ES2233940T3 - Induccion de tolerancia con proteinas de fusion tolerogenicas. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA METODOS Y COMPOSICIONES PARA INDUCIR Y MANTENER LA TOLERANCIA A EPITOPES O ANTIGENOS QUE CONTIENEN LOS EPITOPES. LAS COMPOSICIONES INCLUYEN CASSETTES Y VECTORES DE EXPRESION QUE INCLUYEN SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN UNA INMUNOGLOBULINA DE FUSION OPERABLEMENTE LIGADA A REGIONES DE CONTROL TRANSCRIPCIONAL Y TRANSLACIONAL FUNCIONAL EN UNA CELULA HEMOPOYETICA O LINFOIDE. LA INMUNOGLOBULINA DE FUSION INCLUYE AL MENOS UN EPITOPE TOLEROGENICO HETEROLOGO EN LA REGION VARIABLE N-TERMINAL DE LA INMUNOGLOBULINA. LAS CELULAS ESTABLEMENTE TRANSFORMADAS CON EL VECTOR DE EXPRESION SON FORMADAS Y USADAS PARA PRODUCIR LA INMUNOGLOBULINA DE FUSION. LA INVENCION ADEMAS PROPORCIONA METODOS PARA LA PROTECCION CONTRA NUEVOS EPITOPES TOLEROGENICOS Y PARA INDUCIR Y MANTENER LA TOLERANCIA. LOS METODOS DE LA INVENCION SON UTILES EN EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE RESPUESTAS AUTOINMUNES O INMUNOALERGICAS.

Description

Inducción de tolerancia con proteínas de fusión tolerogénicas.

Antecedentes de la invención

La discriminación propio/no propio es una de las piedras angulares de la inmunología. Normalmente, los individuos desarrollan tolerancia frente a los constituyentes propios durante el desarrollo temprano del sistema inmune. Sin embargo, el mantenimiento de este estado de falta de respuesta requiere la persistencia del antígeno, un hecho que implica que la inducción de la tolerancia es un proceso que dura toda la vida. Smith, Advances in Immunology, 1:67 (1961). De hecho, la desaparición de la tolerancia en individuos viejos explica el incremento de la incidencia de la autoinmunidad en poblaciones que envejecen.

Se han utilizado globulinas gamma isólogas o heterólogas como moléculas tolerogénicas transportadoras (principalmente IgG). Scott, Immunol. Rev., 43:241 (1979). Aunque las diferentes fuentes de IgG pueden variar en cuanto a su persistencia y/o a su mecanismo de inducción de la tolerancia, las IgG transportadoras han sido con mucho las más eficaces para inducir tolerancia en adultos frente a haptenos, nucleósidos y péptidos. Borel, Immunological Reviews, 50:71 (1980); y Scott, Cell Immunol., 22:311 (1976). Estos transportadores deben su tolerogenicidad superior a su persistencia in vivo y a la capacidad de los epítopos unidos químicamente a IgG de entrecruzar IgMm con los receptores Fc de las células B. Sin embargo, el entrecruzamiento químico de epítopos a IgG transportadoras está limitado por la disponibilidad de grupos amino libres y por la unión sin control del determinante añadido a zonas diferentes de la
IgG.

La tecnología de ADN recombinante puede utilizarse para construir mediante ingeniería genética moléculas que tienen epítopos heterólogos. Por ejemplo, se han expresado epítopos heterólogos de oligopéptidos con interés biológico en la flagelina bacteriana (Jennings et al., Protein Eng., 2:365 (1989)); en el antígeno de superficie de la hepatitis B (Rutgers et al., Biotechnology, 6:1065 (1988)); y en las regiones determinantes de complemento de las inmunoglobulinas (Zanetti et al., Nature, 355:476 (1992)). Se han realizado algunos intentos para ensayar la capacidad de las proteínas recombinantes de servir como antígenos para inmunizar animales y de generar respuestas inmunes frente al oligopéptido heterólogo. Sin embargo, no se ha demostrado la inducción y el mantenimiento de la tolerancia frente a oligopéptidos presentados al sistema inmune. La capacidad de mantener la tolerancia frente a un antígeno o un epítopo requiere la persistencia del epítopo in vivo.

Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar un método para inducir tolerancia estable y duradera frente a un epítopo. Existe una necesidad de desarrollar un vector que pueda proporcionar persistencia del epítopo in vivo de manera que se mantenga la tolerancia. Existe una necesidad de desarrollar un vector recombinante que codifique un polipéptido recombinante que tenga un epítopo heterólogo y que pueda utilizarse para inducir y mantener la tolerancia en individuos.

Resumen de la invención

De acuerdo con la presente invención se proporciona una composición farmacéutica para inducir tolerancia frente a un epítopo tolerogénico o un antígeno que contiene el epítopo tolerogénico en un individuo, donde dicho epítopo tolerogénico es un epítopo frente al que se desea una falta de respuesta inmunológica, dicha composición comprende:

(a) una célula hemopoyética o linfoide que comprende un vector de expresión capaz de mantener de manera persistente la expresión del epítopo tolerogénico en el individuo, que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y de la traslación funcionales en la célula hemopoyética o linfoide, donde la inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo heterólogo insertado en el extremo N-terminal de la región variable de la inmunoglobulina, donde el epítopo heterólogo es el epítopo tolerogénico, y donde el vector de expresión mencionado se mantiene de manera estable en la célula hemopoyética o linfoide mencionada; y

(b) un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

La invención proporciona composiciones para inducir y mantener la tolerancia frente a epítopos y antígenos que contienen estos epítopos. Los métodos también se describen. Los métodos y las composiciones son útiles para identificar epítopos tolerogénicos o antígenos que contienen dichos epítopos nuevos. Los métodos y la composición también son útiles para inducir y mantener la tolerancia frente a epítopos o antígenos que contienen los epítopos asociados a respuestas autoinmunes o a respuestas alérgicas inmunes.

Las composiciones incluyen un casete de expresión y un vector. El casete de expresión y el vector pueden utilizarse para formar células transformadas. El casete de expresión comprende una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcionales en una célula hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo tolerogénico heterólogo en el extremo N-terminal de la región variable de la molécula de inmunoglobulina. Un vector incluye el casete de expresión y es un vector que puede proporcionar un mantenimiento estable, es decir, proporciona la expresión génica del casete de expresión en la célula hemopoyética o linfoide a lo largo de toda la vida de la célula. Las células hemopoyéticas o linfoides se transforman de manera estable con un vector para proporcionar células transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión.

También describimos más abajo composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad de una inmunoglobulina de fusión suficiente para inducir y/o mantener la tolerancia combinada con un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La inmunoglobulina de fusión incluye al menos un epítopo tolerogénico heterólogo en el extremo N-terminal de la región variable de la inmunoglobulina.

También describimos métodos para identificar epítopos o antígenos que contienen epítopos que pueden servir como tolerógenos nuevos. Los métodos implican transformar células de manera estable con un casete de expresión que codifica una inmunoglobulina de fusión para formar una población de células transformadas que producen o expresan la inmunoglobulina de fusión. La inmunoglobulina de fusión que tiene uno o más de un epítopo de un antígeno que se sospecha que es capaz de inducir tolerancia, puede ensayarse para detectar su capacidad de inducir tolerancia frente al epítopo de diferentes formas. Un método para determinar si la inmunoglobulina de fusión puede inducir tolerancia es administrar a un animal una cantidad tolerogénica de la inmunoglobulina de fusión. En otro método, las células transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión pueden administrarse a un animal para determinar si la tolerancia frente al epítopo puede inducirse y/o mantenerse. En un tercer método, los epítopos o los antígenos que contienen el epítopo pueden identificarse mediante su reactividad con suero inmune alérgico o autoinmune o con linfocitos.

Las composiciones de la invención son para utilizarse en métodos para inducir y mantener la tolerancia frente a un epítopo en un animal. En este método, las células transformadas que expresan una inmunoglobulina de fusión se administran a un animal para inducir y mantener la tolerancia. También describimos un método que implica administrar una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión suficiente para inducir y/o mantener tolerancia frente al epítopo heterólogo de la inmunoglobulina de fusión. En otro método, se administra una composición farmacéutica que incluye una inmunoglobulina de fusión para inducir tolerancia frente al epítopo heterólogo y después se administran las células transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión para mantener la tolerancia frente al epítopo heterólogo.

Descripción breve de las figuras

Figura 1: Estrategia para la preparación de una construcción de ADN murino que codifica una inmunoglobulina de fusión que incluye el epítopo 12-26 de la proteína represora \lambda-CI en el extremo N-terminal de IgG1: (A) Un mapa del plásmido pSNR que contiene la secuencia genómica de una cadena \gamma1 H, modificada como se describe en el Ejemplo 1. (B) Mapa de restricción y secuencia que muestra la secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26 combinado con la secuencia de ADN que codifica la región variable de la cadena pesada.

Figura 2: Detección de un epítopo heterólogo en la proteína de fusión 12-26-IgG. La construcción 12-26-IgG (Q3), así como la construcción control pSNR (P6) se sometieron a electroporación en células de mieloma J558L, que sólo sintetizan cadenas ligeras \lambda. Las IgG recombinantes se purificaron a partir de los sobrenadantes de las células transformadas con sefarosa-anti IgG de ratón o con columnas de sefarosa-proteína A. Transferencia Western: las muestras se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE 10%. Los geles se transfirieron a nitrocelulosa y se ensayaron con anti IgG de ratón (carriles de la izquierda) o con anticuerpo monoclonal B3.11 anti 12-26 (carriles de la derecha) más anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina como reactivos secundarios.

Figura 3: Curvas de inhibición en ELISA. Se mezcló anticuerpo monoclonal B3.11 titulado previamente con cantidades crecientes del péptido 12-26, péptido 12-26 acoplado químicamente a globulina gamma de conejo (RGG/12-26), o Q3 (proteína de fusión recombinante 12-26 IgG1).

Figura 4: Inducción de tolerancia por la proteína de fusión 12-26-IgG determinada in vitro. Se cultivaron células de bazo durante 18 horas con cantidades crecientes de péptido 12-26 o de la proteína de fusión 12-26-IgG (Q3.13) o de un conjugado 12-26-globulina gamma de conejo (RGG). Después, las células se lavaron y se sometieron a un pulso con un antígeno que contiene el epítopo 12-26 (12-26-fagelina) y se llevaron a cabo ensayos de ELISA en los sobrenadantes del día 4.

