DE69534528T2

DE69534528T2 - Mehrstufiger kaskade-erhöhungs-impfstoff

Info

Publication number: DE69534528T2
Application number: DE69534528T
Authority: DE
Inventors: Hans J. Hansen
Original assignee: Immunomedics Inc
Current assignee: Immunomedics Inc
Priority date: 1994-07-06
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2015-07-07
Also published as: WO1996001126A1; IL132468A0; IL114444A0; JP2000154153A; CA2194166C; EP0768894B1; JP3769014B2; US6926893B1; IL114444A; DE69534528D1; JPH10503758A; ATE306939T1; EP0768894A1; AU2953895A; CA2194166A1; CA2448831A1; IL132468A; US5798100A; US6132718A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten gegen bösartige Zellen oder infektiöse Mittel. Insbesondere ist diese Erfindung auf Medikamente gerichtet zur Erzeugung einer integrierten immunologischen Antwort gegen Tumorzellen oder infektiöse Reagenzien unter Verwendung von Antikörpern und Anti-Idiotypantikörpern, welche ein Epitop eines Antigens nachahmen, das verbunden ist mit einem Tumor oder einem infektiösen Reagenz. Die vorliegende Erfindung ist auch gerichtet auf ein Medikament zu Erhöhung solch einer integrierten Antwort unter Verwendung von Antikörpern und Cytokinen. Die Erfindung ist weiterhin gerichtet auf Medikamente zur Erzeugung von T-Zellen, die nicht MHC-beschränkt sind und die durch einen Tumor anvisiert werden, verbunden mit einem Antigen oder einem Antigen, das verbunden ist mit einem infektiösen Reagenz.
2. Hintergrund
Eines der Hauptziele für Immuntherapie ist es, das Immunsystem eines Patienten gegen Tumorzellen oder infektiöse Organismen zu wappnen. Mit Hinblick auf Krebstherapie ist es das Ziel, das Immunsystem des Patienten gegen Tumorzellen zu richten durch Anvisieren von Antigenen, die mit Tumorzellen verbunden sein können, aber nicht normalen Gegenspielern. Obwohl diese tumorverbundenen Antigene (TAA) sehr schwierig zu identifizieren waren, exprimieren bestimmte Tumorzellen Antigene, die normalerweise nicht exprimiert werden oder bei sehr niedrigen Gehalten im Leben von Erwachsenen exprimiert werden aber bei der fötalen Entwicklung vorliegen. Ein Beispiel eines solchen onkofötalen TAA ist α-Fetoprotein, welches exprimiert wird durch Leberkrebszellen. Anderes onkofötales TAA ist das karzi noembryonische Antigen (CEA, welches in den meisten Adenokarzinomen exprimiert wird von endodermal abgeleiteter Verdauungssystem-Epithelia als auch in Brusttumorzellen und nicht kleinen Zellen von Lungenkrebszellen. Thomas et al., Biochem. Biophys. Acta 1032: 177 (1990).
Die Handhabung von Anti-Idiotypantikörpern (Ab2), welche TAA nachahmen, stellt einen der vielversprechendsten Ansätze für Krebsimmunotherapie dar. Goldenberg, Amer. J. Med. 94: 297 (1993). Ab2 sind Antikörper, die gerichtet sind gegen variable Regionen von konventionellen Antikörpern (Ab1). Da Ab2 und Antigen mit denselben Regionen der Ab1-haltigen Stelle binden kann, können bestimmte Ab2 (bezeichnet "Ab2β" oder "Internabbildungs"-Antikörper) die dreidimensionale Struktur des nominalen Antigens nachahmen. Jerne et al., EMBO J. 1: 243 (1982); Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990); Losman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3421 (1991); Losman et al., Int. J. Cancer 56: 580 (1994). Individuen, die immunisiert sind mit Ab2β können Anti-Antikörper (Ab3) entwickeln, von denen einige (Ab1') das normale Antigen binden können.
Die Antigen nachahmenden Eigenschaften von Anti-Idiotypantikörpern haben zur Verwendung von Ab2β als Surrogatantigenen (oder Idiotypimpfstoffen) geführt, wenn das nominale Antigen nicht direkt verfügbar war oder wenn der Wirt tolerant gegenüber dem nominalen Antigen ist. In Experimentalsystemen erzeugt die Immunisierung mit Ab2β, welches bestimmte TAA nachahmt, spezifische Immunität gegen TAA und schützt gegen nachfolgendes Tumorwachstum. Siehe zum Beispiel Nepom et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2864 (1984); Raychaudhuri et al., J. Immunol. 139: 271 (1987). Ähnlich sind Idiotypimpfstoffe gegen infektiöse Organismen entwickelt worden wie Streptococcus pneumoniae [MCNamara et al., Science 226: 1325 (1984)], Hepatitus B Virus [Kennedy et al., Science 223: 930 (1984)], Escherichia coli K13 [Stein et al., J. Exp. Med. 160: 1001 (1984)], Schistosomiasis mansoni [Kresina et al., J. Clin. Invest. 83: 912 (1989)], und Moloney murine Sarkomavirus [Powell et al., J. Immunol. 142: 1318 (1989)].
Krebspatienten, die ein Anti-TAA tierischen Ursprungs empfangen werden gewöhnlich Antikörper gegen Ab1 erzeugen und diese Anti-Immunoglobulinantikörper um fassen Ab2. Herlyn et al., J. Immunol. Methods 85: 27 (1985); Traub et al., Cancer Res. 48: 4002 (1988). Die Anti-Idiotypantwort kann die Erzeugung von T-Zellen (T2) umfassen. Fagerberg et al., Cancer Immunol. Immunother. 37: 264 (1993). Darüber kann Ab2 nachfolgend eine humorale und zelluläre Anti-Antitioptypantwort, Ab3 und T3 jeweils induzieren, welche dasselbe Epitop wie Ab1. Id. erkennen.
EP-A-438803 offenbart Impfstoffe, die einen Ab2 umfassen, der CEA nachahmenden Anti-Idiotypantikörper erzeugt durch Immunisieren von Pavianen mit NP-4, einem Antikörper gegen CEA.
Daher gibt es eine Möglichkeit, einen Ansatz zur Immunotherapie bereitzustellen unter Verwendung von sowohl humoralen als auch zellulären Immunsystemen. Die Anmelderin hat Medikamente entwickelt, die eine integrale Antwort gegen Tumorzellen hervorrufen sowie gegen infektiöse Reagenzien. Weiterhin hat die Anmelderin Medikamente entwickelt, um die Immunkaskade zu verstärken.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Dementsprechend ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Medikament zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten gegen Tumorzellen und infektiöse Reagenzien unter Verwendung von Antikörpern und Anti-Idiotypantikörpern bereitzustellen, die ein tumorverbundenes Antigen oder ein Antigen nachahmen, das verbunden ist mit einem infektiösen Reagenz. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein Medikament zum Vermehren solcher integrierter Antwort unter Verwendung von Antikörpern und Cytokinen bereitzustellen.
Ein anderes Ziel der Erfindung ist es, Medikamente zur Erzeugung von T-Zellen bereitzustellen, die anvisiert werden von Zellen, die ein tumorverbundenes Antigen oder ein Antigen exprimieren, das verbunden ist mit einem infektiösen Reagenz. Solche T-Zellen werden verwendet, um weiterhin die Immunantwort gegen Tumorzellen oder infektiöse Reagenzien zu verstärken.
Diese und andere Aufgaben werden gelöst in Übereinstimmung mit einer Ausführung der vorliegenden Erfindung durch das Bereitstellen eines Medikaments zur Induzie rung von humoralen und zellulären Immunantworten in einem Säugetier gegen einen Tumor, der ein tumorverbundenes Antigen (TAA) exprimiert oder gegen eine Krankheit, die durch ein infektiöses Reagenz hervorgerufen wird, umfassend:

(a) einen ersten Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier, worin der erste Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, das mit dem infektiösen Reagenz verbunden ist und worin der Antikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein; und
(b) einen zweiten Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier, worin der zweite Impfstoff einen Anti-Idiotypantikörperbestandteil umfasst, der ein Epitop des TAA oder Infektionsreagenz-Antigens umfasst und worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein.

Der Antikörperbestandteil von Schritt (a) kann gewählt sein aus der Gruppe die besteht aus: (a) einem murinen monoklonalen Antikörper bzw. Maus monoklonalen Antikörper; (b) einem humanisierten Antikörper, abgeleitet aus einem Maus monoklonalen Antikörper; (c) einen humanen monoklonalen Antikörper und (d) einem Antikörperfragment, das abgeleitet ist aus (a), (b) oder (c), worin das Antikörperfragment gewählt sein kann aus der Gruppe, die besteht aus (Fab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, sFv und Minimalerkennungseinheit.
Der Anti-Idiotypantikörperbestandteil von Schritt (b) kann gewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem polyklonalen Antikörper; (b) einem Maus monoklonalen Antikörper; (c) einem humanisierten Antikörper, abgeleitet aus (b); (d) einem humanen monoklonalen Antikörper; (e) einem subhumanen Primaten-Antikörper und (f) einem Antikörperfragment, das abgeleitet ist aus (a), (b), (c), (d) oder (e), in welchem das Antikörperfragment gewählt sein kann aus der Gruppe, die besteht aus (Fab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab, Fv, sFv und Minimalerkennungseinheit.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament, das weiterhin (c) γ-Interferon oder Interleukin-2 umfasst, zur Verabreichung vor und während der Verabreichung des zweiten Impfstoffs. Alternativ kann Interleukin-2 und γ-Interferon vor und während Verabreichung des Impfstoffs verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in einem Säugetier gegen einen Tumor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit, die hervorgerufen wird durch ein infektiöses Reagenz, umfassend:

(a) ein Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier, worin der Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, das verbunden ist mit dem infektiösen Reagenz und worin der Antikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein; und
(b) einem Antikörper oder antigenbindenden Fragment davon zur Verabreichung, worin der Antikörper oder das Fragment nicht konjugiert ist mit einem immunogenen löslichen Trägerprotein und worin der Antikörper oder das Fragment mit TAA oder einem Antigen bindet, das mit dem infektiösen Reagenz verbunden ist.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament, in welchem der Antikörper oder das Antikörperfragment von Schritt (b) konjugiert ist mit Biotin und worin das Verfahren weiterhin (c) Avidin zur Verabreichung umfasst, um Kreislaufgehalte des biotinylierten Antikörpers zu erniedrigen oder des biotinylierten Antikörperfragments.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament, worin der Impfstoff von Schritt (a) zur Verabreichung zu einem zweiten Zeitpunkt ist.
Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Medikament, das weiterhin (e) γ-Interferon oder Interleukin-2 zur Verabreichung vor und während der zweiten Verabreichung des Impfstoffes umfasst. Als eine Alternative können Interleukin-2 und γ-Interferon vor und während der Verabreichung des Impfstoffes verabreicht werden.
Die vorliegende Erfindung ist auch verwendbar in einem Verfahren zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in einem Patienten gegen einen Tumor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit, die hervorgerufen wird durch ein infektiöses Reagenz, umfassend die Schritte von:

(a) Erhalten von T-Zellen aus dem Patienten;
(b) Einführen eines Expressionsvektors in die T-Zellen, um transfizierte T-Zellen zu erhalten, worin der Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfasst, das entweder ein chimäres Immunoglobulin/T-Zellrezeptor oder ein chimäres Immunoglobulin/CD3-Protein codiert, und worin der Immunoglobulin codierende Teil des DNA-Moleküls die variable Region eines Antikörpers codiert, welche mit dem TAA oder mit einem Antigen bindet, das mit dem infektiösen Reagenz verbunden ist;
(c) Stimulieren der Vermehrung der transfizierten T-Zellen, um eine vergrößerte Masse transfizierter T-Zellen zu erhalten, und
(d) Zurückgeben der vergrößerten Masse von transfizierten T-Zellen an den Patienten.

Die vorliegende Erfindung ist auch verwendbar in einem Verfahren, welches weiterhin umfasst den Schritt von: (e) Verabreichen eines Impfstoffs an den Patienten, worin der Impfstoff einen Anti-Idiotypantikörperbestandteil umfasst, der mit der Immunoglobulineinheit des chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptors bindet oder dem chirmären Immunoglobulin/CD3-Protein, und worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein. Als Alternative kann wenigstens ein Cytokin, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus γ-Interferon und Interleukin-2 an den Patienten verabreicht werden nach Zurückgeben der transfizierten T-Zellen und vor Ausführen von Schritt (e).
Die vorliegende Erfindung ist auch verwendbar bei einen Verfahren zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in einem Patienten gegen einen Tu mor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit, die hervorgerufen wird durch ein infektiöses Reagenz, umfassend die Schritte von:

(a) Erhalten von T-Zellen aus dem Patienten;
(b) Induzieren eines Expressionsvektors in die T-Zellen, um transfizierte T-Zellen zu erhalten, worin der Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfasst, das entweder einen chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptor oder chimäres Immunoglobulin/CD3-Protein umfasst, und worin der Immunoglobulin codierende Teil des DNA-Moleküls die variable Region eines Antikörpers codiert, der ein Epitop des TAA oder ein Epitop eines Antigens nachahmt, das mit dem infektiösen Reagenz verbunden ist;
(c) Stimulieren der Vermehrung der transfizierten T-Zellen, um eine vergrößerte Masse transfizierter T-Zellen zu erhalten, und
(d) Zurückgeben der vergrößerten Masse von transfizierten T-Zellen an den Patienten.

Weiterhin ist die vorliegende Erfindung auch verwendbar in einem Verfahren, das weiterhin den Schritt umfasst von (e) Verabreichen eines Impfstoffs an den Patienten, worin der Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der mit der Immunoglobulineinheit des chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptors oder chirmären Immunoglobulin/CD3-Proteins bindet und worin der Antikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein. Als eine Alternative kann wenigstens ein Cytokin, gewählt aus der Gruppe, die besteht aus γ-Interferon und Interleukin-2 an den Patienten verabreicht werden nach Zurückgeben der transfizierten T-Zellen und vor Ausführen von Schritt (e).
Die vorliegende Erfindung wird auch gerichtet auf einen Impfstoff zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, der karzinoembryonisches Antigen (CEA) exprimiert, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines Anti-CEA-Antikörperbestandteils, welcher konjugiert ist an ein lösliches immunogenes Trägerprotein. Der Anti-CEA-Antikörperbestandteil kann ge wählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem Maus monoklonalen Klasse III Anti-CEA-Antikörper; (b) einem humanisierten Antikörper, abgeleitet aus einem Maus monoklonalen Klasse III Anti-CEA-Antikörper; (c) einem menschlichen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper und (d) einem Antikörperfragment, abgeleitet aus (a), (b) oder (c).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen Impfstoff zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, der CEA exprimiert, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und eine therapeutisch wirksame Menge eines Anti-Idiotypantikörperbestandteils, welcher konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein, worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil ein Epitop von CEA nachahmt. Der Anti-Idiotypantikörperbestandteil kann gewählt werden aus der Gruppe, die besteht aus: (a) einem polyklonalen Antikörper, der mit dem variablen Bereich von Klasse III Anti-CEA-Antikörper bindet; (b) einem monoklonalen Antikörper, der mit der variablen Region von Klasse III Anti-CEA-Antikörper bindet; (c) einem humanisierten Antikörper, abgeleitet aus (b); (d) einem subhumanen Primaten-Antikörper, der mit der variablen Region eines Klasse III Anti-CEA-Antikörpers bindet; (e) einem humanen monoklonalen Anti-CEA-Antikörper der mit dem variablen Bereich eines Klasse III Anti-CEA-Antikörpers bindet und (f) einem Antikörperfragment, abgeleitet aus (a), (b), (c), (d) oder (e).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in einem Säugetier gegen einen Tumor, der TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit, die verursacht wird durch ein infektiöses Reagenz, umfassend:

(a) einen ersten Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier, worin der erste Impfstoff einen Antikörperbestandteil umfasst, der an das TAA bindet oder mit einem Antigen verbunden mit dem infektiösen Reagenz, und worin der Antikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein;
(b) einen Antikörper oder antigenbindendes Fragment davon zur Verabreichung, worin der Antikörper oder das Fragment nicht konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein und worin der Antikörper oder das Fragment mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, verbunden mit dem infektiösen Reagenz; und
(c) einem zweiten Impfstoff zur Verabreichung an das Säugetier, worin der zweite Impfstoff einen Anti-Idiotypantikörper umfasst, der ein Epitop des TAA oder das Infektionsreagenz-Antigen umfasst, und worin der Anti-Idiotypantikörperbestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein.

Bevorzugt umfasst der erste Impfstoff einen Klasse III Anti-CEA-Antikörper, worin der Antikörper von Schritt (b) ein Klasse III Anti-CEA-Antikörper ist und worin der zweite Impfstoff einen Antikörper umfasst, der mit der variablen Region eines Klasse III Anti-CEA-Antikörpers bindet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Medikament zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, der CEA exprimiert, umfassend einen bispezifischen Antikörper zur Verabreichung an den Patienten, worin der bispezifische Antikörper eine Einheit umfasst, die mit dem CD3-Protein bindet und eine Einheit, die mit dem CEA bindet, und worin die CEA-bindende Einheit abgeleitet ist aus einem Klasse III Anti-CEA-Antikörper.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
1. Definitionen
In der folgenden Beschreibung wird eine Anzahl von Ausdrücken extensiv verwendet. Die folgenden Definitionen werden angegeben, um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern.
Ein Strukturgen ist eine DNA-Sequenz, die transkribiert wird in Messenger-RNA (mRNA), welche dann translatiert werden können in eine Sequenz von Aminosäuren, die charakteristisch für ein spezifisches Polypeptid ist.
Ein Promotor ist eine DNA-Sequenz, die die Transkription eines Strukturgens leitet. Typischerweise ist ein Promotor im 5'-Bereich eines Gens angeordnet, nahe dem Transkriptionsstartort eines Strukturgens. Wenn ein Promotor ein induzierbarer Promotor ist, dann ist die Geschwindigkeit von Transkription erhöht in Erwiderung auf ein Induzierreagenz. Dahingegen ist die Transkriptionsgeschwindigkeit nicht reguliert durch ein induzierendes Reagenz, wenn der Promotor ein konstitutiver Promotor ist.
Ein isoliertes DNA-Molekül ist ein Fragment von DNA, das nicht in dem DNA-Genom eines Organismus integriert ist. Zum Beispiel ist ein kloniertes T-Zellrezeptorgen ein DNA-Fragment, das getrennt worden ist aus der genomischen DNA einer Säugetierzelle. Ein anderes Beispiel eines isolierten DNA-Moleküls ist ein chemisches synthetisiertes DNA-Molekül, das nicht in die genomische DNA eines Organismus integriert ist.
Ein Verstärker ist ein DNA-regulierendes Element, das die Effizienz von Transkription vergrößern kann, unabhängig vom Abstand oder Orientierung des Verstärkers relativ zum Transkriptionsstartort.
Komplementäre DNA (cDNA) ist ein einzelsträngiges DNA-Molekül, das gebildet ist aus einem mRNA-Templat durch das Enzym reverse Transkriptase. Typischerweise wird ein Primer bzw. Starter eingesetzt, der komplementär zu Bereichen von mRNA ist, zum Start der reversen Transkription. Fachleute verwenden auch den Ausdruck "cDNA", um ein doppelsträngiges DNA-Molekül zu bezeichnen, das aus einem solchen einzelsträngigen DNA-Molekül und seinen komplementären DNA-Strang besteht.
Der Ausdruck Expression betrifft die Biosynthese eines Genprodukts. Zum Beispiel involviert im Falle eines Strukturgens Expressiontranskription von Strukturgen in mRNA und die Translation von mRNA in eines oder mehrere Polypeptide.
Ein Klonierungsvektor ist ein DNA-Molekül wie ein Plasmid, Cosmid oder Bakteriophage, das das Vermögen hat, sich autonom in einer Wirtszelle zu replizieren. Klonierungsvektoren enthalten typischerweise eine oder eine geringe Anzahl von Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen, an welchen Fremd-DNA-Sequenzen eingesetzt werden können in einer bestimmbaren Weise ohne Verlust einer wesentlichen biologischen Funktion des Vektors sowie als Markierungsgen, das in der Lage ist zum Gebrauch bei der Identifizierung und Auswahl von Zellen, die mit dem Klonierungsvektor transformiert sind. Markierungsgene umfassen typischerweise Gene, die Tetracyclinresistenz oder Ampicillinresistenz ergeben.
