ES2254663T3 - Peptidos capaces de enlazarse a cd64 y que comprenden uno o mas epitopos heterologos de celulas t, y sus usos. - Google Patents

Abstract

El uso de un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza a CD64, y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos de células T heterólogas en la elaboración de un medicamento para estimular una respuesta citotóxica de las células T.

Description

Péptidos capaces de enlazarse a CD64 y que comprenden uno o más epítopos heterólogos de células T, y sus usos.

La presente invención se relaciona con epítopos de células T, y en particular con moléculas para la producción de tales epítopos para aumentar la respuesta citotóxica de las células T (CTL). En la presente invención, las moléculas puede ser anticuerpos modificados, especialmente anticuerpos monoclonales humanos IgG1 que se enlazan al receptor CD64 y que son modificados genéticamente para expresar a los epítopos de las células T dentro de sus regiones CDR para estimular tanto las respuestas auxiliares como citotóxicas de las células T.

Los anticuerpos se componen de regiones constantes (Fc) que determinan la función efectora del anticuerpo y los dominios de enlazamiento del antígeno (Fab) que comprenden un juego único de regiones determinantes de complementariedad (CDR). El papel de los anticuerpos es enlazarse a los antígenos, marcándolos por lo tanto en forma más visible para el sistema inmunológico. Los complejos antígeno-anticuerpo (Ag-Ab) pueden enlazarse a un receptor Fc sobre células fagocíticas para permitir una digestión eficiente de los patógenos perjudiciales. La internalización del receptor Fc permite también permite una presentación eficiente del antígeno para estimular la respuesta de las células T. Estudios previos han mostrado que la internalización del receptor Fc de los complejos Ag-Ab es 1.000 veces más eficiente que la pinocitosis para la estimulación de las respuestas de las células T ayudadoras. Más recientemente, se ha mostrado que la internalización del receptor Fc de los complejos antígeno-anticuerpo por las células dendríticas, permite también un procesamiento más eficiente del antígeno dentro de las rutas de presentación de la Clase I y de la Clase II para permitir la estimulación no solamente de las respuestas de las células T ayudadoras sino de las citotóxicas (Regnault y colaboradores, (1999) J. exp Med.189: 371-380). Además, la internalización del receptor Fc activa a las células dendríticas para expresar a las moléculas coestimuladoras esenciales para cebar respuestas naive. La internalización del receptor Fc es una consecuencia del entrecruzamiento del receptor por los complejos antígeno/anticuerpo y los estudios previos han mostrado que Ab por si solo no puede mediar este efecto.

Aunque diferentes estudios han sugerido que los anticuerpos antiidiotipo que imitan a los antígenos pueden estimular las respuestas citotóxicas de las células T, ellos han fallado en demostrar respuestas citotóxicas de las células T específicas del antígeno estimuladas por la presentación específica de MHC clase I. En realidad, en un estudio por medio del cual un epítopo de las células T ayudadores y uno de las células T citotóxicas fueron transplantados dentro de la región CDR de un anticuerpo de ratón, solamente pudieron ser estimuladas las respuestas ayudadoras.

Por ejemplo, WO 96/19584 describe anticuerpos quiméricos en los cuales los epítopos de las células T se insertan dentro de los CDR de un anticuerpo, y afirma que tales anticuerpos quiméricos son adecuados para aumentar una respuesta CTL. Sin embargo, este documento solamente revela que un CTL puede ser inducido por un ácido nucleico que codifica tal anticuerpo quimérico, pero no revela como una respuesta CTL pueda ser inducida por medio de la aplicación de un anticuerpo quimérico por si mismo. Por lo tanto, se asevera en la página 51, líneas 8-10 que "solamente las proteínas sintetizadas por las células objetivo por si mismas son presentadas por las moléculas MCH clase I y reconocidas por los CTL".

Además, WO 00/64488 revela que una respuesta CTL puede ser aumentada por medio de ácido nucleico que codifique a un anticuerpo quimérico que tiene epítopos de células T heterólogas insertadas en los CDR de las mismas, a condición de que el ácido nucleico sea dirigido por expresión en células hematopoyéticas.

Sorprendentemente, los presente inventores han encontrado que ciertos anticuerpos monoclonales humanos que tienen diferentes epítopos de células T dentro de sus regiones CDR, pueden estimular tanto las respuestas específicas de las células T antigénicas como ayudadoras. Además, ellos han mostrado que la región Fc\gammal humana es esencial para la generación de las respuestas citotóxicas e incrementan grandemente la sensibilidad de las respuestas estimuladoras de las células T ayudadoras. Esta región se enlaza a la CD64 de las células dendríticas. Por lo tanto, puede ser utilizada para entregar a los epítopos de las células T a las células dendríticas que las pueden procesar y presentarlas a las células a las células T, estimulando así las respuestas de las células T citotóxicas y/o ayudadoras.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención provee el uso de un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte de Fc humano que se enlaza a CD64, y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos de células T heterólogas en la elaboración de un medicamento para estimular una respuesta citotóxica de las células T.

La primera porción puede comprender al segmento Fc de IgG (por ejemplo, humano), por ejemplo IgG1.

La primera porción puede comprender la región de cadena pesada (\gamma) del segmento Fc.

Preferiblemente, la primera porción comprende la región de cadena pesada (\gamma) del segmento Fc de IgG 1 (Fc\gammal).

"El epítopo heterólogo de célula T" se pretende que signifique un epítopo de célula T que es heterólogo a la primera porción. Por ejemplo, en donde la segunda porción comprende al fragmento Fab de un anticuerpo, un epítopo heterólogo de célula T es uno que no estaba presente previamente en el fragmento Fab. El epítopo heterólogo de célula T puede ser un epítopo patógeno o un epítopo no patógeno, tal como un epítopo tumoral.

La segunda porción puede ser un polipéptido. Alternativamente, la segunda porción puede ser un fragmento Fab, que puede ser de humano o no humano, preferiblemente, de ratón. Se prefiere si el o cada epítopo de célula T se/son insertados para reemplazar a las CDR, aunque esto no es necesario, dado que los epítopos de célula T son entregados a, y presentados por las células que presentan antígenos. El epítopo heterólogo de la célula T puede ser insertado como una unidad completa, aunque puede ser preparado a partir de una secuencia insertada de aminoácidos, junto con aminoácidos flanqueadores de la segunda porción. Alternativamente, por ejemplo, un anticuerpo antiidiotipo puede ser elevado en una especie, por ejemplo ratón, con respecto a un antígeno particular, y el fragmento Fab de ese anticuerpo injertado a la parte del Fc humano que se enlaza al CD64.

El medicamento puede estimular las respuestas citotóxica y ayudadora de las células T, y puede ser para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer. El uso de la invención puede comprender además el uso de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido del primer aspecto de la invención en la elaboración de un medicamento para estimular una respuesta citotóxica de las células T. El medicamento puede comprender además un adyuvante.

En el arte previo, se ha mostrado que Fc^{3}l puede ser utilizado para dirigir a las moléculas hacia las células dendríticas (Liu y colaboradores, (1999) J. Clin Invest 98(9): 2001-2007). Sin embargo, esos estudios no fueron capaces de mostrar que tales moléculas podrían no estimular una respuesta CTL, a pesar de la especulación temprana de que esto podría ser posible (Guyre y colaboradores, (1997) Cancer Immunol. Immunothr. 45: 146-148).

Como se lo utiliza aquí, el término "polipéptido" significa, en términos generales, una pluralidad de residuos de aminoácidos unidos entre si por medio de enlaces peptídicos. Se utiliza en forma intercambiable y significa lo mismo que péptido, proteína, oligopéptido, u oligómero. El término "polipéptido" se pretende que incluya también fragmentos, análogos y derivados de un polipéptido en donde el fragmento, análogo o derivado retiene esencialmente la misma actividad biológica o función que una proteína de referencia.

Preferiblemente, el polipéptido útil en la invención es un constructo de proteína de dominio Fc o un anticuerpo monoclonal. Los polipéptidos útiles en la presente invención pueden ser mencionados aquí como "inmunocuerpos".

El ácido nucleico que codifica al polipéptido del primer aspecto de la invención, puede ser suministrado. El ácido nucleico puede ser ADN, cADN, oARN, tal como mARN obtenido por clonación o producido por síntesis química. Para uso terapéutico, el ácido nucleico esta preferiblemente en una forma capaz de ser expresada en el individuo que va a ser tratado.

El polipéptido útil de la presente invención o el ácido nucleico que codifica al polipéptido puede ser suministrado como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el cual se encuentra naturalmente asociado. En el caso de un ácido nucleico, puede estar libre o sustancialmente libre de ácido nucleico que flanquea al gen en el genoma humano, excepto posiblemente una o más secuencia(s) reguladora(s) para expresión. El ácido nucleico puede ser total o parcialmente sintético y puede incluir ADN, cADN, oARN genómico. En donde el ácido nucleico que codifica al polipéptido incluye ARN, con referencia a la secuencia mostrada debe ser construido como referencia al equivalente del ARN, con U sustituido por T.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican a un polipéptido útil en la presente invención, pueden ser preparadas fácilmente por una persona calificada, por ejemplo utilizando la información y las referencias contenidas aquí, y las técnicas conocidas en el estado del arte (por ejemplo, ver Sambrook, Fritsch y Maniatis, "Molecular Cloning", A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, y Ausubel y colaboradores, Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, 1992), dadas las secuencias de ácido nucleico y los clones disponibles. Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las muestras de tal ácido nucleico, por ejemplo de fuentes genómicas, (ii) síntesis química, o (iii) preparando secuencias de cADN. El ADN que codifica al polipéptido puede ser generado y utilizado en cualquier forma adecuada conocida por aquellos entrenados en la técnica, que incluye tomar ADN de codificación, identificar los sitios apropiados de reconocimiento por parte de la enzima de restricción en cualquiera de los dos lados de la porción que va a ser expresada, y cortar dicha porción del ADN. La porción puede ser entonces operativamente enlazada a un promotor adecuado en un sistema de expresión comercialmente apropiado. Otro método recombinante es amplificar la porción relevante del ADN con cabadores PCR adecuados. Las modificaciones a las secuencias pueden hacerse, por ejemplo utilizando mutagénesis dirigida al sitio, para conducir a la expresión del péptido modificado o tener en cuenta las preferencias del codón en las células huésped utilizadas para expresar al ácido nucleico.

Con el propósito de obtener la expresión de las secuencias de ácido nucleico, estas pueden ser incorporadas dentro de un vector que tiene una o más secuencias de control operativamente enlazadas al ácido nucleico para controlar su expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias tales como promotores o mejoradores para conducir la expresión del ácido nucleico insertado, de las secuencias de ácido nucleico de modo que el polipéptido se produce como una fusión y/o como señales se secreción que codifican al ácido nucleico de modo que el polipéptido producido en la célula huésped es secretada a partir de la célula. El polipéptido puede obtenerse entonces transformando a los vectores dentro de las células huésped en las cuales el vector es funcional, cultivando las células huésped de modo que se produce el polipéptido, y recuperando al polipéptido de las células huésped o del medio circundante. Las células procariotas y eucariotas son utilizadas en el arte para este propósito, incluidas las cepas de E. coli, levaduras, y células eucariotas tales como células de insecto, y células animal, por ejemplo, células COS, células CHO, Melanoma de Bowes y otras células humanas adecuadas.

Preferiblemente, la parte del Fc humano de la primera porción se enlaza a CD64 de células dendríticas. Por lo tanto un aspecto adicional de la invención suministra células dendríticas que presentan, expresan o se enlazan a los epítopos homólogos de células T de la segunda porción.

Un método para estimular una respuesta citotóxica de las células T en un paciente tal como un mamífero, incluidos los humanos, puede comprender administrar a un destinatario, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza a CD64, y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos heterólogos de las células T. Un método para estimular una respuesta citotóxica de las células T en un paciente tal como un mamífero, incluidos los humanos, puede comprender administrar a un destinatario una cantidad terapéuticamente efectiva de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza a CD64, y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos heterólogos de las células T. Preferiblemente, el polipéptido y el ácido nucleico se administran como una terapia de administración. En tal método, el polipéptido o el ácido nucleico pueden ser administrados en forma intravenosa, intradérmica, intramuscular, oral o por otras vías.

Se prefiere la administración intradérmica y/o intramuscular debido a que estos tejidos contienen células dendríticas y no tienen niveles altos de IgG en suero que puedan actuar como un inhibidor competitivo para el enlazamiento al CD64.

Como se lo utiliza aquí, el término "tratamiento" incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano. El tratamiento puede ser de una enfermedad heredada o adquirida. Preferiblemente, el tratamiento es de una condición/desorden asociado con la proliferación de células tal como el cáncer.

El polipéptido o el ácido nucleico pueden ser empleados en combinación con un excipiente o excipientes farmacéuticamente aceptables. Tales excipientes pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina bufferada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinación de los mismos.

Los adyuvantes pueden emplearse para facilitar la estimulación de la respuesta inmune del huésped, y pueden incluir, hidróxido de aluminio, lisolecitina, plurónico, polioles, polianiones, péptidos, proteínas y emulsiones aceitosas.

En una modalidad, la presente invención se relaciona con el aumento de un anticuerpo antiidiotípico en una especie, por ejemplo ratón, con respecto de un antígeno particular, injertando el fragmento Fab de ese anticuerpo, o un fragmento de polipéptido, (que puede ser de al menos 300 aminoácidos de longitud, o incluso de al menos 10-20 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 16 aminoácidos (que corresponden al tamaño de un epítopo de clase II) ó 9 aminoácidos (que corresponden al tamaño de un epítopo de clase I) de longitud) a la parte del Fc humano que se enlaza al CD64 (por ejemplo Fc\gammaI), y utilizando el polipéptido resultante para aumentar una respuesta citotóxica de las células T contra ese antígeno.