Figura 5: Inducción de tolerancia in vivo con 12-26-IgG. Se inyectaron ratones Balb/c con una dosis tolerizante de IgG control (P6) a 1 mg/ratón [barras negras], con el péptido 12-26 a 100 \mug/ratón, con el conjugado químico de 12-26 conjugado químicamente con globulina gamma de conejo (12-26-RGG) a 1 mg/ratón [barra rayada] y con la inmunoglobulina de fusión (Q3.13) a 1 mg/ratón [barra punteada]. Después de 7 días, se evaluaron las células de bazo para determinar la respuesta al pulso in vitro con un antígeno que contiene el epítopo 12-26 como se describe en la Figura 4.

Figura 6A: Transferencia Western que muestra la expresión del péptido 12-26 en los sobrenadantes de las células A20.2J infectadas con el vector MBAE-12-26. Los sobrenadantes se trasnfirieron a nitrocelulosa y se ensayaron con el anticuerpo B3.11 anti 12-26. MBpepA, MBpepB, MBpepC y MBpepD representan de manera individual clones de A20.2J infectados que producen el péptido 12-26 que codifican el vector MBAE-12-26.

\newpage

La Figura 6B muestra la proliferación de un clon de células T anti-12-26-IgG TH1 en respuesta a la incubación con sobrenadantes de células A20 infectadas con el vector MBAE-12-26 o con sobrenadantes control.

La Figura 7 muestra la construcción de un vector retroviral MBAE que contiene la secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26.

La Figura 8 muestra una transferencia Southern de ADNc preparada a partir de productos de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (PCR) a partir de células de la médula ósea infectadas con MBAE-12-26 después de madurar en receptores irradiados. Las células de sangre periférica se obtuvieron a partir de ratones 2 semanas después de recibir las células de médula ósea infectadas. El ARN se sometió a transcriptasa inversa y se llevó a cabo PCR con cebadores V_{H} y 12-26. Los geles se ensayaron con una sonda de oligonucleótido complementaria a la secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26. El experimento demuestra la expresión de ARNm que codifica el epítopo 12-26 basado en RT-PCR de ARN de células de sangre periférica después de 2 semanas del transplante de médula ósea.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona composiciones y métodos para inducir y mantener la tolerancia frente a antígenos. Las composiciones incluyen un casete de expresión y un vector que comprenden una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcionales en una célula hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo heterólogo localizado en el extremo N-terminal de la región variable de la cadena de la inmunoglobulina. Los vectores son preferiblemente aquellos vectores que pueden proporcionar una integración estable del casete de expresión en una célula hemopoyética. De acuerdo con la invención, las células se transforman con los vectores. También describimos inmunoglobulinas de fusión que tienen un epítopo heterólogo en el extremo N-terminal que pueden utilizarse en una composición farmacéutica que proporciona la inducción de la tolerancia frente al epítopo y/o frente a su antígeno. También describimos métodos para identificar antígenos y epítopos tolerogénicos nuevos, así como métodos para inducir y mantener la tolerancia frente a un antígeno.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término "antígeno" se refiere a un agente que es capaz de incitar una respuesta inmune en un animal.

Un "epítopo" es una parte del antígeno que es capaz de incitar una respuesta inmune y que se combina con un anticuerpo específico para esa parte del antígeno.

Un "epítopo heterólogo" es un epítopo que normalmente no está asociado con la molécula de inmunoglobulina transportadora. Se obtiene o se deriva a partir de un antígeno que no es el mismo que la molécula de inmunoglobulina transportadora.

Una "célula hemopoyética" es una célula que puede formar células sanguíneas que incluyen linfocitos y macrófagos de tejidos tales como células de la médula ósea y de otros tejidos extra medulares.

Un "casete de expresión o vector" se mantiene de manera estable en una célula hemopoyética o en otro tipo de célula bien cuando se integra en el cromosoma de manera que el casete de expresión o vector se replica y se transmite a las células de la progenie o cuando se mantiene en la célula sin perder actividad funcional, es decir, expresión génica, durante toda la vida de la célula.

Un "epítopo tolerogénico" es un epítopo que puede inducir una falta de respuesta inmunológica frente al epítopo y/o frente a un antígeno que contiene un epítopo. Un epítopo tolerogénico se selecciona debido a un deseo de inducir una falta de respuesta inmunológica frente al epítopo y/o frente a un antígeno que contiene el epítopo. Un epítopo tolerogénico puede identificarse como un epítopo que puede estimular una respuesta inmune si se presenta de manera apropiada al sistema inmune o puede ser un antígeno propio que normalmente puede no incitar una respuesta inmune. Un epítopo tolerogénico puede interaccionar con las células T o con las células B o con ambas. Los epítopos tolerogénicos adecuados que pueden seleccionarse son preferiblemente aquellos epítopos y/o antígenos asociados con enfermedades autoinmunes o con reacciones alérgicas.

A. Casetes de expresión y vectores

Un casete de expresión para utilizarse en la invención incluye una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcional en una célula hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina de fusión incluye al menos un epítopo tolerogénico heterólogo en el extremo N-terminal de la región variable. El casete de expresión se incorpora preferiblemente en un vector que proporciona el mantenimiento y la expresión estable del casete de expresión en la célula anfitriona. Si la célula anfitriona es una célula hemopoyética, el vector es preferiblemente un vector que proporciona la integración del vector en el cromosoma de la célula hemopoyética. Si la célula anfitriona es una línea celular linfoide, el vector puede no integrarse tal como un plásmido siempre que proporcione el mantenimiento y la expresión estable del casete de expresión durante toda la vida de la célula. Los casetes de expresión y los vectores de la invención son útiles para proporcionar inmunoglobulinas de fusión para utilizarse como agentes tolerogénicos y/o para proporcionar el mantenimiento de la tolerancia frente a un antígeno y/o frente a un epítopo.

Una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión puede obtenerse y construirse utilizando métodos estándar como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 3, J. Wiley/Greene Press (1992). Las secuencias de ADN que codifican inmunoglobulinas pueden obtenerse utilizando métodos conocidos como los descritos por Hebell et al., Science, 254:102 (1991) y Huse et al., Science, 246:1275 (1989). Brevemente, las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras pueden obtenerse mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) de ARN mensajero (ARNm) aislado a partir de células del bazo o, preferiblemente, de hibridomas que producen un anticuerpo con una especificidad conocida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar las secuencias de las cadenas ligeras y pesadas que incluyen el fragmento Fd (V_{H}-CH1). Los ejemplos de dichos cebadores se describen en Huse et al., citado supra y en Ballard et al., PNAS, 83:9626 (1986). Típicamente, dichos cebadores se diseñan para incluir secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción en ambos extremos de la secuencia que se va a amplificar. Las secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de restricción son conocidas para las personas especializadas en el campo y pueden seleccionarse para proporcionar una clonación sencilla en un vector en una localización específica.

Las secuencias de ADN que codifican las cadenas ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas son preferiblemente secuencias de ADNc de manera que se ha eliminado cualquier secuencia de ADN intermedia y la secuencia de ADN codifica una inmunoglobulina totalmente funcional. La secuencia de ADN que codifica la molécula de inmunoglobulina puede codificar una inmunoglobulina completa que tiene las cadenas pesadas y ligeras con el fragmento Fc o puede codificar partes de la inmunoglobulina tales como el fragmento Fab, fragmento F(ab)_{2}, o sólo la cadena pesada. Se pueden hacer modificaciones en la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada y todavía resulta una molécula de inmunoglobulina de fusión cuando la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada se expresa en una célula del linaje de las células B que puede suministrar cadenas ligeras para formar la inmunoglobulina. La secuencia de ADN puede codificar una forma de la molécula de inmunoglobulina secretada o de membrana.

Los ejemplos adecuados de una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de un anticuerpo específico frente a nitrofenilo están descritos por Hebell et al., citado supra. IgG1 o IgG2 (ratón) se prefieren como moléculas transportadoras para inducir tolerancia. La secuencia de ADN codifica, preferiblemente, la cadena pesada de tipos IgG1 o IgG2 de inmunoglobulina.

Se puede obtener y preparar mediante métodos estándar una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo tolerogénico de un antígeno. Si el epítopo es un péptido pequeño de 15-20 aminoácidos, la secuencia de nucleótidos que codifica ese epítopo puede sintetizarse utilizando síntesis de ADN automatizada. Si la secuencia de ADN codifica todo o una parte de un antígeno (es decir, codifica muchos epítopos), la secuencia de ADN que codifica ese antígeno puede aislarse y subclonarse utilizando métodos publicados. Las secuencias de ADN que codifican todo o una parte de algunos antígenos también pueden identificarse mediante la búsqueda en una base de datos como GenBank. Una vez que la secuencia se ha identificado en una base de datos como ésta o mediante referencia a publicaciones, la secuencia de ADN que codifica todo o una parte de un antígeno puede obtenerse mediante síntesis automatizada o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el antígeno E del polen de ambrosía ha sido descrito por Rafner et al., J. Biol. Chem., 266:1229 (1991); y Kuo et al., Molecular Immunol., 30:1077 (1993). Los epítopos del antígeno E también se han identificado como describe Olson, J. Immunol., 136:2109 (1986); y Bond et al., J. Immunol., 146:3380 (1991). Se puede obtener mediante métodos estándar una secuencia de ADN que codifica uno o más de los epítopos del antígeno E como se describe en Kuo et al., citado supra.

Los antígenos adecuados son aquellos que inducirían o mantendrían una falta de respuesta inmunológica frente al epítopo y/o frente al antígeno que contiene el epítopo. Dichos antígenos incluyen polen, ambrosía, ácaros del polvo, y otros alergenos conocidos. Los antígenos adecuados también incluyen autoantígenos tales como factor de coagulación VIII, receptores de acetilcolina, colágeno, proteína básica de mielina, tiroglobulina, y antígenos de histocompatibilidad. Un antígeno adecuado también incluye los epítopos de la proteína represora \lambda-CI. Las secuencias de aminoácidos de muchos de estos antígenos así como las de los epítopos de estos antígenos son conocidas para las personas especializadas en el campo. Los antígenos preferidos incluyen antígeno E de ambrosía y factor de coagulación VIII. Las secuencias de ADN que codifican antígenos adecuados pueden obtenerse y prepararse como se describe en la presente memoria y de acuerdo con métodos publicados.

Antes de que obtenga y se prepare una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo tolerogénico, se selecciona el epítopo y/o el antígeno. El epítopo y/o el antígeno puede ser un epítopo único o puede ser todo o una parte de un antígeno que contiene muchos epítopos. El epítopo puede interaccionar con las células T, o puede interaccionar con las células B, o puede interaccionar con las células T y/o con las células B.

