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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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1. Gebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Induzieren von humoralen
und zellulären
Immunantworten gegen bösartige
Zellen oder infektiöse Mittel.
Insbesondere ist diese Erfindung auf Medikamente gerichtet zur Erzeugung
einer integrierten immunologischen Antwort gegen Tumorzellen oder
infektiöse
Reagenzien unter Verwendung von Antikörpern und Anti-Idiotypantikörpern, welche
ein Epitop eines Antigens nachahmen, das verbunden ist mit einem
Tumor oder einem infektiösen
Reagenz. Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf ein Medikament
zu Erhöhung
solch einer integrierten Antwort unter Verwendung von Antikörpern und
Cytokinen. Die Erfindung ist weiterhin gerichtet auf Medikamente
zur Erzeugung von T-Zellen, die nicht MHC-beschränkt sind und die durch einen
Tumor anvisiert werden, verbunden mit einem Antigen oder einem Antigen,
das verbunden ist mit einem infektiösen Reagenz.
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2. Hintergrund
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Eines
der Hauptziele für
Immuntherapie ist es, das Immunsystem eines Patienten gegen Tumorzellen
oder infektiöse
Organismen zu wappnen. Mit Hinblick auf Krebstherapie ist es das
Ziel, das Immunsystem des Patienten gegen Tumorzellen zu richten
durch Anvisieren von Antigenen, die mit Tumorzellen verbunden sein
können,
aber nicht normalen Gegenspielern. Obwohl diese tumorverbundenen Antigene
(TAA) sehr schwierig zu identifizieren waren, exprimieren bestimmte
Tumorzellen Antigene, die normalerweise nicht exprimiert werden
oder bei sehr niedrigen Gehalten im Leben von Erwachsenen exprimiert
werden aber bei der fötalen
Entwicklung vorliegen. Ein Beispiel eines solchen onkofötalen TAA
ist α-Fetoprotein,
welches exprimiert wird durch Leberkrebszellen. Anderes onkofötales TAA
ist das karzi noembryonische Antigen (CEA, welches in den meisten
Adenokarzinomen exprimiert wird von endodermal abgeleiteter Verdauungssystem-Epithelia
als auch in Brusttumorzellen und nicht kleinen Zellen von Lungenkrebszellen.
Thomas et al., Biochem. Biophys. Acta 1032: 177 (1990).
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Die
Handhabung von Anti-Idiotypantikörpern (Ab2),
welche TAA nachahmen, stellt einen der vielversprechendsten Ansätze für Krebsimmunotherapie dar.
Goldenberg, Amer. J. Med. 94: 297 (1993). Ab2 sind Antikörper, die
gerichtet sind gegen variable Regionen von konventionellen Antikörpern (Ab1).
Da Ab2 und Antigen mit denselben Regionen der Ab1-haltigen Stelle
binden kann, können
bestimmte Ab2 (bezeichnet "Ab2β" oder "Internabbildungs"-Antikörper) die
dreidimensionale Struktur des nominalen Antigens nachahmen. Jerne
et al., EMBO J. 1: 243 (1982); Losman et al., Int. J. Cancer 46:
310 (1990); Losman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3421 (1991);
Losman et al., Int. J. Cancer 56: 580 (1994). Individuen, die immunisiert
sind mit Ab2β können Anti-Antikörper (Ab3)
entwickeln, von denen einige (Ab1') das normale Antigen binden können.
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Die
Antigen nachahmenden Eigenschaften von Anti-Idiotypantikörpern haben
zur Verwendung von Ab2β als
Surrogatantigenen (oder Idiotypimpfstoffen) geführt, wenn das nominale Antigen
nicht direkt verfügbar
war oder wenn der Wirt tolerant gegenüber dem nominalen Antigen ist.
In Experimentalsystemen erzeugt die Immunisierung mit Ab2β, welches bestimmte
TAA nachahmt, spezifische Immunität gegen TAA und schützt gegen
nachfolgendes Tumorwachstum. Siehe zum Beispiel Nepom et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 2864 (1984); Raychaudhuri et al., J. Immunol.
139: 271 (1987). Ähnlich
sind Idiotypimpfstoffe gegen infektiöse Organismen entwickelt worden
wie Streptococcus pneumoniae [MCNamara et al., Science 226: 1325
(1984)], Hepatitus B Virus [Kennedy et al., Science 223: 930 (1984)], Escherichia
coli K13 [Stein et al., J. Exp. Med. 160: 1001 (1984)], Schistosomiasis
mansoni [Kresina et al., J. Clin. Invest. 83: 912 (1989)], und Moloney
murine Sarkomavirus [Powell et al., J. Immunol. 142: 1318 (1989)].
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Krebspatienten,
die ein Anti-TAA tierischen Ursprungs empfangen werden gewöhnlich Antikörper gegen
Ab1 erzeugen und diese Anti-Immunoglobulinantikörper um fassen Ab2. Herlyn et
al., J. Immunol. Methods 85: 27 (1985); Traub et al., Cancer Res. 48:
4002 (1988). Die Anti-Idiotypantwort kann die Erzeugung von T-Zellen
(T2) umfassen. Fagerberg et al., Cancer Immunol. Immunother. 37:
264 (1993). Darüber
kann Ab2 nachfolgend eine humorale und zelluläre Anti-Antitioptypantwort,
Ab3 und T3 jeweils induzieren, welche dasselbe Epitop wie Ab1. Id.
erkennen.
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EP-A-438803
offenbart Impfstoffe, die einen Ab2 umfassen, der CEA nachahmenden
Anti-Idiotypantikörper
erzeugt durch Immunisieren von Pavianen mit NP-4, einem Antikörper gegen
CEA.
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Daher
gibt es eine Möglichkeit,
einen Ansatz zur Immunotherapie bereitzustellen unter Verwendung
von sowohl humoralen als auch zellulären Immunsystemen. Die Anmelderin
hat Medikamente entwickelt, die eine integrale Antwort gegen Tumorzellen hervorrufen
sowie gegen infektiöse
Reagenzien. Weiterhin hat die Anmelderin Medikamente entwickelt,
um die Immunkaskade zu verstärken.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Dementsprechend
ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Medikament
zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten gegen Tumorzellen
und infektiöse
Reagenzien unter Verwendung von Antikörpern und Anti-Idiotypantikörpern bereitzustellen,
die ein tumorverbundenes Antigen oder ein Antigen nachahmen, das
verbunden ist mit einem infektiösen
Reagenz. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Medikament
zum Vermehren solcher integrierter Antwort unter Verwendung von
Antikörpern
und Cytokinen bereitzustellen.
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Ein
anderes Ziel der Erfindung ist es, Medikamente zur Erzeugung von
T-Zellen bereitzustellen, die anvisiert werden von Zellen, die ein
tumorverbundenes Antigen oder ein Antigen exprimieren, das verbunden
ist mit einem infektiösen
Reagenz. Solche T-Zellen
werden verwendet, um weiterhin die Immunantwort gegen Tumorzellen
oder infektiöse
Reagenzien zu verstärken.
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Diese
und andere Aufgaben werden gelöst
in Übereinstimmung
mit einer Ausführung
der vorliegenden Erfindung durch das Bereitstellen eines Medikaments
zur Induzie rung von humoralen und zellulären Immunantworten in einem
Säugetier
gegen einen Tumor, der ein tumorverbundenes Antigen (TAA) exprimiert
oder gegen eine Krankheit, die durch ein infektiöses Reagenz hervorgerufen wird,
umfassend:
- (a) einen ersten Impfstoff zur Verabreichung
an das Säugetier,
worin der erste Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der
mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, das mit dem infektiösen Reagenz
verbunden ist und worin der Antikörperbestandteil konjugiert
ist mit einem löslichen immunogenen
Trägerprotein;
und
- (b) einen zweiten Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier,
worin der zweite Impfstoff einen Anti-Idiotypantikörperbestandteil
umfasst, der ein Epitop des TAA oder Infektionsreagenz-Antigens umfasst
und worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil
konjugiert ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein.
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Der
Antikörperbestandteil
von Schritt (a) kann gewählt
sein aus der Gruppe die besteht aus: (a) einem murinen monoklonalen
Antikörper
bzw. Maus monoklonalen Antikörper;
(b) einem humanisierten Antikörper,
abgeleitet aus einem Maus monoklonalen Antikörper; (c) einen humanen monoklonalen
Antikörper
und (d) einem Antikörperfragment,
das abgeleitet ist aus (a), (b) oder (c), worin das Antikörperfragment
gewählt
sein kann aus der Gruppe, die besteht aus (Fab')2, F(ab)2, Fab',
Fab, Fv, sFv und Minimalerkennungseinheit.