En ciertas otras modalidades, la presente invención se relaciona con un método para modificar genéticamente epítopos de células T de los antígenos objetivo dentro de cualquiera de las regiones CDR de los anticuerpos monoclonales humanos IgG, y el uso de tales anticuerpos modificados genéticamente como vacunas para estimular tanto las respuestas ayudadoras como las citotóxicas de las células T.

Cualquier epítopo de células T puede ser insertado con tal de que el anticuerpo pueda enlazarse al CD64 y estimular una respuesta citotóxica de las células T. Pueden emplearse los epítopos de las células T de patógenos tales como VIH, Hepatitis C y otras infecciones que requieren los CTL para eliminar las infecciones latentes, aunque se prefiere que el epítopo sea un "autoepítopo", esto es, asociado con una condición/desorden asociado con la proliferación de células tales como las del cáncer. Preferiblemente, el epítopo de células T es tal que el anticuerpo puede doblarse correctamente y ser secretado. Por lo tanto se prefiere si los epítopos insertados son de tamaño y composición de aminoácidos similar a los CDR originales. La segunda porción puede tener una pluralidad de diferentes epítopos de células T para generar una gran variedad de vacunas de células T. La segunda porción puede incorporar múltiple epítopos de un antígeno único, asegurando así que la mayoría de los individuos con diferentes tipos de HLA respondan a la vacuna única. Alternativamente, pueden insertarse múltiples epítopos de células T de múltiples antígenos dirigiendo un espectro restringido de tipos de HLA. Las moléculas pueden incluir una variedad de antígenos de un patógeno único o tipo de cáncer, o pueden incluir antígenos dispersos dirigiendo un amplio rango de tumores sólidos o patógenos. Las moléculas pueden inclusive ser diseñadas para dirigir diferentes poblaciones de células dentro de un tumor, tales como los antígenos epitelial y endotelial de un tumor.

Un polipéptido preferido útil en la presente invención es un anticuerpo monoclonal humano IgG1 modificado genéticamente para expresarse dentro de sus regiones CDR de los epítopos citotóxicos de células T, opcionalmente con epítopos ayudadores de células T. Los anticuerpos monoclonales humanos útiles en la invención pueden ser preparados inmortalizando secuencias de ácido nucleico que codifican anticuerpos. El proceso de inmortalización puede llevarse a cabo por medio de técnicas de fusión para obtener hibridomas, por transformación viral de linfocitos que producen anticuerpos humanos, por técnicas que combinan fusión celular y metodologías de transformación viral, o por medio de cualquier otra técnica conocida por una persona entrenada.

En una modalidad, el polipéptido útil en la presente invención, se prepara usando una combinación de técnicas de transformación de virus de Epstein-Barr (EBV) y de fusión de hibridoma, tales como aquellas descritas por Kozbor y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. (1982) 79:6551. Por ejemplo, los hibridomas pueden crearse por fusión de células B estimuladas, obtenidas de un humano, con una pareja de fusión heterohíbrida ratón/humano. Una variedad de tales parejas de fusión ha sido descrita. Ver, por ejemplo, James & Bell, J. Immunol. Methds. (1987) 100:5-04 y la patente estadounidense No. 4.624.921. Una pareja de fusión ratón/humano puede construirse por fusión de linfocitos humanos estimulados o transformados por EBV con líneas de mieloma de ratón fácilmente accesibles tales como NS-1 o P3NS-1, en presencia de polietilén glicol, por ejemplo. El híbrido podría ser adecuadamente marcado con una droga, que puede ser acompañado por cultivo del híbrido en concentraciones crecientes de la droga deseada, tal como 6-tioguanina, ouabaina o neomicina.

Alternativamente, la inmortalización de células que producen los anticuerpos antiidiotipo humanos de interés, pueden ser acompañados del uso de técnicas de transformación EBV. Por ejemplo, los linfocitos B derivados de sangre periférica, de medula ósea, de ganglios linfáticos, amígdalas, etc. de pacientes inmunizados con el anticuerpo idiotipo, se inmortalizan usando EBV de acuerdo con métodos tales como aquellos descritos en la patentes estadounidense No. 4.464.465 y Chan y colaboradores, J. Immunol. (1986) 136:106.

Los hibridomas o las células linfoblastoides que segregan el anticuerpo de interés pueden identificarse por medio de exploración de los sobrenadantes del cultivo para la producción de IgG1. Las células de los pozos que poseen la actividad deseada pueden clonarse y subclonarse de acuerdo con técnicas convencionales, y hacerles seguimiento hasta que se identifiquen las líneas inmortalizadas estables que producen al anticuerpo monoclonal humano de interés. "Anticuerpo monoclonal" significa un anticuerpo producido por una línea celular continua clonal, separada de las células que producen anticuerpos monoclonales de una especificidad diferente. Por lo tanto, tales anticuerpos son producidos en forma aislada de otros anticuerpos y, por lo tanto, en forma sustancialmente pura en una concentración mayor que la que se presenta normalmente en suero humano.

Las líneas celulares inmortalizadas de la presente invención pueden fusionarse también con otras células para producir hibridomas o heterohibridomas, y proveer así para la transferencia de genes que codifican los anticuerpos monoclonales humanos. Alternativamente, las técnicas de ADN recombinante pueden ser utilizadas para aislar y transferir el ADN que codifica las inmunoglobulinas o las regiones de las mismas de una variedad de huéspedes para la producción específica de anticuerpo.

Pueden proveerse un anticuerpo modificado que tiene la región constante de un anticuerpo humano, y la región variable o hipervariable de un anticuerpo monoclonal de ratón dentro de los cuales se han insertado los epítopos heterólogos de células T, y su uso en el aumento de la respuesta CTL. La región variable a diferencia de la región hipervariable, puede derivarse también a partir de la región variable de un anticuerpo humano. Se dice que tal anticuerpo está humanizado. Los métodos para elaborar anticuerpos humanizados son conocidos en el estado del arte. Los métodos se describen por ejemplo en la patente estadounidense No. 5.225.539 de Winter.

La región variable del anticuerpo fuera de la región hipervariable de ratón, puede derivarse también de un anticuerpo monoclonal de ratón. En tal caso, la región variable completa se deriva del anticuerpo monoclonal murino, y se dice que el anticuerpo está quimerizado. Los métodos para elaborar anticuerpos quimerizados se conocen en el estado del arte. Tales métodos incluyen, por ejemplo, a aquellos descritos en las patentes estadounidenses de Boss (Celltech) y de Cabilly (Genentech). Ver también las patentes estadounidenses Nos. 4.816.397 y 4.816.567, respectivamente. La invención incluye el uso de anticuerpos monoclonales humanos modificados que tienen la región constante de un anticuerpo humano IgG1, pero el remplazo de una o más de las regiones hipervariables de epítopos de células T para inducir una respuesta CTL.

Un anticuerpo modificado de la presente invención puede tener uno, dos, tres, cuatro, cinco o todas sus regiones hipervariables reemplazadas con epítopos de células T. Preferiblemente, los epítopos incorporados de células T son de tamaño y carga similares a la de los aminoácidos del CDR original del anticuerpo para que el anticuerpo se doble y sea secretado correctamente. Los epítopos de células T pueden predecirse utilizando algoritmos conocidos de células T o sintetizados como péptidos y muestreados utilizando ensayos estándar de células T. Los epítopos identificados de células T pueden ser epítopos citotóxicos de células T y/o epítopos ayudadores de células T, y pueden tener una longitud preferida de aminoácidos de 9-20 aminoácidos. Estos epítopos son preferiblemente cuidadosamente emparejados al CDR más cercano de un anticuerpo monoclonal humano, y las secuencias modificadas utilizan mutagénesis dirigida al sitio del ADN de codificación. Cada CDR es preferiblemente reemplazado secuencialmente, y se investigó la habilidad del inmunocuerpo para doblarse y ser secretado como una molécula de inmunoglobulina intacta. La habilidad del inmunocuerpo para estimular las respuestas ayudadoras y citotóxicas de las células T, puede ser investigada como se ejemplificó aquí. La invención incluye además un anticuerpo modificado que tiene la región constante de un anticuerpo humano fusionada al total o a un dominio de una proteína dentro de tales epítopos heterólogos de células T que han sido insertados, y su uso en el aumento de una respuesta CTL.

Los polipéptidos útiles en la presente invención pueden incorporar múltiples epítopos de células T de un único antígeno objetivo que puede enlazarse a la mayoría de ambas moléculas MCH de clase I y de clase II. Esto puede crear una vacuna que puede ser usada en una vacunación generalizada de la población. Los polipéptidos alternativos útiles en la invención, pueden incorporar múltiples epítopos de células T de múltiples antígenos objetivo que pueden enlazarse a la mayoría de los fenotipos comunes clase I y clase II. Esto puede crear una vacuna que puede prevenir la selección de variantes perdidas del antígeno. Los antígenos objetivo pueden ser de un patógeno único o tipo de tumor, o puede ser seleccionado para producir una respuesta inmune contra una variedad de patógenos o cánceres.

Los polipéptidos útiles en la presente invención que dirigen a los fenotipos específicos HLA comunes pueden incorporar numerosos epítopos de células T de una gran variedad de cánceres y/o patógenos, proveyendo una vacuna única para prevenir la enfermedad.

Por lo tanto, la presente invención también abarca un método para elaborar un polipéptido del primer aspecto, el método incluye la expresión de un ácido nucleico que codifica al polipéptido (generalmente un ácido nucleico de acuerdo con la invención). Esto puede lograrse convenientemente cultivando una célula huésped en un medio de cultivo que contiene a tal vector, bajo condiciones apropiadas que causan o permiten la expresión del polipéptido. Los polipéptidos pueden expresarse también en sistemas in vitro, tal como en un lisado de reticulocito.

Los sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de diferentes células huésped, son bien conocidos. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células eucariotas tale como las de mamífero y levaduras, y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamíferos disponibles en el arte para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de hámster bebé, células COS y muchas otras. Un huésped bacterial común preferido es E. coli.

Los vectores apropiados pueden escogerse o construirse, conteniendo secuencias reguladoras apropiadas, incluidas las secuencias promotoras, los fragmentos de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias mejoradoras, genes marcadores y otras secuencias según corresponda. Los vectores pueden ser plásmidos, virales por ejemplo "fagos o fagémidos", según corresponda. Para detalles adicionales ver, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2da edición, Sambrook y colaboradores, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas técnicas y protocolos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN dentro de las células y expresión génica, y análisis de proteínas, son descritas en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, eds., John Wiley and Sons, 1992.

Así, un aspecto adicional de la presente invención provee una célula huésped que contiene ácido nucleico heterólogo como se revela aquí.

El ácido nucleico de la invención puede integrarse dentro del genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula huésped. La integración puede ser promovida por inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma de acuerdo con técnicas estándar. El ácido nucleico puede estar sobre un vector extracromosómico dentro de la célula, o de lo contrario heterólogos identificables o extraños a la célula.

Un aspecto adicional más provee un método que incluye la introducción del ácido nucleico dentro de una célula huésped. La introducción, que puede referirse generalmente (particularmente para la introducción in vitro) a una "transformación" sin limitación, puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección de fosfato de calcio, DEAE-Dextrano, electroporación, transfección mediada por liposoma y transducción usando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacteriales, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación de cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando un bacteriófago. Como alternativa, podría emplearse la inyección directa del ácido nucleico.

Los genes marcadores tales como los genes para resistencia antibiótica o de sensibilidad, pueden utilizarse para identificar a los clones que contienen ácido nucleico de interés, son bien conocidos en el arte.

La introducción puede ser seguida causando o permitiendo la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando las celulas huésped (que pueden incluir células realmente transformadas aunque más probablemente las células serán desencadenantes de las células transformadas) bajo las condiciones para la expresión del gen para que se produzca el polipéptido codificado (o péptido). Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido líder de señal apropiada, puede ser secretado de la célula dentro del medio de cultivo. Después de la producción por expresión, puede aislarse un polipéptido o péptido y/o purificarse de la célula huésped y/o del medio de cultivo, según el caso, y usado seguidamente como se desee, por ejemplo, en la formulación de una composición que puede incluir uno o más componentes adicionales, tal como una composición farmacéutica que incluya uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos o transportadores (por ejemplo, ver más abajo).

Los polipéptidos útiles en la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las anteriores sustancias, un estabilizador, buffer, transportador, excipiente farmacéuticamente aceptable u otros materiales bien conocidos por aquellos entrenados en la técnica. Tales materiales deberán ser no tóxicos y no deberán interferir con la eficacia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del transportador o de otro material puede depender de la vía de administración, por ejemplo por vías intradérmica, oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal. La formulación es preferiblemente líquida, y es ordinariamente una solución fisiológica salina que contiene un buffer sin fosfato a pH 6,8-7,6, o puede ser un polvo liofilizado.

Las composiciones comprenden, o para la entrega de polipéptidos se administran preferiblemente a un individuo en una "cantidad terapéuticamente efectiva", siendo esto suficiente para mostrar beneficio para el individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y el tiempo necesario para su administración, dependerán de la naturaleza y severidad de lo que está siendo tratado. La prescripción del tratamiento, por ejemplo la decisión sobre la dosis, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales y de otros especialistas, y típicamente tienen en cuenta el desorden que va a ser tratado, la condición individual del paciente, el sitio de entrega, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Los polipéptidos de la invención son particularmente relevantes para el tratamiento de un cáncer existente y en la prevención de la recurrencia del cáncer después del tratamiento inicial o la cirugía. Ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados antes pueden encontrarse en el Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16 ^{ava} edición, Oslo, A. (ed.), 1980.

