JP5597793B2 - Ｉｌｔ３結合分子およびその使用 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、２００６年６月１９日付で、「ＩＬＴ３結合分子およびその使用」という発明の名称で出願された米国特許出願第１１／４７１，３９７号の一部継続出願である。本願は、２００６年６月１９日付で、「ＩＬＴ３結合分子およびその使用」という発明の名称で出願された米国仮特許出願第６０／８１４，９３１号の優先権の便益を主張する。その内容全体を、本明細書中に引用により援用する。
イムノグロブリン様転写物（ＩＬＴ）３は、イムノグロブリン・スーパーファミリーのメンバーである細胞表面分子である。ＩＬＴ３は、単球、マクロファージおよび樹状細胞などの骨髄性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって選択的に発現される。ＩＬＴ３の細胞質領域は、推定上の免疫レセプターチロシンベースの抑制モチーフ（ＩＴＩＭｓ）を含有している。ＩＬＴ３の、ＡＰＣにより発現された刺激性レセプターへの共ライゲーションの結果、［Ｃａ２＋］が増加したフラックスの平滑末端化と、これらのレセプターによってトリガーされたチロシンリン酸化が起こる。シグナル消去は、架橋時、ＩＬＴ３によって補充されたＳＨ２含有タンパク質チロシンホスファターゼ１を伴う。ＩＬＴ３は、抗原の捕捉および提示においても機能することができる。それは架橋によって効率的に内面化し、そのリガンドを細胞内の区画に運び、そこで処理され、Ｔ細胞に提示される（Cellaら（1997） J.
Exp. Med. 185:1743-1751）。
したがって、ＩＬＴ３は、ＡＰＣの活性化をネガティブに調節することができ、抗原の取り込みに関してＡＰＣによって使用され得る抑制受容体である。ＩＬＴ３を介してのシグナリングを調整するのに有用な物質の開発は、免疫反応の調整に非常に有益なものとなるであろう。
本発明は、ＩＬＴ３、例えば、ヒトＩＬＴ３（ｈＩＬＴ３）に、抗原提示細胞、例えば、単球、マクロファージや樹状細胞、例えば、単球由来樹状細胞上で、特異的に結合する結合分子を提供する。本発明の結合分子は、ｈＩＬＴ３と、高いアフィニティーで結合し、インビトロで免疫細胞を下方調整すること、例えば、同種免疫反応、樹状細胞、例えば、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）による炎症性サイトカインの生成、ＤＣ、例えば、ＭＤＤＣによる共刺激分子のアップレギュレーション、および／または、単球へのカルシウムの流入を下方調整することを特徴とする。さらに、結合分子は、樹状細胞、例えば、未成熟の樹状細胞での抑制受容体の発現をアップレギュレーションする。驚くべきことに、インビトロで免疫反応を下方調整する同じこれらの結合分子が、インビボでは、例えば、免疫反応を上方調整するなどの免疫賦活性を示す。
したがって、本発明のある局面は、配列番号：１のアミノ酸配列を含む結合分子を特徴とする。
別の局面においては、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を含む結合分子を特徴とする。
本発明のさらに別の局面は、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群から選択される、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む結合分子を特徴とする。ある態様において、結合分子は、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群から選択される、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。別の態様において、結合分子は、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：５からなる群から選択される、少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。
本発明の別の局面は、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８からなる群から選択される、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む結合分子を特徴とする。ある態様において、結合分子は、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８からなる群から選択される、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。別の態様において、結合分子は、配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８からなる群から選択される、少なくとも３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列を含む。
本発明の別の局面は、配列番号：３〜８に示されたＣＤＲを含む結合分子を特徴とする。
本発明のある局面は、配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含み、さらに、配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む結合分子を特徴とする。
本発明の別の局面は、ヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）上でＩＬＴ−３に結合し、結合定数（Ｋｄ）が０．９×１０−９以下である結合分子を特徴とする。
ある態様において、結合分子は、インビトロで免疫細胞の活性化を下方調整する。
別の態様において、結合分子は、インビボで免疫反応を上方調整する。
さらに別の態様において、結合分子の定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む。
ある態様において、結合分子は、樹状細胞上でヒトＩＬＴ−３に結合する。
別の態様において、結合分子は、単球上でヒトＩＬＴ−３に結合する。
さらに別の態様において、結合分子は、樹状細胞による炎症性サイトカインの生成をインビトロで下方調整する。
ある態様において、結合分子は、樹状細胞上での共刺激分子のアップレギュレーションをインビトロで下方調整する。
別の態様において、結合分子は、樹状細胞上での抑制受容体の発現をインビトロで上方調整する。
ある態様において、結合分子は、マウス抗体である。
別の態様において、結合分子は、モノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。
さらに別の態様において、結合分子は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
本発明の別の局面は、本発明の結合分子および薬学的に許容可能な担体を含む組成物を特徴とする。
ある態様において、組成物は、被験者における免疫反応を上方調整する、少なくとも１つの追加的治療薬をさらに含む。
本発明のある局面は、被験者からの細胞を、インビトロで免疫細胞の活性化を阻害する抗ＩＬＴ３抗体に接触させることを含む、被験者において免疫反応を上方調整する方法を特徴とする。
本発明の別の局面は、被験者において移植の拒絶反応を下方調整する方法であって、被験者からの細胞を本発明の結合分子に接触させること、およびその細胞を移植と同時もしくは移植前に被験者に再度導入して、被験者におけるする移植の拒絶反応を下方調整することを含む方法を特徴とする。
本発明のさらに別の局面は、被験者における癌を治療する方法であって、細胞を本発明の結合分子に接触させて、被験者において癌を治療する方法を特徴とする。
ある態様において、癌の種類は、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳もしくは中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頚癌、子宮もしくは子宮内膜の癌、口腔もしくは咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸もしくは盲腸の癌、唾液腺の癌、甲状腺の癌、副腎の癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌から選択される。
本発明のある局面は、配列番号：９のヌクレオチド配列を含む重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。
本発明の別の局面は、配列番号：１０のヌクレオチド配列を含む軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。
本発明のさらに別の局面は、配列番号：１１、配列番号：１２および配列番号：１３からなる群から選択される、少なくとも１つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。ある態様において、単離された核酸分子は、少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の態様において、単離された核酸分子は、３つのＣＤＲを含む。
本発明の別の局面は、配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６からなる群から選択される、少なくとも１つのＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子を特徴とする。ある態様において、単離された核酸分子は、少なくとも２つのＣＤＲを含む。別の態様において、単離された核酸分子は、３つのＣＤＲを含む。
本発明のある局面は、配列番号：１１〜１６に示されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を特徴とする。
本発明のある局面は、本発明の核酸分子を含む組換え発現ベクターを特徴とする。ある態様において、本発明の結合分子をコードするヌクレオチド配列を持つ核酸分子を含む組換え発現ベクターを特徴とする。別の態様において、本発明は、本発明の組換え発現ベクターが組み込まれた宿主細胞を特徴とする。本発明の別の局面は、ヒトＩＬＴ−３に結合する結合分子の生成方法であって、ヒトＩＬＴ−３に結合する結合分子が細胞によって生成されるまで、本発明の宿主細胞を培地で培養することを含む方法を特徴とする。
図１は、９Ｂ１１の存在下で分化した単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣｓ）が、フローサイトメトリーによれば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲなどの細胞表面共刺激性分子の発現が低いことを示すグラフである。 図２は、混合リンパ球反応においてＭＤＤＣｓが同種間のＴ細胞反応を生成することができなかったことを示すグラフである。 図３は、９Ｂ１１の存在下で培養されたＭＤＤＣｓは、ＬＰＳによる刺激があったとき、ＩＬ−１２、ＴＮＦαまたはＩＬ−１αを生成することができないことを示すグラフである。 図４は、９Ｂ１１とともにインキュベートした、新鮮に単離された血液樹状細胞は、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＰＧＥ）の混合液を用いて細胞を成熟させたとき、共刺激性の分子の発現を完全にアップレギュレートすることができなかったことを示すグラフである。 図５は、ＣＤ３２中で免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を活性化することによって誘発される単球への９Ｂ１１の追加が、Ｃａ＋２流入を阻害することを示す図である。
本発明は、ＩＬＴ３、例えば、ヒトＩＬＴ３（ｈＩＬＴ３）に、抗原提示細胞、例えば、単球マクロファージや樹状細胞（ＤＣ）、例えば、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）上で、特異的に結合する結合分子を提供する。本発明の結合分子は、ｈＩＬＴ３と高いアフィニティーで結合し、インビトロで免疫反応を下方調整すること、例えば、同種免疫反応；樹状細胞、例えば、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）による炎症性サイトカインの生成；ＤＣ、例えば、ＭＤＤＣによる共刺激分子のアップレギュレーション；および／または単球へのカルシウムの流入を下方調整することを特徴とする。さらに、結合分子は、樹状細胞、例えば、未成熟の樹状細胞での抑制受容体の発現をアップレギュレーションする。驚くべきことに、インビトロで免疫反応を下方調整する同じこれらの結合分子が、インビボで免疫賦活性を示す。
本発明の様々な局面は、結合分子およびその薬学的組成物、ならびに結合分子をコードする核酸、そのような結合分子を作製するための組換え発現ベクターおよび宿主細胞に関連する。インビトロまたはインビボで、ヒトＩＬＴ３を検出するため、またはヒトＩＬＴ３活性を調整するために、本発明の結合分子を使用する方法も本発明に含まれる。
本発明を容易に理解することができるように、いくつかの用語をまず定義しておく。
Ｉ．定義
本明細書において用いられている用語「イムノグロブリン様転写物３」（本明細書においては「ＩＬＴ３」もしくは「ｈＩＬＴ３」と省略している。またＣＤ８５ｋとしても知られている）は、ＩＬ−１０またはビタミンＤ３の存在下で分化した単球、マクロファージおよび樹状細胞、例えば、単球由来樹状細胞などの骨髄性の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって選択的に発現されるイムノグロブリン・スーパーファミリーのヒトメンバーである。ＩＬＴ３タンパク質は、分子量が４７ｋＤまでと予測される４４７アミノ酸の膜貫通タンパク質である。ＩＬＴ３タンパク質のアミノ末端部分は、２３アミノ酸の疏水性シグナルペプチドで開始し、２つのＣ２タイプのイムノグロブリン・スーパーファミリードメインからなる細胞外領域が続いている。各ドメインは、互いに４９および５０残基分離れた２つの特徴的なシステインをもち、保存された残基（それぞれＶａｌ−ｘ−Ｌｅｕ／Ｉｌｅ−ｘ−ＣｙｓおよびＨｉｓ／Ｔｙｒ−ｘ−Ｇｌｙ−ｘ−Ｔｙｒ−ｘ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ／Ｐｈｅ。ｘはあらゆるアミノ酸である）に隣接している。ＩＬＴ３の推定上の膜貫通ドメインは２１アミノ酸からなり、１６７アミノ酸の長い細胞質の領域が続いている。それは１つのＴｙｒ−ｘ−ｘ−Ｖａｌモチーフと、それに続く２つの、２６アミノ酸残基分のスペースがあいたＴｙｒ−ｘ−ｘ−Ｌｅｕモチーフを特徴とする。これらのＴｙｒ−ｘ−ｘ−Ｌｅｕ対およびそれらのスペースは、ＫＩＲｓ（ナチュラルキラー細胞Ｉｇレセプター）においてタンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ−１結合部位として同定されたＴｙｒ−ｘ−ｘ−Ｌｅｕモチーフ（免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフまたはＩＴＩＭとも称される）が存在していたことを暗示するものである。
ＩＬＴ３の細胞質領域における推定上の免疫受容体チロシンベースの抑制モチーフは、ＩＬＴ３の抑制機能を示唆するものである。そのため、ＩＬＴ３は、刺激性のレセプターに架橋したとき、抑制受容体として振舞う。
ヒト（ｈＩＬＴ３）ＩＬＴ３の核酸配列を配列番号：１７に示し、アミノ酸配列を配列番号：１８に示す。
本明細書において用いられている用語「結合分子」は、ＩＬＴ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を含む。「特異的に結合する」は、結合分子が非ＩＬＴ３分子に対して基本的にバックグラウンド結合を示すことを意味する。しかしながら、ＩＬＴ３に特異的に結合する単離された結合分子は、他の種からのＩＬＴ３分子に対する交差反応性を示してもよい。
本発明の結合分子は、あらゆるアイソタイプイムノグロブリン重鎖（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはイムノグロブリン分子のサブクラスを含むことができる。結合分子は、重鎖および軽鎖の双方を含んでもよい。本明細書において用いられている用語「結合分子」はまた、例えば、ｓｃＦｖ分子を、ＩＬＴ３との結合性という所望の活性を示す限り、抗体（全長抗体）、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体）、ポリクローナル抗体、他重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、および抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、上記のすべてのエピトープ結合フラグメント、および工学的に処理された形態の抗体を含んでもよい。
「抗原」は、結合分子が特異的に結合する実体（例えば、タンパク質様の実体またはペプチド）である。
「エピトープ」または「抗原決定基」と言う用語は、結合分子が特異的に結合する抗原上の部位を言う。エピトープは、タンパク質の三次折り畳みによって配列された連続的なアミノもしくは非連続的なアミノ酸から構成することができる。連続的なアミノから形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒に曝露されたとき状態を維持するが、一方、三次折り畳みによって形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒に曝露されたとき失われる。エピトープは、典型的に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５のアミノ酸を独特の空間コンホーメーションに含む。エピトープの空間コンホーメーションを決定する方法には、例えば、Ｘ結晶構造解析および２次元核磁気共鳴がある。例えば、Epitope Mapping Protocols in
Methods in Molecular Biology、Vol. 66、G. E. Morris、Ed. （1996）を参照することができる。
同じエピトープを認識する結合分子は、抗原を標的とするために、ある抗体が別の抗体の結合をブロックすることができる能力を示す簡単なイムノアッセイ、例えば、競合結合アッセイにおいて同定することができる。競合結合は、試験される結合分子が、参照結合分子の、一般的な抗原、例えば、ＩＬＴ３への特異的結合を阻害するアッセイにおいて決定することができる。例えば、固相直接もしくは間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；固相直接もしくは間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli et al.、Methods in Enzymology 9:242 （1983））；固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Kirkland et al.、J.
Immunol. 137:3614 （1986））；固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、HarlowとLane、Antibodies:
A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Press（1988））；Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Morel et al.、Mol. Immunol. 25（1）：7 （1988））； 固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（Cheung et al.、Virology 176:546（1990））；および直接標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al.、Scand. J. Immunol. 32:77（1990））などといった、多種の競合結合アッセイが知られている。典型的にそのようなアッセイは、固体表面または、これらの未標識の試験結合分子および標識された参照結合分子のいずれかを担持する細胞に結合する精製された抗原を使用する。競合阻害は、固体表面または試験結合分子の存在下での細胞に結合した標識の量を測定することによって決定することができる。通常、試験結合分子は過剰に存在している。通常、競合する結合分子は、過剰に存在し、参照結合分子の一般的な抗原への特異的結合を、少なくとも、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％以上阻害することになる。
エピトープは、免疫学的細胞、例えば、Ｂ細胞および/またはＴ細胞によっても認識することができる。エピトープの細胞認識は、抗原依存性の増殖を測定するインビトロのアッセイ、例えば、３Ｈチミジン組み込み、サイトカイン分泌、抗体分泌、もしくは抗原依存性殺傷（細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ）による測定によって決定することができる。
本明細書において用いられる「モノクローナル結合分子」という用語は、ほぼ均質な結合分子の集団から得られる結合分子を意味する。モノクローナル結合分子は、単一の抗原部位に対して高度な特異性を示す。さらに、典型的に異なる決定基（エピトープ）に対する異なる結合分子を含むポリクローナル結合分子調製物とは対照的に、各モノクローナル結合分子は、抗原上の単一の決定基に向けられる。修飾因子「モノクローナル」は、ほぼ均質な結合分子の集団から得られるという結合分子の特徴を示しているが、結合分子を作製する方法は特定されない、と解釈されている。例えば、本発明で用いられるモノクローナル結合分子は、Kohler et al.、Nature 256:495 （1975）に最初に記載されたハイブリドーマ法で作製することができるし、あるいは、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６7号）で作製することもできる。「モノクローナル結合分子」は、また、例えば、Clackson et al.、Nature 352:624-628（1991） やMarks et al.、J. Mol Biol. 222:581-597（1991）に記載の技法を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
用語「キメラ結合分子」は、異なる種に由来するアミノ酸配列を含む結合分子を意味する。キメラ結合分子は、例えば、遺伝子工学的技法によって、異なる種に属する結合分子遺伝子セグメントから構築することができる。
本明細書におけるモノクローナル結合分子は、特に、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する結合分子の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖の他の部分は、他の種に由来する、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する他の種に由来する結合分子、ならびに所望の生物学的活性、例えば、ヒトＩＬＴ３（ｈＩＬＴ３）に対する結合性を示す限り、その結合分子のフラグメントと同一または相同である「キメラ」結合分子を含む（米国特許法第４，８１６，５６７号；およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 （1984））。
軽鎖および重鎖はともに構造的および機能的ホモロジーに分類される。用語「定常」および「可変」は、機能的に用いられる。これに関連して、軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）部分の可変ドメインは、抗原認識および特異性を決定することが理解されよう。逆に、軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ１、ＣＨ２もしくはＣＨ３）の定常ドメインは、分泌、経胎盤性の移動、Ｆｃレセプター結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例では、定常領域ドメインの番号は、抗原結合部位または抗体のアミノ末端から離れるにしたがって大きくなる。Ｎ末端は可変領域、Ｃ末端は定常領域である。ＣＨ３およびＣＬドメインはそれぞれ、重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を実際に含む。
結合分子との関連で用いられる「可変領域」は、分子に対する抗原結合を付与する結合分子のアミノ末端部分であり、定常領域ではない部分を意味する。この用語は、相補性決定領域およびフレームワーク領域を含む。この用語はまた、可変領域全体の結合機能の一部もしくは全体を維持する機能的フラグメントを含む。
本明細書において用いられるところの用語「超可変領域」は、配列において超可変であり、および／または構造的にループを形成する結合分子可変ドメインの領域を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基を含む。
本明細書において用いられるところの用語「ＣＤＲ」あるいは「相補性決定領域」は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの双方の可変領域において認められる非連続的な抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域については、Kabatら、J. Biol. Chem. 252、6609-6616 （1977）、およびKabatら、Sequences of protein of immunological
interest. （1991）に記載がある。そして、Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987） およびMacCallumら、J. Mol. Biol. 262:732-745 （1996）により、互いに比較したときのアミノ酸残基のオーバーラッピングまたはサブセットであると定義されている。Kabatの定義が、本発明の結合分子のＣＤＲを定義するのに好ましいが、他の結合分子のＣＤＲの定義、または移植された結合分子もしくはその変形についての定義もこの語の定義に包含され、本明細書において用いられる。
本明細書において用いられるところの用語「フレームワーク領域」あるいは「ＦＲ」は、ＣＤＲによって分離されるフレームワークの各ドメインを意味する。したがって、可変領域フレームワークは、約１００―１２０アミノ酸長であり、ＣＤＲの外部のアミノ酸のみを意味する。
非ヒト（例えば、ネズミ）結合分子の「ヒト化」形体は、キメラ抗体であり、非ヒト結合分子に由来する配列を最小限含有している。大半は、ヒト化結合分子は、超可変領域からの残基が、所望の特異性、アフィニティー、および能力をもつマウス、ラット、ウサギ、もしくは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー結合分子）の超可変領域からの残基に置換されている、ヒト結合分子（アクセプター／レシピエント結合分子）である。いくつかの例においては、ヒト結合分子のＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基が改変されている。例えば、置換もしくは逆突然変異された、対応する非ヒト残基に置き換わっている。さらに、ヒト化結合分子は、レシピエント結合分子もしくはドナー結合分子には見られない残基を含むことができる。これらの改変は一般的に、結合分子の性能をさらに改善するために行われる。一般的に、ヒト化結合分子は、ほぼ全ての、または少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインを含む。そこには、全ての、もしくはほぼ全ての超可変ループが非ヒト結合分子のそれに対応している。そして、全て、もしくはほぼ全てのＦＲ領域は、ヒト結合分子配列のものである。ヒト化結合分子は、必要に応じて、少なくとも一部の結合分子定常領域（Ｆｃ）を含み、典型的には、ヒト結合分子のものを含む。さらに詳細については、Jonesら、Nature 321:522-525 （1986）;
Riechmannら、Nature 332:323-329 （1988）；および
Presta、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 （1992）を参照することができる。
好ましくは、本発明のヒト化結合分子は、配列番号：３（ＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳ（ＶＨ ＣＤＲ１））、配列番号：４（ＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＶＨ ＣＤＲ２））、配列番号：５（ＬＷＧＡＭＤＹ（ＶＨ ＣＤＲ３））、配列番号：６（ＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨ（ＶＬ ＣＤＲ１））、配列番号：７（ＹＡＳＱＳＩＳ（ＶＬ ＣＤＲ２））および配列番号：８（ＱＱＳＮＳＷＰＦＴ（ＶＬ ＣＤＲ３））から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む。
本明細書で用いられているところの用語「工学的に処理した」または「組換えられた」結合分子は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離された結合分子、例えば、宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現させた結合分子、組換え結合分子コンビナトリアルライブラリーから単離した結合分子、ヒト免疫グロブリン遺伝子を導入された動物（例えば、マウス）から単離した結合分子（例えば、Taylor、L.D. et al.（1992） Nucl. Acids Res. 20:6287-6295参照）、またはヒト結合分子遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の手段によって調製、発現、作出または単離された結合分子を含む。しかしながら、いくつかの態様において、そのような組換えヒト結合分子は、インビトロで突然変異誘発（または、ヒトＩｇ配列と遺伝子導入した動物を用いるときは、インビボ体細胞性突然変異誘発）を行い、それによって組換え結合分子のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列に由来し、それに関連するが、ヒト結合分子生殖系列レパートリーには天然にインビボで存在しない配列となる。
本明細書において用いられているところの用語「単離された結合分子」は、異なる抗原性の種をもつ他の結合分子から実質的にフリーの状態の結合分子を言う（例えば、ＩＬＴ３に特異的に結合する単離された結合分子は、ＩＬＴ３以外の抗原に特異的に結合する結合分子から実質的にフリーである）。さらに、単離された結合分子は、他の細胞性の物質および/または化学物質から実質的にフリーであってもよい。「単離された結合分子」は、その天然の環境に存在する成分から同定および分離および/または回収されたものである。その天然の環境の汚染物質は、例えば、結合分子の診断用もしくは治療用の使用と干渉するであろう物質を含み、また、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質様の溶質もしくは非タンパク質様の溶質を含んでもよい。好ましい態様においては、結合分子を精製して、（１）Lowryの方法で測定した場合、９５重量％を超える結合分子、最も好ましくは９９重量％結合分子；（２）スピニングカップ配列決定装置を用いたところ、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度、または（３）クーマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を用いた還元条件もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性にする。単離された結合分子は、結合分子の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞中でin situ で結合分子を含む。しかしながら、通常、単離された結合分子は、少なくとも精製ステップによって調製される。
本明細書において用いられているところの用語「結合定数」「（ｋｄ）」は、「アフィニティー定数」とも称されるが、それは、２つの分子種の間の可逆的結合の程度の測定値であり、実際の結合アフィニティーならびに見かけの結合アフィニティーを含む。実際の結合アフィニティーは、Ｍ−１Ｓ−１中のKassocとＳ−１中のKdissocとの比を計算することによって決定され、それはユニット「Ｍ−１」をもつ。したがって、結合アフィニティーを付与または最適化することは、所望のレベルの結合アフィニティーを達成するようにこれらの成分のいずれかもしくは双方を変更することを含む。見かけのアフィニティーは、例えば、相互作用の結合力である。例えば、二価のヘテロマーの可変領域結合フラグメントは、 その結合価によって、変更もしくは最適化された結合アフィニティーを示す。結合アフィニティーは、例えば、BIAcoreシステムを用いた表面プラスモン共鳴の測定によって求めることができる。
本明細書において用いられているところの用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含む。核酸分子は、一本鎖または二本鎖である。好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。
本明細書において用いられているところの用語「単離された核酸分子」は、ＩＬＴ３に結合する結合分子をコードする核酸の意味においては、結合分子をコードするヌクレオチド配列が他の配列がヒトゲノムＤＮＡの核酸に天然に隣接している他のヌクレオチド配列からフリーである核酸分子を意味する。これらの配列は、調節またはタンパク質の安定性にとって重要な５’または３’ヌクレオチド配列を任意に含むことができる。
本明細書において用いられているところの用語「ベクター」とは、連結された先の別の核酸を輸送できる核酸分子を言う。１つのタイプのベクターは、付加的なＤＮＡセグメントをライゲーションできる環状の二本鎖ＤＮＡループを言う「プラスミド」である。別のタイプのベクターはウイルスベクターである。このベクターでは、付加的なＤＮＡセグメントはウイルスゲノムにライゲーションできる。いくつかのベクターは、それらが導入された宿主細胞（例えば、バクテリア性複製起点をもつバクテリアベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）において自律複製することができる。宿主細胞の導入時に、他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主のゲノムとともに複製することができる。さらにいくつかのベクターは、それらが作用可能に結合した遺伝子の発現を指向することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技法に用いられる発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形体であるので、本明細書においては「プラスミド」および「ベクター」は、互換可能に使用することができる。しかしながら、本発明は、そのような形体の他の形体の発現ベクター、例えば、同様の機能を発揮するウイルスベクター（例えば、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含む。
本明細書において用いられる用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。このような用語は、特定の被検細胞のみならず、そのような細胞の子孫を意味することも意図されている。突然変異や環境の影響によって後の世代において特定の変形が生じるかも知れず、そのような子孫は、実際、親細胞と同一ではないかもしれないが、それでもなお本明細書において用いられる用語「宿主細胞」の範囲に含むものとする。
本明細書において用いられる用語「Ｔ細胞」（つまりＴリンパ球）は、哺乳類（たとえばヒトなど）に由来する胸腺細胞、未熟Ｔ細胞、および成熟Ｔ細胞などを含む、Ｔ細胞系統に属するすべての細胞を含む。好ましくは、Ｔ細胞は成熟Ｔ細胞であって、ＣＤ４またはＣＤ８の両方ではなくいずれか、およびＴ細胞レセプターを発現する成熟Ｔ細胞である。本願明細書に記載の各種Ｔ細胞個体群は、サイトカインプロフィールおよびその機能に基づいて定義することができる。
本明細書において用いられる用語「プロフェッショナル抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、細胞によって認識され得る形で抗原を提示する細胞である。抗原を「提示」することができる細胞には、Ｂ細胞、単球、マクロファージおよび樹状細胞が含まれる。
本明細書において用いられる用語「樹状細胞」または「ＤＣ」は、未処置のＴ細胞を活性化することができ、Ｂ細胞の成長および分化を刺激することができるＡＰＣを含む。ＤＣは、系列陰性細胞である。すなわち、それらはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および単球／マクロファージの表面マーカーを欠いているが、それらは種々の共刺激性の分子（例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲ）、および／または接着分子を強く発現する。樹状細胞は、主な２つの細胞、すなわち「骨髄由来樹状細胞」（「ＭＤＤＣ」）および「形質球様細胞由来樹状細胞」（「ＰＤＤＣ」）に細分することができる。ＰＤＤＣの増殖能力を限定することができるので、樹状細胞系列を区別するために、ＩＬＴ３などの細胞表面マーカーを使用することができる。例えば、Santiago-Schwartz、F. （2004） Rheum. Dis. Clin. Noth Am. 30:115-134を参照することができる。その内容を本明細書において引用によって援用する。さらに、ＤＣは、「未成熟ＤＣ」と「成熟ＤＣ」に分類することができる。未成熟ＤＣは、抗原捕捉およびプロセシングに特化している。一方、成熟ＤＣは、抗原を提示し、Ｔ細胞の刺激脳を増加させる。未成熟ＤＣは、当該技術において認識されている技法を用いて、例えば、炎症性サイトカイン混合物の存在下で、成熟させることができる。
本明細書において用いられる用語「未処置のＴ細胞」は、同族の抗原にさらされていないため活性化されていない、もしくはメモリー細胞であるＴ細胞を含む。未処置のＴ細胞は、循環しておらず、ヒト未処置Ｔ細胞はＣＤ４５ＲＡ＋である。もし未処置Ｔ細胞が抗原を認識し、抗原の量、投与経路および投与タイミングに依存するがそれに限定されないさらなるシグナルを認識すれば、それらは、Ｔ細胞の種々のサブセット、例えば、エフェクター細胞に増殖および分化するかもしれない。
本明細書において用いられる用語「メモリーＴ細胞」は、抗原に曝露された後、機能的に静止し、抗原の不存在下で長期間生存することができるリンパ球を含む。ヒトメモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ−である。
本明細書において用いられる用語「エフェクターＴ細胞」または「Ｔ細胞」には、抗原を除去するように働く（例えば、その他の細胞の活性化を調節するサイトカインを産生することによって、または細胞毒性活性によって）Ｔ細胞が含まれる。「エフェクターＴ細胞」という用語には、Ｔヘルパー細胞（たとえばＴｈ１およびＴｈ２細胞）ならびに細胞毒性Ｔ細胞が含まれる。Ｔｈ１細胞は、遅延型過感受性（ＤＴＨ）反応およびマクロファージ活性化を媒介し、Ｔｈ２細胞はＢ細胞に援助を提供し、アレルギー反応（例えば、ヒト免疫反応）において重要である（Mosmann and Coffman、1989、Annu.
