DE60206731T2

DE60206731T2 - Polypeptide, die fähig sind, an CD64 zu binden und die ein oder mehrere Heterologe T-Zellenpitope enthalten, und deren Verwendung

Info

Publication number: DE60206731T2
Application number: DE60206731T
Authority: DE
Inventors: Linda Gillian Durrant; Tina Parsons; Adrian Robins
Original assignee: Scancell Ltd; Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Scancell Ltd; Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2002-01-28
Publication date: 2006-07-20
Anticipated expiration: 2022-01-29
Also published as: US20110165180A1; DE60206731D1; JP5198715B2; EP1354054A2; DK1354054T3; US8187600B2; EP1354054B1; CA2435672C; KR20030083698A; US20040146505A1; WO2002058728A3; WO2002058728A2; AU2002225230B2; CA2435672A1; ES2254663T3; GB0102145D0; ATE307209T1; JP2004520376A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft T-Zellepitope, und insbesondere Moleküle zur Bereitstellung solcher Epitope zum Erzeugen einer zytotoxischen T-Zell-(CTL) Reaktion. In der vorliegenden Erfindung können die Moleküle modifizierte Antikörper sein, besonders menschliche monoklonale IgG1-Antikörper, welche sich an den CD64-Rezeptor binden, und welche so konstruiert sind, dass sie T-Zellepitope innerhalb ihrer CDR-Region exprimieren, um sowohl Helfer- als auch zytotoxische T-Zellreaktionen zu stimulieren.
Antikörper sind zusammengesetzt aus konstanten Regionen (Fc), welche die Effektorfunktion des Antikörpers bestimmen, und den Antigenbindungsdomänen (Fab), welche einen einmaligen Satz Komplementaritätsbestimmungsregionen (CDRs) aufweisen. Die Rolle von Antikörpern ist die Bindung an Antigene, wodurch sie diese erkennbarer für das Immunsystem machen. Antigen-Antikörper (Ag-Ab)-Komplexe können sich an den Fc-Rezeptor auf phagozytischen Zellen binden, um eine effiziente Verdauung schädlicher Pathogene zu ermöglichen. Fc-Rezeptor-Internalisierung ermöglicht auch eine effiziente Antigenpräsentation zum Stimulieren von T-Zellreaktionen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Fc-Rezeptor-Internalisierung von Ag-Ab-Komplexen 1.000-Fach effizienter ist als Pinozytose zur Stimulation von T-Helferzellenreaktionen. Erst vor kurzen wurde nachgewiesen, dass die Fc-Rezeptor-Internalisierung von Antigen-Antikörper-Komplexen durch dendritische Zellen auch eine effizientere weiterverarbeitung von Antigen in Präsentationswege der Klasse I und Klasse II zulässt, um die Stimulation nicht nur von Helfer-, sondern auch von zytotoxischen T-Zellreaktionen zu ermöglichen (Regnault et al., (1999) J. Exp. Med. 189: 371–380). Ferner aktiviert die Fc-Rezeptor-Internalisierung dendritische Zellen, co-stimulatorische Moleküle zu exprimieren, die essentiell für die Einleitung naiver Reaktionen sind. Die Fc-Rezeptor-Internalisierung ist eine Folge der Rezeptorvernetzung durch Antigen/Antikörper-Komplexe, und frühere Studien haben gezeigt, das Ab (Antikörper) allein diesen Effekt nicht vermitteln können.
Obwohl mehrere Studien nahe gelegt haben, dass anti-idiotyp Antikörper, welche Antigene nachahmen, zytotoxische T-Zellreaktionen stimulieren können, konnten sie keine antigenspezifischen zytotoxischen T-Zellreaktionen nachweisen, die durch eine spezifische MHC-Präsentation der Klasse Iangeregt wird. Tatsächlich konnten in einer Studie, in der ein Helfer- und ein zytotoxisches T-Zellepitop in die CDR-Region eines Mausantikörpers verpflanzt wurden, nur Helferreaktionen stimuliert werden.
Zum Beispiel offenbart WO 96/19584 chimäre Antikörper, in welchen T-Zellepitope in die CDRs eines Antikörpers eingefügt sind, und es wird behauptet, dass solche chimären Antikörper zum Erzeugen einer CTL-Reaktion geeignet wären. Allerdings offenbart dieses Dokument lediglich, dass eine CTL durch Nukleinsäure induziert werden kann, welche einen solchen chimären Antikörper kodiert; es wird jedoch nicht offenbart, wie durch Anwendung eines chimären Antikörpers selbst eine CTL-Reaktion induziert werden kann. So heißt es auf Seite 51, Zeile 8–10, dass „nur Proteine, die von den Zielzellen selbst aufgebaut wurden, von MHC Klasse I Molekülen präsentiert und durch CTLs erkannt werden".
Zusätzlich offenbart WO 00/64488, dass eine CTL-Reaktion durch Nukleinsäure gesteigert werden kann, die einen chimären Antikörper kodiert, weilcher heterologe T-Zellepitope, eingefügt in dessen CDR, aufweist, vorausgesetzt die Nukleinsäure ist für die Expression in hämatopoetischen Zellen ausgerichtet.
Überraschenderweise haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass bestimmte menschliche monoklonale Antikörper, welche bestimmte T-Zellepitope innerhalb ihrer CDR-Regionen aufweisen, sowohl Helfer- als auch antigenspezifische T-Zellreaktionen stimulieren können. Ferner haben sie gezeigt, dass die menschliche FcγI-Region wesentlich für das Erzeugen der zytotoxischen Reaktionen ist und die Empfindlichkeit darauf, T-Helferzellreaktionen anzuregen, enorm steigert. Diese Region bindet CD64 dendritischer Zellen. Dementsprechend kann sie verwendet werden, um T-Zellepitope an dendritische Zellen zu liefern, welche sie dann verarbeiten und an T-Zellen präsentieren können, wodurch zytotoxische und/oder T-Helferzellreaktionen stimuliert werden.
Somit bietet die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt die Verwendung eines Polypeptides, welches aufweist: (i) einen ersten Abschnitt, welcher den Teil des menschlichen Fc aufweist, welcher sich an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt, welcher ein oder mehrere heterologe T-Zellepitope aufweist, zur Herstellung eines Medikamentes für die Stimulation einer zytotoxischen T-Zellreaktion.
Der erste Abschnitt kann das Fc-Segment von (z.B. menschlichem) IgG aufweisen, zum Beispiel IgG1. Der erste Abschnitt kann die Schwerketten-(γ) Region des Fc-Segmentes aufweisen. Vorzugsweise weist der erste Abschnitt die Schwerketten-(γ) Region des Fc-Segmentes von IgG1 (FcγI) auf.
„Heterologe T-Zellepitope" sollen für ein T-Zellepitop stehen, welches heterolog zum ersten Abschnitt ist. Zum Beispiel dort, wo der zweite Abschnitt das Fab-Fragment eines Antikörpers aufweist, ist ein heterologes T-Zellepitop ein solches, welches zuvor nicht in dem Fab-Fragment vorhanden war. Das heterologe T-Zellepitop kann ein pathogenes Epitop oder ein nichtpathogenes Epitop wie ein Tumor-Epitop sein.
Der zweite Abschnitt kann ein Polypeptid sein. Alternativ dazu kann der zweite Abschnitt ein Fab-Fragment sein, welches menschlich oder nicht menschlich, bevorzugt von einer Maus, sein kann.. Es ist bevorzugt, dass das, oder jedes, T-Zellepitop als Ersatz der CDR eingefügt wird, obwohl dies nicht unbedingt notwenig ist, vorausgesetzt die T-Zellepitope werden an Antigen-präsentierende Zellen geliefert und von ihnen präsentiert. Das heterologe T-Zellepitop kann als Ganzes eingefügt werden, obwohl es auch aus einer eingefügten Aminosäuresequenz zusammen mit flankierenden Aminosäuren des zweiten Abschnittes zusammengesetzt sein kann. Alternativ kann zum Beispiel ein anti-idiotyp Antikörper hinsichtlich eines bestimmten Antigens in einer Spezies, z.B. Maus, gezüchtet werden, und das Fab-Fragment dieses Antikörpers wird an den Teil des menschlichen Fc gepfropft, welcher sich an CD64 bindet.
Das Medikament kann zytotoxische und T-Helferzellenreaktionen stimulieren und kann für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebs eingesetzt werden. Die Verwendung der Erfindung kann ferner die Verwendung einer Nukleinsäure, welche ein Polypeptid des ersten Aspektes der Erfindung kodiert, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Stimulation einer zytotoxischen T-Zellreaktion aufweisen. Das Medikament kann ferner ein Adjuvans aufweisen.
Der Stand der Technik hat gezeigt, dass FcγI verwendet werden kann, um Moleküle auf dendritische Zellen zu richten (Liu et al., (1999) J. Clin. Invest. 98(9): 2001–2007). Jedoch waren diese Studien nicht in der Lage, aufzuzeigen, dass solche Moleküle keine CTL-Reaktion stimulieren konnten, trotz früherer Spekulation, dass dies möglich sein könnte (Guyre et al., (1997) Cancer Immunol. Immunothr. 45: 146–148).
Wie hierein verwendet, steht der Begriff „Polypeptid" im Allgemeinen für mehrere Aminosäurereste, welche durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Er wird austauschbar verwendet und bedeutet das Gleiche wie Peptid, Protein, Oligopeptid oder Oligomer. Der Begriff „Polypeptidsoll auch Fragmente, Analoga und Derivate eines Polypeptides beinhalten, wobei das Fragment, Analogon oder Derivat im Wesentlichen die gleiche biologische Aktivität oder Funktion beibehält wie ein Referenzprotein.
Vorzugsweise ist das für die Erfindung geeignete Polypeptid ein Konstrukt der Fc-Protein-Domäne oder ein monoklonaler Antikörper. Für die vorliegende Erfindung geeignete Polypeptide können hierin auch als „Immunkörper" bezeichnet werden.
Nukleinsäure, welche das Polypeptid des ersten Aspektes der Erfindung kodiert, kann bereitgestellt werden. Die Nukleinsäure kann DNA, cDNA oder RNA wie mRNA sein, erhalten durch Klonieren oder hergestellt durch chemische Synthese. Für den therapeutischen Einsatz liegt die Nukleinsäure vorzugsweise in einer Form vor, welche in dem zu behandelnden Körper exprimiert werden kann.
Das für die vorliegende Erfindung geeignete Polypeptid oder die das Polypeptid kodierende Nukleinsäure können als ein Isolat, in isolierter und/oder gereinigter Form, oder frei oder im Wesentlichen frei von Material, mit dem es natürlicherweise verbunden ist, bereitgestellt werden. Im Falle einer Nukleinsäure kann diese frei oder im Wesentlichen frei von Nukleinsäure sein, welche das Gen im menschlichen Genom flankieren, außer möglicherweise einer oder mehreren Regulationssequenz(en) für die Expression. Nukleinsäure kann vollständig oder teilweise synthetisch sein und kann Genom-DNA, -cDNA oder RNA beinhalten. Dort wo Nukleinsäure, welche das Polypeptid kodiert, RNA beinhaltet, gilt die Referenz zur gezeigten Sequenz als Referenz zum RNA-Äquivalent, wobei U durch T ersetzt ist.
Nukleinsäuresequenzen, welche ein für die vorliegende Erfindung geeignetes Polypeptid kodieren, können durch den Fachmann leicht hergestellt werden, zum Beispiel mittels der hierin enthaltenen Informationen und Referenzen sowie der in der Technik bekannten Verfahren (siehe zum Beispiel Sambrook, Fritsch and Maniatis, „Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992), vorausgesetzt die Nukleinsäuresequenzen und Klone sind verfügbar. Zu diesen Verfahren zählen (i) die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Amplifizieren von Proben einer solchen Nukleinsäure, z.B. aus Genom-Quellen, (ii) chemische Synthese, oder (iii) die Herstellung von cDNA-Sequenzen. DNA, welche das Polypeptid kodiert, kann erzeugt und in jeder geeigneten Art und Weise verwendet werden, die dem Fachmann bekannt ist, einschließlich der Heranziehung kodierender DNA, der Identifizierung geeigneter Restriktionsenzymerkennungsstellen auf jeder Seite des zu exprimierenden Abschnittes und des Herausschneidens des Abschnittes aus der DNA. Der Abschnitt kann dann in einem standardmäßigen handelsüblichen Expressionssystem mit einem geeigneten Promotor operativ verbunden werden. Ein weiterer rekombinanter Ansatz ist die Amplifizierung des relevanten Abschnittes der DNA mit geeigneten PCR-Primern. Es können Modifikationen der Sequenzen erfolgen, z.B. mittels ortsspezifischer Mutagenese, um zur Expression eines modifizierten Peptides zu führen, oder um Codonpräferenzen in den Wirtszellen zu berücksichtigen, die zur Expression der Nukleinsäure verwendet werden.
Für die Expression der Nukleinsäuresequenzen können die Sequenzen in einen Vektor mit einer oder mehreren Steuersequenzen eingefügt werden, welche wirkungsmäßig mit der Nukleinsäure verbunden sind, um deren Expression zu steuern. Die Vektoren können auch andere Sequenzen wie Promotoren oder Enhancer beinhalten, um die Expression der eingefügten Nukleinsäure oder Nukleinsäuresequenz voranzutreiben, so dass das Polypeptid als eine Fusion und/oder Nukleinsäure erzeugt wird, welche Sekretionssignale kodiert, so dass das in der Wirtszelle erzeugte Polypeptid von der Zelle sekretiert wird. Das Polypeptid erhält man dann durch Transformation der Vektoren in Wirtszellen, in welchen der Vektor funktional ist, Kultivierung der Wirtszellen, so dass das Polypeptid erzeugt wird und Gewinnung des Polypeptids aus den Wirtszellen oder dem umgebenden Medium. Zu diesem Zweck werden in der Technik prokaryotische und eukaryotische Zellen eingesetzt, einschließlich Stämme von E. coli, Hefe, und eukaryotischen Zellen wie Insektenzellen und Tierzellen, zum Beispiel COS- oder CHO-Zellen, Bowes-Melanom oder andere geeignete menschliche Zellen.