Preferiblemente, los polipéptidos de la invención estimulan a las células T ayudadoras y citotóxicas que pueden inhibir significativamente el crecimiento de células tumorales cuando se los administra a un humano en una cantidad efectiva. La dosis óptima puede determinarse por los médicos con base en un cierto número de parámetros que incluyen por ejemplo, edad, sexo, peso, severidad de la condición que está siendo tratada, del ingrediente activo que está siendo administrado y de la vía de administración. Por ejemplo, una dosis de 10-100 \mug de polipéptidos es suficiente para estimular la respuesta de las células T tanto citotóxicas como ayudadoras.

Los polipéptidos de la invención pueden administrarse junto con ingredientes farmacéuticamente aceptables adicionales. Tales ingredientes incluyen, por ejemplo, estimuladores del sistema inmunitario.

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya seas en forma simultanea o secuencial dependiendo de la condición que va a ser tratada. Otros tratamientos para el cáncer incluyen a otros anticuerpos monoclonales, a otros agentes quimioterapéuticos, otras técnicas de radioterapia u otra inmunoterapia conocida en el arte. Una aplicación particular de las composiciones de la invención es como auxiliares para las cirugías, esto es, para ayudar a reducir el riesgo de nueva ocurrencia de cáncer después de que un tumor es removido.

Las inyecciones (im) pueden ser la vía primaria para la administración terapéutica de los polipéptidos de esta invención. Las formulaciones líquidas pueden ser utilizadas después de la reconstitución de las formulaciones en polvo.

Los polipéptidos pueden administrase en forma localizada en el sitio del tumor o en otro sitio deseado, o pueden ser entregados en una forma en la cual se dirija al tumor o a otras células.

La dosis de polipéptido dependerá de las propiedades del agente empleado, por ejemplo, su actividad de enlazamiento y de su vida media en el plasma in vivo, de la concentración del polipéptido en la formulación, la vía de administración, del sitio y de la velocidad de la dosificación, de la tolerancia clínica del paciente involucrado, de la condición patológica que afecta al paciente y similares, así como con la experiencia del médico. Por ejemplo, se prefieren dosis de 100 \mug del polipéptido por paciente por administración, aunque las dosis pueden estar en el rango entre alrededor de 10 \mug hasta 1 mg por dosis. Se utilizan dosis diferentes durante una serie de inoculaciones secuenciales; el médico puede administrar una inoculación inicial y luego reforzar con dosis relativamente más pequeñas de anticuerpo.

Las composiciones del polipéptido de la invención pueden administrase en una variedad de formas y a diferentes clases de destinatarios. Ejemplos de los diferentes tipos de cáncer que pueden ser tratados con el anticuerpo incluyen cáncer colorrectal, de pulmón, de seno, cánceres gástrico y de ovario.

Esta invención está también dirigida a optimizar los programas de inmunización para mejorar la protección inmunitaria contra el cáncer. A este respecto, la invención provee ácido nucleico que codifica a un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza al CD64 y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos heterólogos de células T, que se administran en combinación con un polipéptido aislado o recombinante que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza al CD64 y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos heterólogos de células T. La administración del ácido nucleico y del polipéptido aislado o recombinante puede tener lugar ya sea simultánea o secuencialmente dependiendo de la condición que va a ser tratada. El ácido nucleico puede ser formulado como una vacuna de ADN tal como la descrita aquí.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para uno de los otros aspectos mutatis mutandis. Los documentos del arte previo mencionados aquí se incorporan en la máxima extensión permitida por la ley.

La invención será descrita ahora además en los siguientes ejemplos no limitantes. Se hace referencia a los siguientes dibujos:

Figura 1 - Anticuerpo monoclonal humano que estimula la proliferación de células T ayudadoras en donadores que expresan a los haplotipos HLA-DR, 1,3,7,11 y 15.

Figura 2 - Anticuerpo monoclonal humano que estimula las respuestas de proliferación de células T ayudadoras (\sqbullet). Los resultados muestran que la remoción del Fc para formar un fragmento Fab, reduce significativamente la sensibilidad de las células T a proliferar (*). No se observó respuesta a hIgG que no expresa a un epítopo de celulas T (\Box).

Figura 3 - Un anticuerpo monoclonal humano IgG1 que estimula las respuestas de proliferación de células T ayudadoras que son inhibidas por un exceso de hIgG que compite por el enlazamiento de Fc.

Figura 4 - Anticuerpo quimérico hIgG1 708 pero ni el IgG de ratón (\Diamondblack) ni humano (*) ni el medio solos estimularon la proliferación de linfocitos de los donantes naive.

Figura 5 - Anticuerpo quimérico humano IgG1 708 (\sqbullet) pero ni el 708 de ratón (\Diamondblack) ni el hIgG (*) inducidos redirigieron la muerte por parte de las células humanas CD8 T de una línea celular de ratón P815 recubierta con anticuerpo OKT3. La citotoxicidad fue evaluada por medio de la liberación de cromo a diferentes proporciones del efector objetivo.

Figura 6 - Ratones inmunizados respuestas inducidas por CTL con una vacuna ADN 105AD7 que reconoce a las células objetivo pulsadas con péptido CDRH3.

Figura 7 - HLA emparejado con IgG1 708 humano pueden estimular a las células citotóxicas T que reconocen a las células tumorales que expresan al antígeno CEA. Estos resultados muestran que 708 imita a un epítopo de células T procesadas y presentadas desde los antígenos CEA que son expresadas por las células objetivo.

Figura 8 - Ensayo Citotóxico de Células T con cebamiento de ADN/Refuerzo de Proteína (los símbolos abiertos se refieren a las células objetivo pulsadas con péptido irrelevante; los símbolos cerrados se refieren a ratones pulsados con péptido H-2Kd).

Figuras 9a y 9b: a. Anticuerpo del Vector de Expresión de Cadena Pesada Anticuerpo b. Vector de Expresión de Cadena Liviana.

Figuras 10a y 10b: a. Efecto de las inserciones de aminoácido C-terminal. FLWGPRALV en los CDR SC100 b. Efecto de las inserciones de aminoácido C-terminal. Porcentaje de cambio del FLWGPRALV nativo en los SC100 CDR.

Figura 11. Efecto de las Sustituciones de Aminoácido C-Terminal sobre el valor Y de NetChop de Tirosina (TPPAYPPNAPIL); Epítopo Ayudador T en SC100 CDR-L1.

Figura 12. Modelo Molecular de la Región Fv del Anticuerpo SC100.

Figura 13. Rayos X de la Estructura Cristalina del Epítopo Ayudador T, TPPAYRPPNAPIL.

Figura 14. Modelo Molecular de la Región Fv del Anticuerpo SC100 (vista superior).

Figura 15. Representación diagramática de Mutación PCR.

Figura 16. Representación en Gel de Agarosa de la Mutación PCR CTL1 L3.

Figura 17. Representación en Gel de Agarosa de los Resultados PCR Asimétricos Mutacionales.

Figura 18. Análisis por PCR de las Mutaciones de la Secuencia CDR-L3.

Figura 19. Resultado de la Secuenciación del ADN del Clon 74:1

Figura 20. Resultado de los Ensayos con CTL

Figura 21. Proliferación del Clon de Células T por Tie-2 Fc Presentado por Dendritic Cells.

Ejemplos Material y métodos Antígenos

105AD7 es un anticuerpo monoclonal humano IgGI (Austin y colaboradores, (1989) Immunol, 67:525-530) purificado a partir del sobrenadante del cultivo de tejido sobre una columna de proteína G. Fab fue producida utilizando papaina inmovilizada (Pierce, Chester, Reino Unido), proteína A removida de Fc y fraccionamiento por tamaño sobre sefarosa S400 (Pharmacia, Upsala, Suecia). El IgG policlonal humano (Sigma, Poole, Reino Unido) fue usado como antígeno de control para medir las respuestas inmunes naive. 708 es un anticuerpo monoclonal 1gG2b de ratón purificado a partir del sobrenadante del cultivo de tejido sobre una columna de proteína A (Durrant y colaboradores, (1992) Int. J. Cancer 50: 811-816).

Se preparó 708 quimérico en líneas generales de acuerdo con el protocolo de (Orlandi y colaboradores, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci (Estados Unidos) 86: 3833-3837). Se utilizó PCR para enlazar las secuencias de la región variable de las cadenas pesada y liviana del hibridoma 708 con secuencias de flanqueo de los vectores M13-VHPCR1 y M13-VKPCR1 respectivamente. El casete resultante de la región variable de la cadena pesada fue subclonado dentro de un vector de expresión pSVgpt de mamífero que contenía una región humana constante de cadena pesada. En forma similar el casete 708 de la región variable de cadena ligera fue subclonado dentro de un vector de expresión pSVhyg que contenía una región humana constante de cadena kappa. Los vectores fueron linealizados con Pvul y cotransfectados dentro de una línea NSO de mieloma de ratón que no segrega por medio de electroporación. El crecimiento de transfectomas en placas de 96 pozos fue seleccionado por medio del desarrollo en el medio que contenía xantina y ácido micofenólico y sobrenadantes muestreados para la producción de inmunoglobulina humana después de 14 días. El muestreo se hizo por medio de ELISA, desarrollada con un reactivo específico de cadena kappa antihumana (The Binding Site, Birmingham, Reino Unido). La línea que más producía fue expandida para la producción de anticuerpos, y el anticuerpo quimérico fue preparado utilizando una preparación de agarosa de proteína A y con las condiciones recomendadas por el proveedor (Bioprocessing Ltd. Consett, Reino Unido).

Estimulación in vitro de sangre de donantes no inmunizados

Las muestras de sangre venosa de los donantes sanos normales fueron colocadas sobre heparina libre de preservativos de los donantes. Toda la sangre había sido tipificada con HLA utilizando sondas moleculares. Las muestras de sangre se separaron sobre lymphoprep (Flow Laboratories, Irvine, Escocia) y sobre células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aislada en la interfase plasma/lymphoprep. Se removió una muestra de las PBMC, se la irradió y se la utilizó como células que presentaban antígeno. Las PBMC restantes fueron vaciadas de las células CD45RO por vaciado con glóbulos magnéticos (Dynal, Oslo, Noruega). Las células CD45RA fueron utilizadas en una concentración de 2 x 10^{6}/ml en suero libre de AIMV (Life Technologies, Paisley, Escocia) suplementado con glutamina 4 mM. Ellas fueron estimuladas con 105AD7 (0,003-30 g/ml), 105AD7 Fab (0,01-30 g/ml), anticuerpo IgG humano de control (10 g/ml), 708 de ratón (10 g/ml) ó 708 quimérico (10 g/ml). Para evaluar la inhibición de la proliferación de células Tpor medio de cloroquina o NH_{4}Cl, las células que presentaban antígeno fueron pulsadas con 105AD7 durante 2 horas con o sin la presencia de los inhibidores. Las células que presentaban antígeno fueron lavadas entonces antes de la adición de las células T naive. Todos los cultivos fueron incubados en atmósfera húmeda de CO_{2} al 5% y 95% de aire a 37ºC. Después de 5 días se añadió IL-2 (10 U/ml; Eurocetus, Reino Unido). La proliferación de linfocitos naive fue cuantificada después de 7-10 días. La proliferación fue estimada utilizando la incorporación de timidina
^{3}[H] en muestras por cuadruplicado. Esto fue realizado resuspendiendo la masa de los cultivos, removiendo alícuotas de células de 4 x 1001 y sembrando nuevamente en placas de 96 pozos antes de pulsar durante la noche con timidina ^{3}[H].

Secreción de citoquina

\GammaIFN e IL-4 fueron detectados usando un ELISA de fase doble, utilizando anticuerpos DuoSet (Genzyme, Cambridge, MA).

Inmunofluorescencia

Las células mononucleares de sangre periférica (2 x 10^{5}) fueron incubadas con un panel de anticuerpos monoclonales marcados directamente con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) por análisis dual de color de subconjuntos de linfocitos. Los anticuerpos probados fueron 2H4 FITC (CD45RA) en combinación ya sea con CD4-PE o CD8-PE para enumerar de memoria o para el ayudador activado T y las células citotóxicas T, respectivamente. Los anticuerpos se obtuvieron con Becton Dickinson (Cowley, Oxford, Reino Unido). Después de incubación por 30 min a 4ºC, las PBMC fueron lavadas dos veces por centrifugación y analizadas utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA).

Citotoxicidad Redireccionada

Los linfocitos libres de CD45RO de donadores normales, fueron estimulados por 9-10 días como sed escribe más arriba, y se ensayó entonces su actividad lítica por medio de un ensayo de citotoxicidad redirigida. Las células P815 fueron marcadas con cromo (10^{6} células marcadas con 100 \muCi de cromo ^{51}[Cr] por 1 hora a 37ºC) y lavadas en forma extensiva. Las células marcadas fueron entonces recubiertas con anticuerpo OKT3 (20 \mug/ml, 30 min, 5 x 10^{3}/pozo a 4ºC). Las células respondedoras fueron mezcladas con 10^{4} células objetivo marcadas con cromo para producir una relación de 100:1-12,5:1. La liberación de cromo fue medida en 50 \mul de sobrenadante a las 4 horas. El porcentaje de cromo liberado y la citotoxicidad fueron calculadas como sigue:

\frac{\text{ensayo de cpm - liberación espontánea de cpm}}{\text{liberación máxima de cpm - liberación espontánea de cpm}} x 100 = % de citotoxicidad

Ensayo de competencia

CEA (purificado por cromatografía de afinidad a partir de la metástasis al hígado del cáncer colorrectal) fue colocado sobre placas de microtitulación (5 \mug/ml) para incubación durante la noche a 4ºC. Las placas fueron bloqueadas con BSA al 1%. Los anticuerpos 708 de ratón o quimerizados fueron preincubados con NCRC23 biotinilado (Ab1) por 1 hora a 4ºC antes de la adición a las placas recubiertas con CEA. El enlazamiento del NCRC23 biotinilado se detectó con estreptavidina conjugada con peroxidasa rábano picante (SA-HRP; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD). El ELISA se desarrolló con solución de sustrato ABTS (Sigma) (0,50 \mug/ml, 2,2’-azino-bis-3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato) en 15 ml de buffer fosfato citrato 0,1 , pH 4,0, con peróxido de hidrógeno 30 v/v añadidos a 0,3 \mul/ml inmediatamente antes de usarlo.