Rev. Immunol. 7、145-173; Paul and Seder、1994、Cell
76、241-251; Arthur and Mason、1986、J.
Exp. Med. 163、774-786; Paliard、et al.、1988、J. Immunol. 141、849-855; Finkelmanら、1988、J.
Immunol. 141、2335-2341）。
本明細書において用いられる用語「Ｔヘルパータイプ１反応」（Ｔｈ１反応）は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびリンホトキシン（ＬＴ）から選択される１以上のサイトカイン、ならびにＴｈ２細胞ではなくＴｈ１細胞によって優先的もしくは独占的に産生される他のサイトカインを産生することを特徴とする反応を言う。本明細書において用いられる用語「Ｔヘルパータイプ２反応」（Ｔｈ２反応）は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０から選択される１以上のサイトカインの産生によって特徴づけられる、Ｔｈ２細胞（例えば、増強したＩｇＧ１および／またはＩｇＥ産生）によって提供される、効率的なＢ細胞の「援助」と関連するＣＤ４＋Ｔ細胞による反応を言う。
本明細書において用いられる用語「調節Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ細胞」は、低レベルのＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１２を産生するＴ細胞を含む。調節Ｔ細胞は、エフェクターＴ細胞より低レベルであるとはいえ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０を産生する。ＴＧＦβは、調節Ｔ細胞によって産生される有力なサイトカインであり、そのサイトカインは、Ｔｈ１もしくはＴｈ２細胞によって産生されるもの未満もしくはそれと同等のレベル、例えば、Ｔｈ１もしくはＴｈ２細胞の未満のレベルで産生される。調節Ｔ細胞は、細胞のＣＤ４＋ＣＤ２５＋群に認めることができる（例えば、WaldmannとCobbold. 2001. Immunity. 14:399）。調節Ｔ細胞は、活性化シグナルとともに刺激されたＴｈ１、Ｔｈ２または未処置のＴ細胞の増殖およびサイトカイン産生を（例えば、抗原および抗原提示細胞、またはＭＨＣ、例えば、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の意味において抗原と類似したシグナルを用いて）積極的に抑制する。
本明細書において用いられる用語「免疫反応不顕性」または「耐性」は、レセプター媒介刺激の活性化についての屈折度が含まれる。そのような屈折度は、一般に、抗原特異的であって、寛容化抗原への曝露が停止した後にも持続する。例えば、耐性は、例えばＩＬ−２などのサイトカイン産生の欠如によって特徴づけられる。耐性は、細胞が抗原に曝露され、最初のシグナル（Ｔ細胞レセプターまたはＣＤ−３媒介性シグナル）を受け、第２のシグナル（共刺激シグナル）が存在しないときに、例えば、ＩＬＴ３などの抑制受容体からの抑制シグナルの上方調整といった改変によって生じうる。このような条件下で、細胞を同じ抗原に再び曝露したとき（共刺激性のポリペプチドの存在下で曝露したときでさえ）、サイトカインを生成することができず、したがって、増殖することができない。例えば、耐性は、サイトカイン、例えば、ＩＬ−２の産生の欠如を特徴とする。または、混合リンパ球アッセイを使用することによって評価することができる。耐性は、自己抗原または外来抗原にも生じうる。
本明細書において用いられる用語「抑制性シグナル」は、抑制受容体（例えば、ＩＬＴ３）を介して、例えば、ＤＣ、例えば、ＭＤＤＣなどの免疫細胞上で伝達されるシグナルを言う。そのようなシグナルは、活性化レセプターを介して（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲもしくはＦｃポリペプチドを介して）、シグナルをアンタゴナイズする。抑制受容体を介してシグナルを伝達した結果、インビトロで「免疫細胞活性を下方調整する」。例えば、第２のメッセンジャー生成の阻害；増殖の阻害；免疫細胞中のエフェクター機能の阻害、例えば、例えば、貪食作用の減少、抗体産生の減少、細胞傷害特性の減少、免疫細胞によるメディエーター作製の不良（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および／もしくは、アレルギー反応のメディエーター）；または耐性の発展が生じる。
ある態様において、免疫細胞活性の下方調整は、インビトロで同種免疫反応を下方調整する。本明細書において用いられている用語「同種免疫反応」は、抗原的に異なる細胞間に生じる免疫反応を意味する。同種免疫反応は、リンパ球、すなわち、休止しているリンパ球、すなわち、２つの個体から刺激されなかったリンパ球（刺激物質およびレスポンダー）すなわち、同種のリンパ球がともに培養され、その増殖反応（「混合リンパ球反応」）が３Ｈ標識されたチミジン取り込みおよび／またはサイトカイン産生によって測定される、ある種のリンパ球増殖試験である「混合リンパ球培養または反応」（「ＭＬＣ」または「ＭＬＲ」）を用いて測定することができる。ある態様において、ＭＬＣは、一次ＭＬＣ、すなわちレスポンダー細胞を、例えば、ガンマ照射によって不活化された、もしくはされなかった刺激物質と、例えば、３日間混合する。別の態様において、ＭＬＣは、２次ＭＬＣ、レスポンダー細胞をまず、例えば、ガンマ照射によって不活化された、もしくはされなかった一次ＭＬＣ中で培養する。次いで、生存可能細胞を回収し、ガンマ照射によって不活化された、もしくはされなかった新たな刺激物質によって再び刺激し、さらに、例えば、３、４、５、６、７日間培養する。
別の態様において、免疫細胞活性化の下方調整の結果、共刺激の分子の細胞上、例えば、樹状細胞上での発現を下方調整されるか、または、共刺激性の分子発現の増加が減衰される。さらに別の態様において、免疫細胞活性化の下方調整の結果、インビトロで細胞内カルシウム流入の下方調整が生じる。
ある態様において、ＭＤＤＣの活性化状態がインビトロで下方調整される。ある態様において、ＭＤＤＣは、例えば、０日目および３日目に添加されたＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で培養された単球に由来する。ある態様において、ＭＤＤＣは、例えば、０日目および３日目に添加された本発明の結合分子の存在下で培養された単球に由来する。別の態様において、成熟樹状細胞の活性化状態が下方調整される。ある態様において、成熟樹状細胞は、例えば、１日目に添加されたＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、ＴＮＦ−アルファの存在下で培養された血液樹状細胞に由来する。別の態様において、単球の活性化状態が下方調整される。
本明細書において用いられている用語「免疫反応の上方調整」は、Ｔ細胞媒介性および/またはＢ細胞媒介性の免疫反応のインビボでの増加を意味する。免疫反応の例としては、Ｔ細胞反応、例えば、サイトカイン産生および細胞傷害性を含む。さらに、免疫反応なる用語は、抗体産生（体液性反応）および生得の免疫系、例えば、マクロファージなどのサイトカイン反応性細胞の細胞活性化を含む。
本明細書において用いられている用語「調節する」は、刺激（例えば、特定の免疫反応または活性の増加、上方調整、もしくはアップレギュレーション）および阻害（例えば、特定の免疫反応または活性の減少、下方調整、もしくはダウンレギュレーション）を含む。
用語「治療する」は、治療的および予防的治療、または予防対策を含む。治療を必要とする対象には障害を既に有している対象、ならびにまだ障害を有していない対象が含まれる。
用語「障害」は、本発明の結合分子を用いた治療により恩恵を受けるであろうあらゆる状態を言う。これには、高すぎる、もしくは低すぎる免疫反応に関連した、慢性および急性の障害または疾患または病理的状態が含まれる。
本発明の種々の局面を以下のセクションにおいてさらに詳細に説明する。
ＩＩ．ＩＬＴ３結合分子
本発明は、単離されたＩＬＴ３結合分子を提供する。本発明の結合分子の例としては、９Ｂ１１抗体、またはその結合部分が含まれる。９Ｂ１１抗体は、ＡＰＣ、例えば、単球、マクロファージ、ＭＤＤＣなどの樹状細胞、例えば、ヒト細胞上でＩＬＴ３と、高アフィニティーで結合した抗ＩＬＴ３抗体である。本発明の結合分子は、ｈＩＬＴ３と高いアフィニティーで結合し、インビトロで免疫反応を下方調整すること、例えば、同種免疫反応；樹状細胞、例えば、単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）による炎症性サイトカインの生成；ＤＣ、例えば、ＭＤＤＣによる共刺激分子のアップレギュレーション；および／または単球へのカルシウムの流入を下方調整することを特徴とする。さらに、結合分子は、樹状細胞、例えば、未成熟の樹状細胞での抑制受容体の発現をアップレギュレーションする。驚くべきことに、インビトロで免疫反応を下方調整する同じこれらの結合分子が、インビボで免疫賦活性を示す。例えば、結合分子は、例えば、ＤＴＨ反応などの細胞性免疫反応といったインビボで免疫反応を刺激する。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＨドメインは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含む。
（ＭＥＦＧＬＳＬＶＦＬＶＬＩＬＫＧＶＱＣＥＶＫＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＥＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）（９Ｂ１１、リーダーを含むＶＨドメイン））。ここに記載の結合分子の配列のいくつかは、リーダー配列を含むが、本発明の結合分子は、リーダー配列を除外してもよい、任意であることがわかる。例えば、ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：１に示された成熟タンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号：１のアミノ酸２０−１３５を含む。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＬドメインは、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を含む。
（ＭＥＴＤＴＩＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＳＶＳＬＳＣＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨＷＹＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＥＴＥＤＦＧＶＦＦＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ）（９Ｂ１１、リーダーを含むＶＬドメイン））。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＨドメインは、配列番号：１のアミノ酸２０−１３８を含む。
（ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＥＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）（９Ｂ１１、リーダーを含まないＶＨドメイン））。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＬドメインは、配列番号：２のアミノ酸残基２１−１２７を含む。
（ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＳＶＳＬＳＣＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨＷＹＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＥＴＥＤＦＧＶＦＦＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫ）（９Ｂ１１、リーダーを含まないＶＬドメイン））。
本発明のある実施態様において、ＶＬ鎖は、リーダーおよび／またはシグナル配列、すなわち、配列番号２（配列番号：２１）のアミノ酸残基１−２０を含む。ある実施態様において、ＶＨ鎖は、リーダーおよび／またはシグナル配列、すなわち、配列番号１（配列番号：２２）のアミノ酸残基１−１９を含む。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３に記載のＣＤＲを含むＶＨドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＨ、ＣＤＲ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：４に記載のＣＤＲを含むＶＨドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＨ、ＣＤＲ２）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：５に記載のＣＤＲを含むＶＨドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＨ、ＣＤＲ３）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：６に記載のＣＤＲを含むＶＬドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＬ、ＣＤＲ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：７に記載のＣＤＲを含むＶＬドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＬ、ＣＤＲ２）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：８に記載のＣＤＲを含むＶＬドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＬ、ＣＤＲ３）。
本発明は又、上記アミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＨドメインは、配列番号：９に記載のヌクレオチド配列を含む（９Ｂ１１、ＶＨドメイン、リーダーを含む）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＨドメインは、配列番号：９のヌクレオチド５８−４０５を含む（９Ｂ１１、ＶＨドメイン、リーダーを含まない）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＬドメインは、配列番号：１０に記載のヌクレオチド配列を含む（９Ｂ１１、ＶＬドメイン、リーダーを含む）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＶＨドメインは、配列番号：１０のヌクレオチド６１−３８３を含む（９Ｂ１１、ＶＨドメイン、リーダーを含まない）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、その核酸配列が配列番号：１１に示されたＣＤＲを含むＶＨドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＨ、ＣＤＲ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、その核酸配列が配列番号：１２に示されたＣＤＲを含むＶＨドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＨ、ＣＤＲ２）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、その核酸配列が配列番号：１３に示されたＣＤＲを含むＶＨドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＨ、ＣＤＲ３）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、その核酸配列が配列番号：１４に示されたＣＤＲを含むＶＬドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＬ、ＣＤＲ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、その核酸配列が配列番号：１５に示されたＣＤＲを含むＶＬドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＬ、ＣＤＲ２）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、その核酸配列が配列番号：１６に示されたＣＤＲを含むＶＬドメインを含む（９Ｂ１１、ＶＬ、ＣＤＲ３）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＣＬドメインは、配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を含む（ネズミＩｇＧ２ａ軽鎖定常領域）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＣＨドメインは、配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を含む（ネズミＩｇＧ２ａ重鎖定常領域）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を含む（キメラ、９Ｂ１１、ＶＬ／ヒト、ＣＬ、ＩｇＧ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を含む（キメラ、９Ｂ１１、ＶＨ／ヒト、Ｇｌｙ−ＣＨ、ＩｇＧ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を含む（キメラ、９Ｂ１１、ＶＨ／ヒト、Ａｇｌｙ−ＣＨ、ＩｇＧ１）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２８に記載のアミノ酸配列を含む（ヒト化、９Ｂ１１、ＶＬ）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２９に記載のアミノ酸配列を含む（ヒト化、９Ｂ１１、ＶＨ）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＣＬドメインは、配列番号：３０に記載のアミノ酸配列を含む（ヒト、ＩｇＧ１、Ｇｌｙ重鎖定常領域）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＣＨドメインは、配列番号：３１に記載のアミノ酸配列を含む（ヒト、ＩｇＧ１、Ａｇｌｙ重鎖定常領域）。
ある実施態様において、本発明の結合分子のＣＬドメインは、配列番号：３２に記載のアミノ酸配列を含む（ヒト、ＩｇＧ１軽鎖定常領域）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を含む（完全ヒト化、９Ｂ１１、軽）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３４に記載のアミノ酸配列を含む（完全ヒト化、９Ｂ１１、重Ｇｌｙ）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３５に記載のアミノ酸配列を含む（完全ヒト化、９Ｂ１１、重Ａｇｌｙ）。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２に記載の９Ｂ１１ ＶＬ領域のＶＬアミノ酸配列および配列番号：２に記載の９Ｂ１１ ＶＨ領域のＶＨアミノ酸配列を含む。別の態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２３および２４に記載のＬＣおよびＨＣ配列をそれぞれ有している。
ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥ（配列番号：２３）；ＡＫＴＴＰＰＳＶＹＰＬＡＰＧＣＧＤＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＳＶＴＶＴＷＮＳＧＳＬＳＳＳＶＨＴＦＰＡＬＬＱＳＧＬＹＴＭＳＳＳＶＴＶＰＳＳＴＷＰＳＱＴＶＴＣＳＶＡＨＰＡＳＳＴＴＶＤＫＫＬＥＰＳＧＰＩＳＴＩＮＰＣＰＰＣＫＥＣＫＣＰＡＰＮＬＥＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＮＩＫＤＶＬＭＩＳＬＴＰＫＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＤＶＱＩＳＷＦＶＮＮＶＥＶＨＴＡＱＴＱＴＨＲＥＤＹＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＱＨＱＤＷＭＳＧＫＥＦＫＣＫＶＮＮＫＤＬＰＳＰＩＥＲＴＩＳＫＩＫＧＬＶＲＡＱＶＹＩＬＰＰＰＡＥＱＬＳＲＫＤＶＳＬＴＣＬＶＶＧＦＮＰＧＤＩＳＶＥＷＴＳＮＧＨＴＥＥＮＹＫＤＴＡＰＶＬＤＳＤＧＳＹＦＩＹＳＫＬＮＭＫＴＳＫＷＥＫＴＤＳＦＳＣＮＶＲＨＥＧＬＫＮＹＹＬＫＫＴＩＳＲＳＰＧＫ（配列番号：２４）。
本発明のある実施態様において、ＶＬ鎖は、リーダーおよび／またはシグナル配列、すなわち、配列番号２（配列番号：２１）のアミノ酸残基１−２０を含む。ある実施態様において、ＶＨ鎖は、リーダーおよび／またはシグナル配列、すなわち、配列番号１（配列番号：２２）のアミノ酸残基１−１９を含む。別の態様において、本発明の結合分子は、リーダーおよび／またはシグナル配列を含まない。
ある局面において、本発明は、９Ｂ１１結合分子、ならびにｈＩＬＴ３と高いアフィニティーで結合し、インビトロで免疫反応を下方調整すること、例えば、同種免疫反応下方調整すること；単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）などの樹状細胞による炎症性サイトカインの生成、ＤＣ、例えば、ＭＤＤＣによる共刺激分子のアップレギュレーション、および／または単球へのカルシウムの流入を下方調整すること；樹状細胞、例えば未成熟樹状細胞上での抑制受容体の発現を上方調節することといった９Ｂ１１と同等の特性を持つ他の結合分子に関する。したがって本発明の均等の結合分子は、例えば、細胞中にＩＬＴ３を介して陰性シグナルを生成するか、または活性化レセプターを介して刺激性のシグナルの生成をインビトロでブロックするが、インビボでは免疫賦活性であり、例えば、それらはＩＬＴ３を隔離または下方調整し、その活性化レセプターとの結合を阻害し、それによって免疫反応を下方調整する。
ある態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と任意にリーダーを含む単離されたヒト結合分子、および配列番号：１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と任意にリーダーを含む単離されたヒト結合分子を提供する。
本発明のいくつかの実施態様において、本発明の結合分子は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域などの重鎖定常領域を含む。さらに、結合分子は、カッパ軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域といった軽鎖定常領域を含む。好ましくは、結合分子は、カッパ軽鎖定常領域を含む。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２３に記載の軽鎖定常領域を含む。ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：２４に記載の重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３０に記載の重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３１に記載の重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、本発明の結合分子は、配列番号：３２に記載の軽鎖定常領域を含む。
別の態様において、本発明は、９Ｂ１１−関連ＶＬ ＣＤＲドメインを持つ結合分子、例えば、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲドメインを持つ軽鎖可変領域（ＶＬ）を備えた結合分子を提供する。別の態様において、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも２つのＣＤＲドメインを持つ．さらに別の態様において、軽鎖可変領域（ＶＬ）は、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲドメインを持つ。
さらに別の態様において、本発明は、９Ｂ１１−関連ＶＨ ＣＤＲドメインを持つ結合分子、例えば、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲドメインを持つ重鎖可変領域（ＶＨ）を備えた結合分子を提供する。別の態様において、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも２つのＣＤＲドメインを持つ．さらに別の態様において、重鎖可変領域（ＶＨ）は、配列番号：３、配列番号：４、および配列番号：５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲドメインを持つ。
別の態様において、本発明の結合分子は、ネズミ抗ヒトＩＬＴ３結合分子由来のＣＤＲを少なくとも１つ、例えば、９Ｂ１１結合分子を含む。本明細書において用いられている、指定されたタンパク質「に由来する」という用語は、そのポリペプチドの起源を意味する。ある実施態様において、特定の開始ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ＣＤＲ配列またはそれに関連する配列である。別の態様において、特定の開始ポリペプチドに由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、ＦＲ配列またはそれに関連する配列である。ある実施態様において、特定の開始ポリペプチドに由来するアミノ酸配列は、隣接していない。
例えば、ある実施態様において、１、２、３、４、５または６のＣＤＲがネズミ９Ｂ１１抗体に由来する。ある実施態様において、本発明の結合分子は、少なくとも１つの、ネズミ９Ｂ１１抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、少なくとも２つの、ネズミ９Ｂ１１抗体の重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、少なくとも３つの、ネズミ９Ｂ１１抗体のＣＤＲを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、少なくとも４つの、ネズミ９Ｂ１１抗体のＣＤＲを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、少なくとも５つの、ネズミ９Ｂ１１抗体のＣＤＲを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、少なくとも６つの、ネズミ９Ｂ１１抗体のＣＤＲを含む。
本発明の結合分子を修飾して、それが由来する９Ｂ１１分子のアミノ酸配列を変化させてもよいことが当業者にはわかるであろう。例えば、保存的置換を行うためにヌクレオチドまたはアミノ酸置換を行ってもよいし、「非必須」アミノ酸残基を変化させてもよい（例えば、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基）、またＩＬＴ３、例えば、ヒトＩＬＴ３を結合する能力を維持させてもよい。
ある実施態様において、本発明の結合分子は、９Ｂ１１抗体、またはその部分（少なくとも３−５アミノ酸、少なくとも５−１０アミノ酸、少なくとも１０−２０アミノ酸、少なくとも２０−３０アミノ酸、もしくは少なくとも３０−５０アミノ酸からなる）に実質的に同一なポリペプチドまたはアミノ酸配列を持つか、または、そうでない場合は、開始配列の起源を有するものと当業者が認識できる程度の同一性を有する。
別の態様において、本発明の結合分子のＶＬ領域は、９Ｂ１１ ＶＬ領域のアミノ酸配列（その部分は、少なくとも３−５アミノ酸、少なくとも５−１０アミノ酸、少なくとも１０−２０アミノ酸、少なくとも２０−３０アミノ酸、もしくは少なくとも３０−５０アミノ酸を持つ）に８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を持つか、または、そうでない場合は、開始配列の起源を有するものと当業者が認識できる程度の同一性を有する。
別の態様において、本発明の結合分子のＶＨ領域は、９Ｂ１１ ＶＨ領域のアミノ酸配列（その部分は、少なくとも３−５アミノ酸、少なくとも５−１０アミノ酸、少なくとも１０−２０アミノ酸、少なくとも２０−３０アミノ酸、もしくは少なくとも３０−５０アミノ酸を持つ）に８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を持つか、または、そうでない場合は、開始配列の起源を有するものと当業者が認識できる程度の同一性を有する。
別の態様において、本発明の結合分子のＣＤＲは、９Ｂ１１ ＣＤＲのそれと約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、または、そうでない場合は、開始配列の起源を有するものと当業者が認識できる程度の同一性を有する。
別の態様において、特定の開始配列に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性、または、そうでない場合は、開始配列の起源を有するものと当業者が認識できる程度の同一性を有する。