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Der
Anti-Idiotypantikörperbestandteil
von Schritt (b) kann gewählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem polyklonalen Antikörper; (b) einem
Maus monoklonalen Antikörper;
(c) einem humanisierten Antikörper,
abgeleitet aus (b); (d) einem humanen monoklonalen Antikörper; (e)
einem subhumanen Primaten-Antikörper und
(f) einem Antikörperfragment,
das abgeleitet ist aus (a), (b), (c), (d) oder (e), in welchem das
Antikörperfragment
gewählt sein
kann aus der Gruppe, die besteht aus (Fab')2, F(ab)2, Fab',
Fab, Fv, sFv und Minimalerkennungseinheit.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament, das weiterhin
(c) γ-Interferon
oder Interleukin-2 umfasst, zur Verabreichung vor und während der
Verabreichung des zweiten Impfstoffs. Alternativ kann Interleukin-2
und γ-Interferon
vor und während
Verabreichung des Impfstoffs verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zum Induzieren
von humoralen und zellulären
Immunantworten in einem Säugetier
gegen einen Tumor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit,
die hervorgerufen wird durch ein infektiöses Reagenz, umfassend:
- (a) ein Impfstoff zur Verabreichung an das
Säugetier,
worin der Impfstoff einen Antikörperbestandteil
umfasst, der mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, das verbunden
ist mit dem infektiösen
Reagenz und worin der Antikörperbestandteil konjugiert
ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein;
und
- (b) einem Antikörper
oder antigenbindenden Fragment davon zur Verabreichung, worin der
Antikörper
oder das Fragment nicht konjugiert ist mit einem immunogenen löslichen
Trägerprotein
und worin der Antikörper
oder das Fragment mit TAA oder einem Antigen bindet, das mit dem
infektiösen
Reagenz verbunden ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament, in welchem der
Antikörper
oder das Antikörperfragment
von Schritt (b) konjugiert ist mit Biotin und worin das Verfahren
weiterhin (c) Avidin zur Verabreichung umfasst, um Kreislaufgehalte
des biotinylierten Antikörpers
zu erniedrigen oder des biotinylierten Antikörperfragments.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament, worin der Impfstoff
von Schritt (a) zur Verabreichung zu einem zweiten Zeitpunkt ist.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung ein Medikament, das weiterhin
(e) γ-Interferon oder Interleukin-2
zur Verabreichung vor und während
der zweiten Verabreichung des Impfstoffes umfasst. Als eine Alternative
können
Interleukin-2 und γ-Interferon vor und
während
der Verabreichung des Impfstoffes verabreicht werden.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch verwendbar in einem Verfahren zum
Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in einem
Patienten gegen einen Tumor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine
Krankheit, die hervorgerufen wird durch ein infektiöses Reagenz,
umfassend die Schritte von:
- (a) Erhalten von
T-Zellen aus dem Patienten;
- (b) Einführen
eines Expressionsvektors in die T-Zellen, um transfizierte T-Zellen
zu erhalten, worin der Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfasst,
das entweder ein chimäres
Immunoglobulin/T-Zellrezeptor oder ein chimäres Immunoglobulin/CD3-Protein
codiert, und worin der Immunoglobulin codierende Teil des DNA-Moleküls die variable
Region eines Antikörpers
codiert, welche mit dem TAA oder mit einem Antigen bindet, das mit
dem infektiösen
Reagenz verbunden ist;
- (c) Stimulieren der Vermehrung der transfizierten T-Zellen,
um eine vergrößerte Masse
transfizierter T-Zellen zu erhalten, und
- (d) Zurückgeben
der vergrößerten Masse
von transfizierten T-Zellen an den Patienten.
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Die
vorliegende Erfindung ist auch verwendbar in einem Verfahren, welches
weiterhin umfasst den Schritt von: (e) Verabreichen eines Impfstoffs
an den Patienten, worin der Impfstoff einen Anti-Idiotypantikörperbestandteil
umfasst, der mit der Immunoglobulineinheit des chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptors
bindet oder dem chirmären
Immunoglobulin/CD3-Protein, und worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil konjugiert
ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein.
Als Alternative kann wenigstens ein Cytokin, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus γ-Interferon
und Interleukin-2 an den Patienten verabreicht werden nach Zurückgeben
der transfizierten T-Zellen und vor Ausführen von Schritt (e).
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Die
vorliegende Erfindung ist auch verwendbar bei einen Verfahren zum
Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in einem
Patienten gegen einen Tu mor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine
Krankheit, die hervorgerufen wird durch ein infektiöses Reagenz,
umfassend die Schritte von:
- (a) Erhalten von
T-Zellen aus dem Patienten;
- (b) Induzieren eines Expressionsvektors in die T-Zellen, um
transfizierte T-Zellen zu erhalten, worin der Expressionsvektor
ein DNA-Molekül umfasst,
das entweder einen chimären
Immunoglobulin/T-Zellrezeptor oder chimäres Immunoglobulin/CD3-Protein
umfasst, und worin der Immunoglobulin codierende Teil des DNA-Moleküls die variable
Region eines Antikörpers
codiert, der ein Epitop des TAA oder ein Epitop eines Antigens nachahmt,
das mit dem infektiösen
Reagenz verbunden ist;
- (c) Stimulieren der Vermehrung der transfizierten T-Zellen,
um eine vergrößerte Masse
transfizierter T-Zellen zu erhalten, und
- (d) Zurückgeben
der vergrößerten Masse
von transfizierten T-Zellen an den Patienten.
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Weiterhin
ist die vorliegende Erfindung auch verwendbar in einem Verfahren,
das weiterhin den Schritt umfasst von (e) Verabreichen eines Impfstoffs an
den Patienten, worin der Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der
mit der Immunoglobulineinheit des chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptors
oder chirmären
Immunoglobulin/CD3-Proteins bindet und worin der Antikörperbestandteil
konjugiert ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein. Als
eine Alternative kann wenigstens ein Cytokin, gewählt aus
der Gruppe, die besteht aus γ-Interferon und
Interleukin-2 an den Patienten verabreicht werden nach Zurückgeben
der transfizierten T-Zellen und vor Ausführen von Schritt (e).
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Die
vorliegende Erfindung wird auch gerichtet auf einen Impfstoff zur
Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, der karzinoembryonisches
Antigen (CEA) exprimiert, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
und eine therapeutisch wirksame Menge eines Anti-CEA-Antikörperbestandteils,
welcher konjugiert ist an ein lösliches
immunogenes Trägerprotein.
Der Anti-CEA-Antikörperbestandteil
kann ge wählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem Maus monoklonalen
Klasse III Anti-CEA-Antikörper;
(b) einem humanisierten Antikörper,
abgeleitet aus einem Maus monoklonalen Klasse III Anti-CEA-Antikörper; (c)
einem menschlichen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper und (d) einem Antikörperfragment,
abgeleitet aus (a), (b) oder (c).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch einen Impfstoff zur Behandlung
eines Patienten mit einem Tumor, der CEA exprimiert, umfassend einen
pharmazeutisch verträglichen
Träger
und eine therapeutisch wirksame Menge eines Anti-Idiotypantikörperbestandteils, welcher konjugiert
ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein,
worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil
ein Epitop von CEA nachahmt. Der Anti-Idiotypantikörperbestandteil
kann gewählt
werden aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem polyklonalen Antikörper, der
mit dem variablen Bereich von Klasse III Anti-CEA-Antikörper bindet; (b)
einem monoklonalen Antikörper,
der mit der variablen Region von Klasse III Anti-CEA-Antikörper bindet;
(c) einem humanisierten Antikörper,
abgeleitet aus (b); (d) einem subhumanen Primaten-Antikörper, der
mit der variablen Region eines Klasse III Anti-CEA-Antikörpers bindet;
(e) einem humanen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper der mit dem variablen
Bereich eines Klasse III Anti-CEA-Antikörpers bindet und (f) einem
Antikörperfragment,
abgeleitet aus (a), (b), (c), (d) oder (e).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zum Induzieren
von humoralen und zellulären
Immunantworten in einem Säugetier
gegen einen Tumor, der TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit,
die verursacht wird durch ein infektiöses Reagenz, umfassend:
- (a) einen ersten Impfstoff zur Verabreichung
an das Säugetier,
worin der erste Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der
an das TAA bindet oder mit einem Antigen verbunden mit dem infektiösen Reagenz,
und worin der Antikörperbestandteil
konjugiert ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein;
- (b) einen Antikörper
oder antigenbindendes Fragment davon zur Verabreichung, worin der
Antikörper
oder das Fragment nicht konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen
Trägerprotein
und worin der Antikörper
oder das Fragment mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, verbunden
mit dem infektiösen
Reagenz; und
- (c) einem zweiten Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier,
worin der zweite Impfstoff einen Anti-Idiotypantikörper umfasst,
der ein Epitop des TAA oder das Infektionsreagenz-Antigen umfasst, und
worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil konjugiert
ist mit einem löslichen
immunogenen Trägerprotein.
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Bevorzugt
umfasst der erste Impfstoff einen Klasse III Anti-CEA-Antikörper, worin
der Antikörper von
Schritt (b) ein Klasse III Anti-CEA-Antikörper ist und worin der zweite
Impfstoff einen Antikörper
umfasst, der mit der variablen Region eines Klasse III Anti-CEA-Antikörpers bindet.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zur Behandlung
eines Patienten mit einem Tumor, der CEA exprimiert, umfassend einen bispezifischen
Antikörper
zur Verabreichung an den Patienten, worin der bispezifische Antikörper eine Einheit
umfasst, die mit dem CD3-Protein bindet und eine Einheit, die mit
dem CEA bindet, und worin die CEA-bindende Einheit abgeleitet ist
aus einem Klasse III Anti-CEA-Antikörper.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG
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1. Definitionen
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In
der folgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Ausdrücken extensiv
verwendet. Die folgenden Definitionen werden angegeben, um das Verständnis der
Erfindung zu erleichtern.
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Ein
Strukturgen ist eine DNA-Sequenz, die transkribiert wird in Messenger-RNA
(mRNA), welche dann translatiert werden können in eine Sequenz von Aminosäuren, die
charakteristisch für
ein spezifisches Polypeptid ist.
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Ein
Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens
leitet. Typischerweise ist ein Promotor im 5'-Bereich eines Gens angeordnet, nahe
dem Transkriptionsstartort eines Strukturgens. Wenn ein Promotor
ein induzierbarer Promotor ist, dann ist die Geschwindigkeit von
Transkription erhöht
in Erwiderung auf ein Induzierreagenz. Dahingegen ist die Transkriptionsgeschwindigkeit nicht
reguliert durch ein induzierendes Reagenz, wenn der Promotor ein
konstitutiver Promotor ist.
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Ein
isoliertes DNA-Molekül
ist ein Fragment von DNA, das nicht in dem DNA-Genom eines Organismus
integriert ist. Zum Beispiel ist ein kloniertes T-Zellrezeptorgen
ein DNA-Fragment, das getrennt worden ist aus der genomischen DNA
einer Säugetierzelle.
Ein anderes Beispiel eines isolierten DNA-Moleküls ist ein chemisches synthetisiertes DNA-Molekül, das nicht
in die genomische DNA eines Organismus integriert ist.
