CN115551894A - 新型抗lilrb4抗体和衍生产物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了抗LILRB4抗体或其抗原结合片段、抗LILRB4嵌合抗原受体蛋白、编码所述抗LILRB4抗体或其抗原结合片段的分离的多核苷酸、包含所述抗LILRB4抗体或其抗原结合片段的药物组合物以及其用途。

Description

新型抗LILRB4抗体和衍生产物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年3月12日提交的美国临时专利申请62/988,892的优先权，所述美国临时专利申请的公开内容通过引用并入本文。
序列表
大小为151KB(如在微软窗口(Microsoft Windows)中测量的)且创建于2021年3月12日的命名为“066564-8013WO01_ST25”的文件中所包括的序列表在此通过电子提交并且通过引用并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及医学、肿瘤学和免疫学领域。更具体地，本公开涉及与LILRB4结合的抗体。
背景技术
人白细胞免疫球蛋白样受体亚家族B成员4(LILRB4)，也称为免疫球蛋白样转录物3(ILT3或ILT-3)、白细胞免疫球蛋白样受体5(LIR5或LIR-5)和CD85k或CD85K，是含有基于细胞质免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)的I型膜蛋白，并且参与免疫细胞激活的负调节。LILRB4在单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞上表达，并且可以以细胞自主方式抑制先天免疫以及通过间接机制抑制T细胞激活。LILRB4是包括难治性和复发性疾病在内的单核细胞急性骨髓性白血病(AML)的特异性标志物。已经显示，LILRB4支持肿瘤细胞浸润到组织中并且通过涉及AML细胞中的APOE、LILRB4、SHP-2、uPAR和ARG1的信号传导途径抑制T细胞活性(Deng M.等人,《自然(Nature)》(2018)562:605-09)。对于新型抗LILRB4抗体存在显著需求。
发明简述
本公开提供了抗LILRB4抗体和其抗原结合片段、其氨基酸和核苷酸序列、抗LILRB4嵌合抗原受体以及其用途。
一方面，本公开提供了一种分离的抗LILRB4抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，所述抗LILRB4抗体或抗原结合片段包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的重链互补决定区(HC-CDR)1、具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含具有带有氨基酸残基NS处的突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链互补决定区(LC-CDR)1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LC-CDR2以及具有SEQID NO:10所示的氨基酸序列的LC-CDR3。
在某些实施方式中，所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:27至少约90％相同的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述抗体或所述抗原结合片段进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地Ig的恒定区或任选地人IgG的恒定区。
在某些实施方式中，本文所述的抗体属于IgG1同型、IgG2同型、IgG3同型或IgG4同型。
在某些实施方式中，所述抗体或所述抗原结合片段是人源化的。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体、双功能抗体、ds(二硫键稳定的)双功能抗体或ds双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、纳米抗体、结构域抗体或双价抗体。
在某些实施方式中，本文所述的抗LILRB4抗体是双特异性抗体。在一些实施方式中，所述抗LILRB4双特异性抗体针对T细胞受体，如CD3。在一些实施方式中，所述抗LILRB4双特异性抗体针对NK细胞受体，如CD16A。
因此，另一方面，本公开提供了能够与LILRB4和CD3结合的双特异性抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中，本文所提供的双特异性抗体或抗原结合片段包含：(a)第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一轻链可变(VL)结构域和第一重链可变(VH)结构域；以及(b)第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二VL结构域和第二VH结构域，其中所述第一抗原结合区能够与LILRB4结合，并且所述第二抗原结合区能够与CD3结合，反之亦然。
在某些实施方式中，所述第一VL结构域和所述第一重链可变结构域分别与第一对恒定结构域连接，并且其中所述第二VL结构域和所述第二VH结构域分别与第二对恒定结构域连接。
在某些实施方式中，所述第一VL结构域与第一轻链恒定(CL)结构域连接，并且所述第一VH结构域与第一重链恒定结构域1(CH1)连接。在某些实施方式中，所述第一VL结构域与第一CH1结构域连接，并且所述VH结构域与第二CL结构域连接。
在某些实施方式中，所述第二VL结构域与第二CL结构域连接，并且所述第二VH结构域与第二CH1结构域连接。在某些实施方式中，所述第二VL结构域与第二CH1结构域连接，并且所述第二VH结构域与第二CL结构域连接。在某些实施方式中，所述第二VL结构域与T细胞受体(TCR)α链恒定结构域连接，并且所述第二VH结构域与TCRβ链恒定结构域连接。在某些实施方式中，所述第二VL结构域与TCRβ链恒定结构域连接，并且所述第二VH结构域与TCRα链恒定结构域连接。
在某些实施方式中，所述第一抗原结合区和/或所述第二抗原结合区是单链可变片段(scFv)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段进一步包含第三抗原结合区，所述第三抗原结合区包含第三VL结构域和第三VH结构域，其中所述第三抗原结合区能够与LILRB4或CD3结合。
在某些实施方式中，所述第三VL结构域和所述第三重链可变结构域分别与第一对恒定结构域连接。在某些实施方式中，所述第三VL结构域与第三CL结构域连接，并且所述第三VH结构域与第三CH1结构域连接。在某些实施方式中，所述第三VL结构域与第三CH1结构域连接，并且所述第三VH结构域与第三CL结构域连接。在某些实施方式中，所述第三VL结构域与第二TCRα链恒定结构域连接，并且所述第三VH结构域与第二TCRβ链恒定结构域连接。在某些实施方式中，所述第三VL结构域与第二TCRβ链恒定结构域连接，并且所述第三VH结构域与第二TCRα链恒定结构域连接。
在某些实施方式中，所述TCRα链恒定结构域具有SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述TCRα链恒定结构域具有SEQ ID NO:89的S91A突变。
在某些实施方式中，所述抗体或所述抗原结合片段与一个或多个缀合物部分连接。在某些实施方式中，所述缀合物部分包含清除调节剂、毒素、可检测标记、化疗剂或纯化部分。
另一方面，本公开提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
另一方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码本文所述的抗体或其抗原结合片段。
另一方面，本公开提供了一种载体，所述载体包含本文所述的分离的多核苷酸。
另一方面，本公开提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本文所述的载体。在某些实施方式中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如，CHO细胞。
另一方面，本公开提供了一种杂交瘤，所述杂交瘤编码或产生如本文所提供的抗LILRB4抗体。
另一方面，本公开提供了一种表达本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法。在一些实施方式中，所述方法包括在表达本文所述的载体的条件下培养本文所述的宿主细胞。
另一方面，本公开提供了一种治疗或改善受试者的癌症的效应的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的抗体或其抗原结合片段或本文所述的药物组合物。
所述方法可以减少或根除所述受试者的肿瘤负荷，可以减少肿瘤细胞的数量，可以减小肿瘤大小，可以减少肿瘤浸润，可以减少肿瘤转移，可以根除所述受试者的肿瘤。所述癌症可以是实体瘤或血液系统恶性肿瘤。
在某些实施方式中，所述癌症是肾上腺癌、胆管癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、胃食管癌、胶质母细胞瘤、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、默克尔细胞癌(merkel cell cancer)、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、前列腺癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、肉瘤、皮肤癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫癌和阴道癌。
在一些实施方式中，所述癌症是转移性癌症、复发性癌症或耐药性癌症。
在一些实施方式中，所述癌症是包括以下的血液系统恶性肿瘤：急性淋巴细胞性/成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、前体B急性淋巴细胞性白血病(前体B ALL)、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、重链病、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和真性红细胞增多症。
在某些实施方式中，所述血液系统恶性肿瘤包括急性骨髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)或M3 AML、急性骨髓单核细胞性白血病或M4 AML、急性单核细胞性/成单核细胞性白血病或M5 AML以及急性成髓细胞性白血病的子集或亚型。
在某些实施方式中，所述血液系统恶性肿瘤包括急性骨髓性白血病(AML)，所述AML对维奈托克(venetoclax)或维奈托克与氮杂胞苷/阿扎胞苷的组合具有抗性，所述AML在用氮杂胞苷/阿扎胞苷和/或维奈托克治疗后复发，所述AML对维奈托克与地西他滨(decitabine)的组合具有抗性，或者在用氮杂胞苷/阿扎胞苷和地西他滨治疗后复发。
在某些实施方式中，静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用所述抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自下组的药物：拓扑异构酶抑制剂、蒽环类拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素(daunorubicin)、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷(cytarabine)、降甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、注射用柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、
Figure BDA0003938659030000061
氮杂胞苷、
Figure BDA0003938659030000062
地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure BDA0003938659030000063
白介素-2、阿地白介素、
Figure BDA0003938659030000064
吉妥单抗奥唑米星、
Figure BDA0003938659030000065
FLT-3抑制剂、米哚妥林、
Figure BDA0003938659030000066
氯法拉滨(clofarabine)、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布(ivosidenib)、
Figure BDA0003938659030000067
IDH2抑制剂、依那昔布(enasidenib)、
Figure BDA0003938659030000068
平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布(glasdegib)、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他(epacadostat)、BCL-2抑制剂、维奈托克、
Figure BDA0003938659030000069
铂复合物衍生物、奥沙利铂、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼(ibrutinib)、
Figure BDA00039386590300000610
阿卡替尼(acalabrutinib)、
Figure BDA00039386590300000611
赞布替尼(zanubrutinib)、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、CD70抗体和CLL1抗体、CD123抗体、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓样细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、源自植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
在某些实施方式中，所述方法进一步包括最初向所述受试者施用抗LILRB4抗体的单一疗法持续一段时间，随后添加一种或多种选自下组的药物：氮杂胞苷、
Figure BDA00039386590300000612
BCL-2抑制剂、维奈托克和
Figure BDA00039386590300000613
在又另一方面，本公开提供了一种用于检测样品或受试者中的癌细胞或癌症干细胞的方法。在某些实施方式中，所述方法包括：(a)使受试者或来自所述受试者的样品与本文所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及(b)检测所述抗体与所述受试者或样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。
在一些实施方式中，所述样品是体液或活检。在一些实施方式中，所述样品是血液、痰、眼泪、唾液、粘液、血清、尿液或粪便。
在一些实施方式中，所述检测包括免疫组织化学、流式细胞术、免疫测定(包括ELISA、RIA等)或蛋白质印迹。
在一些实施方式中，所述方法进一步包括：第二次或额外数次执行步骤(a)和(b)；并且与第一次比较，确定检测水平的变化。
所述抗LILRB4抗体或其抗原结合片段可以进一步包含标记，如肽标签、酶、磁性颗粒、发色团、荧光分子、化学发光分子或染料。所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段可以与脂质体或纳米颗粒缀合。
另一方面，本公开提供了本文所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
另一方面，本公开提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本文所述的抗体或其抗原结合片段，所述试剂盒可用于检测LILRB4。
另一方面，本公开提供了一种抗LILRB4嵌合抗原受体(CAR)蛋白。在一些实施方式中，所述CAR蛋白包含：(a)重链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HC-CDR3；以及(b)轻链可变区，所述轻链可变区包含具有带有氨基酸残基NS处的突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LC-CDR2以及具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LC-CDR3。在一些实施方式中，所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，所述LILRB4 CAR蛋白的所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列；并且所述CAR蛋白的所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:27至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CAR蛋白包含单链可变片段(scFv)，所述scFv具有与SEQ ID NO:66或SEQ IDNO:68至少85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述CAR蛋白具有scFv，所述scFv具有与SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68相同的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本文所述的CAR蛋白。在一些实施方式中，所述多核苷酸分子进一步包含在真核细胞中具有活性的启动子。在一些实施方式中，所述多核苷酸分子是表达载体。
另一方面，本公开提供了一种经工程化的细胞，所述经工程化的细胞包含编码本文所述的CAR蛋白的多核苷酸分子。在一些实施方式中，所述细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
另一方面，本公开提供了一种治疗或改善有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细胞疗法，所述细胞疗法包括一种或多种包含编码本文所述的CAR蛋白的多核苷酸分子的细胞。在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述人受试者施用第二癌症疗法。在一些实施方式中，所述第二癌症疗法是化疗、免疫疗法、放射疗法、激素疗法或外科手术。在一些实施方式中，所述第二癌症疗法与所述细胞疗法同时施用。在一些实施方式中，所述第二癌症疗法在所述细胞疗法之前或之后施用。在一些实施方式中，所述方法进一步包括向所述人受试者第二次施用有效量的一种或多种包含编码本文所述的CAR蛋白的多核苷酸分子的细胞。
在一些实施方式中，所述细胞疗法局部施用于癌症部位、区域施用于癌症部位或全身性施用。
在一些实施方式中，所述癌症是包括以下的血液系统恶性肿瘤：急性淋巴细胞性/成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、前体B急性淋巴细胞性白血病(前体B ALL)、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、重链病、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、华氏巨球蛋白血症、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和真性红细胞增多症。
在某些实施方式中，所述血液系统恶性肿瘤包括急性骨髓性白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病(APL)或M3 AML、急性骨髓单核细胞性白血病或M4 AML、急性单核细胞性/成单核细胞性白血病或M5 AML以及急性成髓细胞性白血病的子集或亚型。
在另外的方面，提供了一种治疗或改善受试者的自身免疫性疾病的效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所定义的抗体或其抗原结合片段。可以静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用所述抗体或其抗原结合片段。所述方法可以进一步包括向所述受试者施用一种或多种选自由类固醇或NSAID组成的组的药物。所述自身免疫性疾病可以是格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、强直性脊柱炎、银屑病性关节炎、肠病性关节炎、反应性关节炎、未分化脊柱关节病、青少年脊柱关节病、白塞氏病(Behcet's disease)、肌腱端炎、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病(Crohn's disease)、肠易激综合征、炎性肠病、纤维肌痛、慢性疲劳综合征、与全身性炎性疾病相关的疼痛病状、全身性红斑狼疮、舍格伦综合征(Sjogren's syndrome)、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、青少年发作型糖尿病(也称为I型糖尿病)、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's granulomatosis)、多肌炎、皮肌炎、包涵体肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt's syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、阿狄森氏病(Addison'sdisease)、格雷夫氏病(Grave's Disease)、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮性肝炎、动脉粥样硬化症、多发性硬化症、肌萎缩侧索硬化症、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒氏综合征(Dressler'ssyndrome)、重症肌无力、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、脱发、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着症、雷诺氏现象、食管运动障碍、指端硬化和毛细管扩张)、成人发作型糖尿病(也称为II型糖尿病)、混合性结缔组织病、结节性多动脉炎、全身性坏死性血管炎、肾小球肾炎、特应性皮炎、特应性鼻炎、古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture's syndrome)、恰加斯氏病(Chagas'disease)、结节病、风湿热、哮喘、抗磷脂综合征、多形性红斑、库欣氏综合征(Cushing's syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、变应性疾病、变应性脑脊髓炎、输血反应、麻风病、疟疾、利什曼病、锥虫病、高安氏动脉炎(Takayasu's arteritis)、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、川崎氏病(Kawasaki's disease)、眼内炎、银屑病、胎儿成红细胞增多病、嗜酸性筋膜炎、舒尔曼氏综合征(Shulman's syndrome)、费耳蒂氏综合征(Felty'ssyndrome)、富克斯氏睫状体炎(Fuch's cyclitis)、IgA肾病、亨-舒二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥、兔热病、周期性发热综合征、化脓性关节炎、家族性地中海热、TNF受体相关周期性综合征(TRAPS)、穆-韦二氏综合征(Muckle-Wellssyndrome)或高IgD综合征。
附图说明
图1示出了抗LILRB4抗体和衍生产物的作用机制的示意图。
图2示出了H7K3(分子A)和H7K3m5(分子B)在40℃下持续2周或4周的icIEF比较结果。
图3示出了抗LILRB4抗体H7K3m5对THP-1细胞上的人内源LILRB4的识别。
图4示出了野生型(WT)或无岩藻糖基化(afu)H7K3m5对THP-1-GFP细胞的ADCC。
图5示出了人单核细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)上的LILRB4表达。
图6示出了在人单核细胞中通过IL-10和IFNα处理上调LILRB4的表达。
图7示出了在被LPS刺激的人单核细胞上LILRB4水平下调和uPAR水平上调。
图8A示出了在体外人单核细胞分化的巨噬细胞上的LILRB4表达。图8B示出了在体外单核细胞衍生的人巨噬细胞上的LILRB4的拷贝数量。
图9示出了在体外分化的MDSC上的LILRB4的拷贝数量。
图10A-10B示出了人单核细胞衍生的树突状细胞(DC)上的LILRB4的拷贝数量。按照以下由高到低的顺序看到LILRB4水平：耐受原性DC>激活的DC>未成熟DC
图11示出了基于通过计算生物学途径产生的巨噬细胞基因表达“标记”，来自TCGARNA测序数据库的、具有巨噬细胞浸润的高和低信号的实体瘤样品之间的LILRB4 mRNA表达水平的比较。分析中包括的每种肿瘤类型的样品的总数在括号中指示。此处所示的结果部分基于由TCGA研究网(TCGA Research network)产生的RNA测序数据。
图12A-12B展示了代表性流式细胞术数据，所述流式细胞术数据示出了H7K3m5与浸润到实体瘤微环境(TME)中的单核细胞髓样细胞，以及来自实体瘤患者的外周血单核细胞髓样细胞特异性结合。深灰色填充的直方图：与H7K3m5一起温育的样品；浅灰色填充的直方图：与人IgG1同型对照一起温育的样品。图12A：H7K3m5或其同型对照对浸润TME的各种髓样细胞子集的结合信号。图12B：H7K3m5或其同型对照对来自外周血的各种髓样细胞子集的结合信号。
图13A-13D示出了在使用新鲜PBMC的自体ADCC中没有H7K3m5介导的单核细胞杀伤。将来自健康供体的新鲜分离的PBMC在存在连续滴定的H7K3m5、同型对照人IgG1或作为阳性对照的利妥昔单抗(rituximab)的情况下温育过夜。通过流式细胞术鉴定单核细胞和B细胞并且将其作为CD14+CD19-和CD19+CD14-计数。图13A和13C示出了缺乏来自两个不同供体的PBMC的单核细胞杀伤，并且图13B和13D示出了对应B细胞杀伤作为阳性对照。
图14A-14D示出了野生型(WT)或无岩藻糖基化(afu)H7K3m5对正常单核细胞的自体ADCC。图14A和14C示出了来自两个不同供体的PBMC通过ADCC进行的代表性单核细胞杀伤。在供体024中观察到无岩藻糖基化H7K3m5对单核细胞的ADCC，但在供体13中活性是最小的。没有观察到由野生型H7K3m5的ADCC。图14B和14D示出了对应B细胞杀伤作为阳性对照。
图15A-15D示出了通过野生型(WT)或无岩藻糖基化(afu)H7K3m5介导的自体ADCC对pDC或单核细胞的自体ADCC。在两个供体中观察到由野生型和无岩藻糖基化H7K3m5两者对针对pDC的ADCC。同时，单核细胞可以仅用无岩藻糖基化H7K3m5杀伤，这取决于供体。此外，针对pDC或单核细胞，无岩藻糖基化H7K3m5显示出比野生型强得多的ADCC活性(图15A-15B)。
图16A-16B示出了在存在H7K3m5的情况下，CD33+MDSC细胞与经过纯化的NK细胞的剂量依赖性ADCC，所述H7K3m5在相同剂量水平下对单核细胞不具有ADCC效应。H7K3m5示出了在同一实验中针对AML细胞系THP-1的ADCC活性(图16B)。
图17A-17B示出了由抗LILRB4对THP-1-GFP细胞的ADCP。在存在连续滴定的野生型H7K3m5或同型对照人IgG1的情况下，将THP-1-GFP细胞与体外分化的巨噬细胞共培养24小时。THP-1-GFP细胞和巨噬细胞被分别鉴定和定量为GFP+和CD163+CD206+。根据GFP+细胞的绝对计数或GFP+％细胞计算THP-1细胞杀伤百分比。图17A和17B示出了从两个单独健康供体分化的巨噬细胞的野生型H7K3m5对THP-1-GFP细胞的ADCP。
图18示出了用抗LILRB4针对THP-1-GFP细胞的体外T细胞细胞毒性。将THP-1-GFP细胞与经过纯化的未经处理的T细胞共培养。抗LILRB4 H7K3m5可以诱导针对AML细胞的T细胞细胞毒性。效应子pan T细胞来自3个不同的健康供体。曲线绘制为平均值±SD。EC50值以纳摩尔为单位。
图19示出了来自体外T细胞细胞毒性测定样品的上清液中的代表性细胞因子产生特征曲线。抗LILRB4诱导的针对THP-1细胞的T细胞细胞毒性通过共培养物中的细胞因子的升高来反映。曲线绘制为平均值±SD。EC50值以纳摩尔为单位。无法得到IL-6的EC50值。
图20示出了通过流式细胞术评估T细胞激活。A-B：T细胞激活标志物CD69(A)和CD25(B)的表面染色。C-E：通过流式细胞术测定的共培养T细胞和THP-1细胞的胞内细胞因子染色。C：产生IFNγ和TNFα的细胞；D：产生IFNγ但不产生TNFα的细胞；E：产生TNFα但不产生IFNγ的细胞。
图21示出了在H7K3m5处理时THP-1细胞上的T细胞激活标志物和MHC表达增加。D428＝供体428。MFI＝几何平均荧光强度。
图22示出了通过流式细胞术测定的的THP-1AML细胞上的激活标志物的表面表达。MFI＝几何平均荧光强度。
图23示出了H7K3m5在AML异种移植模型中是有效的。这个实验评估了THP-1.luc细胞的生长动力学并且使用生物成像测定了H7K3m5在雌性NSG小鼠中的THP-1.luc人AML异种移植模型中的功效。将1×106个THP-1.luc细胞通过尾静脉静脉内植入到JAX雌性NSG小鼠体内。在第1天(细胞注射后4至6小时)，在动物随机化以及媒剂对照或H7K3m5(1mg/kg)的单剂量静脉内施用之前，进行全身生物发光成像。在第7天、第14天、第17天和第21天，收集对照和经过处理的动物的全身生物发光成像数据。
图24展示了流式细胞术数据，所述流式细胞术数据示出了H7K3m5响应于Toll样受体(TLR)信号传导而增强单核细胞衍生的树突状细胞(Mo-DC)的成熟/激活。H7K3m5增强激活标志物(CD86，HLA-DR)的表达，同时降低耐受性标志物CD209的表达。每条线表示来自不同健康供体的结果。供体的分数在括号中指示，在所述供体中H7K3m5产生期望的促炎效应。*p<0.05(配对的t检验)。
图25展示了流式细胞术数据，所述流式细胞术数据示出了在与同种异体T细胞进行混合白细胞反应后，H7K3m5增强成熟单核细胞衍生的DC(Mo-DC)表面上的激活标志物(CD86和HLA-DR)的表达。在不存在(-CD40L)或存在(+CD40L)CD40配体的情况下，评估H7K3m5的作用，以分别研究H7K3m5对未成熟和成熟Mo-DC的作用。每条线表示来自不同健康供体的结果(n＝3个供体)。
图26展示了ELISA数据，所述数据示出了H7K3m5在T细胞和成熟单核细胞衍生的DC(Mo-DC)的同种异体混合白细胞反应中增加IL-12的产生。在不存在(-CD40L)或存在(+CD40L)CD40配体的情况下，评估H7K3m5的作用，以分别研究H7K3m5对未成熟和成熟Mo-DC的作用。数据表示为平均值±SEM，并且每个供体的数据也显示为单独的数据点(n＝2至3个供体)。
图27展示了ELISA数据，所述数据示出了H7K3m5在T细胞和单核细胞衍生的DC(Mo-DC)的同种异体混合白细胞反应中增加IFN-γ的产生。在不存在(-CD40L)或存在(+CD40L)CD40配体的情况下，评估H7K3m5的作用，以分别研究H7K3m5对未成熟和成熟Mo-DC的作用。数据表示为平均值±SEM，并且每个供体的数据也显示为单独的数据点(n＝3个供体)。
图28A和28B示出了LILRB4/CD3双特异性抗体的构型的示意图。
图29A和29B示出了如通过FACS所测量的，CD3和LILRB4双特异性抗体与正常单核细胞和AML细胞系THP-1的结合。在不同的抗LILRB4单特异性抗体和单核细胞与THP-1之间的双特异性抗体中观察到类似的结合亲和力趋势。
图30A和30B示出了双特异性CD3/LILRB4抗体在单核细胞(图22A)和THP-1-luc-GFP细胞(图22B)上的T细胞介导的细胞毒性。
图31A和31B示出了由LILRB4xCD3双特异性抗体产生的单核细胞的自体杀伤(图31A)和由美罗华(Rituxan)作为对照产生的B细胞的自体杀伤(图31B)。
图32示出了在针对人原代单核细胞和人白血病细胞系THP-1的流式细胞术测定中使用H7K3m5全长IgG和ScFv蛋白的结合亲和力比较。
图33示出了用于表达抗LILRB4 CAR蛋白的DNA构建体的示意图。DNA构建体基于包括CD28或4-1BB共刺激结构域与CD3ζ激活结构域的第2代CAR构建体。scFv源自抗LILRB4单克隆抗体H7K3m5。5'和3'同源臂是TRAC基因中Cas9 DNA切割位点的上游和下游的同源序列(基于gRNA设计)。启动子和前导肽是基因表达和胞外易位的元件。包括SV40 poly-A尾部用于改善转录物稳定性和翻译。
图34示出了使用CRISPR敲除和敲入方法有效产生LILRB4 CAR-T细胞。在具有或不具有用于基于同源重组的敲入的DNA模板的情况下，用被设计成灭活TCRα(TRAC)基因座的CRISPR-Cas9 RNP复合物转染人原代T细胞。转染后，将细胞在培养物中扩增2周。通过与LILRB4-Fc融合蛋白(百普赛斯生物公司(ACRObiosystems)CDK-H5259)和抗Fc抗体(百进生物公司(Biolegend)B278652，阴性对照)结合来鉴定抗LILRB4 CAR-T细胞。通过抗CD3染色(抗CD3PE，BD 555333)测量成功的TCRα(TRAC)灭活(敲除或KO)。ATC，激活的T细胞；KO，TCRα(TRAC)灭活的T细胞；RB4_CD28，表达具有CD28共刺激结构域的抗LILRB4 CAR的T细胞；RB4_41BB，表达具有4-1BB共刺激结构域的抗LILRB4CAR的T细胞。
图35示出了TCRα(TRAC)灭活的T细胞(KO)和抗LILRB4 CAR(或对照CAR)敲入的T细胞的增殖。在敲除TCRα之后，将细胞在添加IL-2 300IU/ml且不添加抗CD3/28的完全优化剂培养基中生长。通过将所处天数(如所指示)的总T细胞数除以起始培养物数来绘制倍数扩增。与对照CAR-T细胞相比，抗LILRB4 CAR-T细胞具有显著更高的扩增倍数。ATC，激活的T细胞；KO，TCRα(TRAC)灭活的T细胞；ctrl_CD28，表达具有CD28共刺激结构域的对照CAR的T细胞；ctrl_41BB，表达具有4-1BB共刺激结构域的对照CAR的T细胞；RB4_CD28，表达具有CD28共刺激结构域的抗LILRB4 CAR的T细胞；RB4_41BB，表达具有4-1BB共刺激结构域的抗LILRB4 CAR的T细胞。
图36A-36H示出了CAR-T培养物的抗原依赖性激活。将1ug/ml重组对照抗原或LILRB4抗原包被在96孔板上在PBS缓冲液中过夜。将板用PBS缓冲液洗涤两次。将培养基中的1×105个CAR-T细胞(不添加任何细胞因子)添加到每个孔中并温育72小时。收集细胞培养上清液，以通过路明克斯测定进行细胞因子释放测量。ATC，激活的T细胞；KO，TCRα(TRAC)灭活的T细胞；抗RB4_CD28CART，表达具有CD28共刺激结构域的抗LILRB4 CAR的T细胞；抗RB4_41BB CART，表达具有4-1BB共刺激结构域的抗LILRB4 CAR的T细胞；对照_CD28CART，表达具有CD28共刺激结构域的对照CAR的T细胞；对照_41BBCART，表达具有4-1BB共刺激结构域的对照CAR的T细胞。
图37A-37C示出了扩增2周后CAR-T细胞的表征。在流式细胞术分析之前，将液氮储存中的冷冻的CAR-T细胞解冻并在培养物中保持2-3天。所使用的抗体是抗CD8APC Cy7(BD561945)、抗PD1 PE(BD560908)和抗TIM3 BV421(BD565562)。通过与LILRB4-Fc融合蛋白(百普赛斯生物公司CDK-H5259)和抗Fc抗体(百进生物公司B278652)结合来鉴定抗LILRB4CAR-T细胞。
图38示出了抗LILRB4 CAR-T细胞的细胞毒性。将CHO K1 RB4细胞以不同密度(6×104、2×104或7×103)接种12小时，添加1×105个CAR-T细胞，并且通过去除上清CAR-T细胞并将板用PBS洗涤2次来测量细胞毒性。通过普洛麦格公司(Promega)CTG2.0发光试剂盒测量总活的贴壁CHO K1 RB4细胞。并且通过将每种条件的发光信号除以同一E:T比率激活的T细胞对照来计算细胞毒性％。
图39A-39B示出了1期首次人体临床试验的示意图。图39A是用于剂量递增的“窗口”设计的示意图。图39B是抗LILRB4单一疗法的示意图。图39C-39D是抗LILRB4抗体与氮杂胞苷和/或维奈托克的潜在组合研究的示意图。与抗LILRB4的其它潜在组合将遵循相同或类似的模式。AZA，氮杂胞苷；VEN，维奈托克；C1D1，第1周期第1天；第2周期第1天；DLT，剂量限制性毒性；MTD1，抗LILRB4单一疗法的最大耐受剂量；MTD2，抗LILRB4与氮杂胞苷的组合的最大耐受剂量。将抗LILRB4作为单一疗法或与其它药剂组合每14天进行施用，直至疾病发展或死亡。
发明详述
本公开的以下描述仅旨在说明本公开的各个实施方式。如此，所讨论的具体修改不应被解释为对本公开的范围的限制。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的范围的情况下，可以做出各种等效物、改变和修改，并且应当理解，此类等效实施方式将被包括在本文中。在本文中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入本文。
I.定义
应当理解，前述一般性描述和以下详细描述都仅是示例性和说明性的，并且不限制所要求保护的本发明。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。在本公开中，除非明确指示仅指代替代方案或替代方案是相互排斥的，否则术语“或”用于意指“和/或”。如本文所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。此外，术语“包括(including)”以及如“包括(includes)”和“包括(included)”等其它形式的使用不是限制性的。此外，除非另外特别说明，否则如“元件”或“组件”等术语涵盖包括一个单元的元件或组件和包括多于一个亚单元的元件或组件两者。此外，术语“部分”的使用可以包括部分的一部分或整个部分。
如本文所使用的，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。
如本文所使用的，术语“抗体”包括与特异性抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、双价抗体、单价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。天然的完整抗体包含两条重(H)链和两条轻(L)链。哺乳动物重链被分类为α、δ、ε、γ和μ，每条重链由可变结构域(VH)和恒定区组成，所述恒定区包括第一恒定结构域、第二恒定结构域和第三恒定结构域(分别为CH1、CH2、CH3)，哺乳动物轻链被分类为λ或κ，而每条轻链由可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)组成。典型的IgG抗体呈“Y”形，其中Y的茎部通常由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二恒定结构域和第三恒定结构域组成。Y的每个臂包括与单条轻链的可变结构域和恒定结构域结合的单条重链的可变结构域和第一恒定结构域。轻链和重链的可变结构域负责与抗原结合。两条链的可变结构域通常包括三个高度可变的环，称为互补决定区(CDR)(轻链CDR包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，重链CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3)。本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可以通过Kabat、IMGT、Chothia或Al-Lazikani规则来定义或鉴定(Al-Lazikani,B.,Chothia,C.,Lesk,A.M.,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》,273(4),927(1997)；Chothia,C.等人,《分子生物学杂志》(1985)186(3):651-63；Chothia,C.和Lesk,A.M.,《分子生物学杂志》(1987)196:901；Chothia,C.等人,《自然》(1989)342(6252):877-83；Marie-Paule Lefranc等人,《发育与比较免疫学(Developmental and Comparative Immunology)》(2003)27:55-77；Marie-Paule Lefranc等人,《免疫组研究(Immunome Research)》(2005)1(3)；Marie-Paule Lefranc,《B细胞分子生物学(Molecular Biology of B cells)》(第二版),第26章,481-514,(2015))。三个CDR插置于称为框架区(FR)的侧接延伸段之间，所述FR比CDR更高度保守并且形成支架以支持高变环。重链和轻链的恒定结构域不参与抗原结合，但表现出各种效应子功能。基于抗体的重链恒定区的氨基酸序列将抗体分为多个类别。抗体的五个主要类别或同型是IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征分别在于存在α、δ、ε、γ和μ重链。若干个主要抗体类别被分为亚类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)。
术语“抗原”是指能够诱导适应性免疫应答的物质。具体地，抗原是与抗体或T淋巴细胞抗原受体特异性结合的物质。抗原通常是蛋白和多糖，不太常见的也有脂质。合适的抗原包括但不限于细菌的部分(衣壳、荚膜、细胞壁、鞭毛、菌毛和毒素)、病毒和其它微生物。抗原还包括肿瘤抗原，例如，由肿瘤中的突变产生的抗原。如本文所使用的，抗原还包括免疫原和半抗原。
如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的抗体片段、或与抗原结合但不包含完整天然抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段的实例包括但不限于双功能抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定的双功能抗体(ds双功能抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚体(二价双功能抗体)、双特异性抗体、多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体和二价结构域抗体。抗原结合片段能够与亲本抗体所结合的相同抗原结合。
“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变结构域。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
“Fab'片段”包含一条轻链和一条重链的一部分，使得可以在两个Fab'片段的两条重链之间形成链间二硫键，以形成F(ab')2分子，所述重链的一部分包含VH结构域和CH1结构域并且还包含位于CH1结构域与CH2结构域之间的区域。
“F(ab')2片段”包含两条轻链和两条重链，使得在两条重链之间形成链间二硫键，所述两条重链包含位于CH1结构域与CH2结构域之间的恒定区的一部分。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段构成，所述两个Fab'片段由位于两条重链之间的二硫键保持在一起。
关于抗体的“Fv”是指携带完整抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由与单条重链的可变结构域结合的单条轻链的可变结构域组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变结构域和重链可变结构域组成的工程化抗体，所述轻链可变结构域和重链可变结构域直接相互连接或通过肽连接子序列相互连接(Huston JS等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》(1988)85:5879)。
“Fc”区包含两个重链片段，所述重链片段包含抗体的CH2结构域和CH3结构域。两个重链片段由两个或更多个二硫键并且通过CH3结构域的疏水相互作用保持在一起。抗体的Fc区负责各种效应子功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，但在抗原结合中不起作用。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由与抗体的Fc区连接的scFv组成的工程化抗体。
“dsFv”是指二硫键稳定的Fv片段，其单条轻链的可变结构域与单条重链的可变结构域之间的连接是二硫键。在一些实施方式中，“(dsFv)2”或“(dsFv-dsFv')”包含三条肽链：由肽连接子(例如，长柔性连接子)连接的并且通过二硫桥分别与两个VL结构域结合的两个VH结构域。在一些实施方式中，dsFv-dsFv'具有双特异性，其中每对通过二硫键配对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