Se leyó la absorbancia a 405 nm.

Estadísticas

Los datos inmunológicos del ensayo fueron analizados por medio de un análisis de varianza, utilizando el método modificado de Bonferroni de la diferencia menos significativa para permitir comparaciones múltiples (SPSS/PC Chicago, IL).

Resultados

Ejemplo 1

Para determinar si un anticuerpo monoclonal humano podría presentar epítopos de células T a partir de su región CHDRH3, se enriquecieron los linfocitos de la sangre periférica de los donantes normales con CD45RA, con linfocitos descebados y luego fueron estimulados con 105AD7 o con IgG humano de control. La Figura 1 muestra las respuestas de proliferación de los linfocitos de 6 donantes naive para la estimulación in vitro de 105AD7 (10 \mug/ml:'), IgG humano (10 \mug/ml:\Diamondblack) KLH (10 \mug/ml:\bullet) o medio solo (\blacktriangle). La proliferación fue evaluada a los 7, 8, 9 y 10 días del cultivo in vitro y medida por medio de un pulso nocturno con timidina-^{3}[H]. Los resultados fueron analizados por su significado estadístico por medio del análisis de varianza de un factor, usando el método modificado de Bonferroni de la diferencia menos significativa para permitir múltiples comparaciones. Los donantes que expresan los fenotipos HLA/DR1,3,7,11 y 15, mostraron una respuesta significativa al 105AD7 pero no al IgG humano. El único no respondedor consistente tenia un fenotipo HLA/DR4,8 sugiriendo que esos haplotipos son no permisivos. La proliferación de 105AD7 seleccionado a los 8-10 días en todos los donantes indica respuestas cinéticas primarias.

Ejemplo 2

Los inmunofenotipos de las células que responden a 105AD7 fueron medidos por medio de inmunofluorescencia y citometría de flujo (Tabla 1). Al comienzo de los cultivos había el doble de células T CD4 que de células CD8, y más del 80% de los cultivos expresaron al antígeno CD45RA. Después de 10 días, los cultivos estimulados con 105AD7 tenían 4,4 veces más células CD4 que células CD8 sugiriendo que fueron las células CD4 las que proliferaron en forma predominante. Sin embargo, este efecto no fue tan dramático como el observado en las células cultivadas con KLH, que después de 10 días habían 7 veces más células CD4 que células CD8. En forma muy interesante también hubo un cambio de la predominancia de las células CD45RA a las células CD45RO en respuesta a la estimulación con 105AD7, aunque nuevamente la respuesta fue más marcada en los cultivos con KLH. Aunque hubo una pequeña proliferación de IgG humano, no fue significativa. Los sobrenadantes de los cultivos fueron analizados para determinar si las células estuvieron produciendo \gammalFN (Tabla 1) o IL-4. El sobrenadante tanto de el 105AD7 como del KLH, pero no el IgG humano, estimularon a los cultivos que contenían \gammalFN. IL-4 no fue detectado en ninguno de los cultivos. Aunque el tipo predominante de células que proliferaba en respuesta al 105AD7 fueron las células CD4, había aún un número significativo de células CD8 dentro de estos cultivos. Para determinar si estas células eran capaces de lisis celular, fueron evaluadas en un ensayo de citotoxicidad redirigida. Se observó una mortandad significativa en todas las proporciones efector a objetivo. En contraste, no se observó mortandad ni en los cultivos estimulados por IgG humano ni por KLH. El último fue de particular interés ya que KLH había inducido la proliferación de ambos y la secreción de \gammalFN. Sin embargo, muy pocas células CD8 permanecieron en los cultivos con KLH en el día 10, sugiriendo que las células CD4 mediaron predominantemente la respuesta a este antígeno.

TABLA 1

Subconjuntos de células T y producción de \gammalFN por los linfocitos de los donantes
naive cebados in vitro con 105AD7
Estimulante	Proporción de subconjuntos de	\GammalFN	Citotoxicidad Redirigida
	células T^{1}	(pg/ml)^{2}	(% de citotoxicidad)^{3}
	CD4/8 pre	CD4/8 post	CD45RO/RA post		100:1	50:1	25:1	12,5:1
105AD7	2,3	4,4	2,0	750	34\pm2	22\pm3	15\pm1	7\pm1
HIgG	2,3	2,3	1,0	<62,5	6\pm1	1\pm0,2	1\pm0,2	ND
KLH	2,3	6,9	6,5	\text{>>}1000	2\pm0,01	2\pm0,2	0\pm0,1	1\pm0,1

Los linfocitos de los donantes naive se analizaron frescos (pre) o fueron estimulados (post) in vitro ya sea con 105AD7 (10 \mug/ml), IgG humano (10 \mug/ml), o KLH (30 \mug/ml). Los cultivos se analizaron para:

1.

El porcentaje de linfocitos que expresan CD4, CD6, CD45RO y CD45RA. Los antígenos fueron medidos por medio de inmunofluorescencia de dos colores y analizados por citometría de flujo.

2.

La producción de \gammaIFN fue medida en los sobrenadantes del cultivo en el día 10 por ELISA de fase doble (rango 62,5-1000 pg/ml).

3.

La citotoxicidad redirigida fue medida por medio de la habilidad para matar a las células P815 marcadas con cromo ^{51}[Cr] recubiertas con anticuerpo OKT3 con diferentes proporciones de células efectoras:objetivo. Se detectó una mortandad significativa en los cultivos con 105AD7 en las proporciones de efector celular: objetivo.

Ejemplo 3

Habiendo establecido un ensayo de proliferación in vitro reproducible sobre los donantes naive, este sistema de cultivo fue usado para investigar si la región Fc del 105AD7 era importante para estimular la proliferación de células T. La región Fc del 105AD7 fue removida para formar un fragmento Fab. Las respuestas de proliferación de linfocitos de los donantes naive para la estimulación in vitro con el fragmento Fab del 105AD7 (0,01-30 \mug/ml; \bullet), para 105AD7 (0,003-30 \mug/ml;'), o IgG humano (0,01-10 \mug/ml; \Diamondblack). La proliferación se evaluó en el día 9 del cultivo in vitro y se midió por medio de un pulso nocturno con timidina-^{3}[H]. Los resultados fueron analizados por su significado estadístico por medio de un análisis de varianza de un factor, utilizando el método modificado de Bonferroni de la diferencia menos significativa para permitir comparaciones múltiples. Aunque tanto 105AD7 como Fab estimulan una proliferación significativa, la Figura 2 muestra que Fab fue 1000 veces menos eficiente para la estimulación de la producción de células T que el anticuerpo completo.

Ejemplo 4

Más evidencia sobre el papel de Fc en la estimulación de las respuestas de las células T por el 105AD7, fue proporcionada por los estudios de competencia entre 105AD7 y el IgG humano (Figura 3). Las respuestas de proliferación de los linfocitos de los donantes naive en el día 9 de la estimulación in vitro con 105AD7 (10 \mug/ml;') en presencia de 0-1000 \mug/ml de IgG humano, o la estimulación con IgG humano (\Diamondblack) solo con 0-1000 \mug/ml. La proliferación fue evaluada con cultivos por cuadruplicado y medida por medio de un pulso nocturno con timidina-^{3}[H]. Los resultados fueron analizados por su significado estadístico por medio de un análisis de varianza de un factor, utilizando el método modificado de Bonferroni de la diferencia menos significativa para permitir comparaciones múltiples. La proliferación del 105AD7 se inhibió significativamente por medio de la adición de 300-1000 \mug/ml de IgG humano. Un exceso de tres y diez veces de IgG humano inhibió significativamente la proliferación de células T en un 15% y en un 66% respectivamente. No se observó una respuesta significativa de proliferación del IgG humano a ninguna concentración.

Ejemplo 5

Para investigar si 105AD7 era único o si la presentación de los epítopos de células T de otros anticuerpos podría ser mejorada por medio de la incorporación mejorada de Fc, se estudió un segundo anticuerpo. 708 es un anticuerpo monoclonal IgG2b de ratón que emita a CEA y puede estimular las respuestas de las células T in vitro en los linfocitos de los pacientes con cáncer colorrectal. Sin embargo, 708 falló en estimular a las células T humanas no cebadas de los donantes sanos. Su región Fc de ratón fue remplazada por lo tanto con Fc humano para ver si esto mejoraba su habilidad para estimular las respuestas de las células T. Se produjo el anticuerpo quimerizado y mostró un enlazamiento similar al antiideotipo de ratón tanto como el 708 de ratón y el quimerizado inhibieron el enlazamiento de Ab1, con CEA. Se investigó la estimulación de las células T primarias de los donantes sanos tanto para los anticuerpos 708 de ratón como los quiméricos. Las respuestas de proliferación de los linfocitos de los donantes naive para la estimulación in vitro con 708 quimérico (10 \mug/ml; '), 708 de ratón (10 \mug/ml;\Diamondblack) o IgG humano (10 \mug/ml;\bullet) o medio solo (\blacktriangle). La proliferación fue evaluada a los 7,8,9 y 10 días del cultivo in vitro y medida por medio de un pulso nocturno con timidina-^{3}[H]. Los resultados fueron analizados por su significado estadístico por medio del análisis de varianza de un factor, usando el método modificado de Bonferroni de la diferencia menos significativa para permitir múltiples comparaciones. La Figura 4 muestra que solamente el 708 quimérico y no el 708 de ratón indujeron una respuesta de proliferación significativa cuando se los comparó con el medio solo indicando la importancia de una región constante IgG1 humana.

Ejemplo 6

La estimulación de las células T primarias de los donantes sanos tanto del anticuerpo 708 quimérico como del de ratón fue investigada por su producción de citoquina. Los sobrenadantes de estos cultivos muestran que el anticuerpo quimerizado, pero no el antiidiotipo de ratón, indujeron la secreción de \gammalFN (Tabla 2).

TABLA 2

Secreción de \gammalFN en cultivos de linfocitos de donantes no inmunizados, estimulada con
anticuerpos 708 de ratón o quiméricos
Inmunogén	\gammalFN (pg/ml)
	Estimulación primaria	Estimulación secundaria
708 quimérico	250\pm1	1125\pm60
708 de ratón	<62,5	<62,5
IgG humano	<62,5	<62,5
medio	<62,5	<62,5

Los linfocitos de los donantes naive fueron estimulados in vitro con 708 quimérico (10 \mug/ml), 708 de ratón (10 \mug/ml), IgG humano (10 \mug/ml) o sin antígeno (medio). La producción de \gammalFN en los sobrenadantes del cultivo fue medida por medio del ELISA de fase doble (rango 62,5-1500 pg/ml), seguido por estimulación primaria durante 10 días, o 5 días después de la reestimulación.

Ejemplo 7

Fue de interés determinar si el anticuerpo 708 quimerizado podría estimular también a la células CD8 no cebadas para convertirlas en células T efectoras líticamente activas. La Figura 5 muestra citotoxicidad redirigida después de a) 9 días del cultivo primario in vitro o b) 5 días después de la reestimulación ya sea con 708 de ratón (\Diamondblack), 708 quimérico (') o IgG humano (\bullet). La citotoxicidad fue evaluada por la mortandad de las células P815 marcadas con cromo ^{51}[Cr] recubiertas con anticuerpo OKT3 con diferentes proporciones de células efectoras:objetivo. El 708 quimerizado pero no el 708 de ratón o el IgG humano pudieron estimular a las células T para inducir una lisis celular significativa. Estos cultivos podrían ser alentados por medio de una estimulación adicional in vitro para producir un nivel más alto de citotoxicidad (Figura 7b).

Ejemplo 8

Para probar que los epítopos citotóxicos de las células T dentro del anticuerpo monoclonal humano 105AD7 estaban presentes en la región CDRH3 de este anticuerpo IgG1 humano. 105AD7 fue reconfigurado como una vacuna de ADN scFv por medio de clonación del anticuerpo y luego uniendo las regiones hipervariables de la cadena ligera y la pesada ya sea con un enlazador (scFv-15) de 15 aminoácidos o con un enlazador (scFv-5) de 5 aminoácidos. Alternativamente, la región CHRH3 del 105AD7 fue clonada y empalmada a su secuencia líder para formar un minigén. Estas construcciones de ADN del 105AD7 fueron utilizadas para inmunizar ratones balb/c por medio de una inyección intramuscular de 100 \mug de ADN mezclados con un oligonucleótido CpG. La Figura 6 muestra las respuestas CTL después de la vacunación con A) scFv-15, B) scFv-5, C) el minigén y D) el vector de control pCR3.1. Los ratones fueron vacunados en las semanas 0, 2 y 7 y los bazos fueron recogidos a las 8 semanas. Los esplenocitos fueron cultivados in vitro durante 6 días con 105AD7. Las células objetivo fueron marcadas con ^{51} Cr +/- el péptido CDRH3. La lisis específica de las células fue medida entonces utilizando proporciones de efector:objetivo de 100:1 hasta 12,5:1. Los ratones inmunizados con la vacuna de ADN 105AD7 estimularon las respuestas citotóxicas de las células T contra las células objetivo pulsadas con el péptido CDRH3.