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Ein
Verstärker
ist ein DNA-regulierendes Element, das die Effizienz von Transkription
vergrößern kann,
unabhängig
vom Abstand oder Orientierung des Verstärkers relativ zum Transkriptionsstartort.
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Komplementäre DNA (cDNA)
ist ein einzelsträngiges
DNA-Molekül,
das gebildet ist aus einem mRNA-Templat durch das Enzym reverse
Transkriptase. Typischerweise wird ein Primer bzw. Starter eingesetzt,
der komplementär
zu Bereichen von mRNA ist, zum Start der reversen Transkription.
Fachleute verwenden auch den Ausdruck "cDNA",
um ein doppelsträngiges
DNA-Molekül
zu bezeichnen, das aus einem solchen einzelsträngigen DNA-Molekül und seinen
komplementären
DNA-Strang besteht.
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Der
Ausdruck Expression betrifft die Biosynthese eines Genprodukts.
Zum Beispiel involviert im Falle eines Strukturgens Expressiontranskription
von Strukturgen in mRNA und die Translation von mRNA in eines oder
mehrere Polypeptide.
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Ein
Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül wie ein Plasmid, Cosmid oder
Bakteriophage, das das Vermögen
hat, sich autonom in einer Wirtszelle zu replizieren. Klonierungsvektoren
enthalten typischerweise eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen,
an welchen Fremd-DNA-Sequenzen eingesetzt werden können in
einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer wesentlichen biologischen
Funktion des Vektors sowie als Markierungsgen, das in der Lage ist
zum Gebrauch bei der Identifizierung und Auswahl von Zellen, die
mit dem Klonierungsvektor transformiert sind. Markierungsgene umfassen
typischerweise Gene, die Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz ergeben.
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Ein
Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen umfasst, das
in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise wird Genexpression
angeordnet unter der Kontrolle von bestimmten Regulationselementen,
einschließlich
konstitutiven oder induzierbaren Promotoren, gewebespezifischen
Regulationselementen und Verstärkern.
Solch ein Gen wird als "operativ
verknüpft
an" die Regulatorelemente
vermutet.
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Ein
rekombinanter Wirt kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle
sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder Expressionsvektor
enthält.
Dieser Ausdruck umfasst auch jene prokaryotischen oder eukaryotischen
Zellen, die genetisch gebaut worden sind, um das klonierte Gen (die
klonierten Gene) im Chromosom oder Genom der Wirtszelle zu enthalten.
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Ein
tumorverbundenes Antigen ist ein Protein, das normalerweise nicht
exprimiert wird oder bei sehr geringen Gehalten exprimiert wird,
durch einen normalen Gegenspieler. Beispiele von tumorverbundenen
Antigenen umfassen α-Fetoprotein
und karzinoembryonisches Antigen (CEA).
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Wie
hierin verwendet bezeichnet ein infektiöses Reagenz sowohl Mikroben
als auch Parasiten. Eine "Mikrobe" umfasst Viren, Bakterien,
Rickettsia, Mycoplasma, Protozoa, Pilze und ähnliche Mikroorganismen. Ein "Parasit" bezeichnet Infektionen,
allgemein mikroskopische oder sehr kleine mehrzellulare Intervertebrate
oder Eier oder jugendliche Formen davon, welche geeignet sind, Antikörper-induziertes oder
lytische oder phagocytische Zerstörung hervorzurufen wie Malariaparasiten,
Spirocheten und dergleichen.
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Im
vorliegenden Kontext ist ein Anti-CEA-MAb ein Klasse III MAb, beschrieben
durch Primus et al., Cancer Research 43: 686 (1983) und durch Primus
et al., US-Patent Nr. 4,818,709, was als Referenz eingefügt ist.
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Wie
hierin verwendet ist ein Ab1 ein Antikörper, der mit einem tumorverbundenen
Antigen oder einem Antigen bindet, das mit einem infektiösen Reagenz
verbunden ist.
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Ein
Anti-Idiotypantikörper
(Ab2) wie hierin verwendet ist ein Antikörper, der mit einem Ab1 bindet.
Wichtig bindet ein Ab2 mit der variablen Region von Ab1 und daher
ahmt ein Ab2 ein Epitop eines Tumors nach, der verbunden ist mit
Antigen oder ein Epitop eines infektiösen Reagenzes, verbunden mit einem
Antigen.
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Ein
Antikörperfragment
ist ein Teil eines Antikörpers
wie F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab und dergleichen.
Unabhängig
von der Struktur bindet ein Antikörperfragment mit demselben
Antigen, das durch den intakten Antikörper erkannt wird, Zum Beispiel bindet
ein Anti-CEA-MAb (Ab1) Fragment mit CEA, während ein Ab2-Fragment mit
der variablen Region des Ab1 bindet und ein Epitop von CEA nachahmt.
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Der
Ausdruck "Antikörperfragment" umfasst auch jedes
synthetisch oder genetisch gebaute Protein, das als ein Antikörper durch
Binden an ein spezifisches Antigen wirkt, um einen Komplex zu bilden. Zum
Beispiel umfassen Antikörperfragmente
isolierte Fragmente bestehend aus der leichten kettenvariablen Region, "Fv"-Fragmenten, bestehend aus den variablen
Regionen der schweren und leichten Ketten, rekombinante Einzelkettenpolypeptidmoleküle, in welchen
leichte und schwere variable Regionen verbunden sind durch einen
Peptidverknüpfer
("sFv-Proteine") und Minimalerkennungseinheiten,
bestehend aus den Aminosäureresten,
die den hypervariablen Bereich nachahmen.
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Humanisierte
Antikörper
sind rekombinante Proteine, in welchen Mauskomplementarität, bestimmend
die Regionen von MAb, überführt worden
ist von schweren und leichten variablen Ketten von Mausimmunoglobulin
in eine menschliche variable Region.
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Wie
hierin verwendet umfasst der Ausdruck Antikörperbestandteil sowohl einen
gesamten Antikörper
als auch ein Antikörperfragment.
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Im
vorliegenden Kontext ist ein chimärer Immunoglobulin/T-Zellrezeptor
ein funktionaler T-Zellrezeptor, in welchem die variablen Regionen
von α- oder β-Polypeptidketten
ersetzt worden sind durch variable Segmente der schweren und leichten
Kette von entweder einem Antikörper
(Ab1) oder einem Anti-Idiotypantikörper (Ab2).
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Wie
hierin verwendet ist ein chimäres
Immunoglobulin/CD3-Protein ein rekombinantes Protein, das die Funktion
eines CD3-Polypeptids beibehält und
variable Segmente der schweren und leichten Kette von entweder einem
Ab1 oder einem Ab2 umfasst.
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2. Herstellung von monoklonalen
Antikörpern,
humanisierten Antikörpern,
Primatenantikörpern
und Menschantikörpern.
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Monoklonale
Nagerantikörper
gegen spezifische Antigene können
erhalten werden durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind. Siehe
zum Beispiel Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975) und Coligan
et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Band. 1, Seiten
2.5.1–2.6.7
(John Wiley & Sons
1991) [nachfolgend "Coligan"]. Kurz können monoklonale
Antikörper
erhalten werden durch Spritzen von Mäusen mit einer Zusammensetzung, die
ein Antigen umfasst, Überprüfen der
Gegenwart der Antikörperproduktion
durch Entfernen einer Serumprobe, Entfernen der Milz, um B-Lymphozyten
zu erhalten, Fusionieren der B-Lymphozyten mit Myelomazellen, um
Hybridomas zu erzeugen, Klonieren der Hybridomas, Auswählen positiver
Klone, welche Antikörper
gegen das Antigen erzeugen, Kultivieren der Klone, die Antikörper gegen
das Antigen erzeugen und Isolieren der Antikörper aus dem Hybridomakulturen.
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Eine
Vielzahl von monoklonalen Antikörpern gegen
tumorverbundene Antigene oder Infektionsreagenzien sind entwickelt
worden. Siehe zum Beispiel Goldenberg et al., internationale Patentveröffentlichung
Nr. WO 91/11465 (1991) und Goldenberg, internationale Patentveröffentlichung
Nr. WO 94/04702 (1994).
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Ein
Beispiel eines geeigneten Mab ist ein Klasse III Anti-CEA-Mab. Konventionelle
Antiseren, die gezogen sind gegen CEA enthalten gewöhnlich Antikörper, die
mit einer Gruppe von Substanzen reagieren, die eng verwandt sind
mit CEA. Die Hauptmitglieder dieser Familie oder CEA- verwandten
Antigene sind (1) das normale kreuzaktive Antigen (NCA), welches
eine gemeinsame Gewebeverteilung mit CEA teilt und (2) Meconium-Antigen
(MA), welches fast identische physikochemische Eigenschaften mit
CEA teilt. Die erste Palette von monoklonalen Antikörpern (MAb),
das NCA-kreuzreaktive, MA-kreuzreaktive und CEA-spezifische Epitope
an dem CEA-Molekül
definiert, ist beschrieben worden durch Primus et al., Cancer Research
43: 686 (1983). Insbesondere wurden drei Klassen von Anti-CEA-Antikörper identifiziert:
1)
Klasse I Antikörper,
welche kreuzreagieren mit CEA, NCA und MA; 2) Klasse II Antikörper, welche reagieren
mit CEA und MA, aber nicht mit NCA; und 3) Klasse III Antikörper, welche
spezifisch für
CEA sind und nicht mit NCA oder MA binden. Verfahren zum Erhalten
von Klasse III Anti-CEA-MAbs sind offenbart durch Primus et al.,
Cancer Research 43: 686 (1983) und Primus et al., US-Patent Nr.
4,818,709. Weiterhin ist die Erzeugung von Klasse III Anti-CEA-MABs
zweiter Generation offenbart durch Hansen et al., Cancer 71: 3478
(1993).