“骆驼化单结构域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”是指包含两个VH结构域而不包含轻链的抗体(Riechmann L.和Muyldermans S.,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods)》12月10日；231(1-2):25-38(1999)；Muyldermans S.,《生物技术杂志(J Biotechnol.)》六月；74(4):277-302(2001)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。重链抗体最初源自骆驼科(Camelidae)(骆驼、单峰骆驼和美洲驼)。虽然缺失轻链，但是骆驼化抗体具有确证的抗原结合库(Hamers-Casterman C.等人,《自然》(1993)363:446-8；Nguyen VK.等人,《免疫遗传学(Immunogenetics)》(2002)54:39-47；Nguyen VK.等人《免疫学(Immunology)(2003)109:93-101)。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)表示由适应性免疫应答产生的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte F.等人,《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》(2007)21:3490-8)。
“纳米抗体”是指由来自重链抗体的VHH结构域和两个恒定结构域CH2和CH3组成的抗体片段。
“双功能抗体”或“dAb”包含具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中所述片段包含在同一条多肽链中与VL结构域连接的VH结构域(VH-VL或VL-VH)(参见例如，Holliger P.等人,《美国国家科学院院刊》7月15日；90(14):6444-8(1993)；EP404097；WO93/11161)。通过使用太短以至于不允许在同一条链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点。抗原结合位点可以靶向相同或不同的抗原(或表位)。在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”是靶向两种不同抗原(或表位)的双功能抗体。
在某些实施方式中，“scFv二聚体”是可以通过连接两个scFv工程化的二价(divalent或bivalent)单链可变片段(di-scFv、bi-scFv)。二价双功能抗体或二价scFv(BsFv、di-scFv、bi-scFv)包含与另一个VH-VL部分二聚化的VH-VL(通过肽连接子连接)，使得一个部分的VH与另一个部分的VL配位并且形成可以靶向相同抗原(或表位)或不同抗原(或表位)的两个结合位点。在其它实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，所述双特异性双功能抗体包含与VL1-VH2(通过肽连接子连接)缔合的VH1-VL2(也通过肽连接子连接)，使得VH1与VL1配位并且VH2和VL2配位，并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
“结构域抗体”是指仅包含重链的可变结构域或轻链的可变结构域的抗体片段。在某些情况下，两个或更多个VH结构域通过肽连接子共价连接，以产生二价或多价结构域抗体。二价结构域抗体的两个VH结构域可以靶向相同或不同的抗原。
“双特异性”抗体是指具有源自两个不同的单克隆抗体的片段并且能够与两个不同的表位结合的人工抗体。两个表位可以存在于同一抗原上，或其可以存在于两种不同抗原上。
如本文所使用的，“癌症”是指特征在于恶性细胞生长或赘生物、异常增殖、浸润或转移的任何医学病状，包括实体瘤和非实体癌(血液系统恶性肿瘤)，如白血病。如本文所使用的，“实体瘤”是指赘生性和/或恶性细胞的实体团块。癌症或肿瘤的实例包括血液系统恶性肿瘤、口腔癌(例如，唇癌、舌癌或咽癌)、消化器官癌(例如，食道癌、胃癌、小肠癌、结肠癌、大肠癌或直肠癌)、腹膜癌、肝脏癌和胆道癌、胰腺癌、呼吸系统癌如喉癌或肺癌(小细胞和非小细胞)、骨癌、结缔组织癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤)、乳腺癌、生殖器官癌(输卵管癌、子宫癌、宫颈癌、睾丸癌、卵巢癌或前列腺癌)、泌尿道癌(例如，膀胱癌或肾脏癌)、脑癌和内分泌腺癌如甲状腺癌。在某些实施方式中，癌症选自卵巢癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、膀胱癌、肝细胞癌和结直肠癌。在某些实施方式中，癌症选自淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。
如本文所使用的，术语“嵌合”意指具有源自一种物种的重链和/或轻链的一部分并且所述重链和/或轻链中的其余部分源自另一不同物种的抗体或抗原结合片段。在说明性实施例中，嵌合抗体可以包含源自人的恒定区和源自非人动物如源自小鼠或兔的可变区。在一些实施方式中，非人动物是哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、豚鼠或仓鼠。
如本文所使用的，术语“特异性结合(specific binding)”或“特异性结合(specifically binds)”是指两个分子之间，例如抗体与抗原之间的非随机结合反应。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段以以下结合亲和力(KD)与人LILRB4特异性结合：≤10-6M(例如，≤5x10-7 M、≤2x10-7 M、≤10-7M、≤5x10-8M、≤2x10-8 M、≤10-8M、≤5x10-9 M、≤4x10-9M、≤3x10-9M、≤2x10-9 M或≤10-9M)。本文所使用的KD是指解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)，所述比率可以通过使用本领域中已知的任何常规方法来确定，所述方法包括但不限于表面等离子体共振法、微量热泳法、HPLC-MS方法和流式细胞术(如FACS)方法。在某些实施方式中，KD值可以通过使用流式细胞术适当地确定。
如本文所使用的，“阻断结合”或“竞争同一表位”的能力是指抗体或抗原结合片段抑制两个分子(例如，人LILRB4与抗LILRB4抗体)之间的结合相互作用到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子之间结合的抗体或抗原结合片段将两个分子之间的结合相互作用抑制至少85％或至少90％。在某些实施方式中，所述抑制可以大于85％或大于90％。
本领域技术人员将认识到，通过确定给定抗体是否阻止本公开的抗体与LILRB4抗原多肽结合，可以在不进行不当实验的情况下确定给定抗体是否与本公开的抗体结合同一表位。如果给定抗体与本公开的抗体竞争，如本公开的抗体与LILRB4抗原多肽的结合减少所示，则两种抗体与相同或密切相关的表位结合。或者，如果给定抗体与LILRB4抗原多肽的结合被本公开的抗体抑制，则两种抗体与相同或密切相关的表位结合。
如本文所使用的，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指能够将针对抗原的期望特异性移植到免疫效应子细胞(如T细胞、NK细胞和巨噬细胞)中的工程化受体。通常，CAR蛋白包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域引入期望的特异性，当免疫效应子细胞与抗原结合时，所述胞内结构域向免疫效应子细胞发射信号。在某些实施方式中，胞外结构域包含前导肽、抗原识别区和间隔子区。在某些实施方式中，抗原识别区源自与抗原特异性结合的抗体。在某些实施方式中，抗原识别区是源自抗体的单链可变片段(scFv)。在某些实施方式中，单链可变片段(scFv)源自人源化抗体。在某些实施方式中，单链可变片段包含通过柔性连接子与轻链可变区融合的重链可变区。
关于氨基酸序列的“保守取代”是指将氨基酸残基用不同的具有类似理化性质的侧链的氨基酸残基替代。例如，可以在具有疏水侧链的氨基酸残基(例如，Met、Ala、Val、Leu和Ile)之间、具有中性亲水侧链的残基(例如，Cys、Ser、Thr、Asn和Gln)之间、具有酸性侧链的残基(例如，Asp、Glu)之间、具有碱性侧链的氨基酸(例如，His、Lys和Arg)之间或具有芳香族侧链的残基(例如，Trp、Tyr和Phe)之间进行保守取代。如本领域中已知，保守取代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此可以保留蛋白质的生物活性。
如本文所使用的，“效应子功能”是指由抗体的Fc区与其如C1复合物和Fc受体等效应子结合引起的生物活性。示例性效应子功能包括：由抗体和C1复合物上的C1q的相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性(CDC)；由抗体的Fc区与效应子细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；以及吞噬作用。
如本文所使用的，术语“表位”是指抗体所结合的抗原上的特定的一组原子或氨基酸。如果两种抗体展现出针对抗原的竞争性结合，则其可以结合抗原内的相同或密切相关的表位。例如，如果抗体或抗原结合片段阻断了参考抗体与抗原结合至少85％、或至少90％、或至少95％，则所述抗体或抗原结合片段可以被视为与参考抗体结合相同/密切相关的表位。
如本文所使用的，术语“同源物”和“同源”是可互换的，并且是指在最佳比对时与另一序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)的序列同一性的核酸序列(或其互补链)或氨基酸序列。
如本文所使用的，短语“宿主细胞”是指其中已经引入有外源多核苷酸和/或载体的细胞。
如本文所使用的，术语“人源化”意指抗体或抗原结合片段包含源自非人动物的CDR、源自人的FR区以及当适用时源自人的恒定区。
“分离”的物质已经通过人工由自然状态改变。如果自然界中出现“分离的”组合物或物质，则其已经被改变或脱离其原始环境，或二者均有发生。例如，活体动物体内天然存在的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但如果同一多核苷酸或多肽与其在天然状态下共存的物质充分分离以便以基本上纯的状态存在，则是可以认为是“分离的”。“分离的核酸序列”是指分离的核酸分子的序列。在某些实施方式中，“分离的抗体或其抗原结合片段”是指纯度为至少60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的抗体或抗原结合片段，如通过电泳方法(如SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳)或色谱方法(如离子交换色谱法或反相HPLC)确定的。
“前导肽”是指长度为约5至30个氨基酸的肽，所述肽存在于形成分泌途径的一部分的新合成的蛋白质的N末端。分泌途径的蛋白质包括但不限于驻留在某些细胞器(内质网、高尔基体(Golgi)或核内体)内部、从细胞分泌或插入细胞膜中的蛋白质。在一些实施方式中，前导肽形成蛋白质的跨膜结构域的一部分。
如本文所使用的，“LILRB4”是指源自任何脊椎动物来源的LILRB4，所述脊椎动物来源包括如灵长类动物(例如，人、猴)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)等哺乳动物。人LILRB4的示例性序列包括GenBank SEQ参考编号：NP_001265355、AAH26309、ABM83015、ABM86208、AIC55892。如本文所使用的，术语“LILRB4”旨在涵盖任何形式的人LILRB4，例如，1)天然未加工的LILRB4分子、“全长”LILRB4链或LILRB4的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体；2)由细胞中加工产生的任何形式的LILRB4；或3)通过重组方法产生的LILRB4亚基的全长、片段(例如，截短形式、胞外/跨膜结构域)或经修饰形式(例如，突变形式、糖基化/聚乙二醇化、His-标签/免疫荧光融合形式)。
术语“抗LILRB4抗体”是指能够与LILRB4(例如，人或猴LILRB4)特异性结合的抗体。
如本文所使用的，“LILRB4相关”疾病或病状是指由LILRB4的表达或活性的增加或降低所引起、加剧或以其它方式关联的任何疾病或病状。在一些实施方式中，LILRB4相关病状是免疫相关病症，例如癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染病。
如本文所使用的，术语“连接”是指通过分子内相互作用，例如共价键、金属键和/或离子键或分子间相互作用，例如，氢键或非共价键缔合。
术语“可操作地连接”是指元件布置，其中配置所述组件以执行其常用功能。因此，与多肽可操作地连接的给定信号肽引导从细胞中分泌多肽。在启动子的情况下，与编码序列可操作地连接的启动子将引导编码序列的表达。启动子或其它控制元件不必与编码序列毗连，只要所述启动子或其它控制元件起到引导其表达的作用即可。例如，中间的未翻译但仍被转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，并且仍然可以认为启动子序列与编码序列“可操作地连接”。
关于氨基酸序列(或核酸序列)的“序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列、并且必要时引入空位以实现最大数量的相同氨基酸(或核酸)后，在候选序列中与参考序列中的氨基酸(或核酸)残基相同的氨基酸(或核酸)残基的百分比。氨基酸残基的保守取代可以视为或可以不视为相同残基。可以例如使用公开可用的工具如BLASTN、BLASTp(可在美国国家生物技术信息中心(U.S.National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站上获得，还参见Altschul S.F.等人,《分子生物学杂志》(1990)215:403–410；Stephen F.等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》(1997)25:3389–3402)、ClustalW2(可在欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute)的网站上获得，还参见Higgins D.G.等人,《酶学方法(Methods in Enzymology)》(1996)266:383-402；LarkinM.A.等人,《生物信息学(Bioinformatics)》(2007)23:2947-8)和ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件来实现旨在确定氨基酸(或核酸)序列同一性百分比的比对。本领域的技术人员可以使用由所述工具提供的默认参数或可以根据比对的需要适当定制参数，例如通过选择合适的算法。
术语“多核苷酸”或“核酸”包括单链核苷酸聚合物和双链核苷酸聚合物两者。包含多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸类型的经修饰形式。所述修饰包括碱基修饰，如溴尿嘧啶核苷和肌苷衍生物、核糖修饰，如2',3'-二脱氧核糖，以及核苷酸间键合修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“多肽”或“蛋白质”意指通过肽键相互连接的至少两个氨基酸的链。多肽和蛋白质可以包括除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖基化的)和/或可以以其它方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“多肽”或“蛋白质”可以是由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)或可以是其功能部分。本领域普通技术人员将进一步理解，蛋白质有时可以包括多于一个多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其它方式缔合。所述术语还包括氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是对应天然存在的氨基酸的化学类似物以及聚合物。
术语“药学上可接受的”表示指定的载体、媒剂、稀释剂、赋形剂和/或盐通常与包括调配物的其它成分在化学和/或物理上相容，并且与其接受者在生理上相容。
如本文所使用的，术语“受试者”是指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前形式和出生后形式。在许多实施方式中，受试者是人类。受试者可以是患者，所述患者是指呈现给医疗提供者以进行疾病的诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”可互换地使用。受试者可以患有或易于患上疾病或病症，但是可以展示或可以不展示出疾病或病症的症状。
如本文所使用的，术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗疾病或病状的药物的剂量或浓度。例如，关于本文所公开的单克隆抗体或其抗原结合片段治疗癌症的用途，治疗有效量是能够减少肿瘤体积、根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞向其它器官的浸润、抑制介导癌性病状的细胞的生长或增殖、抑制或减缓肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌性病状相关的任何症状或标志物、防止或延缓肿瘤或癌性病状的发展或其某些组合的单克隆抗体或其抗原结合片段的剂量或浓度。
如本文所使用的，病状的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”包括预防或缓解病状、减缓病状的发作或发展速率、降低罹患病状的风险、预防或延迟与病状相关的症状的发展、减轻或结束与病状相关的症状、产生病状的完全或部分消退、治愈病状或其某种组合。
如本文所使用的，术语“载体”是指可以将编码蛋白质的多核苷酸可操作地插入其中以便引起所述蛋白质的表达的媒剂。载体可以用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传元件在宿主细胞内得以表达。载体的实例包括质粒；噬菌粒；粘粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)；噬菌体，如λ噬菌体或M13噬菌体；和动物病毒。用作载体的动物病毒的类别包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以包括多种用于控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以包括复制起点。载体还可以包括协助其进入细胞的材料，包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包衣。载体可以是表达载体或克隆载体。本公开提供了载体(例如，表达载体)，所述载体含有本文所提供的编码抗体或其抗原结合片段的核酸序列、至少一个与所述核酸序列可操作地连接的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)以及至少一个选择标志物。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
II.抗LILRB4抗体和抗原结合片段
一方面，本公开提供了对LILRB4具有高结合亲和力的抗LILRB4抗体及其抗原结合片段。在一些实施方式中，此类抗体在与LILRB4结合时调节LILRB4的激活。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时抑制LILRB4的激活。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段在与LILRB4结合时可以特异性地干扰、阻断或减少ApoE与LILRB4之间的相互作用。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段能够抑制LILRB4的ApoE介导的活性。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段与人LILRB4特异性或选择性结合。
本文所提供的抗体和抗原结合片段的结合亲和力可以由KD值表示，其表示当抗原与抗原结合分子之间的结合达到平衡时解离速率与缔合速率的比率(koff/kon)。可以使用本领域已知的合适方法(包括例如生物层干涉测量法)适当地测定抗原结合亲和力(例如，KD)。
抗体与人LILRB4的结合也可以由“半最大有效浓度”(EC50)值表示，其是指当观察到抗体最大作用(例如，结合或抑制等)的50％时的抗体浓度。EC50值可以通过本领域中已知的方法来测量，例如夹心测定，如ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术测定和其它结合测定。
特异性抗LILRB4抗体
一方面，本公开提供了包含本文所公开的抗LILRB4抗体的一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)CDR序列的抗LILRB4抗体和其抗原结合片段。已知CDR负责抗原结合，然而，已经发现并非所有6个CDR都是必不可少的或不可改变的。换言之，可以替换或改变或修饰本文所公开的抗LILRB4抗体中的一个或多个CDR，但仍基本上保留对LILRB4的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，LILRB4抗体源自抗体H7K3，所述抗体H7K3具有SEQ ID NO:1所示的重链可变区序列以及SEQ ID NO:3所示的轻链可变区序列。在特定实施方式中，与H7K3相比，抗LILRB4抗体具有增强的稳定性，但仍基本上保留对LILRB4的特异性结合亲和力。
在某些实施方式中，LILRB4抗体具有重链可变区，所述重链可变区包含具有SEQID NO:5所示的氨基酸序列的重链互补决定区(HC-CDR)1、具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HC CDR2和具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HC CDR3。在某些实施方式中，HCCDR3具有带有氨基酸残基W处的突变的SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
在某些实施方式中，LILRB4抗体具有轻链可变区，所述轻链可变区包含具有SEQID NO:8所示的氨基酸序列的轻链互补决定区(LC-CDR)1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LC-CDR3。在某些实施方式中，轻链可变区包含具有带有氨基酸残基NS处的突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LC-CDR3。在某些实施方式中，LC-CDR1具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:20、22、24、26、28、30、32、34。
在某些实施方式中，LILRB4抗体具有如下表1中列出的CDR序列。
表1：抗LILRB4抗体的CDR序列
Figure BDA0003938659030000261
Figure BDA0003938659030000271
下文提供了上述抗LILRB4抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列。
H7(SEQ ID NO:1)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSSYWISWVRQAPGKGLEWIGSIDSGSVGITYYATWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDNWALDLWGQGTLVTVSS
K3(SEQ ID NO:3)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
H7m1(SEQ ID NO:11)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSSYWISWVRQAPGKGLEWIGSIDSGSVGITYYATWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDNVALDLWGQGTLVTVSS
H7m2(SEQ ID NO:13)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSSYWISWVRQAPGKGLEWIGSIDSGSVGITYYATWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDNYALDLWGQGTLVTVSS
H7m3(SEQ ID NO:15)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSSYWISWVRQAPGKGLEWIGSIDSGSVGITYYATWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDNFALDLWGQGTLVTVSS
H7m4(SEQ ID NO:17)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSSSYWISWVRQAPGKGLEWIGSIDSGSVGITYYATWVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGDNQALDLWGQGTLVTVSS
K3m1(SEQ ID NO:19)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIVSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K3m2(SEQ ID NO:21)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIDSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K3m3(SEQ ID NO:23)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIESWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K3m4(SEQ ID NO:25)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIQSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K3m5(SEQ ID NO:27)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K3m6(SEQ ID NO:29)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSITSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K4m7(SEQ ID NO:31)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINQWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
K4m8(SEQ ID NO:33)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSINVWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQHGYIRGDLDNVFGGGTKVEIK
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段包含合适的框架区(FR)序列，只要抗体和其抗原结合片段可以与LILRB4特异性结合即可。表1中所提供的CDR序列可以使用本领域中已知的合适方法(如重组技术)移植到任何合适的物种(如小鼠、人、大鼠、兔等)的任何合适的FR序列。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段是人源化的。人源化抗体或抗原结合片段在其降低人的免疫原性方面是令人期望的。人源化抗体在其可变区中是嵌合的，因为非人CDR序列被移植到人或基本上人FR序列。抗体或抗原结合片段的人源化可以基本上通过用非人(如鼠)CDR基因取代人免疫球蛋白基因中的对应人CDR基因来进行(参见例如，Jones等人,《自然》(1986)321:522-525；Riechmann等人,《自然》(1988)332:323-327；Verhoeyen等人,《科学(Science)》(1988)239:1534-1536)。
可以使用本领域中已知的方法选择合适的人重链和轻链可变结构域以实现此目的。在说明性实施例中，可以使用“最佳拟合”方法，其中针对已知人可变结构域序列的数据库筛选或BLAST非人(例如，啮齿动物)抗体可变结构域序列，并且鉴定最接近非人查询序列的人序列并且将其用作用于移植非人CDR序列的人支架(参见例如，Sims等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》(1993)151:2296；Chothia等人,《分子生物学杂志》(1987)196:901)。可替代地，源自所有人抗体的共有序列的框架可以用于移植非人CDR(参见例如，Carter等人,《美国国家科学院院刊》(1992)89:4285；Presta等人,《免疫学杂志》(1993)151:2623)。
在某些实施方式中，除了非人的CDR序列之外，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段由基本上全人序列构成。在一些实施方式中，可变区FR和恒定区(如果存在的话)完全或基本上来自人免疫球蛋白序列。人FR序列和人恒定区序列可以源自不同的人免疫球蛋白基因，例如FR序列源自一种人抗体并且恒定区源自另一种人抗体。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体和其抗原结合片段包含H7的重链FR序列和/或K3的轻链FR序列。在一些实施方式中，源自人的FR区可以包含与其所源自的人免疫球蛋白相同的氨基酸序列。在一些实施方式中，人FR的一个或多个氨基酸残基被来自亲本非人抗体的对应残基取代。在某些实施方式中，这可能是令人期望的，以使人源化抗体或其片段紧密近似非人亲本抗体结构。在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段在多个人FR序列中的每个人FR序列中包含不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基取代，或者在重链或轻链可变结构域的所有FR中包含不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个氨基酸残基取代。在一些实施方式中，氨基酸残基的此类变化可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或存在于两条链中。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段包含选自下组的重链可变结构域序列：SEQ ID NO:1、11、13、15和17。在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段包含选自下组的轻链可变结构域序列：SEQ ID NO:3、19、21、23、25、27、29、31和33。
在一些实施方式中，本文所提供的抗LILRB4抗体和抗原结合片段包含重链可变结构域的全部或一部分和/或轻链可变结构域的全部或一部分。在一个实施方式中，本文所提供的抗LILRB4抗体和抗原结合片段是由本文所提供的重链可变结构域的全部或一部分组成的单结构域抗体。关于此类单结构域抗体的更多信息可在本领域中获得(参见例如，美国专利号6,248,516)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LILRB4抗体和其片段进一步包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链恒定区和/或轻链恒定区。重链恒定区包含CH1区、铰链区和/或CH2-CH3区。在某些实施方式中，重链恒定区包含Fc区。在某些实施方式中，轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
本文所提供的抗体或其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、经标记的抗体、双价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是使用重组方法在体外制备而非在动物中制备的抗体。
抗体变体
本文所提供的抗体和其抗原结合片段还涵盖其各种变体。在某些实施方式中，抗体和其抗原结合片段涵盖本文所提供的示例性抗体的各种类型的变体。
在某些实施方式中，抗体变体包含如表1中所提供的一个或多个CDR序列、本文所提供的一个或多个可变区序列(但不在任何CDR序列中)和/或恒定区(例如，Fc区)中的一个或多个修饰或取代。此类变体保留其亲本抗体对LILRB4的特异性结合亲和力，但具有由修饰或取代赋予的一种或多种期望性质。例如，抗体变体可以具有改善的抗原结合亲和力、改善的糖基化模式、降低的糖基化风险、减少的脱酰胺化或脱氨基化、改善或增加的效应子功能、减少或耗尽的效应子功能、改善的FcRn受体结合、增加的药代动力学半衰期、pH敏感性和/或与缀合(例如，一个或多个引入的半胱氨酸残基)的相容性。
可以使用本领域已知的方法，例如“丙氨酸扫描诱变”，筛选亲本抗体序列以鉴定合适的或优选的待修饰或取代的残基(参见例如，Cunningham和Wells(1989)《科学》,244:1081-1085)。简而言之，可以鉴定靶残基(例如，带电的残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并由中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代，并且产生经修饰的抗体，并且针对所关注性质对其进行筛选。如果在特定氨基酸位置处的取代表现出所关注功能变化，则所述位置可以被鉴定为进行修饰或取代的潜在残基。可以通过用不同类型的残基(例如，半胱氨酸残基、带正电荷的残基等)取代来进一步评估潜在残基。
亲和力变体
亲和力变体可以包含本文所提供的一个或多个CDR序列、一个或多个FR序列或重链或轻链可变区序列中的修饰或取代。亲和力变体保留了亲本抗体对LILRB4的特异性结合亲和力，或者甚至比亲本抗体具有更高的LILRB4特异性结合亲和力。
可以使用本领域中已知的各种方法来实现此目的。例如，可以产生抗体变体(如Fab或scFv变体)的文库，并用噬菌体展示技术表达，然后对与人LILRB4的结合亲和力进行筛选。再例如，计算机软件可以用于虚拟模拟抗体与人LILRB4的结合，并且鉴定抗体上形成结合界面的氨基酸残基。在取代中可以避开此类残基以防止结合亲和力降低或者可以作为取代的靶标以获得更强的结合。
在某些实施方式中，本文所提供的人源化抗体或抗原结合片段包含一个或多个CDR序列和/或一个或多个FR序列中的一个或多个氨基酸残基取代。在某些实施方式中，亲和力变体包含CDR序列和/或FR序列中总共不超过10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个取代。
在某些实施方式中，抗LILRB4抗体和其抗原结合片段包含1个、2个或3个CDR序列，所述CDR序列与表1中所列出的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，并且同时以相对于其亲本抗体而言类似或甚至更高的水平保留了对LILRB4的结合亲和力。
在某些实施方式中，抗LILRB4抗体和其抗原结合片段包含一个或多个可变区序列，所述一个或多个可变区序列与本文所提供的序列具有至少80％(例如，至少85％、88％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)序列同一性，并且同时以相对于其亲本抗体而言类似或甚至更高的水平保留了对LILRB4的结合亲和力。在一些实施方式中，取代、插入或缺失发生在CDR之外的区中(例如，在FR中)。
糖基化变体
在另一个实施方式中，抗体包含特定的糖基化模式。例如，可以制备去糖基化抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变抗体的糖基化模式，以例如增加抗体对抗原的亲和力或亲合力。此类修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致去除了一个或多个可变区框架糖基化位点，以由此在所述位点处消除糖基化。此类去糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力或亲合力。参见例如，美国专利5,714,350和6,350,861。
还可以制备其中糖基化模式包含低岩藻糖基化或无岩藻糖基化聚糖的抗体，如低岩藻糖基化抗体或无岩藻糖基化抗体在聚糖的岩藻糖基残基量减少。抗体还可以包含具有增加量的二等分GlcNac结构的聚糖。已经证实此类经过改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。此类修饰可以通过例如在宿主细胞中表达抗体来完成，其中糖基化途径被基因工程化以产生具有特定的糖基化模式的糖蛋白。这些细胞已经在本领域中进行了描述，并且可以用作宿主细胞，在所述宿主细胞中表达本发明的重组抗体，以由此产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(α(1,6)-岩藻糖基转移酶)，使得在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705和Ms709 FUT8-/-细胞系是通过使用两种替代载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因而产生的(参见美国专利公开号20040110704)。举例来说，EP 1 176195描述了具有功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，所述基因编码岩藻糖基转移酶，通过减少或消除α-1,6键相关的酶，使得在此类细胞系中所表达的抗体展现出低岩藻糖基化。EP 1176 195还描述了具有将岩藻糖添加到N-乙酰氨基葡萄糖的低酶活性的细胞系，所述N-乙酰氨基葡萄糖与抗体的Fc区结合或不具有酶活性，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCCCRL1662)。PCT公开WO 2003/035835描述了变体CHO细胞系，即Lec13细胞，所述细胞系具有将岩藻糖连接到Asn(297)连接的碳水化合物的降低的能力，也导致在所述宿主细胞中所表达的抗体低岩藻糖基化。如PCT公开WO 06/089231中所描述的，也可以在鸡蛋中产生具有经修饰的糖基化谱的抗体。可替代地，可以在如浮萍属(Lemna)等植物细胞中产生具有经修饰的糖基化谱的抗体(美国专利7,632,983)。在美国专利6,998,267和7,388,081中公开了用于在植物系统中产生抗体的方法。PCT公开WO1999/054342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程化的细胞系中所表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致抗体的ADCC活性增加。当岩藻糖基化在抗体上最小时，低岩藻糖基化也称为无岩藻糖基化。
可替代地，可以使用岩藻糖苷酶将抗体的岩藻糖残基切除，例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体中去除岩藻糖基残基。本文所公开的抗体进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的抗体，具体地真菌宿主细胞，如酵母和丝状真菌，已被基因工程化以产生具有哺乳动物或人样糖基化模式的糖蛋白。与目前使用的哺乳动物细胞系相比，这些经基因修饰的宿主细胞的独特优势是能够控制细胞中产生的糖蛋白的糖基化谱，使得可以产生糖蛋白的组合物，其中特定的N-聚糖结构占主导地位(参见例如，美国专利7,029,872和7,449,308)。这些经基因修饰的宿主细胞已经用于产生主要具有特定的N-聚糖结构的抗体。
另外，由于如酵母或丝状真菌等真菌缺乏产生岩藻糖基化糖蛋白的能力，因此在此类细胞中产生的抗体将缺乏岩藻糖，除非进一步修饰细胞以包括用于产生岩藻糖基化糖蛋白的酶途径(参见例如，PCT公开WO 2008112092)。在特定实施方式中，本文所公开的抗体进一步包括在低等真核宿主细胞中产生的那些抗体，并且所述抗体包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化的杂合和复合N-聚糖，包括二等分和多触角物种，包括但不限于N-聚糖，如GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2；NANA(1-4)Gal(1-4)GlcNAc(1-4)Man3GlcNAc2。在特定实施方式中，本文所提供的抗体组合物可以包含具有至少一种杂合N-聚糖的抗体，所述杂合N-聚糖选自下组：GlcNAcMan5GlcNAc2；GalGlcNAcMan5GlcNAc2和NANAGalGlcNAcMan5GlcNAc2。在特定方面，杂合N-聚糖是组合物中主要的N-聚糖物种。在另外的方面，杂合N-聚糖是特定N-聚糖物种，所述N-聚糖物种在组合物中包含约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的杂合N-聚糖。
在特定实施方式中，本文所提供的抗体组合物包含具有至少一种选自下组的复合N-聚糖的抗体：GlcNAcMan3GlcNAc2；GalGlcNAcMan3GlcNAc2；NANAGalGlcNAcMan3GlcNAc2；GlcNAc2Man3GlcNAc2；GalGlcNAc2Man3GlcNAc2；Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2；NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。在特定方面，复合N-聚糖是组合物中主要的N-聚糖物种。在另外的方面，复合N-聚糖是特定N-聚糖物种，所述N-聚糖物种在组合物中包含约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的复合N-聚糖。在特定实施方式中，N-聚糖是岩藻糖基化的。通常，岩藻糖通过α1,3-键与N-聚糖的还原端处的GlcNAc连接；通过α1,6-键与N-聚糖的还原端处的GlcNAc连接；通过α1,2-键与N-聚糖的非还原端处的Gal连接；通过α1,3-键与N-聚糖的非还原端处的GlcNac连接；或通过α1,4-键与N-聚糖的非还原端处的GlcNAc连接。
因此，在上述糖蛋白组合物的特定方面中，糖型呈α1,3-键或α1,6-键岩藻糖以产生选自下组的糖型：Man5GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan5GlcNAc2(Fuc)、Man3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAcMan3GlcNAc2(Fuc)、GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)、NANAGal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)和NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc)；呈α1,3-键或α1,4-键岩藻糖以产生选自下组的糖型：GlcNAc(Fuc)Man5GlcNAc2、GlcNAc(Fuc)Man3GlcNAc2、GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2、NANAGal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2和NANA2Gal2GlcNAc2(Fuc1-2)Man3GlcNAc2；或呈α1,2-键岩藻糖以产生选自下组的糖型：Gal(Fuc)GlcNAc2Man3GlcNAc2,Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2、NANAGal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2和NANA2Gal2(Fuc1-2)GlcNAc2Man3GlcNAc2。
在另外的方面，抗体包含高甘露糖N-聚糖，包括但不限于Man8GlcNAc2、Man7GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man5GlcNAc2、Man4GlcNAc2，或由Man3GlcNAc2N-聚糖结构组成的N-聚糖。在上述另外的方面，复合N-聚糖进一步包括岩藻糖基化和非岩藻糖基化(或无岩藻糖基化)的二等分和多触角物种。如本文所使用的，术语“N-聚糖”和“糖型”可互换使用并且是指N-连接的寡糖，例如，通过天冬酰胺-N-乙酰氨基葡萄糖键连接到多肽的天冬酰胺残基的寡糖。N-连接的糖蛋白包含与蛋白质中天冬酰胺残基的酰胺氮连接的N-乙酰氨基葡萄糖残基。
本文所提供的抗LILRB4抗体和抗原结合片段还涵盖糖基化变体，可以获得所述糖基化变体以增加或减少所述抗体或抗原结合片段的糖基化程度。
抗体或其抗原结合片段可以包含具有侧链的一个或多个氨基酸残基，碳水化合物部分(例如，寡糖结构)可以连接到所述侧链。抗体的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接是指碳水化合物部分连接到天冬酰胺残基，例如，如天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸等三肽序列中的天冬酰胺残基的侧链，其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸。O连接的糖基化是指将糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一与羟基氨基酸连接，最常见的是与丝氨酸或苏氨酸连接。可以很方便地去除天然糖基化位点，例如通过改变氨基酸序列，使得存在于所述序列中的上述三肽序列(对于N连接的糖基化位点)或者丝氨酸或苏氨酸残基(对于O连接的糖基化位点)中的一者被取代。可以通过引入此类三肽序列或者丝氨酸或苏氨酸残基以类似的方式产生新的糖基化位点。
