen zu richten und Lyse von menschlichen Krebszellen auszulösen, wie dies von Barr et al., Int. J. Cancer 43, 501–507 (1989), beschrieben wird, wobei jedoch die in Beispiel 1A oben (Targeting von AP auf Kolonkrebszellen, die CEA exprimieren) beschriebenen Konzentrationen an Antikörperkonjugat verwendet werden. Mehr Zelltod als mit der nicht bestrahlten Fraktion wird mit der bestrahlten Fraktion des bispezifischen Antikörpers erzielt.
In-situ-Targeting
Das NPE-beschichtete, bispezifische Anti-CD3-Anti-CEA-Antikörper-Konjugat wird zur In-situ-Aktivierung wie folgt verwendet: Sie werden anschließend bezüglich ihrer Fähigkeit verglichen, sich gegen gewonnene T-Zellen zu richten und die Lyse der menschlichen Krebszellen auszulösen, wie dies von Barr et al. beschrieben wird. Die CEA-tragenden Zellen werden ausplattiert und an serumfreies Medium, wie in Beispiel 1A oben (Targeting von AP auf Kolonkrebszellen, die CEA exprimieren) beschrieben, gewöhnt. Antikörperkonjugat wird in serumfreiem Medium (SFM) in einer Konzentration von 2,5 μg/ml zugesetzt und 2 h lang bei 37 °C inkubiert, wobei andere Wells als Kontrollwells verwendet werden und somit kein Antikörperkonjugat erhalten. Die Wells werden wie in Beispiel 3A beschrieben bestrahlt, und die Zellen werden in SFM gewaschen. Die Fähigkeit der zugesetzten T-Zellen, die CEA-exprimierenden Zellen zu lysieren, wird dann gemäß Barr et al. bewertet. Mehr Zelllyse wird im Vergleich zu nicht bestrahlten Wells oder jenen Kontrollwells, die keinen bispezifischen Antikörper erhielten, unabhängig davon, ob bestrahlt oder nicht bestrahlt, in bestrahlten Wells erhalten.
Liste von Rezeptoren und ihren Liganden
Der Rezeptor kann einer der folgenden sein:
Neurotransmitterrezeptoren,
Gastralrezeptoren wie Enterogastron, Cholezystokinin, Pankreozymin und Sekretin,
Histaminrezeptoren, Serotoninrezeptoren,
α- und β-Adrenorezeptoren,
Adrenalinrezeptoren, Noradrenalinrezeptoren,
Enkephalisrezeptoren, Endorphinrezeptoren,
Melanin-stimulierender Hormonrezeptor,
Acetylcholinrezeptor,
andere Hormonrezeptoren wie Insulinrezeptoren und Wachstumshormonrezeptoren, Thyroxin, Thyrotropin, Glucagon, Progesteron, Östradiol, Testosteron, follikelstimulierendes Hormon, Luteinisierungshormon, Choriongonadotropin, Placenta-Lactogen, Oxytocin, Vasopressin, Erythropoietin, Renin und Angiotenin, ACTH-Rezeptoren, Corticosteron, Cortisol, 5α-Dihydrotestosteron, Aldosteron, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Parathormon und Calcitoninrezeptoren,
Corticorophin-freisetzende Faktorrezeptoren,
Cytokinrezeptoren wie Tumornekrosefaktor-Rezeptor,
Immunrezeptoren wie Histokompatibilitäts-Antigenrezeptoren, T-Zell-Rezeptoren und B-Zell-Rezeptoren,
spezifische Wirkstoffrezeptoren wie Diethylstilbestrol (Östradiol-17β-Rezeptor),
spezifische Kohlenhydratstrukturen,
Enzyme können als Rezeptoren verwendet werden,
synthetische Rezeptoren werden immer häufiger hergestellt.
Der Ligand kann einer der folgenden sein:
Gastralhormone und -faktoren wie z.B.:
Enterogastron, Cholecystokinin, Pankreozymin, Histamin und Sekretin,
Neurotransmitter wie z.B.: Serotonin, Adrenalin, Noradrenalin, Enkephaline, Endorphine, Melanin-stimulierendes Hormon, Acetylcholin, Insulinrezeptoren und Wachstumshormon, Thyroxin, Thyrotropin, Glucagon, Progesteron, Östradiol, Testosteron, follikelstimulierendes Hormon, Luteinisierungshormon, Choriongonadotrophin, Placenta-Lactogen, Oxytocin, Vasopressin, Erythropoietin, Renin und Angiotensin, ACTH, Corticosteron, Cortisol, 5α-Dihydrotestosteron, Aldosteron, 1,25-Dihydroxycholecalciferol, Parathormon und Calcitonin, Corticorophin-freisetzender Faktor, Cytokine wie Tumornekrosefaktor, Immunmittel wie Histokompatibilitäts-Antigene, T-Zell-Faktoren und B-Zell-Faktoren und Antigene, spezifische Wirkstoffe wie Diethylstilbestrol (Östradiol-17β-Rezeptor),
Enzymsubstrate, insbesondere irreversible Inhibitoren,
Liganden für synthetische Rezeptoren,
spezifische Kohlenhydratbindemittel wie z.B.: Weizenkeimagglutin, Kermesbeeren-Mitogen (Pokeweed mitogen, PMW) (können Liganden oder Rezeptoren sein).