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MABs
können
isoliert und gereinigt werden aus Hybridomakulturen durch eine Vielzahl
wohletablierter Techniken. Solche Isolierungstechniken umfassen
Affinitätschromatographie
mit Protein-A-Sepharose, Größenausschlusschromatographie
und Ionenaustauschchromatographie. Siehe zum Beispiel Coligan auf
Seiten 2.7.1–2.7.12
und Seiten 2.9.1–2.9.3.
Siehe auch Baines et al., "Purification
of Immunoglobulin G (IgG)," in
METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Band. 10, Seiten 79–104 (The Humana
Press, Inc.k 1992).
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In
einer anderen Ausführung
ist ein Antikörper
der vorliegenden Erfindung ein subhumaner Primatenantikörper. Allgemeine
Techniken zum Anziehen therapeutisch verwendbarer Antikörper in
Pavianen können
gefunden werden zum Beispiel in Goldenberg et al., internationale
Patentveröffentlichung Nr.
WO 91/11465 (1991) und in Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310
(1990), welche hierin durch Bezugnahme miteingefügt sind.
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In
einer weiteren Ausführung
ist ein Antikörper
der vorliegenden Erfindung ein "humanisierter" monoklonaler Antikörper. Das
heißt,
Mauskomplementäre
bestimmende Bereiche werden übertragen von
schweren und leichten variablen Ketten des Mausimmunoglobulins in
einen menschlichen variablen Bereich, gefolgt von der Ersetzung
von einigen menschlichen Resten in den Netzwerkbereichen von deren
murinen Gegenspielern. Humanisierte monoklonale Antikörper in Übereinstimmung
mit dieser Erfindung sind geeignet für die Verwendung in therapeutischen
Verfahren. Allgemeine Techniken zum Klonieren von Mausimmunoglobulin
variablen Bereichen sind beschrieben zum Beispiel durch die Veröffentlichung
von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989).
Techniken zum Erzeugen von humanisierten MAbs sind beschrieben zum
Beispiel durch Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et
al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534
(1988), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992),
Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992) und Singer et al., J.
Immun. 150: 2844 (1993).
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In
einer anderen Ausführung
ist ein Antikörper
der vorliegenden Erfindung ein humaner monoklonaler Antikörper. Solche
Antikörper
werden erhalten aus transgenen Mäusen,
die "gebaut" worden sind, um
spezifische menschliche Antikörper
in Erwiderung auf antigene Herausforderung zu erzeugen. Bei dieser
Technik werden Elemente der menschlichen leichten und schweren Kettenorte
eingeführt
in Stämme
von Mäusen,
die abgeleitet sind aus embryonalen Stammzelllinien, die anvisierte
Unterbrechungen der endogenen Orte von schwerer Kette und leichter
Kette enthalten. die transgenen Mäuse können menschliche Antikörper synthetisieren,
die spezifisch gegen menschliche Antigene sind und die Mäuse können verwendet
werden, um humane Antikörper
sekretierende Hybridomas zu erzeugen. Verfahren zum Erhalten von
menschlichen Antikörpern aus
transgenen Mäusen
sind beschrieben durch Green et al., Nature Genet. 7: 13 (1994),
Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994) und Tayler et al., Int. Immun.
6: 579 (1994).
-
3. Herstellung
von Antikörperfragmenten
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fragmenten von
Ab1 oder Ab2. Antikörperfragmente
können
hergestellt werden durch proteolytische Hydrolyse des Antikörpers oder
durch Expression in E. coli der DNA, die für das Fragment codiert.
-
Antikörperfragmente
können
erhalten werden durch Pepsin- oder Papainverdauung der gesamten
Antikörper
durch konventionelle Verfahren. Zum Beispiel können Antikörperfragmente erzeugt werden
durch enzymatisches Spalten von Antikörpern mit Pepsin, um ein 5S-Fragment
zu erhalten, das bezeichnet wird als F(ab')2. Dieses Fragment kann
weiter gespalten werden unter Verwendung eines Thiolreduktionsmittels
und optional einer Schutzgruppe für die Sulfhydrylgruppen, resultierend
aus der Abspaltung von Disulfidbindungen, um 3.5S Fab'-monovalente Fragmente
zu bilden. Alternativ, eine enzymatische Spaltung unter Verwendung
von Pepsin erzeugt zwei monovalente Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment
direkt. Diese Verfahren sind beschrieben zum Beispiel durch Goldenberg,
US-Patent Nrn. 4,036,945 und 4,331,647 und Referenzen, die darin
enthalten sind. Sie auch Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys.
89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al.,
in METHODS IN ENZYMOLOGY Band 1, Seite 422 (Academic Press 1967)
und Coligan auf Seiten 2.8.1–2.8.10
und 2.10–2.10.4.
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Andere
Verfahren zum Spalten von Antikörpern
wie Trennung von schweren Ketten, um monovalente leichte-schwere
Kettenfragmente zu erzeugen, und weiteres Spalten von Fragmenten
oder andere enzymatische, chemische oder genetische Techniken können auch
verwendet werden, solange das Fragment das Antigen bindet, das durch
den intakten Antikörper
erkannt wird.
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Zum
Beispiel umfassen Fv-Fragmente eine Zuordnung von VH-
und VL-Ketten. Die Verbindung kann nicht
kovalent sein wie beschrieben in Inbar et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 69: 2659 (1972). Alternativ können variable Ketten verknüpft werden
durch intermolekulare Disulfidbindung oder kreuzverknüpft durch
Chemikalien wie Glutaraldehyd. Siehe zum Beispiel Sandhu, supra.
-
Bevorzugt
umfassen die Fv-Fragmente VH- und VL-Ketten, welche verknüpft sind durch einen Peptidverbinder.
Diese einzelkettenantigenbindenden Proteine (sFv) werden hergestellt
durch Konstruieren eines Strukturgens, umfassend DNA-Sequenzen, die die
VH- und VL-Domänen codieren,
welche verbunden sind durch ein Oligonukleotid. Das Strukturgen
wird eingefügt
in einen Expressionsvektor, welcher anschließend eingeführt wird in eine Wirtszelle
wie E. coli. Die rekombinanten Wirtszellen synthetisieren eine einzelne
Polypeptidkette mit einem Verbindungspeptid, was die beiden V-Domänen überbrückt. Verfahren
zum Erzeugen von sFvs sind beschrieben zum Beispiel durch Whitlow
et al., Methods: A Companion to Methods in Emzymology 2: 97 (1991).
Siehe auch Bird et al., Science 242: 423–426 (1988), Ladner et al.,
US.Patent Nr. 4,946,778, Pack et al., Bio/Technology 11: 1271–1277 (1993)
und Sandhu, supra.
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Eine
andere Form eines Antikörperfragments
ist ein Peptid, das für
einzelne komplementaritätsbestimmende
Region (CDR) codiert. CDR-Peptide ("Minimalerkennungseinheiten") können erhalten werden
durch Konstruieren von Genen, die das CDR eines Antikörpers von
Interesse codieren. Solche Gene werden hergestellt zum Beispiel
durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion, um die variable Region
von RNA aus antikörpererzeugenden
Zellen zu synthetisieren. Siehe zum Beispiel Larrick et al., Methods:
A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991).
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4. Produktion von Anti-Idiotypantikörpern (Ab2)
-
Polyklonaler
Ab2 kann hergestellt werden durch Immunisieren von Tieren mit Ab1
oder Fragmenten unter Verwendung von Standardtechniken. Siehe zum
Beispiel Green et al., "Production
of Polyclonal Antisera",
in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS, Manson (Hrsg.),
Seiten 1–12
(Humana Press 1992). Siehe auch Coligan auf Seiten 2.4.1–2.4.7.
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Altenativ
kann monoklonaler Ab2 auch hergestellt werden unter Verwendung von
Ab1 oder Fragmenten wie Immunogenen mit den Techniken, die oben
beschrieben sind. Die Herstellung eines Ratten monoklonalen Ab2
ist in Beispiel 3 veranschaulicht.
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Als
eine andere Alternative kann humanisierter Ab2 oder subhumaner Primaten
Ab2 hergestellt werden durch Verwendung der oben beschriebenen Techniken.
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5. Erzeugung
von bispezifischen Antikörpern
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Bispezifische
Antikörper
können
verwendet werden, um T-Zellen gegen eine Tumorzelle zu rekrutieren
und zielzusteuern. Ein bispezifischer Antikörper ist ein Hybridmolekül, das aus
nicht identischen leichten und schweren Kettenpaaren besteht, was zwei
unterschiedliche Antikörperspezifitäten ergibt. Zum
Beispiel sind bispezifische Antikörper erzeugt worden mit einer
Bindungsstelle, die CD3 signaltransduzierendes Protein auf T-Zellen
erkennt und einer zweiten Bindungsstelle für ein tumorverbundenes Antigen.
Siehe zum Beispiel Canevari et al., Int. J. Cancer 42: 18 (1988);
Lanzaveccia et al., Eur. J. Immunol. 17: 104 (1987); Van Dijk et
al., Int. J. Cancer 43: 344 (1989); und Renner et al., Science 264:
833 (1994).
-
Bispezifische
Antikörper
können
hergestellt werden durch eine Vielzahl herkömmlicher Verfahren, zum Beispiel
Disulfidspaltung und Reformierung von Gemischen von Gesamtantikörper oder
vorzugsweise F(ab')2-Fragmenten, Fusionierungen von mehr als
einem Hybridoma, um Polyomas zu formen, die Antikörper mit
als einer Spezifität
durch genetisches Zusammenbauen erzeugen. Bispezifische Antikörper sind
hergestellt worden durch oxidatives Spalten von Fab'-Fragmenten, die
resultieren aus reduktiven Spalten von verschiedenen Antikörpern. Wie
zum Beispiel Winter et al., Nature 349: 293 (1991). Dies wird vorteilhaft
ausgeführt
durch Mischen von zwei unterschiedlichen F(ab')2-Fragmenten,
erzeugt durch Pepsinverdau von zwei verschiedenen Antikörpern, reduktives
Spalten um ein Gemisch von Fab'-Fragmenten
zu erzeugen, gefolgt von oxidativer Reformierung der Disulfidbindungen,
um ein Gemisch von F(ab')2-Fragmenten zu bilden, einschließlich bispezifischer
Antikörper,
die einen Fab'-Teil
enthalten, der spezifisch für
jedes der Originalepitope ist. Allgemeine Techniken zur Herstellung
solcher Antikörperkomposite
können
zum Beispiel gefunden werden in Nisonhoff et al., Arch Biochem.