用缺乏某些负责位点特异性糖基化(包括岩藻糖基化)的酶途径的抗体产生细胞进行一种类型的糖基化修饰。例如，缺乏岩藻糖基化的抗体(称为无岩藻糖基化抗体)通常具有增强的ADCC活性。在无岩藻糖基化H7K3m5的情况下，在25％至50％的经过测试的PBMC供体中观察到通过ADCC杀伤正常单核细胞(图14A-14D和图15C-15D)。另外，如图15A-15B所示，无岩藻糖基化和野生型H7K3m5两者都通过自体ADCC杀伤pDC。同时，取决于供体，单核细胞可以仅用无岩藻糖基化H7K3m5杀伤，而不用野生型H7K3m5杀伤(图15C-15D)。
半胱氨酸工程化变体
本文所提供的抗LILRB4抗体和抗原结合片段还涵盖半胱氨酸工程化变体，所述变体包含一个或多个引入的游离半胱氨酸氨基酸残基。
游离半胱氨酸残基是不属于二硫桥键的半胱氨酸残基。半胱氨酸工程化变体可用于通过例如马来酰亚胺或卤代乙酰基在经工程化的半胱氨酸的位点处与例如细胞毒性化合物和/或成像化合物、标记或放射性同位素等缀合。用于工程化抗体或抗原结合片段以引入游离半胱氨酸残基的方法是本领域已知的，参见例如，WO2006/034488。
Fc变体
本文所公开的抗体还可以被工程化以包含Fc区内的修饰，通常用于改变抗体的一种或多种功能性质，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或效应子功能(例如，抗原依赖性细胞毒性)。此外，本文所公开的抗体可以被化学修饰(例如，一种或多种化学部分可以与抗体连接)或被修饰成改变其糖基化，以再一次改变抗体的一种或多种功能性质。下文进一步详细描述了这些实施方式中的每个实施方式。Fc区中的残基的编号为Kabat的EU索引的编号。本文所公开的抗体还包括具有经修饰的(或阻断的)Fc区以提供经过改变的效应子功能的抗体。参见例如，美国专利5,624,821；WO2003/086310；US2004/0002587；US2005/0152894；US2005/0249723；WO2006/019447。此类修饰可以用于增强或抑制免疫系统的各种反应，可能对诊断和治疗产生有益的影响。Fc区的改变包括氨基酸变化(取代、缺失和插入)、糖基化或去糖基化以及添加多个Fc。Fc的变化还可以改变治疗性抗体中抗体的半衰期，从而实现更低的给药频率，并且因此增加便利性并减少材料的使用。据报道，此突变消除了铰链区中重链间二硫桥的异质性。
在一个实施方式中，对CH1的铰链区进行修饰，使得铰链区中的半胱氨酸残基的数量得到增加或减少。在美国专利5,677,425中进一步描述了这种方法。改变CH1的铰链区中的半胱氨酸残基的数量，以例如促进轻链和重链的组装或以增加或降低抗体的稳定性。在另一个实施方式中，对抗体进行修饰以增加其生物学半衰期。各种方法是可能的。例如，如美国专利6,277,375中所描述的，可以引入以下突变中的一个或多个突变：T252L、T254S、T256F。可替代地，如在美国专利5,869,046和6,121,022中所描述的，为了增加生物学半衰期，可以在CH1或CL区内对抗体进行改变以包括取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。在另一个实施方式中，通过用不同的氨基酸残基替代至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应子功能。例如，选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸残基替代，使得抗体具有针对效应子配体的经过改变的亲和力，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。亲和力被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。在美国专利5,624,821和5,648,260中进一步详细描述了这种方法。
在另一个实施例中，改变氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基，以由此改变抗体固定补体的能力。在PCT公开WO1994/029351中进一步描述了这种方法。在另一个实施例中，通过修饰以下位置处的一个或多个氨基酸来修饰Fc区，以提高或降低抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高或降低抗体对Fcγ受体的亲和力：238、239、243、248、249、252、254、255、256、258、264、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。在PCT公开WO2000/042072中进一步描述了这种方法。此外，已经绘制出人IgG1上针对FcγR1、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点，并且已经描述具有改善的结合的变体。示出了位置256、290、298、333、334和339处的特异性突变以改善与FcγRIII的结合。另外，示出以下组合突变体以改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。
在一个实施方式中，Fc区被修饰以通过修饰残基243和264来降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎性性质。在一个实施方式中，通过将位置243和264处的残基改变为丙氨酸来修饰抗体的Fc区。在一个实施方式中，Fc区被修饰以通过修饰残基243、264、267和328来降低抗体介导效应子功能的能力和/或增加抗炎性性质。
在一个实施方式中，Fc区被修饰以通过将残基234、235和329修饰为丙氨酸或甘氨酸(L234A-L235A-P329G)来消除抗体介导效应子功能的能力。
本文所提供的抗LILRB4抗体和抗原结合片段还涵盖Fc变体，所述Fc变体包含在其Fc区和/或铰链区处的一个或多个氨基酸残基修饰或取代。
在某些实施方式中，抗LILRB4抗体或抗原结合片段包含改善与新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合的一个或多个氨基酸取代。这种变体可以具有延长的药代动力学半衰期，因为所述变体在酸性pH下与FcRn结合，使其得以免于在溶酶体中降解，并且然后被转移并释放到细胞外。工程化抗体和其抗原结合片段以改善与FcRn的结合亲和力的方法是本领域熟知的，参见例如，Vaughn,D.等人,《结构(Structure)》,6(1):63-73,1998；Kontermann,R.等人,《抗体工程化(Antibody Engineering)》,第1卷,第27章:工程化Fc区以改善PK(Engineering of the Fc region for improved PK),由施普林格(Springer)出版,2010年；Yeung,Y.等人,《癌症研究(Cancer Research)》(2010)70:3269-3277；和Hinton,P.等人,《免疫学杂志》(2006)176:346-356。
在某些实施方式中，抗LILRB4抗体或抗原结合片段包含改变抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)的一个或多个氨基酸取代。在Fc区的CH2结构域处的某些氨基酸残基可以被取代以提供增强的ADCC活性。可替代地或另外地，可以改变抗体上的碳水化合物结构以增强ADCC活性。通过抗体工程化改变ADCC活性的方法在本领域已有描述，参见例如，ShieldsRL.等人,《生物化学杂志(J Biol Chem.)》(2001)276(9):6591-604；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志》(2000)164(8):4178-84；Steurer W.等人,《免疫学杂志》(1995)155(3):1165-74；Idusogie EE.等人,《免疫学杂志》(2001)166(4):2571-5；Lazar GA.等人,《美国国家科学院院刊》(2006)103(11):4005-4010；Ryan MC.等人,《分子癌症疗法(Mol.CancerTher.)》(2007)6:3009-3018；Richards JO.等人,《分子癌症疗法》(2008)7(8):2517-27；Shields R.L.等人,《生物化学杂志》,2002,277:26733-26740；Shinkawa T.等人,《生物化学杂志》(2003)278:3466-3473。
在某些实施方式中，抗LILRB4抗体或抗原结合片段包含改变补体依赖性细胞毒性(CDC)的一个或多个氨基酸取代，例如通过改善或减少C1q结合和/或CDC(参见例如，WO99/51642；Duncan和Winter《自然》322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821)；以及关于Fc区变体的其它实例的WO1994/029351。
在某些实施方式中，抗LILRB4抗体或抗原结合片段在Fc区的界面中包含一个或多个氨基酸取代以便于和/或促进异二聚体化。这些修饰包括将突起引入到第一Fc多肽中和将空腔引入到第二Fc多肽中，其中突起可以定位在空腔中以便促进第一和第二Fc多肽的相互作用以形成异二聚体或复合物。例如，如美国专利号5,731,168中所描述的，产生具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的。
抗原结合片段
本文还提供了抗LILRB4抗原结合片段。各种类型的抗原结合片段是本领域已知的并且可以基于本文所提供的抗LILRB4抗体开发，所述抗体包括例如其CDR和可变序列提供在本文中的示例性抗体和其不同变体(如亲和力变体、糖基化变体、Fc变体、半胱氨酸工程化变体等)。
在某些实施方式中，本文所提供的抗LILRB4抗原结合片段是骆驼化单结构域抗体、双功能抗体、单链Fv片段(scFv)、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、ds双功能抗体、纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或二价结构域抗体。
单链可变片段(scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合，通过短(通常是丝氨酸、甘氨酸)连接子连接在一起。尽管去除了恒定区并引入了连接子肽，但这种嵌合分子保留了原始免疫球蛋白的特异性。这种修饰通常使特异性保持不变。这些分子在历史上是为了促进噬菌体展示而产生的，其中将抗原结合结构域表达为单个肽非常方便。可替代地，可以由源自杂交瘤的亚克隆的重链和轻链直接产生scFv。单链可变片段缺乏在完全抗体分子中发现的恒定Fc区，并且因此缺乏用于纯化抗体的共同结合位点(例如，蛋白A/G)。这些片段通常可以使用蛋白L进行纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
柔性连接子通常包含促进螺旋和转角的氨基酸残基，如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。然而，其它残基也可以发挥作用。Tang等人(1996)使用噬菌体展示作为从蛋白质连接子文库中快速选择单链抗体(scFv)定制连接子的一种手段。构建了随机连接子文库，其中重链和轻链可变结构域的基因通过编码可变组合物的18个氨基酸多肽的区段连接。scFv库(大约5×106个不同成员)展示在丝状噬菌体上，并且用半抗原经受亲和力选择。所选变体的群体展现出结合活性的显著增加，但保留了相当大的序列多样性。筛选1054个单独的变体随后产生了催化活性的scFv，所述scFv以可溶形式有效地产生。序列分析揭示了连接子中在VH C末端后的两个残基中的保守脯氨酸以及在其它位置处的大量精氨酸和脯氨酸作为所选系链的唯一共同特征。
本公开的重组抗体还可以涉及允许受体的二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列包括源自IgA的序列，所述序列允许与J链结合形成多聚体。另一个多聚化结构域是Gal4二聚化结构域。在其它实施方式中，可以用如生物素/亲和素等药剂修饰链，所述药剂允许两种抗体的组合。
在单独的实施方式中，可以通过使用非肽连接子或化学单元连接受体轻链和重链来产生单链抗体。通常，轻链和重链将在不同的细胞中产生、纯化，然后以适当的方式连接在一起(即，重链的N末端通过适当的化学桥与轻链的C末端连接)。
交联试剂用于形成连接两种不同分子的官能团的分子桥，例如稳定剂和凝结剂。然而，设想的是，可以产生相同类似物或包括不同类似物的异聚复合物的二聚体或多聚体。为了以逐步的方式连接两种不同的化合物，可以使用异型双官能交联剂来消除不需要的均聚物形成。
示例性异型双官能交联剂包含两个反应性基团：一个反应性基团与伯胺基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺)反应，并且另一个反应性基团与硫醇基团(例如，吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)反应。通过伯胺反应性基团，交联剂可以与一种蛋白质(例如，所选抗体或片段)的赖氨酸残基反应，并且通过硫醇反应性基团，已经与第一蛋白质连接的交联剂与另一种蛋白质(例如，选择剂)的半胱氨酸残基(游离巯基)反应。
优选地使用在血液中具有合理稳定性的交联剂。已知许多类型的含有二硫键的连接子可以成功用于缀合靶向剂和治疗剂/预防剂。包括空间位阻二硫键的连接子可能会在体内提供更大的稳定性，从而防止靶向肽在到达作用位点之前释放。因此，这些连接子是一组连接剂。
另一种交联试剂是SMPT，其是含有被相邻苯环和甲基“空间位阻”的二硫键的双官能交联剂。据信，二硫键的空间位阻起到保护键免受如可以存在于组织和血液中的如谷胱甘肽等硫醇根阴离子攻击的作用，并且由此有助于在将所附药剂递送到靶位点之前防止缀合物的解耦。
与许多其它已知的交联试剂一样，SMPT交联试剂具有交联官能团的能力，如半胱氨酸的SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基)。另一种可能类型的交联剂包括包含可切割二硫键的异型双官能光活性苯基叠氮化物，如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对叠氮基水杨酰氨基)乙基-1,3'-二硫代丙酸酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应，并且苯叠氮化物(在光解时)与任何氨基酸残基非选择性反应。
除了位阻交联剂之外，还可以根据本文使用非位阻连接子。被认为不包括或不产生受保护的二硫化物的其它有用的交联剂包括SATA、SPDP和2-亚氨基硫烷(Wawrzynczak和Thorpe,1987)。此类交联剂的使用在本领域中是众所周知的。另一个实施方式涉及使用柔性连接子。
美国专利4,680,338描述了可用于产生配体与含胺聚合物和/或蛋白质的缀合物的双官能连接子，特别是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物。美国专利5,141,648和5,563,250公开了含有在各种温和条件下可切割的不稳定键的可切割缀合物。此连接子特别有用，因为所关注药剂可以直接与连接子键合，其中切割引起活性剂的释放。特定用途包括将游离氨基或游离巯基添加到蛋白质，如抗体或药物。
美国专利5,856,456提供了用于连接多肽成分以制备融合蛋白(例如单链抗体)的肽连接子。连接子的长度为至多约50个氨基酸，包含至少一次出现的带电荷的氨基酸(优选地，精氨酸或赖氨酸)，随后是脯氨酸，并且特征在于更高的稳定性和减少的聚集。美国专利5,880,270公开了在多种免疫诊断和分离技术中有用的含氨氧基的连接子。
各种技术可以用于产生此类抗原结合片段。说明性方法包括完整抗体的酶消化(参见例如，Morimoto等人,《生化和生物物理方法杂志(Journal of Biochemical andBiophysical Methods)》(1992)24:107-117；以及Brennan等人,《科学》(1985)229:81)、通过如大肠杆菌(E.Coli)等宿主细胞的重组表达(例如，对于Fab、Fv和ScFv抗体片段)、如上文所讨论的从噬菌体展示文库筛选(例如，对于ScFv)以及两个Fab'-SH片段的化学偶联以形成F(ab')2片段(Carter等人,《生物/技术(Bio/Technology)》(1992)10:163-167)。用于产生抗体片段的其它技术对熟练的从业者来说将是显而易见的。
在某些实施方式中，抗原结合片段是scFv。scFv的产生描述于例如WO93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458。scFv可以在氨基端或羧基端与效应子蛋白融合以提供融合蛋白(参见例如，《抗体工程化(Antibody Engineering)》,Borrebaeck编辑)。
双特异性抗体
在某些实施方式中，本文所公开的LILRB4抗体是双特异性抗体。在某些实施方式中，通过接合T细胞或NK细胞上的抗原和癌细胞上的LILRB4两者，将细胞毒性T细胞或NK细胞重定向到癌细胞，从而可以使用LILRB4双特异性抗体来治疗血液系统和实体恶性肿瘤。在一些实施方式中，所述抗LILRB4双特异性抗体针对T细胞受体，如CD3。在一些实施方式中，所述抗LILRB4双特异性抗体针对NK细胞受体，如CD16A。
应当理解，本公开的抗LILRB4双特异性抗体可以具有各种形式和结构，这可以通过图28A和28B中所展示的与LILRB4和CD3(LILRB4/CD3双特异性)特异性结合的双特异性抗体的示例性实施方式来理解。
如图28A中所展示的，在本发明的示例性实施方式中，LILRB4/CD3双特异性抗体为Y形并且包含两个臂。由第一重链多肽和第一轻链多肽的一部分形成的抗体的一个臂包含一对重链可变结构域(VH1)和轻链可变结构域(VL1)，其形成能够与LILRB4特异性结合的抗原结合位点。由第二重链多肽和第二轻链多肽的一部分形成的抗体的另一个臂包含第二对重链可变结构域(VH2)和轻链可变结构域(VL2)。VH2和VL2形成能够与CD3特异性结合的第二抗原结合位点。在此构型中，每种双特异性抗体包含针对LILRB4的单个拷贝的抗原结合位点和针对CD3的单个拷贝的抗原结合位点，其被称为1+1。
参考图28A中的实施方式4-3ab，第一重链多肽从N末端到C末端包含VH1–CH1–CH2–CH3，其中CH1、CH2和CH3是指重链恒定结构域1、2和3；第一轻链多肽从N末端到C末端包含VL1–CL，其中CL是指轻链恒定结构域；第二重链多肽从N末端到C末端包含VH2–TCRβ–CH2–CH3；并且第二轻链多肽从N末端到C末端包含VL2–TCRα。在双特异性抗体中使用TCRα和TCRβ恒定结构域使得轻链和其同源重链能够正确缔合，从而导致针对LILRB4和CD3的期望双特异性抗体的更高产率(参见例如，WO 2019057122A1)。在某些实施方式中，TCRα结构域具有SEQ IDNO:89所示的氨基酸序列，TCRβ结构域具有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列。
可替代地，如图28A中的4ab-3实施方式所展示的，第一重链多肽从N末端到C末端包含VH1–TCRβ–CH2–CH3；第一轻链多肽从N末端到C末端包含VL1–TCRα；第二重链多肽从N末端到C末端包含VH2–CH1–CH2–CH3；并且第二轻链多肽从N末端到C末端包含VL2–CL。
如图28A所展示的，Y形抗体的茎部包含Fc区，所述Fc区由通过二硫键结合在一起的第一重链多肽和第二重链多肽的第二恒定结构域和第三恒定结构域(CH2和CH3)组成。在某些实施方式中，用杵臼结构(KiH)技术工程化Fc区(Ridgway JB等人,《蛋白质工程化(Protein Eng)》(1996)9:617-21；Atwell S等人,《分子生物学杂志》(1997)270:26-35；Merchant等人,《自然生物技术(Nature Biotech)》(1998)16,677-681)，所述技术防止重链多肽的同源二聚化。简而言之，将两个重链多肽的恒定区中的每个恒定区进行突变以产生杵或臼，所述杵或臼配对以促进异二聚化。使用KiH技术设计LILRB4/CD3双特异性抗体使得重链能够异二聚化并且轻链和其同源重链能够正确缔合，从而导致针对LILRB4和CD3的期望双特异性抗体的更高产率。
在某些实施方式中，双特异性抗体的构型包含针对LILRB4的两个拷贝的抗原结合位点和针对CD3的两个拷贝的抗原结合位点。这种构型被称为2+1并且展示于图28A中。在此类构型中，LILRB4/CD3双特异性抗体包含两对重链/轻链多肽，其形成分别与LILRB4和CD3结合的第一抗原结合区和第二抗原结合区。与1+1构型不同，在2+1构型中，一个重链多肽包含与第三轻链多肽中的第三轻可变结构域同源的第三重链可变结构域(VH3)，从而形成与LILRB4结合的第三抗原结合区。
参考图28A中的实施方式44-3ab，在本发明的示例性实施方式中，LILRB4/CD3双特异性抗体(其为Y形并且包含两个臂)包含第一重链多肽、第一轻链多肽、第二重链多肽、第二轻链多肽和第三轻链多肽。第一重链多肽从N末端到C末端包含VH3–CH1–L–VH1–CH1–CH2–CH3，其中L是连接子(例如，(G4S)2)；第一轻链多肽从N末端到C末端包含VL1–CL；第二重链多肽从N末端到C末端包含VH2–TCRβ–CH2–CH3；并且第三轻链多肽从N末端到C末端包含VL2–TCRα；第三轻链多肽从N末端到C末端包含VL3–CL。在抗体的一个臂上，VH1和VL1形成针对LILRB4的第一抗原结合位点，而VH3和VL3形成针对LILRB4的第二抗原结合位点。在抗体的另一个臂上，VH2和VL2形成能够与CD3特异性结合的抗原结合位点。在某些实施方式中，第三轻链多肽VL3–CL可以与第一轻链多肽VL1–CL相同。
参考图28A中的实施方式4ab4ab-3，在本发明的示例性实施方式中，LILRB4/CD3双特异性抗体包含第一重链多肽、第一轻链多肽、第二重链多肽、第二轻链多肽和第三轻链多肽。第一重链多肽从N末端到C末端包含VH3–TCRβ–L–VH1–TCRβ–CH2–CH3，其中L是连接子(例如，(G4S)2)；第一轻链多肽从N末端到C末端包含VL1–TCRα；第二重链多肽从N末端到C末端包含VH2–CH1–CH2–CH3；并且第二轻链多肽从N末端到C末端包含VL2–CL；第三轻链多肽从N末端到C末端包含VL3–TCRα。在抗体的一个臂上，VH1和VL1形成针对LILRB4的第一抗原结合位点，而VH3和VL3形成针对LILRB4的第二抗原结合位点。在抗体的另一个臂上，VH2和VL2形成能够与CD3特异性结合的抗原结合位点。在某些实施方式中，第三轻链多肽VL3–TCRα可以与第一轻链多肽VL1–TCRα相同。
参考图28A中的实施方式43ab-4，在本发明的示例性实施方式中，LILRB4/CD3双特异性抗体包含第一重链多肽、第一轻链多肽、第二重链多肽、第二轻链多肽和第三轻链多肽。第一重链多肽从N末端到C末端包含VH3–CH1–L–VH2–TCRβ–CH2–CH3，其中L是连接子(例如，(G4S)2)；第一轻链多肽从N末端到C末端包含VL2–TCRα；第二重链多肽从N末端到C末端包含VH1–CH1–CH2–CH3；并且第二轻链多肽从N末端到C末端包含VL1–CL；第三轻链多肽从N末端到C末端包含VL3–CL。在抗体的一个臂上，VH1和VL1形成针对LILRB4的第一抗原结合位点。在抗体的另一个臂上，VH3和VL3形成针对LILRB4的第二抗原结合位点，而VH2和VL2形成能够与CD3特异性结合的抗原结合位点。在某些实施方式中，第三轻链多肽VL3–CL可以与第一轻链多肽VL1–CL相同。
参考图28A中的实施方式4ab3-4ab，在本发明的示例性实施方式中，LILRB4/CD3双特异性抗体包含第一重链多肽、第一轻链多肽、第二重链多肽、第二轻链多肽和第三轻链多肽。第一重链多肽从N末端到C末端包含VH3–TCRβ–L–VH2–CH1–CH2–CH3，其中L是连接子(例如，(G4S)2)；第一轻链多肽从N末端到C末端包含VL2–CL；第二重链多肽从N末端到C末端包含VH1–TCRβ–CH2–CH3；并且第二轻链多肽从N末端到C末端包含VL1–TCRα；第三轻链多肽从N末端到C末端包含VL3–TCRα。在抗体的一个臂上，VH1和VL1形成针对LILRB4的第一抗原结合位点。在抗体的另一个臂上，VH3和VL3形成针对LILRB4的第二抗原结合位点，而VH2和VL2形成针对CD3的抗原结合位点。在某些实施方式中，第三轻链多肽VL3–TCRα可以与第一轻链多肽VL1–TCRα相同。
在某些实施方式中，基于本领域已知的抗CD3抗体产生针对CD3的抗原结合位点，例如WO 2019057099中描述的抗CD3抗体、SP34(Pessano等人《欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》(1985)4,337-334)、OKT3(Ortho,Raritan,NJ；Van Wauwe等人,《免疫学杂志》(1984)133,129-32)、M291(加利福尼亚州弗里蒙特的蛋白质设计实验室(Protein DesignLaboratories,Fremont,CA))、BC3(华盛顿州西雅图的弗雷德哈钦森癌症研究中心(FredHutchinson Cancer Research Center,Seattle,WA))、TR66(科罗拉多州森特尼尔的诺伟思生物制品公司(Novus Biologicals,Centennial,CO))和BMA030(Walker C等人,《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol.)》(1907)17:1611-8)。
在某些实施方式中，LILRB4/CD3双特异性抗体可以被工程化以改进同质性和可制造性。在一些实施方式中，如图28B所展示的，TCRα可以在SEQ ID NO:89的S91A处进行突变以去除O-聚糖修饰位点。在一些实施方式中，Q1E突变可以在重链或轻多肽的N末端处进行，以防止N末端pyro-Q形成。
在某些实施方式中，抗LILRB4双特异性抗体可以以许多其它方式来构建，如Konterman等人2017,9 182-212所综述的。具体地，抗LILRB4双特异性抗体可以构建为共价抗体缀合物、不对称F(ab')2、CovX体、小鼠/大鼠嵌合IgG、具有共同重链的κλ体、串联单链可变结构域(scFv)、BiTE、三抗体、双功能抗体、串联结构域抗体、与CH1/CL结构域的scFv融合体、Fab-scFv双功能抗体或三功能抗体、Fab-Fv融合体、Fab-单结构域抗体(sdAb)/VHH融合体、正交Fab-Fab、scFv2-白蛋白/毒素融合体、单链双功能抗体-白蛋白/毒素融合体、串联scFv白蛋白/毒素融合体、对接锁定(dock-and-lock，DNL)Fab3、DNL-Fab2-scFv、DNL-Fab-IgG融合体、ImmTAC TCR-scFv融合体、具有不同重链和不同或共同轻链的IgG、与重链或轻链N末端或C末端的IgG-scFv融合体、与重链或轻链N末端或C末端的IgG单链Fab(scFab)融合体、具有scFv融合体的单链IgG(scIgG)、双可变结构域(DVD)双特异性抗体、不对称scFv-Fc、串联-scFv-Fc融合体、具有或不具有Fc融合的双亲和力重靶向抗体(DART)、不对称Fab-scFv-Fc融合体、scFv-CH3融合体、TriFab、IgG串联scFv融合体、IgG-crossFab融合体、具有正交Fab的串联Fab-IgG融合体、双功能抗体-Fc融合体、单链双功能抗体Fc融合体、Fab-scFv-Fc融合体、scFv4-Fc融合体、scFv2-Fcab、双-双功能抗体、单链双功能抗体CH3融合体、IgE/M CH2融合体、F(ab')2融合体、CH1/CK融合体、二合一双作用Fab(DAF)或DutaMab、DNL-Fab2-IgG融合体。
包含Fc结构域的双特异性抗体的重链的异二聚化可以通过许多方式来完成，所述方式包括但不限于杵臼(Ridgway等人《蛋白质工程设计和选择(PEDS)》1996；Atwell等人《分子生物学杂志》1997；Merchant等人《自然生物技术》1998)、HA-TF突变(Moore等人《单克隆抗体(Mabs)》2011)、ZW1(Von Kreudenstein等人《单克隆抗体》2013)、CH3电荷对(Gunasekaran等人《生物化学杂志》2010)、IgG1铰链/CH3电荷对(Strop等人《分子生物学杂志》2012)、IgG2铰链/CH3电荷对(Strop等人《分子生物学杂志》2012)、具有或不具有经工程化的二硫化物的EW-RVT突变(Choi等人《分子癌症疗法》2013；Choi等人《分子免疫学(MolImmunol)2015)、双克隆(Geuijen等人《临床肿瘤学杂志(J Clinical Onc)》2014)、DuoBody(Labrijn等人《美国国家科学院院刊》2013)、SEEDbody IgG/A嵌合体(David等人《蛋白质工程设计和选择(Protein Eng Des Sel)》2010)、BEAT(Moretti等人《BMC会议录(BMCProceedings)》2013)、7.8.60或29.8.34(Leaver-Fey等人《结构(Structure)》2016)。不同轻链的正确配对可以通过各种方法来完成，所述方法包括但不限于CrossMab(Schaefer等人,《癌症细胞(Cancer Cell)》2011)、正交Fab(Lewis等人《自然生物技术》2014)、T细胞受体融合(Wu等人《单克隆抗体》2015)、CR3(Golay等人《免疫学杂志》2016)、MUT4(Golay等人《免疫学杂志》2016)、DuetMab(Mazor等人《单克隆抗体》2015,7,377-89；Mazor等人《单克隆抗体》2015,7,461-669)。
在某些实施方式中，双特异性抗体可以靶向LILRB4和另一个靶标，所述靶标包括但不限于CD3、CD2、CD16a、NKp46、CD137、OX40、PD-1、PD-L1、CD40、CTLA4、LAG3、TIM3、CD47。
缀合物
在一些实施方式中，抗LILRB4抗体和其抗原结合片段进一步包含缀合物部分。缀合物部分可以与抗体和其抗原结合片段连接。缀合物部分是可以与抗体或其抗原结合片段连接的蛋白质或非蛋白质部分。设想的是，多种缀合物部分可以与本文所提供的抗体或抗原结合片段连接(参见例如，“缀合物疫苗(Conjugate Vaccines)”,《对微生物学和免疫学的贡献(Contributions to Microbiology and Immunology)》,J.M.Cruse和R.E.Lewis,Jr.(编辑),纽约卡格出版社(Carger Press,New York),(1989))。这些缀合物部分可以通过共价结合、亲和力结合、嵌入、配位结合、复合、缔合、共混或添加以及其它方法与抗体或抗原结合片段连接。
在某些实施方式中，本文所公开的抗体和抗原结合片段可以被工程化以包含表位结合部分之外的可以用于与一个或多个缀合物部分结合的特异性位点。例如，此类位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基(例如半胱氨酸或组氨酸残基)，以促进与缀合物部分的共价连接。
在某些实施方式中，抗体可以间接地或通过另一缀合物部分与缀合物部分连接。例如，抗体或抗原结合片段可以与生物素缀合，然后与和亲和素缀合的第二缀合物间接缀合。缀合物可以是清除调节剂、毒素(例如，化疗剂)、可检测标记(例如，放射性同位素、镧系元素、发光标记、荧光标记或酶底物标记)或纯化部分。
“毒素”可以是对细胞有害或可以损伤或杀伤细胞的任何药剂。毒素的实例包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、一甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)、一甲基澳瑞他汀F(monomethyl auristatin F，MMAF)、美登素(mertansine)、曲妥珠单抗(emtansine)、DM1、美登素DM1、长春碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素、二羧基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)、嘌呤霉素(puromycin)和其类似物、抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲霉素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如，柔红霉素(以前的道诺霉素(daunomycin)和多柔比星)、抗生素(例如，更生霉素(dactinomycin)(以前的放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、光神霉素和氨茴霉素(anthramycin)(AMC))、抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)、拓扑异构酶抑制剂和微管蛋白结合剂。
可检测标记的实例可以包括荧光标记(例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻赤素或德克萨斯红)、酶底物标记(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶或β-D-半乳糖苷酶)、放射性同位素(例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其它镧系元素)、发光标记、发色团部分、地高辛、生物素/亲和素、DNA分子或金以供检测。
在某些实施方式中，缀合物部分可以是帮助增加抗体的半衰期的清除调节剂。说明性实例包括水溶性聚合物，如PEG、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇/丙二醇的共聚物等。聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化的或未支化的。与抗体连接的聚合物的数量可以变化，并且如果连接多于一种聚合物，则所述聚合物可以是相同或不同的分子。
在某些实施方式中，缀合物部分可以是纯化部分，如磁珠。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和其抗原结合片段用作缀合物的基底。
多核苷酸和重组方法
本公开提供了编码抗LILRB4抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，分离的多核苷酸包含如SEQ ID NO:2、4和35所示的一个或多个核苷酸序列，所述一个或多个核苷酸序列编码本文所提供的示例性抗体的可变区。编码单克隆抗体的DNA可使用常规程序(例如，通过使用能够与编码抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。编码DNA也可以通过合成方法获得。
可以使用本领域已知的重组技术将编码抗LILRB4抗体和抗原结合片段的分离的多核苷酸插入到载体中用于进一步克隆(DNA的扩增)或表达。许多载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下中的一者或多者：信号序列、复制起点、一种或多种标志物基因、增强子因子、启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和转录终止序列。
本公开提供了包含本文所提供的编码抗体或抗原结合片段的核酸序列、至少一个与核酸序列可操作地连接的启动子(例如，SV40、CMV、EF-1α)和至少一个选择标志物的载体(例如，表达载体)。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳多空病毒(例如，SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR 2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
包含编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸序列的载体可以被引入到宿主细胞中用于克隆或基因表达。用于克隆或表达本文中的载体中的DNA的合适的宿主细胞是上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。用于此目的的合适的原核细胞包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(例如，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans))和志贺氏菌属(Shigella)以及芽孢杆菌属(Bacilli)，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)以及链霉菌属(Streptomyces)。
除了原核细胞之外，如丝状真菌或酵母等真核微生物也是编码抗LILRB4抗体的载体的合适的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是低等真核宿主微生物中最常用的。然而，许多其它属、物种和菌株都比较常用且在本文中适用，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母菌属宿主(Kluyveromyceshost)，例如，乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、魏氏克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、克鲁雄酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)(EP 183,070)；假丝酵母(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，例如，脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)和曲霉菌(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。
用于表达此处所提供的糖基化抗体或抗原片段的合适的宿主细胞源自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定多种杆状病毒株和变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞，所述许可性昆虫宿主细胞来自于如以下等宿主：草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及斑蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体以及家蚕NPV的Bm-5菌株，并且此类病毒都可以根据本发明用作本文的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物也可以用作宿主。
然而，最关注的是脊椎动物细胞，并且脊椎动物细胞在培养物(组织培养物)中的繁殖已成为常规程序。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是由SV40(COS-7、ATCC CRL1651)转化的猴肾CV1系；人胚胎肾系(293细胞或针对悬浮培养物中的生长亚克隆的293细胞，Graham等人,《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》(1977)36:59)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，CHO细胞缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性，CHO-DHFR(Urlaub等人,《美国国家科学院院刊》(1980)77:4216)；小鼠塞托利细胞(TM4，Mather，《生殖生物学(Biol.Reprod.)》(1980)23:243-251)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,《纽约科学院年报(Annals N.Y.Acad.Sci.)》(1982)383:44-68)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是293F细胞。
用上述用于抗LILRB4抗体产生的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将所述宿主细胞在常规营养培养基中培养，所述常规营养培养基被改性成适于诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因。在另一个实施方式中，抗体可以通过本领域已知的同源重组产生。
用于产生本文所提供的抗体或抗原结合片段的宿主细胞可以在各种培养基中培养。可商购获得的培养基如Ham's F10(西格玛公司(Sigma))、最低必需培养基(MinimalEssential Medium，MEM)(西格玛公司)、RPMI-1640(西格玛公司)和杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)(西格玛公司)适用于培养宿主细胞。另外，在以下文献中描述的培养基中的任何培养基都可以用作宿主细胞的培养基：Ham等人,《酶学方法(Meth.Enz.)》58:44(1979)；Barnes等人,《分析生物化学(Anal.Biochem.)》(1980)102:255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国再颁专利30,985。这些培养基中的任何培养基都可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物)和葡萄糖或等效能量源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充物。培养条件(如温度、pH等)是先前与所选的用于表达的宿主细胞一起使用的条件，并且对于普通技术人员而言将是显而易见的。
当使用重组技术时，抗体可以在胞内、周质间隙中产生，或者直接分泌到培养基中。如果在胞内产生抗体，那么作为第一步骤，可以例如通过离心或超滤来去除宿主细胞或溶解的片段的微粒状碎片。Carter等人,《生物/技术》(1992)10:163-167描述了用于分离分泌到大肠杆菌的周质空间的抗体的程序。简而言之，将细胞糊剂在存在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的情况下经约30分钟解冻。细胞碎片可以通过离心去除。当抗体被分泌到培养基中时，通常首先使用可商购获得的蛋白质浓缩过滤器(例如，Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)对来自此类表达系统的上清液进行浓缩。如PMSF等蛋白酶抑制剂可以包括在上述步骤中的任何步骤中以抑制蛋白水解，并且可以包括抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的抗LILRB4抗体和其抗原结合片段可以使用例如羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱法、硫酸铵沉淀、盐析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是优选的纯化技术。
在某些实施方式中，固定在固相上的蛋白A用于抗体和其抗原结合片段的免疫亲和纯化。蛋白A是否合适作为亲和配体取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同型。蛋白A可以用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等人,《免疫学方法杂志》(1983)62:1-13)。蛋白G被推荐用于所有小鼠同型并用于人γ3(Guss等人,《欧洲分子生物学组织杂志》(1986)5:1567-75)。亲和配体附着的基体最常为琼脂糖，但其它基体也是可用的。与使用琼脂糖可以实现的流速和处理时间相比，机械上稳定的基体(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允许更快的流速和更短的处理时间。当抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(新泽西州菲利普斯堡的马林克罗特贝克有限公司(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于纯化。根据待回收的抗体，用于蛋白质纯化的其它技术也是可用的，如在离子交换柱上进行分级、乙醇沉淀、反相HPLC、在二氧化硅上进行色谱法、在肝素SEPHAROSETM上进行色谱法、在阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上进行色谱法、色谱聚焦、SDS-PAGE以及硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以使用pH介于约2.5至4.5之间的洗脱缓冲液使包括所关注抗体和污染物的混合物经受低pH疏水相互作用色谱法，优选地在低盐浓度(例如，约0至0.25M盐)下进行。
纯化
在某些实施方式中，本公开的抗体可以是经纯化的。如本文所使用的，术语“经纯化”旨在指代可从其它组分中分离的组合物，其中蛋白质相对于其天然可获得状态被纯化到任何程度。因此，经纯化的蛋白也指一种蛋白质，所述蛋白质不受其可能天然存在的环境的影响。当使用术语“基本上纯化的”时，此名称将指代一种组合物，其中蛋白质或肽形成所述组合物的主要组分，如构成所述组合物中约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％或更多的蛋白质。
蛋白质纯化技术是本领域技术人员熟知的。这些技术在一个水平上涉及将细胞环境粗分级为多肽和非多肽部分。将多肽与其它蛋白质分离后，可以使用色谱和电泳技术进一步纯化所关注多肽以实现部分或完全纯化(或纯化至均质)。特别适合制备纯肽的分析方法是离子交换色谱法、排阻色谱法；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。用于蛋白质纯化的其它方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性沉淀，随后离心；凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱法；以及此类和其它技术的组合。
在纯化本公开的抗体时，可能需要在原核或真核表达系统中表达多肽并使用变性条件提取蛋白质。可以使用与多肽的标记部分结合的亲和柱从其它细胞组分中纯化多肽。如本领域通常已知的，据信可以改变各种纯化步骤的顺序，或者可以省略某些步骤，并且仍然产生用于制备基本上纯化的蛋白质或肽的合适方法。
通常，使用与抗体的Fc部分结合的药剂(即，蛋白A)对完整抗体进行分级。可替代地，抗原可以用于同时纯化和选择适当的抗体。此类方法通常利用与载体结合的选择剂，所述载体如柱、过滤器或珠。抗体与载体结合，去除污染物(例如，洗掉)，并且通过施加条件(盐、热等)释放抗体。