La selección del epítopo y/o de los epítopos puede realizarse en base a los criterios siguientes. Los epítopos se seleccionan en primer lugar por su capacidad para inducir tolerancia frente al péptido o a un antígeno que contiene el epítopo, preferiblemente un antígeno asociado con una respuesta alérgica o una respuesta autoinmune. En segundo lugar, si se desea tolerancia frente a un antígeno grande y complejo, puede seleccionarse más de un epítopo para combinarse en una inmunoglobulina de fusión. Preferiblemente, el antígeno completo puede incluirse en la inmunoglobulina de fusión. En tercer lugar, los epítopos pueden seleccionarse si se desea tolerancia de células B y/o T. Las personas especializadas en el campo conocen determinados epítopos que son reconocidos por las células T y no por las células B y viceversa. En cuarto lugar, los epítopos pueden seleccionarse en base a la reactividad con suero inmune o con linfocitos de individuos que tienen una respuesta alérgica o autoinmune frente a un antígeno. Por ejemplo, un epítopo que se sabe que es inmunodominante o que estimula una respuesta autoanticuerpo potente puede seleccionarse de manera que la parte del antígeno incluida en la inmunoglobulina de fusión incluya el epítopo. En quinto lugar, si no existe información o la información es muy poca acerca de epítopos del antígeno, puede resultar deseable incluir el antígeno completo en la inmunoglobulina de fusión.

La secuencia de ADN que codifica un epítopo puede incluir un epítopo de aproximadamente 5-6 aminoácidos o un antígeno que tiene un peso molecular de hasta aproximadamente 100.000 daltons. El intervalo de tamaño preferido es aproximadamente 9 aminoácidos hasta aproximadamente 50.000 daltons. Por ejemplo, los epítopos que reconocen las células T tienen una secuencia consenso que incluye aproximadamente 9 aminoácidos. Se piensa que el tamaño mínimo de un epítopo es aproximadamente 5-6 aminoácidos. El tamaño máximo del antígeno que puede presentarse en una proteína de fusión es el tamaño que permite el plegamiento tanto del antígeno como de la molécula de inmunoglobulina transportadora. Un antígeno preferido es el fragmento A2 del factor de coagulación VIII que tiene un peso molecular de aproximadamente 40.000 daltons.

Una vez que se ha seleccionado el epítopo y que se ha obtenido la secuencia de ADN que codifica ese epítopo, la secuencia de ADN que codifica el epítopo se combina con la secuencia de ADN que codifica la inmunoglobulina para formar una secuencia de ADN que codifica la inmunoglobulina de fusión. La secuencia de ADN que codifica el epítopo se combina, preferiblemente, con una secuencia de ADN de la inmunoglobulina en el extremo N-terminal de la región variable de la cadena pesada en la orientación y marco adecuados. La localización de la combinación de la secuencia de ADN que codifica el epítopo puede variar dependiendo de la localización deseada del epítopo en la inmunoglobulina de fusión. Si el epítopo es el antígeno completo o una parte amplia del antígeno (es decir, tiene un peso molecular de aproximadamente 25.000 hasta aproximadamente 100.000 daltons), la localización del epítopo en la inmunoglobulina de fusión es tal que permitirá el plegamiento tanto de la molécula de inmunoglobulina transportadora como del antígeno o de la parte del antígeno. Cuando el antígeno y/o la parte del antígeno es un epítopo, se fusiona preferiblemente con la inmunoglobulina en el extremo amino terminal de la cadena pesada en los aminoácidos del extremo N-terminal de la primera región marco. Los epítopos más pequeños (es decir, aquellos que contienen aproximadamente 5-50 aminoácidos) pueden localizarse en el extremo N-terminal de la primera región marco o en otras regiones de la parte variable de la cadena de inmunoglobulina siempre que el epítopo permanezca expuesto en la superficie exterior de la molécula de la inmunoglobulina. Preferiblemente, los epítopos pequeños también pueden combinarse con la inmunoglobulina en los aminoácidos del extremo N-terminal de la primera región marco de la cadena pesada.

De manera opcional, la secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo tolerogénico heterólogo puede incluir secuencias de ADN flanqueantes en uno o en ambos extremos de la secuencia de ADN. Estas secuencias de ADN flanqueantes pueden incluir secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción y/o pueden incluir una secuencia de ADN que codifica una parte de la secuencia de la inmunoglobulina en el lugar donde las dos secuencias de ADN se van a combinar. Por ejemplo, una secuencia de ADN que codifica un epítopo que se combina en el extremo N-terminal de la primera región marco de una cadena pesada de una molécula de inmunoglobulina puede incluir una secuencia de ADN flanqueante que codifica los primeros 5 aminoácidos de la primera región marco en cualquier extremo o en ambos extremos de la secuencia de ADN que codifica el epítopo. La secuencia de ADN flanqueante también puede incluir una secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción. La secuencia de ADN flanqueante tiene preferiblemente una longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente 21 nucleótidos. Cuando la secuencia de ADN flanqueante codifica una parte de la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina, la secuencia se selecciona en el sitio del punto de la combinación de la secuencia de ADN del epítopo con la secuencia de la inmunoglobulina. La secuencia de ADN flanqueante que codifica una parte de los aminoácidos de la inmunoglobulina puede proporcionar aminoácidos de la inmunoglobulina de fusión que ayuden a lograr el plegamiento adecuado del epítopo y/o del antígeno y de la inmunoglobulina en el punto de la fusión. La secuencia de ADN flanqueante también puede asegurar que la secuencia de ADN que codifica el epítopo se combina con la secuencia de ADN que codifica la inmunoglobulina en el marco y en la orientación adecuados.

Las secuencias de ADN que codifican la inmunoglobulina y el epítopo se combinan utilizando métodos de subclonación estándar. Se puede ayudar a la combinación de las dos secuencias de ADN mediante la formación de la secuencia de ADN que codifica el epítopo con secuencias de ADN flanqueantes que tienen determinadas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción. Estas secuencias flanqueantes proporcionan a una persona especializada en el campo la capacidad de seleccionar la localización en la que se combinará la secuencia de ADN que codifica el epítopo con la secuencia de ADN que codifica la inmunoglobulina de fusión y aseguran que las secuencias se combinan en el marco y la orientación apropiados. Cuando las secuencias de ADN que codifican la inmunoglobulina y el epítopo se combinan, forman una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión o una cadena pesada de fusión de una molécula de inmunoglobulina.

Debe entenderse que, debido a la degeneración del código genético, existen varias secuencias de ADN que pueden codificar una inmunoglobulina y un epítopo que tienen la misma secuencia de aminoácidos. Este conjunto de secuencias es un conjunto finito que puede determinarse en base a la secuencia de aminoácidos del epítopo y de la inmunoglobulina. Las secuencias alternativas de ADN que codifican una molécula de inmunoglobulina y un epítopo con la misma secuencia de aminoácidos se contemplan y se incluyen en el alcance de la invención.

La secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión puede combinarse entonces con regiones de control de la transcripción y la traslación funcionales en una célula hemopoyética o linfoide. Una región de control que es importante para la expresión de la secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión incluye un cebador. Un cebador adecuado es el que puede funcionar en una célula hemopoyética o linfoide. El cebador proporciona preferiblemente una expresión constitutiva de las secuencias de ADN que codifican la inmunoglobulina de fusión. Preferiblemente, el cebador también proporciona una cantidad de la inmunoglobulina de fusión para inducir y/o mantener la tolerancia. Los ejemplos adecuados de cebadores incluyen el cebador de \beta-actina, el cebador de SV40, y el cebador del virus del sarcoma de Rous LTR.

Otras regiones de control de la transcripción y la traslación incluyen secuencias amplificadoras y secuencias de terminación de la transcripción y de poliadenilación. Las secuencias amplificadoras pueden combinarse con y normalmente se encuentran en o adyacentes a secuencias de cebador. Determinadas secuencias amplificadoras, tales como las de SV40, son activas en muchas células de mamífero y proporcionan la estimulación de la transcripción hasta 1.000 veces respecto a los cebadores homólogos o heterólogos. Las secuencias de poliadenilación se encuentran por debajo de la secuencia codificadora y proporcionan la formación apropiada del ARNm. Las secuencias de poliadenilación pueden obtenerse a partir de SV40. Las secuencias de terminación de la transcripción se encuentran unos cientos de nucleótidos por debajo de las secuencias de poliadenilación.

Estas regiones de control de la transcripción y la traslación están disponibles en vectores que están disponibles comercialmente. Una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión o una cadena pesada de fusión puede combinarse con regiones de control de la transcripción y la traslación en el marco y la orientación apropiados mediante la subclonación en un vector que tiene esas regiones de control para formar un casete de expresión.

Los vectores pueden seleccionarse en base a su capacidad de proporcionar un mantenimiento y/o una expresión génica estable en una célula hemopoyética o linfoide. Un vector se mantiene de manera estable en una célula si puede proporcionar la expresión de una inmunoglobulina de fusión durante toda la vida de la célula. El mantenimiento estable puede incluir el mantenimiento y la expresión de un plásmido en una célula eucariota, preferiblemente una célula como una célula linfoide. En este caso, el plásmido que incluye un casete de expresión no se replica de manera autónoma o no se integra en el cromosoma. La vida de una célula, como una célula linfoide, es aproximadamente 14 a 60 días en el ratón o puede ser varios años en los seres humanos. Un vector de plásmido que contiene un casete de expresión también puede mantenerse en una línea celular linfoide tal como células J558L sin
replicarse.

Un vector también puede seleccionarse para proporcionar la integración del casete de expresión en el cromosoma de la célula anfitriona, como una célula hemopoyética. En una célula hemopoyética de la médula ósea de un animal, el vector se introduce en una población mixta de células, algunas de las cuales son células en división y algunas de las cuales todavía no han empezado a dividirse. El vector puede integrarse en el cromosoma y después replicarse junto al cromosoma y transferirse a las células de la progenie. El vector se integra de manera estable si puede detectarse la expresión génica en la población de células aproximadamente 1 a 12 semanas después de que las células infectadas se han introducido en el animal o han sido cultivadas in vitro.

Los vectores adecuados incluyen los plásmidos tales como pSNR1, pEMBL, pBR322, pRSA101, pUC118,
pUC119, pBluescript, y pComb (Barbas et al., PNAS, 88:7978 (1991)). Los vectores adecuados también incluyen vectores víricos tales como vectores de baculovirus y retrovirales tales como el vector MBAE (Chambers et al., PNAS, 89:1026 (1992)). El vector preferido para las células hemopoyéticas es el vector MBAE.