Biophys. 93: 470 (1961), Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968),
und US-Patent Nr. 4,331,647.
-
Selektivere
Verknüpfung
kann erzielt werden durch Verwendung eines heterobifunktionellen
Verknüpfers
wie Maleimidhydroxysuccinimidester. Reaktion des Esters mit einem
Antikörper
oder Fragment wird Amingruppen an dem Antikörper oder Fragment derivatisieren
und das Derivat kann reagiert werden mit z.B. einem Antikörper-Fab-Fragment mit
freien Sulfhydrylgruppen (oder einem größeren Fragment oder wechselwirken
mit Antikörper
mit Sulfhydrylgruppen, die daran angehängt sind, zum Beispiel durch
Traut's-Reagenz).
Solch ein Verknüpfer
ist weniger geneigt, Gruppen in demselben Antikörper kreuzzuvernetzen und verbessert
die Selektivität
der Verknüpfung.
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Es
ist vorteilhaft, die Antikörper
oder Fragmente an Stellen zu verknüpfen, die entfernt von den Antigenbindungsstellen
sind. Dies kann erzielt werden durch zum Beispiel Verknüpfen an
gespaltete Zwischenkettensulfhydrylgruppen wie oben angemerkt. Andere
Verfahren involvieren das Reagieren eines Antikörpers mit einem oxidierten
Kohlehydrat mit einem anderen Antikörper, der wenigstens eine freie
Aminfunktion hat. Dies resultiert in einer anfänglichen Schiff-Base (Imin-)-Verknüpfung, welche
bevorzugt stabilisiert wird durch Reaktion eines sekundären Amins,
zum Beispiel durch Borhydridreduktion, um einen endgültigen Komposit
zu bilden. Solche ortsspezifische Verknüpfungen sind offenbart für kleine
Moleküle
in US-Patent Nr. 4,671,958 und für
größere Anhänge in US-Patent
Nr. 4,699,784.
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Im
vorliegenden Zusammenhang umfasst ein bispezifischer Antikörper Bindungseinheiten
für T-Zellen
und ein Antigen, das verbunden ist mit einer Tumorzelle oder einem
infektiösen
Reagenz. Zum Beispiel kann eine CEA-Bindungseinheit abgeleitet werden
aus Klasse III Mab und die T-Zellbindungseinheit kann abgeleitet
werden aus Anti-CD3-Mab. Verfahren zum Herstellen von Anti-CD3-Antikörpern sind
wohlbekannt für
Fachleute. Siehe zum Beispiel Canevari et al., supra, Van Dijk et
al., supra, Hansen et al., "Human
T Lymphocyte Cell Surface Molecules Defined by the Workshop Monoclonal
Antibodies (T Cell Protocol)," in
LEUKOCYTE TYPING: HUMAN LEUKOCYTE MARKERS DETECTED BY MONOCLONAL
ANTIBODIES, Bernard et al., (Hrsg.) Seiten 195–212 (Springer-Verlag 1984);
und US-Patent Nr. 4,361,549. Alternativ können Anti-CD3-Antikörper erhalten
werden aus kommerziellen Quellen wie Boehringer Mannheim Corporation
(Indianapolis, IN; Cat. Nr. 1273 485) und der American Type Culture Collection
(Rockville, MD; ATCC CRL 8001 [OKT-3]).
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Zum
Beispiel kann ein bispezifischer Antikörper hergestellt werden durch
Erhalten eines F(ab')2-Fragments aus einem Anti-CEA-Klasse III-Mab
wie oben beschrieben. Die Zwischenkettendisulfidbrücken des
Anti-CEA-Klasse III-F(ab')2-Fragments werden weich mit Cystein reduziert
unter Vorsicht, um Verknüpfung
von leichter und schwerer Kette zu vermeiden, um Fab'-SH-Fragmente zu
bilden. Die SH-Gruppe(n) ist (werden) aktiviert mit einem Überschuss
von Bis-Maleimidverknüpfer
(1,1'-(Methylendi-4,1-Phenylen)Bis-Maleimid).
Das Anti-CD3 Mab wird umgewandelt in Fab'-SH und dann reagiert mit dem aktivierten
anti-CEA Klasse III Fab'-SH
Fragment, um einen spezifischen Antikörper zu erhalten.
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Alternativ
können
solche bispezifischen Antikörper
erzeugt werden durch Fusionieren von zwei Hybridomazelllinien, die
Anti-CD3-Mab und Anti-CEA-Klasse III-Mab erzeugen. Techniken zum
Erzeugen von Tetradomas sind beschrieben zum Beispiel durch Milstein
et al., Nature 305: 537 (1983) und Pohl et al., Int. J. Cancer 54:
418 (1993).
-
Schließlich können bispezifische
Antikörper hergestellt
werden durch genetisches Zusammenbauen. Zum Beispiel Plasmide, die
DNA enthalten, die für
variable Bereiche eines Anti-CEA-Klasse III-Mabs codieren, können eingeführt werden
in Hybridomas, die Anti-CD3-Antikörper sekretieren. Die resultierenden "Transfektomas" erzeugen bispezifische Antikörper, die
CEA und CD3 binden können.
Alternativ können
chimäre
Gene entworfen werden, die sowohl Anti-CD3 als auch Anti-CEA-Bindungsdomänen codieren.
Allgemeine Techniken zum Erzeugen von bispezifischen Antikörpern durch
genetisches Zusammenbauen werden beschrieben zum Beispiel durch
Songsivilai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 271 (1989);
Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991); und Weiner et al., J.
Immunol. 147: 4035 (1991).
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6. Die Verwendung von
Antikörpern
und Cytokinen, um die humorale und zelluläre Immunantwort gegen Tumorzellen
und infektiöse
Reagenzien zu verstärken
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von
Ab1, Ab2, erzeugt gegen Ab1 und Fragmenten von entweder Ab1 oder
Ab2. Diese Antikörper
und Fragmente können
verwendet werden als Impfstoffe, um sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten
in einem Empfängersäugetier
auszulösen.
Darüber
hinaus kann die Verabreichung von Ab1 und/oder bispezifischen Antikörpern verwendet
werden, um die integrierte Immunantwort zu verstärken.
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Gemäß einem
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Säugetier immunisiert mit einem Impfstoff,
umfassend Ab1 oder Fragmente davon, um die Erzeugung von Ab2 und
T-Zellen (T2-Zellen) zu induzieren. Nachdem das Säugetier
beginnt, T2-Zellen
zu erzeugen, kann dem Säugetier
Ab1 oder Fragmente davon durch intravenöse Verabreichung verabreicht
werden, um die T2-Zellenmasse zu vergrößern. Ein zusätzlicher
Vorteil dieser zweiten Verabreichung ist, dass die Antikörper oder
Fragmente mit Erkennungsantigen an Krebszellen oder infektiösen Organismen
binden und daher als Ziele für
T2-Zellen dienen. Verfahren zum Detektieren der Erzeugung von T-Zellen,
die mit spezifischen Antikörpern
reagieren sind wohlbekannt für
Fachleute. Siehe zum Beispiel Fagerberg et al., Cancer Immunol.
Immunother. 37: 264 (1993).
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Gemäß einem
bevorzugten Verfahren wird ein Säugetier
aufeinanderfolgend immunisiert mit einem Impfstoff, umfassend Ab2
oder Fragmenten davon, um die Bildung von Ab3 und T-Zellen zu induzieren,
die Ab2 erkennen (T3-Zellen). Ein Vorteil dieser nachfolgenden Ab2-Impfung
ist, dass Zellen einen Tumor exprimieren, der verbunden ist mit
Antigen oder infektiösem
Reagenzantigen, zerstört
werden durch T3-Zellen,
die gegen das Antigen gerichtet sind und durch T2-Zellen, die gegen
Ab3 gerichtet sind, welches auch durch das Antigen gebunden wird.
Beispiel 4 veranschaulicht ein Verfahren einer Behandlung, umfassend
die Verabreichung eines Ab1-Impfstoffs,
AB1 (oder Fragmente) und eines Ab2-Impfstoffs.
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Zusätzlich kann
die T2-Antwort weiterhin verstärkt
werden durch die intravenöse
Verabreichung von Ab1-Antikörpern
oder Fragmenten nach Ab2-Impfung.
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Es
ist möglich,
dass die Effizienz der Ab2-Impfung vermindert werden kann durch
die Gegenwart von zirkulierenden Ab1-Antikörpern, welche intravenös verabreicht
worden sind. Daher ist es vorteilhaft, zirkulierendes Ab1 vor der
Verabreichung von Ab2-Impfstoff
heraus zu entfernen. Ein Verfahren, das verwendet werden kann, um
Ab1-Entfernung zu
erzielen ist, Ab1-Antikörper
zu verwenden, die mit Biotin konjugiert worden sind. Auf diese Weise kann
zirkulierendes biotinyliertes Ab1 entfernt werden vor Ab1-Verabreichung
durch die intravenöse Verabreichung
von Avidin. Vorzugsweise wird Entfernung mit Avidin ein oder zwei
Tage nach der intravenösen
Verabreichung von Ab1 (oder Fragmenten davon) ausgeführt. Diese
Antikörperentfer nungstechnik ist
beschrieben durch Goldenberg, internationale Patentanmeldungsveröffentlichung
Nr. WO 94/04702 (1994).