鉴于本公开内容，本领域技术人员了解用于对蛋白质或肽的纯化程度进行定量的各种方法。这些方法包括例如确定活性级分的比活性或通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的数量。用于评估级分纯度的另一种方法是计算级分的比活性，以将所述比活性与初始提取物的比活性进行比较，并且因此计算纯度。当然，用于表示活性量的实际单位将取决于选择用于纯化之后的特定测定技术以及所表达的蛋白质或肽是否展现出可检测活性。
已知多肽的迁移可以随着SDS/PAGE的不同条件而变化，有时变化是显著变化(Capaldi等人,1977)。因此，应当理解，在不同的电泳条件下，经纯化或经部分纯化的表达产物的表观分子量可能有所不同。
III.药物组合物
本公开进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含抗LILRB4抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药学上可接受的载体。
用于本文所公开的药物组合物的药学上可接受的载体可以包括例如药学上可接受的液体、凝胶或固相载体、水性媒剂、非水性媒剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲液、抗氧化剂、麻醉剂、悬浮剂/分配剂、多价螯合剂或螯合剂、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质、本领域已知的其它组分或其各种组合。
合适的组分可以包括例如抗氧化剂、填料、粘结剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂，如糖和环糊精。合适的抗氧化剂可以包括例如甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基苯甲醚(butylated hydroxanisol)、丁基化羟基甲苯(butylated hydroxytoluene)和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在包含如本文所提供的抗体或抗原结合片段和缀合物的组合物中包括一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂降低了抗体或抗原结合片段的氧化。这种氧化的降低防止或减少结合亲和力的丧失，由此提高抗体稳定性并使保质期最大化。因此，在某些实施方式中，提供了包含如本文公开的一种或多种抗体或抗原结合片段和一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂的组合物。进一步提供了用于通过将抗体或抗原结合片段与一种或多种如甲硫氨酸等抗氧化剂混合来防止如本文所提供的抗体或抗原结合片段的氧化、延长保质期和/或改善功效的方法。
为了进一步说明，药学上可接受的载体可以包括例如：水性媒剂，如氯化钠注射液、林格氏注射液(Ringer's injection)、等渗右旋糖注射液、无菌水注射液或右旋糖和乳酸林格氏注射液；非水性媒剂，如植物来源的固定油、棉籽油、玉米油、芝麻油或花生油；细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗微生物剂；等渗剂，如氯化钠或右旋糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(吐温80)；多价螯合剂或螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)；乙醇；聚乙二醇；丙二醇；氢氧化钠；盐酸；柠檬酸或乳酸。可以将用作载体的抗微生物剂添加到多剂量容器中的药物组合物中，所述抗微生物剂包括苯酚或甲酚、汞剂、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。合适的赋形剂可以包括例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。合适的无毒辅助物质可以包括例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂或如乙酸钠、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸盐或环糊精等药剂。
药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳液、丸剂、胶囊、片剂、缓释调配物或粉末。口服调配物可以包含标准载体，如医药级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
在某些实施方式中，将药物组合物调配成可注射组合物。可注射药物组合物可以以任何常规形式制备，所述常规形式例如液体溶液、悬浮液、乳液或适用于产生液体溶液、悬浮液或乳液的固体形式。注射制剂可以包括准备注射的无菌和/或无热原溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品，如冻干粉末，包括皮下注射片剂、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用之前与媒剂组合的无菌干燥不溶性产品以及无菌和/或无热原乳液。溶液可以是水性的或非水性的。
在某些实施方式中，单位剂量肠胃外制剂被包装在安瓿、小瓶或带有针头的注射器中。正如本领域已知和实践的一样，所有用于肠胃外施用的制剂都应该是无菌且无热原的。
在某些实施方式中，无菌冻干粉末通过将如本文所公开的抗体或抗原结合片段溶解在合适的溶剂中来制备。所述溶剂可以包含赋形剂，所述赋形剂改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其它药理学组分。可以使用的赋形剂包括但不限于水、右旋糖、山梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其它合适的药剂。在一个实施方式中，溶剂可以包括约中性pH的缓冲液，如柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾或本领域技术人员已知的其它此类缓冲液。随后对溶液进行无菌过滤、随后在本领域技术人员已知的标准条件下冻干提供了令人期望的调配物。在一个实施方式中，将所得溶液分配到小瓶中以供冻干。每个小瓶可以含有单剂量或多剂量的抗LILRB4抗体或其抗原结合片段或其组合物。以高于一定剂量或一组剂量所需的量的少量(例如，约10％)过填充小瓶是可接受的，以便于进行准确的样品取出和准确的给药。可以在适当的条件下(如在约4℃到室温下)储存冻干粉末。
用注射用水重构冻干粉末提供了用于在肠胃外施用时使用的调配物。在一个实施方式中，为了重构，将无菌和/或无热原水或其它合适的液体载体添加到冻干粉末中。精确的量取决于所给予的所选疗法并且可以根据经验确定。
IV.抗LILRB4抗体的使用方法
本公开还提供了治疗方法，所述治疗方法包括：向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文所提供的抗体或抗原结合片段，由此治疗或预防LILRB4相关病状或病症。在一些实施方式中，LILRB4相关病状或病症是癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病或传染病。
癌症的实例通常可以分类为实体瘤和血液系统恶性肿瘤。实体瘤包括但不限于非小细胞肺癌(鳞状/非鳞状)、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌(包括基底乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌(lobular breast carcinoma))、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、蕈样肉芽肿病(mycoses fungoide)、默克尔细胞癌、肝细胞癌(HCC)、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤/滑膜肉瘤、间皮瘤、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、甲状腺乳头状癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、威尔姆氏肿瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、肥大细胞衍生的肿瘤、EBV阳性和阴性PTLD、鼻咽癌、脊髓轴肿瘤(spinalaxis tumor)、脑干胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤(craniopharyogioma)、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
实体瘤的特征在于多种生物学标志，包括维持增殖信号传导、逃避生长抑制剂、抵抗细胞死亡、实现复制永生性、诱导血管生成、激活侵入和转移、肿瘤促进性炎症、避免免疫破坏、基因组不稳定性和突变以及解除细胞能量学的调节。治疗努力已经从靶向快速分裂细胞的细胞毒性化疗发展到抑制选择信号传导通路的小分子，又发展到靶向表面蛋白的单克隆抗体。最近，癌症免疫疗法再增强内源免疫力或利用合成免疫的细胞疗法的概念已经显示出前景。尽管取得了这些进展，但大多数患有晚期实体瘤的患者仍无法长期存活。如抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1等免疫检查点抑制剂的使用已经在少数患者中导致长期无进展和总存活率。
需要靶向免疫生物学的不同方面和不同肿瘤浸润细胞的更新的免疫疗法方法来改善结果，如靶向LILRB4作为在髓样细胞亚群(包括髓源性抑制细胞(MDSC))上表达的抑制性受体的方法。这些髓样细胞在功能上被描述为髓源性抑制细胞，因为所述髓样细胞的免疫抑制/抗炎表型可以抑制肿瘤抗原特异性T细胞的激活、增殖和细胞毒性活性。
在一些实施方式中，耗尽MDSC可以恢复对用于实体瘤治疗的肿瘤抗原特异性T细胞的抑制作用。
在一些实施方式中，阻断髓样细胞上的LILRB4还可以解除其对抗原呈递细胞(APC)的抑制作用，包括表达LILRB4的树突状细胞或髓样白血病细胞。可以通过某些细胞因子产生的APC观察到抗原呈递活性增加，并且可能引起T细胞激活、细胞毒性和T细胞细胞因子产生。
血液系统恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞性/成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、B细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、经典霍奇金淋巴瘤(CHL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、毛细胞白血病、重链病、HHV8相关原发性渗出性淋巴瘤、淋巴恶性肿瘤(lymphoid malignancy)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓发育不良、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金氏淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、前体B急性淋巴细胞性白血病(前体B ALL)、原发性CNS淋巴瘤、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞/组织细胞的B细胞淋巴瘤、骨髓增殖性赘生物和华氏巨球蛋白血症。
自身免疫性疾病或炎性疾病包括但不限于获得性免疫缺陷综合征(AIDS，其是具有自身免疫性组分的病毒性疾病)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、CREST综合征、克罗恩氏病、德戈斯氏病、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯提耳氏病)、幼年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬化症(PSS)、全身性硬化症(SS)、舍格伦综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、科恩氏病、肠粘膜炎症、与结肠炎相关的消耗性疾病、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病、阿尔茨海默氏病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病、呼吸机诱导的肺损伤、病毒感染、自身免疫性糖尿病等。炎性病症包括例如慢性和急性炎性病症。
传染病包括但不限于真菌感染、寄生虫/原生动物感染或慢性病毒感染，例如，疟疾、粗球孢子菌病(coccidioiodmycosis immitis)、组织胞浆菌病(histoplasmosis)、甲真菌病(onychomycosis)、曲霉菌病(aspergillosis)、芽生菌病(blastomycosis)、白色念珠菌病(candidiasis albicans)、副球孢子菌病(paracoccidiodomycosis)、微孢子虫病(microsporidiosis)、棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba keratitis)、阿米巴病(Amoebiasis)、蛔虫病(Ascariasis)、巴贝斯虫病(Babesiosis)、小袋虫病(Balantidiasis)、浣熊贝蛔虫病(Baylisascariasis)、南美锥虫病(Chagas disease)、华支睾吸虫病(Clonorchiasis)、锥蝇属(Cochliomyia)、隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)、裂头绦虫病(Diphyllobothriasis)、麦地那龙线虫病(Dracunculiasis)、包虫病(Echinococcosis)、象皮病(Elephantiasis)、蛲虫病(Enterobiasis)、肝片吸虫病(Fascioliasis)、姜片虫病(Fasciolopsiasis)、丝虫病(Filariasis)、贾第虫病(Giardiasis)、颚口线虫病(Gnathostomiasis)、膜壳绦虫病(Hymenolepiasis)、等孢球虫病(Isosporiasis)、片山热(Katayama fever)、利什曼病(Leishmaniasis)、莱姆病(Lymedisease)、后殖吸虫病(Metagonimiasis)、蝇蛆病(Myiasis)、盘尾丝虫病(Onchocerciasis)、虱病(Pediculosis)、疥疮(Scabies)、血吸虫病(Schistosomiasis)、昏睡病(Sleeping sickness)、类圆线虫病(Strongyloidiasis)、绦虫病(Taeniasis)、弓蛔虫病(Toxocariasis)、弓形体病(Toxoplasmosis)、旋毛虫病(Trichinosis)、鞭虫病(Trichuriasis)、锥虫病(Trypanosomiasis)、蠕虫感染(helminth infection)、乙型肝炎(HBV)感染、丙型肝炎(HCV)感染、疱疹病毒感染、艾普斯登-巴尔病毒(Epstein-Barrvirus)感染、HIV感染、巨细胞病毒感染、单纯疱疹病毒I型感染、单纯疱疹病毒II型感染、人乳头状瘤病毒感染、腺病毒感染、人类免疫缺陷病毒I、人类免疫缺陷病毒II、卡波西西肉瘤相关疱疹病毒流行病感染、细环病毒(转矩特诺病毒(Torquetenovirus))感染、人T嗜淋巴细胞病毒I感染、人T嗜淋巴细胞病毒II感染、水痘带状疱疹病毒感染、JC病毒感染或BK病毒感染。
如本文所提供的抗体或抗原结合片段的治疗有效量将取决于本领域已知的各种因素，例如受试者的体重、年龄、既往病史、目前的药物治疗、受试者的健康状况和交叉反应的潜力、过敏、敏感性和不良副作用以及施用途径和疾病发展的程度。如由这些和其它情况或要求所指示的，本领域的普通技术人员(例如，医师或兽医)可以按比例减少或增加剂量。
在某些实施方式中，如本文所提供的抗体或抗原结合片段可以以约0.0001mg/kg至约100mg/kg的治疗有效量施用。在这些实施方式中的某些实施方式中，抗体或抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量施用，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，剂量为10mg/kg或更少、5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.1mg/kg或更少。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中根据受试者的反应而变化。
可以调整剂量方案以提供最佳的期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单剂量，或可以随时间推移施用若干分次剂量。
本文所公开的抗体和抗原结合片段可以通过本领域已知的任何途径施用，例如，肠胃外(例如，皮下、腹膜内、静脉内，包括静脉内输注、肌内或皮内注射)或非肠胃外(例如，口服、鼻内、眼内、舌下、直肠或局部)途径。
在一些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段可以单独施用或与一种或多种另外的治疗手段或药剂组合施用。例如，本文所公开的抗体或抗原结合片段可以与另一种治疗剂，例如化疗剂或抗癌药物组合施用。
在这些实施方式中的某些实施方式中，与一种或多种另外的治疗剂组合施用的如本文所公开的抗体或抗原结合片段可以与所述一种或多种另外的治疗剂同时施用，并且在这些实施方式中的某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段和所述另外的治疗剂可以作为同一药物组合物的一部分施用。然而，与另一种治疗剂“组合”施用的抗体或抗原结合片段不必与所述药剂同时施用或不必与所述药剂在同一组合物中施用。在另一种药剂之前或之后施用的抗体或抗原结合片段被认为与所述药剂“组合”施用，如本文中所使用的短语，即使所述抗体或抗原结合片段和第二药剂通过不同途径施用也是如此。在可能的情况下，与本文所公开的抗体或抗原结合片段组合施用的另外的治疗剂根据另外的治疗剂的产品信息表中列出的时间表或根据处方医生数字参考手册(Prescriber's DigitalReference)(仅在pdr.net网上可得)或本领域熟知的方案施用。
设想用于与本公开的抗体的组合疗法的特定药剂包括化疗。化疗可以包括阿糖胞苷(ara-C)和蒽环霉素(最常见的是柔红霉素)、单独的高剂量阿糖孢苷、除了诱导化疗之外的全反式视黄酸(ATRA)，通常是在巩固疗法完成后的蒽环霉素、组胺二盐酸盐(Ceplene)和白介素2(Proleukin)、不适合进行高剂量化疗的候选者的60岁以上患有复发性AML的患者的吉妥单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)(麦罗塔(Mylotarg))、氯法拉滨以及靶向疗法，如激酶抑制剂、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨和MDR1(多药耐药蛋白)的抑制剂或三氧化二砷或复发性急性早幼粒细胞白血病(APL)。
在某些实施方式中，用于组合疗法的药剂是一种或多种选自下组的药物：拓扑异构酶抑制剂、蒽环类拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、降甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、注射用柔红霉素和阿糖胞苷脂质体
Figure BDA0003938659030000591
氮杂胞苷/阿扎胞苷、
Figure BDA0003938659030000592
地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure BDA0003938659030000593
白介素-2、阿地白介素、
Figure BDA0003938659030000594
吉妥单抗奥唑米星、
Figure BDA0003938659030000595
FLT-3抑制剂、米哚妥林、
Figure BDA0003938659030000601
氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布、
Figure BDA0003938659030000602
IDH2抑制剂、依那昔布、
Figure BDA0003938659030000603
平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他、BCL-2抑制剂、维奈托克、
Figure BDA0003938659030000604
铂复合物衍生物、奥沙利铂、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼、
Figure BDA0003938659030000605
阿卡替尼、
Figure BDA0003938659030000606
赞布替尼、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓样细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、源自植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
在某些实施方式中，LILRB4相关病状或病症是急性骨髓性白血病(AML)、急性骨髓单核细胞性白血病(FAB M4)亚型和急性成单核细胞性/单核细胞性白血病(FAB M5)亚型。
在某些实施方式中，AML对标准护理治疗如维奈托克和氮杂胞苷/阿扎胞苷具有抗性或难治性。
AML是具有不良预后的侵袭性恶性肿瘤。在世界卫生组织(WHO)分类中，急性骨髓单核细胞性白血病(法美英[FAB]分类中的M4)和急性成单核细胞性/单核细胞性白血病(FAB分类中的M5)是AML的亚型，未另行指定(AML，NOS)。
WHO系统中的急性骨髓单核细胞性白血病(FAB M4)具有由成髓细胞、成单核细胞和前单核细胞(总计≥20％)以及≥20％至79％的单核细胞谱系组成的母细胞。急性成单核细胞性/单核细胞性白血病(FAB M5)具有≥20％的成单核细胞/前单核细胞以及≥80％的具有单核细胞特征的骨髓细胞。急性骨髓单核细胞性白血病(M4)和急性单核细胞白血病(M5)分别占所有AML病例的大约20％和10％(Ganzel等人,2016)。有证据表明，具有显著的单核细胞组分的AML患者更有可能患有髓外疾病(Ganzel等人,2016)和高白细胞血症(定义为≥100×103个白细胞/μL外周血)(Rollig和Ehninger,2015)。
LILRB4在具有单核细胞分化的AML细胞(Deng等人,2018；Dobrowolska等人,2013)和CMML(Chien等人,2019)上表达。在具有单核细胞分化的AML母细胞上，LILRB4的表达水平可以等效于正常单核细胞的表达水平或高至多10倍(Deng等人,2018)。此外，功能研究和免疫表型研究两者均表明LILRB4由来自单核细胞AML的白血病干细胞表达(Deng等人,2018)。
在2008年，AZA被欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)批准用于治疗患有20％至30％骨髓(BM)母细胞的年龄超过64岁且不适合造血干细胞移植(HSCT)的AML患者。早在2007年，专业中心的血液学家就开始用AZA治疗患有>30％ BM母细胞的AML患者，这表明医生确信他们会为他们的患者拼尽全力。这个假设是基于在AZA-MDS-001试验以及癌症和白血病B组方案中获得的总存活率(OS)的显著改善，其中32％和38％的试验群体患有分别具有20％至30％ BM母细胞的AML。
在2010年，在患有新诊断的AML、>30％ BM母细胞和≤15×109/L个白细胞(WBC)计数的年龄超过65岁的AML患者中开始测试AZA对常规护理方案(CCR)(强化化疗、低剂量阿糖胞苷或由治疗医师预选的最佳支持性护理)的国际3期随机化AZA-AML-001临床试验。在此试验中，报道了AZA相对于CCR在OS方面具有临床意义的改善(10.4对6.5个月；p＝0.1009)。另外，AZA组(27.8％)和CCR组(25.1％)(P＝0.5384)中的总应答(完全缓解[CR]+具有不完全血细胞计数恢复的完全缓解[CRi])速率相当，并且EMA批准的AZA于2015年10月30日得到扩展以包括具有>30％ BM母细胞的AML患者。
在某些实施方式中，LILRB4相关病状或病症是慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。
CMML诊断分类基于临床检查、形态学、细胞遗传学，并且只要可能，应该整合流式细胞术和分子生物学以根据WHO 2016分类对患者进行分类。WHO分类(Arber等人,2016年)包括CMML-0，用于在外周血中<2％母细胞和在BM中<5％母细胞的病例；CMML-1，用于在外周血中具有2％至4％母细胞和/或在BM中具有5％至9％母细胞的病例；以及CMML-2，用于在外周血中具有5％至19％母细胞、在BM中具有10％至19％母细胞和/或当Auer棒存在时的病例。
最初由基于13×109/L的WBC截止值的FAB分类提出的“发育异常”CMML与“增殖性”CMML之间的区别仍然是有用的，因为其临床特征不同(血细胞减少对器官巨大、高WBC和体质症状)，并且因此其临床管理不同。
除了脾肿大和肝肿大之外，髓外白血病主要包括特异性浆液性渗出物(胸膜渗出物和较少见心包渗出物或腹膜渗出物)和特异性皮肤浸润，所有这些都与较差的预后相关。
Figure BDA0003938659030000621
(阿扎胞苷)是用于治疗患有以下FAB骨髓增生异常综合征(MDS)亚型的患者的核苷代谢抑制剂：难治性贫血或伴有环状铁粒幼细胞的难治性贫血(如果伴有中性粒细胞减少症或血小板减少症或需要输血)、伴有过量母细胞的难治性贫血、伴有过量转化中的母细胞的难治性贫血以及慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。
本公开进一步提供了使用抗LILRB4抗体或其抗原结合片段来检测样品中LILRB4的存在或量的方法，所述方法包括使所述样品与抗体或其抗原结合片段接触；以及测定所述样品中LILRB4的存在或量。使用抗LILRB4抗体检测LILRB4的方法包括但不限于ELISA、蛋白质印迹、流式细胞术和FACS。
在一些实施方式中，本公开提供了诊断受试者的LILRB4相关疾病或病状的方法，所述方法包括：a)使从所述受试者获得的样品与本文所提供的抗体或其抗原结合片段接触；b)测定所述样品中LILRB4的存在或量；以及c)将所述LILRB4的存在与所述受试者的LILRB4相关疾病或病状相关。
在一些实施方式中，本公开提供了包含本文所提供的任选地与可检测部分缀合的抗体或其抗原结合片段的试剂盒。试剂盒可以用于检测LILRB4或诊断LILRB4相关疾病。
在一些实施方式中，本公开还提供了一种本文所提供的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的LILRB4相关疾病或病状的药物，在制备用于诊断LILRB4相关疾病或病状的诊断试剂中的用途。
V.嵌合抗原受体
另一方面，本公开提供了一种与LILRB4结合的嵌合抗原受体(CAR)蛋白(LILRB4CAR蛋白)。在某些实施方式中，CAR蛋白包含抗原识别区，即，识别如本文所述的LILRB4的抗体或抗原结合片段，以及其它膜和胞内组分。在一些实施方式中，LILRB4 CAR蛋白包含LILRB4抗原识别区、跨膜结构域和胞内共刺激信号结构域。在某些实施方式中，单链LILRB4CAR蛋白还包含前导肽、间隔子区和胞内T细胞信号传导结构域。
在某些实施方式中，抗原识别区包含多条多肽链。
在一些实施方式中，CAR蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括抗体重链可变结构域，所述第二多肽包括抗体轻链可变结构域，其中所述第一多肽或第二多肽进一步包括跨膜结构域，并且其中所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结构域一起形成抗原识别区。
在一些实施方式中，CAR蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括抗体重链可变结构域，所述第二多肽包括抗体轻链可变结构域和抗体轻链恒定结构域，其中所述第一多肽进一步包括跨膜结构域，并且其中所述抗体重链可变结构域、所述抗体轻链可变结构域和所述抗体轻链恒定结构域一起形成抗原识别区。在一些实施方式中，第一部分进一步包括胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括抗体重链可变结构域和抗体重链恒定结构域，所述第二多肽包含抗体轻链可变结构域，其中所述第一多肽进一步包含跨膜结构域，并且其中所述抗体重链可变结构域、所述抗体重链恒定结构域和所述抗体轻链可变结构域一起形成抗原识别区。在一些实施方式中，第一部分进一步包括胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括抗体重链可变结构域，所述第二多肽包括抗体轻链可变结构域，其中所述第二多肽进一步包括跨膜结构域，并且其中所述抗体重链可变结构域、所述抗体轻链可变结构域和所述抗体轻链恒定结构域一起形成抗原识别区。在一些实施方式中，第二部分进一步包括胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
在一些实施方式中，CAR蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽包括抗体重链可变结构域和抗体重链恒定结构域，所述第二多肽包括抗体轻链可变结构域，其中所述第二多肽进一步包括跨膜结构域，并且其中所述抗体重链可变结构域、所述抗体重链恒定结构域和所述抗体轻链可变结构域一起形成抗原识别区。在一些实施方式中，第二部分进一步包括胞内共刺激信号传导结构域和CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
在某些实施方式中，CAR蛋白是包含如本文所述的抗LILRB4 scFv的单链多肽，即通过连接子结构域连接的抗LILRB4重链可变结构域和抗LILRB4轻链可变结构域。在一个实施方式中，CAR蛋白从N末端到C末端包括：前导肽、抗LILRB4重链可变结构域、连接子结构域、抗LILRB4轻链可变结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激信号结构域。在一个实施方式中，CAR蛋白从N末端到C末端包括：前导肽、抗LILRB4轻链可变结构域、连接子结构域、抗LILRB4重链可变结构域、铰链区、跨膜结构域、胞内共刺激信号结构域。在一些实施方式中，CAR蛋白进一步包括CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
在某些实施方式中，连接子结构域通常包含促进螺旋和转角的氨基酸残基，如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸。然而，其它残基也可以发挥作用。在一些实施方式中，连接子结构域插入在scFv的VH与VL之间。在一些实施方式中，连接子结构域位于跨膜结构域与胞内共刺激信号传导结构域之间。在一些实施方式中，连接子结构域位于胞内T细胞信号传导结构域与胞内共刺激信号传导结构域之间。在一些实施方式中，连接子结构域包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:70)。
在一些实施方式中，与天然存在的CD8α跨膜结构域多肽相比，跨膜结构域是具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的CD8α跨膜结构域(SEQID NO:71)。在一些实施方式中，CD8α跨膜结构域由SEQ ID NO:72所示的核酸序列编码。
在一些实施方式中，与天然存在的CD28跨膜结构域多肽相比，跨膜结构域是具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的CD28跨膜结构域(SEQID NO:73)。在一些实施方式中，CD28跨膜结构域由SEQ ID NO:74所示的核酸序列编码。
胞内共刺激信号传导结构域包括能够提供共刺激信号传导以响应抗原与CAR的结合的氨基酸序列。在一些实施方式中，共刺激信号传导结构域的信号传导导致细胞因子的产生和表达细胞因子的T细胞或NK细胞的增殖。在一些实施方式中，胞内共刺激信号传导结构域是CD28胞内共刺激信号传导结构域、4-1BB胞内共刺激信号传导结构域、ICOS胞内共刺激信号传导结构域、OX-40胞内共刺激信号传导结构域或其任何组合。在一些实施方式中，CD28共刺激结构域具有SEQ ID NO:75所示的多肽序列。在一些实施方式中，CD28胞内共刺激信号传导结构域由SEQ ID NO:76所示的核酸序列编码。在一些实施方式中，4-1BB胞内共刺激信号传导结构域具有SEQ ID NO:77所示的多肽序列。在一些实施方式中，4-1BB胞内共刺激信号传导结构域由SEQ ID NO:78所示的核酸序列编码。
如本文所提供的“铰链区”是将抗原结合区与跨膜结构域连接的多肽。在一些实施方式中，铰链区将重链可变区与跨膜结构域连接。在一些实施方式中，铰链区将重链恒定区与跨膜结构域连接。在一些实施方式中，铰链区将轻链可变区与跨膜结构域连接。在一些实施方式中，铰链区将轻链恒定区与跨膜结构域连接。在一些实施方式中，与不存在铰链区相比，抗原结合区与抗原的结合亲和力增加。在一些实施方式中，在存在铰链区的情况下，抗原结合区与抗原之间的空间位阻降低。在一些实施方式中，铰链区是CD8α铰链区。在一些实施方式中，铰链区是CD28铰链区。
在一些实施方式中，胞内T细胞信号传导结构域包括人CD3复合物的ζ(zeta)链的信号传导结构域，即，CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。在一些实施方式中，胞内T细胞信号传导结构域是具有SEQ ID No:79所示的氨基酸序列的蛋白CD3zIso1。在一些实施方式中，胞内T细胞信号传导结构域是具有SEQ ID No:80所示的氨基酸序列的蛋白CD3zIso3，由SEQID NO:81所示的核酸序列编码。
在一个实施例中，CAR蛋白是单链多肽，所述单链多肽从N末端到C末端包括：CD8α前导肽、抗LILRB4 scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜结构域(或CD28跨膜结构域)、4-1BB胞内共刺激信号传导结构域(或CD28胞内共刺激信号传导结构域，或CD28胞内共刺激信号传导结构域随后是4-1BB胞内共刺激信号传导结构域)和处于两种同种型(CD3zIso1或CD3zIso3)之一的CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
在某些实施方式中，本文所提供的LILRB4 CAR蛋白显示出对LILRB4的高亲和力。在某些实施方式中，本文所提供的CAR蛋白与LILRB4的结合亲和力(如通过ELISA测量的EC50)小于1nM、0.9nM、0.8nM、0.7nM、0.6nM、0.5nM、0.4nM、0.3nM、0.2nM、0.1nM、0.09nM、0.08nM、0.07nM、0.06nM或0.05nM。出于本申请的目的，可以如下确定ELISA EC50值。LILRB-4胞外结构域蛋白(在C末端处具有6个HIS标签)在HEK293细胞中重组产生，并且在4℃下以1μg/ml浓度(100微升/孔)包被至高结合的96孔透明板(Corning-Costar，飞世尔科技公司(Fisher Scientific))上14至16小时。将经过包被的板用pH为7.4的PBS洗涤，简要地，并在37℃下用200微升/孔的含5％脱脂牛奶的PBS阻断2小时。将测试单克隆抗体(IgG或scFv片段)的连续稀释液(起始于10μg/ml并且3倍减浓滴定，经12个步骤)添加到96孔板，用于通过在37℃下与测定板上的覆盖物一起温育45分钟以进行结合。然后将板用包括吐温20(0.05％浓度)的PBS洗涤3次并用PBS洗涤一次。添加抗人或抗兔的第二抗体或者具有HRP缀合物(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoResearch))的其它物种IgG特异性抗体，用于按照制造商建议的稀释度在室温下温育1小时。通过添加HRP底物TMB(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))持续10分钟进行检测，并且通过添加50微升/孔的2N H2SO4停止检测。使用酶标仪(SpectraMax M4，美谷分子仪器有限公司(Molecular Devices))读取板的450nm处的吸光度。收集数据并且使用4-参数拟合曲线用GrapPad Prism 7软件绘图以进行EC50计算。
另一方面，本公开提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本文所述的CAR蛋白。在一些实施方式中，所述多核苷酸分子进一步包含在真核细胞中具有活性的启动子。在一些实施方式中，所述启动子是JeT启动子。所述JeT启动子是具有与许多强哺乳动物启动子相当的转录活性的重组启动子。所述JeT启动子由以下五个关键元件组成：(1)TATA盒；(2)转录起始位点(Inr)；(3)CAT共有序列；(4)与所述CAT共有序列结合的CArG元件，以及最终(5)以两个串联排布的四个Spl转录结合位点(GGGCGG)(US 2002/0098547 A1)。在一些实施方式中，所述多核苷酸分子是表达载体。在一些实施方式中，所述载体是基于来自Clontech公司(Clontech)的pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen或pSIN-EF1α-IRES-嘌呤霉素或pSIN-EF1α产生的。在一个实施例中，本公开的多核苷酸分子依次包含以下元件：(1)JeT启动子；(2)编码CD8-α前导子的序列；(3)编码重链可变区的序列；(4)编码连接子的序列；(5)编码轻链可变区的序列；(6)编码CD8铰链和TM结构域的序列；(7)编码4-1BB共刺激结构域的序列；(8)编码CD3-ζ激活结构域的序列。在一个实施例中，上述元件侧接5'和3'同源臂，所述同源臂有助于将多核苷酸分子插入靶基因座，例如T细胞受体α常数(TRAC)基因座。
VI.表达抗LILRB4 CAR蛋白的工程化细胞
另一方面，本公开提供了表达本文所述的CAR蛋白的工程化免疫细胞。免疫细胞可以是T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、自然杀伤(NK)细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞或巨噬细胞。本文还提供了产生免疫细胞和对其进行工程化的方法以及使用和施用细胞用于过继性细胞疗法的方法，在这种情况下，细胞可以是自体的或同种异体的。因此，工程化的免疫细胞可以用作免疫疗法，如靶向癌细胞。
表达CAR蛋白允许工程化的免疫细胞通过识别存在于靶细胞上的抗原与靶细胞(如癌细胞)结合。在与靶细胞结合后，工程化的免疫细胞被激活，然后继续增殖并变得具有细胞毒性，最终破坏靶细胞。已经证明，CAR-T细胞免疫疗法在临床试验中取得成功，并且已经被美国FDA批准用于治疗难治性B细胞急性成淋巴细胞性白血病和B细胞非霍奇金淋巴瘤(Hartmann J等人,《EMBO分子医学(EMBO Mol Med)》(2017)9:1183-97)。除了CAR-T细胞之外，最近还开发了CAR NK细胞和CAR巨噬细胞作为免疫疗法选择(Kloess S等人,《输血医学和血液疗法(Transfusion Medicine and Hemotherapy)》(2019)46:4-13；Klichinsky M等人,《AACR年度会议(AACR Annual Meeting)》2017,摘要4575)。因此，在本公开的某些实施方式中，表达本文所述的CAR蛋白的免疫细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
免疫细胞可以从受试者，特别是人受试者中分离。免疫细胞可以从所关注受试者或血库获得，所述所关注受试者如疑似患有特定疾病或病状的受试者、疑似具有特定疾病或病状的倾向的受试者、正在接受用于特定疾病或病状的疗法的受试者、为健康志愿者或健康供体的受试者。免疫细胞可以从免疫细胞存在于受试者体内的任何位置收集，所述位置包括但不限于血液、脐带血、脾脏、胸腺、淋巴结和骨髓。分离的免疫细胞可以直接使用，或者所述分离的免疫细胞可以如通过冷冻而储存一定时间段。
免疫细胞可以从免疫细胞所在的任何组织中富集/纯化，所述组织包括但不限于血液(包括由血库或脐带血库收集的血液)、脾脏、骨髓、外科手术期间取出和/或暴露的组织，以及通过活检手术获得的组织。免疫细胞从中富集、分离和/或纯化的组织/器官可以从活体和非活体受试者两者中分离，其中非活体受试者是器官供体。在特定实施方式中，免疫细胞从如外周血或脐带血等血液中分离。在一些方面，如通过CD4或CD8阳性T细胞抑制测量的，从脐带血中分离的免疫细胞具有增强的免疫调节能力。在特定方面，免疫细胞从汇集的血液，特别是汇集的脐带血中分离，以增强免疫调节能力。汇集的血液可以来自2个或更多个来源，如3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个来源(例如，供体受试者)。
免疫细胞群体可以从需要疗法或患有与免疫细胞活性降低相关的疾病的受试者获得。因此，细胞对于需要疗法的受试者来说将是自体的。可替代地，免疫细胞群体可以从供体，优选地组织相容性匹配的供体获得。免疫细胞群体可以从外周血、脐带血、骨髓、脾脏或免疫细胞存在于在所述受试者或供体中的任何其它器官/组织中采集。免疫细胞可以从一组受试者和/或供体，如从汇集的脐带血中分离。
当免疫细胞群体是从与受试者不同的供体获得时，所述供体优选地是同种异体的，前提是所获得的细胞与受试者相容，因为可以将所述细胞引入到受试者中。同种异体供体细胞可能与人白细胞抗原(HLA)相容或可能不相容。为了使与受试者相容，可以处理同种异体细胞以降低免疫原性。
可以使用本领域已知的合适的修饰方法对免疫细胞进行基因工程化以表达CAR。参见例如Sambrook和Ausubel,《当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)》,格林出版协会(Greene Publishing Associates)与约翰威利父子公司(John Wiley&Sons),纽约,1994。在一些实施方式中，免疫细胞包含编码一种或多种CAR蛋白的通过基因工程引入的一种或多种核酸。在某些实施方式中，使用基因编辑方法，例如CRISPR/Cas技术将编码CAR蛋白的核酸插入免疫细胞的基因组中。在一个实例中，编码CAR蛋白的核酸插入在T细胞受体α常数(TRAC)基因座处(参见例如，Eyquem J等人,《自然》(2017)543:113-117)。
还提供了用于免疫疗法的方法，所述方法包括施用有效量的本公开的免疫细胞。在一些实施方式中，通过转移引发免疫应答的本文所述的免疫细胞群体来治疗医学疾病或病症。在某些实施方式中，医学疾病或病症是癌症。在某些实施方式中，医学疾病或病症是自身免疫性疾病或炎性疾病。
提供以下实施例以更好地说明所要求保护的发明，而不应理解为限制本发明的范围。下文描述的所有具体组合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体组合物、材料和方法不旨在限制本发明，而仅用于说明落入本发明范围内的具体实施方式。本领域的技术人员可以开发出等效的组合物、材料和方法，而无需行使发明能力且不脱离本发明的范围。应当理解，可以在本文所述的程序中做出许多变化，同时仍然保持在本发明的界限内。本发明的诸位发明人的意图是此类变化都包括在本发明的范围内。
实施例1
材料和方法
SEC：尺寸排阻色谱法(SEC)的程序如下。如果样品浓度高于10.0mg/mL，则在SEC分析之前，用流动相将样品稀释至10.0mg/mL。将100μg样品注入柱中。所使用的设备是具有TSKgel G3000SWXL柱(7.8×300mm，5μm粒度)和UV检测器(检测波长：280nm)的安捷伦(Agilent)1260HPLC系统。流动相是具有300mM氯化钠的50mM磷酸盐缓冲液(pH 6.8±0.1)。以1.0毫升/分钟的流速应用等梯度持续20分钟。
成像毛细管等电聚焦(icIEF)：将20μL参考标准品或样品(稀释至1.0mg/mL)与约80μL主混合物单独混合，所述主混合物由0.5μL pI 7.40标志物、0.5μL pI 9.77标志物、1.0μL两性电解质3-10、3.0μL两性电解质8-10.5、35μL的1％甲基纤维素(MC)、37.5μL 8M尿素溶液、0.07μL乙酸和2.5μL超纯水构成。然后用配备有FC-COATED全柱检测毛细管的iCE3毛细管等电聚焦分析仪分析上样混合物。聚焦分析通过以下两个步骤进行：(1)1.5kV持续1分钟；(2)3kV持续8分钟，并且将自动进样器托盘维持在15℃下。进行280nm处的吸光度检测。分析后，用Empower 3处理原始数据。
EC50 FACS：使用表达人LILRB4或flag标记的食蟹猴LILRB4的稳定CHO-K1细胞来测定H7K3抗体的稳定性样品的结合能力。将CHO-K1细胞(1x105)用连续滴定的稳定性样品进行染色，随后用荧光缀合的抗人IgG(百进生物公司)进行二次染色。测量几何平均荧光(MFI)，并且通过Prism计算EC50。
EC50 ELISA：将人LILRB4 ECD-his重组蛋白(义翘神州公司(Sino Biological))或食蟹猴LILRB4 ECD-his重组蛋白(百普赛斯生物公司)在4℃下包被在EIA/RIA板(康宁公司(Corning))上过夜。在37℃下用5％脱脂牛奶阻断2小时后，将100μL连续稀释的抗LILRB4抗体添加到孔中并且在37℃下温育45分钟。随后，在室温下与HRP缀合的抗hFc抗体(杰克逊免疫研究实验所(Jackson ImmunoResearch Laboratories))一起温育35分钟之前，将这些板用PBS-吐温20(0.05％)洗涤三次并用PBS洗涤一次。在用酶标仪(美国分子仪器有限公司(Molecular Devices))在450nm下读取之前，将信号用TMB底物(西格玛公司)显影，通过添加2M硫酸来终止。使用Prism(GraphPad)基于OD450测量值来计算EC50。
ApoE抑制(IC50)：使用与激活的T细胞(NFAT)-GFP报告系统的核因子胞外连接的表达LILRB4的小鼠T杂交瘤细胞系来筛选H7K3变体的配体阻断能力。当LILRB4报告细胞(2×104/孔)与固定的重组APOE3蛋白(近岸蛋白科技有限公司(Novoprotein)目录号CI02)以10ug/mL共培养时，通过APOE与受体LILRB4的结合诱导GFP表达，并且使用流式细胞术定量GFP信号。在存在连续滴定的LILRB4阻断抗体H7K3的情况下，GFP表达以剂量依赖性方式降低并且通过流式细胞术信号计算IC50。