Ein Expressionsvektor ist ein DNA-Molekül, das ein Gen umfasst, das in einer Wirtszelle exprimiert wird. Typischerweise wird Genexpression angeordnet unter der Kontrolle von bestimmten Regulationselementen, einschließlich konstitutiven oder induzierbaren Promotoren, gewebespezifischen Regulationselementen und Verstärkern. Solch ein Gen wird als "operativ verknüpft an" die Regulatorelemente vermutet.
Ein rekombinanter Wirt kann jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein, die entweder einen Klonierungsvektor oder Expressionsvektor enthält. Dieser Ausdruck umfasst auch jene prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen, die genetisch gebaut worden sind, um das klonierte Gen (die klonierten Gene) im Chromosom oder Genom der Wirtszelle zu enthalten.
Ein tumorverbundenes Antigen ist ein Protein, das normalerweise nicht exprimiert wird oder bei sehr geringen Gehalten exprimiert wird, durch einen normalen Gegenspieler. Beispiele von tumorverbundenen Antigenen umfassen α-Fetoprotein und karzinoembryonisches Antigen (CEA).
Wie hierin verwendet bezeichnet ein infektiöses Reagenz sowohl Mikroben als auch Parasiten. Eine "Mikrobe" umfasst Viren, Bakterien, Rickettsia, Mycoplasma, Protozoa, Pilze und ähnliche Mikroorganismen. Ein "Parasit" bezeichnet Infektionen, allgemein mikroskopische oder sehr kleine mehrzellulare Intervertebrate oder Eier oder jugendliche Formen davon, welche geeignet sind, Antikörper-induziertes oder lytische oder phagocytische Zerstörung hervorzurufen wie Malariaparasiten, Spirocheten und dergleichen.
Im vorliegenden Kontext ist ein Anti-CEA-MAb ein Klasse III MAb, beschrieben durch Primus et al., Cancer Research 43: 686 (1983) und durch Primus et al., US-Patent Nr. 4,818,709, was als Referenz eingefügt ist.
Wie hierin verwendet ist ein Ab1 ein Antikörper, der mit einem tumorverbundenen Antigen oder einem Antigen bindet, das mit einem infektiösen Reagenz verbunden ist.
Ein Anti-Idiotypantikörper (Ab2) wie hierin verwendet ist ein Antikörper, der mit einem Ab1 bindet. Wichtig bindet ein Ab2 mit der variablen Region von Ab1 und daher ahmt ein Ab2 ein Epitop eines Tumors nach, der verbunden ist mit Antigen oder ein Epitop eines infektiösen Reagenzes, verbunden mit einem Antigen.
Ein Antikörperfragment ist ein Teil eines Antikörpers wie F(ab')₂, F(ab)₂, Fab', Fab und dergleichen. Unabhängig von der Struktur bindet ein Antikörperfragment mit demselben Antigen, das durch den intakten Antikörper erkannt wird, Zum Beispiel bindet ein Anti-CEA-MAb (Ab1) Fragment mit CEA, während ein Ab2-Fragment mit der variablen Region des Ab1 bindet und ein Epitop von CEA nachahmt.
Der Ausdruck "Antikörperfragment" umfasst auch jedes synthetisch oder genetisch gebaute Protein, das als ein Antikörper durch Binden an ein spezifisches Antigen wirkt, um einen Komplex zu bilden. Zum Beispiel umfassen Antikörperfragmente isolierte Fragmente bestehend aus der leichten kettenvariablen Region, "Fv"-Fragmenten, bestehend aus den variablen Regionen der schweren und leichten Ketten, rekombinante Einzelkettenpolypeptidmoleküle, in welchen leichte und schwere variable Regionen verbunden sind durch einen Peptidverknüpfer ("sFv-Proteine") und Minimalerkennungseinheiten, bestehend aus den Aminosäureresten, die den hypervariablen Bereich nachahmen.
Humanisierte Antikörper sind rekombinante Proteine, in welchen Mauskomplementarität, bestimmend die Regionen von MAb, überführt worden ist von schweren und leichten variablen Ketten von Mausimmunoglobulin in eine menschliche variable Region.
Wie hierin verwendet umfasst der Ausdruck Antikörperbestandteil sowohl einen gesamten Antikörper als auch ein Antikörperfragment.
Im vorliegenden Kontext ist ein chimärer Immunoglobulin/T-Zellrezeptor ein funktionaler T-Zellrezeptor, in welchem die variablen Regionen von α- oder β-Polypeptidketten ersetzt worden sind durch variable Segmente der schweren und leichten Kette von entweder einem Antikörper (Ab1) oder einem Anti-Idiotypantikörper (Ab2).
Wie hierin verwendet ist ein chimäres Immunoglobulin/CD3-Protein ein rekombinantes Protein, das die Funktion eines CD3-Polypeptids beibehält und variable Segmente der schweren und leichten Kette von entweder einem Ab1 oder einem Ab2 umfasst.
2. Herstellung von monoklonalen Antikörpern, humanisierten Antikörpern, Primatenantikörpern und Menschantikörpern.
Monoklonale Nagerantikörper gegen spezifische Antigene können erhalten werden durch Verfahren, die Fachleuten bekannt sind. Siehe zum Beispiel Kohler und Milstein, Nature 256: 495 (1975) und Coligan et al. (Hrsg.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Band. 1, Seiten 2.5.1–2.6.7 (John Wiley & Sons 1991) [nachfolgend "Coligan"]. Kurz können monoklonale Antikörper erhalten werden durch Spritzen von Mäusen mit einer Zusammensetzung, die ein Antigen umfasst, Überprüfen der Gegenwart der Antikörperproduktion durch Entfernen einer Serumprobe, Entfernen der Milz, um B-Lymphozyten zu erhalten, Fusionieren der B-Lymphozyten mit Myelomazellen, um Hybridomas zu erzeugen, Klonieren der Hybridomas, Auswählen positiver Klone, welche Antikörper gegen das Antigen erzeugen, Kultivieren der Klone, die Antikörper gegen das Antigen erzeugen und Isolieren der Antikörper aus dem Hybridomakulturen.
Eine Vielzahl von monoklonalen Antikörpern gegen tumorverbundene Antigene oder Infektionsreagenzien sind entwickelt worden. Siehe zum Beispiel Goldenberg et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/11465 (1991) und Goldenberg, internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/04702 (1994).
Ein Beispiel eines geeigneten Mab ist ein Klasse III Anti-CEA-Mab. Konventionelle Antiseren, die gezogen sind gegen CEA enthalten gewöhnlich Antikörper, die mit einer Gruppe von Substanzen reagieren, die eng verwandt sind mit CEA. Die Hauptmitglieder dieser Familie oder CEA- verwandten Antigene sind (1) das normale kreuzaktive Antigen (NCA), welches eine gemeinsame Gewebeverteilung mit CEA teilt und (2) Meconium-Antigen (MA), welches fast identische physikochemische Eigenschaften mit CEA teilt. Die erste Palette von monoklonalen Antikörpern (MAb), das NCA-kreuzreaktive, MA-kreuzreaktive und CEA-spezifische Epitope an dem CEA-Molekül definiert, ist beschrieben worden durch Primus et al., Cancer Research 43: 686 (1983). Insbesondere wurden drei Klassen von Anti-CEA-Antikörper identifiziert:
1) Klasse I Antikörper, welche kreuzreagieren mit CEA, NCA und MA; 2) Klasse II Antikörper, welche reagieren mit CEA und MA, aber nicht mit NCA; und 3) Klasse III Antikörper, welche spezifisch für CEA sind und nicht mit NCA oder MA binden. Verfahren zum Erhalten von Klasse III Anti-CEA-MAbs sind offenbart durch Primus et al., Cancer Research 43: 686 (1983) und Primus et al., US-Patent Nr. 4,818,709. Weiterhin ist die Erzeugung von Klasse III Anti-CEA-MABs zweiter Generation offenbart durch Hansen et al., Cancer 71: 3478 (1993).
MABs können isoliert und gereinigt werden aus Hybridomakulturen durch eine Vielzahl wohletablierter Techniken. Solche Isolierungstechniken umfassen Affinitätschromatographie mit Protein-A-Sepharose, Größenausschlusschromatographie und Ionenaustauschchromatographie. Siehe zum Beispiel Coligan auf Seiten 2.7.1–2.7.12 und Seiten 2.9.1–2.9.3. Siehe auch Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Band. 10, Seiten 79–104 (The Humana Press, Inc.k 1992).
In einer anderen Ausführung ist ein Antikörper der vorliegenden Erfindung ein subhumaner Primatenantikörper. Allgemeine Techniken zum Anziehen therapeutisch verwendbarer Antikörper in Pavianen können gefunden werden zum Beispiel in Goldenberg et al., internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/11465 (1991) und in Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990), welche hierin durch Bezugnahme miteingefügt sind.
In einer weiteren Ausführung ist ein Antikörper der vorliegenden Erfindung ein "humanisierter" monoklonaler Antikörper. Das heißt, Mauskomplementäre bestimmende Bereiche werden übertragen von schweren und leichten variablen Ketten des Mausimmunoglobulins in einen menschlichen variablen Bereich, gefolgt von der Ersetzung von einigen menschlichen Resten in den Netzwerkbereichen von deren murinen Gegenspielern. Humanisierte monoklonale Antikörper in Übereinstimmung mit dieser Erfindung sind geeignet für die Verwendung in therapeutischen Verfahren. Allgemeine Techniken zum Klonieren von Mausimmunoglobulin variablen Bereichen sind beschrieben zum Beispiel durch die Veröffentlichung von Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989). Techniken zum Erzeugen von humanisierten MAbs sind beschrieben zum Beispiel durch Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992) und Singer et al., J. Immun. 150: 2844 (1993).
In einer anderen Ausführung ist ein Antikörper der vorliegenden Erfindung ein humaner monoklonaler Antikörper. Solche Antikörper werden erhalten aus transgenen Mäusen, die "gebaut" worden sind, um spezifische menschliche Antikörper in Erwiderung auf antigene Herausforderung zu erzeugen. Bei dieser Technik werden Elemente der menschlichen leichten und schweren Kettenorte eingeführt in Stämme von Mäusen, die abgeleitet sind aus embryonalen Stammzelllinien, die anvisierte Unterbrechungen der endogenen Orte von schwerer Kette und leichter Kette enthalten. die transgenen Mäuse können menschliche Antikörper synthetisieren, die spezifisch gegen menschliche Antigene sind und die Mäuse können verwendet werden, um humane Antikörper sekretierende Hybridomas zu erzeugen. Verfahren zum Erhalten von menschlichen Antikörpern aus transgenen Mäusen sind beschrieben durch Green et al., Nature Genet. 7: 13 (1994), Lonberg et al., Nature 368: 856 (1994) und Tayler et al., Int. Immun. 6: 579 (1994).