Una cepa bacteriana que contiene un vector de plásmido que tiene una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de fusión se ha denominado E. coli DH5\alpha (pQ3.EZ). La cepa bacteriana posee el plásmido pQ3.EZ que codifica la cadena pesada de fusión que tiene un epítopo de 12-26 aminoácidos de la proteína represora \lambda-CI combinado en el extremo N-terminal de la primera región marco de la cadena pesada de un anticuerpo específico frente a nitrofenilo. La cepa bacteriana se ha depositado en la American Type Culture Collection en Rockville, MD el 7 de Febrero, 1994 con el No. 69555 de Registro.

En una versión preferida, una secuencia de ADN que codifica un epítopo como el epítopo 12-26 de la proteína represora \lambda-CI se combina con la secuencia de ADN que codifica una región variable de inmunoglobulina en el extremo N-terminal de la primera región marco de la cadena pesada para formar una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de fusión. La secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de fusión se combina con un cebador de \beta-actina en un vector retroviral MBAE. El vector se utiliza preferiblemente para transformar células de médula ósea u otras células del linaje de las células B que pueden producir cadenas ligeras. Las cadenas ligeras se combinan con la cadena pesada de fusión para formar una inmunoglobulina de fusión. De manera alternativa, puede incluirse una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera en el mismo vector que codifica la cadena pesada de fusión para proporcionar la expresión de una inmunoglobulina de fusión.

B. Células transformadas

Se utilizan vectores que contienen casetes de expresión que codifican una inmunoglobulina de fusión. Las células transformadas se utilizan en métodos para identificar epítopos tolerogénicos nuevos y para producir una inmunoglobulina de fusión. Las células transformadas también pueden introducirse en animales para inducir y mantener la tolerancia frente al epítopo heterólogo expresado por las células transformadas o frente a un antígeno que contiene el epítopo heterólogo.

Las células adecuadas para la transformación incluyen células hemopoyéticas, células linfoides, y líneas de células linfoides. Las células incluyen células de la médula ósea, células linfoides, y las células linfoides J558L. Las células anfitrionas son, preferiblemente, aquellas que son capaces de formar y secretar moléculas de inmunoglobulina. La población de células transformada incluye preferiblemente células del linaje de las células B y son aquellas que sintetizan cadenas ligeras de manera endógena. Las células transformadas que se administrarán a los animales son preferiblemente singénicas o comparten antígenos de histocompatibilidad idénticos para evitar el rechazo de las células inyectadas. Para los ensayos de cribado, pueden ser adecuadas las células anfitrionas bacterianas como E. coli y semejantes.

El vector puede introducirse en la células utilizando diferentes métodos conocidos para las personas especializadas en el campo como transfección mediada por fosfato cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, y transfección mediada por liposomas.

Una vez que el casete de expresión se ha introducido en las células, las células transfectadas pueden seleccionarse inicialmente mediante la detección de la presencia de un gen marcador de selección presente en el vector. Si las células transfectadas son células de médula ósea o células linfoides, puede no utilizarse selección. Las células transfectadas se pueden rastrear para detectar la presencia y/o expresión del casete de expresión que codifica una inmunoglobulina de fusión. Las células transfectadas se pueden rastrear para detectar la presencia de un casete de expresión utilizando una o más técnicas tales como transferencia Southern, transferencia Northern, PCR con transcriptasa inversa, transferencia Western, ELISA, e inmunofluorescencia. Pueden utilizarse sondas de ADN marcadas que se pueden detectar en transferencias Southern y/o Northern. Las sondas son lo suficientemente complementarias a las secuencias de nucleótidos que codifican el epítopo o la parte del antígeno como para que la sonda de aproximadamente 50 a 100 nucleótidos hibride bajo condiciones altas de astringencia. Pueden diseñarse cebadores para la PCR con transcriptasa inversa como se ha descrito previamente para amplificar las secuencias de ADNc que codifican las cadenas pesadas y ligeras variables de la molécula de inmunoglobulina.

Las células transfectadas en las que se está expresando la inmunoglobulina de fusión también pueden detectarse utilizando transferencia Western, ELISA, o inmunofluorescencia. Las cantidades de inmunoglobulinas de fusión que se expresan pueden detectarse utilizando una transferencia Western cuantitativa.

La cantidad de inmunoglobulina de fusión producida en un tipo particular de células anfitrionas y con una secuencia de cebador/amplificador particular puede evaluarse utilizando una transferencia Western cuantitativa. Las secuencias del cebador/amplificador que proporcionan la mayor cantidad de expresión constitutiva de la inmunoglobulina de fusión pueden determinarse comparando la cantidad de inmunoglobulina de fusión producida en el mismo tipo de célula anfitriona durante el mismo periodo de tiempo. Un cebador/amplificador puede seleccionarse para proporcionar una cantidad suficiente de inmunoglobulina de fusión para inducir y/o mantener la tolerancia. La cantidad de una inmunoglobulina de fusión que inducirá tolerancia puede variar de acuerdo con factores descritos en la presente memoria y puede determinarse utilizando métodos estándar.

C. Composiciones farmacéuticas

También describimos composiciones farmacéuticas que incluyen una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión en un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo tolerogénico heterólogo en el extremo N-terminal de la región variable de la inmunoglobulina. Preferiblemente, el epítopo tolerogénico heterólogo se combina con la inmunoglobulina adyacente al extremo N-terminal de la primera región marco de la cadena pesada. La inmunoglobulina de fusión se combina con un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico en cantidades eficaces para inducir la tolerancia frente al epítopo tolerogénico o frente a un antígeno que contiene el epítopo en un animal. La composición farmacéutica puede administrarse a un animal para inducir y/o mantener la tolerancia frente al epítopo tolerogénico. La inducción de la tolerancia frente al epítopo o epítopos puede minimizar las reacciones alérgicas del animal o los síntomas de enfermedades autoinmunes.

Las inmunoglobulinas de fusión pueden aislarse a partir de las células transformadas utilizando métodos estándar. Las inmunoglobulinas de fusión pueden aislarse a partir de sobrenadantes de las células haciéndolos pasar por columnas de proteína A o por otras columnas de afinidad de acuerdo con métodos estándar.

Los epítopos tolerogénicos adecuados son aquellos epítopos asociados con respuestas alérgicas o autoinmunes. Un epítopo tolerogénico es el que puede administrarse de manera que resulte en una falta de respuesta inmunológica frente al epítopo y/o frente a un antígeno que contiene el epítopo. Si el epítopo estimula una respuesta inmunodominante, la tolerancia frente a ese epítopo también puede resultar en tolerancia frente a un antígeno que contiene el epítopo. Los ejemplos específicos incluyen antígeno E o antígeno K de polen de ambrosía, antígenos de los ácaros del polvo, antígenos heterólogos de histocompatibilidad, factor de coagulación VIII, receptores de acetilcolina, proteína básica de mielina, y tiroglobulina. La inmunoglobulina de fusión puede contener un único epítopo tolerogénico o múltiples epítopos tolerogénicos. Preferiblemente, el epítopo tolerogénico es un epítopo que es inmunodominante en la respuesta alérgica o autoinmune.

La cantidad de la inmunoglobulina de fusión eficaz para inducir tolerancia en un animal depende de varios factores pero puede determinarse fácilmente por una persona especializada en el campo utilizando métodos estándar de dosis respuesta. Los factores incluyen el tamaño del animal que se va a tratar, el número y el tipo de los epítopos, el tipo de tolerancia, la edad del animal, la vía y el número de veces de la administración, y la duración deseada de la tolerancia.

La edad del animal puede ser un factor importante para determinar la cantidad tolerogénica eficaz de un epítopo. Un animal neonato o cría puede requerir aproximadamente 100 a 1.000 veces menos de una dosis única de una inmunoglobulina de fusión administrada por vía intravenosa que la que requiere un adulto de la inmunoglobulina de fusión con el fin de inducir tolerancia frente al epítopo.

Una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión también depende del tamaño del animal y típicamente es aproximadamente 10 a 100 veces mayor (en el caso de tolerancia de células B) que la cantidad del antígeno y/o del epítopo administrado al animal para incitar una respuesta inmune protectora, excepto en el caso de tolerancia de dosis baja. Una cantidad tolerogénica de un antígeno por unidad de masa es típicamente aproximadamente 1 a 40 mg/kg de peso corporal para inducir tolerancia de dosis alta frente a un epítopo o un antígeno administrado como una dosis única por vía intravenosa a un animal. La tolerancia de dosis bajas también se observa en algunos casos y puede obtenerse después de múltiples (>4) dosis de cantidades de submicrogramos en disolución salina en intervalos semanales por vía intraperitoneal o intravenosa.

Otro factor que puede variar la cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión es si la inmunoglobulina de fusión incluye más de un epítopo y si esos epítopos son inmunodominantes. Si la inmunoglobulina de fusión tiene múltiples epítopos, algunos de los cuales son inmunodominantes, una dosis aproximadamente 10 veces menor de la inmunoglobulina de fusión puede inducir tolerancia cuando se administra a un animal como una dosis única por vía intravenosa.

La cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión también puede variar dependiendo de si se desea tolerancia de células T o de células B. Típicamente, la tolerancia de células T requiere una dosis de antígeno o de epítopo aproximadamente 10 a 100 veces menor que la tolerancia de células B frente al mismo epítopo o antígeno.

Otro factor es la persistencia de la inmunoglobulina de fusión en la circulación del animal. Un antígeno que se metaboliza más lentamente proporciona un mantenimiento de la tolerancia durante periodos de tiempo más largos, típicamente aproximadamente 2 a 10 veces más tiempo en el mantenimiento de la tolerancia. La velocidad catabólica de los epítopos o los antígenos depende de la vida media de la inmunoglobulina transportadora isóloga o heteróloga así como de la naturaleza del epítopo o epítopos. La vida media de la inmunoglobulina isóloga o heteróloga es aproximadamente 7 a 21 días (ratón). Los epítopos que tienen aminoácidos modificados o inusuales, tales como aminoácidos D, así como los antígenos o los epítopos complejos, pueden no degradarse tan rápido como otros tipos de epítopos.

La vía de administración también puede influir en la cantidad tolerogénica necesaria de la inmunoglobulina de fusión. En el caso más habitual, se prefiere la administración intravenosa para inducir tolerancia. El número de veces que se administra el antígeno también puede influir en la cantidad de inmunoglobulina de fusión requerida por administración.

Se puede determinar una cantidad tolerogénica eficaz para un epítopo tolerogénico heterólogo particular en una inmunoglobulina de fusión mediante la realización de ensayos dosis respuesta in vivo o in vitro. Los ensayos de dosis respuesta in vitro pueden llevarse a cabo, por ejemplo, utilizando ensayos estándar de proliferación de linfocitos. Por ejemplo, se pueden combinar linfocitos de un animal alérgico o autoinmune con diferentes dosis de la inmunoglobulina de fusión y determinarse la proliferación.

