ES2233940T3 - Induccion de tolerancia con proteinas de fusion tolerogenicas. - Google Patents
Induccion de tolerancia con proteinas de fusion tolerogenicas.Info
- Publication number
- ES2233940T3 ES2233940T3 ES95910220T ES95910220T ES2233940T3 ES 2233940 T3 ES2233940 T3 ES 2233940T3 ES 95910220 T ES95910220 T ES 95910220T ES 95910220 T ES95910220 T ES 95910220T ES 2233940 T3 ES2233940 T3 ES 2233940T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- epitope
- immunoglobulin
- fusion
- cells
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Lining Or Joining Of Plastics Or The Like (AREA)
- Fuses (AREA)
- Burglar Alarm Systems (AREA)
- Control Of High-Frequency Heating Circuits (AREA)
Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA METODOS Y COMPOSICIONES PARA INDUCIR Y MANTENER LA TOLERANCIA A EPITOPES O ANTIGENOS QUE CONTIENEN LOS EPITOPES. LAS COMPOSICIONES INCLUYEN CASSETTES Y VECTORES DE EXPRESION QUE INCLUYEN SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN UNA INMUNOGLOBULINA DE FUSION OPERABLEMENTE LIGADA A REGIONES DE CONTROL TRANSCRIPCIONAL Y TRANSLACIONAL FUNCIONAL EN UNA CELULA HEMOPOYETICA O LINFOIDE. LA INMUNOGLOBULINA DE FUSION INCLUYE AL MENOS UN EPITOPE TOLEROGENICO HETEROLOGO EN LA REGION VARIABLE N-TERMINAL DE LA INMUNOGLOBULINA. LAS CELULAS ESTABLEMENTE TRANSFORMADAS CON EL VECTOR DE EXPRESION SON FORMADAS Y USADAS PARA PRODUCIR LA INMUNOGLOBULINA DE FUSION. LA INVENCION ADEMAS PROPORCIONA METODOS PARA LA PROTECCION CONTRA NUEVOS EPITOPES TOLEROGENICOS Y PARA INDUCIR Y MANTENER LA TOLERANCIA. LOS METODOS DE LA INVENCION SON UTILES EN EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE RESPUESTAS AUTOINMUNES O INMUNOALERGICAS.
Description
Inducción de tolerancia con proteínas de fusión
tolerogénicas.
La discriminación propio/no propio es una de las
piedras angulares de la inmunología. Normalmente, los individuos
desarrollan tolerancia frente a los constituyentes propios durante
el desarrollo temprano del sistema inmune. Sin embargo, el
mantenimiento de este estado de falta de respuesta requiere la
persistencia del antígeno, un hecho que implica que la inducción de
la tolerancia es un proceso que dura toda la vida. Smith,
Advances in Immunology, 1:67 (1961). De hecho, la
desaparición de la tolerancia en individuos viejos explica el
incremento de la incidencia de la autoinmunidad en poblaciones que
envejecen.
Se han utilizado globulinas gamma isólogas o
heterólogas como moléculas tolerogénicas transportadoras
(principalmente IgG). Scott, Immunol. Rev., 43:241
(1979). Aunque las diferentes fuentes de IgG pueden variar en cuanto
a su persistencia y/o a su mecanismo de inducción de la tolerancia,
las IgG transportadoras han sido con mucho las más eficaces para
inducir tolerancia en adultos frente a haptenos, nucleósidos y
péptidos. Borel, Immunological Reviews, 50:71 (1980);
y Scott, Cell Immunol., 22:311 (1976). Estos
transportadores deben su tolerogenicidad superior a su persistencia
in vivo y a la capacidad de los epítopos unidos químicamente
a IgG de entrecruzar IgMm con los receptores Fc de las células B.
Sin embargo, el entrecruzamiento químico de epítopos a IgG
transportadoras está limitado por la disponibilidad de grupos amino
libres y por la unión sin control del determinante añadido a zonas
diferentes de la
IgG.
IgG.