-
In
einem alternativen Verfahren der Immunotherapie wird ein Säuger immunisiert
mit einem Ab1-Impfstoff, behandelt mit Ab1 (oder Fragmenten), um
einen hohen Prozentanteil an Tumor oder infektiösen Reagenzantigenorten zu
sättigen
und dann hyperimmunisiert mit Ab1-Impfstoff, um eine große Anzahl
von cytotoxischen Lymphozyten zu erzeugen, die gegen Zellen gerichtet
sind, die mit Ab1 beschichtet sind (oder Fragmenten davon).
-
Gemäß bevorzugten
Immunotherapieverfahren wird die Immunantwort weiter verstärkt durch
die Verabreichung von Cytokinen. Beispiele von Cytokinen umfassen
die Interferone (INFs), Interleukine (Ils) und Tumornekrosefaktoren. γ-INF induziert
Makrophagen sowie Zelloberflächen
Klasse II Histokompatibilitätsantigene
an Lymphoidzellen und Monocyten. Siehe zum Beispiel Klegerman et
al., "Lymphokines
and Monokines",
in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al. (Hrsg.), Seiten 53–70 (Chapman & Hall 1993), und
Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3. Auflage, Seiten 7.8–7.14 (Mosby 1993). IL-2 ist
ein T-Zellwachstumsfaktor und ein Stimulator von natürlichen
Killerzellen und tumorreaktiven T-Zellen. Id. Daher sind γ-INF und
IL-2 bevorzugte Cytokine
für die
Verstärkung
der Immunantwort.
-
Die
Antikörper
und Fragmente der vorliegenden Erfindung können verwendet werden als Impfstoffe
durch Konjugieren der Antikörper
oder Fragmente an ein lösliches
immunogenes Trägerprotein. Geeignete
Trägerproteine
umfassen Schlüsselloch-Lympethemocyanin,
welches das bevorzugte Trägerprotein
ist. Die Antikörper
und Fragmente können
konjugiert werden an das Trägerprotein
unter Verwendung von Standardverfahren. Siehe zum Beispiel Hancock
et al., "Synthesis
of Peptides for Use as Immunogens," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: IMMUNOCHEMICAL
PROTOCOLS, Manson (Hrsg.), Seiten 23–32 (Humana Press 1992).
-
Eine
bevorzugte Impfstoffzusammensetzung umfasst ein Antikörperkonjugat
oder Fragmentkonjugat und ein Adjuvans. Beispiele von geeigneten
Adjuvanzien umfassen Aluminiumhydroxid und Lipid. Verfahren zum
Formulieren von Impfstoffzusam mensetzungen sind Fachleuten wohlbekannt.
Siehe zum Beispiel Rola, "Immunizing
Agents and Diagnostic Skin Antigens", in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SIENCES, 18. Auflage,
Gennaro (Hrsg.), Seiten 1389–1404
(Mack Publishing Company 1990).
-
Weitere
pharmazeutische Verfahren können eingesetzt
werden, um die Wirkungsdauer eines Impfstoffs in einer therapeutischen
Anwendung zu regeln. Kontrollierte Freisetzungszusammensetzungen können hergestellt
werden durch die Verwendung von Polymeren, um die Antikörper oder
Fragmente zu komplexieren oder absorbieren. Zum Beispiel umfassen
biokompatible polymere Matrizes von Poly(ethylen-Covinylacetat) und Matrizes von Polyanhydridcopolymer
eines Stearinsäuredimers
und von Sebacinsäure.
Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). Die Geschwindigkeit
der Freisetzung eines Antikörpers
oder Antikörperfragments
aus solch einer Matrix hängt
vom Molekulargewicht des Antikörpers
oder Fragments, der Menge an Antikörper oder Fragment in der Matrix
und der Größe dispergierter
Partikel ab. Saltzman, et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood
et al., supra. Andere Festkörperdosierungsformen
sind beschrieben in Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG
DELIVERY SYSTEMS, 5. Auflage (Lea & Febiger 1990), und Gennaro (Hrsg.),
REMINGTON'S PHARMACEUTICAL
SCIENCES, 18. Auflage (Mack Publishing Company 1990).
-
Die
Antikörperpräparationen
der vorliegenden Erfindung können
formuliert werden gemäß bekannten
Verfahren, um pharmazeutisch verwendbare Zusammensetzungen herzustellen,
wodurch Antikörper
oder Antikörperfragmente
kombiniert werden in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen
Träger.
Eine Zusammensetzung wird als "pharmazeutisch
verträglicher
Träger" vermutet, wenn ihre Verabreichung
durch einen Säugetierempfänger toleriert
werden kann. Sterile phosphatgepufferte Salzlösung ist ein Beispiel eines
pharmazeutisch verträglichen
Trägers.
Andere geeignete Träger
sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Ansel
et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5.
Auflage (Lea & Febiger
1990), und Gennaro (Hrsg.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (Mack
Publishing Company 1990).
-
Die
Antikörper
oder Fragmente können
verabreicht werden an ein Säugetier
intravenös
oder subkutan. Weiterhin kann die Verabreichung durch kontinuierliche
Infusion oder durch einzelne oder mehrere große Pillen bestehen. Bevorzugt
wird ein Antikörperimpfstoff
subkutan verabreicht werden, während
eine Antikörperherstellung,
die nicht ein Impfstoff ist, intravenös verabreicht wird. Allgemein wird
die Dosierung von verabreichten Antikörpern oder Fragmenten für Menschen
variieren abhängig von
solchen Faktoren wie dem Alter des Patienten, Gewicht, Größe, Geschlecht,
allgemeiner medizinischer Zustand und medizinischer Vorgeschichte.
Typischerweise ist es gewünscht,
den Empfänger
mit einer Dosierung von Antikörpern
oder Fragmenten zu versorgen, welche im Bereich von etwa 1 pg/kg
bis 10 mg/kg ist (Menge Reagenz/Körpergewicht des Patienten),
obwohl eine niedrigere oder höhere
Dosierung auch verabreicht werden kann wie es die Umstände erzwingen.
-
Für Therapiezwecke
werden Antikörper
oder Fragmente verabreicht an ein Säugetier in einer therapeutisch
wirksamen Menge. Eine Antikörperpräparation
wird als verabreicht in einer "therapeutisch wirksamen
Menge" vermutet,
wenn die Menge, die verabreicht wird, physiologisch signifikant
ist. Ein Reagenz ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart
in einer detektierbaren Änderung
in der Physiologie eines Empfängersäugetiers
resultiert. Insbesondere ist eine Antikörperpräparation der vorliegenden Erfindung
physiologisch signifikant, wenn ihre Gegenwart humorale und/oder
zelluläre
Immunantwort in dem Empfängersäugetier
hervorruft.
-
Ein
Cytokin wie γ-INF
oder IL-2 kann verabreicht werden vor und während der Verabreichung eines
Ab1-Impfstoffs oder eines Ab2-Impfstoffs. Alternativ kann γ-INF und
IL-2 verabreicht werden zusammen vor oder während der Verabreichung eines
Antikörperimpfstoffs.
Cytokine werden verabreicht an das Säugetier intravenös, intramuskular
oder subkutan. Zum Beispiel kann rekombinantes IL-2 intravenös verabreicht
werden als eine Pille bei 6 × 105 IU/kg oder als kontinuierliche Infusion
bei einer Dosis von 18 × 106 IU/m2/d. Weiss
et al., J. Clin. Oncol. 10: 275 (1992). Alternativ kann rekombinantes
IL-2 subkutan verabreicht werden bei einer Dosis von 12 × 106 IU. Vogelzang et al., J. Clin. Oncol. 11:
1809 (1993). Darüber
hinaus kann γ-INF
subkutan verabreicht werden bei einer Dosis von 1,5 × 106 U. Lienard et al., J. Clin. Oncol. 10:
52 (1992). Geeignete IL-2-Formulierungen umfassen PROLEUKIN (Chiron
Corp./Cetus Oncology Corp.; Emeryville, CA) und TECELEUKIN (Hoffman-La
Roche, Inc.; Nutley, NJ), während ACTIMMUNE
(Genentech, Inc.; South San Francisco, CA) eine geeignete γ-INF-Präparation
ist.
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Zusätzlich können bispezifische
Antikörper verabreicht
werden nach der anfänglichen
Ab1-Behandlung. Die Funktion der bispezifischen Antikörper ist
es nicht, Lymphozyten mit CEA-tragenden Tumorzellen zu verbrücken und
die Lymphozytenvermittelte Cytolyse auszulösen. Bispezfische Antikörper können gemäß den oben
beschriebenen allgemeinen Richtlinien verabreicht werden. Hingegen
werden bispezifische Antikörper
anders als Antikörperimpfstoffe
nicht konjugiert mit Immunogenen.
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Fachleute
werden schätzen,
dass die oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um
Prophylaxe gegen infektiöse
Reagenzien zu ergeben. Daher betrifft die vorliegende Erfindung
die Verwendung von Verfahren, die hierin beschrieben sind, um Schutz
für ein
Säugetier
vor Aussetzen gegenüber
infektiösen
Reagenzien zu ergeben.
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7. Herstellung und therapeutische
Verwendung von T-Zellen, die chimäre Immunoglobulin/T-Zellrezeptoren
oder chimäre
Immunoglobulin/CD3-Proteine exprimieren
-
T-Zellen
können
aufgeteilt werden in zwei gegenseitig ausschließende Populationen: T-Zellen, die α- und β-T-Zellrezeptor-(TCR)-Polypeptide
exprimieren, und T-Zellen, die γ-
und δ-TCE-Polypeptide exprimieren.
Siehe allgemein Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3. Auflage (Mosby 1993)
und Bolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother. 34: 1 (1991). Das αβ-Polypeptidset
wird exprimiert zu mehr als 95% von peripheren T-Zellen und eine
breite Mehrheit von TCR-exprimierenden Thymocyten. Dagegen wird das γδ-Polypeptidset
exprimiert zu einem geringeren Anteil von T-Zellen im Thymus und sekundären lymphatischen
Organen, während
die γδ-T-Zellen
häufig in
verschiedenen Epithelien sind.