ポリペプチドの天然でない異型例をコードする単離された核酸分子は、１以上のヌクレオチド置換、追加、または欠失を結合分子のヌクレオチド配列に導入することによって、１以上のアミノ酸の置換、追加、または欠失をコードされたタンパク質に導入する。部位指向性突然変異誘発およびＰＣＲ媒介性突然変異誘発などの標準的な技法によって突然変異を導入してもよい。ある態様において、１以上の非必須アミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を行う。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を持つアミノ酸残基と置き換わっているものである。類似の側鎖を持つアミノ酸残基は、当該技術分野において、定義されている。そしてそれには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、結合分子ポリペプチド中の非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基と置換されてもよい。別の態様において、アミノ酸のストリングを構造的に類似するストリングであって、側鎖ファミリーメンバーのオーダーおよび/または組成物において異なるストリング置き換えることができる。
別法として、別の態様において、突然変異を全てもしくは一部の結合分子コード配列にランダムに導入してもよい。
本発明の好ましい結合分子は、ヒトアミノ酸配列に由来するフレームワークおよび定常領域アミノ酸配列を含む。しかしながら、結合分子は、別の哺乳動物種に由来するフレームワークおよび／または定常領域配列を含むことができる。例えば、霊長類フレームワーク領域（例えば、非ヒト霊長類）を、重鎖部および／またはヒンジ部を対象とする結合分子に導入してもよい。ある態様において、１以上のネズミアミノ酸が、結合しているポリペプチドのフレームワーク領域に存在しているかもしれない。例えば、ヒトもしくは非ヒト霊長類フレームワークアミノ酸配列は、１以上のアミノ酸置換、および／または、対応するネズミアミノ酸残基が存在する逆突然変異を含んでもよい。本発明の好ましい結合分子は、開始９Ｂ１１ネズミ抗体より免疫原生が低い。
本発明はまた、ＩＬＴ３に特異的な、キメラおよび/またはヒト化結合分子（例えば、キメラおよび/またはヒト化イムノグロブリン）を特徴とする。キメラおよび/またはヒト化結合分子は、キメラまたはヒト化結合分子を構築するための開始物質を提供するマウスまたは他の非ヒト結合分子と同じ、もしくは類似の結合特異性およびアフィニティーを有する。
キメラ結合分子は、その軽鎖および重鎖遺伝子が、異なる種に属するイムノグロブリン遺伝子セグメントから、典型的には遺伝子工学的に構築されているものである。例えば、マウスモノクローナル結合分子からの遺伝子の可変（Ｖ）セグメントを、ヒト定常（Ｃ）セグメントに結合してもよい。例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。キメラ結合分子の例は、したがって、マウス結合分子からのＶまたは抗原結合ドメイン、ならびにヒト結合分子からのＣまたはエフェクタードメインからなるハイブリッドタンパク質である。
ある態様において、本発明は、９Ｂ１１結合分子のヒト化可変領域、およびそのようなヒト化可変領域を含むポリペプチドに関する。ある態様において、本発明の結合分子は、少なくとも１つのヒト化９Ｂ１１結合分子可変領域、例えば、軽鎖もしくは重鎖可変領域を含む。
用語「ヒト化結合分子」は、ヒト結合分子鎖に由来する可変領域フレームワーク残基を含む少なくとも１つの鎖を含む結合分子（アクセプターイムノグロブリンもしくは結合分子と言う）、マウス結合分子に由来する少なくとも１つの相補性決定領域（ドナーイムノグロブリンもしくは結合分子と言う）を意味する。ヒト化結合分子は、組換えＤＮＡ技法を用いて作製することができる。それは、以下の文献において記載されている。例えば、Hwang, W.Y.K., et al. （2005） Methods
36:35; Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, （1989）,
86:10029-10033; Jones et al., Nature, （1986）, 321:522-25; Riechmann et al., Nature, （1988）, 332:323-27; Verhoeyen et al., Science, （1988）, 239:1534-36; Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, （1989）,
86:3833-37; 米国特許第５，２２５，５３９号；５，５３０，１０１号；５，５８５，０８９号；５，６９３，７６１号；５，６９３，７６２号；６，１８０，３７０号、Selick et al., ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９０／０７８６１号、およびWinter, 米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい（それらの全てを全ての目的のために、引用によって援用する）。定常領域は、もし存在すれば、ヒトイムノグロブリンに由来することが好ましい。
ヒト化のために好ましい非ヒトドナー結合分子を選択すれば、例えば、発現したヒト抗体遺伝子の配列データベースから、いくつかのヒト結合分子の生殖細胞系列Ｉｇ配列もしくはコンセンサス配列から、適切なヒトアクセプター結合分子を取得することができる。
ある態様において、ＣＤＲホモロジーベースの方法を用いてヒト化を行う（例えば、Hwang, W.Y.K., et al. （2005）
Methods 36:35、その内容を本明細書に引用によって援用する）。この方法は通常、類似構造のマウスおよびヒトフレームワークよりむしろ類似構造のマウスおよびヒトＣＤＲに基づいて、マウスＣＤＲをヒト可変ドメインフレームワークへ置換することを含む。マウスＣＤＲとヒトＣＤＲの類似性は、通常、マウス結合分子と同じ正準ＣＤＲ構造の条件をもつ、同じ鎖タイプ（軽鎖または重鎖）のヒト遺伝子を同定し、ＣＤＲペプチド骨格の３次元高次構造を維持することによって決定される。第２に、マウスと候補ヒトＣＤＲの間の残基−残基ホモロジーに対するマッチング正準構造をもつ、それぞれの候補可変遺伝子を評価する。最後に、ヒト化結合分子、マウスＣＤＲにまだ同一性を示さない選択されたヒト候補ＣＤＲのＣＤＲ残基をマウス配列に変換する。ある態様において、ヒトフレームワークの突然変異をヒト化結合分子に導入する。
ある態様において、ヒト生殖細胞系列配列を、ＩＬＴ３結合分子ＣＤＲに対するＣＤＲホモロジーについて評価する。例えば、ネズミ９Ｂ１１抗体と、ＩＭＧＴデータベース中に２−１−１正準構造をもつ全生殖細胞系列軽鎖カッパ鎖Ｖ遺伝子を９Ｂ１１抗体配列と比較した。全１−３生殖細胞系列重鎖Ｖ遺伝子を９Ｂ１１アミノ酸配列と比較するとき、同じことを重鎖についても行った。したがって、ある態様において、本発明の結合分子は、２−１−１正準構造をもつヒトカッパ鎖Ｖ領域フレームワークを含む。別の態様において、本発明の結合分子は、１−３正準構造を持つヒト重鎖Ｖ領域フレームワークを含む。
以下の潜在的ヒト軽鎖生殖細胞系列配列を同定した。それは、本発明の結合分子のフレームワーク領域を提供することができる。より具体的には、そのような分子は、９Ｂ１１軽鎖ＣＤＲに同一性を有しないヒト軽鎖生殖系列ＣＤＲの残基をマウスＣＤＲアミノ酸に変更してもよい足場を提供することができる。
ＩＧＫＶ１−１７遺伝子には２つの対立遺伝子がある。ＩＧＫＶ１−１７の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｘ７２８０８である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰ（配列番号：３６）である。
ＩＧＫＶ１−１７の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｄ８８２５５である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＮＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＮＳＹＰ（配列番号：３７）である。
ＩＧＫＶ１−６遺伝子のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ６４８５８である。そのアミノ酸配列は、
ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＹＰ（配列番号：３８）である。
ＩＧＫＶ１−９遺伝子のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｚ０００１３である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＬＮＳＹＰ（配列番号：３９）である。
ＩＧＫＶ１−１２遺伝子には２つの対立遺伝子がある。ＩＧＫＶ１−１２の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｖ０１５７７である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰ（配列番号：４０）である。
ＩＧＫＶ１−１２の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｖ０１５７６である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＳＦＰ（配列番号：４１）である。
ＩＧＫＶ１Ｄ−１６遺伝子には２つの対立遺伝子がある。ＩＧＫＶ１Ｄ−１６の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｋ０１３２３である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰ（配列番号：４２）である。
ＩＧＫＶ１Ｄ−１６の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｖ００５５８である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＲＱＧＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＥＫＡＰＫＳＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＳＹＰ（配列番号：４３）である。
ＩＧＫＶ１−２７遺伝子のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｘ６３３９８である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＡＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＫＹＮＳＡＰ（配列番号：４４）である。
ＩＧＫＶ１−３９遺伝子には２つの対立遺伝子がある。ＩＧＫＶ１−３９の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｘ５９３１５である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ（配列番号：４５）である。
ＩＧＫＶ１−３９の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｘ５９３１８である。そのアミノ酸配列は、
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＦＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＣＧＹＳＴＰ（配列番号：４６）である。
ＩＧＫＶ１Ｄ−４３遺伝子のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｘ７２８１７である。そのアミノ酸配列は、
ＡＩＲＭＴＱＳＰＦＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＷＡＳＱＧＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＡＫＡＰＫＬＦＩＹＹＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰ（配列番号：４７）である。
以下の潜在的ヒト重鎖生殖細胞系列配列を同定した。それは、本発明の結合分子のフレームワーク領域を提供することができる。より具体的には、そのような分子は、９Ｂ１１軽鎖ＣＤＲに同一性を有しないヒト軽鎖生殖系列ＣＤＲの残基をマウスＣＤＲアミノ酸に変更してもよい足場を提供することができる。
ＩＧＨＶ３−２１遺伝子には２つの対立遺伝子がある。ＩＧＨＶ３−２１の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、ＡＢ０１９４３９である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：４８）である。
ＩＧＨＶ３−２１の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ９９６５８である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＳＳＳＳＳＹＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：４９）である。
ＩＧＨＶ３−１１遺伝子には２つの対立遺伝子および擬似遺伝子がある。ＩＧＨＶ３−１１の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ９９６５２である。そのアミノ酸配列は、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５０）である。
ＩＧＨＶ３−１１の対立遺伝子＊０３のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｘ９２２８７である。そのアミノ酸配列は、
ＱＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＳＹＴＮＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５１）である。
ＩＧＨＶ３−２３遺伝子には３つの対立遺伝子がある。ＩＧＨＶ３−２３の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ９９６６０である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ
（配列番号：５２）である。
ＩＧＨＶ３−２３の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｊ００２３６である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号：５３）である。
ＩＧＨＶ３−２３の対立遺伝子＊０３のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｕ２９４８１である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号：５４）である。
ＩＧＨＶ３−４８遺伝子には３つの対立遺伝子がある。ＩＧＨＶ３−４８の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ９９６７５である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５５）である。
ＩＧＨＶ３−４８の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、ＡＢ０１９４３８である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＳＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＳＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＤＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５６）である。
ＩＧＨＶ３−４８の対立遺伝子＊０３のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｚ１２３５８である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＥＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＳＴＩＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５７）である。
ＩＧＨＶ３−６４遺伝子には５つの対立遺伝子がある。ＩＧＨＶ３−６４の対立遺伝子＊０１のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ９９６８２である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＧＳＬＲＡＥＤＭＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５８）である。
ＩＧＨＶ３−６４の対立遺伝子＊０２のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、ＡＢ０１９４３７である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＥＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＧＳＬＲＡＥＤＭＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：５９）である。
ＩＧＨＶ３−６４の対立遺伝子＊０３のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ７７２９８である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＶＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫ（配列番号：６０）である。
ＩＧＨＶ３−６４の対立遺伝子＊０４のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ７７２９９である。そのアミノ酸配列は、
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号：６１）である。
ＩＧＨＶ３−６４の対立遺伝子＊０５のＩＭＧＴアクセッションナンバーは、Ｍ７７３０１である。そのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＳＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＹＶＳＡＩＳＳＮＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＶＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＫ（配列番号：６２）である。
これらの各生殖細胞系列配列を用いて、１以上の９Ｂ１１ＣＤＲを用いて、フレームワーク領域してもよい。
本明細書において用いられている「正準構造」は、それによって結合分子が抗原と接触する、異なるＣＤＲによって作製される保護された超可変ループ高次構造である。正準構造クラスの新しい結合分子への割り当ては、公に利用可能なソフトウェアを用いて達成される。
別の態様において、マウスＣＤＲのヒト可変ドメインフレームワークへの置換は、マウス可変ドメインフレームワークの正しい空間配置方向の維持に基づいて、ＣＤＲが由来する、マウス可変ドメインフレームワークと同じ高次構造を維持するであろうヒト可変ドメインフレームワークを同定することによって行われる。ある態様において、これは、そのフレームワーク配列がネズミ可変フレームワークドメインに対して高い配列同一性を示すヒト結合分子からのヒト可変ドメインを取得することによって達成される。Kettleborough et al., Protein
Engineering 4:773 （1991）; Kolbinger et al., Protein Engineering
6:971 （1993） およびCarter et al., ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２２６５３号を参照されたい。
好ましくは、ヒトアクセプター結合分子は、正準を維持し、ドナー結合分子の残基と相互作用する。さらに、ヒトアクセプター結合分子は、好ましくは、ＣＤＲループの長さにおいてほぼ類似性を有している。Kettleborough et al., Protein
Engineering 4:773 （1991）; Kolbinger et al., Protein Engineering
6:971 （1993） and
Carter et al., ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／２２６５３を参照されたい。
別の態様において、適切なヒトアクセプター配列は、６Ｃ８結合分子のフレームワーク領域へのホモロジーに基づいて選択してもよい。例えば、６Ｃ８結合分子のアミノ酸配列は、他の公知の結合分子のアミノ酸配列と、例えば、ＦＲ領域と６Ｃ８アミノ酸配列の可変領域配列と、公知の結合分子の公に利用可能なデータベースとを比較することによって、そして、可変領域もしくはＦＲ領域のアミノ酸と最も高いパーセント同一性、すなわち、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の同一性を持つアミノ酸を選択することによって、比較することができる。ある態様において、配列番号：６７に記載のフレームワーク配列を使用してもよい。
（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：６３；（フレームワーク残基を太字で示している）））。別の態様において、配列番号：６４に記載のフレームワーク配列を用いてもよい。
（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＹＡＳＱＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ （配列番号：６４；（フレームワーク残基を太字で示している）））。
ネズミドナーイムノグロブリンとヒトアクセプターイムノグロブリンの相補性決定領域を同定した後、次なるステップは、もしあれば、これらの成分からの残基を置換して、得られたヒト化結合分子の特性を最適化することである。一般に、ヒトアミノ酸残基のネズミとの置換は最低限にすべきである。なぜなら、ネズミ残基の導入によって、ヒトにおけるヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を誘発する結合分子のリスクが上昇するからである。免疫応答を決定するための、当業で認識されている方法を行って、特定の患者もしくは治験中のＨＡＭＡ反応をモニターすることができる。ヒト化結合分子を投与された患者に、前記治療の開始時、および治療期間中ずっと、免疫原生を付与することができる。例えば、当業者に公知の方法を用いて、患者から取得した血清サンプル中で、表面プラスモン共鳴技術（ＢＩＡＣＯＲＥ）および／または固相ＥＬＩＳＡ分析によって、抗体をヒト化治療試薬に対する抗体を検出することによって、ＨＡＭＡ反応を測定する。
必要であれば、ヒトフレームワーク領域中の１以上の残基を、ネズミ抗体中の対応する位置にある残基に変更または置換し、ヒト化抗体の該抗原に対する結合アフィニティーを保存することができる。この変更は、ときに「逆突然変異」と言われることがある。ＣＤＲ高次構造および/または抗原に対する結合におよぼす影響に基づいて、逆突然変異のためのヒト可変領域フレームワーク残基からの特定のアミノ酸を選択する。ネズミＣＤＲ領域をヒト可変フレームワーク領域 に置くことによって、高次構造的抑制をすることができる。それによって、特定のアミノ酸残基を置換して補正しない限り、結合アフィニティーの損失がきたされる。
ある態様において、逆突然変異のためのアミノ酸残基の選択は、部分的には、当業で認識されている技法を用いたコンピューターモデリングによって測定することができる。一般に、分子モデルは、イムノグロブリン鎖もしくはそのドメインのための解決された構造から開始して作製される。モデルとすべき鎖を比較して、解決されている３次元構造の鎖もしくはドメインを用いてアミノ酸配列類似性を調べ、最も類似性の高い鎖もしくはドメインを、分子モデル構築の開始点として選択する。少なくとも５０％の配列同一性を持つ鎖もしくはドメインをモデリングのために選択する。好ましくは、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％の配列同一性を持つものをモデリングのために選択する。解決している開始構造を改変し、イムノグロブリン鎖中の実際のアミノ酸またはモデル化されたドメインとの間の相違を開始構造中に許容する。次いで改変された構造をイムノグロブリン複合体に回収する。最後に、エネルギー最小化によって、および全ての原子が互いに適切な距離をおいて存在することを確認することによって、モデルを精製する。結合長、角度は許容限界中にある。
置換のためのアミノ酸残基の選択は、部分的には、特定の位置のアミノ酸の特徴を調べることによって、または、特定のアミノ酸の置換もしくは突然変異誘発の経験的観察によって、決定することができる。例えば、アミノ酸が、ネズミ可変領域フレームワーク残基と選択されたヒト可変領域フレームワーク残基の間で相違するとき、ヒトフレームワークアミノ酸は、それが、合理的に以下の（１）〜（４）が期待されるとき、マウス結合分子からの等しいフレームワークアミノ酸と置換してもよい。（１）非共有結合的に抗原と直接的に結合する、（２）ＣＤＲ領域に近接する、（３）そうでなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する（例えば、コンピューターモデリングによって測定したとき、ＣＤＲ領域の約３〜６オングストローム内存在する）、または、（４）ＶＬ−ＶＨ干渉に関与する。
「非共有結合的に抗原と直接的に結合する」残基には、確立された化学的な力、例えば、水素結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性の相互作用などによって、抗原上で直接的にアミノ酸と相互作用する可能性の高い、フレームワーク領域内の位置のアミノ酸が含まれる。
「ＣＤＲ領域に近接する」残基としては、ヒト化イムノグロブリン鎖の一次配列中の１以上のＣＤＲ非常に隣接した位置、例えば、Kabatによって定義されるＣＤＲ、またはChothia （See e.g., Chothia and Lesk JMB 196:901 （1987））によって定義されるＣＤＲに非常に隣接した位置におけるアミノ酸残基が挙げられる。これらのアミノ酸は、ＣＤＲ中のアミノ酸と特に相互作用しやすく、アクセプターから選択される場合、ドナーＣＤＲをゆがめ、アフィニティーを減少させるかもしれない。さらに、隣接したアミノ酸は、抗原と直接的に相互作用するかもしれない（Amit et al., Science, 233:747 （1986）、本明細書においは引用によって援用する）。また、これらのアミノ酸をドナーから選択することは、もともとの結合分子におけるアフィニティーを提供する抗原接触を維持するために望ましい。
「そうでなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する」残基としては、ＣＤＲ領域に影響をおよぼすのに十分な空間配置となるようにした二次構造分析によって決定されるものが含まれる。ある態様において、「そうでなければ、ＣＤＲ領域と相互作用する」残基は、ドナーイムノグロブリン（例えば、コンピューター生成モデル）の３次元モデルを分析することによって同定することができる。典型的にはオリジナルのドナー結合分子である３次元モデルは、ＣＤＲ領域外部のアミノ酸がＣＤＲに近接し、水素結合、ファン・デル・ワールス力、疎水性の相互作用などによって、ＣＤＲ中のアミノ酸と相互作用する可能性が高いことを示している。アミノ酸の位置としては、アクセプターイムノグロブリンアミノ酸よりも、ドナーイムノグロブリンアミノ酸が選択されるかもしれない。この範囲のアミノ酸は通常、ＣＤＲ内のいくつかのアトムについて、約３オングストローム内の側鎖原子を持つことになり、上記したもののような化学的な力によって、ＣＤＲ原子と相互作用しうる原子を含有しなければならない。
水素結合を形成する原子の場合、この３オングストロームは、それらの核間で測定する。しかし、結合を形成しない元素の場合、この３オングストロームは、それらのファン・デル・ワールス表面間で測定する。したがって、後者の場合、核は、相互作用が可能であると考えられる原子について、約６オングストローム以内でなければならない（３オングストロームプラスファン・デル・ワールスの合計）。多くの場合、核は、４もしくは５乃至６オングストローム離れている。アミノ酸がＣＤＲと相互作用するか否かを測定する際、重鎖ＣＤＲの最後の８アミノ酸をＣＤＲの一部と考えないことが好ましい。なぜなら、構造の観点から、これらの８アミノ酸は、フレームワークとして振舞うからである。
ＣＤＲ内のアミノ酸と相互作用しうるアミノ酸は、さらに別の方法で同定することができる。各フレームワークアミノ酸の溶媒受容表面積を、（１）未処理の結合分子中、および（２）ＣＤＲが除去された結合分子からなるａ仮説の分子中、の２つの方法で計算する。これらの２つの数値の有意差が１０平方オングストローム以上であることは、フレームワークアミノ酸の溶媒への接近が少なくとも部分的にＣＤＲによってブロックされることを示している。したがって、アミノ酸は、ＣＤＲと接触している。アミノ酸の溶媒接触可能表面積は、結合分子の３次元モデルに基づいて、当該技術分野において公知のアルゴリズムを使用して計算される（例えば、Connolly, J. Appl. Cryst.
16:548 （1983）、ならびにLee
とRichards, J. Mol. Biol. 55:379 （1971）、この両方を本明細書において引用によって援用する）。フレームワークアミノ酸はまた、別のフレームワークアミノ酸の高次構造に影響を及ぼし、ひいてはＣＤＲと接触することによって、間接的にＣＤＲと相互作用する場合もある。
フレームワーク中のいくつかの位置におけるアミノ酸は、多くの結合分子でＣＤＲと相互作用することが可能であることが知られている（ChothiaとLesk, 上掲文献、Chothia
et al.,上掲文献、およびTramontano et al., J. Mol.