3. Herstellung von Antikörperfragmenten
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fragmenten von Ab1 oder Ab2. Antikörperfragmente können hergestellt werden durch proteolytische Hydrolyse des Antikörpers oder durch Expression in E. coli der DNA, die für das Fragment codiert.
Antikörperfragmente können erhalten werden durch Pepsin- oder Papainverdauung der gesamten Antikörper durch konventionelle Verfahren. Zum Beispiel können Antikörperfragmente erzeugt werden durch enzymatisches Spalten von Antikörpern mit Pepsin, um ein 5S-Fragment zu erhalten, das bezeichnet wird als F(ab')₂. Dieses Fragment kann weiter gespalten werden unter Verwendung eines Thiolreduktionsmittels und optional einer Schutzgruppe für die Sulfhydrylgruppen, resultierend aus der Abspaltung von Disulfidbindungen, um 3.5S Fab'-monovalente Fragmente zu bilden. Alternativ, eine enzymatische Spaltung unter Verwendung von Pepsin erzeugt zwei monovalente Fab-Fragmente und ein Fc-Fragment direkt. Diese Verfahren sind beschrieben zum Beispiel durch Goldenberg, US-Patent Nrn. 4,036,945 und 4,331,647 und Referenzen, die darin enthalten sind. Sie auch Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY Band 1, Seite 422 (Academic Press 1967) und Coligan auf Seiten 2.8.1–2.8.10 und 2.10–2.10.4.
Andere Verfahren zum Spalten von Antikörpern wie Trennung von schweren Ketten, um monovalente leichte-schwere Kettenfragmente zu erzeugen, und weiteres Spalten von Fragmenten oder andere enzymatische, chemische oder genetische Techniken können auch verwendet werden, solange das Fragment das Antigen bindet, das durch den intakten Antikörper erkannt wird.
Zum Beispiel umfassen Fv-Fragmente eine Zuordnung von V_H- und V_L-Ketten. Die Verbindung kann nicht kovalent sein wie beschrieben in Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659 (1972). Alternativ können variable Ketten verknüpft werden durch intermolekulare Disulfidbindung oder kreuzverknüpft durch Chemikalien wie Glutaraldehyd. Siehe zum Beispiel Sandhu, supra.
Bevorzugt umfassen die Fv-Fragmente V_H- und V_L-Ketten, welche verknüpft sind durch einen Peptidverbinder. Diese einzelkettenantigenbindenden Proteine (sFv) werden hergestellt durch Konstruieren eines Strukturgens, umfassend DNA-Sequenzen, die die V_H- und V_L-Domänen codieren, welche verbunden sind durch ein Oligonukleotid. Das Strukturgen wird eingefügt in einen Expressionsvektor, welcher anschließend eingeführt wird in eine Wirtszelle wie E. coli. Die rekombinanten Wirtszellen synthetisieren eine einzelne Polypeptidkette mit einem Verbindungspeptid, was die beiden V-Domänen überbrückt. Verfahren zum Erzeugen von sFvs sind beschrieben zum Beispiel durch Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Emzymology 2: 97 (1991). Siehe auch Bird et al., Science 242: 423–426 (1988), Ladner et al., US.Patent Nr. 4,946,778, Pack et al., Bio/Technology 11: 1271–1277 (1993) und Sandhu, supra.
Eine andere Form eines Antikörperfragments ist ein Peptid, das für einzelne komplementaritätsbestimmende Region (CDR) codiert. CDR-Peptide ("Minimalerkennungseinheiten") können erhalten werden durch Konstruieren von Genen, die das CDR eines Antikörpers von Interesse codieren. Solche Gene werden hergestellt zum Beispiel durch Verwendung der Polymerasekettenreaktion, um die variable Region von RNA aus antikörpererzeugenden Zellen zu synthetisieren. Siehe zum Beispiel Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991).
4. Produktion von Anti-Idiotypantikörpern (Ab2)
Polyklonaler Ab2 kann hergestellt werden durch Immunisieren von Tieren mit Ab1 oder Fragmenten unter Verwendung von Standardtechniken. Siehe zum Beispiel Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS, Manson (Hrsg.), Seiten 1–12 (Humana Press 1992). Siehe auch Coligan auf Seiten 2.4.1–2.4.7.
Altenativ kann monoklonaler Ab2 auch hergestellt werden unter Verwendung von Ab1 oder Fragmenten wie Immunogenen mit den Techniken, die oben beschrieben sind. Die Herstellung eines Ratten monoklonalen Ab2 ist in Beispiel 3 veranschaulicht.
Als eine andere Alternative kann humanisierter Ab2 oder subhumaner Primaten Ab2 hergestellt werden durch Verwendung der oben beschriebenen Techniken.
5. Erzeugung von bispezifischen Antikörpern
Bispezifische Antikörper können verwendet werden, um T-Zellen gegen eine Tumorzelle zu rekrutieren und zielzusteuern. Ein bispezifischer Antikörper ist ein Hybridmolekül, das aus nicht identischen leichten und schweren Kettenpaaren besteht, was zwei unterschiedliche Antikörperspezifitäten ergibt. Zum Beispiel sind bispezifische Antikörper erzeugt worden mit einer Bindungsstelle, die CD3 signaltransduzierendes Protein auf T-Zellen erkennt und einer zweiten Bindungsstelle für ein tumorverbundenes Antigen. Siehe zum Beispiel Canevari et al., Int. J. Cancer 42: 18 (1988); Lanzaveccia et al., Eur. J. Immunol. 17: 104 (1987); Van Dijk et al., Int. J. Cancer 43: 344 (1989); und Renner et al., Science 264: 833 (1994).
Bispezifische Antikörper können hergestellt werden durch eine Vielzahl herkömmlicher Verfahren, zum Beispiel Disulfidspaltung und Reformierung von Gemischen von Gesamtantikörper oder vorzugsweise F(ab')₂-Fragmenten, Fusionierungen von mehr als einem Hybridoma, um Polyomas zu formen, die Antikörper mit als einer Spezifität durch genetisches Zusammenbauen erzeugen. Bispezifische Antikörper sind hergestellt worden durch oxidatives Spalten von Fab'-Fragmenten, die resultieren aus reduktiven Spalten von verschiedenen Antikörpern. Wie zum Beispiel Winter et al., Nature 349: 293 (1991). Dies wird vorteilhaft ausgeführt durch Mischen von zwei unterschiedlichen F(ab')₂-Fragmenten, erzeugt durch Pepsinverdau von zwei verschiedenen Antikörpern, reduktives Spalten um ein Gemisch von Fab'-Fragmenten zu erzeugen, gefolgt von oxidativer Reformierung der Disulfidbindungen, um ein Gemisch von F(ab')₂-Fragmenten zu bilden, einschließlich bispezifischer Antikörper, die einen Fab'-Teil enthalten, der spezifisch für jedes der Originalepitope ist. Allgemeine Techniken zur Herstellung solcher Antikörperkomposite können zum Beispiel gefunden werden in Nisonhoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961), Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968), und US-Patent Nr. 4,331,647.
Selektivere Verknüpfung kann erzielt werden durch Verwendung eines heterobifunktionellen Verknüpfers wie Maleimidhydroxysuccinimidester. Reaktion des Esters mit einem Antikörper oder Fragment wird Amingruppen an dem Antikörper oder Fragment derivatisieren und das Derivat kann reagiert werden mit z.B. einem Antikörper-Fab-Fragment mit freien Sulfhydrylgruppen (oder einem größeren Fragment oder wechselwirken mit Antikörper mit Sulfhydrylgruppen, die daran angehängt sind, zum Beispiel durch Traut's-Reagenz). Solch ein Verknüpfer ist weniger geneigt, Gruppen in demselben Antikörper kreuzzuvernetzen und verbessert die Selektivität der Verknüpfung.
Es ist vorteilhaft, die Antikörper oder Fragmente an Stellen zu verknüpfen, die entfernt von den Antigenbindungsstellen sind. Dies kann erzielt werden durch zum Beispiel Verknüpfen an gespaltete Zwischenkettensulfhydrylgruppen wie oben angemerkt. Andere Verfahren involvieren das Reagieren eines Antikörpers mit einem oxidierten Kohlehydrat mit einem anderen Antikörper, der wenigstens eine freie Aminfunktion hat. Dies resultiert in einer anfänglichen Schiff-Base (Imin-)-Verknüpfung, welche bevorzugt stabilisiert wird durch Reaktion eines sekundären Amins, zum Beispiel durch Borhydridreduktion, um einen endgültigen Komposit zu bilden. Solche ortsspezifische Verknüpfungen sind offenbart für kleine Moleküle in US-Patent Nr. 4,671,958 und für größere Anhänge in US-Patent Nr. 4,699,784.
Im vorliegenden Zusammenhang umfasst ein bispezifischer Antikörper Bindungseinheiten für T-Zellen und ein Antigen, das verbunden ist mit einer Tumorzelle oder einem infektiösen Reagenz. Zum Beispiel kann eine CEA-Bindungseinheit abgeleitet werden aus Klasse III Mab und die T-Zellbindungseinheit kann abgeleitet werden aus Anti-CD3-Mab. Verfahren zum Herstellen von Anti-CD3-Antikörpern sind wohlbekannt für Fachleute. Siehe zum Beispiel Canevari et al., supra, Van Dijk et al., supra, Hansen et al., "Human T Lymphocyte Cell Surface Molecules Defined by the Workshop Monoclonal Antibodies (T Cell Protocol)," in LEUKOCYTE TYPING: HUMAN LEUKOCYTE MARKERS DETECTED BY MONOCLONAL ANTIBODIES, Bernard et al., (Hrsg.) Seiten 195–212 (Springer-Verlag 1984); und US-Patent Nr. 4,361,549. Alternativ können Anti-CD3-Antikörper erhalten werden aus kommerziellen Quellen wie Boehringer Mannheim Corporation (Indianapolis, IN; Cat. Nr. 1273 485) und der American Type Culture Collection (Rockville, MD; ATCC CRL 8001 [OKT-3]).