自体ADCC：将PBMC从健康供体中新鲜分离，并且在存在50ng/mL的rhIL-2和连续滴定的抗体的情况下培养过夜。将细胞用荧光缀合的抗CD14、抗CD19、抗CD303和抗CD123抗体进行染色，并且通过FACS Celesta获得细胞以对活单核细胞、pDC和B细胞进行计数。通过添加7-AAD排除死细胞。杀伤百分比计算为100–[(在抗体处理的情况下的细胞数量)/(在没有抗体处理的情况下的细胞数量)]。
THP-1-GFP细胞的ADCC：将THP-1-GFP细胞和新鲜分离的PBMC在存在50ng/mL的rhIL-2和连续滴定的抗体的情况下共培养(E:T比率＝50:1)过夜。通过对GFP+和7-AAD-细胞进行门控来获得活THP-1-GFP细胞计数。使用相同的自体ADCC调配物计算杀伤百分比。
MDSC的ADCC：制备来自两个不同健康供体的MDSC和NK细胞。通过在存在40ng/mL的GM-CSF的情况下将PBMC与SKMEL5细胞共培养8天来产生MDSC，并且使用CD33+微珠进行纯化。添加IL-2(100ng/mL)用于NK细胞激活。MDSC:NK＝1:2.5(一式两份)，其中将50,000个MDSC和125,000个NK细胞共培养21小时。温育21小时后，将细胞用CD14-FITC进行染色。在同一设置中，将THP-1-luc-GFP细胞用作阳性对照。使用相同的自体ADCC调配物计算杀伤百分比。
ADCP：使用负选择(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec))从来自健康供体的PBMC中分离人单核细胞，并且在存在50ng/mL M-CSF(R&D系统公司(R&D system))的情况下在X-vivo 10+10％ FBS培养基中培养7天。在最后24小时中，将50ng/mL的干扰素γ添加到初免巨噬细胞中。将THP-1-GFP细胞(2.5×104)在存在连续滴定的抗LILRB4抗体的情况下与巨噬细胞(E:T＝5:1)共培养24小时，用RPE缀合的抗CD163和抗CD206进行染色。通过对GFP+细胞进行门控通过流式细胞术来获得活THP-1细胞。基于THP-1细胞的绝对计数和GFP+％计算杀伤百分比。
T细胞介导的细胞毒性：使用基于FACS的方法来确定抗LILRB4介导未经处理的T细胞进行的肿瘤细胞杀伤的能力。从健康供体获得人血沉棕黄层，并且通过Ficoll PaquePlus(通用电气医疗集团(GE Healthcare)目录号17-1440-03)密度梯度细胞分离从血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用人Pan T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司目录号130-096-535)从PBMC中进一步分离Pan T细胞。将4×105个新鲜分离的人pan T细胞用作效应子细胞，并且将1×105个THP-1-GFP以4:1的比率用作靶细胞。将人pan T细胞、THP-1-GFP细胞和渐增浓度的抗LILRB4抗体或同型对照人IgG1(BioXcell公司(BioXcell)目录号BE0297)在U形96孔板中在总共200μL的RPMI 1640(Gibco目录号61870-036)+10％热灭活的FBS(Gibco目录号10082-147)中混合，并且在37℃下温育48小时。在温育结束时，收集40uL上清液用于细胞因子路明克斯(Luminex)测定。将7-AAD(BD Pharmingen目录号559925)添加到细胞中，并且通过FACS Celesta获得100uL细胞，并且测量GFP阳性细胞的百分比。使用Flowjo软件(Flowjo有限责任公司(Flowjo LLC))分析流式细胞术数据，并且将细胞毒性计算为：细胞毒性百分比＝100–([T/NT]×100)，其中T和NT分别是用或不用测试抗体处理的GFP+细胞的百分比。
通过路明克斯进行的细胞因子测定：使用定制的15plex面板试剂盒(R&D系统公司)测试细胞上清液。为了使用少壁板和15plex试剂盒的试剂进行DA珠测定，对R&D系统公司试剂盒的方案稍加修改。首先，将DA珠少壁板在室温下用含10μL 1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS阻断30分钟。将DA珠板随后用含0.1％ BSA 0.05％吐温20的PBS(洗涤缓冲液)使用自动洗涤装置LT MX(Curiox Biosystems公司(Curiox Biosystems))洗涤一次。每个孔接收7.5μL预混合的磁珠。然后，适当的孔接收7.5μL稀释的样品、标准品或空白。然后将DA珠板在模拟微板Genie摇床(纽约波希米亚的科学工业公司(Scientific Industries Inc.,Bohemia,NY))上以4的强度等级涡旋大约10秒。将DA珠板放置在3mm跨度的定轨摇床(Orbit300，Labnet，Edison，新泽西州)上，并在室温下以每分钟350转(rpm)(0.2×g)摇动120分钟。将DA珠板然后用LT MX洗涤装置洗涤3次。每个所使用的孔接收10μL检测抗体稀释剂。将DA珠随后放置在如以上所讨论的模拟微板genie摇床上持续大约10秒，并在室温下在定轨摇床上以350rpm温育60分钟。然后使用LT MX装置将DA珠板洗涤3次。每个孔接收10μL链霉亲和素藻红蛋白稀释剂。将DA珠板放置在如以上所讨论的Genie摇床上持续大约10秒，并在室温下在定轨摇床上以350rpm温育30分钟。将DA珠板在LT MX装置中洗涤3次。用总体积65μL的洗涤缓冲液重悬所述珠，并且转移到有裙缘的PCR板中并在路明克斯读取器中读取以进行数据采集(MAGPIX，基于双激光流的检测仪器，路明克斯)。
经过共培养的T细胞和THP-1细胞的FACS分析：从健康供体获得人血沉棕黄层，并且通过Ficoll Paque Plus(通用电气医疗集团目录号17-1440-03)密度梯度细胞分离从血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用人Pan T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司目录号130-096-535)通过负耗尽从冷冻PBMC中进一步分离Pan T细胞。将8×105个经过纯化的人pan T细胞用作效应子细胞，并且将1×105个THP-1-GFP以8:1的比率用作靶细胞。将人pan T细胞、THP-1-GFP细胞和抗LILRB4抗体或同型对照人IgG1(BioXcell公司目录号BE0297)在U-形96孔板中在总共200μL的X-vivo 10(龙沙集团(Lonza)目录号04-380Q)+10％热灭活的胎牛血清(FBS，Gibco目录号10082-147)中混合，并且在37℃下温育48小时。抗LILRB4抗体或人IgG1的最终浓度为3μg/mL(20nM)。为了测量胞内TNFα和IFNγ产生，在最后11小时的温育中添加蛋白转运抑制剂(BD生物科学公司(BD Biosciences)目录号555029)。在温育结束时，将细胞从包括蛋白转运抑制剂的培养基中离心出来，并且与人IgG(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)目录号I4506)在室温下一起温育10分钟以阻断Fc受体。然后将细胞用直接缀合的抗CD4(目录号564975)和抗CD8(目录号563256)针对表面抗原进行染色，使用固定/透化试剂盒(目录号555028)进行固定和透化，并且用抗IFNγ(目录号554552)和抗TNFα(目录号554514)或同型对照抗体(目录号554681、555749)进行染色。针对表面和胞内抗原的抗体来自碧迪公司(Becton,Dickinson and Company)。
T细胞和THP-1细胞激活的FACS分析：用来自BD生物科学公司的直接缀合的抗CD4(目录号564975)、抗CD8(目录号563256)、抗CD69(目录号555533)和抗CD25(目录号555432)抗体评估T细胞激活标志物的表面表达。用来自BD生物科学公司的直接缀合的抗HLA-DR(目录号559866)、抗CD80(目录号563084)、抗CD83(目录号565336)、抗CD86(目录号562432)、抗CD205(目录号558156)、抗CD87(目录号743096)和来自百进生物公司的抗CD40(目录号334310)、抗HLA-A、B、C(目录号311406)、抗LILRB4(目录号333008)评估THP-1细胞标志物的表面表达。在将7-氨基放线菌素D(7AAD；BD Pharmingen目录号559925)添加到细胞之后通过FACS Celesta获得细胞。使用Flowjo软件(Flowjo有限责任公司)分析流式细胞术数据，并且通过Prism GraphPad软件绘图。
用于CAR编码片段的PCR片段：使用以下条件、使用Venti热循环仪、用PRIMESTARDNA聚合酶(Takara Bio R010B)进行PCR：98℃_30秒，(98℃_10秒、64℃_5秒、72℃_30秒)×35个循环，72℃_7分钟。PCR产物使用PCR清洁试剂盒(Macherey-Nagel 740609.250)进行进一步纯化，并且通过乙醇沉淀进一步洗涤/浓缩经过洗脱的DNA。
基因靶向：诸位发明人首先使用TransAct激活T细胞，然后在电穿孔之前洗掉TransAct。在PMBC的TransAct激活后72小时，磁性去除CD3/CD28珠，并且使用氖转染系统(赛默飞世尔公司，10ul尖端)通过5ug和100pmol/l RNA双链转染T细胞。将4×105个细胞与RNP复合物和编码CAR的2.5ug PCR片段混合。在电穿孔后，将细胞稀释到培养基中并在37℃、7％ CO2下温育。随后，使用标准条件(37℃和在T细胞生长培养基中扩增，根据需要补充以维持每2至3天约1×106个细胞/毫升的密度)培养经过编辑的细胞。
TCRαKO T细胞：将人原代T细胞用CRISPR-Cas9 RNP复合物转染，所述复合物包括靶向TRAC的第一外显子的5'末端的向导RNA，并且提供有用于基于同源重组的敲入的DNA模板。在敲除TCRα之后，将细胞在具有IL-2 300IU/ml且不添加抗CD3/28的完全优化培养基中生长。转染后，将细胞在培养物中扩增2周。
CAR-T转导的流式细胞术测定：通过与LILRB4-Fc融合蛋白(百普赛斯生物公司CDK-H5259)和抗Fc抗体(百进生物公司B278652)结合来鉴定LILRB4 CAR-T。通过抗CD3染色(抗CD3 PE，BD 555333)来测量内源TCRα(TRAC)基因座(KO)敲除的成功。
抗原刺激测定：将1ug/ml重组对照抗原或LILRB4抗原包被在96孔板上在PBS缓冲液中过夜。将板用PBS缓冲液洗涤两次。将培养基中的1×105个CAR-T细胞(不添加任何细胞因子)添加到每个孔中并温育72小时。收集细胞培养物上清液用于通过路明克斯测定(R&D系统公司FCSTM-18)进行细胞因子释放测量。
CAR-T细胞介导的细胞毒性测定：将CHO K1 RB4细胞以不同密度(6×104、2×104或7×103)接种12小时。添加1×105个CAR-T细胞，并且通过去除上清液CAR-T细胞并将板用PBS洗涤2次来测定细胞毒性。通过普洛麦格公司CTG2.0发光试剂盒测量总活的贴壁CHO K1RB4细胞，并且通过将每种条件的发光信号除以同一E:T比率激活的T细胞对照来计算细胞毒性％。
阶段1设计：在第1A部分单一疗法递增阶段(第1天的单剂量)期间，患者将被纳入到渐增剂量的抗LILRB4单一疗法的连续群组中。第1A部分的目标是测定抗LILRB4单一疗法(MTD1)的最大耐受剂量(MTD)。将在治疗的前14天内(在抗LILRB4与氮杂胞苷/阿扎胞苷组合的第一剂量之前)，即抗LILRB4的第一剂量间隔期间评估MTD1的DLT。初始剂量-递增开始于加速滴定设计，随后是将使用3+3设计的标准递增阶段。第1部分将包括如上所述的复发性和/或难治性骨髓单核细胞(M4)和单核细胞性/成单核细胞性(M5)AML患者以及慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)患者两者。抗LILRB4的此2周单一疗法引入(“窗口”)使得能够研究特异性靶向LILRB4的单克隆抗体作为单一疗法的效应。在第1B部分(在第15天开始)期间，在第1A部分期间没有DLT的患者将接受与第1A部分中施用的相同剂量的抗LILRB4与标准剂量的氮杂胞苷/阿扎胞苷(每28天皮下注射75mg/m2，持续7天)的组合。抗LILRB4与氮杂胞苷/阿扎胞苷(MTD2)的组合的MTD将在28天DLT窗口中测定，所述窗口由14天的单一疗法和14天的组合治疗组成。第1部分(第1A部分和第1B部分组合)的总DLT时段为28天。随后的循环将是抗LILRB4与氮杂胞苷/阿扎胞苷的组合。
实施例2
诸位发明人先前鉴定了对人LILRB4具有高结合亲和力并且可以抑制异种移植AML小鼠模型中的癌症发展的称为B4-193的兔抗LILRB4抗体。(参见美国临时申请号62/730,715，所述美国临时申请的公开内容以其整体并入本文)
诸位发明人产生包含与B4-193相同的CDR的人源化抗LILRB4抗体。称为H7K3的人源化抗LILRB4抗体具有SEQ ID NO:1所示的重链可变区序列和SEQ ID NO:3所示的轻链可变区序列。
对H7K3的计算机分析表明，其在重链CDR3中的氨基酸残基W处具有潜在的氧化位点并且在轻链CDR1中的氨基酸残基NS处具有潜在的脱酰胺化位点，这可以潜在地降低抗体的稳定性。
然后诸位发明人评估抗体H7K3在PBS或调配物缓冲液中在40℃下的稳定性，其结果总结在表2和3中。结果表明，抗体H7K3不稳定。
表2：H7K3在PBS中的稳定性
Figure BDA0003938659030000751
表3：H7K3在调配物缓冲液中的稳定性
Figure BDA0003938659030000752
实施例3
为了再工程化H7K3以校正脱氨基化作用和氧化倾向，诸位发明人产生一系列具有潜在氧化位点和脱氨基化作用位点处的突变的变体。H7K3变体的序列总结在表4中。
表4：H7K3变体
Figure BDA0003938659030000753
Figure BDA0003938659030000761
诸位发明人使用表达人和食蟹猴LILRB4的CHO稳定细胞通过FACS测试H7K3变体的结合亲和力。结果总结在下表5中。
表5：H7K3变体的结合亲和力
Figure BDA0003938659030000762
诸位发明人进一步测试了H7K3变体的稳定性。如下表6中所总结的，与未在40℃下温育的对照样品相比，在40℃下温育4周后，在H7K3中观察到经过氧化的物种(通过绘图结果证实)。在40℃下温育4周后，在H7K3m5中未观察到明显的氧化。可以得出结论，H7K3m5比H7K3更稳定。
表6：H7K3和H7K3m5的去糖基化还原质量(DRM)结果的比较
Figure BDA0003938659030000763
Figure BDA0003938659030000771
诸位发明人进一步测试了H7K3变体的稳定性。与未在40℃下温育的对照样品相比，在40℃下温育4周后，在H7K3中观察到主峰降低约50％。与对照相比，在40℃下温育4周后，在H7K3m5中观察到主峰％降低约16％。可以得出结论，H7K3m5比H7K3更稳定。
表7：H7K3和H7K3m5的icIEF结果的比较
Figure BDA0003938659030000772
在曝光下，在H7K3m5中未检测到显著氧化。在曝光的情况下，获得H7K3m5的DRM与肽绘图结果之间的一致性。结果表明，H7K3m5在氧化环境(光)下显示出可接受的稳定性。
对于在40℃下温育4周后的H7K3m5，DRM结果表明没有显著氧化。关于DRM和icIEF结果，H7K3m5似乎比H7K3更稳定。即使具有低比率，icIEF也能够监测氧化和脱酰胺化。
实施例4
此实施例说明了H7K3m5的生物功能。
诸位发明人首先评估H7K3m5是否与细胞表面上表达的LILRB4结合。如图3所示，H7K3m5识别在THP-1-GFP细胞上表达的LILRB4。H7K3m5能够在存在体外PBMC的情况下诱导针对THP-1细胞的ADCC活性，如图4所示。值得注意的是，与野生型H7K3m5相比，无岩藻糖基化H7K3m5显示出增强的细胞杀伤，其中EC50增强超过100倍。如图5所示，H7K3m5也与在人单核细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)上表达的LILRB4结合。
如图6所示，人单核细胞中的LILRB4表达可以通过IL-10和IFNα处理来上调。通过负选择从人PBMC中分离人单核细胞，并且通过具有10％ FBS和1xL-谷氨酰胺的RPMI培养基中的50ng/ml IL-10加1500U IFNα刺激24小时。通过CD14-PE和抗LILRB4-APC以2ug/ml将细胞染色。
另一方面，通过LPS处理的人单核细胞下调LILRB4表达并增加uPAR表达水平(图7)。
如图8A和8B所示，LILRB4在体外分化的人巨噬细胞上表达。在体外单核细胞衍生的人巨噬细胞上的LILRB4的拷贝数量非常高，接近150,000个拷贝/细胞。
如图9所示，LILRB4表达在髓源性抑制细胞(MDSC)中大大增加。在体外分化的MDSC上的LILRB4的拷贝数量可以高达200,000个拷贝/细胞。
如图10A-10B所示，LILRB4还在人单核细胞衍生的树突状细胞(DC)上高度表达。LILRB4水平按照由高到低的顺序如下所示：耐受原性DC>激活的DC>未成熟DC。
表8：不同类型人原代细胞和AML细胞系上的LILRB4的拷贝数量的比较
Figure BDA0003938659030000781
诸位发明人然后比较了具有巨噬细胞浸润的高和低信号的实体瘤样品之间的LILRB4 mRNA表达水平。使用计算生物学和统计方法分析来自TCGA数据库的RNA测序数据，以鉴定呈现主要由每个肿瘤类型内的肿瘤相关巨噬细胞(共同定义巨噬细胞基因表达“标记”)表达的多个转录物的协调的上调表达的样品。将巨噬细胞基因表达“标记”呈现高信号的样品分类为被肿瘤相关巨噬细胞高度渗透。然后将LILRB4转录物的表达水平在那些肿瘤样品与巨噬细胞基因表达“标记”不明显的其余样品(分组为低巨噬细胞浸润样品)之间进行比较。如图11所示，较高的LILRB4 mRNA表达水平与巨噬细胞浸润相关。
然后诸位发明人测定实体瘤中由LILRB4抗体(H7K3m5)结合的细胞的类型。使用机械方法和PBS-10mM EDTA将来自实体瘤的组织样品解离成单细胞。在一些情况下，外周血样品也从与肿瘤组织样品相同的供体获得，并且使用标准方法进行处理以用于流式细胞术分析。使用标准方法将所得细胞与H7K3m5和用于髓样细胞的标志物的抗体混合物在4℃下一起温育，并且通过流式细胞术分析经过染色的样品。肿瘤样品中的门控如下：髓系树突状细胞(DC，CD11b+CD15-CD14-HLA-DR+CD11c+)、HLA-DRHi肿瘤相关巨噬细胞(TAM)/单核细胞(CD11b+CD15-CD14+HLA-DR+)、HLA-DRLo TAM/单核细胞髓源性抑制细胞(M-MDSC，CD11b+CD15-CD14+HLA-DR-)、PMN-MDSC(CD11b+CD15+CD14-)。外周血中的门控如下：髓系DC(CD11b+CD14-CD11c+)、单核细胞(CD11b+CD14+HLA-DRHi)、M-MDSC(CD11b+CD14+HLA-DRLo)、PMN-MDSC(CD11b+CD15+CD14-HLA-DR-Lox-1+)。如图12A-12B所示，这些实验的结果证明H7K3m5在肿瘤微环境和外围中与单核细胞(但不是粒细胞)髓样细胞结合。这一发现与LILRB4的表达模式一致，其限于单核细胞谱系的髓样细胞。
尽管LILRB4在原代正常单核细胞上表达，但H7K3m5的结合并未引起通过ADCC进行的单核细胞杀伤(图13A-13D)。在无岩藻糖基化H7K3m5的情况下，在25％-50％的经过测试的PBMC供体中观察到通过ADCC杀伤正常单核细胞(图14A-14D和图15C-15D)。另外，如图15A-15B所示，无岩藻糖基化和野生型H7K3m5两者都通过自体ADCC杀伤pDC。同时，单核细胞可以仅用无岩藻糖基化H7K3m5杀伤，这取决于供体(图15C-15D)。
如图16A和16B所示，如H7K3m5等抗LILRB4抗体通过ADCC耗尽体外来源的(肿瘤细胞调节的)髓源性抑制细胞(MDSC)。这是抗LILRB4在实体瘤治疗中的潜在作用机制。
除了ADCC之外，野生型H7K3m5还证明了通过ADCP对THP-1细胞的细胞杀伤(图17A-17B)。
抗LILRB4抗体还增强针对肿瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性。如图18所示，抗LILRB4可以诱导针对AML细胞系THP-1-GFP的T细胞细胞毒性，而在用同型对照抗体的情况下未观察到T细胞细胞毒性。H7K3m5处理诱导了未经处理的T细胞以剂量依赖性方式杀伤THP-1AML细胞。平均EC50为0.208±0.125nM(31.2±18.8ng/mL)(n＝3)。
通过多路复用路明克斯测定从细胞毒性测定样品的上清液进行的细胞因子测量表明，与对照样品相比，经过H7K3m5处理的样品中IFNγ和TNFα剂量依赖性增加(图19)。细胞因子谱变化与通过THP-1细胞定量测量的细胞杀伤活性增加一致(图18)。除了可能由激活的细胞毒性T细胞产生的TNFα和IFNγ水平增加之外，还观察到由单核细胞和巨噬细胞产生的已知MCP-1和IL-1Rα的剂量依赖性增加，这可能来自激活的THP-1细胞。与对照相比，响应于H7K3m5处理，IL-6、IL-8、IL-10水平也得到增加。这些细胞因子可能来自激活的T细胞和THP-1细胞两者。
通过流式细胞术评估T细胞激活标志物(参见图20)。在H7K3m5处理的情况下，观察到表达CD69的T细胞百分比高出2倍(图20A)。在此，用H7K3m5处理的4.7％的CD4+T细胞和23.6％的CD8+T细胞表达CD69，而用同型对照处理的仅2.6％的CD4+T细胞和12.2％的CD8+T细胞表达CD69。当单独培养T细胞时，通过H7K3m5处理的CD69+T细胞没有增加。H7K3m5对CD25+T细胞增加仅有轻微影响(图20B)。
还通过胞内染色评估经过共培养的T细胞和THP-1AML细胞中的细胞因子产生以用于流式细胞术。与同型对照相比，H7K3m5处理分别使产生IFNγ和TNFα的CD4+T细胞和CD8+T细胞增加2.7倍和34倍(图20C)。在H7K3m5处理的情况下，产生IFNγ的CD4+和CD8+T细胞增加2倍和4倍，并且THP-1细胞没有产生IFNγ(图20D)。相反，当与T细胞共培养时，在H7K3m5处理的情况下，产生TNFα的THP-1细胞增加3倍(图18E)。在没有T细胞的情况下，单独对THP-1细胞进行H7K3m5处理不会引起产生TNFα的THP-1细胞增加。这些数据表明，IFNγ仅由激活的T细胞产生，并且TNFα由激活的T细胞和THP-1AML细胞两者产生。
总之，H7K3m5增强THP-1细胞和激活的T细胞的抗原呈递以产生IFNγ和TNFα。
所提出的增强T细胞介导的细胞毒性的机制由以下组成：用抗LILRB4阻断抗体阻断LILRB4抑制性受体信号传导、减少THP-1细胞产生的精氨酸酶、THP-1细胞产生细胞因子(图19和20)以及增强的THP-1的抗原呈递能力(图21)。如图21所示，在存在1.5ug/mL(10nM)的H7K3m5或人IgG1的情况下，将THP-1AML细胞和未经处理的T细胞以4:1的E:T比率在37℃下共培养48小时。通过流式细胞术评估T细胞和THP-1细胞激活标志物(图21)。在THP-1AML细胞上，在所有实验中检测到共刺激分子CD83的轻微上调。每个实验使用来自不同供体的pan T细胞(n＝4)。在THP-1细胞上还检测到MHC II类分子HLADR(n＝3)、MHC I类分子(n＝1)和另一种共刺激分子CD86(n＝2)的轻微上调。这些数据表明，H7K3m5处理增强THP-1的抗原呈递活性。H7K3m5处理中度诱导了T细胞激活标志物CD69(n＝1)，这与细胞毒性活性增加一致。总之，THP-1的增强的抗原呈递可以触发T细胞激活并引起细胞毒性活性增强。
当THP-1细胞在存在H7K3m5的情况下与未经处理的T细胞共培养时，H7K3m5激活针对THP-1的T细胞细胞毒性(图20)。为了进一步理解在这种活性中两种细胞类型的变化，在存在3ug/mL(20nM)的H7K3m5或人IgG1的情况下，将未经处理的T细胞与THP-1AML细胞以8:1的E:T比率在37℃下共培养48小时。通过流式细胞术评估THP-1激活(图22)。H7K3m5处理诱导了HLA I类(A、B、C)和II类(HLA-DR)、共刺激分子CD40、CD86、CD80和CD83的表达，这表明H7K3m5增强THP-1细胞的抗原呈递功能。相反，抑制性分子CD205和LILRB4的表达未被H7K3m5降低。有趣且出乎意料的是，H7K3m5处理还增加了uPAR(LILRB4下游的NF-kB靶标)的表达，其在单核细胞AML细胞中高度表达并且以促进癌症侵袭、转移、存活和血管生成而闻名(Deng等人2018)。
当将THP-1AML细胞与未经处理的T细胞共培养时，未观察到T细胞激活和细胞毒性。这可能是由于具有高LILRB4表达的THP-1AML细胞的抗原呈递功能受损引起的。当将H7K3m5添加到经过共培养的THP-1和未经处理的T细胞时，观察到THP-1细胞的抗原呈递功能增强，示例为HLA-DR和CD83表达增加。对应地观察到未经处理的T细胞的激活，具体地针对THP-1细胞的细胞毒性激活。这通过组织培养基中的细胞因子(即，TNFα和IFNγ)分泌增加得到证实。这些数据证明，H7K3m5能够激活针对THP-1AML细胞的T细胞细胞毒性。
在此体外系统中还评估了由H7K3m5介导的未经处理的T细胞对正常单核细胞的细胞毒性，但没有观察到对正常单核细胞的杀伤(数据未示出)。正常单核细胞上的LILRB4密度为THP-1AML细胞上的LILRB4密度的1/10，更重要的是，由于缺乏肿瘤相关抗原，预期正常单核细胞的抗原呈递能力显著低于肿瘤AML细胞的抗原呈递能力。尽管诸位发明人发现患者AML细胞可以以与正常单核细胞上类似或高水平表达LILRB4，但似乎AML母细胞在表型上可能更像THP-1细胞并且在用H7K3m5处理时可以被激活的T细胞杀伤。
诸位发明人然后测试了H7K3m5对从单核细胞(Mo-DC)分化的树突状细胞的作用。从健康供体PBMC中分离经典的单核细胞并且用DC培养基(StemXVivo，50μg/mL庆大霉素(gentamycin)、50ng/mL GM-CSF和35ng/mL IL-4)分化为未成熟的树突状细胞，持续6天。然后将未成熟的单核细胞衍生的树突状细胞(Mo-DC)与抗体(100nM)在存在100ng/mL LPS(TLR4激动剂)的情况下一起温育，以诱导树突状细胞成熟和激活。2天后，通过流式细胞术分析细胞的细胞表面标志物的表达。如图24所示，HLA-DR和共刺激分子CD86的表达增加以及耐受原性标志物CD209的表达减少表明H7K3m5增强Mo-DC响应于TLR信号传导的抗原呈递和促炎能力。
用DC培养基(StemXVivo，50μg/mL庆大霉素、100ng/mL GM-CSF和35ng/mL IL-4)使未成熟的树突状细胞从分离自健康供体的PBMC的单核细胞(Mo-DC)分化5天。在第5天，用新鲜的DC培养基补充Mo-DC，并且在不存在或存在5μg/mL CD40配体的情况下用30μg/mLH7K3m5或其同型对照处理另外2天。在第7天，从健康的不相关供体的PBMC中分离T细胞，并悬浮于包含细胞因子混合物和30μg/mL H7K3m5的新鲜培养基中。包括仅T细胞和仅Mo-DC的培养物作为对照。在第4天结束时，通过ELISA测量培养基上清液中的IFN-γ和IL-12水平，而通过流式细胞术分析Mo-DC的细胞表面表型。图24-27中所展示的实验结果显示，如果Mo-DC已经用CD40配体成熟，则H7K3m5对Mo-DC的促炎作用更显著。
实施例5
此实施例说明了基于H7K3m5的重链和轻链可变结构域序列以及WO 2019057099中所公开的抗体的LILRB4/CD3双特异性抗体的产生。重链异二聚化是通过由工程化二硫键(Carter《免疫学方法杂志》2001,248,7-15)稳定的杵突变和臼突变(Merchant等人《自然生物技术》1998,16,677-681)来控制的。如先前所述，通过用人T细胞受体α(TRAC)和β(TRBC)恒定结构域替换轻链Cκ或重链CH1来控制正确的轻链配对(WO 2019057122A1)。还将突变引入到人IgG1恒定结构域中以降低效应子功能、改进稳定性并且增加CHO的生产率(Alegre等人《移植(Transplantation)》1994,57 1537-43和Hu等人《生物技术进展(BiotechnolProg)》2017,33,786-794)。
LILRB4/CD3双特异性抗体的表达和纯化
图28A示出了处于1+1或2+1构型的6种第一代LILRB4/CD3双特异性抗体的示意图。将处于1+1构型(4-3ab和4ab-3)的双特异性抗体工程化以与CD3ε和LILRB4的单个拷贝结合。将处于2+1(44-4ab、4ab4ab-3、43ab-4和4ab3-4ab)构型的双特异性抗体工程化以与CD3ε的单个拷贝和LILRB4的2个拷贝结合。44-3ab和4ab4ab-3构型在双特异性的一个臂上具有串联的两个LILRB4结合部分。43ab-4和4ab3-4ab构型在双特异性的两个臂上具有LILRB4结合部分。每种第一代双特异性抗体的多肽链和其氨基酸序列列于表9中。
表9：第一代LILRB4/CD3双特异性抗体的序列
Figure BDA0003938659030000831
Figure BDA0003938659030000841
为了产生第一代双特异性抗体，在基因合成后将编码第一代双特异性抗体的DNA克隆到哺乳动物表达载体中。然后通过将载体的适当混合物瞬时转染到Expi293细胞中并在100mL规模中表达来表达双特异性抗体。首先使用蛋白A亲和色谱法从上清液中对所有样品进行纯化。双特异性抗体编号1至3通过尺寸排阻色谱法(SEC)进一步纯化，而双特异性抗体4-6通过阴离子交换色谱法(AEX)纯化。通过SDS-PAGE和分析SEC分析所有样品的纯度。结果在表10中示出。将等分试样用PNGase F(MEDNA Bio M3103)进行去糖基化，并且使用Acquity UPLC蛋白BEH SEC柱、使用与Xevo G2-XS QTOF偶联的沃特世Acquity UPLC通过质谱法进行表征。结果在表11中示出。
表10：第一代双特异性抗体的产量和纯度
Figure BDA0003938659030000842
表11：第一代双特异性抗体的质谱数据
Figure BDA0003938659030000843
设计第二代双特异性抗体以改善同质性和可制造性。具体地，这是通过在TCRa结构域中突变S91A以去除O-聚糖修饰或进行Q1E突变以防止N-末端pyro-Q形成来完成的。每种第一代双特异性抗体的多肽链和其氨基酸序列列于表12中。在从第一代双特异性抗体开始的基因合成或标准分子生物学方案之后，将编码第二代双特异性抗体和对照的DNA克隆到哺乳动物表达载体中。然后使用瞬时转染到CHO-K1细胞中的适当载体表达双特异性抗体，并且使用补料分批方案以1L规模表达14天。通过蛋白A柱从来自所有样品的上清液中对双特异性抗体进行纯化，并且通过SEC进行进一步纯化。通过SDS-PAGE和分析SEC分析所有样品的纯度。结果在表13中示出。将样品的等分试样进行去糖基化并且通过质谱法进行表征，这表明样品缺乏第一代双特异性抗体的杂质(参见表14)。
表12：第二代LILRB4/CD3双特异性抗体的序列
Figure BDA0003938659030000851
表13：第二代双特异性抗体的产量和纯度
Figure BDA0003938659030000852
Figure BDA0003938659030000861
表14：第二代双特异性抗体的质谱数据
Figure BDA0003938659030000862
体外细胞毒性测定
使用基于FACS的方法来确定LILRB4/CD3双特异性抗体介导T细胞进行的靶细胞杀伤的能力。THP-1和MV4-11细胞的体外细胞毒性：将人AML细胞系THP-1和MV-4-11细胞工程化以表达绿色荧光蛋白(GFP)。从由斯坦福血液中心(Stanford Blood Center)收集的健康供体获得人血沉棕黄层。通过Ficoll Paque Plus(通用电气医疗集团目录号17-1440-03)密度梯度细胞分离从血沉棕黄层中分离人外周血单核细胞(PBMC)。使用人Pan T细胞分离试剂盒(美天旎生物技术公司目录号130-096-535)从PBMC中进一步分离Pan T细胞。将5×105个新鲜分离的人pan T细胞用作效应子细胞，并且将1×105个THP-1-GFP以5:1的比率用作靶细胞。在MV4-11细胞杀伤测定中，将9×105个新鲜分离的人pan T细胞用作效应子细胞，并且将1×105个MV4-11-GFP以9:1的比率用作靶细胞。将人pan T细胞、THP-1-GFP或MV4-11-GFP细胞以及渐增浓度的IO-202或同型对照人IgG1(BioXcell公司目录号BE0297)在U-形96孔板中在总共200μl的RPMI 1640(Gibco目录号61870-036)+10％热灭活的胎牛血清(FBS，Gibco目录号10082-147)中混合，并且在37℃下温育48小时。在温育结束时，将7-氨基放线菌素D(7-AAD；BD Pharmingen目录号559925)添加到细胞中，并且通过FACS Celesta获得100uL细胞，并且测量GFP阳性细胞的百分比。使用Flowjo软件(Flowjo有限责任公司(Flowjo LLC))分析流式细胞术数据，并且将细胞毒性计算为：细胞毒性百分比＝100–([T/NT]×100)，其中T和NT分别是用或不用测试抗体处理的GFP+细胞的百分比。
人正常单核细胞的自体杀伤：将1×106个PBMC和渐增浓度的LILRB4/CD3双特异性抗体或对照在U形96孔板中在总共200μl的RPMI+10％热灭活的FBS和50ng/ml IL-2(R&D系统公司目录号202-IL/CF)中混合，并且在37℃下温育48小时。将与渐增浓度的利妥昔单抗(基因泰克/百健艾迪(Biogen/Genentech))一起温育的PBMC用作测定对照。在温育结束时，将细胞洗涤并与5μL Fc受体阻断剂(10mg/mL的人免疫球蛋白G[IgG]，西格玛奥德里奇公司目录号I4506)一起在室温下温育10分钟，随后与来自BD生物科学公司的100μL荧光缀合的CD14(克隆M5E2，目录号555397)和CD19(克隆HIB19，目录号555415)在冰上温育30分钟。单核细胞被鉴定为CD14阳性细胞，而B细胞被鉴定为CD19阳性细胞。
如图29A-29B所示，在单核细胞与THP-1之间的不同抗LILRB4单特异性和双特异性抗体中观察到类似的结合亲和力趋势。如图30A-30B所示，观察到双特异性LILRB4/CD3抗体在单核细胞和THP-1-luc-GFP细胞上的T细胞介导的细胞毒性。如图31A-31B所示，观察到LILRB4/CD3双特异性进行的单核细胞的自体杀伤(图31A)和美罗华作为对照进行的B细胞的自体杀伤(图31B)。
通过Prism GraphPad软件使用非线性S形剂量-应答曲线拟合进行细胞杀伤曲线生成和EC50计算。通过Excel计算平均值±SD。结果见于表15和16中。
表15：第一代双特异性物的T细胞细胞毒性
Figure BDA0003938659030000871
*所估计的EC50
**EC50无法准确测量；4-3ab、4ab-3和44-3ab的效力弱于4ab4ab-3、43ab-4和4ab3-4ab的效力
表16：第二代双特异性抗体的T细胞细胞毒性
Figure BDA0003938659030000872
Figure BDA0003938659030000881
表面等离子体共振(Biacore)
使用Biacore 8K仪器通过表面等离子体共振测量第一代双特异性抗体与重组CD3e-CD3d异二聚体蛋白(Acro Biosystems公司)或LILRB4重组蛋白(义翘神州公司)的结合亲和力。简而言之，根据标准方案，将CD3e-CD3d或LILRB4蛋白用EDC和NHS固定在CM5芯片上。然后分别针对LILRB4和CD3e-CD3d以在1x HBX-EP+(10mM HEPES、150mM NaCl、3mMEDTA、0.05％吐温20，pH 7.4)中的6种浓度(1.25nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM和40nM)或7种浓度(20nM、2.5nM、5nM、10nM、20nM、40nM和80nM)注射双特异性抗体分析物。使用10mM甘氨酸pH 1.5作为再生缓冲液来再生芯片。从测试传感器图中减去参考通道Fc1和缓冲通道的传感图，并且通过1:1结合模型拟合实验数据。对于亲和力，参见表17。
表17：第一代双特异性物与重组蛋白和细胞的亲和力
Figure BDA0003938659030000882
生物层干涉测量法(Gator Bio)
使用来自Gator Bio的仪器通过生物层干涉测量法(BLI)测量第二代双特异性抗体与重组人CD3e(Acro，目录号CDE-H5223)、食蟹猴CD3e(Acro，目录号CDE-C5226)、人LILRB4(义翘神州公司，目录号16742-H08H)和食蟹猴LILRB4(Acro，目录号CDK-C5227)的结合亲和力。使用固定的抗人Fc抗体(HFC)探针(Gator Bio，目录号PL168-160003)以5ug/mL负载捕获双特异性抗体。使用6种浓度(0.6nM至159nM、0.7nM至164nM、0.8nM至200nM和2.5nM至595nM)分别测量人CD3e、食蟹猴CD3e、人LILRB4和食蟹猴LILRB4的结合亲和力。使用1:1拟合模型(全局拟合)与Gator的数据分析软件1.6.1.1203来确定结合亲和常数，并且使用比率Kdis/Kon来计算KD。对于亲和力，参见表18。
表18：第二代双特异性抗体与重组蛋白和细胞的亲和力
Figure BDA0003938659030000891
流式细胞术
在Jurkat细胞或THP-1细胞上通过FACS测量第一代和第二代双特异性物与CD3或LILRB4的结合。为了测量双特异性物与THP-1细胞的结合，首先将THP-1细胞与人Fc阻断剂(BD Pharmingen目录号564220)以每一百万个细胞10ug一起在室温下温育10分钟，随后与连续稀释的双特异性物一起在冰上温育30分钟。将细胞用BSA染色缓冲液(BD Pharmingen目录号554657)洗涤两次并且与二级Alexa 647缀合的抗人IgG Fc单克隆抗体(百进生物公司目录号409306)以5ug/mL一起在冰上温育30分钟。最终洗涤后，应用7-AAD以排除死细胞。为了测量第一代双特异性物与Jurkat细胞的结合，将每种双特异性物在包含1％ BSA(5倍稀释系列，400nM最高浓度)的缓冲液中稀释，并且与细胞一起在4℃下温育30分钟。然后在分析之前，将双特异性物用Alexa 647抗人IgG Fc在4℃下以5ug/mL染色0.5小时。与同型对照相比，在细胞上清楚地观察到CD3的结合，但由于结合曲线未达到平稳状态，因此无法计算或仅估计EC50。对于EC50值，参见表17和18。
实施例6
此实施例说明了表达基于H7K3m5的重链和轻链可变区序列的CAR蛋白的CAR-T细胞的产生。
使用流式细胞术测试源自抗LILRB4单克隆抗体H7K3m5的单链Fv(scFv)的两种不同构型的与人原代单核细胞和人白血病细胞THP-1的结合。如图32所示，VlVh构型维持H7K3m5的结合亲和力，而VhVl构型则失去一些结合亲和力。因此，选择CAR构建体的VlVh。
如图33所展示的，用于表达抗LILRB4 CAR蛋白的DNA构建体是包含CD28或4-1BB共刺激结构域与CD3ζ激活结构域的第2代CAR构建体。scFv源自抗LILRB4单克隆抗体H7K3m5。5'和3'同源臂是TRAC基因中Cas9 DNA切割位点的上游和下游的同源序列(基于gRNA设计)。启动子和前导肽是基因表达和胞外易位的必需元件。在此，诸位发明人使用JeT启动子来控制scFv的表达(Eyquem J等人《自然》(2017)543:113-117)。包括SV40 poly-A尾部用于改善转录物的稳定性和翻译。
将人原代T细胞用CRISPR-Cas9 RNP复合物转染，所述复合物包含靶向TRAC的第一外显子的5'末端的向导RNA，并且提供有用于基于同源重组的敲入的DNA构建体。在敲除TCRα之后，将细胞在具有IL-2 300IU/ml且不添加抗CD3/28的完全优化培养基中生长。转染后，将细胞在培养物中扩增2周。通过与LILRB4-Fc融合蛋白(百普赛斯生物公司CDK-H5259)和抗Fc抗体(百进生物公司B278652)结合来鉴定抗LILRB4 CAR-T细胞。通过抗CD3染色(抗CD3PE，BD 555333)来测量内源TCRα(TRAC)基因座(KO)敲除的成功。如图34所示，确认了抗LILRB4 CAR-T细胞的有效产生。
如图35所示，TCRα(TRAC)灭活的T细胞(KO)和抗LILRB4 CAR(或对照CAR)敲入的T细胞在体外经历细胞增殖和扩增。与对照CAR-T细胞相比，抗LILRB4 CAR-T细胞具有显著更高的扩增倍数。
为了测试CAR-T培养物的抗原依赖性激活，将1ug/ml重组对照抗原或LILRB4抗原包被在96孔板上在PBS缓冲液中过夜。将板用PBS缓冲液洗涤两次。将培养基中的1×105个CAR-T细胞(不添加任何细胞因子)添加到每个孔中并温育72小时。收集细胞培养物上清液用于通过路明克斯测定进行细胞因子释放测量。如图36A-36H所示，抗LILRB4 CAR-T细胞释放细胞因子IL-8、IFNγ、IL-10、IL-1ra、IL-2、IL-6、TNFα和IL1α取决于LILRB4的存在。
图37A-37C示出了扩增2周后CAR-T细胞的表征。在流式细胞术分析之前，将液氮储存中的冷冻的CAR-T细胞解冻并在培养物中保持2-3天。所使用的抗体是抗CD8APC Cy7(BD561945)、抗PD1 PE(BD560908)、抗TIM3 BV421(BD565562)。通过与LILRB4-Fc融合蛋白(百普赛斯生物公司CDK-H5259)和抗Fc抗体(百进生物公司B278652)结合来鉴定LILRB4CAR-T细胞。如图37A所示，表达抗LILRB4_CD28使CD8+T细胞的百分比略有降低(从61.8％降至41.8％)，并且基本上不改变细胞上的PD-1和TIM3的表达。如图37B所示，表达抗LILRB4_4-1BB使CD8+T细胞的百分比从48.7％降至3.61％，并且增加PD-1的表达。如图37C所示，插入CAR构建体的TRAC基因座处的敲除(KO)TCRα表达基本上不改变CD8+T细胞的百分比或PD-1或TIM3的表达。
为了测试抗LILRB4 CAR-T细胞的细胞毒性，将CHO K1 RB4细胞以不同密度(6×104、2×104或7×103)接种12小时，添加1×105个CAR-T细胞，并且通过去除上清液CAR-T细胞并将板用PBS洗涤2次来测量细胞毒性。通过普洛麦格公司CTG2.0发光试剂盒测量总活的贴壁CHO K1 RB4细胞，并且通过将每种条件的发光信号除以同一E:T比率激活的T细胞对照来计算细胞毒性％。如图38所示，抗LILRB4 CAR-T细胞(44)而不是抗CD19 CAR-T细胞(94)杀伤CHO K1 RB4细胞。
实施例7
此实施例说明了1期首次人体试验的设计。
如图39A所示，包括抗LILRB4的2周单一疗法引入(“窗口”)的“窗口”设计使得能够研究特异性靶向LILRB4的单克隆抗体作为单一疗法的效应。
在第1A部分单一疗法递增阶段(第1天的单剂量)期间，患者将被纳入到渐增剂量的抗LILRB4单一疗法的连续群组中。第1A部分的目标是确定抗LILRB4单一疗法(MTD1)的MTD。将在治疗的前14天内(在抗LILRB4与氮杂胞苷/阿扎胞苷组合的第一剂量之前)，即抗LILRB4的第一剂量间隔期间评估MTD1的DLT。初始剂量-递增开始于加速滴定设计，随后是将使用3+3设计的标准递增阶段。第1部分将包括复发性和/或难治性骨髓单核细胞(M4)和单核细胞性/成单核细胞性(M5)AML患者以及慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)患者两者。
在第1B部分(在第15天开始)期间，在第1A部分期间没有DLT的患者将接受与第1A部分中施用的相同剂量的抗LILRB4与标准剂量的氮杂胞苷/阿扎胞苷(每28天皮下注射75mg/m2，持续7天)的组合。抗LILRB4与氮杂胞苷/阿扎胞苷(MTD2)的组合的MTD将在28天DLT窗口中测定，所述窗口由14天的单一疗法和14天的组合治疗组成。
第1部分(第1A部分和第1B部分组合)的总DLT时段为28天。这也可以容易地变为42天，其中前14天进行单一疗法DLT并且后28天(添加氮杂胞苷/阿扎胞苷)进行组合疗法DLT。
随后的循环将是抗LILRB4与氮杂胞苷/阿扎胞苷的组合。
如图39B和图39C所示，一旦抗LILRB4+氮杂胞苷/阿扎胞苷组合的MTD和/或RP2D被鉴定并且获得安全审查委员会(Safety Review Committee，SRC)的批准，将在复发性和/或难治性成单核细胞性/单核细胞性白血病患者中开始纳入两个扩增组之一(图39B和图39C)。
如图39B所示，此研究将在患有具有单核细胞分化的复发性/难治性AML的患者中纳入单一疗法群组抗LILRB4。图39B也可以是在所设计的“窗口”不被接受的情况下用于首次人体1期试验的设计。
如图39C所示，此研究将在患有具有单核细胞分化的复发性/难治性AML的患者中纳入抗LILRB4+氮杂胞苷/阿扎胞苷的组合群组。
如图39D所示，此研究将在患有具有单核细胞分化的复发性/难治性AML的患者中和在新诊断的具有患有单核细胞分化的AML的患者中纳入抗LILRB4+氮杂胞苷/阿扎胞苷+维奈托克的组合群组。
*************
根据本公开内容，无需过度实验即可制备和执行本文所公开和要求保护的所有组合物和方法。虽然已经根据优选实施方式描述了本发明的组合物和方法，但是对于本领域的技术人员来说将显而易见的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以改变所述方法以及本文所描述的方法的步骤或步骤顺序。更具体地，将显而易见的是，化学和生理学相关的某些药剂可以取代本文所述的药剂，同时将实现相同或类似的结果。对于本领域的技术人员来说显而易见的所有此类类似的取代和修改都被认为处于由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
序列表
<110> 以明生物免疫医疗公司
<120> 新型抗LILRB4抗体和衍生产物
<130> 066564-8013CN01
<160> 124
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 2
gaggtgcagc tggtcgagtc cggaggcgga ctggtgcagc ctggaggatc cctgaggctg 60
tcctgcgccg cttccggctt ctccctgtcc tcctcctact ggatctcctg ggtgaggcag 120
gcccctggaa agggcctgga gtggatcggc tccatcgact ccggctccgt gggcatcacc 180
tactacgcca cctgggtgaa gggcaggttc accatctcca gggacaactc caagaacacc 240