Biol. 215:175 （1990）、この全てを本明細書において、引用によって援用する）。明らかに、軽鎖の２、４８および７１位置および重鎖の２６〜３０、７１および９４位置のアミノ酸は、多くの結合分子でＣＤＲと相互作用することが可能であることが知られている。軽鎖の３５位置のアミノ酸および重鎖の９３および１０３のアミノ酸もＣＤＲと相互作用する可能性が高い。これらすべての、番号付けされた位置において、（アクセプターアミノ酸とドナーアミノ酸が異なる場合）アクセプターアミノ酸よりむしろドナーアミノ酸が、ヒト化イムノグロブリンとして選択されることが好ましい。一方、ＣＤＲ領域と相互作用する特定の残基、例えば、軽鎖の第１の５アミノ酸は、時として、アクセプターイムノグロブリンから、ヒト化結合分子におけるアフィニティーの損失なしに選択される。
「ＶＬ−ＶＨ干渉に関与する」残基、または「充填残基」としては、例えば、NovotnyとHaber （Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-66 （1985））またはChothia et al, 上掲文献の定義によれば、ＶＬとＶＨ間の界面の残基を含む。通常、異常な充填残基は、それらがヒトフレームワークと異なる場合、ヒト化結合分子に位置されるべきである。
通常、上記評価基準を満たす１以上のアミノ酸が置換される。いくつかの態様において、上記評価基準を満たす全て、もしくは大半のアミノ酸が置換される。場合によっては、特定のアミノ酸が上記評価基準を満たすか否かについて、なんらかの曖昧さがあり、代わりに異型結合分子が作製される。その１つは、他のそれにはない特定の置換をもつ。そのようにして作製された別の異型結合分子は、その所望の活性および選択された好ましい結合分子に関して、本明細書に記載のあらゆるアッセイにおいて試験することができる。
通常、ヒト化結合分子のＣＤＲ領域は、ほぼ同一であり、より一般的には、ドナー結合分子の対応するＣＤＲ領域と同一である。いつも好ましいわけではないが、ときに、得られたヒト化結合分子の結合アフィニティーに感知されるほどの影響を及ぼすことなく、ＣＤＲ残基の１以上の保存的アミノ酸置換を行うことができる。保存的置換とは、ＧｌｙとＡｌａ；Ｖａｌ、ＩｌｅとＬｅｕ；ＡｓｐとＧｌｕ；ＡｓｎとＧｌｎ；ＳｅｒとＴｈｒ；ＬｙｓとＡｒｇおよびＰｈｅとＴｙｒなどの組み合わせを意味する。
置換のためのさらなる候補は、その位置のヒトイムノグロブリンとしては普通でない、もしくは「珍しい」アクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。これらのアミノ酸は、マウスドナー結合分子の同じ位置からのアミノ酸、または、より典型的にはヒトイムノグロブリンの同じ位置からのアミノ酸で置換することができる。例えば、アクセプターイムノグロブリンのヒトフレームワーク領域のアミノ酸がその位置にとって珍しいとき、また、ドナーイムノグロブリンの対応するアミノ酸が、ヒトイムノグロブリン配列のその位置にとって一般的であるとき、あるいは、アクセプターイムノグロブリンのアミノ酸がその位置にとって珍しいとき、また、ドナーイムノグロブリンの対応するアミノ酸が他のヒト配列にとって珍しいとき、置換が望ましいかもしれない。これらの評価基準は、ヒトフレームワークにおいて典型的でないアミノ酸が 結合分子構造を確実に分裂させる助けをする。さらに、一般的でないヒトアクセプターアミノ酸とヒト結合分子にとって典型的となるドナー結合分子からのアミノ酸とを置換することによって、ヒト化結合分子の免疫原性は小さくなる。
本明細書で用いられている用語「稀な」は、その位置でのそのアミノ酸の発生が、配列の約２０％未満で、より一般的には約１０％未満であることを意味する。本明細書で用いられている用語「一般的な」は、そのアミノ酸の発生が、代表的なサンプルにおける配列の約２５％を超える、より一般的には約５０％を超えることを意味する。例えば、全てのヒト軽鎖および重鎖可変領域配列を、それぞれ、特に相同的であり、いくつかの重要な位置におけるアミノ酸が同じである配列の「サブグループ」に分ける（Kabat et al., 上掲文献）。ヒト配列において、ヒトアクセプター配列のアミノ酸が「珍しい」か「一般的」かを決定する際、同じサブグループにおける人配列のみをアクセプター配列として検討することが好ましいことが多い。
置換のためのさらなる候補は、別に定義された（Chothia et al.,上掲文献）ＣＤＲ領域の一部と同定されるであろうアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。置換のためのさらなる候補は、ＡｂＭおよび／または接触定義のものとでＣＤＲ領域の一部と同定されるであろうアクセプターヒトフレームワークアミノ酸である。特に、可変重鎖のＣＤＲ１は、残基２６−３２を含むとされる。
置換のためのさらなる候補は、珍しいまたは普通でないドナーフレームワーク残基に対応するアクセプターフレームワーク残基である。珍しいまたは普通でないドナーフレームワーク残基とは、（本明細書に定義されているように）その位置におけるネズミ結合分子にとって珍しいまたは普通でないものを言う。ネズミ結合分子にとって、サブグループは、Kabatにしたがって決定することができる。そして、残基位置は、コンセンサスとは異なるものとして同定される。これらのドナー特異的相違は、活性を高めるネズミ配列における体細胞突然変異を示唆するものであるかもしれない。結合に影響を及ぼすことが予測される普通でない残基が維持される。一方、結合にとって重要でないことが予測される残基を置換することができる。
置換のためのさらなる候補は、アクセプターフレームワーク領域に発生する非生殖細胞系列の残基である。例えば、アクセプター結合分子鎖（すなわち、重要な配列を共有するヒト結合分子鎖がドナー結合分子鎖と一致する）を、生殖細胞系列結合分子鎖に配列させ（同じく、共有の重要な配列がドナー鎖と一致する）、アクセプター鎖フレームワークと生殖細胞系列鎖フレームワークとの間にマッチングしない残基を生殖細胞系列配列からの対応する残基と置換することができる。
上記した特異的アミノ酸置換の他に、ヒト化結合分子のフレームワーク領域は、それらが由来するヒト結合分子のフレームワーク領域と一般的にほぼ同一であり、より一般的には同一である。もちろんフレームワーク領域におけるアミノ酸の多くは、特異性または結合分子のアフィニティーに対してあまり寄与しない、もしくは直接的な寄与をしない。したがって、フレームワーク残基の多くの個別の保存的置換は、得られたヒト化結合分子の特異性またはアフィニティーの感知可能なほどの変化を起こすことなく、耐性がある。したがって、ある態様において、ヒト化結合分子可変フレームワーク領域は、少なくともヒト可変フレームワーク領域配列またはそのような配列のコンセンサスに少なくとも８５％の配列同一性を持つ。別の態様において、ヒト化結合分子の可変フレームワーク領域は、ヒト可変フレームワーク領域配列またはそのような配列のコンセンサスに少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を示す。しかしながら、通常、そのような置換は望ましくない。
ある態様において、本発明の結合分子はさらに、アミノ酸残基が界面充填残基であるとき、少なくとも１つのヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基に対する逆突然変異を含む。「界面充填残基」は、例えば、NovotnyとHaber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82:4592-66 （1985）に定義されているように、ＶＬとＶＨの間の界面にそれらの残基を含む。
ある態様において、本発明の結合分子はさらに、アミノ酸残基が正準残基であるとき、少なくとも１つのヒトアミノ酸残基の、対応するマウスアミノ酸残基に対する逆突然変異を含む。「正準残基」は、正準もしくは構造的クラス内において、ＣＤＲ高次構造にとって重要であることが知られている保存されたフレームワーク残基である（Tramontano et al., J. Mol.
Biol. 215:175 （1990）、それらの全てを全ての目的のために、引用によって援用する）。正準残基は、軽鎖の２、２５、２７Ｂ、２８、２９、３０、３３、４８、５１、５２、６４、７１、９０、９４および９５、重鎖の２４、２６、２７、２９、３４、５４、５５、７１および９４の残基を含む。さらなる残基（例えば、ＣＤＲ構造決定残基）は、Martin とThorton （1996） J. Mol. Biol. 263:800の方法に従って同定することができる。
ある態様において、本発明の結合分子はさらに、アミノ酸残基がＣＤＲと相互作用することが可能な位置にある場合、ヒトアミノ酸残基の対応するマウスアミノ酸残基に対する少なくとも１つの逆突然変異を含む。特に、軽鎖の２、４８、６４および７１ならびに重鎖の２６〜３０、７１および９４の位置のアミノ酸（番号付けは、Kabatにしたがっている）は、多くの抗体においてＣＤＲと相互作用できることが知られている。軽鎖の位置３５のアミノ酸ならびに重鎖の位置９３および１０３のアミノ酸も同様にＣＤＲと相互作用する可能性がある。
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ分析に基づいて、ヒトフレームワークのいくつかのアミノ酸残基を、例えば、９Ｂ１１軽鎖からの対応するアミノ酸残基を用いて、潜在的な置換のために同定した。これらには、位置３、４、９、１０、１３、１４、１５、１８、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４５、４６、４９、５８、７０、７６、７８、７９、８０、８４、８５、８６、８７、および１００が含まれる。
ある態様において、本発明の結合分子可変軽鎖フレームワークはさらに、ヒトアミノ酸残基のＱ３Ｖ（すなわち、ネズミＣＤＲおよびヒトＦＲ領域を含むＣＤＲ移植抗体の位置１のＱがＶに突然変異することを表す。これは、９Ｂ１１抗体の対応するアミノ酸残基である（リーダーなし））、Ｑ３Ｌ、Ｑ３Ｉ、Ｍ４Ｌ、Ｍ４Ｖ、Ｍ４Ｉ、Ｓ９Ａ、Ｓ９Ｇ、Ｓ９Ｖ、Ｓ９Ｌ、Ｓ９Ｉ、Ｓ１０Ｔ、Ｓ１０Ｙ、Ａ１３Ｖ、Ａ１３Ｌ、Ａ１３Ｉ、Ｓ１４Ｔ、Ｓ１４Ｙ、ＶＰ１５、Ｒ１８Ｓ、Ｒ１８Ｔ、Ｒ１８Ｙ、Ｔ２０Ｓ、Ｔ２０Ｙ、Ｉ２１Ｌ、Ｉ２１Ｖ、Ｔ２２Ｓ、Ｔ２２Ｙ、Ｇ４１Ｈ、Ｇ４１Ｃ、Ｋ４２Ｅ、Ｋ４２Ｄ、Ａ４３Ｓ、Ａ４３Ｔ、Ａ４３Ｙ、Ｋ４５Ｒ、Ｒ４６Ｌ、Ｒ４６Ｉ、Ｒ４６Ｖ、Ｙ４９Ｋ、Ｙ４９Ｒ、Ｖ５８Ｉ、Ｖ５８Ｌ、Ｅ７０Ｄ、Ｓ７６Ｎ、Ｓ７６Ｑ、Ｌ７８Ｖ、Ｌ７８Ｉ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｐ８０Ｔ、Ｐ８０Ｓ、Ｐ８０Ｙ、Ａ８４Ｇ、Ａ８４Ａ、Ｔ８５Ｌ、Ｔ８５Ｉ、Ｙ８６Ｆ、Ｙ８６Ｗ、Ｙ８６Ｖ、Ｙ８６Ｌ、Ｙ８６Ｉ、Ｙ８７Ｆ、Ｙ８７Ｗ、Ｙ８７Ｖ、Ｙ８７Ｌ、Ｙ８７Ｉ、Ｑ１００Ａ、Ｑ１００Ｐ、およびＱ１００Ｇからなる群から選択される対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む。
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ分析に基づいて、ヒトフレームワークのいくつかのアミノ酸残基を、例えば、９Ｂ１１重鎖からの対応するアミノ酸残基を用いて、潜在的な置換のために同定した。これらには、３、１０、１９、４０、４２、４４、４９、７６、７８、８４、８８、９３、および９７が含まれる。
ある態様において、本発明の結合分子可変重鎖フレームワークはさらに、ヒトアミノ酸残基のＱ３Ｋ（すなわち、ネズミＣＤＲおよびヒトＦＲ領域を含むＣＤＲ移植抗体の位置３のＱがＫに突然変異することを表す。これは、９Ｂ１１抗体の対応するアミノ酸残基である）、Ｑ３Ｈ、Ｑ３Ｒ、Ｇ１０Ｄ、Ｇ１０Ｅ、Ｒ１９Ｋ、Ｒ１９Ｈ、Ａ４０Ｔ、Ａ４０Ｙ、Ａ４０Ｓ、Ｇ４２Ｅ、Ｇ４２Ｄ、Ｇ４４Ｒ、Ｇ４４Ｋ、Ｓ４９Ａ、Ｓ４９Ｇ、Ｓ４９Ｖ、Ｓ４９Ｌ、Ｓ４９Ｉ、Ｋ７６Ｒ、Ｋ７６Ｈ、Ｓ７８Ｔ、Ｓ７８Ｙ、Ｎ８４Ｓ、Ｎ８４Ｔ、Ｎ８４Ｙ、Ａ８８Ｓ、Ａ８８Ｔ、Ａ８８Ｙ、Ｖ９３Ｌ、Ｖ９３Ｉ、Ｖ９３Ａ、Ｖ９３Ｇ、Ａ９７Ｅ、およびＡ９７Ｄからなる群から選択される対応するマウスアミノ酸残基への少なくとも１つの置換を含む。
ヒト化結合分子は、好ましくは、少なくともｌ０７、１０８、１０９またはｌ０１０Ｍ−１の抗原に対する特異的結合アフィニティーを示す。通常、抗原に対するヒト化結合分子の結合アフィニティーの上限は、ドナーイムノグロブリンのそれの３、４または５倍以内である。しばしば、結合アフィニティーの下限もまた、ドナーイムノグロブリンのそれの３、４または５倍以内である。別法として、結合アフィニティーを（例えば、ドナーＣＤＲおよびアクセプターＦＲをもつが、ＦＲ置換を持たない結合分子）をもたないヒト化結合分子のそれと比較することができる。そのような例において、最適化された結合分子（置換を有する）は、置換されていない結合分子と比較して、好ましくは、少なくとも２〜３倍大きい、または３〜４倍大きい。比較のために、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（すなわち、非標識試薬を用いた表面プラスモン共鳴）または競合的結合アッセイによって、種々の結合分子の活性を決定することができる。
ヒト化結合分子のＣＤＲおよびフレームワーク成分を概念的に選択すれば、そのような結合分子を作製するための種々の方法が適用可能である。コードの縮重により、種々の核酸配列は、それぞれの結合分子のアミノ酸配列をコードするであろう。所望の核酸配列を、早期に作製された所望のポリヌクレオチドの異型のde novo 固相ＤＮＡ合成もまたはＰＣＲ突然変異誘発によって作製することができる。
オリゴヌクレオチド媒介性の突然変異誘発は、標的ポリペプチドＤＮＡの異型の置換、欠失、挿入を調製するための好ましい方法である。Adelman et al. （DNA 2:183 （1983））を参照されたい。簡単に述べれば、標的ポリペプチドＤＮＡは、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを、一本鎖ＤＮＡ鋳型にハイブリダイズすることによって改変することができる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、全体的な第２のオリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、選択された改変を標的ポリペプチドＤＮＡにコードする鋳型の相補鎖を合成する。
上掲文献に記載のようにして作製した結合分子の可変セグメント（例えば、キメラ、ヒト化もしくはヒト結合分子の重鎖および軽鎖可変領域）は、典型的には、少なくとも一部のイムノグロブリン定常領域（Ｆｃ）に、典型的には、ヒトイムノグロブリンのそれに結合する。ヒト定常領域ＤＮＡ配列は、公知の方法に従って、種々のヒト細胞、好ましくは不死化Ｂ細胞から単離することができる（Kabat et al.上掲文献、およびLiu et al．ＰＣＴ国際公開公報Ｗ０８７／０２６７１号）（それらの全てを全ての目的のために、引用によって援用する）。通常、結合分子は、軽鎖および重鎖定常領域の双方を含有する。重鎖定常領域は、通常ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４領域を含む。本明細書に記載の結合分子は、全てのタイプの定常領域を有する抗体（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥ）、ならびにあらゆるアイソタイプ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）を含む。定常領域の選択は、部分的には、または結合分子依存性補体および／または細胞媒介性毒性が望ましいかどうかにしたがって成される。例えば、アイソタイプＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、補体活性を持ち、アイソタイプＩｇＧ２およびＩｇＧ４はもたない。結合分子（例えば、ヒト化結合分子）が細胞傷害性活性を示すことが望ましいとき、定常ドメインは通常、定常ドメインを固定する補体であり、そのクラスは典型的にはＩｇＧ１である。そのような細胞傷害性活性が望ましくない場合、定常ドメインは、例えば、ＩｇＧ２クラスであるかもしれない。アイソタイプの選択は、抗体の脳への継代培養にも影響を及ぼす。ヒトアイソタイプＩｇＧ１が好ましい。軽鎖定常領域は、ラムダもしくはカッパとすることができる。ヒト化結合分子は、１以上のクラスもしくはアイソタイプからの配列を含んでもよい。結合分子は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含有する四量体として、分離した重鎖、軽鎖として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖとして、もしくは重鎖および軽鎖可変ドメインがスペーサーを介して結合している一本鎖結合分子として、発現させることができる。
ＩＩＩ．結合分子の作製
本発明は、ＩＬＴ３、例えば、ヒトＩＬＴ３に特異性を有する結合分子に関する。そのような結合分子は、本発明の種々の治療的組成物の作製に用いることができ、好ましくは、ヒト化もしくはキメラ結合分子（以下に詳細に示す）の作製のための相補性決定領域を提供する。非ヒトモノクローナル結合分子、例えば、ネズミ、モルモット、霊長類、ウサギ、もしくはラットの作製は、例えば、ＩＬＴ３もしくはＩＬＴ３をコードする核酸分子を持つ動物を免疫することによって達成することができる。例えば、９Ｂ１１結合分子は、ヒトＩＬＴ３をコードする遺伝子を発現ベクターに入れ、動物を免疫することによって作製することができる。ＩＬＴ３もしくはＩＬＴ３の免疫原性フラグメントもしくは抗イディオタイプのＩＬＴ３の結合分子を含むより長いポリペプチドを用いることもできる（例えば、Harlow & Lane, 上掲文献、全ての目的のために引用によって援用する）。そのようなイムノゲンは、ペプチド合成もしくは組換え発現によって、天然のソースから取得することができる。以下に述べるように、任意に該イムノゲンを、投与、融合、そうでなければ、キャリアタンパク質と複合体形成することができる。任意に該イムノゲンをアジュバントとともに投与することができる。用語「アジュバント」は、抗原と組み合わせて投与されたとき、抗原に対する免疫応答を高めるが、単独で投与されたとき、抗原に対する免疫応答を発生させない化合物を言う。アジュバントは、リンパ球補充、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の刺激、ならびにマクロファージの刺激を含めたいくつかのメカニズムによって免疫応答を増強させる。いくつかのタイプのアジュバントは、以下に述べるようにして用いることができる。実験動物を免疫するためには、完全フロイントアジュバントを用い、その後不完全アジュバントを用いることが好ましい。
ポリクローナル結合分子を作製するために、典型的にウサギまたはモルモットを使用することができる。ポリクローナル結合分子の調製例、例えば、継代保護は、以下のようにして行うことができる。動物を、１００μｇのＧＩＴＲおよびアジュバントで免疫し、４〜５ヶ月目に安楽死させる。血液を回収し、ＩｇＧを他の血液成分から分離する。イムノゲンに特異的な結合分子は、アフィニティークロマトグラフィーによって部分的に精製してもよい。動物１匹あたり平均約０．５〜１．０ｍｇのイムノゲン特異性結合分子を取得し、合計６０〜１２０ｍｇ取得する。
モノクローナル結合分子を作製するために、典型的にマウスを使用することができる。フラグメントまたはより長い形態のＩＬＴ３をマウスに注射し、ハイブリドーマを調製し、ＩＬＴ３に特異的に結合する結合分子のためのハイブリドーマをスクリーニングすることによって、フラグメントに対するモノクローナルを作製することができる。任意に、他の非オーバーラップのＩＬＴ３のフラグメントに結合させずに、特異的領域もしくは所望のＩＬＴ３のフラグメントに結合させるために、結合分子をスクリーニングした。後者スクリーニングは、結合分子の、ＩＬＴ３ペプチドの欠失突然変異の集合物に対する結合を決定することによって、どの欠失突然変異が結合分子に結合するかを決定することによって、達成することができる。結合は、例えば、ウェスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって調べることができる。結合分子への特異的結合を示す最小フラグメントが、結合分子のエピトープを定義する。あるいは、エピトープ特異性が、試験結合分子もしくは参照結合分子がＩＬＴ３に対する結合に競合する競合アッセイによって決定することができる。もし、試験結合分子もしくは参照結合分子が競合すれば、それらは同じエピトープ（もしくは十分に遠位にあるエピトープ）に結合し、その結果、結合分子の結合どうしが互いに干渉する。そのような結合分子のための好ましいアイソタイプは、マウスアイソタイプＩｇＧ２ａもしくは他の種の等価アイソタイプである。マウスアイソタイプＩｇＧ２ａは、ヒトアイソタイプＩｇＧ１の等価である。
別の態様において、結合分子をコードするＤＮＡは、従来の方法によって容易に単離して配列してもよい（例えば、ネズミ結合分子重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いた方法など）。単離され、サブクローニングされたハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましいソースとして働く。単離してすぐ、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いでそれを原核生物もしくは真核生物の宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、類人猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）細胞、または、イムノグロブリンを作製しない骨髄腫細胞にトランスフェクトする。より詳細には、単離されたＤＮＡ（以下に述べるように合成的でもよい）を用いて、Newman et al., 米国特許第５，６５８，５７０号（１９９５年１月２５日出願、本明細書において引用によって援用する）に記載のように、結合分子の製造のための、定常および可変領域配列へクローンニングを行う。基本的に、これは、選択された細胞からのＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡの変換、Ｉｇ特異性プライマーを用いたＰＣＲによる増幅を必然的に伴う。この目的にとって好適なプライマーについても米国特許第５，６５８，５７０号に記載がある。所望の抗体を発現する形質転換された細胞を、比較的大量に作製し、臨床および市販用の結合分子を提供することができるかもしれない。
当業者は、結合分子をコードするＤＮＡまたはそのフラグメント（例えば、抗原結合部位）は、例えば、ｐｄファージもしくはＦｄファージミド技法を用いた抗体ファージライブラリーに由来するかもしれないことを理解するであろう。その方法の例が、例えば、欧州特許第３６８６８４Ｂ１号；米国特許第５，９６９，１０８号、Hoogenboom,
H.R. とChames. 2000. Immunol.
Today 21:371; Nagy et
al. 2002. Nat. Med. 8:801; Huie et al. 2001. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 98:2682; Lui et al. 2002.
J. Mol. Biol.
315:1063に記載されている。そのそれぞれを本明細書においては引用によって援用する。いくつかの出版物（例えば、Marks et
al. Bio/Technology 10:779-783 （1992））は、大きなファージライブラリーを構築するための方法として、高アフィニティーヒト結合分子の鎖シャフリングによる作製、ならびにコンビナトリアル感染およびインビボ 組換えについて記載している。別の態様において、リボソーム性の表示を行って、バクテリオファージを表示プラットフォームに置き換える（例えば、Hanes et
al. 2000. Nat.
Biotechnol. 18:1287; Wilson
et al. 2001. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA
98:3750; or Irving
et al. 2001 J. Immunol. Methods
248:31）。さらに別の態様において、細胞表面ライブラリーをスクリーニングして結合分子を得ることができる（Boder et
al. 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
97:10701; Daugherty et al.