Ejemplo 9

Para probar que el anticuerpo 708 desinmunizado presentó un epítopo citotóxico de células T de un antígeno asociado con un tumor. La Figura 7 muestra la citotoxicidad después de 28 días del cultivo primario in vitro de los linfocitos humanos con el 708 desinmunizado (') con una reestimulación en los días 7, 14 y 21. La citotoxicidad fue evaluada por la mortandad de las células tumorales humanas marcadas con cromo ^{51}[Cr] que expresan CEA en diferentes proporciones de células efectoras:objetivo. Los 708 desinmunizados podrían estimular a las células T para inducir una lisis significativa de las células de las células objetivo emparejadas con HLA que expresan CEA.

Ejemplo 10

Optimización del protocolo de inmunización in vivo. 105AD7 fue utilizado como ejemplo de una región Fc humana enlazada a un epítopo CTL de ratón H-2Kb. 105AD7 fue reconfigurado como una vacuna de ADN scFv por clonación del anticuerpo y luego uniendo las regiones hipervariables de las cadenas pesada y liviana con un enlazador de 5 aminoácidos. Este ADN fue recubierto sobre partículas de oro y este ADN fue administrado a ratones balb/c en forma intradérmica utilizando GeneGun acompañado de helio (Biorad laboratories Limited, Hemel Hempstead, Reino Unido). Cuatro grupos de animales fueron inmunizados ya sea con ^{1}1) tres inyecciones de ADN con adyuvante CpG, 2) una inmunización con ADN y dos con proteína de 105AD7 con adyuvante CpG, 3) tres inmunizaciones con proteína de 105AD7 con adyuvante CpG ó 4) tres inmunizaciones con proteína de 105AD7 y adyuvante de Freund como se describió o por medio d inyección intramuscular de proteína de 105AD7 (ver Tabla 3). Los esplenocitos fueron cosechados dos semanas después. Los ratones naive fueron utilizados para producir celulas alimentadoras para la estimulación del péptido in vitro por medio de una técnica estándar basada en la producción de células blásticas estimuladas por lipopolisacáridos (LPS). El día tres, estas células blásticas LPS fueron irradiadas y se añadió el péptido H-2Kd (100 \mug por 2 x 10^{7} células incubadas en 1 mL) durante 1 hora. Estas células fueron lavadas entonces y utilizadas como células alimentadoras para los eplenocitos de los ratones inmunizados. Después de 5 días de incubación, estas células fueron enviadas para un experimento de rutina de células T citotóxicas. Se establecieron los ensayos para analizar la respuesta contra un péptido irrelevante y el péptido H-2Kd.

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TABLA 3

Programa de Vacunación
week	0	2	4	6
1	ADN + CpG Gene Gun	ADN + CpG Gene Gun	ADN + CpG Gene Gun	Ensayo de Células
				T Citotóxicas
2	ADN + CpG Gene Gun	Proteína + CpG IM	Proteína + CpG IM
3	Proteína + CpG IM	Proteína + CpG IM	Proteína + CpG IM
4	Proteína + IFA IM	Proteína + IFA IM	Proteína + IFA IM

Solamente el grupo que recibe un cebado de ADN y dos inmunizaciones reforzadoras de proteína mostraron una respuesta CTL (Figura 8). Estos resultados sugieren que una combinación de cebado de ADN y reforzamiento de proteína producen respuestas óptimas de CTL.

Ejemplo 11

Injerto de un epítopo CTL de la proteína MAGE-3 en un anticuerpo desinmunizado

El anticuerpo que se seleccionó para entregar los determinantes de CTL es el anticuerpo SC100 desinmunizado (WO 01/88138). El uso de un anticuerpo desinmunizado es conveniente en su utilidad como un sistema para entrega del epítopo ya que el protocolo de desinmunización remueve a cualquier epítopo preexistente de células T. Esto asegura un transportador inmunológicamente inerte que dirige las respuestas inmunes contra el inmunocuerpo en si mismo para que se basen en aquellos epítopos injertados dentro de los CDR.

El epítopo escogido para el análisis inicial es un epítopo de CTL basado en el antígeno MAGE-3 que es sobrexpresado por el melanoma maligno.

En la Figura 9a, el vector de expresión de cadena pesada pSVgpHulgG1 se basa en pSV_{2}gpt (Mulligan y Berg, (1980) Science, 209: 1422-1427). Incluye el gen de resistencia a la ampicilina para selección en células bacteriales, el gen gpt para selección en células de mamífero, la región reforzadora de la inmunoglobulina de cadena murina pesada, secuencia genómica que codifica el gen de la región constante IgG Humana y secuencias poli A SV40. La región variable de cadena pesada para expresión se inserta como un fragmento Hind111 para BamH1. Este casete de expresión incluye al promotor de cadena murina pesada, la secuencia que codifica al péptido de señal y al intrón de secuencia de señal, al gen V_{H}, a la secuencia donante de empalme V-C y a las secuencias del intrón. Los sitios entre paréntesis han sido removidos.

En la Figura 9b, el vector de expresión de cadena liviana pSVhygHuC\kappa se basa en el vector pSVhyg. Incluye al gen de resistencia a la ampicilina para la selección en células bacteriales, al gen hyg para selección en células de mamífero, a la región reforzadora de inmunoglobulina de cadena murina pesada, a la secuencia genómica que codifica al gen Humano de la región constante capa e incluye al reforzador capa y a las secuencias poli A SV40. La región variable de cadena liviana para expresión se inserta como un fragmento Hind111 al fragmento BamH1. Este casete de expresión incluye al promotor murino de cadena pesada, a la secuencia que codifica al péptido de señal y al intrón de secuencia de la señal, al gen V\kappa, a la secuencia donadora de empalme V-C y a las secuencias del intrón. Existen 3 sitios EcoR1 al interior de HuC\kappa. Los sitios entre paréntesis han sido removidos. El vector pSVhygHuCº fue obtenido con G Winter, Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, Reino Unido. El gen de la región constante en el vector fue reemplazado con un gen humano de la región constante Kappa de ADN placentario. Con el propósito de mantener la integridad de los vectores de expresión después de mutación se ideó una estrategia que utilizaría los sitios de restricción de HindIII y BamH1 en cualquiera de los dos extremos de las regiones de codificación VH y VL (ver Figuras 9a y 9b) para eliminar la secuencia nativa SC100 y reemplazarla con la secuencia del InmunoCuerpo injertado CDR.

De esta forma, solamente la región injertada diferiría de la secuencia de expresión que ya había probado ser exitosa en la producción de moléculas de anticuerpo.

Ya que el anticuerpo contiene 6 CDR (3 sobre la cadena pesada y 3 sobre la cadena liviana), puede ser posible reemplazar cualquiera de estas regiones con el epítopo MAGE-3. Sin embargo, existen ciertas restricciones estructurales sobre esta generalización, determinadas por la naturaleza del epítopo que va a ser introducido y del sitio aceptor CDR que lo recibirá. Serias perturbaciones de la estructura secundaria del anticuerpo en el sitio del empalme pueden tener un efecto perjudicial sobre el repliegue de la proteína hasta un grado en que se afecta la función inmune. Una aproximación más racional basada en la necesidad de preservar tanto la estructura del anticuerpo en sí mismo, y más importante aún, permitir a un elemento de control en el procesamiento último de los epítopos, sería de beneficio en el diseño de una molécula InmunoCuerpo. A este respecto, se ideó una estrategia basada tanto en el uso de algoritmos que predicen la escisión proteolítica de la molécula y el modelamiento molecular del anticuerpo nativo e injertado.

Escisión Proteolítica

Los algoritmos basados en la red (accesibles por Internet) (ver Tabla 4) fueron utilizados para escrutar la secuencia primaria SC100 para los sitios de escisión proteosomal predichos. Este es un intento por identificar una jerarquía potencial de los sitios del aceptor CDR, que permitirían un procesamiento favorable del InmunoCuerpo internalisado. Esto permitiría la liberación de los epítopos injertados para su presentación en una forma más controlada y definida.

TABLA 4

Sitios en Internet de Algoritmos para Escisión Proteolítica
Algoritmo	NetChop*	PAProC
Autores	C. Kesmir, A. Nussbaum, Hansjorg	C. Kuttler, A. Nussbaum, T.P. Dick,
	Schild, Vincent Detours, y S. Brunak	H-G. Rammensee y H. Schild
Referencias	Manuscrito presentado (C. Kesmir,	J. Mol. Biol. 298: 417-429 (2000)
	comunicación personal)	Immunogenetics 53: 87-94 (2001)
Dirección de Internet	www.cbs.dtu.dk/services/NetChop	www.uni-tuebingen.de/uni/kxi

Por lo tanto, los análisis emprendidos fueron específicos para producir el InmunoCuerpo, tanto en términos de la estructura del anticuerpo InmunoCuerpo que se utiliza como de las secuencias del epítopo que se injertan sobre esta estructura. Los experimentos de predicción iniciales, analizaron la incorporación del epítopo MAGE3 CTL (FLWGPRALV) y del epítopo ayudador T (TPPAYRPPNAPIL) en cada uno de los CDR SC100. En cada análisis, la totalidad de la secuencia primaria del anticuerpo fue escrutada con relación a las influencias de los residuos de la región de flanqueo que deben ser tenidas en cuenta. Los resultados de los análisis de PaProC y de NetChop se resumen en la Tabla 5.

TABLA 5a NetChop Versión 1.0. Número de Sitios de Escisión Predichos

Sitio del Injerto		Epítopo
CDR		Nativo	CTL	T Ayudador
H1		0	0	X	1	X
H2		0	0	X	1	\surd
H3		1	0	X	1	X
L1		2	0	X	1	\surd
L2		1	1	X	1	X
L3		1	0	X	1	X

TABLA 5b PaProC Número de Sitios de Escisión Predichos

Sitio del Injerto		Epítopo
CDR		Nativo	CTL	T Ayudador
H1		0	1	5	X
H2		3	2	5	\surd
H3		3	1	4	X
L1		6	2	6	X
L2		3	2	5	X
L3		2	1	4	\surd
Clave: "\surd" igual a la escisión C-terminal del péptido epitópico
\hskip1cm "X" igual a ausencia de escisión C-terminal

NetChop, establece un umbral por defecto de 0,8 predicciones de ausencia de escisión interna del péptido CTL cuando empalma dentro de H1, H2, H3, L1 y L3 (Tabla 5b). la inserción dentro de L2 produce un sitio de escisión C-terminal después del residuo terminal F. Existe un sitio de escisión interna para todas las inserciones ayudadoras T en donde el residuo aminoácido Y se escinde en el N-terminal. NetChop también predijo que no existen sitios de escisión C-terminal para el epítopo CTL, pero el epítopo ayudador T en H2 y L1 se escinden en su C-terminal.

PaProC es más difícil de analizar empíricamente, ya que se generan múltiples sirios de escisión por cada epítopo, especialmente para el ayudador T. Con base en los datos presentados aquí, las futuras manipulaciones de la secuencia deberían iniciarse por lo tanto con el análisis de CTL en H1, H3 y L3 y el ayudador T en H3 y L3.

Estos estudios aunque únicamente predictivos por naturaleza, indican que precauciones deben tomarse cuando se diseña la combinación de epítopos que se insertan y los sitios aceptores usados. La estructura de los epítopos acoplados a la secuencia de los CDR y a la región de flanqueo pueden finalmente tener efectos sobre el procesamiento y la presentación de los epítopos por si mismos. Aquí, NetChop ha dado una indicación en particular de la probabilidad de los problemas que surgen con la escisión interna de los epítopos injertados. Esto tendría obviamente un efecto nocivo terminal sobre la presentación de estos epítopos por las células que presentan antígeno.

El dogma de procesamiento actual decreta que durante el procesamiento del epítopo en el ambiente del proteosoma, la escisión C-terminal ocurre en este extremo del péptido. Este es un agudo contraste con el patrón de escisión en el N-terminal, en donde la escisión ocurre en un sitio a cierta distancia secuencia arriba del N-terminal. El péptido es entonces cortado por la actividad de las aminopeptidasas N-terminales hasta que el epítopo logra la longitud requerida para la presentación del péptido asociado MCH. Por lo tanto puede ser posible controlar la escisión en el C-terminal del epítopo en cuestión, proveyendo a lo largo de el, en el injerto, un residuo que es propenso a escisión cuando es colocado en este medio. Esto permitiría que el proceso se iniciara en una forma más precisa e incrementaría grandemente las posibilidades del péptido correcto de ser remitido para presentación. Nuevamente, los residuos que flanquean son de importancia para este proceso y su influencia debe ser tenida en cuanta. Teniendo en cuenta estos puntos, se procesaron una serie de secuencias experimentales por medio del algoritmo NetChop (Versión 1.0). En estos experimentos, tanto el epítopo CTL como el ayudador T, fueron injertados dentro de cada uno de los CDR, como se llevó a cabo previamente. Sin embargo, en cada sitio de injerto, el análisis de NetChop fue realizado después de la adición, en pasos individuales de cada uno de los 20 amino (o imido) ácidos. Los resultados de los análisis realizados con el epítopo CTL FLWGPRALV, más una variante adicional de aminoácido en el C-terminal, cuando se los inserta dentro de cada uno de los 6 CDR, se resumen en la Figura 10a. Los resultados se dan como un porcentaje del cambio inducido por la inserción del aminoácido C-terminal adicional a partir del valor obtenido por la inserción del epítopo solo (Figura 10b). Los resultados se corrigen por la escisión interna. Donde esto ocurre, el epítopo es por lo tanto destruido y no podrá ser presentado en una forma que valga la pena. El puntaje para estos eventos se da como si fuera el valor nativo, de modo que el cambio en porcentaje se registra como cero. Estos eventos son por lo tanto fácilmente identificables por escrutinio de la representación gráfica. La adición de algunos de los aminoácidos en el C-terminal del epítopo puede conducir a un incremento en la capacidad del epítopo para ser procesado exitosamente por escisión del C-terminal. Esto incluye a C, G, K, R y S y hasta cierto grado en CDR H1 únicamente, A. NetChop ha identificado también algunos aminoácidos, tales como F, I, P, V, W y Y cuyos efectos combinados a la secuencia SC100 impiden el procesamiento del epítopo. Por lo tanto se hace importante analizar la secuencia en el sitio de unión, de modo que el primer residuo (que hace parte del andamiaje del anticuerpo) secuencia abajo del epítopo empalmado, no consiste de uno de aquellos residuos que es probable que conduzca a un procesamiento inapropiado del epítopo. Esto puede dar un elemento más de control sobre el procesamiento resultante del epítopo por el antígeno presente en las células, permitiendo una apariencia de previsibilidad dentro de la formación del estimulante epitópico.