Zum Beispiel kann ein bispezifischer Antikörper hergestellt werden durch Erhalten eines F(ab')₂-Fragments aus einem Anti-CEA-Klasse III-Mab wie oben beschrieben. Die Zwischenkettendisulfidbrücken des Anti-CEA-Klasse III-F(ab')₂-Fragments werden weich mit Cystein reduziert unter Vorsicht, um Verknüpfung von leichter und schwerer Kette zu vermeiden, um Fab'-SH-Fragmente zu bilden. Die SH-Gruppe(n) ist (werden) aktiviert mit einem Überschuss von Bis-Maleimidverknüpfer (1,1'-(Methylendi-4,1-Phenylen)Bis-Maleimid). Das Anti-CD3 Mab wird umgewandelt in Fab'-SH und dann reagiert mit dem aktivierten anti-CEA Klasse III Fab'-SH Fragment, um einen spezifischen Antikörper zu erhalten.
Alternativ können solche bispezifischen Antikörper erzeugt werden durch Fusionieren von zwei Hybridomazelllinien, die Anti-CD3-Mab und Anti-CEA-Klasse III-Mab erzeugen. Techniken zum Erzeugen von Tetradomas sind beschrieben zum Beispiel durch Milstein et al., Nature 305: 537 (1983) und Pohl et al., Int. J. Cancer 54: 418 (1993).
Schließlich können bispezifische Antikörper hergestellt werden durch genetisches Zusammenbauen. Zum Beispiel Plasmide, die DNA enthalten, die für variable Bereiche eines Anti-CEA-Klasse III-Mabs codieren, können eingeführt werden in Hybridomas, die Anti-CD3-Antikörper sekretieren. Die resultierenden "Transfektomas" erzeugen bispezifische Antikörper, die CEA und CD3 binden können. Alternativ können chimäre Gene entworfen werden, die sowohl Anti-CD3 als auch Anti-CEA-Bindungsdomänen codieren. Allgemeine Techniken zum Erzeugen von bispezifischen Antikörpern durch genetisches Zusammenbauen werden beschrieben zum Beispiel durch Songsivilai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 164: 271 (1989); Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991); und Weiner et al., J. Immunol. 147: 4035 (1991).
6. Die Verwendung von Antikörpern und Cytokinen, um die humorale und zelluläre Immunantwort gegen Tumorzellen und infektiöse Reagenzien zu verstärken
Die vorliegende Erfindung betrifft die therapeutische Verwendung von Ab1, Ab2, erzeugt gegen Ab1 und Fragmenten von entweder Ab1 oder Ab2. Diese Antikörper und Fragmente können verwendet werden als Impfstoffe, um sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten in einem Empfängersäugetier auszulösen. Darüber hinaus kann die Verabreichung von Ab1 und/oder bispezifischen Antikörpern verwendet werden, um die integrierte Immunantwort zu verstärken.
Gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Säugetier immunisiert mit einem Impfstoff, umfassend Ab1 oder Fragmente davon, um die Erzeugung von Ab2 und T-Zellen (T2-Zellen) zu induzieren. Nachdem das Säugetier beginnt, T2-Zellen zu erzeugen, kann dem Säugetier Ab1 oder Fragmente davon durch intravenöse Verabreichung verabreicht werden, um die T2-Zellenmasse zu vergrößern. Ein zusätzlicher Vorteil dieser zweiten Verabreichung ist, dass die Antikörper oder Fragmente mit Erkennungsantigen an Krebszellen oder infektiösen Organismen binden und daher als Ziele für T2-Zellen dienen. Verfahren zum Detektieren der Erzeugung von T-Zellen, die mit spezifischen Antikörpern reagieren sind wohlbekannt für Fachleute. Siehe zum Beispiel Fagerberg et al., Cancer Immunol. Immunother. 37: 264 (1993).
Gemäß einem bevorzugten Verfahren wird ein Säugetier aufeinanderfolgend immunisiert mit einem Impfstoff, umfassend Ab2 oder Fragmenten davon, um die Bildung von Ab3 und T-Zellen zu induzieren, die Ab2 erkennen (T3-Zellen). Ein Vorteil dieser nachfolgenden Ab2-Impfung ist, dass Zellen einen Tumor exprimieren, der verbunden ist mit Antigen oder infektiösem Reagenzantigen, zerstört werden durch T3-Zellen, die gegen das Antigen gerichtet sind und durch T2-Zellen, die gegen Ab3 gerichtet sind, welches auch durch das Antigen gebunden wird. Beispiel 4 veranschaulicht ein Verfahren einer Behandlung, umfassend die Verabreichung eines Ab1-Impfstoffs, AB1 (oder Fragmente) und eines Ab2-Impfstoffs.
Zusätzlich kann die T2-Antwort weiterhin verstärkt werden durch die intravenöse Verabreichung von Ab1-Antikörpern oder Fragmenten nach Ab2-Impfung.
Es ist möglich, dass die Effizienz der Ab2-Impfung vermindert werden kann durch die Gegenwart von zirkulierenden Ab1-Antikörpern, welche intravenös verabreicht worden sind. Daher ist es vorteilhaft, zirkulierendes Ab1 vor der Verabreichung von Ab2-Impfstoff heraus zu entfernen. Ein Verfahren, das verwendet werden kann, um Ab1-Entfernung zu erzielen ist, Ab1-Antikörper zu verwenden, die mit Biotin konjugiert worden sind. Auf diese Weise kann zirkulierendes biotinyliertes Ab1 entfernt werden vor Ab1-Verabreichung durch die intravenöse Verabreichung von Avidin. Vorzugsweise wird Entfernung mit Avidin ein oder zwei Tage nach der intravenösen Verabreichung von Ab1 (oder Fragmenten davon) ausgeführt. Diese Antikörperentfer nungstechnik ist beschrieben durch Goldenberg, internationale Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. WO 94/04702 (1994).
In einem alternativen Verfahren der Immunotherapie wird ein Säuger immunisiert mit einem Ab1-Impfstoff, behandelt mit Ab1 (oder Fragmenten), um einen hohen Prozentanteil an Tumor oder infektiösen Reagenzantigenorten zu sättigen und dann hyperimmunisiert mit Ab1-Impfstoff, um eine große Anzahl von cytotoxischen Lymphozyten zu erzeugen, die gegen Zellen gerichtet sind, die mit Ab1 beschichtet sind (oder Fragmenten davon).
Gemäß bevorzugten Immunotherapieverfahren wird die Immunantwort weiter verstärkt durch die Verabreichung von Cytokinen. Beispiele von Cytokinen umfassen die Interferone (INFs), Interleukine (Ils) und Tumornekrosefaktoren. γ-INF induziert Makrophagen sowie Zelloberflächen Klasse II Histokompatibilitätsantigene an Lymphoidzellen und Monocyten. Siehe zum Beispiel Klegerman et al., "Lymphokines and Monokines", in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et al. (Hrsg.), Seiten 53–70 (Chapman & Hall 1993), und Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3. Auflage, Seiten 7.8–7.14 (Mosby 1993). IL-2 ist ein T-Zellwachstumsfaktor und ein Stimulator von natürlichen Killerzellen und tumorreaktiven T-Zellen. Id. Daher sind γ-INF und IL-2 bevorzugte Cytokine für die Verstärkung der Immunantwort.
Die Antikörper und Fragmente der vorliegenden Erfindung können verwendet werden als Impfstoffe durch Konjugieren der Antikörper oder Fragmente an ein lösliches immunogenes Trägerprotein. Geeignete Trägerproteine umfassen Schlüsselloch-Lympethemocyanin, welches das bevorzugte Trägerprotein ist. Die Antikörper und Fragmente können konjugiert werden an das Trägerprotein unter Verwendung von Standardverfahren. Siehe zum Beispiel Hancock et al., "Synthesis of Peptides for Use as Immunogens," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: IMMUNOCHEMICAL PROTOCOLS, Manson (Hrsg.), Seiten 23–32 (Humana Press 1992).
Eine bevorzugte Impfstoffzusammensetzung umfasst ein Antikörperkonjugat oder Fragmentkonjugat und ein Adjuvans. Beispiele von geeigneten Adjuvanzien umfassen Aluminiumhydroxid und Lipid. Verfahren zum Formulieren von Impfstoffzusam mensetzungen sind Fachleuten wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Rola, "Immunizing Agents and Diagnostic Skin Antigens", in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SIENCES, 18. Auflage, Gennaro (Hrsg.), Seiten 1389–1404 (Mack Publishing Company 1990).
Weitere pharmazeutische Verfahren können eingesetzt werden, um die Wirkungsdauer eines Impfstoffs in einer therapeutischen Anwendung zu regeln. Kontrollierte Freisetzungszusammensetzungen können hergestellt werden durch die Verwendung von Polymeren, um die Antikörper oder Fragmente zu komplexieren oder absorbieren. Zum Beispiel umfassen biokompatible polymere Matrizes von Poly(ethylen-Covinylacetat) und Matrizes von Polyanhydridcopolymer eines Stearinsäuredimers und von Sebacinsäure. Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992). Die Geschwindigkeit der Freisetzung eines Antikörpers oder Antikörperfragments aus solch einer Matrix hängt vom Molekulargewicht des Antikörpers oder Fragments, der Menge an Antikörper oder Fragment in der Matrix und der Größe dispergierter Partikel ab. Saltzman, et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al., supra. Andere Festkörperdosierungsformen sind beschrieben in Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5. Auflage (Lea & Febiger 1990), und Gennaro (Hrsg.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (Mack Publishing Company 1990).
Die Antikörperpräparationen der vorliegenden Erfindung können formuliert werden gemäß bekannten Verfahren, um pharmazeutisch verwendbare Zusammensetzungen herzustellen, wodurch Antikörper oder Antikörperfragmente kombiniert werden in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger. Eine Zusammensetzung wird als "pharmazeutisch verträglicher Träger" vermutet, wenn ihre Verabreichung durch einen Säugetierempfänger toleriert werden kann. Sterile phosphatgepufferte Salzlösung ist ein Beispiel eines pharmazeutisch verträglichen Trägers. Andere geeignete Träger sind im Stand der Technik wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5. Auflage (Lea & Febiger 1990), und Gennaro (Hrsg.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18. Auflage (Mack Publishing Company 1990).