2000 J. Immunol. Methods 243:211）。そのような処置は、単離およびそれに続くモノクローナル結合分子のクローニングのための伝統的なハイブリドーマ技法にとって変わるものである。
本発明のさらに別の態様は、ヒトまたは実質的にヒト結合分子を、内因性イムノグロブリンを産生することができないトランスジェニック動物（例えば、マウス）で生成することを含む（例えば、米国特許第６,０７５，１８１号、第５,９３９，５９８号、第５,５９１，６６９号、第５,５８９，３６９号を参照されたい。それぞれ本明細書において引用によって援用する）。例えば、キメラおよび生殖細胞系列突然変異マウスにおける抗体重鎖結合領域のホモ接合性の欠失の結果、内因性の抗体産生の完全な阻害を引き起こすことが記載されている。ヒトイムノグロブリン遺伝子アレイを、そのような生殖細胞系列突然変異マウスへ転移した結果、抗原誘発後すぐに、ヒト結合分子が作製されるであろう。ＳＣＩＤマウスを用いてヒト結合分子を作製するための別の好ましい手段が、米国特許第５,８１１，５２４号に開示されている。それを本発明において引用によって援用する。これらのヒト結合分子に関連する遺伝物質を、本明細書に記載のように単離し、操作してもよいことが理解できるであろう。
組換え結合分子を生成するための、さらに別の非常に効率的な手段が、Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 （1992）に開示されている。具体的には、この技術によって、サル可変ドメインおよびヒト定常配列を含有する霊長類結合分子を作製することができる。この引例の全体を本明細書において引用によって援用する。さらにこの技法は、米国特許第５，６５８，５７０号、第５，６９３，７８０号、第５，７５６，０９６号に開示されている。そのそれぞれを引用によって本明細書に引用する。
別の態様において、リンパ球をマイクロマニピュレーションによって選択し、可変遺伝子を単離することができる。例えば、末梢血単核細胞を、免疫した哺乳動物から単離し、で約７日間培養することができる。該培養物をスクリーニングして、スクリーニング評価基準を満たす特異的ＩｇＧを選別することができる。細胞は、陽性のウェルから単離することができる。個別のＩｇ産生Ｂ細胞は、ＦＡＣＳによって、または、それらを補体で媒介された溶血プラークアッセイ中で、単離することができる。Ｉｇ産生Ｂ細胞を、試験管内でマイクロマニピュレーションし、ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲを用いて増幅することができる。ＶＨおよびＶＬ遺伝子は、抗体発現ベクターにクローニングすることができ、細胞中（例えば、真核生物細胞または原核生物細胞）にトランスフェクトして、発現させることができる。
さらに、本発明ポリペプチドを産生させるために有用な遺伝子配列は、いくつかの異なるソースから取得することができる。例えば、上で広範囲において説明したように、種々のヒト抗体遺伝子は、公にアクセス可能な寄託機関の形態のものを利用可能である。抗体および抗体がコードする遺伝子の多くの配列が公開されている。そして好適な抗体遺伝子をこれらの配列から、当業で認識されている技術を用いて化学的に合成することができる。本発明のこの局面に適合するオリゴヌクレオチド合成技術は、当業者に公知であり、いくつかの市販されている自動合成装置を用いて行うことができる。さらに、本明細書において示したいくつかのタイプの重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡ配列は、市販のＤＮＡ合成の業者のサービスを介して取得することができる。その後、前記あらゆる方法を用いて取得した遺伝子物質を、改変または合成して、本発明のポリペプチドを取得することができる。
別法として、抗体産生細胞系列を選択し、当業者に公知の方法を用いて培養することができる。そのような技法については、種々の実験室マニュアルや主要な出版物に記載がある。この局面において、以下に述べるように本発明において使用するのに適した技法については、Current Protocols in Immunology, Coligan
et al., Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley
and Sons, New York （1991） に記載がある。その内容全体を補足も含めて、本明細書に引用によって援用する。
よく知られているように、ＲＮＡは、グアニジニウムイソチオシアネート抽出や、遠心分離もしくはクロマトグラフィーによる析出法などの標準的な方法によって、オリジナルのハイブリドーマ細胞または、他の形質転換された細胞から単離することができる。望ましければ、ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロース上のクロマトグラフィーなどの標準的な方法によって、全ＲＮＡから単離することができる。好適な技術は、当該技術において公知である。
ある態様において、結合分子の軽鎖および重鎖をコードするｃＤＮＡは、公知の方法にしたがって、逆トランスクリプターゼおよびＤＮＡポリメラーゼを用いて、同時に、あるいは別個に作製することができる。公開されている重鎖および軽鎖ＤＮＡおよびアミノ酸配列に基づいて、コンセンサス定常領域プライマーまたはより特異的なプライマーによってＰＣＲを開始することができる。上記したように、結合分子軽鎖および重鎖をコードするＣＮＡクローンを単離するためにＰＣＲを使用することもできる。この場合、ライブラリーを、コンセンサスプライマーまたはより大きなホモログプローブ、例えば、マウス定常領域プローブによってスクリーニングしてもよい。
ＤＮＡ、典型的には、プラスミドＤＮＡは、公知の方法を用いて細胞から単離してもよい。詳細を示した、標準的な公知の方法、例えば、組換えＤＮＡ技法に関連する上記引用文献中に示した方法にしたがって、制限マッピングおよび配列決定してもよい。もちろん、ＤＮＡは、単離プロセスまたは続く分析中のあらゆるポイントにおいて、本発明にしたがって合成してもよい。
ある態様において、本発明の結合分子は、抗原の抗原結合フラグメントを含む、または、それによって構成される。用語「抗原−結合フラグメント」は、抗原に結合する、または、抗原が結合（すなわち、特異的結合）をする、未処理の抗体（すなわち、それらが由来する未処理の抗体）に競合するイムノグロブリンまたは抗体のポリペプチドフラグメントを表す。本明細書において用いられている用語、抗体分子の「フラグメント」は、抗体の抗原−結合フラグメント、例えば、抗体軽鎖（ＶＬ）、抗体重鎖（ＶＨ）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、および単一ドメイン抗体フラグメント（ＤＡｂ）を意味する。フラグメントは、例えば、未処理もしくは完全な抗体または抗体鎖の化学的もしくは酵素的処理を介して、または組換え手段によって、取得することができる。
ある態様において、本発明の結合分子は、工学的処理が施された、または改変された抗体である。工学的に処理された形態の抗体の例としては、例えば、ミニボディー（ミニボディー（Minibodies））、ジアボディー（diabodies）、ＣＨ３分子に融合されたジアボディー（diabodies）、四価の抗体、イントラジアボディー（intradiabodies）（例えば、Jendreyko et al. 2003. J. Biol. Chem. 278:47813）、二重特異性抗体、融合タンパク質（例えば、抗体サイトカイン融合タンパク質）、または二重特異性抗体が挙げられる。他のイムノグロブリン（Ｉｇ）および特定の変形例を、例えば、米国特許第４，７４５，０５５号；欧州特許第２５６，６５４号；Faulkner et al., Nature 298:286
（1982）; 欧州特許第１２０，６９４号；欧州特許第１２５，０２３号；Morrison, J. Immun. 123:793 （1979）; Kohler et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 （1980）; Raso et al., Cancer Res. 41:2073 （1981）; Morrison et
al., Ann. Rev.
Immunol. 2:239 （1984）; Morrison, Science 229:1202 （1985）;
Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851 （1984）；欧州特許第２５５，６９４号；欧州特許第２６６，６６３号；ならびにＰＣＴ国際公開公報ＷＯ８８／０３５５９に記載されている。再配列されたイムノグロブリン鎖も公知である。例えば、米国特許第４，４４４，８７８；ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ８８／０３５６５；および欧州特許第６８，７６３号および、そこに引用されている引例を参照されたい。
ある態様において、本発明の改変された抗体は、ミニボディーである。ミニボディーは、それぞれＳｃＦｖ分子（１以上の抗原結合部位を含む単一ポリペプチド、例えば、柔軟なリンカーによってＶＨドメインイン結合したＶＬドメインが結合ペプチドを介してＣＨ３ドメインに融合している）をもつ２つのポリペプチド鎖からなる二量体分子である。
ＳｃＦｖ分子は、ＶＨ−リンカー−ＶＬ配向定位、またはＶＬ−リンカー−ＶＨ配向定位中に構築することができる。
抗原結合部位を構成するＶＬドメインとＶＨドメインとを結合する柔軟なヒンジは、約１０乃至約５０のアミノ酸残基から構成されることが好ましい。この目的のための結合ペプチドの例としては、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号：２０） （Huston
et al. . 1988. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 85:5879）がある。他の結合ペプチドは、当該技術分野において公知である。
一本鎖抗体を作製する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ho et al. 1989. Gene 77:51; Bird et al. 1988 Science 242:423; Pantoliano et
al. 1991. Biochemistry 30:10117; Milenic et al. 1991. Cancer Research 51:6363;
Takkinen et al. 1991. Protein
Engineering 4: 837を参照されたい。
ミニボディーは、ＳｃＦｖ成分および結合ペプチド−ＣＨ３成分を当該技術において記載されている方法を用いて構築することによって、作製することができる（例えば、米国特許第５，８３７，８２１号またはＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９４／０９８１７Ａ１）。これらの成分は、分離したプラスミドから制限フラグメントとして単離し、ライゲーションし、適切なベクターに再度クローニングすることができる。適切なアセンブリーは、制限消化およびＤＮＡ配列分析によって確認することができる。
ジアボディーは、ｓｃＦｖ分子に類似しているが、通常、Ｖ−ドメイン間を結合し、同じポリペプチド鎖上のＶＬドメインおよびＶＨドメインが相互作用しないようにする、短い（１０未満、好ましくは１〜５）のアミノ酸残基リンカーを有する。かわりに、一方のポリペプチド鎖のＶＬドメインおよびＶＨドメインは、第２のポリペプチド鎖上のＶＨドメインおよびＶＬドメイン（それぞれ）と相互作用する（ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ０２／０２７８１）。ある態様において、本発明の結合分子は、少なくとも１つの重鎖部分に融合したジアボディーである。別の好ましい態様において、本発明の結合分子は、ＣＨ３ドメインに融合したジアボディーである。
他の形態の改変された抗体も、本発明の範囲に包含される（例えば、ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ０２／０２７８１Ａ１；５，９５９，０８３；６，４７６，１９８Ｂ１；米国特許第２００２／０１０３３４５Ａ１号；ＰＣＴ国際公開公報００／０６６０５； Byrn et al. 1990. Nature. 344:667-70; ChamowとAshkenazi. 1996. Trends Biotechnol. 14:52）。
ある態様において、本発明の結合分子は、イムノグロブリン定常領域を含む。定常領域がいくつかのエフェクター機能を媒介することは、当該技術分野において公知である。例えば、補体のＣ１成分の結合分子への結合が補体系を活性化する。補体の活性化は、オプソニン処理、細胞病原体の溶解において重要である。補体の活性化はまた、炎症性の反応を刺激する。また、それは、自己免疫過敏症にも関与するかもしれない。さらに別の結合分子は、Ｆｃ領域を介して細胞に結合する。結合分子Ｆｃ領域上のＦｃレセプター部位は、細胞上のＦｃレセプター（ＦｃＲ）に結合する。異なるクラスの結合分子に特異的ないくつかのＦｃレセプター、例えば、ＩｇＧ（ガンマレセプター）、ＩｇＥ（イプシロンレセプター）、ＩｇＡ（アルファレセプター）およびＩｇＭ（ミューレセプター）が存在する。結合分子のＦｃレセプターへの細胞表面上での結合によって、結合分子をコーティングした粒子の貪食および破壊、免疫複合体の分解、結合分子をコーティングした標的細胞のキラー細胞による溶解（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性、もしくはＡＤＣＣと呼ばれる）、炎症性の仲介物質の放出、経胎盤伝達およびイムノグロブリン産生のコントロールといった、いくつかの重要かつ多様な生物学的反応を引き起こす。
ある態様において、エフェクター機能は、標的細胞を枯渇させることができないと考えられているＩｇＧ４結合分子の定常領域を使用することによって、または、Ｆｃ変形例を作製することによって、削除もしくは減少させることができる。エフェクター機能にとって重要なＦｃ領域内の残基は、公知の技術（例えば、米国特許第５,５８５，０９７号）によって突然変異させることができる。例えば、定常領域ドメインの欠失もしくは不活化（点突然変異または別の手段による）は、循環する改変された結合分子のＦｃレセプター結合を減少させ、それによって腫瘍の局在化を増加させる。その他の場合においては、それは、本発明と一致する定常領域改変によって、補体結合を和らげ、それによって、複合化したサイトトキシンの血清半減期および非特異的結合を減少させる。定常領域の他の変形例は、抗原特異性または結合分子の柔軟性の増加によって、局在化を増強させるジスルフィド結合または、オリゴ糖部分改変をするために用いることができる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のように改変された結合分子は、容易に理解することができるかもしれない、もしくはできないかもしれない、いくつかのサブセットの効果を発揮しうることを理解するであろう。しかしながら、得られた生理学的プロファイル、バイオアベイラビリティおよび他の生化学的作用（例えば、腫瘍の局在化、生体内分布および血清半減期）を容易に、免疫学的方法によって、過度な実験をすることなく、測定および定量化することができる。
ある態様において、本発明の結合分子は、別の機能的分子に誘導体化または結合することができる（例えば、別のペプチドもしくはタンパク質）。したがって、本発明の結合分子は、誘導体化された、そうでなければ改変された形態の、本明細書に記載の抗ＩＬＴ３結合分子（イムノアドヘシン分子）を含む。例えば、本発明の結合分子は、機能的に、異常の他の分子部分、例えば、結合分子と他の分子（例えば、ストレプトアビジンコア領域もしくはポリヒスチジンタグ）の結合を媒介することができる、他の結合分子（例えば、二重特異性抗体もしくはジアボディー）、または、検出可能な作用物質、細胞傷害性物質、薬学的物質、および/または、タンパク質もしくはペプチドに結合（化学的結合、遺伝的融合、非共有結合もしくはその他）することができる。
誘導体化された結合分子の１つのタイプは、２以上の結合分子（例えば、二重特異性抗体を作製するための同一タイプ、もしくは異なるタイプ）を架橋することによって作製することができる好適なクロスリンカーとしては、適切なスペーサー（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）によって分離された２つのはっきりした反応グループをもつヘテロ二機能性、またはホモ二機能性（例えば、ジスクシンイミジルスベリン酸塩）をもつものが挙げられる。そのようなリンカーは、Pierce Chemical Company,
Rockford, ILから入手可能である。
それによって本発明の結合分子が誘導体化されうる有用な検出可能な物質は、蛍光化合物を含む。検出可能な蛍光物質の例としては、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリンなどが挙げられる。結合分子はまた、アルカリ性ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ, グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素によって誘導体化されうる。結合分子が、検出可能な酵素によって誘導体化される場合、それは、検出可能な反応産物を作製するために酵素を使用するさらなる試薬を添加することによって検出される。例えば、検出可能な物質、西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加によって、検出可能な着色された反応物が導かれる。結合分子はまた、ビオチンによって誘導体化することもでき、アビジンもしくはアビジン結合の間接的な測定によって測定することもできる。
ＩＶ．結合分子の発現
本発明の結合分子は、イムノグロブリン軽鎖および重鎖遺伝子の宿主細胞中での組換え発現によって調製することができる。結合分子を組換え的に発現させるために、宿主細胞を、結合分子のイムノグロブリン軽鎖および重鎖をコードして、軽鎖および重鎖を宿主細胞中で発現させるＤＮＡフラグメントをもつ１以上の組換え発現ベクターでトランスフェクトする。好ましくは、宿主細胞を培養している培地であって、そこから結合分子を除去することができる培地中に分泌させる。標準的な組換えＤＮＡ方法を用いて、抗体重鎖および軽鎖遺伝子を取得し、これらの遺伝子を組換え発現ベクターに組み込み、該ベクターを宿主細胞中に導入する。Sambrook, Fritsch and Maniatis （eds）,
Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor,
N.Y., （1989）,
Ausubel, F.M. et al. （eds.） Current Protocols in Molecular Biology,
Greene Publishing Associates, （1989） and in 米国特許第. 4,816,397 by Boss, et al.に記載されているように行う。
本発明の結合分子を発現させるために、部分的もしくは全長軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを発現ベクターに挿入して、その遺伝子が転写および翻訳調節配列に作用可能に連結するようにしてもよい。この文脈において、「作用可能に連結する」とは、結合分子遺伝子がベクターにライゲーションして、ベクター内の転写および翻訳調節配列が、結合分子遺伝子の転写および翻訳を調節するという、それらの意図された機能を発揮するようにすることを意味する。ある態様において、発現ベクターおよび発現調節配列は、用いられる発現宿主細胞と両立するように選択される。結合分子軽鎖遺伝子および結合分子重鎖遺伝子を、分離したベクターに挿入する。または、典型的には双方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入する。結合分子遺伝子を標準的な方法（例えば、結合分子遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的な制限部位のライゲーション、または、もし制限部位が存在しなければ、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入してもよい。結合分子の軽鎖または重鎖配列の挿入前に、発現ベクターは、結合分子定常領域配列を有してもよい。例えば、ＶＨおよびＶＬ配列を全長結合分子遺伝子に変換する１つのアプローチは、それらを、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターにそれぞれ挿入して、ＶＨセグメントをベクター内のＣＨセグメントに作用可能に連結し、ＶＬセグメントをベクター内のＣＬセグメントに作用可能に連結することである。さらに、または別法として、組換え発現ベクターは、結合分子鎖の宿主細胞からの分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることができる。結合分子鎖遺伝子を該ベクターにクローンニングし、シグナルペプチドがインフレームでが結合分子鎖遺伝子のアミノ末端に結合するようにしてもよい。シグナルペプチドは、イムノグロブリンシグナルペプチドであってもよいし、または、異種のシグナルペプチド（すなわち、非イムノグロブリンタンパク質からのシグナルペプチド）であってもよい。
結合分子鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞中の結合分子鎖の発現を調節する調節配列を保有する。用語「調節配列」は、結合分子鎖遺伝子の転写または翻訳を調節するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。そのような調節配列は、例えば、Goeddel; Gene Expression
Technology: Methods in Enzymology
185, Academic Press, San Diego, CA （1990）に記載されている。当業者は、調節配列の選択を含めた発現ベクターのデザインが、形質転換されるべき宿主細胞、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子によって決定されることを理解するであろう。哺乳動物宿主細胞の発現のための好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞において高いレベルのタンパク質発現を導くウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、ＣＭＶプロモーター/エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター/エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルスメジャーレートプロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび/またはエンハンサーが挙げられる。ウイルス調節エレメントについてのさらなる詳細、およびその配列については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号（Stinskiによる）、米国特許第４，５１０，２４５号（Bell et al.による）および米国特許第４，９６８，６１５号（Schaffner, et al.による）を参照されたい。
結合分子鎖遺伝子および調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば、宿主細胞（例えば、複製のオリジン）および選択可能なマーカー遺伝子中のベクターの複製を調節する配列を保有してもよい。該選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号および第５，１７９，０１７（全てAxel et al.）を参照されたい）。例えば、典型的に、該選択可能なマーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性をベクターが導入された宿主細胞に付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（ｄｈｆｒ−宿主細胞に用いられる。メトトレキサート選択／増幅をもつ）や、ネオ遺伝子（Ｇ４１８選択）などがある。
軽鎖および重鎖を発現させるために、結合分子重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な方法によって宿主細胞にトランスフェクトする。種々の形態の用語「トランスフェクション」は、外因性ＤＮＡを原核生物もしくは真核生物宿主細胞に導入する際に一般的に使用される広範囲の技法、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図されている。本発明の結合分子を、原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて発現させることができ、結合分子の真核生物細胞での発現、最も好ましくは哺乳動物宿主細胞での発現が最も好ましい。なぜなら、そのような真核生物細胞、特に哺乳動物細胞は、原核生物細胞よりも集合しやすく、適切に折り曲げられた、免疫学的に活性のある結合分子に分泌する可能性があるからである。
一般的に、発現ベクターは、選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、もしくはネオマイシン耐性）を含有して、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換した細胞を検出すること可能とする（例えば、Itakura et al., 米国特許第４，７０４，３６２号）。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、本発明のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ配列）をクローニングするために特に有用な１つの原核生物宿主である。使用するのに好適な他の微生物宿主としては、バシラス−サチリスなどの桿菌類、および他のエンテロバクテリアセエ、例えば、サルモネラ、セラチア、および種々のシュードモナス種が挙げられる。これらの原核生物宿主中に、発現ベクターを作製することもできる。それは、典型的には、宿主細胞（例えば、複製のオリジン）と適合性のある発現制御配列を含む。さらに、ラクトースプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ベータ−ラクタマーゼプロモーター系、またはファージラムダからのプロモーター系などの、あらゆる数の種々の公知のプロモーターが存在するであろう。該プロモーターは典型的に、オペレーター配列を任意に用いて発現を制御する。そしてそれは、転写および翻訳を開始し、完成させるためのリボソーム結合部位配列などを有する。
酵母菌などの他の微生物も発現にとって有用である。サッカロミセスは、必要であれば、発現制御配列（例えば、プロモーター）、複製のオリジン、終止配列などをもつ好適なベクターをもつ好ましい酵母菌宿主である。典型的なプロモーターとしては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよび他の糖分解酵素が挙げられる。誘導性の酵母菌プロモーターは、とりわけ、アルコールデヒドロゲナーゼからのプロモーター、イソチトクロームＣ、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関与する酵素を含む。
微生物の他に、哺乳動物組織細胞の培養もまた、本発明のポリペプチド（例えば、結合分子をコードするポリヌクレオチド）を発現および産生させるために使用してもよい。Winnacker, From Genes to
Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. （1987）を参照されたい。真核生物細胞が実際には好ましい。なぜなら、異種のタンパク質（例えば、未処理の結合分子）を分泌することが可能な、多くの好適な宿主細胞系列が当該技術分野において開発されており、ＣＨＯ細胞系列、種々のＣｏｓ細胞系列、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系列、または形質転換されたＢ細胞もしくはハイブリドーマなどがあるからである。好ましくは、該細胞は、非ヒト細胞である。これらの細胞のための発現ベクターは、複製のオリジン、プロモーターおよびエンハンサーなどの発現制御配列、および、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、および転写終始配列といった必要なプロセシング情報部位を含むことができる（Queen et al., Immunol. Rev.