Claims

Antikörper zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin (a) der Antikörper mit einem Element eines Bindungspaars markiert ist, das aus einem Liganden und einem Rezeptor besteht, sodass der Antikörper in der Lage ist, sich an das andere Element des Bindungspaares zu binden, wenn an der Oberfläche einer Targetzelle vorhanden, die wünschenswerterweise zu entfernen ist, und (b) der Antikörper in der Lage ist, sich an ein Enzym, das in der Lage ist, ein Prodrug eines zytotoxischen Wirkstoffs zum zytotoxischen Wirkstoff umzusetzen, oder an eine Zelle des Immunsystems, die die Targetzelle töten kann, zu binden; worin die Bindung des Antikörpers an das Enzym oder die Zelle des Immunsystems durch die Gegenwart einer photospaltbaren Gruppierung reversibel inhibiert ist.
Bispezifischer Antikörper zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin der bispezifische Antikörper eine erste Antikörperkomponente, die in der Lage ist, sich an ein Element eines Bindungspaars zu binden, das aus einem Liganden und einem Rezeptor besteht, vorhanden an der Oberfläche einer Targetzelle, die wünschenswerterweise zu entfernen ist, und eine zweite Antikörperkomponente umfasst, die in der Lage ist, sich an ein Enzym, das in der Lage ist, ein Prodrug eines zytotoxischen Wirkstoffs zum zytotoxischen Wirkstoff umzusetzen, oder an eine Zelle des Immunsystems, die die Targetzelle töten kann, zu binden; worin die Bindung des Antikörpers an das Enzym oder die Zelle des Immunsystems durch die Gegenwart einer photospaltbaren Gruppierung reversibel inhibiert ist.
Bispezifischer Antikörper nach Anspruch 2, worin die erste und die zweite Antikörperkomponente Teile von Antikörpern sind, die die aktive Stelle beibehalten, jedoch frei von Fc-Regionen sind.
Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die photospaltbare Gruppierung Nitrophenylmethylalkohol, 1-Nitrophenylethan1-ol oder 1-(2-Nitrophenyl)ethanol, konjugiert an den Antikörper, ist.
Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Targetzelle eine Tumorzelle ist.
Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Enzym eine Phosphatase, eine Carboxypeptidase, eine β-Glucosidase, eine β-Lactamase, eine Amidase, eine Cytosindesaminase oder eine Nitroreductase ist.
Antikörper nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Zelle des Immunsystems eine natürliche Killerzelle, eine T-Zelle, eine zytotoxische T-Zelle, ein Makrophage, ein aktivierter peripherer Blutlymphozyt, ein CD3+-Lymphozyt, ein CD16+-Lymphozyt, ein polymorphkerniger Leukozyt, ein großer granulärer Lymphozyt, ein B-Lymphozyt, eine Knochenmarkzelle, eine Lymphokin-aktivierte Killerzelle oder ein Monozyt ist.
Verwendung eines Antikörpers nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung einer Medikaments zur Behandlung eines Tumors.
Verwendung nach Anspruch 8, worin elektromagnetische Energie verwendet wird, um die photospaltbare Gruppierung zu entfernen und die Fähigkeit des Antikörpers zu aktivieren, das Enzym oder die Zelle des Immunsystems zu binden.
Antikörper zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, worin der Antikörper ein bispezifischer Antikörper ist, der in der Lage ist, (a) eine Targetzelle, die wünschenswerterweise zu entfernen ist; und (b) ein Virus zu binden; worin die Bindung des Antikörpers an das Virus durch die Gegenwart einer photospaltbaren Gruppierung reversibel inhibiert ist.
Antikörper nach Anspruch 10, worin die Targetzelle eine Tumorzelle ist.
Set zur Verwendung in einem medizinischen Behandlungsverfahren, umfassend: (i) eine Zelle, die ein Träger eines zytotoxischen Mittels, eines radioaktiven Isotops, eines Toxins, eines Virus oder von Bor ist; und (ii) einen Antikörper, der in der Lage ist, sich (a) an ein Element eines Bindungspaars zu binden, das aus einem Liganden oder einem Rezeptor besteht, an der Oberfläche einer Targetzelle vorhanden, die wünschenswerterweise zu entfernen ist; und (b) an die Zelle zu binden, die ein Träger eines zytotoxischen Mittels, eines radioaktiven Isotops, eines Toxins, eines Virus oder von Bor ist; worin die Bindung des Antikörpers an die Trägerzelle durch die Gegenwart einer photospaltbaren Gruppierung reversibel inhibiert ist.