Bevorzugt bindet sich der Teil des menschlichen Fc des ersten Abschnittes an das CD64 dendritischer Zellen. Daher bietet ein weiterer Aspekt der Erfindung dendritische Zellen, welche die heterologen T-Zellepitope des zweiten Abschnittes präsentieren, exprimieren oder daran gebunden sind.
Ein Verfahren zur Stimulation einer zytotoxischen T-Zellreaktion bei einem Patienten wie einem Säugetier, einschließlich eines Menschen, kann die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines Polypeptides an einen Empfänger aufweisen, welches Folgendes aufweist: (i) einen ersten Abschnitt, welcher den Teil des menschlichen Fc aufweist, welcher sich an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt, welcher ein oder mehrere heterologe T-Zellepitope aufweist. Ein Verfahren zur Stimulation einer zytotoxischen T-Zellreaktion bei einem Patienten wie einem Säugetier, einschließlich eines Menschen, kann die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge einer Nukleinsäure an einen Empfänger aufweisen, welche ein Polypeptid kodiert, welches Folgendes aufweist: (i) einen ersten Abschnitt, welcher den Teil der menschlichen Fc aufweist, welcher sich an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt, welcher ein oder mehrere heterologe T-Zellepitope aufweist. Vorzugsweise werden das Polypeptid und die Nukleinsäure als eine Kombinationstherapie verabreicht. Bei einem solchen Verfahren kann das Polypeptid oder die Nukleinsäure intravenös, intradermal, intramuskulär, oral oder auf anderen Wegen verabreicht werden.
Die intradermale und/oder intramuskuläre Verabreichung wird bevorzugt, da diese Gewebe dendritische Zellen enthalten und sie keine hohes Niveau an Serum-IgG aufweisen, welches als konkurrierender Hemmstoff für die Bindung an CD64 agieren könnte.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff „Behandlung" jede Behandlungsregel, welches für einen Menschen oder ein nicht-menschliches Tier von Nutzen sein kann. Die Behandlung kann die einer Erbkrankheit oder einer erworbenen Krankheit sein. Vorzugsweise ist die Behandlung die eines/r Leidens/Störung mit Zellproliferation wie Krebs.
Das Polypeptid oder die Nukleinsäure kann in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Trägerstoff oder Trägerstoffen eingesetzt werden. Solche Trägerstoffe können Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Liposome, Wasser, Glycerol, Ethanol sowie Kombinationen davon beinhalten, sind gedoch nicht darauf beschränkt.
Adjuvantien können eingesetzt werden, um die Stimulation der Immunreaktion des Wirtes zu vereinfachen, und zu ihnen können Aluminiumhydroxid, Lysolezithin, Pluronic, Polyole, Polyanione, Peptide, Proteine und Ölemulsionen zählen.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Züchtung eines antiidiotyp Antikörpers in einer Spezies, z.B. einer Maus, hinsichtlich eines bestimmten Antigens, das Pfropfen des Fab-Fragmentes dieses Antikörpers oder eines Polypeptidfragmentes (welches zu windest 300 Aminosäuren lang sein kann, oder selbst mindestens 10–20 Aminosäuren lang sein kann, zum Beispiel 16 Aminosäuren (entsprechend der Größe eines Epitops der Klasse II) oder 9 Aminosäuren (entsprechend der Größe eines Epitops der Klasse I)), an den Teil des menschlichen Fc, welcher sich an CD64 bindet (z.B. menschliche FcγI), sowie die Verwendung des entstehenden Polypeptids zur Steigerung einer zytotoxischen T-Zellreaktion gegen das Antigen.
Bei bestimmten anderen Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erzeugen von T-Zellepitopen von Target-Antigenen in igend einer der CDR-Regionen menschlicher monoklonaler IgG1-Antikörper und die Verwendung solcher konstruierter Antikörper als Impfstoffe zur Stimulation von sowohl Helfer- als auch zytotoxischen T-Zellreaktionen.
Jedes beliebige T-Zellepitop kann eingefügt werden, vorausgesetzt der Antikörper kann sich an CD64 binden und eine zytotoxische T-Zellreaktion stimulieren. T-Zellepitope aus Pathogenen wie HIV, Hepatitis C und anderen Infektionen, welche CTLs zur Bereinigung latenter Infektionen erfordern, können verwendet werden, obwohl bevorzugt wird, wenn das Epitop eine „Eigen-Epitop" ist, d.h. in Verbindung steht mit einem/r Leiden/Störung, das/die wie Krebs mit Zellproliferation einhergeht. Bevorzugt ist das T-Zellepitop so beschaffen, dass der Antikörper korrekt gefaltet und sekretiert werden kann. Es ist daher bevorzugt, dass die eingefügten Epitope eine ähnliche Größe und Aminosäurezusammensetzung wie die usprünglichen CDRs aufweisen. Der zweite Abschnitt kann mehrere unterschiedliche T-Zellepitope aufweisen, damit eine große Vielfalt an T-Zellimpfstoffen erzeugt werden kann. Der zweite Abschnitt kann multiple Epitope aus einem einzelnen Antigen beinhalten, wodurch sichergestellt wird, dass die Mehrheit der Einzelpersonen mit unterschiedlichen HLA-Typen auf einen einzelnen Impfstoff reagiert. Alternativ können multiple T-Zellepitope aus multiplen Antigenen, welche auf ein eingeschränktes Spektrum von HLA-Typen zielen, eingefügt werden. Die Moleküle können eine Vielzahl von Antigenen aus einem/r einzigen Pathogen oder Krebsart beinhalten, oder sie können nicht korrespondierende Antigene beinhalten, welche auf eine breite Spanne von soliden Tumoren oder Pathogenen zielen. Die Moleküle selbst können so konstruiert sein, dass sie auf unterschiedliche Zellpopulationen innerhalb eines Tumors zielen, wie Epithel- und Endothel-Tumorantigene.
Ein bevorzugtes Polypeptid geeignet für die vorliegende Erfindung ist ein menschlicher monoklonaler IgG1-Antikörper, welcher so konstruiert ist, dass er innerhalb seiner CDR-Regionen zytotoxische T-Zellepitope, gegebenenfalls mit T-Helferzellepitopen, aufbildet. Die menschlichen monoklonalen Antikörper geeignet für die Erfindung können durch die Immortalisierung von Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden, welche Antikörper kodieren. Der Immortalisierungsprozess kann durch Hybridomfusionsverfahren durchgeführt werden, durch virale Transformation von menschlichen Antikörper-produzierenden Lymphozyten, durch Verfahren, welche Zellfusions- und Virustransformationsmethoden kombinieren, oder durch jegliches andere, dem Fachmann bekannte Verfahren.
In einer Ausführungsform wird das für die vorliegende Erfindung geeignete Polypeptid mittels einer Kombination aus Epstein-Barr-Virus (EBV)-Transformation und Hybridomfusionsverfahren, wie die von Kozbor et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79:6551 beschriebenen, hergestellt. Zum Beispiel können die Hybridome erzeugt werden, indem stimulierte B-Zellen aus einem Menschen mit einem Maus/Mensch-Heterohybridfusionspartner fusioniert werden. Eine Vielzahl solcher Fusionspartner wurde beschrieben. Siehe zum Beispiel James & Bell, J. Immunol. Methds., (1987) 100: 5–04 und US-Patentschrift Nr. 4,624,921. Ein Maus/Mensch-Fusionspartner kann zum Beispiel durch Fusion menschlicher Lymphozyten, welche durch EBV stimuliert oder transformiert wurden, mit leicht verfügbaren Mausmyelomlinien wie NS-1 oder P3NS-1 in Gegenwart von Polyethylenglykol konstruiert werden. Der Hybrid könnte angemessen Arznei-markiert werden, was durch Kultivierung des Hybrids in ansteigenden Konzentrationen des gewünschten Arzneimittels wie 6-Thioguanin, Ouabain oder Neomycin erreicht werden kann.
Alternativ kann die Immortalisierung von Zellen, welche die menschlichen anti-idiotyp Antikörper von Interesse erzeugen, durch Verwendung von EBV-Transformationstechniken erreicht werden. Zum Beispiel werden, aus peripherem Blut, Knochenmark, Lymphknoten, Tonsillen usw. abgeleitete B-Lymphozyten von Patienten, die mit dem idiotypen Antikörper immunisiert wurden, mit Hilfe von EBV immortalisiert, entsprechende den in US-Patentschrift Nr. 4,464,465 und Chan et al., J. Immunol. (1986) 136:106 beschriebenen Verfahren.
Die Hybridome oder Lymphoblastoid-Zellen, welche den Antikörper von Interesse sekretieren, können identifiziert werden durch das Screening von Kulturüberständen auf eine Produktion von menschlichem Igel. Zellen aus Vertiefungen, welche die gewünschte Aktivität besitzen, können in Übereinstimmung mit konventionellen Verfahren kloniert und subkloniert werden, und werden überwacht, bis stabile immortalisierte Linien identifiziert werden, welche den menschlichen monoklonalen Antikörper von Interesse erzeugen. „Monoklonaler Antikörper" steht für einen Antikörper hergestellt durch eine klonale, kontinuierliche Zelllinie welche getrennt geführt wird von Zellen, welche monoklonale Antikörper einer anderen Spezifität erzeugen. Somit werden solche Antikörper isoliert von anderen Antikörpern hergestellt und dementsprechend in im Wesentlichen reiner Form mit einer Konzentration, welcher höher ist, als es in normal vorkommendem menschlichem Serum der Fall wäre.
Die immortalisierten Zelllinien der vorliegenden Erfindung können auch mit anderen Zellen verschmolzen werden, um Hybridome oder Heterohybridome herzustellen, und sorgen somit für den Transfer von Genen, welche menschliche monoklonale Antikörper kodieren. Alternativ können rekombinante DNA-Techniken eingesetzt werden, um DNA, welche die Immunglobuline oder Regionen davon kodiert zu isolieren, und sie für spezifische Antikörperproduktion an mehrere Wirte zu übertragen.
Ein modifizierter Antikörper mit der konstanten Region eines humanen Antikörpers und der variablen oder hypervariablen Region eines monoklonalen Mausantikörpers, in welchen heterologe T-Zellepitope eingefügt wurden, sowie die Verwendung des modifizierten Antikörpers zur Steigerung einer CTL-Reaktion kann bereitgestellt werden. Die variable Region, mit Ausnahme der hypervariablen Region, kann auch aus der variablen Region eines menschlichen Antikörpers abgeleitet sein. Einen solchen Antikörper nennt man dann humanisiert. Verfahren zum Herstellen humanisierter Antikörper sind in der Technik bekannt. Verfahren sind zum Beispiel in Winter, US-Patentschrift Nr. 5,225,539 beschrieben.
Die variable Region des Antikörpers außerhalb der hypervariablen Region der Maus kann auch aus einem monoklonalen Mausantikörper abgeleitet werden. In einem solchen Fall wird die gesamte variable Region aus murinem monoklonalem Antikörper abgeleitet, und man nennt den Antikörper dann chimärisiert. Verfahren zum Herstellen chimärisierter Antikörper sind in der Technik bekannt. Zu solchen Verfahren zählen zum Beispiel die in den US-Patentschriften von Boss (Celltech) und von Cabilly (Genentech) beschriebenen. Siehe auch US-Patentschrift Nr. 4,816,397 bzw. 4,816,567.
Die Erfindung beinhaltet die Verwendung modifizierter menschlicher monoklonaler Antikörper mit der konstanten Region eines menschlichen IgG1-Antikörpers, jedoch dem Austausch von einer oder mehreren der hypervariablen Regionen durch T-Zellepitope zum Induzieren einer CTL-Reaktion.
Ein modifizierter Antikörper der vorliegenden Erfindung kann eine, zwei, drei, vier, fünf oder alle seine hypervariablen Regionen mit T-Zellepitopen ersetzt haben. Vorzugsweise besitzen die eingegliederten T-Zellepitope eine ähnliche Größe und Ladung wie die Aminosäuren der ursprünglichen CDR des Antikörpers, so dass der Antikörper korrekt gefaltet und sekretiert wird. T-Zellepitope können mittels bekannter T-Zellalgorithmen vorhergesagt, oder als Peptide synthetisiert und mit Hilfe von Standard-T-Zelluntersuchungen gescreened werden. Die identifizierten T-Zellepitope können zytotoxische T-Zellepitope und/oder T-Helferzellepitope sein und können eine bevorzugte Aminosäurenlänge von 9–20 Aminosäuren aufweisen. Vorzugsweise werden diese Epitope sorgfältig mit der nächstliegenden CDR eines menschlichen monoklonalen Antikörpers abgestimmt und die Sequenzen mittels ortsspezifischer Mutagenese der kodierenden DNA modifiziert. Jede CDR wird bevorzugt sequentiell ersetzt, und die Fähigkeit des Immunkörpers, sich zu falten und als ein intaktes Immunglobulinmolekül sekretiert zu werden, wird gescreened. Die Fähigkeit des Immunkörpers, Helfer- und zytotoxische 7-Zellreaktionen zu stimulieren, kann wie hierin exemplarisch dargestellt gescreened werden. Die Erfindung beinhaltet ferner einen modifizierten Antikörper mit der konstanten Region eines menschlichen Antikörpers fusioniert mit einem ganzen oder einem Teil eines Proteins, in welches heterologe T-Zellepitope eingefügt wurden, sowie die Verwendung des modifizieren Antikörpers zur Steigerung einer CTL-Reaktion.