89:49 （1986））。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなどに由来するプロモーターである。Co et al., J. Immunol. 148:1149
（1992）を参照されたい。
あるいは、結合分子コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、次いでトランスジェニック動物の乳において発現させるためのトランスジーンに組み込むことができる（例えば、Deboer et al., 米国特許第５，７４１，９５７号；Rosen、米国特許第５，３０４，４８９号、およびMeade et al., 米国特許第５，８４９，９９２号）。好適なトランスジーンは、乳腺特異的遺伝子、例えば、カゼインまたはベータラクトグロブリンからのプロモーターやエンハンサーとの作用可能な連結におけるリガンドおよび/または重鎖のためのコード配列を含む。
本発明の組換え結合分子を発現させるための好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）（UrlaubとChasin, （1980） Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:4216-4220に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む。R.J. Kaufman and P.A. Sharp （1982）
Mol. Biol. 159:601-621に記載されているようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに用いられる）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞が挙げられる。結合分子遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入したとき、宿主細胞中の結合分子の発現、より好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地への結合分子の分泌を可能にするのに十分な時間の間、宿主細胞を培養することによって、結合分子を作製する。結合分子は、標準的な精製方法を用いて培養培地から回収することができる。
当該ポリヌクレオチド配列（例えば、結合分子重鎖および軽鎖コード配列および発現制御配列）を含有するベクターを、細胞宿主のタイプにしたがって、公知の方法で宿主細胞に移入する。例えば、原核生物細胞には、通常塩酸カルシウムトランスフェクションが用いられ、一方、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理、エレクトロポレーション、リポフェンブフェン、微粒子銃またはウイルスベースのトランスフェクションを使用することができる（一般的に、Sambrook et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual （Cold Spring Harbor Press, 2nd
ed., 1989参照）（その全体を全ての目的のために引用によって援用する）。哺乳動物細胞を形質転換するために用いられる他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクション（一般的に、Sambrook et al., 上掲文献参照）。トランスジェニック動物を作製するために、トランスジーンを受精卵にマイクロインジェクションすることができる。または、胚性幹細胞のゲノムに組み込み、そのような細胞の核を摘出された卵子に移植することがある。
重鎖および軽鎖を別個の発現ベクターにクローニングし、該ベクターをコトランスフェクトし、発現させ、未反応のイムノグロブリンを回収する。一旦、発現すれば、全結合分子、それらの二量体、個別の軽鎖および重鎖、もしくは本発明の他のイムノグロブリン形態を、硫酸アンモニュウム沈殿法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ精製、ゲル電気泳動法などを含む当該技術分野における標準的な処置にしたがって精製する（一般的に、Scopes, Protein Purification （Springer-Verlag, N.Y., （1982））。少なくとも約９０〜９５％の相同性を示す、本質的に純粋な結合分子が好ましい。医薬品として使用するためには、相同性が９８〜９９％の相同性が最も好ましい。
宿主細胞を用いて、ＦａｂフラグメントまたはｓｃＦｖ分子などといった未反応の結合分子部分を作製することもできる。上記処置に対する変形も本発明に包含されることが理解されよう。例えば、本発明の結合分子の軽鎖または重鎖（両方ではない）をコードするＤＮＡを有する宿主細胞をトランスフェクトすることが望ましいかもしれない。組換えＤＮＡ技術を用いて、一部もしくは全ての、ＩＬＴ３に結合するために必要な軽鎖および重鎖のいずれかもしくは双方をコードするＤＮＡを除去することもできる。そのような切断されたＤＮＡ分子から発現された分子も、本発明の結合分子の範囲に含まれる。さらに、二官能性結合分子を作製してもよい。そこでは、１つの重鎖および１つの軽鎖が本発明の結合分子となり、他の重鎖および軽鎖が本発明の結合分子を第２の結合分子に標準的な架橋方法によって架橋されることによって、ＩＬＴ３以外の抗原に特異性をもつ。
上述に鑑み、本発明の別の局面は、本発明の結合分子の組換え発現に用いることができる核酸、ベクター、および宿主細胞組成物に関する。９Ｂ１１軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を配列番号１０に示す。ＶＬのＣＤＲ１ドメインは、配列番号：１０のヌクレオチド１３０〜１６２を含み、ＣＤＲ２ドメインは、配列番号：１０のヌクレオチド２０８〜２２８を含み、ＣＤＲ３ドメインは、配列番号：１０のヌクレオチド３２５〜３５１を含む。９Ｂ１１重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を配列番号９に示す。ＶＨのＣＤＲ１ドメインは、配列番号：９のヌクレオチド１３３〜１６２を含み、ＣＤＲ２ドメインは、配列番号：９のヌクレオチド２０５〜２５５を含み、ＣＤＲ３ドメインは、配列番号：９のヌクレオチド３５２〜３７２を含む。９Ｂ１１関連結合分子をコードするヌクレオチド配列は、ゲノムコードや標準的な分子生物学的手法を用いて、９Ｂ１１ＶＬおよびＶＨをコードするヌクレオチド配列から導出され得ることを当業者は理解するであろう。
ある態様において、本発明は、９Ｂ１１ＣＤＲを含む、例えば、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、および配列番号：８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、配列番号：２のアミノ酸配列からなる結合分子軽鎖可変領域をコードする単離された核酸を提供する。もっとも、遺伝子コードの縮重によって、他のヌクレオチド配列が配列番号：２のアミノ酸配列をコードしうることを当業者は理解するであろう。核酸は、ＶＬのみ、またはＶＬに作用可能に連結した結合分子軽鎖定常領域をコードすることができる。ある態様において、この核酸は、組換え発現ベクター中に存在する。
さらに別の態様において、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列からなる結合分子重鎖可変領域をコードする単離された核酸を提供する。もっとも、遺伝子コードの縮重によって、他のヌクレオチド配列が配列番号：１のアミノ酸配列をコードしうることを当業者は理解するであろう。核酸は、ＶＨのみ、またはＶＨに作用可能に連結した結合分子軽鎖定常領域をコードすることもできる。例えば、該核酸は、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ２定常領域を含むことができる。ある態様において、この核酸は、組換え発現ベクター中に存在する。
本発明はまた、結合分子重鎖および/または結合分子軽鎖をコードする、組換え発現ベクターを提供する。例えば、ある態様において、本発明は、組換え発現ベクターを提供する。それは、以下をコードする。
ａ）配列番号２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子軽鎖；および
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子重鎖。
別の態様において、本発明は、組換え発現ベクターを提供する。それは、以下をコードする。
ａ）配列番号２８のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子軽鎖；および
ｂ）配列番号２９のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子重鎖。
別の態様において、本発明は、組換え発現ベクターを提供する。それは、以下をコードする。
ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子軽鎖；および
ｂ）配列番号２６のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子重鎖。
さらに別の態様において、本発明は、組換え発現ベクターを提供する。それは、以下をコードする。
ａ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子軽鎖；および
ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子重鎖。
さらに別の態様において、本発明は、組換え発現ベクターを提供する。それは、以下をコードする。
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子軽鎖；および
ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子重鎖。
さらに別の態様において、本発明は、組換え発現ベクターを提供する。それは、以下をコードする。
ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子軽鎖；および
ｂ）配列番号３５のアミノ酸配列を含む可変領域を有する結合分子重鎖。
本発明は、本発明の１以上の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。このましくは、該宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。
さらに、本発明は、本発明の宿主細胞を好適な培養培地において、本発明の組換え結合分子が合成されるまで培養することによって、本発明の組換え結合分子を合成する方法を提供する。該方法はさらに当該培養培地から組換え結合分子を単離することを含む。
Ｖ．本発明の結合分子の使用
ＩＬＴ３に対して結合する能力があれば、本発明の結合分子は、ＩＬＴ３（例えば、血清もしくは血漿などの生物学的サンプル中）を、従来のイムノアッセイ、例えば、酵素結合抗体免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは組織免疫組織化学的手法を用いて検出するために用いることができる。本発明は、生物学的サンプル中のｈＩＬＴ３を検出するための方法であって、生物学的サンプルを本発明の結合分子に接触させ、およびｈＩＬＴ３に結合した結合分子または未結合の結合分子のいずれかを検出し、それによって、生物学的サンプル中のｈＩＬＴ３を検出することを含む方法を提供する。該結合分子は、検出可能な物質を用いて、直接的または間接的に標識し、結合した結合分子または未結合の結合分子の検出を容易にすることができる。好適な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光性物質、および放射性物質が挙げられる。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。好適な補欠分子団の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例にはルミノールが含まれる；好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓもしくは３Ｈが含まれる。
結合分子の標識に替えて、ｈＩＬＴ３は、検出可能な物質や未標識抗ｈＩＬＴ３結合分子で標識されたＩＬＴ３標準を用いた競合イムノアッセイによって生物学的液体中でアッセイすることができる。このアッセイにおいて、生物学的サンプル、標識されたＩＬＴ３標準、および抗ｈＩＬＴ３結合分子を組み合わせ、未標識の結合分子に結合した標識されたＩＬＴ３標準の量を測定する。生物学的サンプル中のｈＩＬＴ３の量は、抗ｈＩＬＴ３結合分子に結合した標識されたＩＬＴ３標準の量に反比例する。
本発明の抗ＩＬＴ３結合分子はまた、ヒト以外の種のＩＬＴ３、特に、霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、カニクイザルおよびアカゲザル）からのＩＬＴ３を検出するために用いることもできる。
インビトロおよびインビボで免疫反応を下方調整する方法
添付の実施例に記載のように、本発明の結合分子は、免疫抑制組成物としてインビトロで使用して、免疫細胞活性化、例えば、細胞による同種免疫反応（例えば、ＭＬＣ）を阻害することができる。ある態様において、細胞をインビトロでＩＬＴ−３結合分子を用いて、例えば、１、２、３、４、５、６、７日間処理し、例えば、それらを被験体に注入する前に、活性化の状態を減少させることができる。
したがって、ある態様において、本発明は、調整する方法、免疫細胞活性化、例えば同種免疫反応をインビトロで下方調整する方法を提供する。別の態様において、本発明は、インビボで免疫細胞活性化を下方調整する、インビトロでＩＬＴ−３結合分子を用いて処理し細胞を被験体に導入することを含む方法を提供する。同種免疫反応の調整は、技術的に認識されている技法によって、例えば、結合分子がＴ細胞の増殖活性（例えば、混合リンパ球反応において）を調節する可能性を測定することによって、アッセイすることができる。
本発明の結合分子は、炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ１２ｐ４０、ＩＬ１２ｐ７０およびＴＮＦαの、ＤＣ、例えばＭＤＤＣによるインビトロでの、例えば、被験体に導入する前における産生を下方調整するために用いることもできる。ＤＣによる炎症性サイトカイン産生の下方調整は、例えば、ＥＬＩＳＡによってアッセイすることができる。
別の態様において、本発明の結合分子は、共刺激性分子、例えば、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲの、ＤＣ、例えばＭＤＤＣによるインビトロでの、例えば、被験体に導入する前におけるアップレギュレーションを下方調整するために用いることもできる。共刺激性分子のＤＣによるアップレギュレーションの下方調整は、例えば、ＦＡＣｓ分析によってもアッセイすることができる。
さらに別の態様において、本発明の結合分子は、例えば、被験体に導入する前の、インビトロでの単球へのカルシウム流入を下方調整するために用いることもできる。単球へのカルシウム流入は、例えば、ＦＡＣｓ分析、またはカルシウムキレート化発光吸光度測定法によって測定することができる。例えば、Rabin, et al. （1999） J
Immunol. 162: 3840- 3850, Youn, B.
S., et al. （1998）
Blood 91:3118、およびYoun, B.S., et al. （1997） J.
Immunol. 159:5201を参照することができる。これらの引例のそれぞれの内容を引用によって本明細書に援用する。
ある態様において、本発明の結合分子は、抑制受容体の細胞上、例えば、樹状細胞、例えば、未成熟樹状細胞上での発現をアップレギュレートするために用いることもできる。その発現が本発明の結合分子によってアップレギュレートされる抑制受容体の例としては、限定されないが、ＣＤ２００Ｒ、ＣＤ４０ＬおよびＩＤＯ（インドールアミン）が挙げられる。
別の局面において、本発明は、被験体において望ましくない免疫細胞活性化に関連する疾患もしくは状態を予防する方法に関する。該方法は、ＩＬＴ−３結合物質を用いてインビトロで細胞を処理すること、およびそれらを適合性のある被験体に組み込むこと、またはそれらを再び同じ被験体に組み込むことを含む。ここで述べている物質を用いた治療によって恩恵を受けるであろう疾患のリスクのある被験体、または方法を、例えば、当業で公知の診断的アッセイまたは予後的アッセイのいずれか、またはその組み合わせによって、確認することができる。予防的な物質の投与を、望ましい反応に関連する症状、または望ましいとはいえない症状が顕在化する前に行うことができる。
ＩＬＴ３のＡＰＣ、例えば、単球、マクロファージ、ＭＤＤＣなどのＤＣ上での活性を下方調整することによって恩恵を受ける疾患および病理学的状態としては、組織、皮膚、よび臓器移植の状態、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれる。例えば、免疫細胞活性化を遮断すると、移植組織において組織破壊が減少する。典型的には、組織移植においては、移植物質を免疫細胞による異物として認識して拒絶が始まり、移植物質を破壊する免疫拒絶が起こる。インビトロで抗ＩＬＴ３結合分子を用いて処理した細胞は、単独または免疫細胞活性化を下方調整する他の物質と組み合わせて（例えば、ホルモン療法、免疫療法、例えば、免疫抑制療法、抗生物質およびイムノグロブリン）、移植前または移植時に投与され、移植物質の免疫細胞活性化を減少させる。通常、患者と同じ種の起源または種の反応性（結合分子の場合）の物質を投与することが好ましい。他のポリペプチド共刺激性の機能を遮断することが望ましいかもしれない。例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＢ７−１およびＢ７−２の機能を、これらの抗原の活性を有するペプチドの組み合わせの溶解性の形体を投与し、これらの抗原に対する抗体を遮断する、もしくは小分子（別々に、または単一の組成物と一緒に）を、移植前または移植時に遮断することによって、遮断することが望ましいかもしれない。本発明の下方調整方法と組み合わせて用いることができる他の下方調整用の物質の例としては、例えば、ＣＴＬＡ４、可溶形態のＣＴＬＡ４を介して抑制性シグナルを伝達する物質、ＣＴＬＡ４を介した抑制性シグナルを活性化する抗体、免疫細胞マーカーもしくは可溶形体の他のレセプターリガンド対に対するブロッキング抗体（例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンドの間の相互作用を破壊する物質（例えば、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体、または免疫抑制性薬物が含まれる。
さらに、ＩＬＴ３の調整、および／または共刺激性のシグナルの阻害、および／または、他の抑制受容体のアップレギュレーションもまた、免疫細胞を反応不顕性にし、それによって、被験体において耐性を誘発するのに十分かもしれない。ＩＬＴ３を調整することによって長期の耐性を誘発することによって、これらのブロッキング試薬を反復投与しなくてもよくなる。
したがって、本発明の方法は、本発明の結合分子を用いて、免疫反応を下方調整するようにして被験体を治療するために用いることができる。好ましくは、被験体はヒト被験体である。あるいは、被験体は、本発明の結合分子が交差反応するＩＬＴ３を発現する哺乳動物とすることもできる。
インビボで免疫反応を上方調整する方法
添付の実施例に記載しているように、本発明の結合分子は、免疫賦活性の組成物、例えば、単独でもしくはワクチンの一部として使用して、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の活性化、例えば、患者におけるＴｈ１またはＴｈ２細胞の活性化を促進することができる。すなわち、本発明の結合分子は、当該抗原と組み合わせて用いられるアジュバントとして機能し、当該の抗原に対するインビボでの免疫反応を高めることができる。例えば、当該の抗原に対する抗体または細胞免疫反応を刺激するために（例えば、ワクチン接種の目的）、抗原および本発明の結合分子を同時に投与することができる（例えば、同じ組成物もしくは別個の組成物として同時投与する。または免疫反応を高めるべく連続して投与する）。当該抗原と結合分子は、単一の薬学的組成物または別個の組成物に製剤することができる。好ましい態様において、当該抗原と結合分子は同時に被験体に投与する。別法として、ある状況においては、最初に抗原を投与し、次いで結合分子を投与することが望ましいかもしれないし、逆が望ましいかもしれない（例えば、天然にＴｈ１反応を誘発する抗原の場合、最初に単独で抗原を投与してＴｈ１反応を刺激し、次いで結合分子を単独で、もしくは抗原の追加免疫とともに投与し、免疫反応をＴｈ２反応にすることが有益かもしれない）。好ましい態様において、本発明のＩＬＴ３結合分子を準備段階、すなわち、最初の抗原の投与時に、抗原とともに、例えば、−３、−２、−１、０、＋１、＋２、＋３日目に投与する。本発明のＩＬＴ３結合分子の特に好ましい投与日は、−１日目である。
ある態様において、ＩＬＴ−３結合分子は、関連する抗原とともに投与される。関連する抗原とは、免疫反応が望ましい抗原である。例えば、抗原が由来する感染物質への曝露から被験体を保護することが可能なものである。別の態様において、本発明は、抗原を投与する必要なく免疫反応を高めるための、本発明ＩＬＴ−３の結合分子の投与に関連する。
関連する抗原の例としては、該抗原に対する免疫反応が、抗原によって引き起こされる疾患を予防または治療する機能をもつ、感染物質に由来するものが挙げられる。そのような抗原としては、限定されないが、ウイルス性、細菌性、真菌性、もしくは寄生虫性タンパク質や他のあらゆるタンパク質類、グリコプロテイン、リポタンパク質、糖脂質などが含まれる。関連する抗原はまた、腫瘍を持つリスクのある被験者、もしくは、腫瘍があると診断された被験者に対して有益なものを含む。該被験者は、好ましくは哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。
典型的な抗原は、以下のように分類することができる。すなわち、タンパク質抗原、例えば、セルロプラスミンおよび血清アルブミンなど；細菌性抗原、例えば、タイコ酸、鞭毛抗原、莢膜多糖体、および細胞外細菌性生成物やトキシンなど；グリコプロテインおよび糖脂質；ウイルス類、例えば、動物、植物および細菌性ウイルスなど；複合体化した、および合成抗原、例えば、タンパク質ハプテン接合体、正常組織と比較したとき、腫瘍によって優先的に発現される分子；合成ポリペプチド；ならびに、リボ核酸およびデオキシリボ核酸などの核酸。本明細書において用いられている用語「感染物質」は、宿主細胞に免疫反応を誘発するあらゆる抗原を含む。有用であると考えられているウイルス性抗原の例としては、限定されないが、インフルエンザウイルスの核タンパク質（ＮＰ）や、ＨＩＶのＧａｇタンパク質が挙げられる。他の異種性の抗原としては、限定されないが、ＨＩＶ−Ｅｎｖタンパク質もしくはその部分ｇｐ１２０やｇｐ４１、ＨＩＶ−Ｎｅｆタンパク質、およびＨＩＶ−Ｐｏｌタンパク質、逆転写酵素、およびプロテアーゼなどが挙げられる。さらに、他のウイルス抗原、例えば、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）抗原、例えば、ＥＢＯＶ−ＮＰもしくはグリコプロテイン（ＧＰ）、全長もしくは分子のムチン領域にＧＰ欠失をもつもの（Yang Z-Y, et al. （2000） Nat
Med 6:886-9, 2000）、小痘疹抗原、Ａ型、Ｂ型、もしくはＣ型肝炎ウイルス、ヒトライノウイルス、例えば、タイプ２もしくはタイプ１４、単純疱疹ウイルス、ポリオウイルスタイプ２もしくはタイプ３、足突起病ウイルス（ＦＭＤＶ）、狂犬病ウイルス、ロタウイルス、インフルエンザウイルス、コクサッキーウイルス、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、例えば、タイプ１６パピローマウイルス、そのＥ７タンパク質、Ｅ７タンパク質を含有するフラグメント、もしくはそのエピトープ；ならびに、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を用いることができる。関連する抗原は、ウイルス起源の抗原に限られるわけではない。寄生虫性の抗原、例えば、マラリア抗原が含まれる。同様に、真菌性抗原、細菌性抗原、および腫瘍抗原も含まれる。細菌起源の抗原の例としては、百日咳菌（例えば、Ｐ６９タンパク質、および糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）抗原）、ビブリオコレラ、バシラス−アンスラシス、および、例えば、熱不安定性トキシンＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）大腸菌、Ｋ８８抗原大腸菌、および腸内毒素原性大腸菌などの大腸菌抗原が挙げられる。抗原の他の例としては、マンソン住血吸虫Ｐ２８グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ抗原（Ｐ２８抗原）および吸虫の抗原、マイコプラズマ、線虫、条虫、クラミジア−トラコマチス、およびマラリア属またはバベシア属の原虫などのマラリア原虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫、および前記抗原からのイムノゲンエピトープをコードするペプチドが挙げられる。
本明細書において用いられている用語「腫瘍関連抗原」は、宿主生物の腫瘍成長または転移に影響を及ぼす抗原を意味する。腫瘍関連抗原は、腫瘍成長によって発現される抗原であることができる。または、それは、非腫瘍細胞によって発現された抗原であってもよいが、そのように発現された場合は、腫瘍細胞の成長または転移を促進する。腫瘍抗原の種類および腫瘍関連抗原は、あらゆる公知のまたは、これまで知られていない腫瘍抗原であり、限定されないが、白血病のｂｃｒ／ａｂｌ抗原、子宮頚癌に関連する発癌性ウイルスのＨＰＶＥ６およびＥ７抗原、メラノーマの、またはそれに関連するＭＡＧＥ１およびＭＺ２−Ｅ抗原、および乳癌に関連するＭＶＣ−１およびＨＥＲ−２抗原が挙げられる。
本発明の組成物を投与することによって治療または予防することができるかもしれない感染、疾患、または障害は、宿主が免疫反応することによって、感染、疾患、または障害を予防する機能を果たすあらゆる感染、疾患、または障害を含む。本発明の組成物によって治療または予防され得る疾患、障害、または感染は、限定されないが、真菌、寄生虫、ウイルス、もしくは細菌によって引き起こされる、またはそれに関連するあらゆる感染、疾患、または障害、バイオテロリズム、リステリア症、エボラウイルス、ＳＡＲＳ、小痘、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎に用いられる種々の抗原に関連する疾患、障害または感染、ヒトライノウイルスによって引き起こされる疾患および障害、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ、ヘルペス、ポリオ、足突起病、狂犬病、ロタウイルス、インフルエンザ、コクサッキーウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＳＩＶ、マラリア、癌などによって引き起こされる疾患または障害、および腫瘍、ならびに、百日咳菌、ビブリオコレラ、バシラス−アンスラシス、大腸菌、吸虫、マイコプラズマ、回虫、条虫、クラミジア−トラコマチス、およびマラリア原虫による感染によって引き起こされる、もしくはそれに関連する疾患または障害が挙げられる。
腫瘍細胞に対する免疫反応
調節Ｔ細胞は、自己免疫疾患および癌に対する免疫反応を抑制することによって、免疫学的自己耐性（忍容性）において重要な役割を果たす。したがって、ある態様において、免疫反応を上方調整することは、癌における免疫反応を高めるのに有用であろう。したがって、本発明の結合分子を悪性の疾患の治療に用いて、腫瘍の成長または転移を阻害することができる。結合分子は、全身投与もしくは局所投与によって腫瘍部位に投与することができる。
ある態様において、ＩＬＴ３機能の調整は、腫瘍免疫の誘発において有用かもしれない。ＩＬＴ３結合分子は、腫瘍（例えば、サルコーマ、メラノーマ、リンパ腫、白血病、神経芽細胞腫、癌腫）のある患者に対して投与して、該患者において腫瘍特異性の耐性（忍容性）を克服することができる。
本明細書において用いられている用語「腫瘍疾患」は、悪性腫瘍の成長、または良性の過剰増殖および増殖性細胞によって特徴付けられる疾患の状態を特徴とする。用語「新生物」の通常の医学的意味は、正常の成長コントロールに対する反応性を損失した結果、起こる「新細胞の成長」、例えば、新生物の細胞成長を意味する。
本明細書において用いられている用語「過剰増殖」、「増殖性」、「悪性の」および「新生物の」は、互換可能に用いられており、異常な状態または急速な増殖もしくは新生物を特徴とする状態の細胞を意味する。これらの用語は、組織病理学的なタイプもしくは侵襲度合いに関係なく、あらゆるタイプの過剰増殖成長、増殖性成長、癌性成長もしくは発癌性のプロセス、転移性組織、または、悪性に変換された細胞、組織、もしくは臓器を含むことが意図される。「過形成」は、異常に高速で成長する細胞を意味する。しかしながら、異常な細胞成長速度を行う細胞を一般的に意味するという状況からわかるように、用語、新生物および過形成は互換可能に用いることができる。新生物および過形成は、「腫瘍」を含む。そしてこの腫瘍は、良性、前悪性、または悪性のいずれであってもよい。
用語「新生物」、「過形成」および「腫瘍」は、一般に、制御することができない、異常な細胞の成長を特徴とする１００を超える疾患の一般名称である「癌」と呼ばれることが多い。癌の例としては、限定されないが、乳癌、結腸癌、非小細胞肺癌、頭部および頚部の癌、結直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、腎臓癌、メラノーマ、および消化器系（例えば、膵臓および胃）の癌、ならびに骨原性肉腫が挙げられる。
ある態様において、癌は、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳もしくは中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頚癌、子宮もしくは子宮内膜の癌、口腔もしくは咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸もしくは盲腸の癌、唾液腺の癌、甲状腺の癌、副腎の癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌からなる群から選択される。
感染物質に対する免疫反応
免疫反応に対するアップレギュレーションは、存在する免疫反応を高める形態であってもよいし、または最初の免疫反応を誘発する形態であってもよい。例えば、ＩＬＴ３を調整することによって免疫反応を高めることは、ウイルス感染の症例において有用かもしれない。抗ＩＬＴ３結合分子は、免疫反応を高める作用をするので、それらは、より迅速で完全な、病原性物質、例えば、バクテリアやウイルスの除去が有効である場合に治療的に有用である。