La tecnología de ADN recombinante puede
utilizarse para construir mediante ingeniería genética moléculas que
tienen epítopos heterólogos. Por ejemplo, se han expresado epítopos
heterólogos de oligopéptidos con interés biológico en la flagelina
bacteriana (Jennings et al., Protein Eng.,
2:365 (1989)); en el antígeno de superficie de la hepatitis B
(Rutgers et al., Biotechnology, 6:1065 (1988));
y en las regiones determinantes de complemento de las
inmunoglobulinas (Zanetti et al., Nature,
355:476 (1992)). Se han realizado algunos intentos para
ensayar la capacidad de las proteínas recombinantes de servir como
antígenos para inmunizar animales y de generar respuestas inmunes
frente al oligopéptido heterólogo. Sin embargo, no se ha demostrado
la inducción y el mantenimiento de la tolerancia frente a
oligopéptidos presentados al sistema inmune. La capacidad de
mantener la tolerancia frente a un antígeno o un epítopo requiere la
persistencia del epítopo in vivo.
Por lo tanto, existe una necesidad de desarrollar
un método para inducir tolerancia estable y duradera frente a un
epítopo. Existe una necesidad de desarrollar un vector que pueda
proporcionar persistencia del epítopo in vivo de manera que
se mantenga la tolerancia. Existe una necesidad de desarrollar un
vector recombinante que codifique un polipéptido recombinante que
tenga un epítopo heterólogo y que pueda utilizarse para inducir y
mantener la tolerancia en individuos.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona una composición farmacéutica para inducir tolerancia
frente a un epítopo tolerogénico o un antígeno que contiene el
epítopo tolerogénico en un individuo, donde dicho epítopo
tolerogénico es un epítopo frente al que se desea una falta de
respuesta inmunológica, dicha composición comprende:
(a) una célula hemopoyética o linfoide que
comprende un vector de expresión capaz de mantener de manera
persistente la expresión del epítopo tolerogénico en el individuo,
que comprende una secuencia de ADN que codifica un inmunoglobulina
de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la
transcripción y de la traslación funcionales en la célula
hemopoyética o linfoide, donde la inmunoglobulina de fusión tiene al
menos un epítopo heterólogo insertado en el extremo
N-terminal de la región variable de la
inmunoglobulina, donde el epítopo heterólogo es el epítopo
tolerogénico, y donde el vector de expresión mencionado se mantiene
de manera estable en la célula hemopoyética o linfoide mencionada;
y
(b) un excipiente aceptable desde un punto de
vista farmacéutico.
La invención proporciona composiciones para
inducir y mantener la tolerancia frente a epítopos y antígenos que
contienen estos epítopos. Los métodos también se describen. Los
métodos y las composiciones son útiles para identificar epítopos
tolerogénicos o antígenos que contienen dichos epítopos nuevos. Los
métodos y la composición también son útiles para inducir y mantener
la tolerancia frente a epítopos o antígenos que contienen los
epítopos asociados a respuestas autoinmunes o a respuestas alérgicas
inmunes.
Las composiciones incluyen un casete de expresión
y un vector. El casete de expresión y el vector pueden utilizarse
para formar células transformadas. El casete de expresión comprende
una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión
unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción
y la traslación funcionales en una célula hemopoyética o linfoide.
La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo tolerogénico
heterólogo en el extremo N-terminal de la región
variable de la molécula de inmunoglobulina. Un vector incluye el
casete de expresión y es un vector que puede proporcionar un
mantenimiento estable, es decir, proporciona la expresión génica del
casete de expresión en la célula hemopoyética o linfoide a lo largo
de toda la vida de la célula. Las células hemopoyéticas o linfoides
se transforman de manera estable con un vector para proporcionar
células transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión.
También describimos más abajo composiciones
farmacéuticas que comprenden una cantidad de una inmunoglobulina de
fusión suficiente para inducir y/o mantener la tolerancia combinada
con un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico. La
inmunoglobulina de fusión incluye al menos un epítopo tolerogénico
heterólogo en el extremo N-terminal de la región
variable de la inmunoglobulina.