También determinado a través de los análisis predictivos usando inserciones de aminoácidos en el C-terminal, está la capacidad para predecir la remoción de un punto de empalme que está situado internamente dentro del epítopo injertado mismo. Un ejemplo de esto sería tratar de remover el sitio de escisión predicho en Y (subrayado) en la secuencia Ayudadora T TPPAYPPNAPIL (indicada para ser escindida en cada uno de los CDR, como se muestra en la Tabla 5a y 5b, columna 3 del epítopo). Los análisis han mostrado que la remoción de los sitios de escisión interna, puede ser posible utilizando la influencia de los aminoácidos ubicados en el C-terminal del epítopo (Figura 11). Aquí, la escisión C-terminal de la secuencia se altera hasta una posición que mantiene la integridad del epítopo que va a ser presentado, con los efectos benéficos obvios para la presentación del péptido. Algunos aminoácidos (tales como A, C, G, K, Q, R y S) disminuyen el valor interno de la tirosina en medio del epítopo y desvían la escisión hacia la leucina C-terminal, con efectos benéficos para la presentación de este epítopo. Nuevamente, parece ser importante tener en cuenta tales datos predictivos cuando se diseña tanto al epítopo como al punto de empalme para la producción de una construcción de un InmunoCuerpo viable.

Modelamiento Molecular del Anticuerpo SC100 y los Derivados Modelamiento del Fv

Los anticuerpos se prestan por si mismos al modelamiento molecular con relativa facilidad debido a su muy lata similitud de secuencia, aún en la así llamada región variable (Fv). También, han sido cristalizados un gran número de anticuerpos, cuyas coordenadas han sido depositadas en la base de datos de acceso público, el Protein Data Bank (PDB). Otros factores facilitan el modelamiento de anticuerpos tales como una clasificación canónica de las regiones en bucle en la Fv, que son primordiales para el normal funcionamiento del enlazamiento a un antígeno objetivo.

Las técnicas estándar de modelamiento por homología fueron empleadas para modelar la región Fv. Esto comenzó con la alineación de la secuencia del anticuerpo SC100 contra una base de datos de secuencias que corresponden con las estructuras cristalinas en el PDB. La cadena pesada (sin CDR3), la cadena liviana y CDR3 de la cadena pesada, fueron examinadas individualmente. Los resultados de estos análisis se muestran en las Tablas 6, 7 y 8.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Alineación de la Cadena Pesada (sin CDR3)

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1

TABLA 7 Alineación de la Cadena Pesada

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3

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Inicialmente:

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6

El alineamiento para el alineamiento de CDR-H3 fue descartado después de estudiar las reglas definidas por Morea y colaboradores, (1998) J. Biol. 275: 269-294). Estas muestran la especificidad de la secuencia en las posiciones YYCAX y XYWG, que determinan la presencia de beta-protuberancias en el bucle. La base de datos de la proteína fue revisada nuevamente por los bucles de longitud correcta, que tenían las secuencias YYCAR y DYWG. La secuencia entre estos dos puntos fue examinada muy de cerca por cualquier parecido con la secuencia SC100 CDR-H3, y se seleccionaron las estructuras cristalinas por rayos X con bucles de la misma longitud. Estas se muestran en la Tabla 9.

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TABLA 9 Secuencias CDR-H3 Seleccionadas con Longitudes de Cristal por Rayos X Similares a las de SC100

Código PDB	Secuencia	Elegida
Pregunta	YYCAR HYGHYVDYAVDY
1AP2	YYCAR REVYSYYSPLDV	\surd
1C12	YYCVT SLTWLLRRKRSY
1DEE	YYCAK VKFYDPTAPNDY	\surd
1DN0	YYCAR PPHDTSGHYWNY
1DSF	YYCGR SPIYYDYAPFTY
1IAI	YFCAR DGYYENYYAMDY	\surd
1IGA	YYCAR DPYGGGKSEFDY	\surd
1IGM	YYCAK HRVSYVLTGFDS	\surd
1IL1	YYCNA ISTTRDYYALDY
1JRH	YYCAR RAPFYGNHAMDY	\surd
1MNU	YYCSI IYFDYADFIMDY
1MPA	YYCSI IYFDYADFIMDY
1OSP	YYCAR SRDYYGSSGFAF
1QLR	YYCAR PPHDTSGHYWNY
1SBS	YYCTR GAYYRYDYAMDY	\surd
6FAB	YFCAR SEYYGGSYKFDY	\surd
8FAB	YYCAR DPDILTAFSFDY	\surd
1HEZ	YYCAK VKFYDPTAPNDY	\surd

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Estas secuencias fueron alineadas entonces fueron alineadas entonces para encontrar la secuencia más similar a la SC100. Esto se hizo utilizando el alineamiento de secuencia múltiple CLUSTAL W (1.81) (Tabla 10). De las secuencias identificadas, 1SBS fue escogida entre estos alineamientos como la plantilla para la modelación de CDR3.

TABLA 10 Alineación de Secuencia Múltiple CLUSTAL

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8

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Metodología de Modelamiento Molecular

Todo el modelamiento fue realizado sobre una estación de trabajo SGI Octane 2 R12000, usando Sybyl 6.7 (Tripos, Reino Unido).

La cadena liviana de 2JEL fue cargada y los residuos fueron mutados por aquellos de la secuencia requerida. Se añadieron entonces átomos de hidrógeno. Aquellos residuos que habían sido añadidos a la estructura fueron entonces minimizados como sigue:

\bullet

Solo átomos de hidrógeno (el resto de la proteína permaneció fija en su posición) fueron minimizados por 100 iteraciones de optimización de Steepest descent, seguido por el método de gradiente Conjugado hasta un criterio de convergencia de un derivado de energía de 0,01 Kcal/mol/angstrom2.

\bullet

A los átomos de la cadena lateral se les permitió moverse (el resto de la proteína se mantuvo) y se minimizaron como en la etapa 1.

\bullet

Los átomos de la cadena lateral y de la columna vertebral se les permitió moverse (el resto de la proteína se mantuvo) y se minimizaron como en la etapa 1.

El modelo fue sincronizado entonces al ojo, para asegurarse de no haber incorporado errores. Para la cadena pesada, la modelación se realizó como en la sección para la cadena liviana, pero CDRH3 había sido removido de la cadena de proteína. La minimización se realizó en la misma forma que en la cadena liviana.

El bucle CDR3 de la cadena pesada de 1SBS fue mutada por aquella del SC100. La estructura fue entonces sobrepuesta sobre el modelo de cadena pesada existente, usando residuos YYCAR y DYWG para posicionar al bucle. El bucle fue entonces injertado a través de su N-terminal sobre la estructura en posición, y a través de su C-terminal en posición. Se llevó a cabo la rotación manual de los diedros de la columna vertebral para traer de vuelta a la región de la estructura 4 a su posición usual (rareza de Sybyl). La unión de las regiones y los residuos recientemente incorporados fueron minimizados como antes.

Construcción VH-VL

Para proveer un modelo de Fv, las regiones construidas VH y VL tuvieron que ser traídas juntas como un par. Con el propósito de hacer esto, los alineamientos de la secuencia original fueron revisados para encontrar emparejamientos altamente alineados tanto en los puntajes de cadena pesada como liviana. Esta aproximación debe producir un Fv sobre el cual podríamos superponer al VH y al VL individuales usando los residuos conservados en la estructura. Las cinco principales estructuras alineadas se muestran en la Tabla 11. 1ATM fue escogida por la superposición del VH y del VL. Una vez que esto ha sido realizado, los residuos en la interfase VH-VL fueron revisados por malas coincidencias y minimizarlas en la medida necesaria. El Fv completo se muestra en la Figura 12. El modelo de la Fv fue revisado entonces utilizando PROCHECK (Laskowski y colaboradores, (1993) J. Appl. Crystallog 26: 283-291) para asegurarse de que las conformaciones de la columna vertebral y de la cadena lateral fueron de buena
calidad.

TABLA 11

Alineación de las Cadenas Pesada y Liviana para la Superposición de VH-VL
Muestra	Rango pesado	Rango liviano
1ATM	21	12
1CLZ	20	13
1BLN	14	20
2HIP	16	30
1CLY	18	31

Modelamiento de Incorporación del Epítopo

El propósito principal del ejercicio de modelación ha sido examinar la posibilidad de incorporar epítopos inmunológicamente activos dentro de los CDR del anticuerpo transportador SC100. Por lo tanto, en línea con los resultados del injerto de los experimentos de escisión proteolítica, se hicieron intentos para modelar a los péptidos epitópicos FLWGPRALV (CTL) y TPPAYRPPNAPIL (Ayudador T) en los SC100 CDR apropiados. Las combinaciones escogidas fueron:

\bullet

CTL en L3

\bullet

TH en L1

\bullet

CTL en H2

\bullet

TH en L3

Para ayudar en el modelamiento, ambas secuencias del epítopo fueron probadas contra la secuencia de la base de datos. El epítopo CTL1 produjo secuencias no relacionadas estrechamente. Los residuos del epítopo TH en la porción C-terminal de la proteína de la cápside viral (hbcag) de la hepatitis b Humana, que ha sido cristalizada (código PBD: 1QGT). Como puede observarse en la Figura 13, esta porción de la proteína existe en una forma extendida no estructurada, debido parcialmente al alto contenido de prolina en la secuencia. Los alineamientos iniciales de la secuencia se produjeron como una guía para la inserción de estos péptidos dentro del modelo de anticuerpo. Estos se muestran en la Tabla 11. Los residuos similares están resaltados en verde. Cada modelo se describe separadamente más abajo.

Inserción del Epítopo CDR-L1 TH

Como se había mencionado previamente, el epítopo TH que tiene un alto contenido de prolina, lo cual puede significar forzar la secuencia dentro de un bucle de horquilla a menudo observado en los CDR, puede ser muy difícil. Sin embargo, CDR1 en la cadena liviana se ubica en una conformación relativamente extendida a lo largo de la superficie superior del Fv. También, debido a que la mayor parte del bucle se observa cerca de la superficie, debe estar involucrado en menos restricciones estructurales como algunas partes que están enterradas dentro de la estructura. Esto está resaltado en la Figura 14. La secuencia TH fue incorporada dentro de la sección del CDR1 mostrada en la alineación que se observa en la Tabla 12. Los residuos que habían sido mutados fueron minimizados como antes. Hubieron pocos o ningún problema con la incorporación de este epítopo dentro del CDR1. Las pequeñas coincidencias de la cadena lateral fueron mitigadas por minimización.

TABLA 12 Alineaciones Originales para la Incorporación del Epítopo/CDR

9

Inserción del Epítopo CTL CDR-L3

Por el examen de las alineaciones anteriores, se pensó que el epítopo CTL podía tener una secuencia muy diferente a aquella del anticuerpo, que puede hacer difícil la modelación. Para resolver este problema, se usó un bucle de una estructura cristalina de un anticuerpo para modelar la secuencia insertada. La alineación se muestra más abajo, con los residuos similares resaltados:

10

Se observó a partir de la estructura del anticuerpo con la secuencia LW cerca del N-terminal del bucle, que la orientación de la cadena lateral del triptófano era inusual, y altamente conservada en anticuerpos con esta secuencia. Debido a que este es el grupo de cadena lateral más larga en ser incorporado a la secuencia del epítopo, la prioridad en la modelación fue el correcto posicionamiento del mismo. La secuencia GP encajó bien en la estructura observada de horquilla vista en la plantilla CDR-L3.

La CDR-L3 fue tomada del archivo line.pdb y mutada a la secuencia deseada en Sybyl. Esta fue entonces injertada sobre la estructura existente del anticuerpo entre la cisteína y la valina. Las cadenas laterales de los residuos insertados fueron minimizadas y el modelo fue revisado por cualquier coincidencia inusual de la cadena lateral.

Inserción del Epítopo CTL CDR-H2

La alineación de este epítopo con la última parte del CDR-H2 es alentadora, con 4 de los 9 residuos mostrando similitud con la secuencia ya presente en el anticuerpo. También, la prolina es central en cada sección, y cuando se la examina en la estructura es clara en el fondo de la vuelta del CDR. Este caso fue relativamente fácil de modelar, con los residuos siendo mutados a la secuencia deseada, y minimizados como se describió.

Inserción del Epítopo TH CDR-H3

Como se mencionó en el modelamiento de la inserción CDR-L1, es probable que este epítopo exista en una conformación relativamente extendida, debido principalmente al alto contenido de prolina. Para formar un bucle que pudiera ser insertado dentro del espacio restringido de la posición CDR-H3, el epítopo tendría que demostrar una vuelta ajustada dentro de parte de la estructura, y una conformación como de hoja en b en el resto del péptido. La opinión de los autores es que no sería posible para el epítopo TH, y la inserción de este péptido dentro de esta área produciría un anticuerpo doblado defectuosamente. Por lo tanto, este epítopo no ha sido modelado.