本明細書において用いられている用語「ウイルス感染」は、生物による感染が含まれ、その生物の例としては、限定されないが、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）、ヒトヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（特に、ヒト）、ロタウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスおよびＥ型肝炎ウイルスといった肝炎ウイルス、パラミキソウイルス：呼吸系発疹ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８など）、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）、またはインフルエンザウイルスが挙げられる。
本明細書において用いられている用語「細菌感染」は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌を含む、種々の細菌生物による感染を意味する。その例としては、限定されないが、ナイセリア・ゴノレエ、ナイセリア・メニンギチジスを含むナイセリア種、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ストレプトコッカス・アガラクティエ、トレプトコッカス・ミュータンスを含むトレプトコッカス種；ヘモフィルス・インフルエンゼタイプＢ、非型ヘモフィルス・インフルエンゼ、ヘモフィルス・インフルエンゼ・デュクレイを含むヘモフィルス種；ブランハメラカタラーリスとしても知られているモラクセラカタラーリスを含むモラクセラ種；ボルデテラ・ペルツッシス、ボルデテラ・パラペルツッシスおよびボルデテラ・ブロンキセプチカを含むボルデテラ種；マイコバクテリウム・ツベルクローシス、マイコバクテリウム・ボビス、マイコバクテリウム・レプレ、マイコバクテリウム・アビウム、パラ結核菌、マイコバクテリウム・スメグマチスを含むマイコバクテリウム種；レジオネラ・ニューモフィラを含むレジオネラ種；エンテロトキシン性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管病原性大腸菌を含む大腸菌；ビブリオコレラを含むコレラ種；ゾンネ菌、志賀赤痢菌、フレクスナー赤痢菌を含む赤痢菌種；エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ペスティス、エルシニア・シュードツベルクローシスを含むエルシニア種；カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・コリを含むカンピロバクタ種；チフス菌、パラチフス菌、サルモネラ・コレレスイス、サルモネラエンテリティディスを含むサルモネラ種；リステリア・モノサイトゲネスを含むリステリア種；ヘリコバクターピロリを含むヘリコバクター種；シュードモナス・アエルギノーザを含むシュードモナス種；スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディスを含むスタフィロコッカス種；エンテロコッカス・フェカーリス、エンテロコッカス・フェシウムを含むエンテロコッカス種；破傷風菌、ボツリヌス菌C型、クロストリジウム-ディフィシレを含むクロストリジウム種；炭疽菌を含むバチルス種；ジフテリア菌を含むコリネバクテリウム種；ライム病菌、ボレリア・グラインゲリ、ボレリア・アフゼリ、ボレリア・アンデルソニ（B. andersonii）、ボレリア・ヘルムシーを含むボレリア種；エーリキア・エクイ（E. equi）およびヒト顆粒球を含むエーリキア種；リケッチア-リケッチイを含むリケッチア種；クラミジア・トラコマチス、クラミジア肺炎、オウム病クラミジアを含むクラミジア種；レプトスピラ・インタロガンスを含むレプトスピラ種；梅毒トレポネーマ、トレポネーマ-デンティコラ、トレポネーマ-ビオディセンテリエを含むトレポネーマ種が含まれる。好ましいバクテリアは、限定されないが、リステリア、マイコバクテリア、マイコバクテリア（例えば、ツベルクローシス）、炭素菌、サルモネラおよびリステリアモノサイトゲネス（monocytogenes）が含まれる。
別の態様において、Ｔ細胞を患者から除去し、任意にシグナルを活性化しながら（例えば、抗原プラスＡＰＣ、もしくはポリクローナル抗体）、インビトロで抗ＩＬＴ３結合分子に接触させ、患者に再び導入することができる。
抗ＩＬＴ３結合分子はまた、種々の病原菌に対するワクチンにおいて予防的に使用することもできる。病原体に対する免疫、例えば、ウイルスは、ＩＬＴ３結合分子（上記）を一緒に用いて、ウイルス性タンパク質でワクチン駐車して導入することができるであろう。別法として、病原性の抗原とＩＬＴ３結合分子の双方をコードする発現ベクター、例えば、ウイルスタンパク質をコードする核酸およびＩＬＴ３結合分子をコードする核酸を発現するように工学処理されたワクチンウイルス発現ベクターをワクチン接種に用いることができる。有用かもしれないワクチン用の病原菌としては、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウィルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリア、および住血吸虫病などがある。
本発明はさらに、診断薬または治療薬と組み合わせた結合分子を含む。結合分子は、診断的に使用することができる。例えば、臨床試験処置の一環として、腫瘍の発達または進行をモニターして、例えば、所望の治療レジメンの有効性を判断するために使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質に結合させることによって容易にすることができる。検出可能な物質の例としては、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物ルミネセンス物質、放射性物質、種々の陽電子放出トモグラフィーを用いた陽電子放出金属、および非放射性の常磁性金属イオンなどが挙げられる。検出可能な物質は、当業で公知の技術を用いて、直接的または中間物質（例えば、当業で公知のリンカーなど）を介して間接的に結合分子に結合または接合することができる。例えば、米国特許第４，７４１，９００号は本発明の診断薬として使用される結合分子に結合し得る金属イオンについて記載しエチル。好適な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼがある。好適な補欠分子団としては、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンの複合体がある。好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。発光性の物質の例としては、ルミノールがある。生物ルミネセンスの例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、アエクオリンがある。放射性物質の例としては、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉ１１１またはＩｎ９９Ｔｃがある。
さらに、結合分子は、サイトトキシン、例えば、細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊薬などの治療的部分、治療薬、または放射性金属イオン、例えば、アルファエミッター（例えば、２１３Ｂｉ）に結合せることもできる。サイトトキシンもしくは細胞毒物は、細胞に有害なあらゆる物質を含む。例としては、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらのアナログ類またはホモログ類が含まれる。治療薬としては、限定されないが、アンチメタボライト（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロールエサミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（carnustine）（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ，およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリノン（例えば、ダウノルビシン（旧称、ダウノマイシン）および抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧称、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、および抗有糸分裂物質（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が含まれる。
本発明は、さらに本発明の結合分子を、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト患者に、開示されている疾患、障害、または状態を治療、検出、および／または予防するために投与することを含む、結合分子をベースとした治療に関する。本発明の治療的薬物は、限定されないが、本発明の結合分子（本明細書に記載のように、そのアナログおよび誘導体を含む）および本明細書に記載の抗イディオタイプ結合分子を含む。本発明の結合分子は、限定されないが、本明細書に記載の疾患、障害、または状態のいずれか１つ（例えば、本発明の結合分子は、当業で公知の、もしくは本明細書に記載の薬学的に許容可能な組成物とともに提供してもよい）を含む、ＩＬＴ３の異常活性に関連する疾患、障害、または状態を診断、阻害、または予防するために使用することもできる。
本発明の結合分子はまた、他のモノクローナルもしくはキメラ結合分子、または、リンフォカインもしくは造血性成長因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７）、例えば、結合分子と相互作用するエフェクター細胞の数もしくは活性を増加させる働きをするものと組み合わせて用いることが有利かもしれない。
本発明の結合分子は、単独で投与してもよいし、または他の治療、例えば、免疫抑制剤による治療もしくは活性化された免疫細胞の標的（例えば、癌細胞もしくは病原菌）の増殖を制御するように設計された治療を組み合わせてもよい。治療法の例としては、例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、ならびに、抗腫瘍薬、抗生物質およびイムノグロブリンがあげられる。一般的に、生成物（結合分子の場合）の投与は、その種そのものまたは患者と同じ反応性であることが好ましい。そのため、好ましい態様において、ヒト結合分子、誘導体、アナログ、または核酸は、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
本発明の結合分子は、ヒト被験者に治療目的で投与することができる。さらに、本発明の結合分子は、結合分子が交差反応するＩＬＴ３を発現する非ヒト哺乳動物（例えば、霊長類）に獣医学的目的で投与することができるし、または、ヒト疾患の動物モデルに投与することができる。後者に関しては、そのような動物モデルは、本発明の結合分子の治療効果（例えば、投与量や投与クールの時間）を評価するのに有用かもしれない。
本発明は、さらに本発明の結合分子を、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト患者に、開示されている疾患、障害、または状態を治療、検出、および／または予防するために投与することを含む、結合分子をベースとした治療に関する。本発明の治療的薬物は、限定されないが、本発明の結合分子（本明細書に記載のように、そのアナログおよび誘導体を含む）および本明細書に記載の抗イディオタイプ結合分子を含む。本発明の結合分子は、限定されないが、本明細書に記載の疾患、障害、または状態のいずれか１つ（例えば、本発明の結合分子は、当業で公知の、もしくは本明細書に記載の薬学的に許容可能な組成物とともに提供してもよい）を含む、ＩＬＴ３の異常活性に関連する疾患、障害、または状態を診断、阻害、または予防するために使用することもできる。
ＶＩ．薬学的組成物
本発明の結合分子は、被験体に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込むことができる。薬学的組成物は、典型的に、本発明の結合分子と、薬学的に許容可能な担体とを含む。本明細書において用いられる用語「薬学的に許容可能な担体」には、薬剤投与に適合性あるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗カビ剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。このような媒質および薬剤の、薬学的に活性な物質のための使用は当業で公知である。従来の媒質または薬剤が当該活性化合物にとって不適合でない限り、当該組成物中のその使用が考慮される。補助的な活性化合物も、本組成物中に組み込むことができる。
本発明の薬学的組成物は、それに意図された投与経路に適合性あるように調合される。投与経路の例には、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与がある。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液には、以下の成分を含めることができる：無菌の希釈剤、例えば、注射用の水、生理食塩水溶液、非揮発性の油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張性を調節するための薬剤。ｐＨは、塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節することができる。非経口用の製剤は、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ又は多人数用バイアルに封入することができる。
注射用用途に適した薬学的組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）または分散液や、無菌の注射用溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末がある。静脈内投与の場合、適した担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）（BASF, Parsippany, NJ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）がある。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、また注射筒への注入が容易な程度に流動性でなければならない。またそれは製造および保管条件下で安定でなければならず、細菌およびカビなどの微生物の汚染作用から保護されていなければならない。当該の担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、およびこれらの適した混合物などを含有する溶媒または分散媒であってよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子の大きさを維持したり、そして界面活性剤を使用するなどにより、維持できる。微生物の活性は、種々の抗菌座および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどを用いて、阻止することができる。多くの場合、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、および塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収を長引かせるには、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど、吸収を遅らせる薬剤を組成物中に含めることにより、可能である。
無菌の注射用溶液は、必要量の活性化合物を適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせと一緒に加えた後、濾過滅菌を行うことにより、調製できる。分散液は一般的には、塩基性の分散媒と、上に列挙したものの中で必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に当該活性化合物を取り入れることで、調製されている。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥および凍結乾燥であり、その結果、活性成分および付加的な所望の成分の粉末が、予め殺菌濾過されたその溶液から生じる。
経口用組成物は、一般に、不活性の希釈剤または食用の担体を含む。これらをゼラチン・カプセルに封入することも、または圧縮して錠剤にすることも可能である。経口による治療的投与の目的のためには、活性化合物を賦形剤と一緒に導入することができ、錠剤、トローチ、またはカプセルの形で用いることができる。経口用組成物は、さらに、口内洗浄剤として用いるために流動性の担体を用いて調製でき、この場合、当該の流動性の担体中の化合物は経口により用いられ、さっと口に入れ、喀出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合性ある結合剤、および／または、アジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等には以下の成分、または同様の性質の化合物のうちのいずれかを含めることができる：微結晶セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；でんぷんまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Primogel、またはコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはSterotesなどの潤滑剤；コロイド状二酸化珪素などの推進剤；ショ糖またはサッカリンなどの甘味料；またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ着香料などの着香料。
吸入による投与の場合、本化合物を、例えば二酸化炭素などのガスなど、適した推進剤を含有する加圧式の容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからのエーロゾル噴霧の形で送達する。
全身投与は、経粘膜または経皮手段によってもよい。経粘膜または経皮投与の場合、透過させようとする障壁に適した浸透剤を調合物中に用いる。このような浸透剤は当業で広く公知であり、その中には、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体がある。経粘膜投与は、鼻孔用スプレーまたは座薬を用いて行うことができる。経皮投与の場合、当該の活性化合物を軟膏、軟膏剤、ゲル、またはクリームに当業で広く公知のように調合する。
さらに本化合物を座薬（例えば、ココアバターおよび他のグリセリドなどの従来の座薬用基材と一緒に）または直腸送達用の停留浣腸剤の形で調製することもできる。
ある実施態様では、本発明の結合分子を、インプラントおよびマイクロ封入送達系を含め、制御放出調合物などとして、身体から化合物が急速に失われないように保護する担体と一緒に調製する。酢酸エチレンビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生分解性で生体適合性のあるポリマーを用いることができる。このような調合物の調製法は、当業者には明白なはずである。さらに当該の材料はアルザ・コーポレーションおよびノヴァ・ファーマシューティカルズ社から市販のものを入手できる。リポソーム懸濁液も、薬学的に許容可能な担体として用いることができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に解説された通りに、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
投与の容易さおよび投薬量の均一性のためには、経口用または非経口用組成物を単位剤形で調合することが特に有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象にとって単位型の投薬量として調整された物理的に別個の単位を言う。各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の治療効果を生ずるよう計算された所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位剤形の詳細は、活性化合物の固有の特徴、および、達成しようとする特定の治療効果、およびこのような活性化合物を、個体の治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。
このような化合物の毒性および治療上の効験は、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致命的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を判定するためなど、細胞培養または実験動物における標準的薬学的手法により決定することができる。毒性および治療上の効果の間の用量比が治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物を用いることもできるが、非罹患細胞への潜在的損傷を抑え、ひいては副作用を減らすためには、罹患組織の部位にこのような化合物を標的決定する送達系をデザインするように注意が必要である。
細胞培養アッセイおよび動物実験で得たデータを、ヒトで用いる投薬量範囲を処方する際に用いることができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性が少ないか、または全くないような、ＥＤ５０を含む血中濃度範囲内であるとよい。投薬量は、用いる投薬量および用いる投与経路に応じてこの範囲内で様々であろう。本発明の方法において用いられるいずれの化合物でも、治療上の有効量はまず細胞培養アッセイから推定することができる。細胞培養で判定された通りのＩＣ５０（即ち、症状の半分−最大の阻害を達成する検査化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで用量を調合することができる。このような情報は、ヒトで有用な用量をより精確に決定するために用いることができる。血漿中レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーで測定することができる。
本薬学的組成物は、容器、パック、またはディスペンサー内に、投与に関する指示と一緒に含めることができる。
ＶＩＩ．本発明の結合分子の投与
本発明の結合分子は、インビボでの薬剤投与に適した生物学的適合形で対象に投与される。「インビボ投与に適した生物学的適合形」とは、いずれかの毒性効果よりも当該作用薬の治療的効果の方が大きいような、投与される作用薬の形であることを意味する。
本発明の治療用組成物の治療上の有効量の投与とは、所望の結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量であると定義しておく。例えば、作用薬の治療上有効量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重といった因子や、当該個体で所望の応答を惹起する上での結合分子の能力に応じて変わるであろう。投薬養生法は、最適な治療的応答が得られるように調節することができる。例えば、複数に分割した用量を毎日投与することも、あるいは、治療の状態の緊急度を指標として用量を比率的に減らすこともできる。
本発明の薬学的組成物は、「治療的に有効な量」または「予防的に有効な量」の本発明の結合分子を含む。「治療的に有効な量」は、投与時および必要な期間において、所望の治療的効果を達成するために、有効な量を意味する。結合分子の治療的に有効な量は、個体の疾患の状態、年齢、性別、および体重といった因子や、当該個体で所望の応答を惹起する上での作用薬の能力に応じて様々であろう。治療的に有効な量はまた、治療的に有効な効果が結合分子の毒性作用もしくは有害作用よりも勝る場合の量である。「予防的に有効な量」は、投与時および必要な期間において、所望の予防的効果を達成するために、有効な量を意味する。典型的に、予防的投与は、被験体において、疾患が発症する前、もしくは疾患の早期の段階で適用されるので、予防的に有効な量は、治療的に有効な量よりも少ない。
投薬養生法は、最適な所望の反応（例えば、治療的もしくは予防的反応）を提供するために調整することができる。例えば、単回ボラスを投与してもよいし、複数回に分けて経時的に投与してもよいし、または、治療状況の緊急度によって指示に比例して、投与量を減少もしくは増加させてもよい。投与量の適用および均一化を容易にするために、投与単位の組成物を調剤することが特に有利である。本明細書において用いられている投与単位の剤形とは、治療されるべき哺乳動物被験体の単一の投与量として好適な、物理的に分散した単位を意味する。各ユニットは、所望の治療効果を発生させるために計算された所定量の活性化合物を、必要な薬学的担体と組み合わせて含有する。本発明の投与単位剤形の詳細を記載する。それは、直接的に（ａ）活性化合物の独自の特性および特定の治療的もしくは予防的効果、ならびに（ｂ）そのような化合物を、個体の治療感受性について化合物化する技術に固有の限定に依存している。
本発明の結合分子の治療的もしくは予防的有効な量の限定されない例の範囲は、例えば、約０．１〜２５ｍｇ／ｋｇ、約１．０〜１０ｍｇ／ｋｇ、約０．５〜２．５ｍｇ／ｋｇ、約５〜２５ｍｇ／ｋｇ、約１〜４００ｍｇ／ｋｇである。なお、用量の値は、改善しようとする病状のタイプおよび重篤度によって変化する。さらに、あらゆる特定の被験体について、具体的な用量を、個体の必要性、および当該組成物の投与および投与の監督を行う当業者の専門的判断に基づいて、時間をかけて調整すべきであること、また、ここに示した投与量の範囲は、単なる例に過ぎず、請求の範囲で述べた組成物の範囲またはプラクティスを限定することを意図するものではないことが理解されるであろう。本発明の結合分子の治療的もしくは予防的有効な量の、さらなる限定されない例の範囲は、被験体の体重あたり、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、および約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇなど）である。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができる。好ましくは、少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。上記範囲の投与量中間値も本発明の範囲内であることが意図される。
被験体にそのような用量で、毎日、１日おき、週１回、または経験的分析によって決定された他のあらゆるスケジュールにしたがって、投与することができる。治療は、複数の投与を長期間、例えば、少なくとも６ヶ月にわたって行うことを必要とする。さらに別の例の治療計画は、２週間に１回、または３〜６ヶ月に１回投与することを必要とする。投与の例としては、連続して毎日、１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは１５ｍｇ／ｋｇ、隔日に３０ｍｇ／ｋｇまたは週１回６０ｍｇ／ｋｇの投与が挙げられる。
本発明の結合分子は、多数回投与することができる。単回投与間の間隔は、例えば、毎日、週１回、月１回、または年１回、がある。間隔は、患者における結合分子の血液濃度を測定することによって指示されるように不規則とすることもできる。
本発明の結合分子は、任意に、治療を必要とする障害または状態を治療するのに有効な量（例えば、予防的もしくは治療的）の他の物質と組み合わせて投与することができる。好ましい追加的物質は、当業で認識されており、特定の障害のために標準的に投与される。
該結合分子は、注射（皮下、静脈内等）、経口投与、吸入、経皮投与、または直腸投与などの便利な方法で投与することができる。投与経路に応じ、当該化合物を失活させかねない酵素、酸および他の天然条件の作用から当該化合物を保護する物質で被覆することができる。例えば、非経口投与以外により本作用薬を投与するには、本作用薬を、その失活から保護する物質で被覆または同時投与することが好ましいであろう。
本発明の結合分子を、当業で公知の種々の方法で投与することができが、多くの治療的投与について、好ましい投与経路／投与形態は、静脈注射または注入である。当業者が理解しているように、該投与経路／投与形態は、所望の結果によって変わるであろう。いくつかの態様においては、活性化合物は、当該化合物が急速に放出するのを防ぐであろう担体とともに調製されるかもしれない。例えば、徐放性製剤である。これには、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロ封入送達系がある。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸など、生分解性で生体適合性あるポリマーを用いることができる。このような製剤の調製方法は、多く特許となっており、当業者に全般に公知である。例えば、Sustained and Controlled
Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。
いくつかの態様において、本発明の結合分子は、例えば、不活性の希釈剤および食用の担体とともに、経口投与される。該化合物（および必要であれば、他の成分）は、ゼラチン硬カプセルもしくは軟カプセルに封入することも、または圧縮して錠剤にすることもできる。または被験者の食事に直接と組み込むこともできる。経口による治療的投与の場合、該化合物を添加物と一緒に取り入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース、などの形で用いることができる。非経口投与以外で本発明の化合物を投与するためには、該化合物をコーティングすること、または該化合物とその不活化を防ぐための物質とを同時投与することが必要かもしれない。
結合分子を、酵素阻害剤と一緒に投与することも、あるいはリポソームなどの適した担体に入れて投与することもできる。薬学的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性の緩衝剤水溶液がある。アジュバントはその最も広い意味で用いられており、その中には、インターフェロンなど、いずれかの免疫刺激性化合物が含まれる。ここで考慮されるアジュバントには、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。酵素阻害剤には、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＥＰ）およびトラジロールがある。リポソームには、水中油中水乳濁液や、従来のリポソームがある （Sterna
et al. （1984） J.