-
Jede
Polypeptidkette eines TCR-Heterodimers umfasst zwei externe variable
und konstante Immunoglobulin-artige Bereiche, die verankert sind in
der Plasmamembran durch ein Transmembranpeptid und einen kurzen
cytoplasmatischen Schwanz. Die N-terminalen Bereiche der TCR-Polypeptide
enthalten variable Bereiche, die homolog sind mit den variablen
Bereichen von Immunoglobulinen. Darüber hinaus hat die Analyse
dieser TCR-variablen Bereiche Bereiche enthüllt von relativ großer Variabilität, welche
den Immunoglobulin-hypervariablen Regionen (CDRs) entsprechen. Die
variablen Domänen
von αβ- und γδ-Polypeptiden
werden vermutet als in einer Weise, die ähnlich zur Verbindung von VH/VL-Bereichen von
Immunoglobulinmolekülen
ist, unter Verbrückung
von sechs TCR-hypervariablen Bereichen miteinander, um eine Antigenbindungsstelle
zu bilden.
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TCR-αβ- und γδ-Polypeptide
sind sowohl nicht kovalent gebunden mit einer Reihe von Polypeptiden
(γ, δ, ε, ζ und η), kollektiv
bezeichnet als CD, um den vollständigen
TCR-Komplex zu bilden. Im Gegensatz zu den TCR-Polypeptiden zeigen
die Aminosäuresequenzen
von CD3-Komponenten keine Variabilität an verschiedenen T-Zellen und daher können die
CD3-Komponenten nicht die Vielfalt erzeugen, die verbunden ist mit
TCR-Polypeptiden. Anstatt dessen ist die CD3-Komponente des TCR-Komplexes erforderlich
für die
Transduktion von Signalen, die generiert werden durch TCR-Antigen-Wechselwirkung.
-
Allgemein
erkennen T-Zellen, die zellgebundenes Antigen erkennen in Verbindung
mit Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekülen an der Oberfläche der
Antigen-präsentierenden
Zelle. Hingegen sind Verfahren verfügbar, um T-Zellen zu erzeugen,
die anvisiert werden auf spezielle Tumoren und die nicht MHC-eingeschränkt sind.
Bispezifische Antikörper,
die oben beschrieben sind, ergeben einen Ansatz zum Anvisieren von
T-Zellen. Ein anderer Ansatz ist es, genetisch T-Zellen zu bauen mit chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptoren.
Um effektiv zu sein, müssen
die chimären
Immunoglobulin/TCRs exprimiert werden durch T-Zellen in einer stabilen Weise
und die chimären
Immunoglobulin/TCRs müssen
eine funktionale Verbindung mit CD3-signaltransduzierenden Polypeptiden
bilden.
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Funktionale
chimäre
Immunoglobulin/TCRs sind erzeugt worden, in welchen die variablen
Gensegmente der TCR-α-
und β-Ketten
ersetzt wurden durch variable Gensegmente von der schweren und leichten
Kette eines Immunoglobulins. Siehe als Beispiel Becker et al., Cell
58: 911 (1989), Eshhar et al., Br. J. Cancer 62 (Suppl. 10): 27
(1990), Goverman et al., Cell 60: 929 (1990), Gross et al., Transplant
Proc. 21: 127 (1989a) und Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86: 10024 (1989b). Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion
von chimären
Immunoglobulin/TCRs, in welchen TCR-α- und -β-Ketten ersetzt werden durch
variable Gensegmente der schweren und leichten Kette von entweder
einem Ab1 oder einem Ab2.
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Zusätzlich sind
funktionelle chimäre
Immunoglobulin/CD3-Proteine erzeugt worden, in welchen DNA-Fragmente,
die Immunoglobulin-variable Segmente codieren, wurden fusioniert
mit DNA-Fragmenten, die γ, ζ oder η CD3-Polypeptide
codieren. Siehe zum Beispiel, Seed et al., internationale Anmeldungsveröffentlichung
Nr. WO 92/15322 (1992) und Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90: 720 (1993). Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die
Konstruktion von chimären
Immunoglobulin/CD3-Proteinen, umfassend variable Gensegmente der
schweren und leichten Kette von entweder einem Ab1 oder einem Ab2.
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Chimäre Immunoglobulin/TCRs
und chimäre Immunoglobulin/CD3-Proteine
können
konstruiert werden unter Verwendung von Standardtechniken. Typische
Techniken sind veranschaulicht durch die folgenden Verfahren, die
verwendet werden können, um
ein Anti-CEA-(oder Ab2)/TCR zu konstruieren.
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DNA-Moleküle, die
die variablen Regionen von Anti-CEA-Mab oder Anti-Iodiotyp-Mab codieren, können synthetisiert
werden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit RNA aus
Hybridomas, die Antikörper
erzeugen. Allgemeine Techniken für die
Synthese von Maus-variablen Regionen und geeigneten Primern sind
beschrieben zum Beispiel durch Orlandi et al., supra, Larrick et
al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991) und
durch Kang et al., Id., bei 111.
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Verfahren
zum Erhalten von DNA-Molekülen,
die humane T-Zellrezeptorpolypeptide codieren, sind Fachleuten wohlbekannt.
Siehe zum Beispiel Bougueleret et al., Immunogenetics 26: 304 (1987) und
Luria et al., EMBO J. 6: 3307 (1987). Weiterhin sind Techniken zum
Konstruieren von chimären
Immunoglobulin/TCRs und Einfügen
von chimären
Genen in Expressionsvektoren beschrieben worden zum Beispiel durch
Becker et al., supra, Eshhar et al., supra, Goverman et al., supra,
Gross et al. (1989a) supra und Gross et al. (1989b), supra. Weiterhin
sind Standardprotokolle zum Konstruieren von Immunoglobulinfusionsproteinen
beschrieben worden durch Coligan auf Seiten 10.19.1–10.19.11.
Bevorzugte Expressionsvektoren enthalten einen dominanten selektierbaren
Markierer für
die Erzeugung von stabil transfizierten Zellen.
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Expressionsvektoren,
umfassend chimäre Immunoglobulin/TCR-Gene
werden induziert in menschliche T-Zellen. Menschliche periphere
Blutzellen können
erhalten werden durch einfache Venipunkture und fraktioniert durch
Ficoll-Hypaque-Gradiententrennung,
um eine mononukleare Zellfraktion zu erhalten. Siehe zum Beispiel
Goligan auf Seiten 7.1.1–7.1.2.
T-Zellen werden dann getrennt von anderen mononuklearen Zellen unter
Verwendung eines Zurücksetzungsvorgangs.
Id. auf Seiten 7.2.1–7.2.4.
Expressionsvektoren werden induziert in die menschliche T-Zellfraktion durch
Elektroporation oder andere wohlbekannte Techniken. Siehe zum Beispiel
Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992) und Coligan auf Seiten 10.13.2–10.17.7.
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Alternativ
können
chimäre
Immunoglobulin/TCRs induziert werden in T-Zellen durch Retrovirus-vermittelten
Gentransfer. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass sämtliche
proviralen Kopien stabil integriert werden in die Chromosomen der
T-Zellen und diese konstitutive Expression von chimären Immunoglobulin/TCRs
sicherstellt. Verfahren zum Transfizieren von menschlichen T-Zellen
durch Retrovirus-vermittelten Gentransfer sind beschrieben durch
Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 473 (1990), Rosenberg
et al., N. Engl J. Med. 323: 570 (1990) und Morecki et al., Cancer
Immunol. Immunother. 32: 342 (1991).
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Transfizierte
Zellen, die den Expressionsvektor tragen, sind gewählt unter
Verwendung eines dominanten selektierbaren Markers. Zum Beispiel
kann G418 verwendet werden, um transfizierte T-Zellen auszuwählen, die
einen Expressionsvektor tragen, der das Aminoglycosid-Phosphotransferasegen
hat. Southern et al., J. Mol. Appl. Gen 1: 327 (1982). Ein Verfahren
für G418-Selektion
von transfizierten menschlichen T-Zellen ist beschrieben durch Morecki et
al., supra. Alternativ kann Hygromycin-B verwendet werden, um transfizierte
Zellen zu selektieren, die einen Expressionsvektor tragen mit dem
Hygromycin-B-Phosphotransferasegen. Palmer et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84: 1055 (1987). Weiterhin kann Aminopterin und Mycophenolsäure verwendet
werden, um transfizierte Zellen auszuwählen, die einen Expressionsvektor tragen
mit dem Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegen. Mulligan et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981).
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Stabil
transfizierte T-Zellen müssen
expandiert werden in Kultur bevor die T-Zellen einem Patienten verabreicht
werden. Die Vermehrung der T-Zellen kann induziert werden durch
Inkubieren der Zellen mit dem geeigneten Antigen. Zum Beispiel kann
eine gereinigte Herstellung von CEA verwendet werden, um die Vermehrung
von T-Zellen zu
induzieren, die chimäre
Anti-CEA-TCR-Polypeptide exprimieren, wohingegen eine gereinigte
Präparation
von Anti-CEA-Antikörper
(oder Fragmenten davon) verwendet werden kann, um T-Zellen zu stimulieren,
die die chimären
Anti-Idiotyp/TCR-Polypeptide
exprimieren. Eine Standardtechnik für Antigen induzierte T-Zellvermehrung ist
beschrieben durch Coligan auf Seite 7.10.4. Im vorliegenden Zusammenhang
ist eine andere wichtige Funktion von Antigen induzierter T-Zellvermehrung die Überprüfung der
Gegenwart von funktionellem Immunoglobu-lin/TCR oder funktionellem Immunoglobulin/CD3-Protein.
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Nach
Kulturerweiterung werden T-Zellen dem Patienten zurückgegeben
durch intravenöse
Infusion oder durch intraperitoneale Verabreichung. Siehe zum Beispiel
Rosenberg et al., Science 233: 1318 (1986), Rosenberg et al., N.