Die Antikörper oder Fragmente können verabreicht werden an ein Säugetier intravenös oder subkutan. Weiterhin kann die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion oder durch einzelne oder mehrere große Pillen bestehen. Bevorzugt wird ein Antikörperimpfstoff subkutan verabreicht werden, während eine Antikörperherstellung, die nicht ein Impfstoff ist, intravenös verabreicht wird. Allgemein wird die Dosierung von verabreichten Antikörpern oder Fragmenten für Menschen variieren abhängig von solchen Faktoren wie dem Alter des Patienten, Gewicht, Größe, Geschlecht, allgemeiner medizinischer Zustand und medizinischer Vorgeschichte. Typischerweise ist es gewünscht, den Empfänger mit einer Dosierung von Antikörpern oder Fragmenten zu versorgen, welche im Bereich von etwa 1 pg/kg bis 10 mg/kg ist (Menge Reagenz/Körpergewicht des Patienten), obwohl eine niedrigere oder höhere Dosierung auch verabreicht werden kann wie es die Umstände erzwingen.
Für Therapiezwecke werden Antikörper oder Fragmente verabreicht an ein Säugetier in einer therapeutisch wirksamen Menge. Eine Antikörperpräparation wird als verabreicht in einer "therapeutisch wirksamen Menge" vermutet, wenn die Menge, die verabreicht wird, physiologisch signifikant ist. Ein Reagenz ist physiologisch signifikant, wenn seine Gegenwart in einer detektierbaren Änderung in der Physiologie eines Empfängersäugetiers resultiert. Insbesondere ist eine Antikörperpräparation der vorliegenden Erfindung physiologisch signifikant, wenn ihre Gegenwart humorale und/oder zelluläre Immunantwort in dem Empfängersäugetier hervorruft.
Ein Cytokin wie γ-INF oder IL-2 kann verabreicht werden vor und während der Verabreichung eines Ab1-Impfstoffs oder eines Ab2-Impfstoffs. Alternativ kann γ-INF und IL-2 verabreicht werden zusammen vor oder während der Verabreichung eines Antikörperimpfstoffs. Cytokine werden verabreicht an das Säugetier intravenös, intramuskular oder subkutan. Zum Beispiel kann rekombinantes IL-2 intravenös verabreicht werden als eine Pille bei 6 × 10⁵ IU/kg oder als kontinuierliche Infusion bei einer Dosis von 18 × 10⁶ IU/m²/d. Weiss et al., J. Clin. Oncol. 10: 275 (1992). Alternativ kann rekombinantes IL-2 subkutan verabreicht werden bei einer Dosis von 12 × 10⁶ IU. Vogelzang et al., J. Clin. Oncol. 11: 1809 (1993). Darüber hinaus kann γ-INF subkutan verabreicht werden bei einer Dosis von 1,5 × 10⁶ U. Lienard et al., J. Clin. Oncol. 10: 52 (1992). Geeignete IL-2-Formulierungen umfassen PROLEUKIN (Chiron Corp./Cetus Oncology Corp.; Emeryville, CA) und TECELEUKIN (Hoffman-La Roche, Inc.; Nutley, NJ), während ACTIMMUNE (Genentech, Inc.; South San Francisco, CA) eine geeignete γ-INF-Präparation ist.
Zusätzlich können bispezifische Antikörper verabreicht werden nach der anfänglichen Ab1-Behandlung. Die Funktion der bispezifischen Antikörper ist es nicht, Lymphozyten mit CEA-tragenden Tumorzellen zu verbrücken und die Lymphozytenvermittelte Cytolyse auszulösen. Bispezfische Antikörper können gemäß den oben beschriebenen allgemeinen Richtlinien verabreicht werden. Hingegen werden bispezifische Antikörper anders als Antikörperimpfstoffe nicht konjugiert mit Immunogenen.
Fachleute werden schätzen, dass die oben beschriebenen Verfahren verwendet werden können, um Prophylaxe gegen infektiöse Reagenzien zu ergeben. Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Verfahren, die hierin beschrieben sind, um Schutz für ein Säugetier vor Aussetzen gegenüber infektiösen Reagenzien zu ergeben.
7. Herstellung und therapeutische Verwendung von T-Zellen, die chimäre Immunoglobulin/T-Zellrezeptoren oder chimäre Immunoglobulin/CD3-Proteine exprimieren
T-Zellen können aufgeteilt werden in zwei gegenseitig ausschließende Populationen: T-Zellen, die α- und β-T-Zellrezeptor-(TCR)-Polypeptide exprimieren, und T-Zellen, die γ- und δ-TCE-Polypeptide exprimieren. Siehe allgemein Roitt et al., IMMUNOLOGY, 3. Auflage (Mosby 1993) und Bolhuis et al., Cancer Immunol. Immunother. 34: 1 (1991). Das αβ-Polypeptidset wird exprimiert zu mehr als 95% von peripheren T-Zellen und eine breite Mehrheit von TCR-exprimierenden Thymocyten. Dagegen wird das γδ-Polypeptidset exprimiert zu einem geringeren Anteil von T-Zellen im Thymus und sekundären lymphatischen Organen, während die γδ-T-Zellen häufig in verschiedenen Epithelien sind.
Jede Polypeptidkette eines TCR-Heterodimers umfasst zwei externe variable und konstante Immunoglobulin-artige Bereiche, die verankert sind in der Plasmamembran durch ein Transmembranpeptid und einen kurzen cytoplasmatischen Schwanz. Die N-terminalen Bereiche der TCR-Polypeptide enthalten variable Bereiche, die homolog sind mit den variablen Bereichen von Immunoglobulinen. Darüber hinaus hat die Analyse dieser TCR-variablen Bereiche Bereiche enthüllt von relativ großer Variabilität, welche den Immunoglobulin-hypervariablen Regionen (CDRs) entsprechen. Die variablen Domänen von αβ- und γδ-Polypeptiden werden vermutet als in einer Weise, die ähnlich zur Verbindung von V_H/V_L-Bereichen von Immunoglobulinmolekülen ist, unter Verbrückung von sechs TCR-hypervariablen Bereichen miteinander, um eine Antigenbindungsstelle zu bilden.
TCR-αβ- und γδ-Polypeptide sind sowohl nicht kovalent gebunden mit einer Reihe von Polypeptiden (γ, δ, ε, ζ und η), kollektiv bezeichnet als CD, um den vollständigen TCR-Komplex zu bilden. Im Gegensatz zu den TCR-Polypeptiden zeigen die Aminosäuresequenzen von CD3-Komponenten keine Variabilität an verschiedenen T-Zellen und daher können die CD3-Komponenten nicht die Vielfalt erzeugen, die verbunden ist mit TCR-Polypeptiden. Anstatt dessen ist die CD3-Komponente des TCR-Komplexes erforderlich für die Transduktion von Signalen, die generiert werden durch TCR-Antigen-Wechselwirkung.
Allgemein erkennen T-Zellen, die zellgebundenes Antigen erkennen in Verbindung mit Haupthistokompatibilitätskomplex-(MHC)-Molekülen an der Oberfläche der Antigen-präsentierenden Zelle. Hingegen sind Verfahren verfügbar, um T-Zellen zu erzeugen, die anvisiert werden auf spezielle Tumoren und die nicht MHC-eingeschränkt sind. Bispezifische Antikörper, die oben beschrieben sind, ergeben einen Ansatz zum Anvisieren von T-Zellen. Ein anderer Ansatz ist es, genetisch T-Zellen zu bauen mit chimären Immunoglobulin/T-Zellrezeptoren. Um effektiv zu sein, müssen die chimären Immunoglobulin/TCRs exprimiert werden durch T-Zellen in einer stabilen Weise und die chimären Immunoglobulin/TCRs müssen eine funktionale Verbindung mit CD3-signaltransduzierenden Polypeptiden bilden.
Funktionale chimäre Immunoglobulin/TCRs sind erzeugt worden, in welchen die variablen Gensegmente der TCR-α- und β-Ketten ersetzt wurden durch variable Gensegmente von der schweren und leichten Kette eines Immunoglobulins. Siehe als Beispiel Becker et al., Cell 58: 911 (1989), Eshhar et al., Br. J. Cancer 62 (Suppl. 10): 27 (1990), Goverman et al., Cell 60: 929 (1990), Gross et al., Transplant Proc. 21: 127 (1989a) und Gross et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10024 (1989b). Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion von chimären Immunoglobulin/TCRs, in welchen TCR-α- und -β-Ketten ersetzt werden durch variable Gensegmente der schweren und leichten Kette von entweder einem Ab1 oder einem Ab2.
Zusätzlich sind funktionelle chimäre Immunoglobulin/CD3-Proteine erzeugt worden, in welchen DNA-Fragmente, die Immunoglobulin-variable Segmente codieren, wurden fusioniert mit DNA-Fragmenten, die γ, ζ oder η CD3-Polypeptide codieren. Siehe zum Beispiel, Seed et al., internationale Anmeldungsveröffentlichung Nr. WO 92/15322 (1992) und Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 720 (1993). Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch die Konstruktion von chimären Immunoglobulin/CD3-Proteinen, umfassend variable Gensegmente der schweren und leichten Kette von entweder einem Ab1 oder einem Ab2.
Chimäre Immunoglobulin/TCRs und chimäre Immunoglobulin/CD3-Proteine können konstruiert werden unter Verwendung von Standardtechniken. Typische Techniken sind veranschaulicht durch die folgenden Verfahren, die verwendet werden können, um ein Anti-CEA-(oder Ab2)/TCR zu konstruieren.
DNA-Moleküle, die die variablen Regionen von Anti-CEA-Mab oder Anti-Iodiotyp-Mab codieren, können synthetisiert werden unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit RNA aus Hybridomas, die Antikörper erzeugen. Allgemeine Techniken für die Synthese von Maus-variablen Regionen und geeigneten Primern sind beschrieben zum Beispiel durch Orlandi et al., supra, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 (1991) und durch Kang et al., Id., bei 111.
Verfahren zum Erhalten von DNA-Molekülen, die humane T-Zellrezeptorpolypeptide codieren, sind Fachleuten wohlbekannt. Siehe zum Beispiel Bougueleret et al., Immunogenetics 26: 304 (1987) und Luria et al., EMBO J. 6: 3307 (1987). Weiterhin sind Techniken zum Konstruieren von chimären Immunoglobulin/TCRs und Einfügen von chimären Genen in Expressionsvektoren beschrieben worden zum Beispiel durch Becker et al., supra, Eshhar et al., supra, Goverman et al., supra, Gross et al. (1989a) supra und Gross et al. (1989b), supra. Weiterhin sind Standardprotokolle zum Konstruieren von Immunoglobulinfusionsproteinen beschrieben worden durch Coligan auf Seiten 10.19.1–10.19.11. Bevorzugte Expressionsvektoren enthalten einen dominanten selektierbaren Markierer für die Erzeugung von stabil transfizierten Zellen.