Neuroimmunol. 7:27）。
該活性化合物を非経口投与しても、または腹腔内投与してもよい。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびこれらの混合物中や、油中に調製することもできる。通常の保管および使用条件下では、これらの製剤に、微生物の成長を防ぐ保存剤を含めてもよい。
活性化合物が上述したように適宜保護されていれば、本作用薬を、例えば不活性の希釈剤または同和可能な食用の担体と一緒に経口投与することができる。
補助活性化合物を組成物に組み込むこともできる。いくつかの対応において、本発明の結合分子は、１以上の追加治療薬と同時に製剤されおよび/または同時に投与される。例えば、本発明の抗ＩＬＴ３結合分子は、他の標的と結合する１以上のさらに別の抗体、例えば、他のサイトカインと結合する抗体、または、細胞表面分子と結合する抗体と同時に製剤されおよび/または同時に投与される。そのような併用療法は、投与された治療薬の投与量を有利に減少させるかもしれず、可能な毒性または種々の単独治療との併用を避ける。
本発明はさらに、診断薬もしくは治療薬と組み合わせた結合分子を包含する。結合分子は、例えば、所与の治療計画の有効性を決定するための臨床試験処置の一環として、例えば、腫瘍の発症もしくは進行を診断的にモニターするために使用することができる。検出は、抗体を検出可能な物質と結合することによって容易に行うことができる。検出可能な物質の例には、種々の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光性物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影を利用したポジトロン放出金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。該検出可能な物質は、結合分子に直接的結合もしくは接合してもよいし、中間物質（例えば、当業で公知のリンカーなど）を介して間接的に結合もしくは接合してもよい。例えば、本発明において診断に使用するための結合分子に接合され得る金属イオンについては、米国特許第 ４，７４１，９００号を参照されたい。好適な酵素の例には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。好適な補欠分子団の例には、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが含まれ、好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドもしくはフィコエリトリンが含まれ、発光性物質の例にはルミノールが含まれ、好適な生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、アエクオリンが含まれ、好適な放射性物質の例には、Ｉ１２５、Ｉ１３１、Ｉ１１１、Ｉｎ９９Ｔｃが含まれる。
さらに、結合分子は、サイトトキシン、例えば、細胞静止もしくは細胞破壊性の物質、治療薬、放射性金属イオン、例えば、アルファエミッター（例えば、２１３Ｂｉ）、生物学的トキシン、プロドラッグ、ペプチド、タンパク質、酵素、ウイルス、脂質、生物反応変性剤、医薬物質、免疫学的に活性のあるリガンド（例えば、リンフォカインもしくは他の抗体）、などの治療的部分に接合してもよい。別の態様において、本発明の結合分子は、腫瘍の血管新生を減少させる分子に接合することができる。他の態様においては、開示された組成物は、薬物もしくはプロドラッグに結合した本発明の結合分子を含んでもよい。本発明のさらに別の態様は、特異的な生物毒素もしくはそれらの細胞傷害性フラグメント、例えば、リシン、シュードモナスエキソトキシンもしくはジフテリアトキシンに接合した本発明の結合分子の使用を含む。使用すべき結合分子のいずれが接合されており、接合されていないかの選択は、癌の種類、調整治療の使用（例えば、化学療法もしくは体外放射線療法）および患者の状態によって変わる。当業者は、ここに記載の教示に鑑み、そのような選択を容易に行うことができると理解されよう。
サイトトキシンまたは細胞傷害性物質は、細胞にとって有害なあらゆる物質を含む。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（dihydroxy anthracin dione）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド類、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそのアナログもしくはホモログがある。治療薬としては、限定されないが、アンチメタボライト（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン（fluorouracil decarbazine）、アルキル化剤（例えば、クロルエタミン、チオテパクロランブシル（thioepa chlorambucil）、メルファラン、カルスチン（carnustine）（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（cyclothosphamide）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス-ジクロロジアンミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧称：ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（旧称：アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
本発明をさらに以下の実施例で説明することとするが、以下の実施例を限定的なものと捉えられてはならない。本出願全体を通じて引用された全参考文献、特許および公開済み特許出願の内容や、図面および添付物を、引用をもってここに援用することとする。
９Ｂ１１の単離および精製
ＩＬＴ３をコードする遺伝子をクローニングし、それを用いてマウスを免疫し、抗ＩＬＴ３モノクローナル抗体を作製した。９Ｂ１１抗体は、ＩｇＧ１抗体である。
９Ｂ１１抗体を下記のようにして精製した：
１．２０ｍｌのタンパク質Ｇ（Pharmacia HR 10/30）を５ＣＶのｄＰＢＳで洗浄した。
２．１Ｌ（ラン１）または２Ｌ（ラン２）のマウス抗ヒトＩＬＴ３上清を載せた。
３．１０ＣＶのｄＰＢＳで洗浄した。
４．１００ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ２．８を用いて、直接的に１Ｍのトリス（２０〜２５％ｖ：ｖ）に溶出させた。
５．１００ｍＭのクエン酸塩、ｐＨ２．８、０．３ＭのＮａＣｌを用いて剥離した。
９Ｂ１１抗体は、カニクイザルおよびヒヒの単球と交差反応を示した。
インビトロで９Ｂ１１処理した樹状細胞は、共刺激性分子の細胞表面での発現が低い
ＭＤＤＣをＩＬ−１０または抗ＩＬＴ３ｍＡｂｓ（５Ａ１、９Ｂ１１もしくは９Ｇ３）の存在下で誘発した。未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞を対照として用いた。さらに、ＭＤＤＣも陰性対照であるＴＲＸ１の存在下で誘発した。得られた結果を図１に示す。これは、フローサイトメトリーによる測定によれば、９Ｂ１１の存在下で分化したＭＤＤＣにおいて、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＨＬＡ−ＤＲなどの共刺激性分子の発現が低いことがわかる。
上記したように、９Ｂ１１の存在下で分化した細胞は、共刺激性分子の細胞表面発現パターンが減少することがわかった。したがって、これらの細胞は、混合リンパ球反応においてＴ細胞の同種間反応を起こさない可能性が高い。図２に示すように、９Ｂ１１の存在下で分化したＭＤＤＣでは、混合リンパ球反応においてアネルギー性のＴ細胞刺激が起こる。２×１０５のＴ細胞に対して５００個または１０００個ずつのＤＣを添加した。３Ｈチミジンの添加前、細胞を３日間刺激した。
さらに、９Ｂ１１の存在下で誘発されたＭＤＤＣは、ＬＰＳを用いて刺激を行った場合、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αまたはＩＬ−αを生成できない。０日目および３日目に単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４で処理した。０日目および３日目にＩＬ−１０またはＩＬＴ３（９Ｂ１１；１０μｇ／ｍｌ）を添加した。５日目に、細胞を洗浄し、ＬＰＳ（５μｇ／ｍｌ）を成熟培養物に添加した。ＬＰＳを添加した４８時間後に上清液を回収した。サイトカインをＥＬＩＳＡによって測定した（Pierce Endogen）。２つの異なる単球ドナー（ドナー＃２６およびドナー＃５を用いた）（図３）。
９Ｂ１１を用いてインキュベートした新鮮に単離された血液樹状細胞は、サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１ベータ、ＴＮＦ−アルファおよびＰＧＥ）の混合物を用いて該細胞を成熟させたとき、刺激性の分子の発現を完全にアップレギュレートすることが可能であった。成熟混合物を添加する２４時間前に、新鮮に単離された血液樹状細胞を９Ｂ１１とともにインキュベートした。該細胞を４８時間表現型化し、その後９Ｂ１１による処理によって共刺激性の分子の発現が減少するかどうかを判定した。図４に示すように、９Ｂ１１によって単球を処理した結果、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの双方の発現を減少させた。
９Ｂ１１はまた、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、ＣＤ３２を活性化することによって誘発される単球へのＣａ＋２流入を阻害する。抗ＣＤ３２を用いて単球を処理した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＭによって架橋すると、有意なＣａ＋２流入が起こるであろう。しかしながら、ＣＤ３２の添加および架橋の前に９Ｂ１１によるインキュベーションを行った結果、これらの単球によるＣａ＋２流入が減少した。アイソタイプ対照（マウスＩｇＧｌ）ではＣａ＋２流入の阻害が少なかったことから、これは、ＩＬＴ３抗体に特異的なものであった（図５）。
Rabin,
et al.（J Immunol. （1999）162:3840-3850）に記載のようにして、フローサイトメトリーを用いて細胞内カルシウム流入を調べた。簡単に述べれば、単球由来の樹状細胞（２×１０７）をＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、および１％胎児性ウシ血清を添加したＨＢＳＳ）に添加した。インド−１（Indo-1）およびプロイロニック界面活性剤（pleuronic detergent）（Molecular Probes, Eugene, OR）を当初濃度５μＭおよび３００μＭで、それぞれ添加した。細胞懸濁液を３０℃で４５分間、穏やかに撹拌しながらインキュベートした。細胞をＨＢＳＳ−ＨＥＰＥＳで２回洗浄し、抗ＣＤ１ａで染色し、再度洗浄した。ＣＤ１ａ＋樹状細胞のカルシウム流入を、アルゴンレーザーを備えたFACSVantageフローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて調べたところ、４８８ｎＭであった。クリプトンレーザーでは、３６０ｎＭであった。Ｉｎｄｏ−１蛍光光度を、３９０／２０ｎＭおよび５３０／２０ｎＭで分析し、境界およびフリーカルシウムをそれぞれ求めた。刺激前、細胞懸濁液を、３７℃で３分間加温した。ＣＤ１ａ＋細胞集団を分離し、ベースライン蛍光比率を３０秒間集めた。その後細胞をｆＭＬＰ（１０−５Ｍ）、Ｔ−２０ペプチド（１０−５Ｍ）またはＦ−ペプチド（１０−５Ｍ）を用いて刺激し、その後ｆＭＬＰ（１０−８Ｍ）で刺激した。カルシウム流入が基本レベルになるまで回収を続けた。Ｉｎｄｏ−１蛍光性の変化を、境界対細胞内のフリーカルシウムの比率で表した。刺激時のＣＤ１ａ＋細胞集団全体をスキャッタグラフに示す。データ分析は、Flowjoソフトウェアを用いて行った（Tree Star, San Carlos, CA）。
インビトロで９Ｂ１１を用いて処理した樹状細胞は、細胞表面抑制受容体の高い発現を示した
９Ｂ１１は、抑制受容体、例えば、細胞に陰性阻害を生成するレセプターの発現を上方調整するもわかった。磁性ビーズ分離技術を用いて単球を単離した。該単球を、９Ｂ１１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４を用いて１日おきに処理した。５日目、これらの細胞の一部をＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＴＮＦαおよびＰＧＥ２を用いて成熟させた。細胞をさらに７日間インキュベートし、次いで、未成熟の樹状細胞（ｉＤＣ）（ＩＬ１ｂ、ＩＬ６、ＴＮＦαおよびＰＧＥ２を用いて処理していない細胞）および成熟した樹状細胞（ｍＤＣ）からＲＮＡを調製した。該ＲＮＡを用いてＱＰＣＲのｃＤＮＡを生成した。そのデータをハウスキーピング遺伝子１８ｓＲＮＡと関連付けて表す。マウスＩｇＧ１をアイソタイプ対照として用いた。双方の抗体を１０μｇ／ｍｌの濃度で用いた。
結果によれば、ＩＬＴ３結合分子の存在下で樹状細胞に発育するように単球を培養することによって、いくつかの阻害分子がアップレギュレートすることがわかる。ＩＤＯ（インドールアミン）は、細胞で処理したＩＬＴ３結合分子中で非常に過剰発現した。この分子は、耐性の発生と関連している。トレロジェン性の樹状細胞はまた、ＣＤ２００Ｒを発現し、インビボでトレロジェン性を示すことがわかっている。アイソタイプ対照と比較して、ＣＤ２００ＲおよびＣＤ４０Ｌは、ＩＬＴ３結合分子で処理した細胞で上昇した。９Ｂ１１処理によってＦＣＧＲＩＩｂおよびＦＣＧＲＩＩａの発現が上昇したが、サンプルの全てにおいて、ＦＣＧＲＩＩｂとＦＣＧＲＩＩａの発現は等しかった。成熟ＤＣ上の同じレセプターの発現がアイソタイプ対照と違いがなかったことから、この効果は未成熟ＤＣに特異的なものである。
９Ｂ１１のインビボでの特性
準備段階、例えば、マイコバクテリウム−ツベルクローシスを抗原として用いるワクチン接種プロトコルの−１、０および＋１日目に、アカゲマカクを９Ｂ１１で免疫した。＋１８日目に抗原を用いて、続く攻撃を行った結果、皮膚のＤＴＨ反応の悪化が認められた。これらの結果は、存在するアジュバントと比較して低い罹患率で、結合９Ｂ１１が免疫反応を高める（例えば、感染および悪性の場合）のに有用なアジュバントとして機能するということを示すものである。
キメラ抗ＩＬＴ３結合分子の調製
９Ｂ１１軽鎖可変領域を、従来の分子生物学的手法を用いてヒト軽鎖定常領域に移植した。ＩｇＧ１軽鎖定常領域を用いた。完全なキメラ軽鎖ＧＩＴＲ結合分子のアミノ酸配列を以下に示す：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＶＴＰＧＤＳＶＳＬＳＣＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨＷＹＱＱＫＰＨＥＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＱＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＮＳＶＥＴＥＤＦＧＶＦＦＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：２５）
９Ｂ１１重鎖可変領域も、従来の分子生物学的手法を用いてヒト重鎖定常領域に移植した。ＩｇＧ１重鎖定常領域を用いた。完全なキメラ重鎖ＩＬＴ３結合分子のアミノ酸配列を以下に示す「Ｇｌｙ」とも称する）：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＥＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：２６）。
アミノ酸配列ＮＸ（Ｓ／Ｔ）は、結合分子の作製に影響を及ぼし得るグリコシレーション部位の推定上のコンセンサス配列であり、９Ｂ１１重鎖のＩｇＧ１定常領域は配列ＮＳＴを有しているので、第２のバージョンの重鎖定常領域を、配列番号：２７のアミノ酸残基２９６（太字かつ下線を施してある部分）においてグルタミンとアスパラギンが保存的に置換されるように作製した。それに応じて、第２のヒト定常領域を９Ｂ１１重鎖可変領域に移植した。完全なキメラ重鎖ＩＬＴ３結合分子のアミノ酸配列を以下に示す（「Ａｇｌｙ」とも称する）：
ＥＶＫＬＶＥＳＧＧＤＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＥＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：２７）。
９Ｂ１１抗ＧＩＴＲ結合分子のヒト化形態の調製
Hwang et al. （2005）
Methods （36）
35-42に記載されているＣＤＲホモロジーベースの方法を用いて９Ｂ１１をヒト化した。重鎖および軽鎖アミノ酸配列を、公開されている利用可能なデータベースを用いてブラストした。その結果によれば、９Ｂ１１は、３−１重鎖正準構造および２−１−１軽鎖正準構造を持つことが示された。これにより、ＩＭＧＴデータベース中の２−１−１正準構造を持つ全ての生殖細胞系列κ鎖Ｖ遺伝子を９Ｂ１１抗体配列と比較した。同じことを重鎖についても行い、そこでは、全ての３−１生殖細胞系列重鎖Ｖ遺伝子を９Ｂ１１アミノ酸配列と比較した。ＣＤＲ配列のみを比較し、フレームワークは、ＣＤＲにおいてどの生殖細胞系列配列が最も多くのマッチングを示すかに基づいて選択した（下のアライメントを参照されたい）。
軽鎖として、１−１７＊０１配列は、１５のマッチングをＣＤＲに有するものを選択した。ＣＤＲ３は、ロイシンとトレオニンで終わっている。Ｊｋ４Ｊ遺伝子セグメント配列を用いた。Ｊκ３遺伝子セグメント配列はより多くのマッチングを有している。しかしながら、Ｊκ２遺伝子配列（ＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ）（配列番号：１９）を使用してもよい。
２−１−１正準構造を持つ軽鎖Ｖ遺伝子
Figure 0005597793
ＩＭＧＴデータベース中の２−１−１正準構造を持つ全ての生殖細胞系列軽鎖カッパ鎖Ｖ遺伝子を９Ｂ１１抗体配列と比較した。同じことを重鎖についても行い、そこでは、全ての３−１生殖細胞系列重鎖Ｖ遺伝子を９Ｂ１１アミノ酸配列と比較した。
この方法を用いて、軽鎖の１つのバージョンを作製した。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＹＡＳＱＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号：２８）（ＣＤＲをイタリック体で示している）。
多くの重鎖生殖系列配列は、９Ｂ１１抗体に対して１６のマッチングを有している。しかしながら、３−２１＊０１は、ＣＤＲ２の開始点のＳが、キメラ配列のＴに最も類似しているために選択した（保存的アミノ酸置換）。さらに、３−２１＊０１のフレームワークは、ＣＡＲで終わっている。これに対して、１６のマッチングを有する他の重鎖生殖系列においては、ＣＡＫまたはＣＡＲＩである。
重鎖のＪ遺伝子セグメントとして、最も高いマッチングを示していたＪＨ４を選択する。その後アミノ酸配列を逆翻訳し、所望のヌクレオチド配列に対応するプライマーをＩＤＴ（Coralville, IA）から取得する。
１−３正準構造重鎖Ｖ遺伝子
Figure 0005597793
この方法を用いて、重鎖の１つのバージョンを作製した。
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：５３）
９Ｂ１１軽鎖可変領域および１−１７＊０１生殖細胞系列の軽鎖配列のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８２）マルチプル配列アライメント（ギャップペナルティー１０をもつBlosumスコアリングマトリックスを用いる）も行った。その結果を下記表に示す。
Figure 0005597793
ヒト化９Ｂ１１軽鎖の９Ｂ１１フレームワーク残基に対応するアミノ酸残基を用いた潜在的置換を行うために、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ分析に基づいて、ヒトフレームワーク中のいくつかのアミノ酸残基を同定した。具体的には、位置３のＱ、位置４のＭ、位置９のＳ、位置１０のＳ、位置１３のＡ、位置１４のＳ、位置１５のＶ、位置１８のＲ、位置２０のＴ、位置２１のＩ位置２２のＴ、位置４１のＧ、位置４２のＫ、位置４３のＡ、位置４５のＫ、位置４６のＲ、位置４９のＹ、位置５８のＶ、位置７０のＥ、位置７６のＳ、位置７８のＬ、位置７９のＱ、位置８０のＰ、位置８４のＡ、位置８５のＴ、位置８６のＹ、位置８７のＹ、および位置１００のＱ。
同様に、９Ｂ１１重鎖可変領域および３−２１＊０１アミノ酸配列を持つ生殖細胞系列重鎖タンパク質のＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ（１．８２）マルチプル配列アライメント（ギャップペナルティー１０をもつBlosumスコアリングマトリックスを用いる）も行った。その結果を下に示す。
Figure 0005597793
ヒト化９Ｂ１１重鎖の９Ｂ１１フレームワーク残基に対応するアミノ酸残基を用いた潜在的置換を行うために、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ分析に基づいて、ヒトフレームワーク中のいくつかのアミノ酸残基を同定した。
具体的には、位置３のＱ、位置１０のＧ、位置１９のＲ、位置４０のＡ、位置４２のＧ、位置４４のＧ、位置４９のＳ、位置７６のＫ、位置７８のＳ、位置８４のＮ、位置８８のＡ、位置９３のＶ、および／または位置９７のＡ。
上記に基づいて、２つのヒト化全長９Ｂ１１結合分子を、以下のヒト化重鎖および軽鎖の組み合わせを用いて作製することができる。
全長バージョン１（ＨｕＮ９Ｂ１１−Ｇｌｙ）−ヒト化（Ｈｕ）９Ｂ１１軽鎖（Ｌ）／ヒト化重鎖、Ｎをもつ定常領域を含む（「Ｇｌｙ」）。
全長バージョン２（ＨｕＮ９Ｂ１１−Ａｇｌｙ）−ヒト化（Ｈｕ）９Ｂ１１軽鎖（Ｌ）／ヒト化重鎖、Ａをもつ定常領域を含む（「Ａｇｌｙ」）。
全長結合分子を作製するために用いられたグリコシル化されたＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：３０）。
全長結合分子を作製するために用いられたグリコシル化されたＩｇＧ１重鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：３１）。
全長結合分子を作製するために用いられたグリコシル化されたＩｇＧ１軽鎖定常領域のアミノ酸配列を以下に示す。
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：３２）。
ヒト化９Ｂ１１軽鎖の完全なアミノ酸配列を以下に示す。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＬＴＮＤＬＨＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＹＡＳＱＳＩＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＮＳＷＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号：３３）。
配列番号：２１に記載のリーダー配列を任意に含んでもよい。
ヒト化９Ｂ１１重鎖可変領域Ｈｕ９Ｂ１１−ＧｌｙおよびＨｕ９Ｂ１１−Ａｇｌｙの完全アミノ酸配列を下記に示す。
Ｈｕ９Ｂ１１−Ｇｌｙ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：３４）；および
Ｈｕ９Ｂ１１−Ａｇｌｙ
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＡＦＳＳＹＤＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＳＳＳＧＳＹＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＬＷＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号：３５）。
配列番号：２２に記載のリーダー配列を任意に含んでもよい。
均等物
当業者は、ルーチンの実験以上のことをすることなく、本明細書に記載した本発明の具体的な実施形態に対する多くの均等物を認識、または確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の請求項に包含されることが意図されている。

Claims (27)

  1. 配列番号：３に示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）；
    配列番号：４に示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）；
    配列番号：５に示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域３（ＶＨ ＣＤＲ３）；
    配列番号：６に示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）；
    配列番号：７に示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域２（ＶＬ ＣＤＲ２）；
    配列番号：８に示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域３（ＶＬ ＣＤＲ３）；および
    各重鎖フレームワーク領域が、配列番号：４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および６３からなる群から選択される重鎖可変領域配列中の対応するヒト重鎖フレームワークアミノ酸配列のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有し、各軽鎖フレームワーク領域が、配列番号：３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７および６４からなる群から選択される軽鎖可変領域配列中の軽鎖フレームワークアミノ酸配列のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有する、ヒト重鎖フレームワーク領域、またはヒト軽鎖フレームワーク領域、を含むＩＬＴ３に特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  2. 配列番号：３に示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域１（ＶＨ ＣＤＲ１）；
    配列番号：４に示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域２（ＶＨ ＣＤＲ２）；
    配列番号：５に示されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）相補性決定領域３（ＶＨ ＣＤＲ３）；
    配列番号：６に示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域１（ＶＬ ＣＤＲ１）；
    配列番号：７に示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域２（ＶＬ ＣＤＲ２）；
    配列番号：８に示されたアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）相補性決定領域３（ＶＬ ＣＤＲ３）；および
    各重鎖フレームワーク領域が、配列番号：４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および６３からなる群から選択される重鎖可変領域配列中の対応するヒト重鎖フレームワークアミノ酸配列のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有し、各軽鎖フレームワーク領域が、配列番号：３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７および６４からなる群から選択される軽鎖可変領域配列中の軽鎖フレームワークアミノ酸配列のアミノ酸配列に少なくとも９５％の同一性を有する、ヒト重鎖フレームワーク領域、またはヒト軽鎖フレームワーク領域、を含むＩＬＴ３に特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント、または、
    前記１以上のヒトフレームワーク残基に対応する、ネズミ9B11抗体の配列番号：１に示されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は配列番号：２に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域中のフレームワーク残基に逆突然変異した１以上のヒトフレームワークアミノ酸残基を有する、前記抗体または抗原結合フラグメント。
  3. （ａ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み、配列番号：２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を更に含み；または、
    （ｂ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号：３４のアミノ酸配列を含む重鎖を更に含み；または、
    （ｃ）配列番号：３３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、配列番号：３５のアミノ酸配列を含む重鎖を更に含む、
    ＩＬＴ３に特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  4. 前記抗体またはフラグメントは、（ａ）乃至（ｃ）のいずれかを含み、１以上のヒトフレームワーク残基に対応する、ネズミ9B11抗体の配列番号：１に示されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は配列番号：２に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域中のフレームワーク残基に逆突然変異した１以上のヒトフレームワークアミノ酸残基を持つ、請求項３に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
  5. 前記ヒト重鎖フレームワーク領域は、配列番号：６３中のフレームワーク領域であり、前記ヒト軽鎖フレームワーク領域は、配列番号：６４中のフレームワーク領域である、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  6. 前記１以上のヒトフレームワーク残基に対応する、ネズミ9B11抗体の配列番号：１に示されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は配列番号：２に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域中のフレームワーク残基に逆突然変異している前記１以上のヒトフレームワークアミノ酸残基は、配列番号：２８のアミノ酸残基番号３、４、９、１０、１３、１４、１５、１８、２０、２１、２２、４１、４２、４３、４５、４６、４９、５８、７０、７６、７８、７９、８０、８４、８５、８６、８７、および１００から選択される、請求項１、２および４のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  7. 前記１以上のヒトフレームワーク残基に対応する、ネズミ9B11抗体の配列番号：１に示されたアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、又は配列番号：２に示されたアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域中のフレームワーク残基に逆突然変異している前記１以上のヒトフレームワークアミノ酸残基は、配列番号：２９のアミノ酸残基番号３、１０、１９、４０、４２、４４、４９、７６、７８、８４、８８、９３、および９７から選択される、請求項１、２および４のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  8. ＩｇＧ１重鎖定常領域をさらに含む、請求項１又は２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  9. 前記IgG1重鎖定常領域が：
    （ａ）配列番号：３０のアミノ酸配列、または
    （ｂ）配列番号：３１のアミノ酸配列
    を含む、請求項８に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  10. 軽鎖定常領域をさらに含む、請求項１又は２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  11. 前記軽鎖定常領域は、配列番号：３２のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  12. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびｓｃＦｖからなる群から選択される抗原結合フラグメントである、請求項１又は２に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  13. 前記抗体またはフラグメントは、ヒト単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）上でＩＬＴ３に結合し、結合定数が１０９Ｍ−１以下である、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  14. 前記抗体またはフラグメントは、
    （ａ）インビトロで免疫反応をダウンレギュレートし、
    （ｂ）樹状細胞上での共刺激分子のアップレギュレーションをインビトロで下方調整し、または、
    （ｃ）樹状細胞上での抑制受容体の発現をインビトロで上方調整する、
    請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  15. 前記抗体またはフラグメントは、モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  16. 請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント、および薬学的に許容可能な担体を含む、組成物。
  17. 被験者における免疫反応を上方調整する、少なくとも１つの追加的治療薬をさらに含む、請求項１６に記載の組成物。
  18. 被験者における免疫反応を上方調整する方法において使用するための単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、該方法は、該抗体または該フラグメントを被験者に投与することを含む、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  19. 被験者において移植の拒絶反応を下方調整するための方法において使用される単離された抗体または抗原結合フラグメントであって、該方法は、被験者からの抗原提示細胞を、該抗体または抗原結合フラグメントにインビトロで接触させること、および移植と同時もしくは移植の前に抗原提示細胞を被験者に再度導入することによって、被検者における移植の拒絶反応を下方調整する、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  20. 被験者における癌の治療に使用するための単離された抗体、またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはフラグメントを、それを必要とする被験者に投与することを含む、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。
  21. 前記癌は、膵臓癌、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳もしくは中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、食道癌、子宮頚癌、子宮もしくは子宮内膜の癌、口腔もしくは咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸もしくは盲腸の癌、唾液腺の癌、甲状腺の癌、副腎の癌、骨肉腫、軟骨肉腫、および血液組織の癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用のための単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
  22. （ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖またはそのフラグメント、及び
    （ｂ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖またはそのフラグメント、をコードするヌクレオチド配列を含み、
    前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖を含む抗体又はそのフラグメントがILT3に特異的に結合する、少なくとも一つの単離された核酸分子。
  23. 前記抗体重鎖は、配列番号：３４または配列番号：３５のアミノ酸配列を含み、前記抗体軽鎖は、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の少なくとも一つの核酸分子。
  24. 請求項２２または２３に記載の少なくとも一つの核酸分子を含む、発現ベクター。
  25. （ａ）配列番号：２９のアミノ酸配列を含む抗体重鎖またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列、および
    （ｂ）配列番号：２８のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列
    を含む一つ以上の発現ベクターを含み、
    前記抗体重鎖及び前記抗体軽鎖を含む抗体又はそのフラグメントがILT3に特異的に結合する、組換え宿主細胞。
  26. 前記抗体重鎖は、配列番号：３４または配列番号：３５のアミノ酸配列を含み、前記抗体軽鎖は、配列番号：３３のアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。
  27. ＩＬＴ３に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメントを作製するための方法であって、前記方法は、抗体またはフラグメントが細胞によって作製されるまで請求項２５または２６の宿主細胞を培養することを含む方法。
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