Engl. J. Med. 319: 1676 (1988), Hercend et al., J. Biol. Response
Modif. 9: 546 (1990), Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 570
(1990) und Bartholeyns et al., Anticancer Res. 11: 1201 (1991).
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Zusammenfassend
kann genetisches Aufbauen (genetic engineering) verwendet werden,
um transformierte menschliche T-Zellen zu bilden, die chimäre Immunoglobulin/TCRs
oder chimäre
Immunoglobulin/CD3-Proteine exprimieren. T-Zellen, die Ab1/TCRs
oder Ab1/CD3-Proteine exprimieren, entsprechen T3-Zellen, während T-Zellen, die Anti-Idiotyp
(Ab2)/TCRs oder Ab2/CD3-Proteine exprimieren, T2-Zellen entsprechen.
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Einige
Verfahren können
verwendet werden, um die Effizienz von adoptiver Immunotherapie
zu erhöhen.
Nach Verabreichung von T-Zellen, die Ab1/TCRs oder Ab1/CD3-Proteine
exprimieren, kann ein Ab2-Impfstoff verabreicht werden, um die infusierten
T-Zellen in vivo zu erweitern. Ähnlich
kann die Verabreichung von T-Zellen, die Ab2/TCRs oder Ab2/CD3-Proteine
exprimieren, gefolgt sein von Ab1-Impfung. In beiden Fällen kann
die Immunantwort weiter vermehrt werden durch Verabreichung von γ-INF, IL-2
oder γ-INF
und IL-2 nach der Verabreichung von transformierten T-Zellen. Daher kann Antikörperimpfung
und Cytokinbehandlung verwendet werden, um die Effizienz von adaptiver
Immunotherapie mit transformierten T-Zellen zu komplimentieren und
zu vergrößern.
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Die
vorliegende Erfindung, daher allgemein beschrieben, wird besser
verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele,
welche als Veranschaulichung angegeben sind und nicht zur Begrenzung
der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind.
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BEISPIEL 1
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Erzeugung von murinem
Anti-CEA-Mab (MN-14)
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Die
Herstellung von MN-14, einem Klasse III Anti-CEA-MAb ist beschrieben
worden von Hansen et al., Cancer 71: 3478 (1993). Kurz gefasst wurde eine
20 Gramm BALB/c weibliche Maus subkutan immunisiert mit 7,5 μg von teilweise
gereinigtem CEA in vollständigem
Freudschen Adjuvans. Am Tag 3 wurde die Maus subkutan mit 7,5 μg CEA in
unvollständigem
Freudschen Adjuvans angeregt und dann wurde die Maus intravenös mit 7,5 μg CEA in
Salzlösung an
den Tagen 6 und 9 angeregt. Am Tag 278 wurde der Maus 65 μg CEA intravenös in Salzlösung zugegeben
und 90 μg
CEA in Salzlösung
am Tag 404. Am Tag 407 wurde die Maus geopfert, eine Zellsuspension
der Milz wurde hergestellt, die Milzzellen wurden fusioniert mit
Maus-Myelomazellen,
SP2/0-Ag 14 (ATCC CRL 1581) unter Verwendung von Polyethylenglykol
und die Zellen wurden kultiviert in einem Medium, das 8-Azaguanin
enthält.
Hybridomaüberstände wurden
gescreent für
CEA-reaktiven Antikörper
unter Verwendung eines 125I-CEA-Radioimmunotests
(Roche; Nutley, NJ). Positive Klone wurden umkloniert.
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Ein
Klon, bezeichnet als MN-14, hatte Eigenschaften ähnlich zu Klasse III Anti-CEA-spezifischem MAb,
NP-4, war nicht reaktiv mit normalem kreuzreaktiven Antigen und
Meconiumantigen. Hingegen zeigte MN-14, verglichen mit NP-4 signifikant
sich über legen
bei Tumoranvisieren in einem menschlichen Darmtumorxenograftmodell
und konsistent stärkeren
Anfärben
von Gefrierschnitten von Darmkrebs.
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BEISPIEL 2
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Herstellung von CDR-versetztem
MN-14 (hMN-14) und hAb1-Impfstoffen (hMN-14-Impfstoff)
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Ein
modifizierter Antikörper
wurde hergestellt, in welchem komplementäre bestimmende Regionen (CDR)
von MN-14 eingesetzt waren in die Gerüstbereiche von humanem IgG1-Antikörper.
Der CDR-gepfropfte ("humanisierte") MN-14-Antikörper wurde "hMN-14" bezeichnet. Allgemeine
Techniken zur Herstellung humanisierter Antikörper sind beschrieben zum Beispiel
von Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature
332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit.
Rev. Biotech. 12: 437 (1992) und Singer et al., J. Immun. 150: 2844
(1993).
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Um
hMN-14-Impfstoff herzustellen, wurde hMN-14 konjugiert mit Schlüssellochlympethemocyanin.
Typischerweise werden Patienten immunisiert mit subkutanen Injektionen
des Konjugats (2 mg/Injektion) vermischt mit 100 μl (107 Organismen) von Tice Bacillus Calmette-Guérin (Organon;
West Orange, NJ).
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BEISPIEL 3
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Herstellung von monoklonalem
Ratten-Ab2 gegen MN-14 (WI2) und Ab2-Impfstoff (WI2-Impfstoff)
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Ratten-Ab2
gegen MN-14 wurde hergestellt wie beschrieben von Losman et al.,
Int. J. Cancer 56: 580 (1994), welches als Referenz eingefügt ist.
Kurz gefasst wurden 3 Wochen alte weibliche Kopenhagen Ratten intraperitoneal
eingespritzt mit 200 μg
von MN-14 F(ab')2-Fragmenten, emulgiert in vollständigem Freudschem
Adjuvans. Die Tiere wurden angeregt bei Tagen 200, 230 und 235 mit
derselben Menge von Antigen in unvollständigen Freudschen Adjuvans.
Vier Tage nach der letzten Injektion wurden die Tiere geopfert,
Milzzellsuspensionen wurden hergestellt und die Zel len wurden fusioniert
mit murinem nicht sekretierendem Plasmocytoma SP2/0 unter Verwendung
von Standardtechniken. Hybridomazellen wurden kultiviert in Gegenwart
von Ratten-peritonealen Makrophagen (10.000 Zellen/200 μl Kulturloch).
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Kulturüberstände wurden
gescreent durch ELISA auf Reaktivität mit MN-14 und Abwesenheit von
Reaktivität
mit murinen Kontroll-MAbs. Positive Hybridomas wurden wenigstens
zweimal durch begrenzende Verdünnung
in Gegenwart von Ratten-peritonalen
Makrophagen geklont.
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WI2
ist ein IgG1k-Ab2, welcher spezifisch ist für MN-14
und reagiert nicht mit anderen Isotyp-gemischten Anti-CEA-MAbs.
Immunisierung von Mäusen
oder Kaninchen mit WI2 (aber nicht Kontrollratten-IgG) induzierte
die Erzeugung von Ab1'-Anti-CEA-Antikörpern. Daher
kann WI2 verwendet werden als ein Idiotypimpfstoff für Patienten
mit CEA-erzeugenden Tumoren.
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WI2-Impfstoff
wird hergestellt aus WI2 wie beschrieben für die Herstellung von hMN-14-Impfstoff.
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BEISPIEL 4
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Behandlung mit hMN-14-Impfstoff
(hAB1-Impfstoff) und WI2-Impfstoff (Ab2-Impfstoff)
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Ein
Patient mit Dukes C Darmkarzinom unterlief einer ersten Tumorresektion
zur Heilung und wurde dann platziert auf Fluorouracil- und Levamisole-Adjuvanstherapie.
Der voroperative CEA-Titer war 15,5 ng/ml. Drei Monate nach primärer Chirurgie
war der CEA-Titer im normalen Bereich, das heißt unter 2,5 ng/ml.
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Zwei
Jahre später
wurde bei dem Patienten ein CEA-Titer von 25 ng/ml gefunden und
ein CAT-Scan zeigte einen 5 cm Tumor im linken Leberlappen und einen
2 cm Tumor im rechten Lappen. Ein Monat später war der CEA-Titer 25 ng/ml
und der Patient wurde subkutan immunisiert mit 2 mg hAb1-Impfstoff
(Tag 0). Die Immunisierung wurde am Tag 7 wiederholt.
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Am
Tag 30 wurde der Patient gefunden als Lymphozyten habend, die reaktiv
mit Ab1 (T2-Zellen) sind. Am Tag 40 wurde dem Patienten 100 mg des hAb1
intravenös
gegeben. Zwei Monate später
war der CEA-Titer 5 ng/ml und ein CAT-Scan zeigte, dass der Tumor
am linken Lappen auf 2 cm Größe schwand,
während
der Tumor am rechten Lappen vollständig zurückgegangen war.
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Sechs
Monate später
war der Tumor am linken Lappen in der Größe vergrößert und die große Tumormasse
wurde in dem Abdomen gefunden wie durch Nadelbiopsie bestätigt. Ein
CEA-Titer hatte sich erhöht
auf 50 ng/ml. Dem Patienten wurden WI2-Ab2-Impfstoff (2 mg) subkutan am Tag
0 und am Tag 30 gegeben. Eine ernste Reaktion trat am Injektionsort
am Tag 35 auf, welche langsam zurückging.
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Drei
Monate später
wurde der CEA-Titer gefunden als weniger als 2,5 ng/ml seiend und
der Tumor am linken Lappen war vollständig aufgelöst. Die Masse in dem Abdomen
wurde in der Größe vermindert
und eine Nadelbiopsie enthüllte
nicht die Gegenwart eines Tumors und zeigte nur Fasergewebe, das mit
Lymphozyten infiltriert war.
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Zwei
Jahre später
zeigte ein CAT-Scan, dass das Tumorwiederauftreten nicht auftrat
und der CEA-Titer kleiner als 2,5 ng/ml war.