Für die vorliegende Erfindung geeignete Polypeptide können multiple T-Zellepitope aus einem einzelnen Targetantigen aufweisen, welche sich an die Mehrheit der MHC-Moleküle sowohl der Klasse I als auch der Klasse II binden können. So kann ein Impfstoff hergestellt werden, welcher bei einer Impfung gegen weitgefächerte Populationen eingesetzt werden kann. Alternativ können für die Erfindung geeignete Polypeptide multiple T-Zellepitope von multiplen Targetantigenen aufweisen, welche an die geläufigsten Phänotpypen der Klasse I und Klasse II binden können. So kann ein Impfstoff hergestellt werden, welcher die Auswahl von Antigenfehlvarianten verhindern kann. Targetantigene können von einem einzelnen Pathogen oder Tumortyp stammen, oder können ausgewählt werden, um einen Immunreaktion gegen eine Vielzahl von Pathogenen oder Karzinomen zu bieten.
Für die vorliegende Erfindung geeignete Polypeptide, welche auf spezifische übliche HLA-Phänotypen gerichtet sind, können zahlreiche T-Zellepitope aus einer Vielzahl von Karzinomen und/oder Pathogenen aufweisen, wodurch man einen einzelnen Impfstoff zur Verhinderung von Krankheiten erhält.
Somit beinhaltet die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides des ersten Aspektes, wobei das Verfahren die Expression aus Nukleinsäure, welche das Polypeptid kodiert (im Allgemeinen die Nukleinsäure nach der Erfindung) beinhaltet. Dies kann auf bequeme Weise durch Aufzucht einer Kultur einer Wirtszelle erreicht werden, welche einen solchen Vektor aufweist, und zwar unter solchen geeigneten Bedingungen, welche die Expression des Polypeptides veranlassen oder zulassen. Polypeptide können auch in in vitro-Systemen wie Retikulozyt-Lysat exprimiert werden.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren eines Polypeptides in einer Vielzahl unterschiedlicher Wirtszellen sind gut bekannt. Zu geeigneten Wirtszellen zählen Bakterien, eukaryotische Zellen wie Säugetier- und Hefezellen, und Baculovirus-Systeme. Zu in der Technik verfügbaren Säugetierzelllinien zur Expression eines heterologen Polypeptides zählen Ovarienzellen Chinesischer Hamster, HeLa-Zellen, Baby-Hamster-Nierenzellen, COS-Zellen und viele andere. Ein üblicher bevorzugter Bakterienwirt ist E. coli.
Geeignete Vektoren, welche angemessenen Regulationssequenzen, beinhalten, können wie erforderlich ausgewählt oder konstruiert werden; zu diesen Sequenzen gehören Promotorsequenzen, Terminatorfragmente, Polyadenylierungssequenzen, Enhancersequenzen, Markergene oder geeignete andere Sequenzen. Vektoren können je nach Erfordernis Plasmide, Viren, z.B. Phagen, oder Phagemid sein. Weitere Einzelheiten dazu finden sich zum Beispiel in Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2. Edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Viele Techniken und Protokolle zur Manipulation von Nukleinsäuren, zum Beispiel bei der Herstellung von Nukleinsäurekonstrukten, Mutagenese, Sequenzierung, Einfügung von DNA in Zellen und Genexpression und die Analyse von Proteinen sind in Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Eds., John Wiley and Sons, 1992 detailliert beschrieben.
Somit bietet ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung eine Wirtszelle, welche heterologe Nukleinsäure wie hierin offenbart enthält.
Die Nukleinsäure der Erfindung kann in das Genom (z.B. Chromosom) der Wirtszelle integriert werden. Die Integration kann durch den Einschluss von Sequenzen gefördert werden, welche die Rekombination mit dem Genom in Übereinstimmung mit Standardverfahren unterstützen. Die Nukleinsäure kann sich auf einem extrachromosomalen Vektor innerhalb der Zelle befinden, oder anderweitig identifizierbar heterolog oder zellfremd sein.
Noch ein weiterer Aspekt bietet ein Verfahren, welches das Einfügen der Nukleinsäure in eine Wirtszelle beinhaltet. Die Einfügung, welche (besonders bei der in vitro-Einfügung) im Allgemeinen, ohne einschränkend zu sein, als „Transformation" bezeichnet werden kann, kann jegliche verfügbare Technik anwenden. Bei eukaryotischen Zellen können Folgende zu geeigneten Verfahren zählen: Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextran, Elektroporation, Liposom-mediierte Transfektion und Transduktion mittels Retrovirus oder anderen Viren, z.B. Vaccinia oder, bei Insektenzellen, Baculovirus. Bei Bakterienzellen können Folgende zu geeigneten Verfahren zählen: Calciumchlorid-Transformation, Elektroporation und Transfektion mittels Bakteriophagen. Als eine Alternative kann die direkte Injektion der Nukleinsäure eingesetzt werden.
Markergene wie Antibiotikaresistenz- oder -empfindlichkeitsgene können bei der Identifikation von Klonieren verwendet werden, welche die Nukleinsäure von Interesse enthalten, wie in der Technik gut bekannt ist.
Der Einfügung kann das Veranlassen oder Zulassen der Expression aus der Nukleinsäure folgen, z.B. durch das Kultivieren von Wirtszellen (zu welchen tatsächlich transformierte Zellen zählen können, obwohl die Zellen wahrscheinlicher Nachkommen transformierter Zellen sind) unter Bedingungen, die geeignet für die Expression des Genes sind, so dass das kodierte Polypeptid (oder Peptid) hergestellt wird. Wird das Polypeptid gekoppelt an ein entsprechendes Signalleaderpeptid exprimiert, so kann es von der Zelle in das Kulturmedium sekretiert werden. Im Anschluss an die Produktion durch Expression kann ein Polypeptid oder Peptid aus der Wirtszelle und/oder dem Kulturmedium, je nachdem, was zutreffend ist, isoliert und/oder gereinigt und anschließend wie gewünscht verwendet werden, z.B. bei der Formulierung einer Zusammensetzung, welche ein oder mehrere zusätzliche Komponenten aufweisen kann, wie z.B. eine pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein oder mehrere pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe, Vehikel oder Trägerstoffe (z.B. siehe unten) beinhalten.
Für die Erfindung geeignete Polypeptide können in pharmazeutischen Zusammensetzungen formuliert werden. Diese Zusammensetzungen können, zusätzlich zu einer der zuvor genannten Substanzen, ein pharmazeutisch akzeptables Hilfsstoffe, Trägermittel, Puffer, Stabilisator oder weitere Materialien aufweisen, welche dem Fachmann gut bekannt sind. Solche Materialien sollten nichttoxisch sein und sollten nicht die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffes beeinflussen. Die genaue Natur des Trägerstoffes oder anderen Materials kann vom Verabreichungsweg abhängen, z.B. intradermal, oral, intravenös, kutan oder subkutan, nasal, intramuskulär oder intraperitoneal. Die Formulierung ist vorzugsweise flüssig und ist üblicherweise eine physiologische Salzlösung mit Nichtphosphatpuffer bei pH 6,8–7,6 oder kann lyophilisiertes Pulver sein.
Die Zusammensetzungen, welche die Polypeptide aufweisen, oder für deren Bereitstellung, werden einer Person vorzugsweise in einer „therapeutisch effektiven Menge" verabreicht, d.h. welche ausreichend ist, um einen Nutzen für die Person zu zeigen. Die tatsächlich verabreichte Menge und die Rate und der zeitliche Verlauf der Verabreichung sind abhängig von der Art und Schwere des behandelten Zustandes. Die Verschreibung der Behandlung, z.B. Entscheidungen über die Dosierung usw., liegen im Ermessen von Allgemeinmedizinern und anderen Ärzten, und berücksichtigt im Allgemeinen die zu behandelnde Störung, den Zustand des einzelnen Patienten, die Verabreichungsstelle, das Verabreichungsverfahren sowie weitere dem Arzt bekannte Faktoren. Die Polypeptide der Erfindung sind besonders relevant für die Behandlung eines bestehenden Krebsleidens und die Prävention des Wiederauftretens von Krebs nach anfänglicher Behandlung oder Operation. Beispiele der zuvor erwähnten Verfahren und Protokolle finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Edition, Oslo, A. (Ed.), 1980.
Vorzugsweise stimulieren die Polypeptide der Erfindung Helfer- und zytotoxische T-Zellen, welche das Wachstum von Tumorzellen erheblich hemmen können, wenn sie einem Menschen in einer effektiven Menge verabreicht werden. Die optimale Dosis kann durch Ärzte basierend auf einer Reihe von Parametern bestimmt werden, einschließlich, zum Beispiel, des Alters, Geschlechtes, Gewichtes, der Schwere des behandelten Leidens, des verabreichten aktiven Inhaltsstoffes und des Verabreichungsweges. Zum Beispiel ist eine Dosis von 10–100 μg Polypeptid ausreichend, um sowohl Helfer- als auch zytotoxische T-Zellreaktionen zu stimulieren.
Die Polypeptide der Erfindung können zusammen mit zusätzlichen pharmazeutisch akzeptablen Inhaltsstoffen verabreicht werden. Zu solchen Inhaltsstoffen zählen zum Beispiel Immunsystemstimulatoren.
Eine Zusammensetzung kann allein verabreicht werden, oder in Kombination mit anderen Behandlungen, entweder simultan oder sequentiell, je nach dem behandelten Leiden. Andere Krebsbehandlungen beinhalten weitere monoklonale Antikörper, weitere chemotherapeutische Wirkstoffe, weitere Radiotherapieverfahren oder weitere in der Technik bekannte Immuntherapien. Eine besondere Anwendung der Zusammensetzungen der Erfindung ist die als Beigabe bei einem chirurgischen Eingriff, d.h. zur Unterstützung der Reduzierung des Risikos, das der Krebs nach der Entfernung des Tumors wieder auftritt.
Injektionen (im) können den primären Weg für die therapeutische Verabreichung der Polypeptide dieser Erfindung darstellen. Flüssige Formulierungen können nach Rekonstitution aus Pulverformulierungen verwendet werden.
Die Polypeptide können in einer örtlich begrenzten Art und Weise an eine Tumorstelle oder an eine andere gewünschte Stelle verabreicht werden, oder sie können auf eine Art und Weise verabreicht werden, in welcher sie den Tumor oder andere Zellen angreifen.
Die Polypeptiddosis ist abhängig von den Eigenschaften des eingesetzten Wirkstoffes, z.B. seiner Bindungsaktivität und der in vivo-Plasma-Halbwertszeit, der Konzentration der Polypeptide in der Formulierung, dem Verabreichungsweg, der Dosierungsstelle und – rate, der klinischen Toleranz des betroffenen Patienten, dem pathologischen Zustand, an dem der Patient leidet, und ähnlichem, was innerhalb der Fähigkeit des Arztes liegt. Zum Beispiel werden Dosen von 100 μg Polypeptid pro Patient pro Verabreichung bevorzugt, obwohl Dosierungen von etwa 10 μg bis 1 mg pro Dosis ausreichen können. Unterschiedliche Dosierungen werden während einer Reihe sequentieller Inokulationen verwendet; der Arzt kann eine anfängliche Inokulation verabreichen und in Folge mit relativ kleineren Antikörperdosen verstärken.
Die Polypeptidzusammensetzungen der Erfindung können in einer Vielzahl von Möglichkeiten und an unterschiedliche Klassen von Empfängern verabreicht werden. Zu Beispielen von Krebsarten, welche mit dem Antikörper behandelt werden können, zählen Kolorektalkrebs, Lungen-, Brust-, Magen- und Eierstockkrebs.
Diese Erfindung betrifft außerdem die Optimierung von Immunisierungsplänen zur Verbesserung einer schützenden Immunreaktion gegen Krebs. Im Hinblick darauf bietet die Erfindung Nukleinsäure, welche ein Polypeptid kodiert, welches Folgendes aufweist: (i) einen ersten Abschnitt, welcher den Teil der menschlichen Fc aufweist, welcher sich an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt, welcher ein oder mehrere heterologe T-Zellepitope aufweist, welche Nukleinsäure in Kombination mit einem isolierten oder rekombinanten Polypeptid verabreicht wird, welches Folgendes aufweist: i) einen ersten Abschnitt, welcher den Teil der menschlichen Fc aufweist, welcher sich an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt, welcher ein oder mehrere T-Zellepitope aufweist. Die Verabreichung der Nukleinsäure und des isolierten oder rekombinanten Polypeptides kann entweder simultan oder sequentiell erfolgen, abhängig von dem zu behandelnden Leiden. Die Nukleinsäure kann als ein DNA-Impfstoff wie hierin beschrieben formuliert werden.
Bevorzugte Merkmale jeden Aspektes der Erfindung sind wie für jeden der anderen Aspekte mutatis mutandis. Die hierin angegebenen Dokumente des Standes der Technik sind im vollsten durch das Gesetz zulässigen Umfang hierin eingeschlossen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen weiter beschrieben. Es wird auf die folgenden Zeichnungen Bezug genommen:
1 – Menschlicher monoklonaler Antikörper, welcher die T-Helferzellen-Proliferation in Spendern stimuliert, welche den HLA-DR, 1, 3, 7, 11 und 15 Haplotyp exprimieren.
2 – Menschlicher monoklonaler Antikörper, welcher die T-Helferzellen-Proliferationsreaktionen (
) stimuliert. Die Ergebnisse zeigen, dass das Entfernen der Fc zur Bildung eines Fab-Fragmentes die Sensibilität von T-Zellen zu Proliferieren (
) signifikant verringerte. Keine Reaktion zeigte sich bei hIgG, welches kein T-Zellepitop exprimiert (☐).
3 – Ein menschlicher monoklonaler IgG1-Antikörper stimuliert die T-Helferzellen-Proliferationsreaktionen, welche durch einen Überschuss an hIgG gehemmt werden, welches um die Fc-Bindung konkurriert.
4 – Chimärer hIgG1 708-Antikörper, jedoch nicht Maus- (⧫) oder menschliches IgG (