También describimos métodos para identificar
epítopos o antígenos que contienen epítopos que pueden servir como
tolerógenos nuevos. Los métodos implican transformar células de
manera estable con un casete de expresión que codifica una
inmunoglobulina de fusión para formar una población de células
transformadas que producen o expresan la inmunoglobulina de fusión.
La inmunoglobulina de fusión que tiene uno o más de un epítopo de un
antígeno que se sospecha que es capaz de inducir tolerancia, puede
ensayarse para detectar su capacidad de inducir tolerancia frente al
epítopo de diferentes formas. Un método para determinar si la
inmunoglobulina de fusión puede inducir tolerancia es administrar a
un animal una cantidad tolerogénica de la inmunoglobulina de fusión.
En otro método, las células transformadas que expresan la
inmunoglobulina de fusión pueden administrarse a un animal para
determinar si la tolerancia frente al epítopo puede inducirse y/o
mantenerse. En un tercer método, los epítopos o los antígenos que
contienen el epítopo pueden identificarse mediante su reactividad
con suero inmune alérgico o autoinmune o con linfocitos.
Las composiciones de la invención son para
utilizarse en métodos para inducir y mantener la tolerancia frente a
un epítopo en un animal. En este método, las células transformadas
que expresan una inmunoglobulina de fusión se administran a un
animal para inducir y mantener la tolerancia. También describimos un
método que implica administrar una cantidad tolerogénica de una
inmunoglobulina de fusión suficiente para inducir y/o mantener
tolerancia frente al epítopo heterólogo de la inmunoglobulina de
fusión. En otro método, se administra una composición farmacéutica
que incluye una inmunoglobulina de fusión para inducir tolerancia
frente al epítopo heterólogo y después se administran las células
transformadas que expresan la inmunoglobulina de fusión para
mantener la tolerancia frente al epítopo heterólogo.
Figura 1: Estrategia para la preparación de una
construcción de ADN murino que codifica una inmunoglobulina de
fusión que incluye el epítopo 12-26 de la proteína
represora \lambda-CI en el extremo
N-terminal de IgG1: (A) Un mapa del plásmido pSNR
que contiene la secuencia genómica de una cadena \gamma1 H,
modificada como se describe en el Ejemplo 1. (B) Mapa de restricción
y secuencia que muestra la secuencia de ADN que codifica el epítopo
12-26 combinado con la secuencia de ADN que codifica
la región variable de la cadena pesada.
Figura 2: Detección de un epítopo heterólogo en
la proteína de fusión 12-26-IgG. La
construcción 12-26-IgG (Q3), así
como la construcción control pSNR (P6) se sometieron a
electroporación en células de mieloma J558L, que sólo sintetizan
cadenas ligeras \lambda. Las IgG recombinantes se purificaron a
partir de los sobrenadantes de las células transformadas con
sefarosa-anti IgG de ratón o con columnas de
sefarosa-proteína A. Transferencia Western: las
muestras se sometieron a electroforesis en SDS-PAGE
10%. Los geles se transfirieron a nitrocelulosa y se ensayaron con
anti IgG de ratón (carriles de la izquierda) o con anticuerpo
monoclonal B3.11 anti 12-26 (carriles de la derecha)
más anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina como reactivos
secundarios.
Figura 3: Curvas de inhibición en ELISA. Se
mezcló anticuerpo monoclonal B3.11 titulado previamente con
cantidades crecientes del péptido 12-26, péptido
12-26 acoplado químicamente a globulina gamma de
conejo (RGG/12-26), o Q3 (proteína de fusión
recombinante 12-26 IgG1).
Figura 4: Inducción de tolerancia por la proteína
de fusión 12-26-IgG determinada
in vitro. Se cultivaron células de bazo durante 18 horas con
cantidades crecientes de péptido 12-26 o de la
proteína de fusión 12-26-IgG (Q3.13)
o de un conjugado 12-26-globulina
gamma de conejo (RGG). Después, las células se lavaron y se
sometieron a un pulso con un antígeno que contiene el epítopo
12-26
(12-26-fagelina) y se llevaron a
cabo ensayos de ELISA en los sobrenadantes del día 4.