Expressionsvektoren, umfassend chimäre Immunoglobulin/TCR-Gene werden induziert in menschliche T-Zellen. Menschliche periphere Blutzellen können erhalten werden durch einfache Venipunkture und fraktioniert durch Ficoll-Hypaque-Gradiententrennung, um eine mononukleare Zellfraktion zu erhalten. Siehe zum Beispiel Goligan auf Seiten 7.1.1–7.1.2. T-Zellen werden dann getrennt von anderen mononuklearen Zellen unter Verwendung eines Zurücksetzungsvorgangs. Id. auf Seiten 7.2.1–7.2.4. Expressionsvektoren werden induziert in die menschliche T-Zellfraktion durch Elektroporation oder andere wohlbekannte Techniken. Siehe zum Beispiel Co et al., J. Immunol. 148: 1149 (1992) und Coligan auf Seiten 10.13.2–10.17.7.
Alternativ können chimäre Immunoglobulin/TCRs induziert werden in T-Zellen durch Retrovirus-vermittelten Gentransfer. Ein Vorteil dieses Ansatzes ist, dass sämtliche proviralen Kopien stabil integriert werden in die Chromosomen der T-Zellen und diese konstitutive Expression von chimären Immunoglobulin/TCRs sicherstellt. Verfahren zum Transfizieren von menschlichen T-Zellen durch Retrovirus-vermittelten Gentransfer sind beschrieben durch Kasid et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 473 (1990), Rosenberg et al., N. Engl J. Med. 323: 570 (1990) und Morecki et al., Cancer Immunol. Immunother. 32: 342 (1991).
Transfizierte Zellen, die den Expressionsvektor tragen, sind gewählt unter Verwendung eines dominanten selektierbaren Markers. Zum Beispiel kann G418 verwendet werden, um transfizierte T-Zellen auszuwählen, die einen Expressionsvektor tragen, der das Aminoglycosid-Phosphotransferasegen hat. Southern et al., J. Mol. Appl. Gen 1: 327 (1982). Ein Verfahren für G418-Selektion von transfizierten menschlichen T-Zellen ist beschrieben durch Morecki et al., supra. Alternativ kann Hygromycin-B verwendet werden, um transfizierte Zellen zu selektieren, die einen Expressionsvektor tragen mit dem Hygromycin-B-Phosphotransferasegen. Palmer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1055 (1987). Weiterhin kann Aminopterin und Mycophenolsäure verwendet werden, um transfizierte Zellen auszuwählen, die einen Expressionsvektor tragen mit dem Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferasegen. Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981).
Stabil transfizierte T-Zellen müssen expandiert werden in Kultur bevor die T-Zellen einem Patienten verabreicht werden. Die Vermehrung der T-Zellen kann induziert werden durch Inkubieren der Zellen mit dem geeigneten Antigen. Zum Beispiel kann eine gereinigte Herstellung von CEA verwendet werden, um die Vermehrung von T-Zellen zu induzieren, die chimäre Anti-CEA-TCR-Polypeptide exprimieren, wohingegen eine gereinigte Präparation von Anti-CEA-Antikörper (oder Fragmenten davon) verwendet werden kann, um T-Zellen zu stimulieren, die die chimären Anti-Idiotyp/TCR-Polypeptide exprimieren. Eine Standardtechnik für Antigen induzierte T-Zellvermehrung ist beschrieben durch Coligan auf Seite 7.10.4. Im vorliegenden Zusammenhang ist eine andere wichtige Funktion von Antigen induzierter T-Zellvermehrung die Überprüfung der Gegenwart von funktionellem Immunoglobu-lin/TCR oder funktionellem Immunoglobulin/CD3-Protein.
Nach Kulturerweiterung werden T-Zellen dem Patienten zurückgegeben durch intravenöse Infusion oder durch intraperitoneale Verabreichung. Siehe zum Beispiel Rosenberg et al., Science 233: 1318 (1986), Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 319: 1676 (1988), Hercend et al., J. Biol. Response Modif. 9: 546 (1990), Rosenberg et al., N. Engl. J. Med. 323: 570 (1990) und Bartholeyns et al., Anticancer Res. 11: 1201 (1991).
Zusammenfassend kann genetisches Aufbauen (genetic engineering) verwendet werden, um transformierte menschliche T-Zellen zu bilden, die chimäre Immunoglobulin/TCRs oder chimäre Immunoglobulin/CD3-Proteine exprimieren. T-Zellen, die Ab1/TCRs oder Ab1/CD3-Proteine exprimieren, entsprechen T3-Zellen, während T-Zellen, die Anti-Idiotyp (Ab2)/TCRs oder Ab2/CD3-Proteine exprimieren, T2-Zellen entsprechen.
Einige Verfahren können verwendet werden, um die Effizienz von adoptiver Immunotherapie zu erhöhen. Nach Verabreichung von T-Zellen, die Ab1/TCRs oder Ab1/CD3-Proteine exprimieren, kann ein Ab2-Impfstoff verabreicht werden, um die infusierten T-Zellen in vivo zu erweitern. Ähnlich kann die Verabreichung von T-Zellen, die Ab2/TCRs oder Ab2/CD3-Proteine exprimieren, gefolgt sein von Ab1-Impfung. In beiden Fällen kann die Immunantwort weiter vermehrt werden durch Verabreichung von γ-INF, IL-2 oder γ-INF und IL-2 nach der Verabreichung von transformierten T-Zellen. Daher kann Antikörperimpfung und Cytokinbehandlung verwendet werden, um die Effizienz von adaptiver Immunotherapie mit transformierten T-Zellen zu komplimentieren und zu vergrößern.
Die vorliegende Erfindung, daher allgemein beschrieben, wird besser verstanden werden durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche als Veranschaulichung angegeben sind und nicht zur Begrenzung der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind.
BEISPIEL 1
Erzeugung von murinem Anti-CEA-Mab (MN-14)
Die Herstellung von MN-14, einem Klasse III Anti-CEA-MAb ist beschrieben worden von Hansen et al., Cancer 71: 3478 (1993). Kurz gefasst wurde eine 20 Gramm BALB/c weibliche Maus subkutan immunisiert mit 7,5 μg von teilweise gereinigtem CEA in vollständigem Freudschen Adjuvans. Am Tag 3 wurde die Maus subkutan mit 7,5 μg CEA in unvollständigem Freudschen Adjuvans angeregt und dann wurde die Maus intravenös mit 7,5 μg CEA in Salzlösung an den Tagen 6 und 9 angeregt. Am Tag 278 wurde der Maus 65 μg CEA intravenös in Salzlösung zugegeben und 90 μg CEA in Salzlösung am Tag 404. Am Tag 407 wurde die Maus geopfert, eine Zellsuspension der Milz wurde hergestellt, die Milzzellen wurden fusioniert mit Maus-Myelomazellen, SP2/0-Ag 14 (ATCC CRL 1581) unter Verwendung von Polyethylenglykol und die Zellen wurden kultiviert in einem Medium, das 8-Azaguanin enthält. Hybridomaüberstände wurden gescreent für CEA-reaktiven Antikörper unter Verwendung eines ¹²⁵I-CEA-Radioimmunotests (Roche; Nutley, NJ). Positive Klone wurden umkloniert.
Ein Klon, bezeichnet als MN-14, hatte Eigenschaften ähnlich zu Klasse III Anti-CEA-spezifischem MAb, NP-4, war nicht reaktiv mit normalem kreuzreaktiven Antigen und Meconiumantigen. Hingegen zeigte MN-14, verglichen mit NP-4 signifikant sich über legen bei Tumoranvisieren in einem menschlichen Darmtumorxenograftmodell und konsistent stärkeren Anfärben von Gefrierschnitten von Darmkrebs.
BEISPIEL 2
Herstellung von CDR-versetztem MN-14 (hMN-14) und hAb1-Impfstoffen (hMN-14-Impfstoff)
Ein modifizierter Antikörper wurde hergestellt, in welchem komplementäre bestimmende Regionen (CDR) von MN-14 eingesetzt waren in die Gerüstbereiche von humanem IgG₁-Antikörper. Der CDR-gepfropfte ("humanisierte") MN-14-Antikörper wurde "hMN-14" bezeichnet. Allgemeine Techniken zur Herstellung humanisierter Antikörper sind beschrieben zum Beispiel von Jones et al., Nature 321: 522 (1986), Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988), Verhoeyen et al., Science 239: 1534 (1988), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285 (1992), Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437 (1992) und Singer et al., J. Immun. 150: 2844 (1993).
Um hMN-14-Impfstoff herzustellen, wurde hMN-14 konjugiert mit Schlüssellochlympethemocyanin. Typischerweise werden Patienten immunisiert mit subkutanen Injektionen des Konjugats (2 mg/Injektion) vermischt mit 100 μl (10⁷ Organismen) von Tice Bacillus Calmette-Guérin (Organon; West Orange, NJ).
BEISPIEL 3
Herstellung von monoklonalem Ratten-Ab2 gegen MN-14 (WI2) und Ab2-Impfstoff (WI2-Impfstoff)
Ratten-Ab2 gegen MN-14 wurde hergestellt wie beschrieben von Losman et al., Int. J. Cancer 56: 580 (1994), welches als Referenz eingefügt ist. Kurz gefasst wurden 3 Wochen alte weibliche Kopenhagen Ratten intraperitoneal eingespritzt mit 200 μg von MN-14 F(ab')₂-Fragmenten, emulgiert in vollständigem Freudschem Adjuvans. Die Tiere wurden angeregt bei Tagen 200, 230 und 235 mit derselben Menge von Antigen in unvollständigen Freudschen Adjuvans. Vier Tage nach der letzten Injektion wurden die Tiere geopfert, Milzzellsuspensionen wurden hergestellt und die Zel len wurden fusioniert mit murinem nicht sekretierendem Plasmocytoma SP2/0 unter Verwendung von Standardtechniken. Hybridomazellen wurden kultiviert in Gegenwart von Ratten-peritonealen Makrophagen (10.000 Zellen/200 μl Kulturloch).
Kulturüberstände wurden gescreent durch ELISA auf Reaktivität mit MN-14 und Abwesenheit von Reaktivität mit murinen Kontroll-MAbs. Positive Hybridomas wurden wenigstens zweimal durch begrenzende Verdünnung in Gegenwart von Ratten-peritonalen Makrophagen geklont.