Diseño del Cebador y Tecnología OLE

Los cebadores son diseñados para remplazar a los CDR escogidos con el epítopo de interés. Esto se realiza por medio de un variación sobre la técnica de extensión de superposición (OLE) utilizada para muchas mutaciones de ADN. A diferencia de la mutagénesis dirigida al sitio que está principalmente dirigida a introducir mutaciones puntuales, OLE permite la mutación de un número de nucleósidos simultáneamente de modo que la necesidad de una subclonación se mantiene al mínimo. Un cebador se diseña con base en las secuencias 5' y 3' de la longitud del ADN que va a ser mutado, y se elaboran para ser exactamente complementarios para aquellas regiones. Proveer suficiente complementariedad, se logra aquí con base en el número de residuos escogidos y sus resistencias al acoplamiento, el sitio en medio de esta región puede ser cualquier secuencia de ADN. La complementariedad en cualquiera de los dos extremos aún permitirá que el acoplamiento de este cebador tenga lugar durante PCR. Cuando se la utiliza junto con otros cebadores de avance y retroceso, esto tiene el efecto de introducir la mutación dentro de la cadena de ADN recientemente sintetizada. Ya que esto constituye en la siguiente vuelta de PCR una cadena de ADN molde, la mutación se duplica fielmente por medio de la enzima polimerasa y por lo tanto se amplifica a través de un PCR posterior. Usualmente los cebadores se fabrican para mutar al mismo número de bases que estaban presentes en la secuencia original. Sin embargo, esta técnica puede también ser utilizada para introducir bases extra así como para reducir el número de bases en una secuencia. Aquí tiene que tenerse un cuidado especial con el diseño de los cebadores de modo que se evita la formación de estructuras secundarias como los bucles de horquilla, y la actividad de la ADN polimerasa no se afecta.

Estos estudios resaltaron el hecho de que aunque la incorporación de muchas estructuras primarias diferentes es aceptada en este CDRH3, pueden existir instancias en donde las secuencias insertadas conduzcan a la integridad de la estructura del anticuerpo que se encuentra comprometida. Los estudios de modelación, como este, indican que debe tener cuidado cuando el epítopo sufre un injerto. El modelamiento del bucle puede ayudar a identificar aquellas secuencias que van a comprometer el doblamiento del anticuerpo, lo cual conduciría a una falla en la producción de un vehículo para la entrega del anticuerpo y la utilidad de una vacuna.

De las cuatro combinaciones epítopo/CDR escogidas para los estudios de modelación, es interesante observar, que el epítopo ayudador T fue incapaz de ser modelado dentro de CDR-H3 debido a impedimentos estructurales. Muchos determinantes ayudadores son mucho más largos que sus contrapartes CTL, así que este puede ser en realidad el caso para muchos determinantes ayudadores. Aunque los datos para este fenómeno solamente se han generado para el anticuerpo SC100, también es importante observar que el CDR-L1 puede ser un sitio aceptor más apropiado para los determinantes ayudadores. TPPAYRPNNAPIL causa modelado dentro del CDR-L1 debido a su estructura más relajada, lo cual puede también ser el caso para otros determinantes ayudadores. Con base en los resultados de la escisión proteolítica y los estudios de modelado, se escogieron las siguientes variantes iniciales de construcción:

\bullet

CTL dentro de CDR-L3

\bullet

TH dentro de CDR-L1

Con base en los datos del estudio de modelación que habían resaltado al CDR-H2 con el potencial para acomodar favorablemente fácilmente al epítopo CTL, debido a las similitudes en secuencia, se inició este injerto.

\bullet

CTL dentro de CDR-H2

Una vez que habían sido escogidos los injertos epitópicos, una combinación de análisis de datos de secuencia y el diseño del cebador de novo, permitirían la incorporación de tales injertos dentro de los CDR escogidos utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para la construcción inicial del InmunoCuerpo prototipo, se diseñaron los cebadores con el propósito de facilitar el injerto de las combinaciones epítopo/CDR descritas anteriormente, y estos cebadores están presentes en la Tabla 13a.

TABLA 13a Cebadores Mutantes de CDR

Nombre	Secuencia
CTL1 L3	CTGGGAAATTATTACTGCTTCCTGTGGGGTCC
	AAGGGCCCTCGTTTTCGGTGGAGGCACCAAG
TH1 L1	CAAGCCTCCATCTCTTGCACTCCTCCAGCCTA
	TAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATGGTACCTGCAGAAACCA
CTL1 H2	ATTGGTAGTGGTGGTTTCCTGTGGGGTCCAAG
	GGCCCTCGTTCGATTCACCATTTCC
TH1 H3	ATGTATTACTGTGCAAGAACTCCTCCAGCCTA
	TAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATGGGGTCAAGGAACCACG
CTL1	TTCCTGTGGGGTCCAAGGGCCCTCGTT
TH1	ACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTA

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TABLA 13b Cebadores Oligonucleótidos Específicos para SC100

Nombre	Secuencia
GD SC100 FORH+L	GTCGACCTGCAGCCCAAGCTT
2 H FOR	GCTTATCATCGATAAGCTTAT
GD SC100 REVL	TGTGAGACTCTGCCAGGATCC
GD SC100 REVH	CAGAAAGCTAGCTTGGGATCC

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Estos cebadores son utilizados entonces en combinaciones apropiadas con los cebadores detallados en la Tabla 13b para producir un sistema de tres cebadores capaz de mutar las secuencias CTL y ayudadora T dentro de los CDR SC100. En este escenario, se utilizan dos cebadores de avance y apareamiento a la cadena de ADN molde a temperaturas similares (la temperatura de apareamiento). Esto ceba la actividad de la ADN polimerasa, que luego se inserta en los pares de bases complementarias. En conjunto con la acción del cebador de retroceso, esto amplifica exponencialmente las cadenas molde de ADN por medio del reciclamiento de las temperaturas de desnaturalizantes, de apareamiento y elongación. En los primeros ciclos, si el cebador de mutación es capaz de acoplarse a la cadena objetivo, la mutación es entonces incorporada dentro de las cadenas molde de ADN subsiguientes. Una representación diagramática de este proceso se da en la Figura 15. La facilidad de templado del cebador de mutación gobierna la proporción de ADN mutado presente en la mezcla amplificada. Las mezclas de productos PCR nativos (no mutados) y mutados, puede separarse entonces por clonación.

Los experimentos realizados utilizaron el sistema PCR del cebador tres para incorporar FLWGPRALV dentro del CDR-L3 de SC100. El PCR fue realizado utilizando pSVhyg SC100 Chimaeric VK, plásmido HuCK como molde para la cadena liviana SC100 y se utilizó una combinación equimolar de los cebadores GD SC100 ForH+L, GD SC100 REVL y CTL1 L3 para cebar la reacción PCR. Se utilizaron condiciones y reactivos PCR estándar y se aplicaron a los ciclos PCR que consisten de 45 segundos a 94ºC, 45 segundos a 56ºC y 90 segundos a 72ºC. Treinta ciclos de estas temperaturas permitieron la amplificación de los productos PCR en concentraciones suficientemente grandes para ser reconocidas por electroforesis estándar en gel de agarosa. Una representación del gel de agarosa, que identifica a los productos PCR mutados del CDR-L3 de SC100 que codifican a FLWGPRALV, se muestra en la Figura 16. En esta Figura, las diferencias en la utilidad del cebador de mutación se encuentran resaltadas en la diferencia de los tamaños de los productos encontrados en las sendas 3 y 5. La configuración de la banda superior e inferior en la senda 5 es consistente con los productos de amplificación teorizados en la Figura 15. La banda superior debe contener por lo tanto una proporción de secuencia mutada, ya que el cebador de mutación es claramente capaz de acoplarse a la cadena de ADN molde, como se muestra por la presencia de la banda inferior (que representa una secuencia mutada, truncada). Por lo tanto, la clonación de los productos PCR representada visualmente en la senda 5 será capaz de aislar al producto PCR mutado (no truncado).

Con el propósito de facilitar una clonación más fácil, sería aconsejable tratar de alterar las concentraciones relativas de las diferentes especies de productos PCR a favor de la secuencia mutada, no truncada. Esto puede realizarse por medio de PCR asimétrico. Aquí, el producto representado en la Figura 16, senda 5, banda inferior, es, por sí mismo, utilizado como el cebador de retroceso junto con la adición del cebador de avance (en esta instancia, GD SC100 ForH+L). La amplificación utilizando estos cebadores bajo las mismas condiciones que el PCR original, conduce a la producción de un exceso de secuencia mutada, ya que esta secuencia esta representada en el cebador de retroceso. El resultado de este PCR se muestra en la Figura 17. Los productos de las sendas 3 y 4 fueron considerados adecuados y fueron remitidos para clonación. La cantidad creciente de ADN que presenta la banda superior y la disminución en los niveles de la secuencia de mutación truncada (banda inferior no visible) cuando se la comparó con el PCR previo y paterno (senda 2) dio crédito a la noción de que el PCR asimétrico había producido en realidad altos niveles de secuencia mutada (no truncada).

Clonación y Secuenciación

Una vez que el PCR mutacional ha sido emprendido, la clonación y posterior secuenciación de los productos PCR generados indicaría si se habían introducido las mutaciones apropiadas. Como puede verse en la Figura 15, tanto la secuencia nativa como la mutada estarán presentes en los productos PCR derivados. Identificando estos clones con mutaciones a partir del medio nativo puede lograrse en un cierto número de formas. Una forma es desarrollar clones y purificar al plásmido de cada uno para análisis de secuenciación. Este es un ejercicio intensivo bastante laborioso, especialmente cuando se necesitan docenas de clones para ser procesados de una sola vez. El uso de PCR puede ayudar derivando la mayoría de este trabajo por medio de la identificación de aquellos clones que contienen la secuencia mutada. Aquí, los cebadores se elaboran con base únicamente en la secuencia mutada (esto es, sin las porciones complementarias a la secuencia nativa). La amplificación por PCR que utiliza tal cebador como el cebador de avance junto con el cebador de retroceso de la reacción original únicamente produciría productos de amplificación en aquellos clones en donde esta presente la mutación. De esta forma, muchos clones pueden ser analizados rápida y eficientemente y los productos obtenidos que pueden verificar, debido a su tamaño, donde se ha introducido la mutación sobre la secuencia nativa. Los clones que dan resultados positivos aquí serían utilizados entonces para producir un plásmido para la verificación de la secuencia.

Los productos PCR representados en la Figura 18 fueron por lo tanto remitidos para clonación. Esto se logró utilizando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen Corporation, San Diego, CA, Estados Unidos). Aquí, el vector de clonación (pCR®2.1-TOPO®) es suministrado solo con 3'-timidina (T) suspendida a lo largo de la Topoisomerasa I que está enlazada en forma covalente al vector. La estrategia de clonación toma en cuenta la actividad de la transferasa terminal dependiente sin molde de ADN de la enzima del Thermus aquaticus (Taq) utilizada en la regeneración de los productos PCR que añade una desoxiadenosina (A) sola al extremo 3' del producto PCR. La T suspendida, proporciona por lo tanto un "extremo pegajoso" para el apareamiento de bases de los nucleótidos de A y T, una reacción que es catalizada por la Topoisomerasa 1. Por lo tanto, en una reacción en una sola etapa (virtualmente) cualquiera de los productos PCR puede ser clonado dentro de este vector. La transformación de las cepas apropiadas de E. coli facilita el crecimiento del plásmido pCR®2.1-TOPO® incorporado por PCR para el análisis de secuenciación del ADN. Como se mencionó antes, el E. coli transformado puede ser utilizado directamente en las reacciones PCR para analizar el contenido de mutación de los clones individuales. En el contexto de la incorporación de FLWGPRALV dentro del CDR-L3, esto se logró utilizando a los clones transformados pCR®2.1-TOPO® con cebadores CTL1 L3 y GD SC100 REVL (ver Tablas 13a y 13b, respectivamente). La representación en gel de agarosa de los resultados de estos análisis por PCR se muestra en la Figura 18.

Estos experimentos produjeron muchos productos clonados, uno de los cuales fue llamado 74:1. Este clon fue remitido para la purificación del plásmido con el propósito de secuenciar al ADN para verificar la presencia de la mutación incorporada. Los resultados del análisis de secuencia se muestran en la Figura 19.

Mucho de la misma estrategia completa fue utilizada para incorporar al epítopo ayudador T dentro del CDR-L1. En los experimentos realizados, este epítopo sería utilizado a lo largo de aquel epítopo CTL con el propósito de determinar los efectos benéficos (o lo contrario) de la célula T que ayuda en la actividad CTL. Por lo tanto, se intentó la elaboración de un mutante doble, que incorporara al injerto CTL en el CDR L3 y al injerto ayudador T en el CDR-L1. La mutación exitosa para producir al clon 74:1 significó que esta construcción podría ser utilizada como un molde para mutar al ayudador T dentro del CDR-L1. El éxito de este intento de mutación obviamente conduciría a un mutante doble. Este fue en realidad el caso, y el PCR asimétrico para incrementar la proporción de mutante para a secuencia de ADN nativo fue nuevamente exitoso. Estos productos fueron remitidos por lo tanto para clonación. La clonación fue nuevamente realizada en la forma descrita, utilizando la estrategia de clonación del InVitrogen TOPO TA. Los clones fueron positivamente identificados con el CDR-L1 mutado utilizando PCR con el cebador THL1 y un clon, llamado 213:4 fue remitido para el análisis de secuencia de ADN. Los datos de la secuencia para este clon se presentan en la Figura 20.