) oder Medium allein, stimulierte die Proliferation von Lymphozyten von naiven Spendern.
5 – Chimärer menschlicher Igel 708 (
) Antikörper, jedoch nicht Maus 708 (⧫) oder hIgG (
), induzierte umgerichtetes Abtöten durch menschliche CD8-T-Zellen einer Mauszelllinie P815 überzogen mit OKT-Antikörper. Die Zytotoxizität wurde durch Chromfreisetzung mit unterschiedlichen Effektor-Target-Verhältnissen bewertet.
6 – Mäuse immunisiert mit einem 105AD7 DNA-Impfstoff induzierten CTL-Reaktionen, welche Targetzellen gepulst mit CDRH3-Peptid erkennen.
7 – HLA-abgestimmter IgG1 708 kann zytotoxische T-Zellen stimulieren, welche Tumorzellen erkennen, welche CEA-Antigen exprimieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass 708 ein T-Zellepitop vortäuscht, welches von CEA-Antigenen verarbeitet und präsentiert wurde, die durch Targetzellen exprimiert werden.
8 – Zytotoxische T-Zelluntersuchung infolge von DNA-Prime/Protein-Boost (leere Symbole beziehen sich auf Targetzellen gepulst mit irrelevantem Peptid; volle Symbole beziehen sich auf Mäuse gepulst mit H-2Kd-Peptid).
9a und 9b: a. Antikörper-Schwerkettenexpressionsvektor. b. Antikörper-Leichtkettenexpressionsvektor
10a und 10b: a. Auswirkung von C-Terminus-Aminosäure-insertionen. FLWGPRALV in SC100-CDRs. b. Auswirkung von C-Terminus-Aminosäureinsertionen. Prozentuale Veränderung gegenüber dem Naiven, FLWGPRALV in SC100 CDRs.
11. Auswirkungen von C-Terminus-Aminosäuresubstitutionen auf den NetChop-Y-Wert von Tyrosin (TPPAYPPNAPIL); T-Helferepitop in SC100-CDR-L1.
12. Molekularmodell der Fv-Region des Antikörpers SC100.
13. Röntgenaufnahme der Kristallstruktur des T-Helferepitops TPPAYRPPNAPIL.
14. Molekularmodell der Fv-Region des Antikörpers SC100 (Draufsicht).
15. Schematische Darstellung der Mutations-PCR.
16. Agarosegeldarstellung der CTL1 L3 Mutation-PCR.
17. Agarosegeldarstellung des asymmetrischen Mutations-PCR-Ergebnisses.
18. PCR-Analyse von CDR-L3-Sequenzmutationen
19. Ergebnis der Klon 74:1 DNA-Sequenzierung
20. Ergebnisse der CTL-Untersuchungen
21. Proliferation von T-Zellklons gegenüber Tie-2-Fc präsentiert durch dendritische Zellen.
BEISPIELE
MATERIAL UND VERFAHREN
Antigene
105AD7 ist ein menschlicher monoklonaler IgG1-Antikörper (Austin et al., (1989) Imunol. 67: 525–530) gereinigt aus Gewebskulturüberstand auf einer Protein-G-Säule. Fab wurde mit Hilfe von immobilisiertem Papain (Pierce, Chester, GB), Protein-A-Entfernung der Fc und Größenfraktionierung auf S400-Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt. Polyklonales menschliches IgG (Sigma, Poole, GB) wurde als ein Kontrollantikörper (Sigma, Poole, Dorset, GB) verwendet. Keyhole Limpet Hämocyanin (KLH, Sigma) wurde als Kontrollantigen zur Messung naiver Immunreaktionen verwendet. 708 ist ein monoklonaler Maus-IgG2b-Antikörper gereinigt aus Gewebskulturüberstand auf einer Protein-A-Säule (Durrant et al., (1992) Int. J. Cancer 50: 811–816).
Chimärer 708 wurde weitgehend nach dem Protokoll von (Orlandi et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 86: 3833–3837) hergestellt. PCR wurde verwendet, um die variablen Schwer- und Leichtkettenregionsequenzen von Hybridom 708 mit flankierenden Sequenzen der Vektoren M13-VHPCR1 bzw. M13-VKPCR1 zu verknüpfen. Die entstehende Kassette der variablen Schwerkettenregion wurde in den Säugetierexpressionsvektor pSVgpt subkloniert, welcher die menschliche konstante Schwerkettenregion enthält. Ähnlich wurde die Kassette der variablen 708-Leichtkettenregion in den Expressionsvektor pSVhyg subkloniert, welcher eine menschliche konstante Kappakettenregion enthält. Die Vektoren wurden mit Pvu1 linearisiert und durch Elektroporation in die nichtsekretierende Mausmyelomlinie NSO co-transfiziert. In Schalen mit 96 Vertiefungen wachsende Transfektome wurden durch Wachstum in Medium ausgewählt, die Schalen enthielten Xanthin und Mycophenolsäure, und die Überstände wurden nach 14 Tagen auf die Produktion von menschlichen Immunglobulin gescreened. Das Screening erfolgte durch ELISA, entwickelt mit einem antihumanen Kappaketten-spezifischen Wirkstoff (The Bindung Site, Birmingham, GB). Die am besten produzierende Linie wurde für die Antikörperproduktion expandiert und chimärer Antikörper wurde mit Hilfe eines Protein-A-Agarosepräparates hergestellt, unter Bedingungen empfohlen vom Lieferanten (Bioprocessing Ltd., Consett, GB).
In-vitro-Stimulation von Blut nichtimmunisierter Spender
Es wurden Venenblutproben von normalen gesunden Spendern in Konservierungsmittelfreien Heparin verwendet. Sämtliches Blut war mittels molekularer Proben HLA-typisiert worden. Blutproben wurden auf Lymphoprep (Flow Laboratories, Irvine, Schottland) separiert und mononukleäre, periphere Blutzellen (PBMC) wurden auf der Plasma/Lymphoprep-Grenzfläche isoliert. Eine Probe von PBMC wurde entfernt, bestrahlt und als Antigenpräsentierende Zellen verwendet. Aus den übrigen PBMC wurden durch Magnetperlendepletion (Dynal, Oslo, Norwegen) CD45R0-Zellen depletiert. Die CD45RA-Zellen wurden mit 2 × 106/ml in Serum-freiem AIMV (Life Technologies, Paisley, Schottland) ergänzt mit 4 mM Glutamin verwendet. Sie wurden mit 105AD7 (0,003–30 g/ml), 105AD7 Fab (0,01–30 g/ml), menschlichem IgG-Kontrollantikörper (10 g/ml), Maus 708 (10 g/ml) oder chimärem 708 (10 g/ml) stimuliert. Um die Hemmung der T-Zell-Proliferation durch Chlorochin oder NH₄Cl zu bewerten, wurden Antigen-präsentierende Zellen für zwei Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit des Inhibitors mit 105AD7 gepulst. Antigen-präsentierende Zellen wurden dann vor der Zugabe nativer T-Zellen gewaschen. Alle Kulturen wurden in einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO₂ und 95% Luft bei 37°C inkubiert. Nach 5 Tagen wurde IL-2 (10 U/ml; Eurectus, GB) hinzugegeben. Die Proliferation naiver Lymphozyten wurde nach 7–10 Tagen quantifiziert. Die Proliferation wurde mit Hilfe der ³[H]-Thymidin-Inkorporation vierfacher Proben abgeschätzt. Dies erfolgte durch das Resuspendieren der Sammelkulturen, das Entfernen von 4 × 1001 Aliquots von Zellen und ausplattieren in Platten mit 96 Vertiefungen vor dem Pulsieren über Nacht mit ³[H]-Thymidin.
Zytokinsekretion
γIFN und IL-4 wurden mittels eines Sandwich-ELISA unter Verwendung von Duo-Set-Antikörpern (Genzyme, Cambridge, MA) entdeckt.
Immunfluoreszenz
Mononukleäre periphere Blutzellen (2 × 10⁵) wurden mit einer Reihe monoklonaler Antikörper inkubiert, welche mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) oder Phykoerythrin (PE) zur dualen Farbanalyse von Lymphozyten-Teilmengen direkt markiert waren. Getestete Antikörper waren 2H4 FITC (CD45RA) in Kombination mit entweder CD4-PE oder CD8-PE zum Auszählen der Gedächtniszellen bzw. aktivierter T-Helfer und zytotoxischer Zellen. Antikörper erhielt man von Becton Dickinson (Cowley, Oxford, GB). Nach 30 Minuten Inkubation bei 4°C wurde PBMC zweimal durch Zentrifugierung gewaschen und mit Hilfe eines FACScan-Flusszytometers (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) analysiert.
Umgerichtete Zytotoxizität
CD45R0-depletierte Lymphozyten von normalen Spendern wurden für 9–10 Tage, wie zuvor beschrieben, stimuliert und dann durch eine umgerichtete Zytotoxizitätsuntersuchung auf lytische Aktivität untersucht. P815-Zellen wurden mit Chrom markiert (10⁶ Zellen für eine Stunde bei 37°C markiert mit 100 μCi⁵¹[Cr]-Chrom) und extensiv gewaschen. Markierte Zellen wurden dann mit OKT3-Antikörper (20 μg/ml, 30 Min., 5 × 10³/Well bei 4°C) überzogen. Responder-Zellen wurden mit 10⁴ Chrom-markierten Targetzellen gemischt, um Verhältnisse von 100:1–12,5:1 zu erzeugen. Die Chromfreisetzung wurde nach 4 Stunden in 50 μl Überstand gemessen. Der Prozentsatz des freigesetzten Chroms und die Zytotoxizität wurden wie Folgt berechnet: cpm-Test – spontane cpm-Freisetzung × 100 = % Zytotoxizität maximale cpm-Freisetzung – spontane cpm-Freisetzung
Konkurrenzuntersuchung
CEA (aufbereitet durch Affinitätschromatographie aus Lebermetastasen von Kolorektalkrebs) wurde durch Übernacht-Inkubation bei 4°C auf Mikrotiterplatten (5 μg/ml) geschichtet. Die Platten wurden mit 1% BSA blockiert. Maus- oder chimärisierter 708 wurde mit biotinyliertem NCRC23 (Ab1) für 1 Stunde bei 4°C vorinkubiert, bevor er den CEA-beschichteten Platten zugegebene wurde. Die Bindung von biotinyliertem NCRC23 wurde mit Streptavidin-Meenettichperoxidase (SA-HRP; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) ermittelt. Die ELISA wurde mit ABTS-Substrat (Sigma)-Lösung (0,50 μg/ml, 2,2'-Azino-bis-3-Ethyl-Benzthiazolin-6-Sulfonat) in 15 ml 0,1 M Citratphosphatpuffer, pH 4,0, mit 30 v/v Wasserstoffperoxid mit 0,3 μl/ml unmittelbar vor der Verwendung hinzugegeben entwickelt. Die Absorbtion wurde bei 405 nm abgelesen.
Statistik
Die immunologischen Untersuchungsdaten wurden durch Einwegvarianzanalyse unter Verwendung der modifizierten geringstsignifikanten Differenzmethode nach Bonferroni analysiert, um multiple Vergleiche zuzulassen (SPSS/PC Chicago, IL).
ERGEBNISSE
BEISPIEL 1
Um zu bestimmen, ob ein menschlicher monoklonaler Antikörper T-Zellepitope von seiner CHDRH3-Region präsentieren kann, wurden periphere Blutlymphozyten von normalen Spendern für CD45RA, unbehandelte Lymphozyten angereichert, und sie wurden dann mit 105AD7 oder menschlichem Kontroll-IgG stimuliert. 1 zeigt Proliferationsreaktionen von Lymphozyten von 6 naiven Spendern auf in vitro-Stimulation durch 105AD7 (10 μg/ml; '), menschliches IgG (10 μg/ml; ⧫), KLH (10 μg/ml;
oder nur Medium
). Die Proliferation wurde an Tag 7, 8, 9 und 10 der in vitro-Kultur bewertet und durch einen Übernacht-Impuls mit ³[H)-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse wurden durch Einwegvarianzanalyse auf statistische Signifikanz geprüft, mit der modifizierten geringstsignifikanten Differenzmethode nach Bonferroni, um multiple Vergleiche zuzulassen. Spender, welche den HLA/DR1,3,7,11- und 15-Phänotyp exprimieren, zeigten eine signifikante Reaktion auf 105AD7, jedoch nicht auf menschliches IgG. Der einzige konsistente Nicht-Responder wies einen HLA/DR4,8-Phänotyp auf, was darauf schließen lässt, dass es sich bei ihnen um nichttolerante Haplotypen handelt. Die Proliferation mit 105AD7 erreichte ihre Spitze bei 8–10 Tagen bei allen Spendern, welche primäre kinetische Reaktionen zeigten.
BEISPIEL 2
Die Immunphänotypen der Zellen, welche auf 105AD7 reagieren, wurden durch Immunfluoreszenz- und Fluss-Zytometrie gemessen (Tabelle 1). Zu Beginn der Kulturen gab es doppelt so viele CD4- wie CD8-T-Zellen und mehr als 80% der Kulturen exprimierten das CD45RA-Antigen. Nach 10 Tagen wiesen Kulturen stimuliert mit 105AD7 4,4 Mal mehr CD4-Zellen als CD8-Zellen auf, was darauf schließen lässt, dass vorrangig die CD4-Zellen proliferierten. Jedoch war diese Auswirkung nicht so dramatisch wie sie sich bei Zellen kultiviert mit KLH zeigte, bei denen nach 10 Tagen 7 Mal mehr CD4- als CD8-Zellen vorhanden waren. Interessanterweise gab es hier auch eine Verschiebung von einer Prädominanz von CD45RA-Zellen zu CD45R0-Zellen als Reaktion auf die 105AD7-Stimulation, obwohl die Reaktion wieder eher in den KLH-Kulturen festzustellen war. Obwohl es eine leichte Proliferation auf menschliches IgG gab, war diese nicht signifikant. Überstände aus den Kulturen wurden analysiert, um zu bestimmen, ob die Zellen γIFN (Tabelle 1) oder IL-4 produzieren. Überstand von sowohl mit 105AD7 als auch KLH, jedoch nicht mit dem menschlichen IgG stimulierten Kulturen, enthielt γIFN. IL-4 wurde in keiner der Kulturen erkannt. Obwohl der vorherrschende Zelltyp, welcher als Reaktion auf 105AD7 proliferierte CD4-Zellen waren, gab es immer noch eine signifikante Anzahl an CD8-Zellen innerhalb dieser Kulturen. Um zu bestimmen, ob diese Kulturen zur Zell-Lyse in der Lage sind, wurden sie in einer umgerichteten Zytotoxizitätsuntersuchung untersucht. Signifikante Abtötung wurde bei allen Effektor-zu-Target-Verhältnissen beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde weder in der mit menschlichem IgG noch mit KLH stimulierten Kulturen Abtötung beobachtet. Letzteres war von besonderem Interesse, da KLH sowohl die Proliferation als auch die γIFN-Sekretion induziert hatte. Jedoch verblieben an Tag 10 nur sehr wenige CD8-Zellen in den KLH-Kulturen, was darauf schließen lässt, dass vorrangig die CD4-Zellen die Reaktion auf dieses Antigen mediierten.
TABELLE 1 – T-Zell-Untermengen und γIFN-Produktion durch Lymphozyten von naiven Spendern, in vitro mit 105AD7 behandelt
Lymphozyten von naiven Spendern wurde frisch (prä) analysiert oder wurden in vitro stimuliert (post) mit entweder 105AD7 (10 μg/ml), menschlichem IgG (10 μg/ml) oder KLH (30 μg(ml). Die Kulturen wurden auf Folgendes untersucht:

1. Den Prozentsatz der Lymphozyten, welche CD4, CD8, CD45RO und CD45RA exprimieren. Antigene wurden durch Zweifarben-Immunfluoreszenz gemessen und durch Fluss-Zytometrie analysiert.
2. Die γIFN-Produktion wurde in den Kulturüberständen an Tag 10 durch Sandwich-ELISA (Bereich 62,5–1000 pg/ml) gemessen.
3. Die umgerichtete Zytotoxizität wurde durch die Fähigkeit gemessen, ⁵¹[Cr]-Chrom-markierte P815-Zellen überzogen mit OKT3-Antikörpern bei unterschiedlichen Effektor:Target-Zell-Verhältnissen abzutöten. Signifikante Abtötung war in den 105AD7-Kulturen mit Zell-Effektor:Target-Verhältnissen zu verzeichnen.

BEISPIEL 3
Nach Erstellung einer reproduzierbaren in vitro Proliferationsuntersuchung bei naiven Spendern wurde dieses Kultursystem verwendet, um zu untersuchen, ob die Fc-Region von 105AD7 bei der Anregung einer T-Zell-Proliferation von Bedeutung ist. Die Fc-Region von 105AD7 wurde entfernt, um ein Fab-Fragment zu bilden. Proliferationsreaktionen von Lymphozyten naiver Spender auf in vitro-Stimulation mit dem 105AD7-Fab-Fragment (0,01–30 μg/ml;
), auf 105AD7 (0,003–30 μg/ml; ') oder menschliches IgG (0,01–10 μg/ml; ⧫). Die Proliferation wurde an Tag 9 der in vitro-Kultur bewertet und durch einen Übernacht-Impuls mit ³[H]-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse wurden durch Einwegvarianzanalyse auf statistische Signifikanz analysiert, mit Hilfe der modifzierten geringstsignifikanten Differenzmethode nach Bonferroni, um multiple Vergleiche zuzulassen. Obwohl sowohl 105AD7 als auch Fab signifikante Proliferation stimulierten, zeigt 2, dass Fab 1.000-Fach weniger effizient bei der Stimulation der T-Zell-Proliferation war als der gesamte Antikörper.
BEISPIEL 4
Ein weiterer Beweis für die Fc-Beteiligung bei der Stimulation von T-Zell-Reaktionen durch 105AD7 wurde durch die Konkurrenzstudien zwischen 105AD7 und menschlichem IgG (3) bereitgestellt. Proliferationsreaktionen von Lymphozyten naiver Spender an Tag 9 der in vitro-Stimulation mit 105AD7 (10 μg/ml; ') in Gegenwart von 0–1000 μg/ml von menschlichem IgG oder Stimulation nur mit menschlichem IgG (⧫) bei 0–1000 μg/ml. Die Proliferation wurde in vierfachen Kulturen bewertet und durch einen Übernacht-Impuls mit ³[H]-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse wurden durch Einwegvarianzanalyse auf statistische Signifikanz analysiert, mit Hilfe der modifizierten geringstsignifikanten Differenzmethode nach Bonferroni, um multiple Vergleiche zuzulassen. Die Proliferation mit 105AD7 wurde durch Zugabe von 300–1.000 μg/ml menschlichem IgG erheblich gehemmt. Ein drei- und zehnfacher Überschuss an menschlichem IgG hemmte die T-Zell-Proliferation erheblich, und zwar um 15% bzw. um 66%. Egal mit welcher Konzentration, es wurde keine signifikante Proliferationsreaktion auf menschliches IgG beobachtet.
BEISPIEL 5
Um zu untersuchen, ob 105AD7 einmalig war, oder ob die Präsentation von T-Zellepitopen aus anderen Antikörpern durch verbesserte Fc-Aufnahme gesteigert werden könnte, wurde ein zweiter Antikörper untersucht. 708 ist eine monoklonaler Maus-IgG2b-Antikörper, welcher CEA nachahmt und T-Zell-Reaktionen in vitro in Lymphozyten von Kolorektalkrebs-Patienten stimulieren kann. Jedoch konnte 708 keine unbehandelten menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern stimulieren. Seine Maus-Fc-Region wurde daher mit menschlicher Fc ersetzt, um zu sehen, ob dies seine Fähigkeit verbessert, T-Zell-Reaktionen zu stimulieren. Der chimärisierte Antikörper wurde hergestellt und zeigte eine ähnliche Bindung zum Maus-Anti-Idiotyp, da sowohl Maus- als auch chimärisierter 708 Antikörper die Bindung von Ab1 an CEA hemmten. Die Stimulation primärer T-Zellen von gesunden Spendern durch sowohl Maus- als auch chimären 708 Antikörper wurde untersucht. Die Proliferationsreaktionen von Lymphozyten naiver Spender auf die in vitro-Stimulation mit chimärem 708 (10 μg/ml; '), Maus-708 (10 μg/ml; ⧫) oder menschlichem IgG (10 μg/ml;
oder nur Medium
). Die Proliferation wurde an Tag 7, 8, 9 und 10 der in vitro-Kultur bewertet und durch einen Übernacht-Impuls mit ³[H]-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse wurden durch Einwegvarianzanalyse auf statistische Signifikanz analysiert, mit Hilfe der modifizierten geringstsignifikanten Differenzmethode nach Bonferroni, um multiple Vergleiche zuzulassen. 4 zeigt, dass im Vergleich zu nur Medium nur chimärer 708 und nicht Maus-708 eine signifikante Proliferationsreaktion induzierte, was die Bedeutung einer konstanten menschlichen IgG1-Region zeigt.
BEISPIEL 6
Die Stimulation primärer T-Zellen von gesunden Spendern durch sowohl Maus- als auch chimären 708 Antikörper wurde auf Zytokinproduktion untersucht. Überstände aus diesen. Kulturen zeigten, dass der chimärisierte Antikörper, jedoch nicht der Maus-Anti-Idiotyp die γIFN-Sekretion (Tabelle 2) induzierte.
TABELLE 2 – Sekretion von γIFN in Kulturen von Lymphozyten von nichtimmunisierten Spendern stimuliert mit Maus- oder chimären 708 Antikörpern.
Lymphozyten naiver Spender wurden in vitro entweder mit chimärem 708 (10 μg/ml), Maus-708 (10 μg/ml), menschlichem IgG (10 μg/ml) oder ohne Antigen (Medium) stimuliert. Die γIFN-Produktion in Kulturüberständen wurde durch Sandwich-ELISA (Bereich 62,5–1500 pg/ml), 10 Tage nach primärer Stimulation für 10 Tage oder 5 Tage nach Restimulation gemessen.
BEISPIEL 7
Es war von Interesse zu bestimmen, ob der chimärisierte 708 Antikörper auch unbehandelte CD8-Zellen stimulieren kann, damit diese zu lytisch aktiven Effektor-T-Zellen werden. 5 zeigt umgerichtete Zytotoxizität nach a) 9 Tagen primärer in vitro-Kultur oder b) 5 Tage nach Restimulation mit entweder Maus-708(⧫), chimärem 708(') oder menschlichem IgG (
). Die Zytotoxizität wurde durch das Abtöten von ⁵¹[Cr]-Chrom-markierten P815-Zellen überzogen mit OKT3-Antikörper bei unterschiedlichen Effektor:Target-Zell-Verhältnissen bewertet. Chimärisierter 708, jedoch nicht Maus-708 oder menschliches IgG, konnte T-Zellen stimulieren, um signifikante Zelllyse zu induzieren. Diese Kulturen konnten durch weitere in vitro-Stimulation geboosted werden, um ein höheres Level an Zytotoxizität zu erzeugen (7b).
BEISPIEL 8
Zum Beleg dessen, dass die zytotoxischen T-Zellepitope innerhalb des menschlichen monoklonalen Antikörpers 105AD7 von der CDRH3-Region dieses menschlichen IgG1-Antikörpers präsentiert werden. 105AD7 wurde als ein scFv-DNA-Impfstoff rekonfiguriert, indem der Antikörper geklont und dann die hypervariablen Regionen der Schwer- und Leichtkette entweder mit einem 15-(scFv-15) oder einem 5-Aminosäuren (scFv-5)-Linker verbunden wurden. Alternativ wurde die CHRH3-Region von 105AD7 geklont und auf seine Leadersequenz gespleißt, um ein Minigen zu erzeugen. Diese 105AD7-DNA-Konstrukte wurden verwendet, um Balb/c-Mäuse durch intramuskuläre Injektion von 100 μg DNA gemischt mit einem CpG-Oligonukleotid zu immunisieren. 6 zeigt CTL-Reaktionen nach der Vakzination mit A) scFv-15, B) scFv-5, C) dem Minigen und D) dem Kontrollvektor pCR3.1. Die Mäuse wurden in Woche 0, 2 und 7 geimpft, und in Woche 8 wurde die Milz entnommen. Die Splenozyten wurden in vitro für 6 Tage mit 105AD7 kultiviert. P815-Targetzellen wurden mit ⁵¹Cr +/– dem CDRH3-Peptid markiert. Die spezifische Zelllyse wurde dann unter Verwendung von Effektor:Target-Verhältnissen von 100:1 bis 12,5:1 gemessen. Mit 105AD7-DNA-Impfstoff immunisierte Mäuse stimulierten zytotoxische T-Zellreaktionen gegen Targetzellen gepulst mit dem CDRH3-Peptid.
BEISPIEL 9
Zum Beleg dessen, dass der entimmunisierte 708 Antikörper ein zytotoxisches T-Zellepitop aus einem Tumor-assoziierten Antigen präsentiert. 7 zeigt die Zytotoxizität nach 28 Tagen primärer in vitro-Kultur menschlicher Lymphozyten mit entimmunisiertem 708 (') mit Re-Stimulation an Tag 7, 14 und 21. Die Zytotoxizität wurde durch das Abtöten von ⁵¹[Cr]-Chrom-markierten menschlichen Tumorzellen, welche CEA exprimieren, bei unterschiedlichen Effektor:Target-Zell-Verhältnissen bewertet. Entimmunisierter 708 konnte T-Zellen stimulieren, signifikante Zelllyse von HLA-angepassten Targetzellen, welche CEA exprimieren zu induzieren.
BEISPIEL 10
Optimierung des in vivo-Immunisierungsprotokolls. 105AD7 wurde als Beispiel einer menschlichen Fc-Region verknüpft mit einem Maus-H-2Kb-CTL-Epitop verwendet. 105AD7 wurde als ein scFv-DNA-Impfstoff rekonfiguriert, indem der Antikörper geklont und dann die hypervariablen Regionen der Schwer- und Leichtkette mit einem 5-Aminosäuren-Linker verbunden wurden. Diese DNA wurde auf Goldpartikel beschichtet und sie wurde mittels einer Helium-betriebenen GeneGun (Biorad Laboratories Limited, Hemel Hempstead, GB) intradermal an Balb/c-Mäuse verabreicht. Vier Gruppen von Tieren wurden entweder mit ^l1) drei Injektionen der DNA mit CpG-Adjuvans, 2) einer Immunisierung mit DNA und zweien mit 105AD7-Protein mit CpG-Adjuvans, 3) drei Immunisierungen mit 105AD7-Protein mit CpG-Adjuvans oder 4) drei Immunisierungen mit 105AD7-Protein und Freund's Adjuvans wie beschrienen oder durch intramuskuläre Injektion des 105AD7-Proteins (siehe Tabelle 3) immunisiert. Splenozyten wurden zwei Wochen später entnommen. Naive Mäuse wurden eingesetzt, um Feeder-Zellen für die in vitro-Peptidstimulation durch Standardverfahren basierend auf der Produktion von Lipopolysaccharid (LPS)-stimulierten Blasten zu erzeugen. An Tag drei wurden diese LPS-Blasten bestrahlt, und H-2Kd-Peptid (100 μg pro 2 × 10⁷ Zellen inkubiert in 1 ml) für 1 Stunde hinzugegeben. Diese Zellen wurden dann gewaschen und als Feeder-Zellen für Splenozyten aus immunisierten Mäusen verwendet. Nach 5 Tagen Inkubation wurden diese Zellen für das routinemäßige Experiment mit zytotoxischen T-Zellen weitergegeben. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um die Reaktion gegen ein irrelevantes Peptid und das H-2Kd-Peptid zu analysieren.
Tabelle 3 – Impfplan
Nur die Gruppe, welche eine DNA-Behandlung und zwei Protein-Booster-Immunisierungen erhielt, zeigte eine CTL-Reaktion (8). Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass eine Kombination aus DNA-Behandlung und Protein-Boosten optimale CTL-Reaktionen erzeugt.
BEISPIEL 11
Pfropfen eines CTL-Epitops aus dem MAGE-3-Protein in einen entimmunisierten Antikörper.
Der Antikörper, welcher zur Bereitstellung der CTL-Determinanten ausgewählt wurde, ist der entimmunisierte SC100-Antikörper (WO 01/88138). Die Verwendung eines entimmunisierten Antikörpers ist von Vorteil durch seine Einsetzbarkeit als ein Epitopbereitstellungssystem, da das Entimmunisierungsprotokoll jegliche zuvor vorhandenen T-Zellepitope entfernt. Dies stellt sicher dass ein immunologisch inerter Träger, welcher die Immunreaktionen gegen den Immunkörper selbst richtet, auf den Epitopen basiert, die in die CDRs aufgepfropft sind.
Das für die anfängliche Analyse ausgewählte Epitop ist ein CTL-Epitop basierend auf dem MAGE-3-Antigen, welches durch malignes Melanom überexprimiert wird.
In 9a basiert der Schwerkettenexpressionsvektor pSVgptHuIgG1 auf pSV₂gpt (Mulligan and Berg, (1980) Science 209: 1422–1427). Er beinhaltet das Ampicillinresistenzgen zur Auswahl in Bakterienzellen, das gpt-Gen zur Auswahl in Säugetierzellen, die murine Schwerketten-Immunglobulin-Enhancer-Region, eine Genomsequenz, welche das Gen der konstanten Region des menschlichen IgG1 kodiert und SV40-Poly-A-Sequenzen. Die variable Schwerkettenregion zur Expression wird als ein Hindl11-bis BamH1-Fragment eingefügt. Diese Expressionskassette beinhaltet den murinen Schwerkettenpromotor, die Signalpeptidkodiersequenz und das Signalsequenzintron, das V_H-Gen, die V-C-Spleiß-Spendersequenz und Intronsequenzen. Stellen in Klammern wurden entfernt.
In 9b basiert der Leichtkettenexpressionsvektor pSVhygHuCκ auf dem Vektor pSVhyg. Er beinhaltet das Ampicillinresistenzgen zur Selektion in Bakterienzellen, das hyg-Gen zur Selektion in Säugetierzellen, die murine Schwerketten-Immunglobulin-Enhancer-Region, eine Genomsequenz, welche das menschliche Gen der konstanten Kappa-Region kodiert, sowie den Kappa-Enhancer und SV40-Poly-A-Sequenzen. Die variable Leichtkettenregion zur Expression wird als ein Hindl 11- bis BamH1-Fragment eingefügt. Diese Expressionskassette beinhaltet den murinen Schwerkettenpromotor, die Signalpeptidkodiersequenz und das Signalsequenzintron, das V_K-Gen, die V-C-Spleiß-Spendersequenz und Intronsequenzen. Innerhalb von HuCκ gibt es 3 EcoR1-Stellen. Stellen in Klammern wurden entfernt. Den Vektor pSVhygHuCκ erhielt man von G Winter, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, GB. Das Gen der konstanten Region im Vektor wurde durch ein menschliches Gen der konstanten Region Kappa, geklont aus Plazenta-DNA, ersetzt. Um die Unversehrheit des Expressionsvektors nach der Mutation zu erhalten, wurde eine Strategie entwickelt, welche die Restriktionsstellen von HindIII und BamHI an jedem Ende der VH- und VL-Kodierregionen verwendet (siehe 9a und 9b), um native SC100-Sequenz herauszuschneiden und sie mit CDR-gepfropfter Immunkörpersequenz zu ersetzen.
Auf diese Art und Weise würde sich nur die gepfropfte Region von der Expressionssequenz unterscheiden, welche bereits nachweislich erfolgreich bei der Produktion von Antikörper-Molekülen war.
Da der Antikörper 6 CDRs enthält (3 in der schweren und 3 in der leichten Kette), kann es möglich sein, eine beliebige dieser Regionen mit dem MAGE-3-Epitop zu ersetzen. Jedoch kann es bestimmte strukturelle Einschränkungen dieser Generalisierung geben, bestimmt durch die Art des einzufügenden Epitops und die Akzeptor-CDR-Stelle, welche es aufnehmen soll. Ernsthafte Störungen der Antikörper-Sekundärstruktur an der Spleißstelle können eine schädliche Wirkung auf die Proteinrückfaltung haben, und zwar in einem solchen Ausmaß, dass die Immunfunktion beeinträchtigt wird. Ein zweckmäßigerer Ansatz, der auf dem Bedürfnis basiert, sowohl die Struktur des Antikörpers selbst zu erhalten als auch, was wichtiger ist, ein Steuerelement bei der abschließenden Verarbeitung der Epitope zuzulassen, wäre bei der Herstellung eines Immunkörper-Moleküls von Vorteil. Im Hinblick darauf wurde eine Strategie entwickelt, die sowohl auf der Verwendung von Algorithmen basiert, welche die proteolytische Spaltung des Moleküls vorhersagen, als auch auf molekularer Modellierung des nativen und des gepfropften Antikörpers.
Proteolytische Spaltung
Web-basierte (übers Internet zugängliche) Algorithmen (siehe Tabelle 4) wurden verwendet, um die SC100-Sequenz auf Stellen vorhergesagter proteosomaler Spaltung zu untersuchen. Dies ist ein Versuch, eine potentielle Hierarchie von Akzeptor-CDR-Stellen zu identifizieren, welche eine günstige Verarbeitung des internalisierten Immunkörpers zulassen würden. Dies würde die Freisetzung gepfropfter Epitope zur Präsentation in einer kontrollierteren und definierteren Art und Weise ermöglichen. Tabelle 4: Internetseiten mit proteolytischen Spaltalgorithmen