WI2 ist ein IgG_1k-Ab2, welcher spezifisch ist für MN-14 und reagiert nicht mit anderen Isotyp-gemischten Anti-CEA-MAbs. Immunisierung von Mäusen oder Kaninchen mit WI2 (aber nicht Kontrollratten-IgG) induzierte die Erzeugung von Ab1'-Anti-CEA-Antikörpern. Daher kann WI2 verwendet werden als ein Idiotypimpfstoff für Patienten mit CEA-erzeugenden Tumoren.
WI2-Impfstoff wird hergestellt aus WI2 wie beschrieben für die Herstellung von hMN-14-Impfstoff.
BEISPIEL 4
Behandlung mit hMN-14-Impfstoff (hAB1-Impfstoff) und WI2-Impfstoff (Ab2-Impfstoff)
Ein Patient mit Dukes C Darmkarzinom unterlief einer ersten Tumorresektion zur Heilung und wurde dann platziert auf Fluorouracil- und Levamisole-Adjuvanstherapie. Der voroperative CEA-Titer war 15,5 ng/ml. Drei Monate nach primärer Chirurgie war der CEA-Titer im normalen Bereich, das heißt unter 2,5 ng/ml.
Zwei Jahre später wurde bei dem Patienten ein CEA-Titer von 25 ng/ml gefunden und ein CAT-Scan zeigte einen 5 cm Tumor im linken Leberlappen und einen 2 cm Tumor im rechten Lappen. Ein Monat später war der CEA-Titer 25 ng/ml und der Patient wurde subkutan immunisiert mit 2 mg hAb1-Impfstoff (Tag 0). Die Immunisierung wurde am Tag 7 wiederholt.
Am Tag 30 wurde der Patient gefunden als Lymphozyten habend, die reaktiv mit Ab1 (T2-Zellen) sind. Am Tag 40 wurde dem Patienten 100 mg des hAb1 intravenös gegeben. Zwei Monate später war der CEA-Titer 5 ng/ml und ein CAT-Scan zeigte, dass der Tumor am linken Lappen auf 2 cm Größe schwand, während der Tumor am rechten Lappen vollständig zurückgegangen war.
Sechs Monate später war der Tumor am linken Lappen in der Größe vergrößert und die große Tumormasse wurde in dem Abdomen gefunden wie durch Nadelbiopsie bestätigt. Ein CEA-Titer hatte sich erhöht auf 50 ng/ml. Dem Patienten wurden WI2-Ab2-Impfstoff (2 mg) subkutan am Tag 0 und am Tag 30 gegeben. Eine ernste Reaktion trat am Injektionsort am Tag 35 auf, welche langsam zurückging.
Drei Monate später wurde der CEA-Titer gefunden als weniger als 2,5 ng/ml seiend und der Tumor am linken Lappen war vollständig aufgelöst. Die Masse in dem Abdomen wurde in der Größe vermindert und eine Nadelbiopsie enthüllte nicht die Gegenwart eines Tumors und zeigte nur Fasergewebe, das mit Lymphozyten infiltriert war.
Zwei Jahre später zeigte ein CAT-Scan, dass das Tumorwiederauftreten nicht auftrat und der CEA-Titer kleiner als 2,5 ng/ml war.

Claims

Kombiniertes Medikament zur Verabreichung an ein Säugetier, einschließend humorale und zelluläre Immunantworten in dem Säugetier gegen einen Tumor, der einen Tumor exprimiert, der mit einem Antigen (TAA) verbunden ist oder gegen eine Krankheit, die durch ein Infektionsmittel verursacht ist, wobei das kombinierte Medikament umfasst: (a) einen ersten Impfstoff, der einen Antikörper-Bestandteil umfasst, der mit dem TAA oder mit einem Antigen kombiniert, das mit dem Infektionsmittel assoziiert ist, welcher Antikörper-Bestandteil mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein konjugiert ist, und (b) einen zweiten Impfstoff, welcher einen Anti-Idiotyp-Antikörper-Bestandteil umfasst, der ein Epitop von dem TAA oder dem infektiösen Antigenmittel nachahmt, welcher Anti-Idiotyp-Antikörper-Bestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein.
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 1, worin der Antikörper-Bestandteil von Teil (a) ist: (i) ein mausmonoklonaler Antikörper (ii) ein humanisierter Antikörper, der von einem mausmonoklonalen Antikörper abgeleitet ist. (iii) ein menschlicher monoklonaler Antikörper, oder (iv) ein Antikörperfragment, das abgeleitet ist von (i), (ii) oder (iii).
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin der Anti-Idiotyp-Antikörper-Bestandteil ist: (i) ein polyklonaler Antikörper; (ii) ein mausmonoklonaler Antikörper; (iii) ein humanisierter Antikörper, der abgeleitet ist von (ii); (iv) ein menschlicher monoklonaler Antikörper; (v) ein subhumaner Primatenantikörper; oder (vi) ein Antikörperfragment, das abgeleitet ist von (i), (ii), (iii), (iv) oder (v).
Kombiniertes Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 3, welches weiterhin ein Antikörper- oder ein Antigen bindendes Fragment davon umfasst, worin der Antikörper oder das Fragment nicht konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein und worin der Antikörper oder das Fragment mit dem TAA oder mit einem Antigen bindet, das mit dem Infektionsmittel assoziiert ist.
Kombiniertes Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin der erste Impfstoff einen Klasse-III-Anti-CEA-Antikörper umfasst, worin der Antikörper ein Klasse-III-Anti-CEA-Antikörper ist und worin der zweite Impfstoff einen Antikörper umfasst, der mit der variablen Region eines Klasse-III-Anti-CEA-Antikörpers kombiniert.
Kombiniertes Medikament zur Verabreichung an ein Säugetier zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in dem Säugetier gegen einen Tumor, der ein TAA exprimiert oder gegen eine Krankheit, die durch ein Infektionsmittel hervorgerufen wird, wobei das kombinierte Medikament umfasst: (a) einen Impfstoff, der einen Antikörper-Bestandteil umfasst, der mit dem TAA kombiniert oder mit einem Antigen, das mit dem Infektionsmittel assoziiert ist und worin der Antikörper-Bestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein; und (b) ein Antikörper oder ein Anikörperbindungsfragment davon, worin der Antikörper oder das Fragment nicht mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein konjugiert ist und worin der Antikörper oder das Fragment mit dem TAA oder mit einem Antigen bindet, das mit dem Infektionsmittel assoziiert ist.
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 6, worin der Antikörper oder das Fragment von Teil (b) konjugiert ist mit Biotin und worin das kombinierte Medikament weiterhin Avidin zur Verabreichung umfasst, um zirkulierende Gehalte des biotinylierten Antikörpers oder des biotinylierten Antikörperfragments zu vermindern.
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 7, worin der Impfstoff von Teil (a) für eine zweite Verabreichung ist.
Kombiniertes Medikament zur Verabreichung an einen Patienten zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in dem Säugetier gegen einen Tumor, der ein mit dem Tumor assoziiertes Antigen (TAA) exprimiert oder gegen eine Krankheit, die durch ein Infektionsmittel hervorgerufen wird, wobei das Medikament umfasst: (a) Transfizierte T-Zellen des Patienten, umfassend einen Expressionsvektor, worin der Expressionsvektor ein DNA-Molekül umfasst, das entweder für einen chimären Immunoglobulin-/T-Zell-Rezeptor ein chimäres Immunoglobulin-/CD3-Protein kodiert und worin der Immunoglobulin kodierende Teil des DNA-Moleküls die variable Region eines Antikörpers kodiert, der mit dem TAA bindet oder mit einem Antigen, das mit einem Infektionsmittel assoziiert ist; und (b) ein Impfstoff, der einen Anti-Idiotyp-Antikörper-Bestandteil umfasst, welcher an die Immunoglobulin-Einheit des chimären Immunoglobulin-/T-Zell-Rezeptors bindet oder das chimäre Immunglobulin-/CD3-Protein oder einen Antikörper-Bestandteil, der mit der Immunoglobulin-Einheit des chimären Immunoglobulin-/T-Zell-Rezeptors bindet oder dem chimären Immunoglobulin-/CD3-Protein und worin der Antikörper-Idiotyp-Antikörper-Bestandteil oder der Antikörper-Bestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein.
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 9, worin die variablen Regionen der α- und β-Polypeptidketten des T-Zell-Rezeptors genannt in Teil (a) ersetzt sind durch variable Regionen des Antikörpers von Teil (a).
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 10, worin das TAA carcinoembryonales Antigen (CEA) ist.
Kombiniertes Medikament nach Anspruch 11, worin der Immunoglobulin kodierende Teil des DNA-Moleküls die variable Region eines Klasse-III-Anti-CEA-Antikörpers kodiert.
Kombiniertes Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches weiterhin Interferon-γ zur Verabreichung vor und während der Verabreichung des Impfstoffs oder transfizierter T-Zellen umfasst.
Kombiniertes Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 13, welches weiterhin Interleukin-2 zur Verabreichung vor und während der Verabreichung des Impfstoffs oder transfizierter T-Zellen umfasst.
Kombiniertes Medikament nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin jedes Antikörper-Fragment F(ab')₂, F(ab)₂, Fab, Fv, sFv oder eine Minimal-Erkennungseinheit ist, die aus den Aminosäureresten besteht, welche die hypervariable Region nachahmen.
Kombiniertes Medikament zur Verabreichung an ein Säugetier zum Induzieren von humoralen und zellulären Immunantworten in dem Säugetier gegen einen Tumor, der einen Tumor exprimiert, der mit einem Antigen (TAA) assoziiert ist oder gegen eine Krankheit, die durch ein Infektionsmittel hervorgerufen wird, wobei das kombinierte Medikament umfasst: (a) einen ersten Impfstoff, welcher einen Antikörper-Bestandteil umfasst, der mit dem TAA oder mit einem Antigen kombiniert, welches mit dem Infektionsmittel verbunden ist, welcher Antikörper-Bestandteil konjugiert ist mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein; und (b) einen bispezifischen Antikörper oder Antigenbindungs-Fragment davon, worin der Antikörper oder das Fragment nicht mit einem löslichen immunogenen Trägerprotein konjugiert ist und worin der Antikörper oder Fragmente (i) mit dem TAA oder mit einem Antigen bindet, das mit dem Infektionsmittel assoziiert ist, und (ii) eine Bindungseinheit für T-Zellen hat.