La dosis respuesta in vivo puede determinarse mediante la administración de diferentes dosis de la inmunoglobulina de fusión en un excipiente a un animal. La falta de respuesta inmune frente al epítopo tolerogénico heterólogo puede determinarse evaluando la respuesta específica de anticuerpo frente al epítopo tolerogénico heterólogo o la proliferación de linfocitos en respuesta a un pulso de la inmunoglobulina de fusión.

La inducción de la tolerancia se evalúa mediante la determinación de un descenso de la falta de respuesta inmunológica. Los métodos para determinar la respuesta inmunológica pueden llevarse a cabo con presentación y pulso con el antígeno in vivo o in vitro y son conocidos para las personas especializadas en el campo. Por ejemplo, se puede determinar la cantidad de anticuerpo específico frente al epítopo y/o al antígeno así como la proliferación de linfocitos en respuesta a un pulso con el epítopo o con la inmunoglobulina de fusión. El descenso de la respuesta inmunológica que indica que la tolerancia ha sido inducida puede ser una reducción de aproximadamente 2 veces a 100 veces, preferiblemente aproximadamente 20 veces a 100 veces, de la respuesta de anticuerpos o linfocitos. El intervalo del descenso puede variar dependiendo de la sensibilidad del ensayo utilizado para determinar la respuesta inmunológica. Por ejemplo, se sabe que un descenso del número de células productoras de anticuerpos es más sensible que un descenso de la cantidad de anticuerpo. El intervalo del descenso también puede variar si el epítopo es un epítopo inmunodominante. Un cambio de 2 veces en la respuesta frente a un epítopo inmunodominante puede resultar en niveles significativos de tolerancia frente al epítopo y/o a un antígeno que contiene el epítopo.

Una dosis única de una inmunoglobulina de fusión puede inducir tolerancia. En algunos casos, la tolerancia inducida por una dosis única en el ratón puede durar de aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 6 meses. Si embargo, para que la tolerancia se mantenga en un animal, típicamente se requieren dosis múltiples. El mantenimiento de la tolerancia puede resultar deseable durante al menos la cantidad de tiempo inducida por una dosis única de la inmunoglobulina de fusión hasta toda la vida del animal.

Una cantidad tolerogénica de la inmunoglobulina de fusión se combina con un excipiente fisiológico como disolución salina, disolución salina tamponada y adyuvante de Freund incompleto. La inmunoglobulina de fusión puede administrarse por diferentes vías tales como intraperitoneal, oral, e intravenosa pero se administra preferiblemente por la vía intravenosa. Los animales pueden tratarse entonces para inducir tolerancia frente a alergenos o autoantígenos que incluyen ratones, seres humanos, ratas, conejos y cobayas.

D. Métodos para identificar epítopos que pueden sevir como tolerógenos

También describimos métodos para identificar epítopos que pueden servir como epítopos tolerizantes. La identificación de epítopos tolerogénicos nuevos podría ser útil para el diagnóstico y tratamiento de respuestas autoinmunes y alérgicas. Un método incluye las etapas de proporcionar un vector que incluye una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcionales en una célula anfitriona. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo heterólogo en el extremo N-terminal de la región variable. El epítopo puede ser uno que se sospeche que es capaz de inducir tolerancia. Las células se transforman de manera estable con el vector como se ha descrito previamente. Las células transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión o la inmunoglobulina de fusión aislada se analizan para detectar su capacidad de inmunoreaccionar con suero inmune o linfocitos de animales alérgicos o autoinmunes. La inducción de la tolerancia frente a una inmunoglobulina de fusión que se ha identificado mediante reactividad con suero inmune o linfocitos de animales autoinmunes o alérgicos puede evaluarse mediante métodos in vitro o in vivo conocidos para las personas especializadas en el campo. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de fusión que reaccionan con suero inmune y/o estimulan la proliferación de linfocitos pueden administrarse a un animal y se puede evaluar la inducción y el mantenimiento de la tolerancia como se describe en la presente memoria.

En otro método, las células hemopoyéticas o linfoides transformadas pueden introducirse en un animal y la inducción y el mantenimiento de la tolerancia frente al epítopo heterólogo pueden determinarse utilizando ensayos para evaluar la respuesta inmunológica específica frente al epítopo como se ha descrito previamente.

Se sabe que algunos epítopos y antígenos incitan respuestas inmunes. Se sabe que algunos epítopos y antígenos incitan respuestas inmunes inmunodominantes asociadas con respuestas inmunes alérgicas o autoinmunes. Estos epítopos que incitan respuestas inmunes pueden inducir tolerancia o no cuando se presentan en una inmunoglobulina de fusión. No se han identificado los epítopos de algunos antígenos que se sabe que están asociados con respuestas inmunes alérgicas o autoinmunes. Los métodos de la invención pueden utilizarse para determinar si un epítopo que se sabe que incita una respuesta inmune puede inducir tolerancia cuando se presenta en una inmunoglobulina de fusión o para identificar epítopos tolerogénicos nuevos de antígenos.

En un método, un vector que comprende una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcionales en la célula hemopoyética o linfoide se transforma en una célula hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina de fusión puede incluir un epítopo que se sabe que incita una respuesta inmune o un epítopo tolerogénico nuevo. Las secuencias del cebador/amplificador proporcionan preferiblemente la expresión de la inmunoglobulina de fusión en una célula hemopoyética o linfoide a un nivel suficiente como para inducir tolerancia frente al epítopo in vivo o in vitro. Dicho cebador puede identificarse y rastrearse en un ensayo in vitro como se describe en la presente memoria. La cantidad de inmunoglobulina de fusión que puede inducir tolerancia en animales puede determinarse utilizando metodología estándar de dosis respuesta.

Las células transformadas se introducen en un animal. Cuando las células hemopoyética transformadas se introducen en un animal, preferiblemente el animal ha sido irradiado antes de la introducción de las células transformadas con el fin de destruir las células hemopoyéticas endógenas. Las células transformadas se administran a un animal mediante una inyección intraperitoneal o intravenosa. Después, los animales se analizan para detectar la inducción de tolerancia frente al epítopo después de aproximadamente 2 a 20 días. La tolerancia puede detectarse mediante la determinación de la respuesta de anticuerpos específica o de la respuesta de proliferación de linfocitos frente al epítopo tolerogénico heterólogo. Un descenso de la respuesta del anticuerpo específico o de la proliferación de linfocitos frente al epítopo de aproximadamente 2 a 100 veces, preferiblemente 10 a 100 veces, indica tolerancia frente al epítopo.

Preferiblemente, los ensayos de rastreo para identificar epítopos tolerogénicos se llevan a cabo en ratones. Las células transformadas pueden ser células de ratón singénicas derivadas de otro ratón idéntico genéticamente, o pueden ser células hemopoyéticas o linfoides humanas. Por ejemplo, los ensayos de rastreo pueden llevarse a cabo utilizando tejido de médula ósea humano transformado con un vector. El tejido de médula ósea humano se administra entonces a un ratón inmunodeficiente como al ratón SCID-SCID de acuerdo con el método descrito por Chambers et al., citado supra. La tolerancia puede evaluarse en el ratón SCID-SCID mediante el examen bien de la respuesta de anticuerpo específica frente al epítopo o de la respuesta de la proliferación de linfocitos.

También describimos el rastreo de tolerógenos nuevos, preferiblemente de aquellos asociados a respuestas autoinmunes o alérgicas inmunes. En este método, se rastrean los epítopos de los antígenos asociados con respuestas alérgicas o autoinmunes para detectar su capacidad de inmunoreaccionar con suero inmune o de estimular la proliferación de linfocitos de animales que tienen respuestas alérgicas o autoinmunes. Por ejemplo, pueden combinarse diferentes secuencias de ADNc que codifican partes de un antígeno complejo como el factor de coagulación VIII con una secuencia de ADN que codifica el extremo N-terminal de la región variable de un anticuerpo para formar una biblioteca de secuencias de ADNc que codifican inmunoglobulinas de fusión con diferentes epítopos derivados del factor de coagulación VIII. Las secuencias de ADN que codifican epítopos pueden generarse al azar, o pueden seleccionarse para codificar secuencias de aminoácidos lineales que se solapen, o pueden seleccionarse en base a la probabilidad de que los aminoácidos codificados por la secuencia de ADN estén expuestos (en base a su estructura terciaria) en la superficie de la molécula del factor de coagulación VIII. Las secuencias de ADNc que codifican diferentes partes del antígeno pueden combinarse con secuencias de ADNc del extremo N-terminal de la región variable de una inmunoglobulina, preferiblemente en el extremo N-terminal de la primera región marco de la cadena pesada como se ha descrito previamente.

Puede utilizarse un sistema de vector fagémido como pComb para generar una biblioteca de ADNc de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos que tienen secuencias de ADNc que codifican diferentes partes de un antígeno combinadas como se ha descrito más arriba. El vector fagémido puede construirse para portar estas secuencias de ADNc utilizando métodos estándar de ligación y digestión con enzimas de restricción como se describe en Barbas et al., PNAS, 88:7978 (1991). La biblioteca de fagémidos puede rastrearse para detectar inmunoreactividad con suero inmune de animales alérgicos o autoinmunes en un ensayo de transferencia Western similar al descrito por Barbas et al., citado supra.

Brevemente, los vectores fagémidos que portan los fragmentos Fab con al menos un epítopo heterólogo derivado de un antígeno se transforman en una cepa de E. coli. La cepa de E. coli se crece en presencia de antibióticos para seleccionar aquellas cepas que portan el vector fagémido. Los fagos pueden aislarse y después rastrearse para detectar su unión a células recubiertas con suero inmune de un animal alérgico o autoinmune como describe Barbas et al., citado supra. Los fagos adherentes se eluyen utilizando un tampón de elución. Los fagos eluidos pueden transferirse a células de E. coli y las colonias pueden examinarse para detectar la presencia de un fagémido que porta un fragmento Fab con un epítopo heterólogo utilizando un ensayo del tipo transferencia Western a filtro con suero inmune de un animal alérgico o autoinmune.

El ADN fagémido de los clones positivos puede aislarse y la secuencia de ADN que codifica Fab de fusión puede subclonarse en un vector que puede utilizase para transformar células hemopoyéticas o linfoides. El vector puede contener secuencias de ADN adicionales de manera que las células transformadas producen una inmunoglobulina de fusión en lugar del fragmento Fab. La inmunoglobulina de fusión que tiene un epítopo heterólogo que reacciona con el suero inmune de animales alérgicos o autoinmunes de un clon positivo identificado como se ha descrito, puede aislarse y ensayarse para detectar su capacidad de inducir tolerancia in vitro o in vivo. De manera alternativa, las células transformadas que portan dicho vector pueden introducirse en un animal y se puede determinar la inducción de la tolerancia in vivo como se describe en la presente memoria.