Figura 5: Inducción de tolerancia in vivo
con 12-26-IgG. Se inyectaron ratones
Balb/c con una dosis tolerizante de IgG control (P6) a 1 mg/ratón
[barras negras], con el péptido 12-26 a 100
\mug/ratón, con el conjugado químico de 12-26
conjugado químicamente con globulina gamma de conejo
(12-26-RGG) a 1 mg/ratón [barra
rayada] y con la inmunoglobulina de fusión (Q3.13) a 1 mg/ratón
[barra punteada]. Después de 7 días, se evaluaron las células de
bazo para determinar la respuesta al pulso in vitro con un
antígeno que contiene el epítopo 12-26 como se
describe en la Figura 4.
Figura 6A: Transferencia Western que muestra la
expresión del péptido 12-26 en los sobrenadantes de
las células A20.2J infectadas con el vector
MBAE-12-26. Los sobrenadantes se
trasnfirieron a nitrocelulosa y se ensayaron con el anticuerpo B3.11
anti 12-26. MBpepA, MBpepB, MBpepC y MBpepD
representan de manera individual clones de A20.2J infectados que
producen el péptido 12-26 que codifican el vector
MBAE-12-26.
\newpage
La Figura 6B muestra la proliferación de un clon
de células T
anti-12-26-IgG TH1
en respuesta a la incubación con sobrenadantes de células A20
infectadas con el vector MBAE-12-26
o con sobrenadantes control.
La Figura 7 muestra la construcción de un vector
retroviral MBAE que contiene la secuencia de ADN que codifica el
epítopo 12-26.
La Figura 8 muestra una transferencia Southern de
ADNc preparada a partir de productos de la reacción en cadena de la
polimerasa con transcriptasa inversa (PCR) a partir de células de la
médula ósea infectadas con
MBAE-12-26 después de madurar en
receptores irradiados. Las células de sangre periférica se
obtuvieron a partir de ratones 2 semanas después de recibir las
células de médula ósea infectadas. El ARN se sometió a transcriptasa
inversa y se llevó a cabo PCR con cebadores V_{H} y
12-26. Los geles se ensayaron con una sonda de
oligonucleótido complementaria a la secuencia de ADN que codifica el
epítopo 12-26. El experimento demuestra la expresión
de ARNm que codifica el epítopo 12-26 basado en
RT-PCR de ARN de células de sangre periférica
después de 2 semanas del transplante de médula ósea.
La invención proporciona composiciones y métodos
para inducir y mantener la tolerancia frente a antígenos. Las
composiciones incluyen un casete de expresión y un vector que
comprenden una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de
fusión unida de manera operativa a regiones de control de la
transcripción y la traslación funcionales en una célula hemopoyética
o linfoide. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo
heterólogo localizado en el extremo N-terminal de la
región variable de la cadena de la inmunoglobulina. Los vectores son
preferiblemente aquellos vectores que pueden proporcionar una
integración estable del casete de expresión en una célula
hemopoyética. De acuerdo con la invención, las células se
transforman con los vectores. También describimos inmunoglobulinas
de fusión que tienen un epítopo heterólogo en el extremo
N-terminal que pueden utilizarse en una composición
farmacéutica que proporciona la inducción de la tolerancia frente al
epítopo y/o frente a su antígeno. También describimos métodos para
identificar antígenos y epítopos tolerogénicos nuevos, así como
métodos para inducir y mantener la tolerancia frente a un
antígeno.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, el
término "antígeno" se refiere a un agente que es capaz de
incitar una respuesta inmune en un animal.
Un "epítopo" es una parte del antígeno que
es capaz de incitar una respuesta inmune y que se combina con un
anticuerpo específico para esa parte del antígeno.
Un "epítopo heterólogo" es un epítopo que
normalmente no está asociado con la molécula de inmunoglobulina
transportadora. Se obtiene o se deriva a partir de un antígeno que
no es el mismo que la molécula de inmunoglobulina
transportadora.
Una "célula hemopoyética" es una célula que
puede formar células sanguíneas que incluyen linfocitos y macrófagos
de tejidos tales como células de la médula ósea y de otros tejidos
extra medulares.