* Die NetChop-Internetseite läuft mittlerweile mit NetChop Version 2.0.

Daher waren die vorgenommenen Analysen spezifisch für den herzustellenden Immunkörper, sowohl bezüglich des zu verwendeten Immunkörper-Antikörper-Rahmens als auch der Epitopsequenzen, welche auf diesen Rahmen aufzupfropfen sind. Anfängliche vorraussagende Experimente analysierten die Einfügung des MAGE3-CTL-Epitops (FLWGPRALV) und des T-Helfer-Epitops (TPPAYRPPNAPIL) in jede der SC100-CDRs. Bei jeder Analyse wurde die gesamte Antikörper-Primärsequenz untersucht, damit die Einflüsse der Flankenregionreste in Betracht gezogen werden konnten. Die Ergebnisse der PaProC- und NetChop-Analyse sind in Tabelle 5 zusammengefasst.
Tabelle 5a: NetChop Version 1.0 Anzahl der vorhergesagten Spaltstellen
Tabelle 5b: PaProC Anzahl der vorhergesagten Spaltstellen
Schlüssel:

√

steht für C-Terminus-Spaltung des Epitoppeptids

x

steht für keine C-Terminus-Spaltung

NetChop, eingestellt auf einen Standardschwellwert von 0,8 sagt keine interne Spaltung des CTL-Peptids vorher, wenn es in H1, H2, H3, L1 und L3 gespleißt wird (Tabelle 5b). Die Einfügung in L2 ergibt eine C-Terminus-Spaltstelle nach dem Aminosäurerest F. Es gibt eine interne Spaltstelle für alle T-Helfer-Einfügungen, an welcher der Y-Aminosäurerest an seinem N-Terminus aufgespaltet ist. Net Chop sagte außerdem vorher, dass es keine C-Terminus- Spaltstellen für das CTL-Epitop gibt, jedoch ist das T-Helferepitop in H2 und L1 an seinem C-Terminus aufgespaltet.
PaProC ist schwieriger empirisch zu analysieren, da multiple Spaltstellen für jedes Epitop erzeugt werden, besonders für T-Helfer-Zellen. Auf Grundlage der hier dargestellten Daten sollten zukünftige Sequenzmanipulationen daher mit der Analyse der CTL in H1, H3 und L3 und T-Helfer-Zellen in H3 und L3 beginnen.
Diese Studien zeigen, obwohl sie nur Vorhersagecharakter haben, dass mit Vorsicht vorgegangen werden muss, wenn die Kombination der zu transplantierenden Epitope und der verwendeten Akzeptorstellen konzipiert wird. Die Struktur der an die Sequenz der CDR und Flankenregion gekoppelten Epitope kann letzten Endes Auswirkungen auf die Verarbeitung und Präsentation der Epitope selbst haben. Hier hat insbesondere NetChop einen Hinweis auf die Wahrscheinlichkeit von Problemen, die mit der internen Spaltung der gepfropften Epitope auftreten, gegeben. Dies hätte offensichtlich eine verhängnisvolle schädliche Auswirkung auf die Präsentation dieser Epitope durch Antigen-präsentierende Zellen.
Derzeitige Verarbeitungsgrundsätze bestimmen, dass während der Verarbeitung der Epitope in der Proteosomumgebung C-Terminusspaltung an einer Stelle unmittelbar vor dem C-Terminus des zu präsentierenden Peptides auftritt, und dass an diesem Ende des Peptides keine weitere Verarbeitung stattfindet. Dies steht im deutlichen Kontrast zum Spaltmuster am N-Terminus, wo Spaltung an einer Stelle mit einiger Entfernung oberhalb des N-Terminus auftritt. Das Peptid wird dann durch die Aktivität von N-Terminus-Aminopeptidasen zugeschnitten bis das Epitop die erforderliche Länge für die MHC-assoziierte Peptidpräsentation erreicht. Es kann daher möglich sein, die Spaltung am C-Terminus des fraglichen Epitops zu steuern, indem neben ihm in der Pfropfung ein Rest bereitgestellt wird, welcher dazu neigt, sich zu spalten, wenn er in diese Umgebung eingebracht wird. Dies würde die Initiierung der Verarbeitung in einer präziseren Art und Weise zulassen und würde die Chancen, dass das korrekte Peptid zur Präsentation übergeben wird, enorm erhöhen. Auch hier sind die Flankenreste von Bedeutung für diesen Prozess und ihr Einfluss muss berücksichtigt werden. Unter Berücksichtigung dieser Punkte wurde eine Reihe von Experimentsequenzen mit dem NetChop (Version 1.0) – Algorithmus verarbeitet. Bei diesen Experimenten wurden sowohl die CTL- als auch die T-Helfer-Epitope in jede der CDR gepfropft, wie zuvor durchgeführt. Jedoch wurde an jeder Pfropfungsstelle nach der Addition eine NetChop-Analyse durchgeführt, in einzelnen Schritten nach jeder der 20 Amino- (oder Imido) Säuren. Die Ergebnisse der mit dem CTL-Epitop FLWGPRALV mit einer zusätzlichen Aminosäurenvariante am C-Terminus durchgeführten Analysen bei Einfügung in jede der 6 CDR, ist in 10a zusammengefasst. Die Ergebnisse sind als eine prozentuale Änderung induziert durch die Einfügung der zusätzlichen C-Terminus-Aminosäure vom Wert erhalten durch die Einfügung des Epitops allein (10b) angegeben. Die Ergebnisse sind für interne Spaltung korrigiert. Wo dies auftritt, wird das Epitop daher zerstört und wird nicht in einer wertvollen Art und Weise präsentiert werden können. Der Wert für diese Ereignisse wird als der des nativen Wertes angegeben, so dass die prozentuale Änderung als Null verzeichnet wird. Diese Ereignisse sind daher bei Untersuchung der graphischen Darstellung leicht identifizierbar. Das Hinzufügen von einigen der Aminosäuren am C-Terminus des Epitops kann zu einer Steigerung der Fähigkeit des Epitops führen, durch die C-Terminus-Spaltung erfolgreich verarbeitet zu werden. Dazu zählen C, G, K, R und S, und, nur in einem gewissen Umfang in CDR H1, auch A. NetChop hat außerdem einige Aminosäuren, wie F, I P, V W und Y identifiziert, deren Auswirkungen, wenn sie mit der SC100-Sequenz verbunden sind, die Verarbeitung des Epitops behindern. Es wird daher wichtig, die Sequenz an der Verbindungsstelle zu analysieren, so dass der erste Rest (welcher Teil des Antikörpergerüstes ist) unterhalb des gespleißten Epitops nicht aus einem dieser Reste besteht, welche wahrscheinlich zu einer inkorrekten Verarbeitung der Epitope führen. Dies kann ein weiteres Steuerelement über die resultierende Verarbeitung der Epitope durch Antigen-präsentierende Zellen bieten, welches einen Anschein von Vorhersagbarkeit für die Bildung des Epitopstimulans zulässt.
Außerdem wird durch die vorhersagenden Analysen mit Hilfe von Aminosäureinsertionen am C-Terminus die Fähigkeit bedingt, die Entfernung eines Spleißpunktes vorherzusagen, welcher sich intern innerhalb des gepfropften Epitops selbst befindet. Ein Beispiel dessen wäre zu versuchen, die vorhergesagte Spaltstelle bei Y (unterstrichen) in der T-Helfer-Sequenz TPPAYPPNAPIL (Spaltung angezeigt in jeder der CDR, wie in Tabelle 5a und 5b Epitopspalte 3 gezeigt) zu entfernen. Die Analyse hat gezeigt, dass die Entfernung interner Spaltstellen mit Hilfe des Einflusses von Aminosäuren möglich sein kann, welche am C-Terminus des Epitops platziert werden (11). Hier wurde die C-Terminus-Spaltung der Sequenz auf eine Position verändert, welche die Integrität des darzustellenden Epitops erhält, mit offensichtlichen vorteilhaften Auswirkungen für die Darstellung des Peptids. Einige Aminosäuren (wie A, C, G, K, Q R und S) verringern den internen Wert des Mittel-Epitop-Tyrosins und verschieben außerdem die Spaltung in Richtung des C-Terminus-Leucins, mit vorteiliger Auswirkung für die Darstellung dieses Epitops. Wieder scheint es von Bedeutung zu sein, solche Vorhersagedaten in Betracht zu ziehen, sowohl bei der Konzeption des Epitops als auch des Spleißpunktes für die Produktion eines entwicklungsfähigen Immunkörper-Konstruktes.
Molekulare Modellierung des SC100-Antikörpers und von Derivaten
Modellierung der Fv.
Antikörper sind aufgrund ihrer sehr hohen Sequenzähnlichkeit, selbst in der sogenannten variablen Region (Fv), leicht für die molekulare Modellierung einsetzbar. Es wurde außerdem eine hohe Anzahl an Antikörpern kristallisiert, deren Koordinaten bereits in der Datenbank mit öffentlichem Zugang, der Protein Data Bank (PDB), hinterlegt worden sind. Weitere Faktoren vereinfachen die Modellierung von Antikörpern, wie zum Beispiel die kanonische Klassifikation der Schleifenregionen in der Fv, welche vorrangig zur normalen Funktion der Bindung an ein Targetantigen sind.
Standardhomologie-Modellierungsverfahren wurden eingesetzt, um die Fv-Region zu modellieren. Dies begann mit einem Sequenz-Alignment des SC 100-Antikörpers mit einer Datenbank von Sequenzen, welche Kristallstrukturen in der PDB entsprechen. Die schwere Kette (ohne CDR3), die leichte Kette und die CDR3 der schweren Kette wurden individuell untersucht. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in Tabelle 6, 7 und 8 gezeigt.
Tabelle 6: Schwerketten-Alignment (ohne CDR3)
Tabelle 7: Leichtketten-Alignment
Tabelle 8: CDR3-Alignment
Das Alignment für das CDR-H3-Alignment wurde nach Untersuchung von Regeln definiert durch Morea et al., (1998) J. Mil. Biol. 275: 269–294) unberücksichtigt gelassen. Diese zeigen Sequenzspezifität an der YYCAX- und der XYWG-Position, welche die Gegenwart von Beta-Aufwölbungen in der Schleife bedingen können. Die Proteindatenbank wurde nochmals auf Schleifen passender Länge geprüft, welche die YYCAR- und DYWG-Sequenz enthielten. Die Sequenz zwischen diesen beiden Punkten wurde genau auf jede Ähnlichkeit mit der SC100-CDR-H3-Sequenz untersucht und Röntgen-Kristallstrukturen mit Schleifen der gleichen Länge wurden ausgewählt. Diese sind in Tabelle 9 gezeigt.
Tabelle 9: Ausgewählte CDR-H3-Sequenzen mit Röntgen-Kristalllängen ähnlich SC100
Mit diesen Sequenzen wurde dann ein Alignment durchgeführt, um die Sequenz herauszufinden, welche dem SC 100 am ähnlichsten ist. Dies erfolgte mit Hilfe des multiplen Sequenzalignments CLUSTAL W (1.81) (Tabelle 10). Von den identifizierten Sequenzen wurde 1SBS aus diesen Alignments als eine Schablone für die Modellierung der CDR3 ausgewählt.
Tabelle 10: CLUSTAL multiples Sequenz-Alignment
Molekulare Modellierungsmethoden
Die gesamte Modellierung erfolgte auf einer SGI Octane 2 R12000 Workstation unter Verwendung von Sybyl 6.7 (Tripis, GB).
Die leichte Kette von 2JEL wurde geladen und Reste wurden zu denen der erforderlichen Sequenz mutiert. Dann wurden Wasserstoffatome zugefügt. Die Reste, welche zu der Struktur hinzugefügt worden waren, wurden dann wie Folgt minimiert:

• Nur Wasserstoffatome (der Rest des Proteins wurde fest in Position gehalten) wurden minimiert, durch 100 Iterationen der Optimierungsmethode des steilsten Abstiegs, gefolgt von der Konjugat-Gradienten-Methode auf ein Konvergenzkriterium eines Energiederivates von 0,01 kcal/mol/Ångström2.
• Man beließ Seitenkettenatome frei beweglich (der Rest des Proteins wurde festgehalten), und sie wurden wie in Schritt 1 minimiert.
• Man beließ Seitenketten- und Hauptkettenatome frei beweglich (der Rest des Proteins wurde festgehalten), und die wurden wie in Schritt 1 minimiert.

Das Modell wurde mit bloßem Auge untersucht, um sicherzustellen, dass sich keine Fehler eingeschlichen haben. Für die schwere Kette wurde die Modellierung wie für den Leichtkettenabschnitt durchgeführt, jedoch war CDRH3 aus der Proteinkette entfernt worden. Die Minimierung erfolgte in gleicher Art und Weise wie für die leichte Kette.
Die CDR3-Schleife aus der schweren Kette von 1SBS wurde zu der von SC100 mutiert. Die Struktur wurde dann auf das vorhandene Schwerkettenmodell überlagert, mit Hilfe der Reste YYCAR und DYWG zur Positionierung der Schleife. Die Schleife wurde dann durch ihren N-Terminus auf den Rahmen in Position und durch ihren C-Terminus in Position gepfropft. Es erfolgte eine manuelle Rotation der Hauptketten-Dieder, um die Region des Rahmens 4 wieder zurück in ihre übliche Position zu bringen (eine Eigenart von Sybyl). Verbindungsregionen und neu eingefügte Reste wurden wie zuvor beschrieben minimiert.
VH-VL-Konstruktion
Um ein Modell der Fv bereitzustellen, mussten die konstruierten VH- und VL-Regionen als ein Paar zusammengebracht werden. Um dies zu erreichen, wurden die ursprünglichen Sequenz-Alignments auf Übereinstimmungen überprüft, deren Wert für die Schwerkette wie auch die Leichtkette in einem hohen Bereich lag. Dieser Ansatz sollte eine Fv ergeben, auf welche die einzelnen VH und VL mit Hilfe konservierter Reste im Rahmen überlagert werden können. Die fünf bestplatzierten Strukturen sind in Tabelle 11 gezeigt. 1ATM wurde für die Überlagerung der VH und VL ausgewählt. Nachdem dies geschehen war, wurden die Reste an der VH-VL-Schnittstelle auf schlechte Stöße überprüft und wie erforderlich minimiert. Die komplettierte Fv ist in 12 gezeigt. Das Modell der Fv wurde dann mit Hilfe von PROCHECK (Laskowski et al., (1993) J. Appl. Crystallog. 26: 283–291) überprüft, um sicherzustellen, dass Hauptketten- und Seitenkettenkonformationen eine gute Qualität aufweisen.
Tabelle 11: Rangliste von Schwer- und Leichtketten für die VH-VL-Überlagerung
Epitopeinschlussmodellierung
Das Hauptziel der Modellierung war die Überprüfung der Möglichkeit des Einschlusses immunologisch aktiver Epitope in die CDR des SC100-Trägerantikörpers. Daher wurde unmittelbar nach der Pfropfungsresultaten der proteolytischen Spaltungsexperimente Versuche unternommen, die Epitoppeptide FLWGPRALV (CTL) und TPPAYRPPNAPIL (T-Helfer) in geeignete SC100-CDR zu modellieren. Folgende Kombinationen wurden ausgewählt:

• CTL in L3
• TH in L1
• CTL in H2
• TH in L3

Um die Modellierung zu unterstützen, wurden beide Epitopsequenzen mit Sequenz- und Strukturdatenbanken verglichen. Das CTL1-Epitop ergab keine nah verwandten Sequenzen. Das TH-Epitop befindet sich im C-Terminus-Abschnitt des menschlichen Hepatitis B Viruskapsid (hbcag)-Proteins, welches kristallisiert wurde (PDB-Code: IQGT). Wie aus 13 ersichtlich ist, existiert dieser Abschnitt des Proteins in einer langgestreckten, nichtstrukturierten Form, teilweise aufgrund des hohen Gehaltes an Prolin in der Sequenz. Initiale Sequenzalignments wurden als eine Anleitung für die Einfügung dieser Peptide in das Antikörpermodel erzeugt. Diese sind in Tabelle 11 gezeigt. Ähnliche Reste sind grün markiert. Jedes Modell ist im Folgenden separat beschrieben.
CDR-L1 TH-Epitop-Insertion
Wie bereits zuvor erwähnt, besitzt das TH-Epitop einen hohen Gehalt an Prolin, was bedeuten kann, dass es möglicherweise sehr schwierig ist, die Sequenz in eine Haarnadelschleife zu zwingen, wie dies bei CDR häufig zu beobachten ist. Jedoch liegt die CDR1 in der leichten Kette in einer relativ ausgedehnten Konformation entlang der Oberfläche der Fv. Da außerdem der Großteil der Schleife nahe der Oberfläche beobachtet wird, sollte sie an weniger strukturellen Einschränkungen beteiligt sein wie einige Teile, welche tief innerhalb der Struktur liegen. Dies ist in 14 hervorgehoben. Die TH-Sequenz wurde in den Abschnitt der CDR1 eingeschlossen, welche in dem als Tabelle 12 dargestellten Alignment gezeigt ist. Reste, welche mutiert worden waren, wurden wie zuvor minimiert. Es gab wenige oder gar keine Probleme beim Einschluss dieses Epitops in die CDR1. Kleine Seitenkettenzusammenstöße wurden durch Minimierung gemildert.
Tabelle 12: Ursprüngliche Alignments für den Epitop/CDR-Einschluss
CDR-L3 CTL-Epitop-Insertion
Bei der Untersuchung der obigen Alignments dachte man, dass das CTL-Epitop eine Sequenz aufweisen könnte, welche der des Antikörpers zu ähnlich ist, was die Modellierung schwierig machen könnte. Um dieses Problem zu lösen, wurde eine Schleife aus einer Kristallstruktur eines Antikörpers verwendet, um die eingefügte Sequenz zu modellieren. Das Alignment ist nachfolgend gezeigt, wobei ähnliche Reste hervorgehoben sind:
Aus der Antikörperstruktur mit der LW-Sequenz nahe dem N-Terminus der Schleife wurde erkannt, dass die Seitenkettenorientierung des Tryptophans ungewöhnlich war, und hochkonserviert in Antikörpern mit dieser Sequenz. Da dies die größte Seitenkettengruppe ist, welche in die Epitopsequenz eingeschlossen werden soll, lag die Priorität bei der Modellierung in ihrer korrekten Positionierung. Die GP-Sequenz passte gut in die beobachtete Haarnadelstruktur, die in Schablone CDR-L3 zu sehen ist.
Die CDR-L3 wurde aus der Datei line.pdb entnommen und in die gewünschte Sequenz in Sybyl mutiert. Diese wurde dann auf den bestehenden Rahmen des Antikörpers zwischen Cystein und Valin gepfropft. Seitenketten der eingefügten Reste wurden minimiert und das Model wurde auf jegliche ungewöhnlichen zusammengestoßenen Seitenketten überprüft.
CDR-H2 CTL-Epitop-Insertion
Das Alignment dieses Epitops mit dem letztgenannten Teil der CDR-H2 ist vielversprechend, da 4 von 9 Resten Ähnlichkeit mit der Sequenz zeigen, welche bereits im Antikörper vorliegt. Außerdem liegt das Prolin zentral in jedem Abschnitt, und wenn es in der Struktur untersucht wurde, erscheint es in der unteren Schlaufe der CDR Dieser Fall war relativ einfach zu modellieren, wobei die Reste wie beschrieben in die gewünschte Sequenz mutiert und minimiert wurden.
CDR-H3 TH-Epitop-Insertion
Wie in der CDR-L1-Insertionsmodellierung erwähnt, existiert dieses Epitop wahrscheinlich in einer relativ ausgedehnten Konformation, hauptsächlich aufgrund des hohen Prolin-Gehaltes. Um eine Schleife zu bilden, welche in die raumbeschränkte CDR-H3-Position eingefügt werden könnte, müsste das Epitop eine enge Umkehrung innerhalb eines Teils der Struktur zeigen, und eine B-Blatt-ähnliche Konformation im Rest des Peptids. Nach Meinung des Autors ist dies für das TH-Epitop nicht möglich, und die Insertion dieses Peptids in diesen Bereich würde zu einem inkorrekt gefalteten Antikörper führen. Daher wurde dieses Epitop nicht modelliert.
Primer-Design und OLE-Technologie
Die Primer werden so ausgelegt, dass sie die ausgewählten CDR mit dem Epitop von Interesse ersetzen. Dies erfolgt durch eine Variation des Überlappungsextensions-(OLE) Verfahrens, wie es für viele DNA-Mutationen eingesetzt wird. Anders als bei gegen bestimmte Stellen gerichteter Mutagenese, welche hauptsächlich auf die Einbringung von Punktmutationen abzielt, erlaubt die OLE die Mutation einer Reihe von Nukleosiden mit einem Mal, so dass der Bedarf für Subklonierung auf einem Minimum gehalten wird. Ein Primer wird basierend auf den Sequenzen 5' und 3' der Länge der zu mutierenden DNA konzipiert und wird so hergestellt, dass er exakt komplementär zu diesen Regionen hergestellt wird. Die Bereitstellung ausreichender Komplementarität wird hier basierend auf der Anzahl der ausgewählten Reste und deren Aufschmelzstärke erreicht, und die Stelle zwischen dieser Region kann jede DNA-Sequenz sein. Die Komplementarität an beiden Enden erlaubt noch immer, dass dieser Primer während der PCR aufgeschmolzen wird. Wenn in Verbindung mit anderen Vorwärts- oder Rückwärtsprimern verwendet, hat dies den Effekt der Einfügung der Mutation in den neu synthetisierten DNA-Strang. Da dieser in der nächsten PCR-Runde einen Schablonenstrang darstellt, wird die Mutation durch das Polymeraseenzym getreu dupliziert, und daher über die gesamte nachfolgende PCR hinweg amplifiziert. Üblicherweise werden Primer hergestellt, um die gleiche Anzahl an Basen zu mutieren, welche in der Originalsequenz vorhanden waren. Jedoch kann dieses Verfahren auch verwendet werden, um zusätzliche Basen einzufügen sowie um die Anzahl der Basen in einer Sequenz zu verringern. Hier muss bei der Konzeption der Primer besonders sorgfältig vorgegangen werden, so dass die Bildung von Sekundärstrukturen wie Haarnadel-Schleifen vermieden und die DNA-Polymerase-Aktivität nicht behindert wird.
Diese Studie hob den Fakt hervor, dass, obwohl die Einfügung vieler unterschiedlicher Primärstrukturen in diese CDRH3 akzeptiert wird, es Fälle geben kann, bei denen gepfropfte Sequenzen dazu führen, dass die Integrität der Antikörperstruktur zerstört wird. Modellierungsstudien wie die vorliegende zeigen, dass sorgfältig vorgegangen werden muss, wenn eine Epitoppfropfung vorgenommen wird. Die Schleifenmodellierung kann dabei helfen, die Sequenzen zu identifizieren, welche die Antikörperfaltung stören, was zu einer Störung in der Herstellung eines Antikörperbereitstellungsvehikels und dem Nutzen des Impfstoffes führen würde.
Von den vier für die Modellierungsstudien ausgewählten Epitop/CDR-Kombinationen, ist es interessant festzustellen, dass das T-Helfer-Epitop aufgrund struktureller Einschränkungen nicht in die CDR-H3 modelliert werden konnte. Viele Helfer-Determinanten sind viel größer als ihre CTL-Gegenstücke, so dass dies für viele Helfer-Determinanten tatsächlich der Fall sein kann. Obwohl Daten für dieses Phänomen nur für den SC100-Antikörper erzeugt wurden, ist es auch interessant festzustellen, dass die CDR-L1 möglicherweise eine geeignetere Akzeptorstelle für Helfer-Determinanten ist. TPPAYRPNNAPIL ließ sich aufgrund seiner entspannteren Struktur in CDR-L1 modellieren, was auch für andere Helfer-Determinanten der Fall sein könnte. Basierend auf den Ergebnissen der proteolytischen Spaltung und Modellierungsstudien, wurden die folgenden Initialkonstruktvarianten ausgewählt:

• CTL in CDR-L3
• TH in CDR-L1

Basierend auf den Modellierungsstudiendaten, welche CDR-H2 mit dem Potential hervorgehoben hatten, dass CTL-Epitop aufgrund von Ähnlichkeiten in der Sequenz leicht aufzunehmen, wurde diese Pfropfung initiiert.

• CTL in CDR-H2

Mutations-PCR
Nach der Auswahl der Epitoppfropfung sollte eine Kombination aus Sequenzdatenanalyse und de novo Primer-Design den Einschluss solcher Pfropfungen in die ausgewählten CDRs unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zulassen. Für die anfängliche Prototypen-Immunkörper-Konstruktion wurden Primer konzipiert, um die Pfropfung der zuvor beschriebenen Epitop/CDR-Kombination zu vereinfachen, und diese Primer sind in Tabelle 13a dargestellt.
Tabelle 13a: CDR-mutierende Primer
Tabelle 13b: SC100-spezifische Oligonukleotidprimer
Diese Primer werden dann in geeigneten Kombinationen mit den in Tabelle 13b detaillierten Primern verwendet, um ein Drei-Primer-System zu erreichen, welches in der Lage ist, die CTL- und T-Helfer-Sequenzen in die SC100-CDR zu mutieren. In diesem Szenarium werden zwei Vorwärtsprimer verwendet und schmelzen bei ähnlichen Temperaturen (der Aufschmelztemperatur) auf den Schablonenstrang auf. Dies löst die DNA-Polymerase-Aktivität aus, welche dann komplementäre Basenpaare einfügt. In Verbindung mit der Wirkung des Gegenprimers amplifiziert dies die DNA-Schablonenstränge exponentiell durch das zyklische Wiederkehren von Denaturierungs-, Aufschmelz- und Verlängerungstemperaturen. In frühen Zyklen, falls der Mutationsprimer an den Targetstrang aufgeschmolzen werden kann, wird die Mutation dann in nachfolgende Schablonenstränge eingefügt. Eine graphische Darstellung dieses Prozesses findet sich in 15. Die Leichtigkeit, mit der der Mutationsprimer aufgeschmolzen werden kann, bestimmt das Verhältnis, in dem mutierte DNA in der amplifizierten Mischung vorliegt. Mischungen nativer (nicht-mutierter) und mutierter PCR-Produkte können dann durch Klonierung getrennt werden.
Leitexperimente verwendeten das Drei-Primer-System zum Einschluss von FLWGPRALV in SC100 CDR-L3. PCR wurde mit Hilfe von pSVhyg SC100 chimärem VK, HuCK-Plasmid als eine Schablone für die SC100-Leichtkette durchgeführt und eine äquimolare Kombination der Primer GD SC 100 ForH + L, GD SC100 REVL und CTL1 L3 wurden verwendet, um die PCR-Reaktion auszulösen. Standard-PCR-Bedingungen und -Reagenzien wurden verwendet und auf die PCR-Zyklen angewandt, welche aus 45 Sekunden bei 94°C, 45 Sekunden bei 56°C und 90 Sekunden bei 72°C bestanden. Dreißig Zyklen dieser Temperaturen ermöglichten eine Amplifikation der PCR-Produkte in Konzentrationen hoch genug, um durch Standard-Agarosegel-Elektrophorese sichtbar zu werden. Die Repräsentation auf dem Agarosegel, welche FLWGPRALV-kodierende SC100-CDR-L3-mutierte PCR-Produkte identifiziert, ist in 16 gezeigt. In dieser Figur sind die Unterschiede in der Nützlichkeit des Mutationsprimers im Unterschied der in Spur 3 und 5 gefundenen Produktgrößen hervorgehoben. Die Konfiguration des oberen und unteren Bandes in Spur 5 ist konsistent mit den Amplifikationsprodukten, die theoretisiert in 15 wiedergegeben sind. Das obere Band sollte daher einen Anteil mutierter Sequenz enthalten, da der Mutationsprimer eindeutig auf den Schablonenstrang aufgeschmolzen werden kann, wie durch die Gegenwart des unteren Bandes gezeigt wird (welches eine verkürzte, mutierte Sequenz darstellt). Daher sollte das Klonieren der PCR-Produkte, welche in Spur 5 visuell dargestellt sind, in der Lage sein, mutiertes (nichtverkürztes) PCR-Produkt zu isolieren.
Um leichteres Klonieren zu ermöglichen, wäre es ratsam zu versuchen, die relativen Konzentrationen der unterschiedlichen Spezies von PCR-Produkten zu Gunsten der mutierten, nichtverkürzten Sequenz zu verändern. Dies kann durch asymmetrische PCR erfolgen. Hier wird das Produkt dargestellt in 16, Spur 5, unteres Band selbst als der Rückwärtsprimer in Verbindung mit der Zugabe der Vorwärtsprimer verwendet (in diesem Fall GD SC 100 ForH + L). Die Amplifikation mittels dieser Primer unter den gleichen Bedingungen wie die ursprüngliche PCR führt zur Produktion eines Überschusses an mutierter Sequenz, da diese Sequenz im Umkehrprimer dargestellt wird. Das Ergebnis dieser PCR ist in 17 gezeigt. Die Produkte von Spur 3 und 4 wurde als geeignet erachtet und wurden zum Klonieren weiterverwendet. Die erhöhte Menge an DNA, welche das obere Band darstellt, und die Verringerung der Levels verkürzter Mutationssequenz (kein unteres Band sichtbar) bestätigten beim Vergleich mit der vorherigen und unsprünglichen PCR (Spur 2) die Idee, dass die asymmetrische PCR tatsächlich höhere Levels an mutierter (nichtverkürzter) Sequenz produziert hat.
Klonierung und Sequenzierung
Nachdem die Mutations-PCR stattgefunden hat, würde das Klonieren und anschließende Sequenzieren der erzeugten PCR-Produkte zeigen, ob die geeigneten Mutationen eingefügt wurden. Wie in 15 zu sehen ist, liegen sowohl die native wie auch die mutierte Sequenz in den abgeleiteten PCR-Produkten vor. Für die Identifikation dieser Klone mit Mutationen aus dem nativen Hintergrund gibt es eine Reihe von Möglichkeiten. Eine davon ist das Züchten von Klonen und Reinigen des Plasmids aus jedem davon zur Sequenzierungsanalyse. Dies ist eine recht arbeitsintensive Vorgehensweise, besonders wenn Dutzende Klone gleichzeitig verarbeitet werden müssen. Die Verwendung der PCR kann dabei unterstützend einwirken, da dadurch die meisten der Arbeitsschritte umgangen werden, indem nur die Klone identifiziert werden, welche die mutierte Sequenz enthalten. Hier werden Primer nur basierend auf der mutierten Sequenz hergestellt (d.h. ohne die Anteile, welche komplementär zur nativen Sequenz sind). Die PCR-Amplifikation mittels eines solchen Primers als dem Vorwärtsprimer in Verbindung mit dem Rückwärtsprimer der unsprünglichen Reaktion sollte nur die Amplifikationsprodukte derjenigen Klone erzeugen, bei denen die Mutation vorliegt. Auf diese Art und Weise können viele Klone schnell und effizient analysiert werden, und es entstehen Produkte, welche aufgrund ihrer Größe verifizieren können, wo auf der nativen Sequenz die Mutation eingefügt wurde. Klone, welche hier zu positiven Ergebnissen führen, würden dann verwendet werden, um Plasmid für die Sequenzverifikation zu erzeugen.
Die PCR-Produkte dargestellt in 18 wurde daher für das Klonieren weiterverwendet. Dies wurde durch Verwendung des TOPO TA-Klon-Kits (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA) erreicht. Hier ist der Klonvektor (pCR^®2.1-TOPO mit einfachen 3'-Thymidin(T)-Überhängen entlang der Topoisomerase I ausgestattet, welche kovalent an den Vektor gebunden ist. Die Klonierstrategie berücksichtigt die Nicht-Schablonenabhängige Terminus-Transferase-Aktivität des Thermus aquaticus (Taq) Enzyms verwendet bei der Erzeugung von PCR-Produkten, welche ein einzelnes Deoxyadenosin (A) an das 3'-Ende des PCR-Produktes hinzufügt. Die T-Überhänge bieten daher ein „haftendes Ende" für die Basenpaarung der A- und T-Nukleotide, eine Reaktion, welche durch Topoisomerase I katalysiert wird. Somit können in einer einfachen Einschrittreaktion (praktisch) alle PCR-Produkte in diesen Vektor kloniert werden. Die Transformation geeigneter Stämme von E. coli vereinfacht das Züchten von durch PCR eingefügtem pCR^®2.1-TOPO^®-Plasmid für die DNA-Sequenzierungsanalyse. Wie bereits zuvor erwähnt kann transformiertes E. coli direkt für PCR-Reaktionen verwendet werden, um den Mutationsgehalt individueller Klone zu analysieren. Im Kontext des FLWGPRALV-Einschlusses in CDR-L3, wurde dies unter Verwendung von mit pCR^®2.1-TOPO^® transformierten Klonen mit den Primern CTL1 L3 und GD SC100 REVL erreicht (siehe Tabelle 13a bzw. 13b). Die Agarosegeldarstellung der Ergebnisse dieser PCR-Analysen sind in 18 gezeigt.
Diese Experimente erzeugten viele klonierte Produkte, von denen eines als 74:1 bezeichnet wird. Dieser Klon wurde für die Plasmidreinigung weiterverwendet, damit durch DNA-Sequenzierung die Gegenwart der eingeschlossenen Mutation verifiziert werden kann. Die Ergebnisse der Sequenzanalyse sind in 19 gezeigt.
Die im Wesentlichen gleiche Gesamtstrategie wurde angewandt, um das T-Helfer-Epitop in CDR-L1 einzuschließen. In Leitexperimenten wurde dieses Epitop neben dem CTL-Epitop verwendet, um die vorteilhaften (oder andere) Wirkungen der T-Zellen-Hilfe auf die CTL-Aktivität sicherzustellen. Somit wurde die Herstellung eines Doppelmutanten in Angriff genommen, welche das CTL-Transplantat in die CDR-L3 und das T-Helfer-Transplantat in die CDR-L1 einschließt. Die erfolgreiche Mutation zum Erzeugen des 74:1-Klons bedeutete, dass dieses Konstrukt als eine Schablone verwendet werden konnte, um den T-Helfer in CDR-L1 zu mutieren. Der Erfolg dieser in Angriff genommenen Mutation würde offensichtlich in einem Doppelmutanten resultieren. Dies war tatsächlich der Fall, und die asymmetrische PCR zum Erhöhen des Verhältnisses des Mutanten zur nativen DNA-Sequenz war wiederum erfolgreich. Diese Produkte wurden dann zum Klonieren weiterverwendet. Das Klonieren wurde wieder in der beschriebenen Art und Weise mit Hilfe der Invitrogen TOPO TA Klonierstrategie durchgeführt. Klone wurden positiv identifiziert mit mutierter CDR-L1 mittels PCR mit dem THL1-Primer, und ein Klon, nämlich 213:4, wurde für die DNA-Sequenzanalyse weiterverwendet. Sequenzdaten für diesen Klon sind in 20 dargestellt. DNA-Vakzination Bei diesen Studien wurden die Primer sorgfältig konzipiert, um sowohl geeignete Primer in die CDR von Interesse einzufügen und um das Spleißen mutierter DNA zurück in die ursprünglichen, für die Proteinexpression verwendeten, Plasmide zuzulassen. Dies bietet eine Möglichkeit der Untersuchung der Auswirkungen der erzeugten Mutationen vor dem Hintergrund nativen Proteins. Die Verwendung der PCR erlaubt auch das Subklonieren interessanter Produkte in andere Zwischenvektoren für die Durchführung von Zwischenexperimenten. Auf diese Art und Weise konnten native und CDR-mutierte Sequenzen in Vektoren eingefügt werden, welche für die Durchführung von DNA-Vakzinationsexperimenten geeignet sind.
Zur Durchführung von DNA-Vakzinationsexperimenten in einem transgenen Maussystem muss das als das Impfstoffvehikel eingeschlossene Plasmid eine eukaryotische Promotorsequenz enthalten, damit diese DNA transkribiert und translatiert werden kann. Da der pCR^®2.1-TOPO^®-Vektor eine prokaryotische Promotorregion enthält, mussten daher die mutierten Sequenzen der Klone 74:1 und 213:4 in einen alternativen Vektor gespleißt werden. Wieder wurde ein Invitrogen-Vektor ausgewählt, um dies zu erreichen, nämlich der Vektor pCR3.1^®. Dieser Vektor enthält den Cytomegalovirus (CMV) Immediate-Early-Promotor, welcher die High-Level-Expression geklonter Gene in einem eukaryotischen System zulässt. Einfache TA-Klonexperimente vereinfachten wieder die Einfügung der 74:1- und 213:4-mutierten Sequenzen in diesen Vektor. Um ihren Unterschied zu den mit pCR^®2.1-TOPO^® erzeugten Klonen anzuzeigen, wurde jeder isolierte Klon, welcher den pCR3.1^®-Vektor enthielt, mit dem Präfixbuchstaben „C" versehen. Ein solcher Einschluss erfolgte auch bei nativen SC100-Leichtketten-PCR-Produkten (erzeugt aus dem Plasmid pSVhyg SC100 Chimärer VK, HuCK) und nativen Schwerkettenprodukten (erzeugt aus dem Plasmid pSVgpt SC100 Chimärer VH). Geklonte Versionen dieser Konstrukte wurden mit K2 und H8 für die Leichtketten- bzw. die Schwerkettenversion bezeichnet.
Die DNA-Vakzination selbst erfolgte mittels der GeneGun-Technologie (Biorad Laboratories Limited, Hemel Hempsted, UK). Kurzgesagt, Plasmid-DNA wurde intradermal in Tiere eingefügt, und zwar mittels einer Helium-betriebenen Pistole. Die Geschosse haben die Form von Goldpartikeln, welche mit DNA nach Wahl beschichtet sein können. Im vorliegenden Fall wurden Plasmide hergestellt aus den Klonen 74:1, 213:4, K2 und K8 mit Goldpartikeln gemischt und zum Immunisieren von Gruppen von vier Mäusen verwendet. Die folgenden Immunisierungen wurde untersucht:

• C74:1-Plasmid
• C213:4-Plasmid
• K2-Plasmid
• C74:1-Plasmid plus H8-Plasmid

Gruppen von Mäusen ohne Immunisierungen wurden bereitgestellt sowie positive Kontrollmäuse. Dies waren Mäuse immunisiert mit dem Peptid FLWGPRALV in einer geeigneten Immunisierungsregel für Peptidimmunogene.
Untersuchung zytotoxischer T-Zellen
Der Endpunkt dieser Anfangsstudien zum Epitop/CDR-Einschluss ist die Erzeugung von CTL-Reaktionen gegen das in die CDR eingefügte T-Zellepitop. Diese Studien wurden an transgenen Mäusen dürchgeführt, welche das Gen tragen, welches menschliche HLA-A2-Moleküle erzeugt, was eine translationale Studie der menschlichen Immunepitop-Funktion in diesen Mäuse ermöglicht. Wieder wurde das geeignete Epitop zur Überprüfung des Immunkörperprinzipnachweises verwendet, da das MAGE-3 Epitoppeptid FLWGPRALV bekannt dafür ist, sich mit hoher Affinität an HLA-A2 zu binden.
Splenozyten aus immunisierten und Kontrollmäusen wurden entnommen und mit Hilfe von Standardgewebekulturtechniken und Wachstumsmedien kultiviert. Naive Mäuse wurden verwendet, um Feeder-Zellen für die in vitro-Peptidstimulation durch ein Standardverfahren basierend auf der Produktion von durch Lipopolysaccharid (LPS) stimulierten Blasten (auch aus der Milz) zu erzeugen. An Tag drei wurden diese LPS-Blasten bestrahlt und MAGE-3-Peptid (FLWGPRALV: 100 μg pro 2 × 10⁷ Zellen inkubiert in 1 ml) für eine Stunde zugegeben. Diese Zellen wurden dann gewaschen und als Feeder-Zellen für Splenozyten aus immunisierten Mäusen verwendet. Nach 5 Tagen Inkubation wurden diese Zellen für routinemäßige zytotoxische T-Zellen-Experimente weiterverwendet. Es wurden Untersuchungen für die Analyse der Reaktion gegen kein Peptid, ein irrelevantes Peptid und das MAGE-3-Peptid durchgeführt. Die Ergebnisse der CTL-Untersuchungen sind in 20 dargestellt. Für jeden Immunisierungssatz sind die am stärksten reagierenden Mäuse angezeigt.
Bei Mäusen immunisiert mit MAGE-3-Peptid tritt Abtötung bei dem höchsten Effektor:Target-Verhältnis (E:T-Verhältnis) von Zellen gepulst mit dem MAGE-3-Peptid auf. Dieses Ergebnis spiegelt sich praktisch bei den mit Plasmid-C74:1 immunisierten Mäusen wieder. In beiden Fällen, wie in allen in 20 gezeigten Fällen, gibt es keine signifikante Abtötung von Zellen gepulst mit entweder keinem Peptid oder einem irrelevanten Peptid. Die zytotoxische Aktivität der C74:1 (Mage 3 in CDR-L3)-Gruppen-Mäuse steht in starkem Kontrast mit dem Mangel an CTL-Aktivität bei den K2 (native SC100) -Plasmid-immunisierten Mäusen. Dieser Unterschied bei der Zytotoxizität lässt darauf schließen, dass, infolge der Immunisierung, die Sequenz, welche FLWGPRALV kodiert, translatiert wurde, und dass dieses Peptid angemessen an CTLs präsentiert wurde. Dies belegt ein erfolgreiches Pfropfen eines Epitops an eine Immunkörperstruktur, welche eine Immunreaktion bei immunisierten Mäusen hervorruft. Weitere Belege für die Erzeugung von CTLs zeigen sich in den Gruppen von Mäusen immunisiert mit Plasmid-C213:4 und auch bei den Mäusen immunisiert mit einer Kombination aus C74:1 und H8. Plasmid-C213:4 enthält ebenfalls eine Sequenz, welche das Peptid FLWGPRALV in der CDR-L3 kodiert, enthält aber auch das T-Helfer-Epitop (TPPAYRPPNAPIL) in der CDR-L1. Die Gegenwart des T-Helfer-Epitops kann möglicherweise für T-Zellen-Unterstützung sorgen, wie die Tatsache andeutet, dass die Abtötung in einem niedrigeren E:T-Verhältnis stattfindet als dies bei der mit C74:1 immunisierten Gruppe zu verzeichnen ist. Eine weitere Beobachtung aus 20 ist, dass relativ hohe zytotoxische Aktivität bei den Mäusen immunisiert mit einer Kombination aus Plasmid-C74:1 und -H8 stattzufinden scheint, welche sowohl leichte als auch schwere Ketten in der gleichen Zelle kodieren. Dies könnte als Auswirkung die Herstellung einer ganzen Immunkörpereinheit innerhalb der transfizierten Zelle haben. Die Präsentation der Epitope für Antigen-präsentierende Zellen könnte zur Zellabtötung führen sowie zur Freisetzung der ganzen Immunkörpereinheit in die Umgebung. Dies würde dann das Targeting von Langerhan-Zellen (spezialisierte dendritische Zellen in der Haut) durch CD64 zulassen, wobei der Ligand durch den Schwerkettenabschnitt des Immunkörpers bereitgestellt wird. Dies kann die Ursache für die relativ höhere Abtötung sein, die in dieser Gruppe beobachtet wurde.
BEISPIEL 12
Herstellung von Polypeptid-Fc-Konstrukten (Signal pigplus Tie2-FC und Mutanten). Eine Proteindomäne eines Moleküls wurde kloniert und an die menschliche IgG1-Fc-Region gespleißt. Diese würde durch den CD64-Rezeptor auf dendritischen Zellen erkannt, internalisiert und in Peptide für die Präsentation auf MHC-Molekülen der Klasse I und Klasse II verarbeitet werden. Falls diese Epitope hochaffine Eigen-Epitope sind, dann wurden möglicherweise die T-Zellen, welche sie erkennen, im Thymus gelöscht. T-Zellen, welche moderat affine Epitope erkennen, werden noch immer präsentiert, jedoch sind diese Epitope auf MHC-Molekülen nicht gut dargestellt, da von höheraffinen Epitopen auskonkurriert werden. Durch die Veränderung der Ankerreste, welche sich an das MHC binden, ist es möglich, Hochaffinitätspeptide zu erzeugen, ohne die T-Zellen-Erkennung zu verändern (Rosenberg et al., (1998) Nature Medicine 4:321–327).
Methoden & Ergebnisse
cDNA synthetisiert aus 5 μg Gesamt-RNA isoliert aus der Zelllinie TF1 (gezüchtet in Gegenwart von 200 Einheiten/ml GMCSF) wurde als Schablone für die Amplifikation von verkürztem Tie-2 (1–196 Aminosäuren) verwendet, unter Verwendung folgender Primere: 5'-Primer, 5'-GAT CTC GAG ATT TGG GGA AGC ATG GAC-3', entsprechend der Nukleotidsequenz 128-154 des Tie-2-Gens mit einer zusätzlichen Xhol-Restriktionsstelle; und 3'-Primer, 5'-GAA GAT ATC TCC TCC TAT ATA CCT GGC CGA-3', entsprechend der Nukleotidsequenz 716–745 des Tie-2-Gens mit einer eingeschlossenen EcoRV-Stelle. Das PCR-Fragment wurde geschnitten und in die multiple Xho-1/EcoRV-Klonstelle des Säugetierexpressionsvektors Signal pigplus (R- und D-System) ligiert, und zwar im Rahmen mit einer CD33-Signalsequenz und dem menschlichen C-Terminus IgG₁-Fc-Schwanz, zum Erzeugen eines sekretorischen Fusionsproteins. Dieses Plasmid wurde durch Restriktionsanalyse identifiziert und durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Aus diesem Wildtyp-Plasmid wurden durch PCR-Mutagenese fünf weitere Konstrukte erzeugt. Das „Quik^TM Change Site Directed Mutagenesis"-Kit (Stratagene) wurde entsprechend dem Herstellerprotokoll verwendet, um spezifische Aminosäuren auszutauschen, um potentielle CTL-Epitope unter Verwendung der konzipierten Primer Z84, Z95, Z101 und Z107 wie in Tabelle 14 aufgelistet zu erzeugen.
Tabelle 14: Primer verwendet für die Stellen-gerichtete Mutagenese des Signal piplus Tie2-FC Wildtyp-Konstruktes
Rot hervorgehobene Nukleotide sind die substituierten Basen, die zur Kodierung für die ausgetauschte spezifische Aminosäure des Epitops erforderlich sind.
Z84-Primer schmelzen an der Nukleotidsequenz von 524–557 auf; Z95-Primer: 160–201; Z101-Primer: 512–548 und Z107-Primer: 509–548 des Wildtyp-Tie-2-Gens. (Zugangsnummer L06139).
Für ein Konstrukt wurden sowohl Z95- als auch Z107-Primer verwendet, um zwei potentielle CTL-Epitope ainzubinden. Alle stellenspezifischen Mutationen wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt (Tabelle 15).
Tabelle 15: Alignment von Wildtyp Tie-2 cDNA und Aminosäuren mit Sequenzierung erhalten aus den eingefügten Stellen-spezifischen Mutationen vorhanden in den Signal pigplus Tie-2-FC Konstrukten
Die Zahlen entsprechen den Nukleotidbasen und Aminosäuren der Tie-2-Wildtypsequenz (Zugangsnummer L06139).
Die Plasmide wurden mit Hilfe von „Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (PE Applied Biosystems) sequenziert, und die Sequenzierungsreaktionen wurden mittels des „ABI Prism 373A DNA" Sequenzierers (Applied Biosystems) elektrophoresiert. Mit den daraus resultierenden DNA-Sequenzen wurde ein Alignment mit Wildtyp-cDNA (Zugangsnummer: L06139), erhalten aus der NIH-Datenbank durchgeführt, dabei wurde das Programm Blast 2 zur paarweisen Suche verwendet. Menschliche 293-Nierenzellen wurden stabil mit tie2-Fc transfiziert und das aus dem Überstand erhaltene Protein wurde auf einer Protein-A-Säule gereinigt.
Menschliche T-Zellen, welche ein Peptid innerhalb des Tie2-Moleküls erkannten, wurden geklont. Es konnte gezeigt werden, dass diese Klone moderat affin sind, indem sie nur 5 ug Peptid benötigen, um 50% maximale Stimulation zu erzeugen, und, dass sie daher repräsentativ für die T-Zellen sind, welche die Thymusselektion umgehen konnten. Dendritische Zellen wurden entweder mit rekombinantem Tie2-Protein, Peptid oder dem Tie2Fc-Konstrukt versorgt, und wurden dann dem T-Zellenklon ausgesetzt. 21 zeigt, dass der Klon schwach auf das Peptid reagierte, überhaupt nicht auf das rekombinante Protein, jedoch ausgezeichnet auf das Tie2Fc-Konstrukt. Ferner konnte die Reaktion auf das Tie2Fc-Konstrukt durch einen Anti-CD64-Antikörper blockiert werden.
Deutsche Zeichnungsbeschriftung:

Claims

Verwendung eines Polypeptids, das aufweist: (i) einen ersten Abschnitt, der den Teil von menschlichem Fc enthält, der an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt, der ein oder mehrere heterologe T-Zellepitope enthält, bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulation einer zytotoxischen T-Zellreaktion.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der erste Abschnitt das Fc-Segment von menschlichem IgG enthält.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das IgG menschliches IgG1 ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei der erste Abschnitt menschliches FcγI enthält.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der zweite Abschnitt ein Fab-Fragment ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Fab-Fragment nicht menschlich, vorzugsweise von der Maus ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Fab-Fragment vom Menschen ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das heterologe T-Zellepitop ein pathogenes Epitop ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das heterologe T-Zellepitop ein nichtpathogenes Epitop ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das nichtpathogene Epitop ein Tumor-Epitop ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polypeptid ein monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Polypeptid ein Protein-Domäne-Fc-Konstrukt ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zytotoxische und T-Helfer-Zellreaktionen stimuliert.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament für die Behandlung und/oder Prophylaxe von Krebs ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament für eine intramuskuläre und/oder intradermale Verabreichung ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die ferner die Verwendung einer Nucleinsäure enthält, die ein Polypeptid codiert, das (i) einen ersten Abschnitt aufweist, der den Teil von menschlichem Fc enthält, der an CD64 bindet, und (ii) einen zweiten Abschnitt aufweist, der ein oder mehrere heterologe T-Zellepitope enthält, bei der Herstellung eines Medikaments zur Stimulation einer zytotoxischen T-Zellreaktion.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament ferner ein Adjuvans enthält.