Una vez que se han identificado epítopos y/o inmunoglobulinas de fusión nuevos que pueden inducir tolerancia, éstos pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas y en métodos para tolerizar animales frente a los epítopos. De manera alternativa, la identificación de epítopos tolerogénicos nuevos asociados con respuestas autoinmunes o alérgicas inmunes podría utilizarse en ensayos estándar de diagnóstico para evaluar la presencia de respuestas autoinmunes o alérgicas inmunes o para evaluar la eficacia del tratamiento.

E. Métodos para tolerizar un animal frente a un epítopo

La invención también describe métodos para inducir y mantener la tolerancia frente a un epítopo en un animal. De acuerdo con la invención, la tolerancia puede inducirse y mantenerse en un animal mediante la introducción de células hemopoyéticas o linfoides que producen la inmunoglobulina de fusión en el animal. También describimos una composición farmacéutica que incluye una inmunoglobulina de fusión que se administra a un animal como se ha descrito previamente. Sin limitar la invención de ninguna manera, se piensa que la producción persistente in vivo de una inmunoglobulina de fusión que porta el epítopo heterólogo por las células transformadas puede permitir el mantenimiento de la tolerancia de la misma manera o mejor que utilizando una composición farmacéutica de la inmunoglobulina de fusión.

En un método, se proporciona un vector que codifica una inmunoglobulina de fusión que puede mantenerse de manera estable en una célula hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo tolerogénico heterólogo. Las células hemopoyéticas o linfoides, tales como células de sangre periférica, se transforman con un vector como MBAE utilizando polibreno. Típicamente, las células transformadas no se seleccionan y se administra al animal la población completa de células hemopoyéticas o linfoides. Las células transformadas pueden evaluarse para detectar la producción de una inmunoglobulina de fusión in vivo o in vitro mediante la detección de la presencia de una inmunoglobulina de fusión utilizando anticuerpos o mediante la detección de la expresión del ARNm de una inmunoglobulina de fusión utilizando RT-PCR o transferencia Northern. Preferiblemente, la población de células transformadas se analiza in vitro para detectar la producción de una inmunoglobulina de fusión a un nivel suficiente como para inducir y mantener la tolerancia frente al epítopo heterólogo en un animal.

La población de células transformadas preparadas de manera que la inmunoglobulina de fusión se produce a un nivel suficiente como para inducir y/o mantener la tolerancia se introduce en un animal. La cantidad de células introducidas en el animal es la cantidad que proporciona la producción de una inmunoglobulina de fusión a un nivel suficiente como para inducir tolerancia y, preferiblemente para mantener la tolerancia. El animal se evalúa para detectar la inducción y la persistencia de la tolerancia frente al epítopo heterólogo utilizando ensayos como se ha descrito previamente. En algunos casos, los animales se irradian lo suficiente como para destruir las células hemopoyéticas o linfoides endógenas antes de la introducción de las poblaciones de células transformadas. Un animal se considera tolerante frente al epítopo si se observa un descenso de aproximadamente 2 a 100 veces de la respuesta inmunológica, como la proliferación de linfocitos o la respuesta de anticuerpos. Se considera que la tolerancia se mantiene si el estado tolerante se mantiene al menos el mismo tiempo que el estado tolerante inducido con una inyección intravenosa única de una composición farmacéutica tolerogénica. En ratones, una inyección única de una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión puede resultar en una tolerancia de aproximadamente 2 a 20 días y tan prolongada como aproximadamente 2 meses a 6 meses. La tolerancia podría mantenerse a lo largo de toda la vida del animal.

Las células transformadas adecuadas incluyen células de la médula ósea y células linfoides de ratones o de seres humanos. Los animales adecuados incluyen cepas endogámicas de ratones que incluyen ratones inmunodeficientes como los ratones SCID-SCID. La inducción y el mantenimiento de la tolerancia frente a epítopos utilizando células humanas transformadas pueden evaluarse mediante el desarrollo de tolerancia frente a epítopos en poblaciones de células humanas transformadas administradas a ratones SCID-SCID. Otras células de animales transformadas, tales como células de bovino transformadas, también pueden evaluarse para detectar inducción de tolerancia en ratones SCID-SCID.

En otro método, puede utilizarse una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión para inducir tolerancia y la tolerancia puede mantenerse mediante la administración de células hemopoyéticas o linfoides transformadas que expresan la misma inmunoglobulina de fusión. En el método, puede administrarse una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión como una dosis única como se describe en la presente memoria. Después de que se obtiene un estado de falta de respuesta inmunológica, pueden administrarse al animal las células hemopoyéticas o linfoides transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión. Sin pretender limitar la invención, se piensa que las células hemopoyéticas o linfoides transformadas resultarán en el mantenimiento de la tolerancia frente al epítopo. La cantidad de inmunoglobulina de fusión que se debe expresar cuando se utilizan las células transformadas para mantener en lugar de inducir tolerancia puede ser menor que la requerida cuando las células inducen y mantienen la tolerancia. Típicamente, se requiere la administración de aproximadamente 10 a 100 veces menos de la inmunoglobulina de fusión o del antígeno para mantener en lugar de inducir la tolerancia.

Ejemplo 1 Preparación de construcciones recombinantes de la inmunoglobulina de fusión p12-26

Se estudió la tolerancia frente al epítopo que comprende los restos 12-26 de la proteína cI del bacteriófago \lambda debido a que este epítopo puede ser reconocido tanto por las células T como B, y a que es el epítopo inmunodominante principal de esta proteína en ratones H-2^{d}. Este epítopo se expresó en una proteína de fusión IgG de ratón que tiene el epítopo en el extremo N-terminal. Se eligió IgG1 isóloga para la proteína de fusión porque se sabe que es un transportador tolerogénico. Las inmunoglobulinas isólogas (especialmente IgG) son probablemente transportadores tolerogénicos eficaces debido a su capacidad de entrecruzar receptores Fc de las células B y de persistir en la circulación, así como a su falta de "inmunogenicidad intrínseca", es decir, la falta del potencial de incitar una respuesta inmune en una forma soluble. Las construcciones de ADN que codifican un polipéptido de fusión de inmunoglobulina IgG que contiene el epítopo 12-26 de la proteína represora cI de \lambda se obtuvieron mediante la modificación del plásmido pSNR-1. (Véase la Figura 1).

El péptido inmunodominante principal de la proteína represora \lambda CI de (restos 1-102) se encuentra en los restos 12-26, como se describe en Nature, 343:381 (1990). La secuencia de ADN que codifica este fragmento del péptido se sintetizó mediante métodos automatizados estándar. El fragmento del oligonucleótido sintético que codifica el epítopo 12-26 tiene la secuencia siguiente (SEQ ID NO:1):

5' CTG GAG GAC GCG CGG CGG CTG AAG GCG ATA TAC GAG AAG AAG AAG 3'

3' GAC CTC CTG CGC GCC GCC GAC TTC CGC TAT ATG CTC TTC TTC CCT 5'

La secuencia de aminoácidos correspondiente codificada por este fragmento es:

Leu-Glu-Asp-Ala-Arg-Leu-Lys-Ala-Ile-Tyr-Glu-Lys-Lys-Lys

(SEQ ID NO:2)

El plásmido pSNR-1 es un plásmido que incluye una secuencia de ADN que codifica el dominio variable de la cadena pesada (VH) y las regiones constantes de la cadena pesada 1-3 (CH1-3) de una inmunoglubulina murina específica para 4-hidroxi-3-nitrofenilo. El plásmido pSNR-1 se construyó como describe Ballard et al., PNAS, 83:9626 (1986). El plásmido pSNR-1 se obtuvo de Douglas Fearon (Johns Hopkins, Baltimore, MD). Para introducir la secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26 en el extremo N-terminal de la cadena pesada variable, el plásmido pSNR se manipuló como se describe más abajo. Se subclonó utilizando métodos estándar una región de 1,3 kbp del plásmido pSNR-1 que incluye la secuencia que codifica VH, 118 bp de secuencia de ADN 5' por encima del elemento cebador de la secuencia de VH que codifica el elemento cebador, y 3' por debajo del intrón y de las secuencias amplificadoras IgH. Esta secuencia se define entre los sitios de las enzimas de restricción BamHI y EcoRI y se subclonó en el plásmido pBS (Stratagene) utilizando endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI. El pBS/VH se digirió con PstI en condiciones para aislar un único fragmento parcialmente digerido por PstI, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, citado supra.

El epítopo 12-26 se modificó y después se insertó en la región VH de la inmunoglobulina en una localización que proporciona un plegamiento adecuado de esta región. La secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26 se modificó mediante la adición de la secuencia que codifica los 5 primeros aminoácidos de la región marco (FRI) de la secuencia que codifica VH en el extremo 3' de la secuencia de ADN sintética que codifica el epítopo 12-26. Esta modificación permitió el plegamiento adecuado y se seleccionó para producir una alteración mínima de la estructura terciaria de la molécula de inmunoglobulina. Las regiones de la molécula de Ig que son sitios probables en los que la inserción de un epítopo probablemente no altera la molécula pueden determinarse mediante el análisis de la secuencia de aminoácidos de la molécula de Ig así como de la estructura terciaria. El extremo N-terminal y las regiones CDR de la cadena de Ig son regiones preferibles en las que se pueden insertar los epítopos produciendo una alteración mínima de la estructura terciaria. La inserción en la región N-terminal permite la inserción de polipéptidos mayores \geq 10 kDa.

La secuencia 12-26 modificada que incluye la secuencia de los cinco primeros aminoácidos de la primera región marco de la VH se obtuvo mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Se construyó un plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos de 45 pares de bases que codifica el epítopo 12-16 mediante la clonación de la secuencia sintética de ADN de 45 bases de pares en el sitio BamHI/CIaI de un plásmido pPX1647 que contiene el gen de H-1d flagelina (proporcionado por el Dr. P. Brey, Praxis-Lederle Corp.), un plásmido derivado de pUC119. La secuencia 12-26 modificada se amplificó utilizando técnicas de PCR y dos cebadores.

Los cebadores se denominaron OS-1 y OS-2. El cebador OS-1 contiene la secuencia que codifica el sitio PstI y la secuencia que codifica los 5 primeros aminoácidos de la secuencia 12-26. La secuencia de OS-1 (SEQ ID NO:3) es:

5' TGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG 3'.