Un "casete de expresión o vector" se
mantiene de manera estable en una célula hemopoyética o en otro tipo
de célula bien cuando se integra en el cromosoma de manera que el
casete de expresión o vector se replica y se transmite a las células
de la progenie o cuando se mantiene en la célula sin perder
actividad funcional, es decir, expresión génica, durante toda la
vida de la célula.
Un "epítopo tolerogénico" es un epítopo que
puede inducir una falta de respuesta inmunológica frente al epítopo
y/o frente a un antígeno que contiene un epítopo. Un epítopo
tolerogénico se selecciona debido a un deseo de inducir una falta de
respuesta inmunológica frente al epítopo y/o frente a un antígeno
que contiene el epítopo. Un epítopo tolerogénico puede identificarse
como un epítopo que puede estimular una respuesta inmune si se
presenta de manera apropiada al sistema inmune o puede ser un
antígeno propio que normalmente puede no incitar una respuesta
inmune. Un epítopo tolerogénico puede interaccionar con las células
T o con las células B o con ambas. Los epítopos tolerogénicos
adecuados que pueden seleccionarse son preferiblemente aquellos
epítopos y/o antígenos asociados con enfermedades autoinmunes o con
reacciones alérgicas.
Un casete de expresión para utilizarse en la
invención incluye una secuencia de ADN que codifica una
inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de
control de la transcripción y la traslación funcional en una célula
hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina de fusión incluye al
menos un epítopo tolerogénico heterólogo en el extremo
N-terminal de la región variable. El casete de
expresión se incorpora preferiblemente en un vector que proporciona
el mantenimiento y la expresión estable del casete de expresión en
la célula anfitriona. Si la célula anfitriona es una célula
hemopoyética, el vector es preferiblemente un vector que proporciona
la integración del vector en el cromosoma de la célula hemopoyética.
Si la célula anfitriona es una línea celular linfoide, el vector
puede no integrarse tal como un plásmido siempre que proporcione el
mantenimiento y la expresión estable del casete de expresión durante
toda la vida de la célula. Los casetes de expresión y los vectores
de la invención son útiles para proporcionar inmunoglobulinas de
fusión para utilizarse como agentes tolerogénicos y/o para
proporcionar el mantenimiento de la tolerancia frente a un antígeno
y/o frente a un epítopo.
Una secuencia de ADN que codifica una
inmunoglobulina de fusión puede obtenerse y construirse utilizando
métodos estándar como se describe en Current Protocols in
Molecular Biology, Capítulo 3, J. Wiley/Greene Press (1992). Las
secuencias de ADN que codifican inmunoglobulinas pueden obtenerse
utilizando métodos conocidos como los descritos por Hebell et
al., Science, 254:102 (1991) y Huse et al.,
Science, 246:1275 (1989). Brevemente, las secuencias
de las cadenas pesadas y ligeras pueden obtenerse mediante la
utilización de la reacción en cadena de la polimerasa con
transcriptasa inversa (RT-PCR) de ARN mensajero
(ARNm) aislado a partir de células del bazo o, preferiblemente, de
hibridomas que producen un anticuerpo con una especificidad
conocida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar las
secuencias de las cadenas ligeras y pesadas que incluyen el
fragmento Fd (V_{H}-CH1). Los ejemplos de dichos
cebadores se describen en Huse et al., citado supra y
en Ballard et al., PNAS, 83:9626 (1986).
Típicamente, dichos cebadores se diseñan para incluir secuencias de
reconocimiento de enzimas de restricción en ambos extremos de la
secuencia que se va a amplificar. Las secuencias de reconocimiento
de las endonucleasas de restricción son conocidas para las personas
especializadas en el campo y pueden seleccionarse para proporcionar
una clonación sencilla en un vector en una localización
específica.