Vacunación con ADN

En estos estudios, los cebadores han sido diseñados cuidadosamente tanto para introducir a los cebadores apropiados dentro de los CDR de interés, como para permitir el empalme del ADN mutado nuevamente dentro de los plásmidos originales utilizados para la expresión de la proteína. Esto proporciona una forma de examinar los efectos de las mutaciones producidas contra un medio de proteína nativa. El uso de PCR también permite la subclonación de productos de interés dentro de otros vectores intermediarios con el propósito de realizar experimentos intermedios. De esta forma fuimos capaces de introducir secuencias mutadas nativas y CDR dentro de los vectores apropiados para realizar experimentos de vacunación con ADN.

Con el propósito de realizar experimentos de vacunación con ADN en un sistema con un ratón transgénico, el plásmido incorporado como vehículo para la vacuna debe contener una secuencia eucariota promotora con el objeto de que este ADN sea trascrito y traducido. Ya que el vector pCR®2.1-TOPO® contiene una región procariota promotora, de tal manera que la secuencia mutada de los clones 74:1 y 213:4 tuvieran que ser empalmadas dentro de un vector alterno. Nuevamente, se escogió un vector InVitrogen para lograr esto, llamado el vector pCR3.1®. Este vector contiene al promotor temprano inmediato citomegalovirus (CMV) que permite un alto nivel de expresión de los genes clonados en un sistema eucariótico. Los experimentos sencillos de clonación TA nuevamente facilitaron la introducción de las secuencias mutadas 74:1 y 213:4 dentro de este vector para significar su diferencia de los clones generados con pCR®2.1-TOPO®, cada clon aislado que contenía al vector pCR3.1® fue prefijado con la letra "C". Tal incorporación fue realizada también sobre los productos PCR de la cadena liviana nativa SC100 (generados a partir del plásmido pSVhyg SC100 Chimaeric VK, HuCK) y los productos de la cadena pesada nativa (generados a partir del plásmido pSVgpt SC100 Chimaeric VH). Las versiones clonadas de estas construcciones fueron llamadas K2 y H8 para las versiones de la cadena liviana y de la cadena pesada, respectivamente.

La vacunación con ADN en sí misma fue realizada utilizando tecnología GeneGun (Biorad Laboratories Limited, Hemel Hempsted, Reino Unido). En resumen, el ADN del plásmido se introdujo en forma intradérmica en los animales, utilizando una pistola de helio. Las balas toman la forma de partículas de oro que pueden estar recubiertas con el ADN de escogencia. En nuestro caso, los plásmidos producidos a partir de los clones 74:1, 213:4, K2 y H8 fueron mezclados con partículas de oro y utilizados para inmunizar grupos de cuatro ratones. Se estudiaron las siguientes inmunizaciones:

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Plásmido C74:1

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Plásmido C213:4

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Plásmido K2

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Plásmido C74:1 más plásmido H8

Los grupos de ratones sin inmunización fueron erigidos también como ratones de control positivo estos fueron ratones inmunizados con el péptido FLWGPRALV en un régimen de inmunización apropiado para los inmunogenes peptídicos.

Ensayos con Células T Citotóxicas

El último punto de estos estudios iniciales sobre la incorporación del epítopo/CDR es para generar respuestas CTL contra el epítopo de célula T introducido en el CDR. Estos estudios fueron realizados en ratones transgénicos que portan al gen, los cuales producen moléculas HLA-A2 humanas, permitiendo el estudio translacional de la función epitópica inmune humana en estos ratones. Nuevamente, el epítopo apropiado para examinar al InmunoCuerpo, prueba al principio que ha sido utilizado, ya que el péptido epitópico de MAGE-3 FLWGPRALV es conocido por enlazarse con alta afinidad al HLA-A2.

Los esplenocitos de los ratone inmunizados y de control fueron cosechados y cultivados utilizando técnicas estándar para cultivo de tejido y medio de crecimiento. Los ratones naive fueron utilizados para producir células alimentadoras para la estimulación del péptido in vitro por medio de una técnica estándar basada en la producción de células de blásticas estimuladas por lipopolisacáridos (LPS) (nuevamente con origen en el bazo). En el día tres, estas células blásticas LPS fueron irradiadas y el péptido MAGE-3 (FLWGPRALV: 100 \mug por 2 x 10^{7} células incubadas en 1 mL) añadido durante 1 hora. Estas células fueron entonces lavadas y utilizadas como células alimentadoras para los esplenocitos de los ratones inmunizados. Después de 5 días de incubación, estas células fueron remitidas para un experimento de rutina de las células T citotóxicas. Los ensayos fueron erigidos, para analizar la respuesta contra un no péptido, un péptido irrelevante y el péptido MAGE-3. Los resultados de los ensayos CTL se dan en la Figura 20. Los ratones con la más alta respuesta se muestran para cada conjunto de inmunización.

Los ratones inmunizados con el péptido MAGE-3 existe una mortandad en la proporciones más altas de efector:objetivo (proporción E:T) de células pulsadas con el péptido MAGE-3. Este resultado se refleja virtualmente en los ratones inmunizados con el plásmido C74:1. En ambos casos, así como en todos los casos mostrados en la Figura 20, no existe una mortandad significativa de células pulsadas ya sea con el no péptido o con un péptido irrelevante. La actividad citotóxica de los ratones del grupo C74:1 (Mage3 en CDR-L3) esta en agudo contraste con la carencia de actividad CTL en los ratones inmunizados con el plásmido K2 (SC100 Nativo). Esta diferencia en citotoxicidad sugiere que, por la inmunización, la secuencia que codifica al FLWGPRALV a sido traducida y que este péptido ha sido apropiadamente presentado a los CTL. Esto soporta a un injerto exitoso de epítopo en una estructura de tipo InmunoCuerpo que causa una respuesta inmune en los ratones inmunizados. Más evidencia en la generación de los CTL es mostrada en aquellos grupos de ratones inmunizados con plásmido C213:4 y también en aquellos ratones inmunizados con una combinación de C74:1 y H8. El plásmido C213:4 también contiene una secuencia que codifica al péptido FLWGPRALV en CDR-L3, pero también contiene al epítopo Ayudador T (TPPAYRPPNAPIL) en CDR-L1. La presencia del epítopo ayudador T puede ser proveyendo ayuda de las células T, como se indicó por el hecho de que la mortandad ocurre en una proporción E:T más baja que la observada en el grupo inmunizado con C74:1. Otra observación a partir de la Figura 20, es que la actividad citotóxica relativamente alta parece ocurrir en los ratones inmunizados con una combinación de los plásmidos C74:1 y H8 que codifican tanto a las cadenas liviana como pesada en la misma célula. Esto podría tener el efecto de producir una entidad de InmunoCuerpo completa dentro de la célula transfectada. La presentación de los epítopos a las células que presentan al antígeno, podría conducir a una mortandad celular, y a la liberación de la entidad de InmunoCuerpo completa dentro del medio ambiente circundante. Esto permitiría entonces el direccionamiento de las células de Langerhan (células dendríticas especializadas encontradas en la piel) a través de CD64, siendo proveído el ligando por medio de la porción de la cadena pesada del InmunoCuerpo. Esto puede contar para la cantidad relativamente más alta de mortandad observada en este grupo.

Ejemplo 12

Preparación de las construcciones de Polipéptido-Fc (Señal pigplus Tie2-Fc y mutantes). Un dominio de proteína de una molécula fue clonado y empalmado a una región IgG1 Fc humana. Esta sería reconocida por un receptor CD64 sobre células dendríticas que son internalisadas y procesadas dentro de péptidos para la presentación sobre moléculas MHC de clase I y clase II. Si estos epítopos son por sí mismos epítopos de alta afinidad, las células T que los reconocen pueden haber sido suprimidas en el timo. Las células T que reconocen a los epítopos de afinidad moderada serán presentados aún, pero estos epítopos no estarán bien representados sobre las moléculas MHC, ya que tendrán competencia por parte de los epítopos de mayor afinidad. Cambiando los residuos ancla que se enlazan al MHC, es posible generar péptidos de alta afinidad sin alterar el reconocimiento de las células T (Rosenberg y colaboradores, (1998) Nature Medicine 4: 321-327).

Métodos y resultados

El cADN sintetizado a partir de 5 \mug de ARN total aislado de la línea celular TF1 (desarrollado en presencia de 200 unidades/ml de GMCSF) fue utilizado como molde para la amplificación de Tie-2 truncado (1-196 aminoácidos) utilizando los cebadores: cebador 5', 5'-GAT CTC GAG ATT TGG GGA AGC ATG GAC-3', correspondiente a la secuencia de nucleótidos 128-154 del gen Tie-2 con un sitio de restricción adicional Xho1; y un cebador 3', 5'-GAA GAT ATC TCC TCC TAT ATA CCT GGC CGA-3', correspondiente a la secuencia de nucleótidos 716-745 del gen Tie-2 con un sitio EcoRV incorporado. El fragmento PCR fue cortado y ligado dentro del sitio de clonación múltiple Xho-1/EcoRV del vector de expresión de mamífero Signal pigplus (sistemas R y D) en el marco con una secuencia de señal CD33 y una cola IgG_{1} Fc humana C-terminal para generar una proteína secretora de fusión. Este plásmido fue identificado por análisis de restricción y confirmado por secuenciación de ADN.

A partir de este plásmido de tipo silvestre, se generaron cinco construcciones más por mutagénesis con PCR. Se utilizó el kit "Quik^{TM} Change Site Directed Mutagénesis" (Stratagene), de acuerdo con el protocolo de los fabricantes para cambiar los aminoácidos específicos con el propósito de producir epítopos potenciales CTL utilizando los cebadores designados como Z84, Z95, Z101 y Z107 como se enlista en la Tabla 14.

TABLA 14 Cebadores utilizados para la mutagénesis dirigida al sitio de la construcción tipo silvestre Signal pigplus Tie2-FC

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Los nucleótidos resaltados en rojo son las bases sustituidas requeridas para codificar al aminoácido específico cambiado del Epítopo.

Los cebadores Z84 se aparean a la secuencia de nucleótidos desde 524 hasta 557; los cebadores Z95: 160-201; los cebadores Z101: 512-548 y los cebadores Z107: 509-548 del gen Tie-2 de tipo silvestre.

(Número de acceso L06139)

Para una construcción, ambos cebadores, Z95 y Z107, fueron utilizados para incorporar dos epítopos CTL potenciales. Todas las mutaciones específicas del sitio fueron confirmadas por medio de la secuenciación del ADN (Tabla 15).

TABLA 15 Alineación del cADN Tie-2 tipo silvestre y los aminoácidos con secuenciación obtenida a partir de las mutaciones específicas incorporadas en el sitio, presentes en las construcciones Signal pigplus Tie-2-FC

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Los números corresponden a bases nucleótidos y a aminoácidos de la secuencia tipo silvestre Tie-2 (Número de acceso L06139).

Los plásmidos fueron secuenciados utilizando una reacción lista de secuenciación del ciclo de terminación BigDye (PE Applied Biosystems) y las reacciones de secuenciación se les hizo electroforesis utilizando el secuenciador ABI prism 373A DNA (Applied Biosyetems). Las secuencias resultantes de ADN fueron alineadas con cADN de tipo silvestre (Acceso No. L06139) obtenido a partir de la base de datos NIH, utilizando el programa de búsqueda de parejas de indicadores Blast 2. 293 células de riñón humano fueron transfectadas en forma estable con tie2-Fc, y la proteína recuperada del sobrenadante fue purificada en una columna de proteína A.

Las células T humanas que reconocen a un péptido dentro de la molécula Tie2 fueron clonadas. Se mostró que esos clones eran de afinidad moderada, requiriendo de 5 \mug de péptido para dar una estimulación máxima del 50%, y son por lo tanto representativas de las células T que tienen una selección tímica escapada. Las células dendríticas fueron alimentadas ya sea con proteína recombinante Tie2, con péptido o con la construcción Tie2Fc y fueron expuestas entonces al clon de las células T. La Figura 21 muestra que el clon respondió en forma débil al péptido, falló en responder a todas las proteínas recombinantes, pero dio una excelente respuesta a la construcción Tie2Fc. Además, la respuesta a la construcción Tie2Fc podría ser bloqueada por un anticuerpo antiCD64.

Claims (17)

1. El uso de un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza a CD64, y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos de células T heterólogas en la elaboración de un medicamento para estimular una respuesta citotóxica de las células T.

2. El uso como el reivindicado en la reivindicación 1, en donde la primera porción comprende al segmento Fc de IgG humano.

3. El uso como el reivindicado en la reivindicación 2, en donde el IgG es IgG1 humano.

4. El uso como el reivindicado en la reivindicación 3, en donde la primera porción comprende Fc31 humano.

5. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la segunda porción es un fragmento Fab.

6. El uso como el reivindicado en la reivindicación 5, en donde el fragmento Fab es no humano, preferiblemente de ratón.

7. El uso como el reivindicado en la reivindicación 5, en donde el fragmento Fab es de humano.

8. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el epitopo de células T heterólogas es un epítopo patógeno.

9. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el epítopo de células T heterólogas es un epitopo no patógeno.

10. El uso como el reivindicado en la reivindicación 9, en donde el epítopo no patógeno es un epitopo tumoral.

11. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el polipéptido es un anticuerpo monoclonal.

12. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el polipéptido es una construcción Fc de dominio de la proteína.

13. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento estimula las respuestas citotóxicas y ayudadoras de las células T.

14. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento es para el tratamiento y/o la profilaxis del cáncer.

15. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento es para administración intramuscular y/o intradérmica.

16. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además el uso de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido que comprende (i) una primera porción que comprende la parte del Fc humano que se enlaza a CD64, y (ii) una segunda porción que comprende uno o más epítopos de células T heterólogas en la elaboración de un medicamento para estimular una respuesta citotóxica de las células T.

17. El uso como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento comprende además un adyuvante.