El cebador OS-2 fue complementario a la secuencia que codifica el sitio PstI y a la secuencia que codifica los 5 primeros aminoácidos de la primera región marco de VH y a los 6 últimos aminoácidos de la secuencia 12-26. La secuencia de OS-2 (SEQ ID NO:4) es:

5' CGACCTCCTG CAGTTGGACC TGCTTCTTCT TCTCGTATAT 3'.

El producto de 82 bp del método de PCR, es decir, la secuencia 12-26 modificada, se aisló mediante tamiz de agarosa utilizando métodos estándar.

El fragmento de PCR de 82 pares de bases se digirió con PstI para producir un fragmento de 65 pb que codifica el epítopo 12-26 modificado que incluye los 5 primeros aminoácidos de FRI. El fragmento de 65 pb se subclonó en el plásmido pBS en el sitio pST1. La subclonación se realizó mediante la digestión de la secuencia 12-26 modificada con PstI. Los plásmidos seleccionados que contienen el fragmento PstI de 12-26 modificado se secuenciaron para confirmar la presencia de ese fragmento en la orientación adecuada. Los plásmidos que contienen la secuencia 12-26 modificada se refieren como pBS/12-26 y se secuenciaron para confirmar su estructura.

El fragmento 12-26 modificado de pBS/12-26 se subclonó en pBS/VH. La subclonación se llevó a cabo realizando inicialmente una digestión parcial de pBS/VH con PstI para cortar la región VH en el sitio PstI, que está localizado en la secuencia que codifica los aminoácidos 4 y 5 del primer marco de VH. pBS/12-26 se digirió totalmente con PstI. Después de ligar, se seleccionaron los plásmidos que contienen la secuencia 12-26 modificada insertada después de la secuencia que codifica los 5 primeros aminoácidos de la primera región marco de la VH mediante hibridación en filtro de las colonias bacterianas utilizando como sonda un oligonucleótido 12-26 marcado con P^{32}. La secuencia de fusión resultante de VH es como sigue: L-FRI-12-26-FRI (L = secuencia líder; FRI = los 5 primeros aminoácidos de la primera región marco de VH). Se realizó una secuenciación de doble cadena para confirmar el sitio adecuado de la inserción así como la orientación. Estos plásmidos se denominaron pBS/VH/12-26.

La presencia de la secuencia recombinante VH/12-26 en el plásmido se verificó mediante metodologías de secuenciación de ADN. La secuencia de ADN VH que está alrededor y que incluye el inserto 12-26 modificado (SEQ ID NO:5) es como sigue:

1

Se subclonó 12-26/VH modificado recombinante de pBS/VH/12-26 en un plásmido pSV2-neo en los sitios BamHI/ECORI. El plásmido pSV2-neo se deriva a partir de pSNR (Dr. Al Bothwell, Universidad de Yale, New Haven, CT) y contiene V_{H} (unión de NP) insertado en una cadena pesada de IgG_{1}. El fragmento EcoRI de 8,5 kbp de pSNR-1 que contiene las regiones constantes 1-3 (CH 1-3) de la cadena \alpha_{1} también se subclonó en el pSV2-neo. La deleción de una región de 8,5 kbp entre los sitios EcoRI del plásmido pSNR-1, que incluye la secuencia que codifica CH1-3, se llevó a cabo utilizando técnicas estándar como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, Vol 1: Suplemento 3.1.3, John Wiley & Sons (1989). El plásmido completo contiene la secuencia que codifica la cadena pesada variable con la secuencia de 65 pares de bases que codifica el epítopo 12-26 insertada en el extremo N-terminal de la primera región marco de la cadena pesada variable y la secuencia que codifica las regiones constantes 1-3 (CH1-3). Las orientaciones de las secuencias de la región variable modificadas y de las regiones constantes se verificaron mediante análisis de restricción por Southern, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, citado supra. Los recombinantes exitosos se seleccionaron mediante ampicilina y se creció una preparación a gran escala del plásmido utilizando métodos estándar.

Ejemplo II Expresión de construcciones recombinantes de la inmunoglobulina de fusión p12-26

Los plásmidos recombinantes que contienen la secuencia que codifica tanto la fusión VH/12-26 como CH1-3 de IgG1 se introdujeron en células anfitrionas y se detectó la expresión de la proteína de fusión. La transformación y la detección de la expresión se llevaron a cabo utilizando métodos estándar como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, citado supra.

La construcción de ADN 12-26 IgG1 (Q3) así como la construcción control pSNR (P6) se sometieron a electroporación en células de mieloma J558L que sintetizan sólo cadenas ligeras \lambda. Los integrantes estables se seleccionaron mediante crecimiento en presencia del antibiótico G418. Los transfectomas que expresan la proteína de fusión 12-26 IgG1 se identificaron mediante el análisis de los sobrenadantes de los cultivos celulares por transferencia Western y ELISA.

Los transfectomas se crecieron hasta lograr una densidad alta en medio sin suero (RPMI-1640 con 5% FCS) en botellas con rodillos y en cultivo. La purificación a partir de los sobrenadantes sin suero de los transfectomas se consiguió mediante la unión a sefarosa-proteína-A a pH 8, con elución a pH 4, así como con columnas de afinidad con anti IgG de raton.

Los sobrenadantes purificados de clones seleccionados se analizaron para detectar la expresión de epítopos 12-26 mediante transferencia Western y ELISA mediante métodos estándar. (Véanse las Figuras 2 y 3). En el caso de la transferencia Western, las muestras se sometieron a electroforesis en 10% SDS-PAGE. Los geles se transfirieron a nitrocelulosa y se ensayaron con anti IgG de ratón (carriles de la izquierda) o con anticuerpo monoclonal B3.11 anti 12-26 (carriles de la derecha) y con anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina como reactivos secundarios. Los resultados se muestran en la Figura 2. Sólo los sobrenadantes de los cultivos celulares de los transfectomas que contienen la construcción 12-26 IgG1 (Q3) reaccionaron con los anticuerpos específicos frente a IgG de ratón (carriles de la izquierda) y con los anticuerpos específicos frente al epítopo 12-26 (carriles de la derecha).

En el caso de los ensayos de inhibición competitiva de ELISA, se mezcló anticuerpo monoclonal B3.11 previamente titulado con cantidades crecientes del péptido 12-26, o del péptido 12-26 acoplado químicamente a globulina gamma de conejo (RGG/12-26), ó 12-26 IgG1 (Q3). Mediante métodos estándar se determinó la capacidad de las mezclas de unirse al péptido 12-26 inmovilizado. Los resultados, mostrados en la Figura 3, indican que la proteína de fusión 12-26 IgG fue capaz de inhibir de manera eficaz la unión del anticuerpo monoclonal al epítopo 12-26 en comparación con el péptido 12-26 en disolución.

Los estudios de inhibición competitiva de ELISA muestran que estas inmunoglobulinas de fusión pueden competir de manera eficaz con el péptido sintético libre o con 12-26 conjugado químicamente con IgG de conejo en la unión con el anticuerpo monoclonal B3.11 anti 12-26. Además, 12-26-IgG es inmunogénico frente al epítopo 12-26 cuando se emulsiona en CFA (datos no mostrados). Esto sugiere que el péptido insertado puede procesarse y presentarse de una manera relevante desde un punto de vista fisiológico incluso en el contexto de una molécula IgG propia. Los experimentos también indican que las inmunoglobulinas de fusión 12-26 pueden estimular la producción de IL-2 (determinada por ensayo CTLL) en un hibridoma específico para 12-26 de células T restringido para H-2^{d} (9C127) (datos no mostrados).

Ejemplo III Inducción de tolerancia en ratones con la proteína de fusión 12-26 IgG1

Un pretratamiento de animales con el péptido 12-26 a dosis altas inyectado intravenosa o intraperitonealmente en disolución salina o emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA), puede inducir tolerancia de células T colaboradoras después de una inmunización posterior con el péptido en adyuvante completo de Freund (CFA). Sherer et al., Symp. on Quant. Biol., Cold Spring Harbor, NY, 54:497 (1989). La inducción de la tolerancia frente al epítopo 12-26 se ha confirmado en ensayos de proliferación de células T. Sin embargo, los animales tratados con el péptido no son tolerantes a nivel de las células B. Es decir, cuando se realiza un pulso con flagelina 12-26 (que proporciona "epítopos transportadores"), la respuesta no disminuyó (véase más abajo). Esto indica que las reducciones con el pulso del péptido se debieron a tolerancia de células T y no de células B.

Con el fin de determinar si la proteína de fusión 12-16 IgG1 puede inducir tolerancia de células B, se llevó a cabo el experimento siguiente. Se cultivaron células de bazo de ratón in vitro en RPMI-1640 + 5% FCS durante 18 horas. Las células de bazo de ratón se incubaron entonces con concentraciones crecientes bien del péptido 12-26 libre, de un conjugado químico de globulina gamma de conejo con 12-26 (RGG-12-26) o de 12-26-IgG1 (Q3). A las 18 horas, estas células de bazo se lavaron y después se sometieron a un pulso bien con lipopolisacárido (un estímulo mitogénico, no mostrado) o con la proteína de fusión A29 de Salmonella flagellin que contiene el péptido 12-26. Previamente se ha visto que la proteína de fusión de Salmonella flagellin que contiene el epítopo 12-26 es inmunogénica tanto in vivo como in vitro (datos no mostrados). Como control para la inducción de la tolerancia, las células de bazo se trataron con una anti inmunoglobulina de conejo que previamente se había visto que induce falta de respuesta in vitro. G. Warner et al., J. Immunol., 146: 2185 (1991). El efecto de anti IgG se muestra como un círculo en blanco en el extremo derecho de cada gráfico. La respuesta de las células se determinó por ELISA. Los resultados se muestran como Figura 4 (proteína de fusión A29 con pulso con péptido 12-26).

Los resultados indican que cuando las células de bazo se someten a un pulso con la proteína de fusión A29, la proteína de fusión 12-26 IgG1 (Q3.13), o el conjugado químico (RGG-12-26) son tolerogénicos a niveles de microgramo. Por el contrario, el péptido libre no inhibe la respuesta de las células B a ninguna dosis. Por lo tanto, estos resultados indican que las proteínas de fusión 12-26 IgG pueden inducir tolerancia en células B in vitro. Se obtuvieron resultados similares in vivo como sigue.

Las proteínas de fusión 12-26-IgG se ensayaron para detectar inducción de la tolerancia in vivo. Se inyectaron ratones CAF_{1} con 1 mg de la proteína de fusión 12-26-IgG, de 12-26-IgG o del péptido libre en disolución salina. Los ratones control recibieron PBS en disolución salina. Las células de bazo de estos ratones se sometieron a un pulso 10 días después con la proteína de fusión 12-26-flagelina in vitro. Se determinó la respuesta frente a 12-26 mediante ensayos de ELISA 4 días después del pulso como se ha descrito para la Figura 4. Los resultados se muestran en la Figura 5.