ctgtacctgc agatgaactc cctgagggcc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgccagg 300
cacggcgata actgggctct ggacctgtgg ggacagggca cactggtgac cgtgtcctcc 360
<210> 3
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 4
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
gacatccaga tgacccagtc cccttccacc ctgtccgctt ccgtgggcga cagggtgacc 60
atcacctgca gggccagcca gtccatcaac tcctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gcttccaccc tggcttccgg cgtgcctagc 180
aggttttccg gctccggctc cggcaccgag tttaccctga ccatctcctc cctgcagccc 240
gacgacttcg ccacctacta ctgccagcac ggctacatca ggggcgacct ggacaacgtg 300
tttggcggcg gcaccaaggt ggagatcaag 330
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Trp
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
Gln Ser Ile Asn Ser Trp
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp Leu Asp Asn Val
1 5 10
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Val Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
Ala Arg His Gly Asp Asn Val Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Tyr Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
Ala Arg His Gly Asp Asn Tyr Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 15
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Phe Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
Ala Arg His Gly Asp Asn Phe Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Gln Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
Ala Arg His Gly Asp Asn Gln Ala Leu Asp Leu
1 5 10
<210> 19
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Val Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
Gln Ser Ile Val Ser Trp
1 5
<210> 21
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
Gln Ser Ile Asp Ser Trp
1 5
<210> 23
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
Gln Ser Ile Glu Ser Trp
1 5
<210> 25
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gln Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 26
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
Gln Ser Ile Gln Ser Trp
1 5
<210> 27
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
Gln Ser Ile Ser Ser Trp
1 5
<210> 29
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
Gln Ser Ile Thr Ser Trp
1 5
<210> 31
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Gln Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 32
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
Gln Ser Ile Asn Gln Trp
1 5
<210> 33
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 34
Gln Ser Ile Asn Val Trp
1 5
<210> 35
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 35
gacatccaga tgacccagtc ccctagcaca ctgtccgcca gcgtgggcga tcgtgtgacc 60
atcacttgtc gggcttccca gagcatcagc agctggctgg cttggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gcttccactt tagctagcgg cgtgccttct 180
cgtttctccg gatccggatc cggcaccgag ttcactttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gacgacttcg ccacatacta ctgccagcac ggctacatcc ggggcgattt agacaatgtg 300
ttcggcggcg gcaccaaggt cgagatcaag 330
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 36
Gln Ser Ile Ala Ser Trp
1 5
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Gln Ser Ile Cys Ser Trp
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 38
Gln Ser Ile Phe Ser Trp
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Gln Ser Ile Gly Ser Trp
1 5
<210> 40
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Gln Ser Ile His Ser Trp
1 5
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Ser Ile Ile Ser Trp
1 5
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Gln Ser Ile Lys Ser Trp
1 5
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gln Ser Ile Leu Ser Trp
1 5
<210> 44
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Gln Ser Ile Met Ser Trp
1 5
<210> 45
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Ser Ile Pro Ser Trp
1 5
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 46
Gln Ser Ile Arg Ser Trp
1 5
<210> 47
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Gln Ser Ile Trp Ser Trp
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 48
Gln Ser Ile Tyr Ser Trp
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Gln Ser Ile Asn Ala Trp
1 5
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 50
Gln Ser Ile Asn Cys Trp
1 5
<210> 51
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Gln Ser Ile Asn Asp Trp
1 5
<210> 52
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 52
Gln Ser Ile Asn Glu Trp
1 5
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Gln Ser Ile Asn Phe Trp
1 5
<210> 54
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 54
Gln Ser Ile Asn Gly Trp
1 5
<210> 55
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Gln Ser Ile Asn His Trp
1 5
<210> 56
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Gln Ser Ile Asn Ile Trp
1 5
<210> 57
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Gln Ser Ile Asn Lys Trp
1 5
<210> 58
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Gln Ser Ile Asn Leu Trp
1 5
<210> 59
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Gln Ser Ile Asn Met Trp
1 5
<210> 60
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 60
Gln Ser Ile Asn Asn Trp
1 5
<210> 61
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Gln Ser Ile Asn Pro Trp
1 5
<210> 62
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 62
Gln Ser Ile Asn Arg Trp
1 5
<210> 63
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Gln Ser Ile Asn Thr Trp
1 5
<210> 64
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 64
Gln Ser Ile Asn Trp Trp
1 5
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 65
Gln Ser Ile Asn Tyr Trp
1 5
<210> 66
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser
130 135 140
Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala
145 150 155 160
Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly
180 185 190
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 67
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 67
accggtgccg ccaccatggg ctggagctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgctaca 60
ggcgtgcact ctgaggtgca gctggtggag agcggaggag gactggtgca gcctggaggc 120
tccctgagac tgtcttgtgc cgcttctggc tttagcctga gctcctctta ctggatctcc 180
tgggtgcgcc aggctccagg caagggactg gagtggatcg gctctatcga cagcggctcc 240
gtgggcatca cctactatgc cacatgggtg aagggccggt tcaccatcag cagggacaac 300
tccaagaata cactgtatct gcagatgaac tccctgcggg ccgaggatac agccgtgtac 360
tattgcgcca ggcacggcga caattgggct ctggatctgt ggggacaggg caccctggtg 420
acagtgagct ccggcggcgg cggctctgga ggaggaggca gcggcggagg aggctccgac 480
atccagatga cccagtctcc cagcacactg tccgcttctg tgggcgatag agtgaccatc 540
acatgtcgcg ccagccagtc catctctagc tggctggctt ggtaccagca gaagcccggc 600
aaggccccta agctgctgat ctataaggcc tctaccctgg ctagcggagt gccatcccgg 660
ttctctggca gcggctccgg aacagagttt accctgacaa tctcctctct gcagcccgac 720
gatttcgcca cctactattg ccagcacgga tacatcaggg gcgacctgga taacgtgttt 780
ggcggcggca ccaaggtgga gatcaagaga tct 813
<210> 68
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Trp Ile
145 150 155 160
Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser
165 170 175
Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 69
<211> 813
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 69
accggtgccg ccaccatggg ctggagctgc atcatcctgt tcctggtggc caccgctaca 60
ggcgtgcact ccgacatcca gatgacccag tccccctcta cactgagcgc ctccgtgggc 120
gatagagtga ccatcacatg tcgcgcctct cagagcatca acagctggct ggcttggtac 180
cagcagaagc ccggcaaggc ccctaagctg ctgatctata aggcctctac cctggctagc 240
ggagtgccat cccggttctc cggctctggc agcggaacag agtttaccct gacaatcagc 300
tccctgcagc ccgacgattt cgccacctac tattgccagc acggatacat caggggcgac 360
ctggataacg tgttcggcgg cggcacaaag gtggagatca agggaggagg aggcagcggc 420
ggaggaggct ccggcggcgg cggctctgag gtgcagctgg tggagtccgg aggaggactg 480
gtgcagcctg gaggctctct gagactgagc tgtgccgcta gcggcttctc cctgtctagc 540
tcctactgga tctcttgggt gcgccaggct ccaggcaagg gactggagtg gatcggcagc 600
atcgactccg gctctgtggg catcacctac tatgccacat gggtgaaggg ccggtttacc 660
atctccaggg acaactctaa gaatacactg tatctgcaga tgaactctct gcgggccgag 720
gataccgccg tgtactattg cgccaggcac ggcgacaatt gggctctgga tctgtgggga 780
cagggcaccc tggtgacagt gtctagcaga tct 813
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 71
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr
20
<210> 72
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
atctacatct gggctccact ggcaggaacc tgtggcgtgc tgctgctgtc cctggtcatc 60
aca 63
<210> 73
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 74
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 75
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 76
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 77
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 77
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 78
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 79
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
50 55 60
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
65 70 75 80
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
85 90 95
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
100 105 110
Arg
<210> 80
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 81
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 82
<211> 40
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 82
rurcrargrg rgrururcru rgrgrarura rurcrurgru 40
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 83
agatgctatt tcccgtataa 20
<210> 84
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 84
ccatagacct catgtctagc acag 24
<210> 85
<211> 3261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 85
ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60
caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120
agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180
taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240
actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300
ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360
agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420
gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 720
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 780
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 840
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 900
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 960
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggccct 1020
gcctgtgaca gccctgctgc tgcctctggc tctgctgctg catgccgcta gacccgatat 1080
ccagatgaca cagaccacca gcagcctgag cgccagcctg ggcgaccgag tgactatcag 1140
ctgccgggca tcccaggata tttctaagta tctgaactgg taccagcaga agcccgacgg 1200
cactgtcaaa ctgctgatct accacaccag tagactgcat tcaggggtgc ctagcaggtt 1260
ctccggatct ggcagtggga ctgactactc cctgaccatc tctaacctgg agcaggaaga 1320
tattgccacc tatttctgcc agcagggcaa tacactgcct tacacttttg gcgggggaac 1380
aaagctggag atcactggcg gaggaggatc tggaggagga ggaagtggag gaggaggatc 1440
agaggtgaaa ctgcaggaaa gcggaccagg actggtcgca ccttcacaga gcctgtccgt 1500
gacatgtact gtctccggag tgtctctgcc cgattacggc gtctcttgga tccggcagcc 1560
ccctagaaag ggactggagt ggctgggcgt gatctgggga agtgaaacta cctactataa 1620
tagtgctctg aaatcaagac tgaccatcat taaggacaac tctaaaagtc aggtgtttct 1680
gaagatgaat tccctgcaga ccgacgatac agcaatctac tattgcgcca aacactacta 1740
ttacggcggg agctatgcca tggattactg ggggcaggga acttccgtca ccgtgagcag 1800
caccactact cccgctccaa ggccacccac ccctgccccg accatcgcct ctcagccgct 1860
ttccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg gccgtgcata cccggggtct 1920
tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct ggtacttgcg gggtcctgct 1980
gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt 2040
caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg 2100
atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga 2160
cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag 2220
agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc 2280
gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga 2340
ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct 2400
ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct 2460
gccccctcgc tgataaaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 2520
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 2580
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt agatatccag aaccctgacc ctgccgtgta 2640
ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc 2700
tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct 2760
agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga 2820
ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaggacacct tcttccccag 2880
cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag gaatggccag 2940
gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg gtctcggcct 3000
tatccattgc caccaaaacc ctctttttac taagaaacag tgagccttgt tctggcagtc 3060
cagagaatga cacgggaaaa aagcagatga agagaaggtg gcaggagagg gcacgtggcc 3120
cagcctcagt ctctccaact gagttcctgc ctgcctgcct ttgctcagac tgtttgcccc 3180
ttactgctct tctaggcctc attctaagcc ccttctccaa gttgcctctc cttatttctc 3240
cctgtctgcc aaaaaatctt t 3261
<210> 86
<211> 3261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 86
ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60
caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120
agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180
taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240
actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300
ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360
agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420
gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 720
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 780
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 840
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 900
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 960
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggccct 1020
gcctgtgaca gccctgctgc tgcctctggc tctgctgctg catgccgcta gacccgatat 1080
ccagatgaca cagaccacca gcagcctgag cgccagcctg ggcgaccgag tgactatcag 1140
ctgccgggca tcccaggata tttctaagta tctgaactgg taccagcaga agcccgacgg 1200
cactgtcaaa ctgctgatct accacaccag tagactgcat tcaggggtgc ctagcaggtt 1260
ctccggatct ggcagtggga ctgactactc cctgaccatc tctaacctgg agcaggaaga 1320
tattgccacc tatttctgcc agcagggcaa tacactgcct tacacttttg gcgggggaac 1380
aaagctggag atcactggcg gaggaggatc tggaggagga ggaagtggag gaggaggatc 1440
agaggtgaaa ctgcaggaaa gcggaccagg actggtcgca ccttcacaga gcctgtccgt 1500
gacatgtact gtctccggag tgtctctgcc cgattacggc gtctcttgga tccggcagcc 1560
ccctagaaag ggactggagt ggctgggcgt gatctgggga agtgaaacta cctactataa 1620
tagtgctctg aaatcaagac tgaccatcat taaggacaac tctaaaagtc aggtgtttct 1680
gaagatgaat tccctgcaga ccgacgatac agcaatctac tattgcgcca aacactacta 1740
ttacggcggg agctatgcca tggattactg ggggcaggga acttccgtca ccgtgagcag 1800
caccactact cccgctccaa ggccacccac ccctgccccg accatcgcct ctcagccgct 1860
ttccctgcgt ccggaggcat gtagacccgc agctggtggg gccgtgcata cccggggtct 1920
tgacttcgcc tgcgatatct acatttgggc ccctctggct ggtacttgcg gggtcctgct 1980
gctttcactc gtgatcactc tttactgtaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt 2040
caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg 2100
atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca ggagcgcaga 2160
cgcccccgcg tacaagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag 2220
agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc 2280
gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga 2340
ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct 2400
ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct 2460
gccccctcgc tgataaaatt gttgttgtta acttgtttat tgcagcttat aatggttaca 2520
aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg cattctagtt 2580
gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt agatatccag aaccctgacc ctgccgtgta 2640
ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc 2700
tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct 2760
agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga 2820
ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaggacacct tcttccccag 2880
cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag gaatggccag 2940
gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg gtctcggcct 3000
tatccattgc caccaaaacc ctctttttac taagaaacag tgagccttgt tctggcagtc 3060
cagagaatga cacgggaaaa aagcagatga agagaaggtg gcaggagagg gcacgtggcc 3120
cagcctcagt ctctccaact gagttcctgc ctgcctgcct ttgctcagac tgtttgcccc 3180
ttactgctct tctaggcctc attctaagcc ccttctccaa gttgcctctc cttatttctc 3240
cctgtctgcc aaaaaatctt t 3261
<210> 87
<211> 3267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 87
ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60
caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120
agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180
taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240
actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300
ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360
agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420
gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 720
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 780
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 840
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 900
ggggcagtgc aggaaaagtg gcactatgaa ccctgcagcc ctaggaatgc atctagacaa 960
ttgtactaac cttcttctct ttcctctcct gacaggcctc gaggccgcca ccatggccct 1020
gcctgtgaca gccctgctgc tgcctctggc tctgctgctg catgccgcta gacccgacat 1080
ccagatgacc cagtccccct ctacactgag cgcctccgtg ggcgatagag tgaccatcac 1140
atgtcgcgcc tctcagagca tcaacagctg gctggcttgg taccagcaga agcccggcaa 1200
ggcccctaag ctgctgatct ataaggcctc taccctggct agcggagtgc catcccggtt 1260
ctccggctct ggcagcggaa cagagtttac cctgacaatc agctccctgc agcccgacga 1320
tttcgccacc tactattgcc agcacggata catcaggggc gacctggata acgtgttcgg 1380
cggcggcaca aaggtggaga tcaagggagg aggaggcagc ggcggaggag gctccggcgg 1440
cggcggctct gaggtgcagc tggtggagtc cggaggagga ctggtgcagc ctggaggctc 1500
tctgagactg agctgtgccg ctagcggctt ctccctgtct agctcctact ggatctcttg 1560
ggtgcgccag gctccaggca agggactgga gtggatcggc agcatcgact ccggctctgt 1620
gggcatcacc tactatgcca catgggtgaa gggccggttt accatctcca gggacaactc 1680
taagaataca ctgtatctgc agatgaactc tctgcgggcc gaggataccg ccgtgtacta 1740
ttgcgccagg cacggcgaca attgggctct ggatctgtgg ggacagggca ccctggtgac 1800
agtgtctagc accactactc ccgctccaag gccacccacc cctgccccga ccatcgcctc 1860
tcagccgctt tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac 1920
ccggggtctt gacttcgcct gcgatatcta catttgggcc cctctggctg gtacttgcgg 1980
ggtcctgctg ctttcactcg tgatcactct ttactgtagg agtaagagga gcaggctcct 2040
gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg cccacccgca agcattacca 2100
gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc agagtgaagt tcagcaggag 2160
cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg 2220
acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg 2280
aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat 2340
ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga 2400
tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca 2460
ggccctgccc cctcgctgat aaaattgttg ttgttaactt gtttattgca gcttataatg 2520
gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa agcatttttt tcactgcatt 2580
ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttagat atccagaacc ctgaccctgc 2640
cgtgtaccag ctgagagact ctaaatccag tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt 2700
tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac 2760
tgtgctagac atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa 2820
atctgacttt gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagagg acaccttctt 2880
ccccagccca ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg cttcaggaat 2940
ggccaggttc tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga ttggtggtct 3000
cggccttatc cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag ccttgttctg 3060
gcagtccaga gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag gagagggcac 3120
gtggcccagc ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc tcagactgtt 3180
tgccccttac tgctcttcta ggcctcattc taagcccctt ctccaagttg cctctcctta 3240
tttctccctg tctgccaaaa aatcttt 3267
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ggcaccatat tcattttgca ggtgaaattc ctgagatgta aggagctgct gtgacttgct 60
caaggcctta tatcgagtaa acggtagtgc tggggcttag acgcaggtgt tctgatttat 120
agttcaaaac ctctatcaat gagagagcaa tctcctggta atgtgataga tttcccaact 180
taatgccaac ataccataaa cctcccattc tgctaatgcc cagcctaagt tggggagacc 240
actccagatt ccaagatgta cagtttgctt tgctgggcct ttttcccatg cctgccttta 300
ctctgccaga gttatattgc tggggttttg aagaagatcc tattaaataa aagaataagc 360
agtattatta agtagccctg catttcaggt ttccttgagt ggcaggccag gcctggccgt 420
gaacgttcac tgaaatcatg gcctcttggc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 480
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 540
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 600
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 660
gaattcgggc ggagttaggg cggagccaat cagcgtgcgc cgttccgaaa gttgcctttt 720
atggctgggc ggagaatggg cggtgaacgc cgatgattat ataaggacgc gccgggtgtg 780
gcacagctag ttccgtcgca gccgggattt gggtcgcggt tcttgtttgt ggatccctgt 840
gatcgtcact tgacagtaag tcactgactg tctatgcctg ggaaagggtg ggcaggagat 900
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tctgagactg agctgtgccg ctagcggctt ctccctgtct agctcctact ggatctcttg 1560
ggtgcgccag gctccaggca agggactgga gtggatcggc agcatcgact ccggctctgt 1620
gggcatcacc tactatgcca catgggtgaa gggccggttt accatctcca gggacaactc 1680
taagaataca ctgtatctgc agatgaactc tctgcgggcc gaggataccg ccgtgtacta 1740
ttgcgccagg cacggcgaca attgggctct ggatctgtgg ggacagggca ccctggtgac 1800
agtgtctagc accactactc ccgctccaag gccacccacc cctgccccga ccatcgcctc 1860
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Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu
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Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys
20 25 30
Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val
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Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu
50 55 60
Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
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Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln
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Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly
115 120 125
Arg Ala
130
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 90
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Gln Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
85 90 95
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
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Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
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Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
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Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ala Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Ser Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Tyr Ser Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
115 120 125
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
130 135 140
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
145 150 155 160
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr
165 170 175
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Gln Asp Ser Arg Tyr
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Ala Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
195 200 205
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
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Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
225 230 235 240
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
245 250 255
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
260 265 270
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
275 280 285
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
290 295 300
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
305 310 315 320
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
325 330 335
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
340 345 350
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
355 360 365
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu
370 375 380
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
385 390 395 400
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
405 410 415
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
420 425 430
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
435 440 445
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
450 455 460
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
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Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
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Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 95
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
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Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala
245 250 255
Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg
260 265 270
Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly
275 280 285
Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr
290 295 300
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
305 310 315 320
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp
325 330 335
Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
340 345 350
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
355 360 365
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
370 375 380
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
385 390 395 400
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
405 410 415
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln
420 425 430
Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
435 440 445
Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
450 455 460
Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<220>
<223> 合成的
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
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Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
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65 70 75 80
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<220>
<223> 合成的
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 98
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211> 207
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 102
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<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 103
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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<210> 104
<211> 205
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 104
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 105
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Gly Tyr Ile Arg Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Asn Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Pro Asp
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Gln
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Gln Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Gln Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ala Pro Glu Ser Ser
195 200 205
<210> 106
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 106
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Ser Ile Asp Ser Gly Ser Val Gly Ile Thr Tyr Tyr Ala Thr
50 55 60
Trp Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg His Gly Asp Asn Trp Ala Leu Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly
<210> 107
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 107
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 108
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 108
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtcag 60
gtgcagcttg tgcagtctgg ggcagaagtg aagaagcctg ggtctagtgt caaggtgtca 120
tgcaaggcta gcgggttcgc ctttactgac tactacatcc actgggtgcg gcaggctccc 180
ggacaagggt tggagtggat gggatggatc tccccaggca atgtcaacac aaagtacaac 240
gagaacttca aaggccgcgt caccattacc gccgacaaga gcacctccac agcctacatg 300
gagctgtcca gcctcagaag cgaggacact gccgtctact actgtgccag ggatgggtac 360
tccctgtatt actttgatta ctggggccag ggcacactgg tgacagtgag ctccgcgtcg 420
accaagggcc catccgtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcctggaac 540
tcaggcgctc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagagttga gcccaaatct 720
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aagccgccgg gggaccgtca 780
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080
aaagggcagc cccgagaacc acaggtctac accctgcccc catgccggga ggagatgacc 1140
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380
agcttaagcc tgtctccggg ttaatag 1407
<210> 109
<211> 1422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 109
caggtgcagc ttgtgcagtc tggggcagaa gtgaagaagc ctgggtctag tgtcaaggtg 60
tcatgcaagg ctagcgggtt cgcctttact gactactaca tccactgggt gcggcaggct 120
cccggacaag ggttggagtg gatgggatgg atctccccag gcaatgtcaa cacaaagtac 180
aacgagaact tcaaaggccg cgtcaccatt accgccgaca agagcacctc cacagcctac 240
atggagctgt ccagcctcag aagcgaggac actgccgtct actactgtgc cagggatggg 300
tactccctgt attactttga ttactggggc cagggcacac tggtgacagt gctggaggac 360
ctgaagaacg tgttccctcc cgaggtggcc gtgttcgaac ccagcgaggc cgagatcagc 420
cacacccaga aggccaccct ggtgtgtctg gccaccggct tctaccccga ccacgtggag 480
ctgagctggt gggtgaacgg caaggaggtg cacagcggcg tgtgtaccga ccctcagccc 540
ctgaaggagc agcccgccct gcaggacagc aggtacgccc tgagcagcag gctgagagtg 600
agcgccacct tctggcagaa ccccaggaac cacttcaggt gccaggtgca gttctacggc 660
ctgagcgaga acgacgagtg gacccaggac agggccaagc ccgtgaccca gatcgtgagc 720
gctgaggcct ggggcagagc ctctgacaaa actcacacat gcccaccgtg tccagcacct 780
gaagccgccg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtcta caccctgccc 1140
ccatgccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc 1200
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1260
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 1320
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380
cacaaccact acacgcagaa gagcttaagc ctgtctccgg gt 1422
<210> 110
<211> 1485
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 110
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtgag 60
gtgcagcttg tgcagtctgg ggcagaagtg aagaagcctg ggtctagtgt caaggtgtca 120
tgcaaggcta gcgggttcgc ctttactgac tactacatcc actgggtgcg gcaggctccc 180
ggacaagggt tggagtggat gggatggatc tccccaggca atgtcaacac aaagtacaac 240
gagaacttca aaggccgcgt caccattacc gccgacaaga gcacctccac agcctacatg 300
gagctgtcca gcctcagaag cgaggacact gccgtctact actgtgccag ggatgggtac 360
tccctgtatt actttgatta ctggggccag ggcacactgg tgacagtgct ggaggacctg 420
aagaacgtgt tccctcccga ggtggccgtg ttcgaaccca gcgaggccga gatcagccac 480
acccagaagg ccaccctggt gtgtctggcc accggcttct accccgacca cgtggagctg 540
agctggtggg tgaacggcaa ggaggtgcac agcggcgtgt gtaccgaccc tcagcccctg 600
aaggagcagc ccgccctgca ggacagcagg tacgccctga gcagcaggct gagagtgagc 660
gccaccttct ggcagaaccc caggaaccac ttcaggtgcc aggtgcagtt ctacggcctg 720
agcgagaacg acgagtggac ccaggacagg gccaagcccg tgacccagat cgtgagcgct 780
gaggcctggg gcagagcctc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgtcc agcacctgaa 840
gccgccgggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 900
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 960
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1020
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1080
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1140
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtctacac cctgccccca 1200
tgccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgtggt gcctggtcaa aggcttctat 1260
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1320
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1380
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1440
aaccactaca cgcagaagag cttaagcctg tctccgggtt aatag 1485
<210> 111
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 111
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtgag 60
gtgcagctcg tcgagtccgg aggaggttta gtccaacccg gtggatcttt aaggctgtct 120
tgtgctgctt ccggcttttc tttatcctcc agctactgga tctcttgggt gcggcaagct 180
cccggaaagg gactcgagtg gatcggctcc atcgattccg gatccgtggg cattacctac 240
tacgccacat gggtgaaagg tcgtttcaca atctcccggg acaactccaa gaacaccctc 300
tatttacaga tgaactcttt aagggccgag gataccgctg tgtactactg tgcccggcac 360
ggcgacaatt gggctttaga tctgtggggc caaggtacac tggtgacagt gagcagcgcg 420
tcgaccaagg gcccatccgt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcctgg 540
aactcaggcg ctctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc cgggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtc tgcaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gagctgcgcg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctcgttagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcttaa gcctgtctcc gggttaatag 1410
<210> 112
<211> 2046
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 112
gaggtgcagc tcgtcgagtc cggaggaggt ttagtccaac ccggtggatc tttaaggctg 60
tcttgtgctg cttccggctt ttctttatcc tccagctact ggatctcttg ggtgcggcaa 120
gctcccggaa agggactcga gtggatcggc tccatcgatt ccggatccgt gggcattacc 180
tactacgcca catgggtgaa aggtcgtttc acaatctccc gggacaactc caagaacacc 240
ctctatttac agatgaactc tttaagggcc gaggataccg ctgtgtacta ctgtgcccgg 300
cacggcgaca attgggcttt agatctgtgg ggccaaggta cactggtgac agtgagcagc 360
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 480
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg gtggaggtgg cagtggaggc ggaggatctg aggtgcagct cgtcgagtcc 720
ggaggaggtt tagtccaacc cggtggatct ttaaggctgt cttgtgctgc ttccggcttt 780
tctttatcct ccagctactg gatctcttgg gtgcggcaag ctcccggaaa gggactcgag 840
tggatcggct ccatcgattc cggatccgtg ggcattacct actacgccac atgggtgaaa 900
ggtcgtttca caatctcccg ggacaactcc aagaacaccc tctatttaca gatgaactct 960
ttaagggccg aggataccgc tgtgtactac tgtgcccggc acggcgacaa ttgggcttta 1020
gatctgtggg gccaaggtac actggtgaca gtgagcagcg cgtcgaccaa gggcccatcc 1080
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 1140
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcct ggaactcagg cgctctgacc 1200
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 1260
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 1320
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 1380
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gccgggggac cgtcagtctt cctcttcccc 1440
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 1500
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1560
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1620
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1680
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1740
gaaccacagg tctgcaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1800
ctgagctgcg cggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1860
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1920
ttcctcgtta gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1980
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagctt aagcctgtct 2040
ccgggt 2046
<210> 113
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 113
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtgag 60
gtgcagctcg tcgagtccgg aggaggttta gtccaacccg gtggatcttt aaggctgtct 120
tgtgctgctt ccggcttttc tttatcctcc agctactgga tctcttgggt gcggcaagct 180
cccggaaagg gactcgagtg gatcggctcc atcgattccg gatccgtggg cattacctac 240
tacgccacat gggtgaaagg tcgtttcaca atctcccggg acaactccaa gaacaccctc 300
tatttacaga tgaactcttt aagggccgag gataccgctg tgtactactg tgcccggcac 360
ggcgacaatt gggctttaga tctgtggggc caaggtacac tggtgacagt gctggaggac 420
ctgaagaacg tgttccctcc cgaggtggcc gtgttcgaac ccagcgaggc cgagatcagc 480
cacacccaga aggccaccct ggtgtgtctg gccaccggct tctaccccga ccacgtggag 540
ctgagctggt gggtgaacgg caaggaggtg cacagcggcg tgtgtaccga ccctcagccc 600
ctgaaggagc agcccgccct gcaggacagc aggtacgccc tgagcagcag gctgagagtg 660
agcgccacct tctggcagaa ccccaggaac cacttcaggt gccaggtgca gttctacggc 720
ctgagcgaga acgacgagtg gacccaggac agggccaagc ccgtgaccca gatcgtgagc 780
gctgaggcct ggggcagagc ctctgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 840
gaagccgccg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 900
atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 960
gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 1020
gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1080
tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1140
gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtctg caccctgccc 1200
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga gctgcgcggt caaaggcttc 1260
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1320
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tcgttagcaa gctcaccgtg 1380
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1440
cacaaccact acacgcagaa gagcttaagc ctgtctccgg gttaatag 1488
<210> 114
<211> 2196
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 114
gaggtgcagc tcgtcgagtc cggaggaggt ttagtccaac ccggtggatc tttaaggctg 60
tcttgtgctg cttccggctt ttctttatcc tccagctact ggatctcttg ggtgcggcaa 120
gctcccggaa agggactcga gtggatcggc tccatcgatt ccggatccgt gggcattacc 180
tactacgcca catgggtgaa aggtcgtttc acaatctccc gggacaactc caagaacacc 240
ctctatttac agatgaactc tttaagggcc gaggataccg ctgtgtacta ctgtgcccgg 300
cacggcgaca attgggcttt agatctgtgg ggccaaggta cactggtgac agtgctggag 360
gacctgaaga acgtgttccc tcccgaggtg gccgtgttcg aacccagcga ggccgagatc 420
agccacaccc agaaggccac cctggtgtgt ctggccaccg gcttctaccc cgaccacgtg 480
gagctgagct ggtgggtgaa cggcaaggag gtgcacagcg gcgtgtgtac cgaccctcag 540
cccctgaagg agcagcccgc cctgcaggac agcaggtacg ccctgagcag caggctgaga 600
gtgagcgcca ccttctggca gaaccccagg aaccacttca ggtgccaggt gcagttctac 660
ggcctgagcg agaacgacga gtggacccag gacagggcca agcccgtgac ccagatcgtg 720
agcgctgagg cctggggcag aggtggaggt ggcagtggag gcggaggatc tgaggtgcag 780
ctcgtcgagt ccggaggagg tttagtccaa cccggtggat ctttaaggct gtcttgtgct 840
gcttccggct tttctttatc ctccagctac tggatctctt gggtgcggca agctcccgga 900
aagggactcg agtggatcgg ctccatcgat tccggatccg tgggcattac ctactacgcc 960
acatgggtga aaggtcgttt cacaatctcc cgggacaact ccaagaacac cctctattta 1020
cagatgaact ctttaagggc cgaggatacc gctgtgtact actgtgcccg gcacggcgac 1080
aattgggctt tagatctgtg gggccaaggt acactggtga cagtgctgga ggacctgaag 1140
aacgtgttcc ctcccgaggt ggccgtgttc gaacccagcg aggccgagat cagccacacc 1200
cagaaggcca ccctggtgtg tctggccacc ggcttctacc ccgaccacgt ggagctgagc 1260
tggtgggtga acggcaagga ggtgcacagc ggcgtgtgta ccgaccctca gcccctgaag 1320
gagcagcccg ccctgcagga cagcaggtac gccctgagca gcaggctgag agtgagcgcc 1380
accttctggc agaaccccag gaaccacttc aggtgccagg tgcagttcta cggcctgagc 1440
gagaacgacg agtggaccca ggacagggcc aagcccgtga cccagatcgt gagcgctgag 1500
gcctggggca gagcctctga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1560
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1620
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1680
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1740
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1800
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1860
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tctgcaccct gcccccatcc 1920
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgagctgcg cggtcaaagg cttctatccc 1980
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 2040
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctcgtta gcaagctcac cgtggacaag 2100
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 2160
cactacacgc agaagagctt aagcctgtct ccgggt 2196
<210> 115
<211> 2178
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 115
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtgag 60
gtgcagctcg tcgagtccgg aggaggttta gtccaacccg gtggatcttt aaggctgtct 120
tgtgctgctt ccggcttttc tttatcctcc agctactgga tctcttgggt gcggcaagct 180
cccggaaagg gactcgagtg gatcggctcc atcgattccg gatccgtggg cattacctac 240
tacgccacat gggtgaaagg tcgtttcaca atctcccggg acaactccaa gaacaccctc 300
tatttacaga tgaactcttt aagggccgag gataccgctg tgtactactg tgcccggcac 360
ggcgacaatt gggctttaga tctgtggggc caaggtacac tggtgacagt gctggaggac 420
ctgaagaacg tgttccctcc cgaggtggcc gtgttcgaac ccagcgaggc cgagatcagc 480
cacacccaga aggccaccct ggtgtgtctg gccaccggct tctaccccga ccacgtggag 540
ctgagctggt gggtgaacgg caaggaggtg cacagcggcg tgtgtaccga ccctcagccc 600
ctgaaggagc agcccgccct gcaggacagc aggtacgccc tgagcagcag gctgagagtg 660
agcgccacct tctggcagaa ccccaggaac cacttcaggt gccaggtgca gttctacggc 720
ctgagcgaga acgacgagtg gacccaggac agggccaagc ccgtgaccca gatcgtgagc 780
gcggaggcct ggggcagagg tggaggtggc agtggaggcg gaggatctca ggtgcagctt 840
gtgcagtctg gggcagaagt gaagaagcct gggtctagtg tcaaggtgtc atgcaaggct 900
agcgggttcg cctttactga ctactacatc cactgggtgc ggcaggctcc cggacaaggg 960
ttggagtgga tgggatggat ctccccaggc aatgtcaaca caaagtacaa cgagaacttc 1020
aaaggccgcg tcaccattac cgccgacaag agcacctcca cagcctacat ggagctgtcc 1080
agcctcagaa gcgaggacac tgccgtctac tactgtgcca gggatgggta ctccctgtat 1140
tactttgatt actggggcca gggcacactg gtgacagtga gctccgcgtc gaccaagggc 1200
ccatccgtct tccccctggc accctcctcc aagagcacct ctgggggcac agcggccctg 1260
ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcctggaa ctcaggcgct 1320
ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 1380
agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg 1440
aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa 1500
actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaagccgccg ggggaccgtc agtcttcctc 1560
ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 1620
gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1680
gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1740
gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1800
gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1860
ccccgagaac cacaggtcta caccctgccc ccatgccggg aggagatgac caagaaccag 1920
gtcagcctgt ggtgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1980
agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 2040
tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc 2100
ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcttaagc 2160
ctgtctccgg gttaatag 2178
<210> 116
<211> 2121
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 116
gaggtgcagc tcgtcgagtc cggaggaggt ttagtccaac ccggtggatc tttaaggctg 60
tcttgtgctg cttccggctt ttctttatcc tccagctact ggatctcttg ggtgcggcaa 120
gctcccggaa agggactcga gtggatcggc tccatcgatt ccggatccgt gggcattacc 180
tactacgcca catgggtgaa aggtcgtttc acaatctccc gggacaactc caagaacacc 240
ctctatttac agatgaactc tttaagggcc gaggataccg ctgtgtacta ctgtgcccgg 300
cacggcgaca attgggcttt agatctgtgg ggccaaggta cactggtgac agtgagcagc 360
gcgtcgacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcc 480
tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 660
aaatcttgtg gtggaggtgg cagtggaggc ggaggatctc aggtgcagct tgtgcagtct 720
ggggcagaag tgaagaagcc tgggtctagt gtcaaggtgt catgcaaggc tagcgggttc 780
gcctttactg actactacat ccactgggtg cggcaggctc ccggacaagg gttggagtgg 840
atgggatgga tctccccagg caatgtcaac acaaagtaca acgagaactt caaaggccgc 900
gtcaccatta ccgccgacaa gagcacctcc acagcctaca tggagctgtc cagcctcaga 960
agcgaggaca ctgccgtcta ctactgtgcc agggatgggt actccctgta ttactttgat 1020
tactggggcc agggcacact ggtgacagtg ctggaggacc tgaagaacgt gttccctccc 1080
gaggtggccg tgttcgaacc cagcgaggcc gagatcagcc acacccagaa ggccaccctg 1140
gtgtgtctgg ccaccggctt ctaccccgac cacgtggagc tgagctggtg ggtgaacggc 1200
aaggaggtgc acagcggcgt gtgtaccgac cctcagcccc tgaaggagca gcccgccctg 1260
caggacagca ggtacgccct gagcagcagg ctgagagtga gcgccacctt ctggcagaac 1320
cccaggaacc acttcaggtg ccaggtgcag ttctacggcc tgagcgagaa cgacgagtgg 1380
acccaggaca gggccaagcc cgtgacccag atcgtgagcg ctgaggcctg gggcagagcc 1440
tctgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgt ccagcacctg aagccgccgg gggaccgtca 1500
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 1560
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 1620
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 1680
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1740
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1800
aaagggcagc cccgagaacc acaggtctac accctgcccc catgccggga ggagatgacc 1860
aagaaccagg tcagcctgtg gtgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1920
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1980
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 2040
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 2100
agcttaagcc tgtctccggg t 2121
<210> 117
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 117
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggatcc 60
cgatgcgata tcgtgatgac ccagagccca gactcccttg ctgtctccct cggcgaaaga 120
gcaaccatca actgcaagag ctcccaaagc ctgctgaact ccaggaccag gaagaattac 180
ctggcctggt atcagcagaa gcccggccag cctcctaagc tgctcatcta ctgggcctcc 240
acccggcagt ctggggtgcc cgatcggttt agtggatctg ggagcgggac agacttcaca 300
ttgacaatta gctcactgca ggccgaggac gtggccgtct actactgtac tcagagccac 360
actctccgca cattcggcgg agggactaaa gtggagatta agcgtacggt ggctgcacca 420
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc 660
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720
tgttaatag 729
<210> 118
<211> 621
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 118
gatatcgtga tgacccagag cccagactcc cttgctgtct ccctcggcga aagagcaacc 60
atcaactgca agagctccca aagcctgctg aactccagga ccaggaagaa ttacctggcc 120
tggtatcagc agaagcccgg ccagcctcct aagctgctca tctactgggc ctccacccgg 180
cagtctgggg tgcccgatcg gtttagtgga tctgggagcg ggacagactt cacattgaca 240
attagctcac tgcaggccga ggacgtggcc gtctactact gtactcagag ccacactctc 300
cgcacattcg gcggagggac taaagtggag attaagcccg acatccagaa ccccgacccc 360
gccgtgtacc agctgagaga cagcaagagc agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac 420
ttcgacagcc agacccaggt gagccagagc aaggactccg acgtgtatat caccgacaag 480
tgcgtgctgg acatgaggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggagccag 540
aagagcgact tcgcctgcgc caacgccttc cagaacagca tcatccccga ggacaccttc 600
ttccccagcc ccgagagcag c 621
<210> 119
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 119
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggatcc 60
cgatgcgata tcgtgatgac ccagagccca gactcccttg ctgtctccct cggcgaaaga 120
gcaaccatca actgcaagag ctcccaaagc ctgctgaact ccaggaccag gaagaattac 180
ctggcctggt atcagcagaa gcccggccag cctcctaagc tgctcatcta ctgggcctcc 240
acccggcagt ctggggtgcc cgatcggttt agtggatctg ggagcgggac agacttcaca 300
ttgacaatta gctcactgca ggccgaggac gtggccgtct actactgtac tcagagccac 360
actctccgca cattcggcgg agggactaaa gtggagatta agcccgacat ccagaacccc 420
gaccccgccg tgtaccagct gagagacagc aagagcagcg acaagagcgt gtgcctgttc 480
accgacttcg acagccagac ccaggtgagc cagagcaagg actccgacgt gtatatcacc 540
gacaagtgcg tgctggacat gaggagcatg gacttcaaga gcaacagcgc cgtggcctgg 600
agccagaaga gcgacttcgc ctgcgccaac gccttccaga acagcatcat ccccgaggac 660
accttcttcc ccgcccccga gagcagctaa tag 693
<210> 120
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 120
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggatcc 60
cgatgcgaca tccagatgac ccagtcccct agcacactgt ccgccagcgt gggcgatcgt 120
gtgaccatca cttgtcgggc ttcccagagc atcagcagct ggctggcttg gtatcagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tacaaggctt ccactttagc tagcggcgtg 240
ccttctcgtt tctccggatc cggatccggc accgagttca ctttaaccat cagctcttta 300
cagcccgacg acttcgccac atactactgc cagcacggct acatccgggg cgatttagac 360
aatgtgttcg gcggcggcac caaggtcgag atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc 420
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 480
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 540
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 600
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 660
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttaa 720
tag 723
<210> 121
<211> 615
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 121
gacatccaga tgacccagtc ccctagcaca ctgtccgcca gcgtgggcga tcgtgtgacc 60
atcacttgtc gggcttccca gagcatcagc agctggctgg cttggtatca gcagaagccc 120
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gcttccactt tagctagcgg cgtgccttct 180
cgtttctccg gatccggatc cggcaccgag ttcactttaa ccatcagctc tttacagccc 240
gacgacttcg ccacatacta ctgccagcac ggctacatcc ggggcgattt agacaatgtg 300
ttcggcggcg gcaccaaggt cgagatcaag cccgacatcc agaaccccga ccccgccgtg 360
taccagctga gagacagcaa gagcagcgac aagagcgtgt gcctgttcac cgacttcgac 420
agccagaccc aggtgagcca gagcaaggac tccgacgtgt atatcaccga caagtgcgtg 480
ctggacatga ggagcatgga cttcaagagc aacagcgccg tggcctggag ccagaagagc 540
gacttcgcct gcgccaacgc cttccagaac agcatcatcc ccgaggacac cttcttcccc 600
agccccgaga gcagc 615
<210> 122
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 122
atggacatgc gcgtgcccgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggtt ccccggatcc 60
cgatgcgaca tccagatgac ccagtcccct agcacactgt ccgccagcgt gggcgatcgt 120
gtgaccatca cttgtcgggc ttcccagagc atcagcagct ggctggcttg gtatcagcag 180
aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tacaaggctt ccactttagc tagcggcgtg 240
ccttctcgtt tctccggatc cggatccggc accgagttca ctttaaccat cagctcttta 300
cagcccgacg acttcgccac atactactgc cagcacggct acatccgggg cgatttagac 360
aatgtgttcg gcggcggcac caaggtcgag atcaagcccg acatccagaa ccccgacccc 420
gccgtgtacc agctgagaga cagcaagagc agcgacaaga gcgtgtgcct gttcaccgac 480
ttcgacagcc agacccaggt gagccagagc aaggactccg acgtgtatat caccgacaag 540
tgcgtgctgg acatgaggag catggacttc aagagcaaca gcgccgtggc ctggagccag 600
aagagcgact tcgcctgcgc caacgccttc cagaacagca tcatccccga ggacaccttc 660
ttccccgccc ccgagagcag ctaatag 687
<210> 123
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 123
atggagtttg ggctgagctg gctttttctt gtcgcgattc ttaagggtgt acagtgtgag 60
gtgcagctcg tcgagtccgg aggaggttta gtccaacccg gtggatcttt aaggctgtct 120
tgtgctgctt ccggcttttc tttatcctcc agctactgga tctcttgggt gcggcaagct 180
cccggaaagg gactcgagtg gatcggctcc atcgattccg gatccgtggg cattacctac 240
tacgccacat gggtgaaagg tcgtttcaca atctcccggg acaactccaa gaacaccctc 300
tatttacaga tgaactcttt aagggccgag gataccgctg tgtactactg tgcccggcac 360
ggcgacaatt gggctttaga tctgtggggc caaggtacac tggtgacagt gagcagcgct 420
agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 480
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ccgtcctaca gtcctcagga 600
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 660
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagcgggt tgagcccaaa 720
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaagccgc agggggaccg 780
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 840
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 900
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 960
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 1020
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1080
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg 1140
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1200
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1260
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1320
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1380
aagagcctct ccctgtctcc gggttgatga 1410
<210> 124
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 124
atggtgctcg ccgcccctct cctgctcgga tttctcctgc tggctctcga actgagaccc 60
aggggagagg ccgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga agccgccggg 120
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 180
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 240
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 300
aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 360
aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 420
tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtctgca ccctgccccc atcccgggag 480
gagatgacca agaaccaggt cagcctgagc tgcgcggtca aaggcttcta tcccagcgac 540
atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 600
gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc gttagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 660
tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 720
acgcagaaga gcttaagcct gtctccgggt taatag 756

Claims (79)

1.一种分离的抗LILRB4抗体或其抗原结合片段，其包含：
a)重链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的重链互补决定区(HC-CDR)1、具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HC-CDR2和具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HC-CDR3；以及
b)轻链可变区，所述轻链可变区包含具有带有氨基酸残基NS处的突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链互补决定区(LC-CDR)1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LC-CDR2和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的LC-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区具有与SEQ IDNO:1至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:27至少约90％相同的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区具有SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含免疫球蛋白恒定区，任选地Ig的恒定区或任选地人IgG的恒定区。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是骆驼化单结构域抗体、双功能抗体、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv'、Fv片段、Fab、Fab'、F(ab')2、双特异性抗体、ds双功能抗体、纳米抗体、结构域抗体或双价抗体。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其是针对LILRB4和CD3的双特异性抗体。
9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其与一个或多个缀合物部分连接。
10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述缀合物部分包含清除调节剂、毒素、可检测标记、化疗剂、细胞因子或纯化部分。
11.一种药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
12.一种分离的多核苷酸，其编码根据权利要求1至10所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种载体，其包含根据权利要求12所述的分离的多核苷酸。
14.一种宿主细胞，其包含根据权利要求13所述的载体。
15.一种表达根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在表达根据权利要求13所述的载体的条件下培养根据权利要求14所述的宿主细胞。
16.一种治疗或改善受试者的癌症的效应的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求11所述的药物组合物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症选自下组：肾上腺癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、结直肠癌、食道癌、眼癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡细胞肺癌、间皮瘤、头颈癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤、口腔癌、卵巢癌、宫颈癌、阴茎癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌、肉瘤、睾丸癌、甲状腺癌、子宫癌、阴道癌。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症具有免疫抑制性微环境，并且其中所述抗体或其抗原结合片段杀死至少一种髓源性抑制细胞(MDSC)。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症选自下组：淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、霍奇金氏病、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞性/成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中静脉内、动脉内、肿瘤内或皮下施用所述抗体或其抗原结合片段。
22.根据权利要求16至21中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用选自下组的一种或多种药物：拓扑异构酶抑制剂、蒽环类拓扑异构酶抑制剂、蒽环霉素、柔红霉素、核苷代谢抑制剂、阿糖胞苷、降甲基化剂、低剂量阿糖胞苷(LDAC)、柔红霉素和阿糖胞苷的组合、注射用柔红霉素和阿糖胞苷脂质体、
Figure FDA0003938659020000031
氮杂胞苷、
Figure FDA0003938659020000032
地西他滨、全反式视黄酸(ATRA)、砷、三氧化二砷、组胺二盐酸盐、
Figure FDA0003938659020000033
白介素-2、阿地白介素、
Figure FDA0003938659020000034
吉妥单抗奥唑米星、
Figure FDA0003938659020000035
FLT-3抑制剂、米哚妥林、
Figure FDA0003938659020000036
氯法拉滨、法呢基转移酶抑制剂、地西他滨、IDH1抑制剂、艾伏尼布、
Figure FDA0003938659020000037
IDH2抑制剂、依那昔布、
Figure FDA0003938659020000038
平滑(SMO)抑制剂、格拉吉布、精氨酸酶抑制剂、IDO抑制剂、艾卡哚司他、BCL-2抑制剂、维奈托克、
Figure FDA0003938659020000039
铂复合物衍生物、奥沙利铂、激酶抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、PI3激酶抑制剂、BTK抑制剂、依鲁替尼、
Figure FDA00039386590200000310
阿卡替尼、
Figure FDA00039386590200000311
赞布替尼、PD-1抗体、PD-L1抗体、CTLA-4抗体、LAG3抗体、ICOS抗体、TIGIT抗体、TIM3抗体、CD40抗体、4-1BB抗体、CD47抗体、SIRP1α抗体或融合蛋白、E-选择蛋白的拮抗剂、与肿瘤抗原结合的抗体、与T细胞表面标志物结合的抗体、与髓样细胞或NK细胞表面标志物结合的抗体、烷化剂、亚硝基脲剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、源自植物的生物碱、激素疗法药物、激素拮抗剂、芳香酶抑制剂和P-糖蛋白抑制剂。
23.一种用于治疗或改善受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或根据权利要求11所述的药物组合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自下组：获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克罗恩氏病、德戈斯氏病、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯提耳氏病)、幼年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬化症(PSS)、全身性硬化症(SS)、舍格伦综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、科恩氏病、肠粘膜炎症、与结肠炎相关的消耗性疾病、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病、阿尔茨海默氏病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病、呼吸机诱导的肺损伤、病毒感染和自身免疫性糖尿病。
25.一种杀死受试者体内的细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞是单核细胞、浆细胞样树突状细胞(pDC)、巨噬细胞、髓源性抑制细胞(MDSC)、单核细胞衍生的巨噬细胞、单核细胞衍生的树突状细胞或癌细胞。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞具有抗原呈递功能。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述细胞具有在所述细胞的表面上表达的至少2,000个、至少50,000个、至少100,000个或至少150,000个拷贝的LILRB4蛋白。
29.根据权利要求25所述的方法，其中通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)杀死所述细胞。
30.根据权利要求25所述的方法，其中通过T细胞细胞毒性杀死所述细胞。
31.一种激活T细胞的方法，所述方法包括使所述T细胞与根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。
32.一种激活T细胞的方法，所述方法包括在存在癌细胞的情况下使所述T细胞与根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述癌细胞增加抗原呈递活性。
34.根据权利要求31至32所述的方法，其中所述T细胞是在体外培养的。
35.一种检测样品或受试者中的癌细胞或癌症干细胞的方法，所述方法包括：
(a)使受试者或来自所述受试者的样品与根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；以及
(b)检测所述抗体与所述受试者或样品中的癌细胞或癌症干细胞的结合。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述样品是体液或活检。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述样品是血液、痰、眼泪、唾液、粘液、血清、尿液或粪便。
38.根据权利要求35所述的方法，其中检测包括免疫组织化学、流式细胞术或FACS、免疫测定(包括ELISA、RIA等)或蛋白质印迹。
39.根据权利要求35所述的方法，其进一步包括：第二次或额外数次执行步骤(a)和(b)；并且与第一次比较，确定检测水平的变化。
40.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗受试者的癌症的药物中的用途。
41.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述试剂盒能够用于检测LILRB4。
42.一种嵌合抗原受体(CAR)蛋白，其包含：
a)重链可变区，所述重链可变区包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的HC-CDR2以及具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的HC-CDR3；以及
b)轻链可变区，所述轻链可变区包含具有带有氨基酸残基NS处的突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的LC-CDR1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的LC-CDR2以及具有SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列的LC-CDR3。
43.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其中所述LC-CDR1具有SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
44.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其中所述重链可变区具有与SEQ ID NO:1至少约90％相同的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有与SEQ ID NO:27至少约90％相同的氨基酸序列。
45.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其中所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；并且其中所述轻链可变区具有SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
46.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其包含具有与SEQ ID NO:66或68至少85％、90％、95％或99％相同的氨基酸序列的单链可变片段(scFv)。
47.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其包含具有与SEQ ID NO:66或68相同的氨基酸序列的scFv。
48.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其进一步包含CD8α跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
49.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其进一步包含4-1BB胞内共刺激信号传导结构域或CD28胞内共刺激信号传导结构域。
50.根据权利要求42所述的CAR蛋白，其进一步包含CD3ζ胞内T细胞信号传导结构域。
51.一种多核苷酸分子，其编码根据权利要求42至50中任一项所述的CAR蛋白。
52.根据权利要求51所述的多核苷酸分子，其进一步包含在真核细胞中具有活性的启动子。
53.根据权利要求51所述的多核苷酸分子，其进一步定义为表达载体。
54.一种经工程化的细胞，其包含根据权利要求51所述的多核苷酸分子。
55.根据权利要求54所述的细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞或巨噬细胞。
56.一种治疗或改善有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用细胞疗法，所述细胞疗法包括治疗有效量的根据权利要求54或55所述的细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述细胞疗法局部施用于癌症部位、区域施用于癌症部位或全身性施用。
58.根据权利要求57所述的方法，其进一步包括向所述人受试者施用第二癌症疗法。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述第二癌症疗法是化疗、免疫疗法、放射疗法、激素疗法或外科手术。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述第二癌症疗法与所述细胞疗法同时施用。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述第二癌症疗法在所述细胞疗法之前或之后施用。
62.根据权利要求57所述的方法，其进一步包括向所述人受试者第二次施用有效量的一种或多种根据权利要求54或55所述的细胞。
63.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症是转移性、复发性或耐药性癌症。
64.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症是AML。
65.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症选自下组：前体B急性淋巴细胞性白血病(前体B ALL)、B细胞白血病、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性骨髓单核细胞性白血病(CMML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、骨髓增殖性赘生物和母细胞性浆细胞样树突状细胞赘生物(BPDCN)。
66.根据权利要求56所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌、肺癌、胰腺癌或前列腺癌。
67.一种用于治疗或改善受试者的自身免疫性疾病或炎性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用细胞疗法，所述细胞疗法包括治疗有效量的根据权利要求54或55所述的细胞。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述自身免疫性疾病或炎性疾病选自下组：获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂综合征、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性淋巴组织增生综合征(ALPS)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞氏病、心肌病、口炎性腹泻-疱疹样皮炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征(CFIDS)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIPD)、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、肢端硬皮综合征、克罗恩氏病、德戈斯氏病、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯氏病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、胰岛素依赖型糖尿病、幼年型慢性关节炎(斯提耳氏病)、幼年型类风湿性关节炎、美尼尔氏病、混合性结缔组织病、多发性硬化、重症肌无力、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、银屑病、银屑病关节炎、雷诺氏现象、莱特尔氏综合征、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬化症(PSS)、全身性硬化症(SS)、舍格伦综合征、僵人综合征、全身性红斑狼疮(SLE)、高安氏动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、炎性肠病(IBD)、溃疡性结肠炎、科恩氏病、肠粘膜炎症、与结肠炎相关的消耗性疾病、葡萄膜炎、白癜风和韦格纳氏肉芽肿病、阿尔茨海默氏病、哮喘、特应性过敏、过敏、动脉粥样硬化、支气管哮喘、湿疹、肾小球肾炎、移植物抗宿主病、溶血性贫血、骨关节炎、败血症、中风、组织和器官移植、血管炎、糖尿病性视网膜病、呼吸机诱导的肺损伤、病毒感染和自身免疫性糖尿病。
69.一种双特异性抗体或抗原结合片段，其能够与LILRB4和CD3结合。
70.根据权利要求69所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其包含
(a)第一抗原结合区，所述第一抗原结合区包含第一轻链可变(VL)结构域和第一重链可变(VH)结构域；以及
(b)第二抗原结合区，所述第二抗原结合区包含第二VL结构域和第二VH结构域，
其中所述第一抗原结合区能够与LILRB4结合，并且所述第二抗原结合区能够与CD3结合，或反之亦然。
71.根据权利要求70所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中所述第一VL结构域和所述第一重链可变结构域分别与第一对恒定结构域连接，并且其中所述第二VL结构域和所述第二VH结构域分别与第二对恒定结构域连接。
72.根据权利要求71所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述第一VL结构域与第一轻链恒定(CL)结构域连接，并且所述第一VH结构域与第一重链恒定结构域1(CH1)连接，或
(b)所述第一VL结构域与第一CH1结构域连接，并且所述VH结构域与第二CL结构域连接。
73.根据权利要求72所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述第二VL结构域与第二CL结构域连接，并且所述第二VH结构域与第二CH1结构域连接，或
(b)所述第二VL结构域与第二CH1结构域连接，并且所述第二VH结构域与第二CL结构域连接，或
(c)所述第二VL结构域与T细胞受体(TCR)α链恒定结构域连接，并且所述第二VH结构域与TCRβ链恒定结构域连接，或
(d)所述第二VL结构域与TCRβ链恒定结构域连接，并且所述第二VH结构域与TCRα链恒定结构域连接。
74.根据权利要求73所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中所述TCRα链恒定结构域具有S91A突变。
75.根据权利要求70所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中所述第一抗原结合区和/或所述第二抗原结合区是单链可变片段(scFv)。
76.根据权利要求70所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其进一步包含第三抗原结合区，所述第三抗原结合区包含第三VL结构域和第三VH结构域，其中所述第三抗原结合区能够与LILRB4或CD3结合。
77.根据权利要求76所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中所述第三VL结构域和所述第三重链可变结构域分别与第一对恒定结构域连接。
78.根据权利要求77所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述第三VL结构域与第三CL结构域连接，并且所述第三VH结构域与第三CH1结构域连接，或
(b)所述第三VL结构域与第三CH1结构域连接，并且所述第三VH结构域与第三CL结构域连接，或
(c)所述第三VL结构域与第二TCRα链恒定结构域连接，并且所述第三VH结构域与第二TCRβ链恒定结构域连接，或
(d)所述第三VL结构域与第二TCRβ链恒定结构域连接，并且所述第三VH结构域与第二TCRα链恒定结构域连接。
79.根据权利要求70所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中
(a)所述第一VH结构域包含具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的第一HC-CDR1、具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的第一HC-CDR2和具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的第一HC-CDR3；并且
(b)第一VL结构域包含具有带有氨基酸残基NS处的突变的SEQ ID NO:8的氨基酸序列的第一LC-CDR1、具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的第一LC-CDR2和具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的第一LC-CDR3。
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