Los resultados indican que las proteínas de fusión 12-26-IgG así como el conjugado químico (RG-12-26) pueden inducir tolerancia in vivo e in vitro. Véanse las Figuras 4 y 5.

Ejemplo IV Construcción de un vector retroviral que contiene una secuencia de ADN que codifica la proteína de fusión 12-26-IgG1

Se han preparado muchas construcciones de retrovirus que están basadas en el vector retroviral murino de la leucemia Moloney MBAE, como describe Kang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9803 (1990).

El vector retroviral MBAE puede obtenerse del Dr. Hozumi o puede prepararse como describe Kang et al., citado supra. Brevemente, el vector retroviral que contiene las repeticiones terminales largas de leucemia Moloney murina y el gen neo que codifica resistencia frente a G418 se modificó mediante la inserción del cebador y de las secuencias amplificadoras de la \beta-actina. Las secuencias del cebador y del amplificador de la \beta-actina se clonaron por debajo del gen neo. Los genes heterólogos pueden insertarse entonces por debajo del cebador de la \beta-actina mediante subclonación con HindIII y SalI.

Las secuencias de ADN que se subclonaron en MBAE se derivaron a partir de ARN amplificado por PCR con transcriptasa inversa a partir de transfectoma Q3 que contiene la cadena pesada 12-26-IgG. El transfectoma Q3 se preparó como se describe en el Ejemplo II. El ARN del transfectoma Q3 se recogió y se incubó con transcriptasa inversa en una reacción de PCR estándar como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, citado supra, para formar moléculas de ADNc. Las moléculas de ADNc se amplificaron utilizando los cebadores siguientes:

V_{H} 5' cebador (SEQ ID NO: 6):

5' TGG ACT AAG TCG ACA CCA TGG GAT GCA GC

pep 3' cebador (SEQ ID NO: 7):

5' GGC AAC AGA AGC TTT CAC TTC TTC TTC TCG TAT 3'

Este ADNc incluye una secuencia de ADN que codifica la secuencia líder y el epítopo 12-26 del gen de la cadena pesada variable seguido de un codón de parada. El codón de parada se diseñó en el cebador de PCR en el extremo de la secuencia de ADN que codifica el último aminoácido de 12-26 (en el cebador) para construir un minigen de péptido.

Se subclonó una secuencia de ADN que codifica la secuencia líder y la secuencia que codifica el epítopo 12-26 seguido de un codón de parada en pBluescript y se secuenció y después se subclonó en el vector MBAE. La subclonación se llevó a cabo utilizando SalI y HindIII para insertar el minigen del péptido por debajo del cebador y las secuencias amplificadoras de la \beta-actina, como se muestra en la Figura 7.

Los vectores MBAE recombinantes se transfectaron mediante lipofección en la línea celular \Psi-2 obtenida del Dr. N. Hozumi (Toronto, Canadá). Las líneas celulares transfectadas se crecieron en RPMI 5% FCS en presencia de 0,8 mg/ml de G418 crudo. Los clones resistentes a G418 se aislaron mediante dilución limitante y la titulación vírica se determinó en células NIH 3T3 en presencia de 0,8 mg/ml de G418 (peso crudo). En el caso de la construcción del minigen de péptido, se eligió un clon \Psi-2 transfectado (MBAE pEP19) con una titulación de 10^{5}-10^{6} CFU/ml para experimentos posteriores de transferencia génica. Se ensayó la presencia de virus colaboradores utilizando métodos estándar (método de "extensión horizontal de la infección"), como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, citado supra, y no se detectó. Las líneas que producían virus se descongelaron para cada experimento individual.

Una célula de linfoma de células B A20.2J, disponible en ATCC, infectada con el vector vírico expresó y secretó el péptido según se detectó mediante transferencia Western. Véase la Figura 6A. Después de la infección de las células de linfoma de células B A20.2J, las células se crecieron en G418 y se analizaron 200 \mul de los sobrenadantes mediante transferencia Western. Los sobrenadantes de cuatro clones \Psi-2/A20.2J infectados con minigen 12-26 retroviral se transfirieron y se hicieron reaccionar con el anticuerpo monoclonal B3.11 específico frente al epítopo 12-26. Como se puede ver en la Figura 6A, el péptido se expresó en las células de linfoma infectadas.

Las células A20.2J infectadas no sólo producen el péptido sino que también lo presentan a un hibridoma de células T reactivo frente a 12-26. Brevemente, se incubaron volúmenes titulados de los sobrenadantes de células A20.2J infectadas con clones de células T reactivos frente a 12-26 (T32) durante 24-48 horas. Los clones de células T reactivos frente a 12-26 se obtuvieron del Dr. Tom Briner y del Dr. M. Gefter (Massachussets Institute of Technology, Cambridge, MA). La respuesta del clon de células T se determinó mediante incorporación de ^{3}H-timidina y un ensayo de IL-2 estándar. Los resultados se muestran en la Figura 6B. Los resultados indican que las células A20 procesan este péptido de manera que puede presentarse a un clon de células T reactivo frente a 12-26. También se determinó la producción de IL-2 por estos clones y los resultados muestran que las células infectadas producen y secretan el péptido
12-26.

Ejemplo V Preparación de ratones que tienen células de médula ósea transfectadas

Se prepararon ratones con células de médula ósea transfectadas con el vector vírico MBAE 12-26 que codifica el epítopo 12-26 (Figura 7). Se infectaron progenitores de médula ósea de ratones Balb/c con el vector MBAE 12-26 como describe Chambers et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89:1026 (1992). Los ratones Balb/c donantes de médula se pretrataron por vía intravenosa con 150 mg/kg de 5-fluoroacilo durante 3-4 días antes de la recogida de la médula. Las células de la médula fraccionadas se mantuvieron en hielo y después se lavaron con RPMI completo con 15% FCS y 10 unidades/ml de IL-3. Después, las células de la médula ósea se cocultivaron con una capa confluente aproximadamente al 80% de líneas \Psi-2 irradiadas (2.000 rads). El cocoultivo con la línea \Psi-2 adherente que produce virus se realizó a 37ºC durante 48 horas como sigue:

5 x 10^{6} células de médula por 6 pocillos en 10 ml de medio que contiene:

- 15% FCS

- 6 \mu/ml polibreno

- 100 unidades/ml IL-6

- 200 unidades/ml IL-3

Se recogieron las células de médula ósea no adherentes después de 48 horas, se lavaron y se resuspendieron en medio Eaglis tamponado con HEPES. Los ratones Balb/c singénicos receptores se irradiaron letalmente con 900 rads y se inyectaron por vía intravenosa 4 x 10^{6} células en un volumen de 400 \mul a los ratones irradiados. Los ratones receptores se trataron en agua acidificada de 1 a 2 semanas antes del transplante para evitar infecciones por bacterias gram negativas y se mantuvieron en cajas microisolator autoclavadas con alimento autoclavado, y agua acidificada suplementada con antibióticos.

Después de dos semanas, se recogieron las células linfoides de los ratones receptores a partir de sangrados de la cola y se examinaron para detectar la presencia de la secuencia 12-26 mediante RT-PCR. Se detectaron fragmentos de aproximadamente 100 pares de bases tanto en las células linfoides infectadas como en la línea celular \Psi-2 que contiene MBAE 12-26. Véase la Figura 8.

Brevemente, el ARN de células de sangre periférica obtenidas de animales a las dos semanas o de líneas [\Psi]-2 infectadas se sometió a transcripción inversa. Las secuencias de ADN que codifican el epítopo 12-26 se amplificaron utilizando los cebadores V_{H} (SEQID NO: 6) y pep (SEQ ID NO: 7). Los productos amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y los productos que contienen una secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26 se detectaron mediante transferencia Southern. La sonda utilizada para detectar las secuencias que codifican 12-26 es como sigue (SEQ ID NO: 8):

5' - TGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG G - 3'

La hibridación se llevó a cabo bajo condiciones estándar como se describe en Current Protocols, citado supra. Un fragmento detectado en las células de sangre periférica mediante hibridación con la sonda 12-26 indicó que la expresión del epítopo 12-26 se producía en las células 2 semanas después de la administración.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: Universidad de Rochester

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inducción de Tolerancia Con Proteínas de Fusión Tolerogénicas

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Schwegman, Lundberg y Woessner

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 3500 IDS Center

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Minneapolis

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: Minesota

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 55402

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE CUMPLIMENTACIÓN: 10-FEB-1995

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Raasch, Kevin W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 35.651

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 850.014WO1

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 612-339-0331

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 612-339-3061

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGAGGACG CGCGGCGGCT GAAGGCGATA TACGAGAAGA AGAAG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 15 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: desconocida

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Asp Ala Arg Arg Leu Lys Ala lle Tyr Glu Lys Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG G

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGACCTCCTG CAGTTGGACC TGCTTCTTCT TCTCGTATAT

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 75 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 16..61

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTCCAAC TGCAG CTG GAG GAC GCG CGG CGG CTG AAG GCG ATA TAC GAG

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Glu Asp Ala Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAG AAG AAG C AGGTCCAACT GCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\sac{Lys Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGACTAAGT CGACACCATG GGATGCAGC

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAACAGAA GCTTTCACTT CTTCTTCTCG TAT

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG G

\hfill

2

Claims (7)

1. Una composición farmacéutica para inducir tolerancia en un individuo frente a un epítopo tolerogénico o a un antígeno que contiene el epítopo tolerogénico, en la que dicho epítopo tolerogénico es un epítopo frente al que se desea una falta de respuesta inmunológica, dicha composición comprende:

(a)

una célula hemopoyética o linfoide que comprende un vector de expresión capaz de mantener de manera persistente la expresión del epítopo tolerogénico en el individuo, que comprende una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcional en la célula hemopoyética o linfoide, donde la inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo heterólogo insertado en el extremo N-terminal de la región variable de la inmunoglobulina, donde el epítopo heterólogo es el epítopo tolerogénico, y donde el vector de expresión mencionado se mantiene de manera estable en la célula hemopoyética o linfoide mencionada; y

(b)

un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico.

2. Una composición de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la célula es una célula de la médula ósea o una célula linfoide.

3. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la inmunoglobulina de fusión es una IgG.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que el individuo es un ser humano.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la célula hemopoyética o linfoide se deriva a partir del individuo en el que se va a inducir la tolerancia.

6. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la célula es una célula de la médula ósea.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el antígeno es un antígeno asociado a una enfermedad autoinmune o a una reacción alérgica en el individuo.