Las secuencias de ADN que codifican las cadenas
ligeras y pesadas de las inmunoglobulinas son preferiblemente
secuencias de ADNc de manera que se ha eliminado cualquier secuencia
de ADN intermedia y la secuencia de ADN codifica una inmunoglobulina
totalmente funcional. La secuencia de ADN que codifica la molécula
de inmunoglobulina puede codificar una inmunoglobulina completa que
tiene las cadenas pesadas y ligeras con el fragmento Fc o puede
codificar partes de la inmunoglobulina tales como el fragmento Fab,
fragmento F(ab)_{2}, o sólo la cadena pesada. Se
pueden hacer modificaciones en la secuencia de ADN que codifica la
cadena pesada y todavía resulta una molécula de inmunoglobulina de
fusión cuando la secuencia de ADN que codifica la cadena pesada se
expresa en una célula del linaje de las células B que puede
suministrar cadenas ligeras para formar la inmunoglobulina. La
secuencia de ADN puede codificar una forma de la molécula de
inmunoglobulina secretada o de membrana.
Los ejemplos adecuados de una secuencia de ADN
que codifica la cadena pesada de un anticuerpo específico frente a
nitrofenilo están descritos por Hebell et al., citado
supra. IgG1 o IgG2 (ratón) se prefieren como moléculas
transportadoras para inducir tolerancia. La secuencia de ADN
codifica, preferiblemente, la cadena pesada de tipos IgG1 o IgG2 de
inmunoglobulina.
Se puede obtener y preparar mediante métodos
estándar una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo
tolerogénico de un antígeno. Si el epítopo es un péptido pequeño de
15-20 aminoácidos, la secuencia de nucleótidos que
codifica ese epítopo puede sintetizarse utilizando síntesis de ADN
automatizada. Si la secuencia de ADN codifica todo o una parte de un
antígeno (es decir, codifica muchos epítopos), la secuencia de ADN
que codifica ese antígeno puede aislarse y subclonarse utilizando
métodos publicados. Las secuencias de ADN que codifican todo o una
parte de algunos antígenos también pueden identificarse mediante la
búsqueda en una base de datos como GenBank. Una vez que la secuencia
se ha identificado en una base de datos como ésta o mediante
referencia a publicaciones, la secuencia de ADN que codifica todo o
una parte de un antígeno puede obtenerse mediante síntesis
automatizada o mediante la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Por ejemplo, la secuencia de ADN que codifica el antígeno E
del polen de ambrosía ha sido descrito por Rafner et al.,
J. Biol. Chem., 266:1229 (1991); y Kuo et al.,
Molecular Immunol., 30:1077 (1993). Los epítopos del
antígeno E también se han identificado como describe Olson, J.
Immunol., 136:2109 (1986); y Bond et al., J.
Immunol., 146:3380 (1991). Se puede obtener mediante
métodos estándar una secuencia de ADN que codifica uno o más de los
epítopos del antígeno E como se describe en Kuo et al.,
citado supra.
Los antígenos adecuados son aquellos que
inducirían o mantendrían una falta de respuesta inmunológica frente
al epítopo y/o frente al antígeno que contiene el epítopo. Dichos
antígenos incluyen polen, ambrosía, ácaros del polvo, y otros
alergenos conocidos. Los antígenos adecuados también incluyen
autoantígenos tales como factor de coagulación VIII, receptores de
acetilcolina, colágeno, proteína básica de mielina, tiroglobulina, y
antígenos de histocompatibilidad. Un antígeno adecuado también
incluye los epítopos de la proteína represora
\lambda-CI. Las secuencias de aminoácidos de
muchos de estos antígenos así como las de los epítopos de estos
antígenos son conocidas para las personas especializadas en el
campo. Los antígenos preferidos incluyen antígeno E de ambrosía y
factor de coagulación VIII. Las secuencias de ADN que codifican
antígenos adecuados pueden obtenerse y prepararse como se describe
en la presente memoria y de acuerdo con métodos publicados.
Antes de que obtenga y se prepare una secuencia
de ADN que codifica al menos un epítopo tolerogénico, se selecciona
el epítopo y/o el antígeno. El epítopo y/o el antígeno puede ser un
epítopo único o puede ser todo o una parte de un antígeno que
contiene muchos epítopos. El epítopo puede interaccionar con las
células T, o puede interaccionar con las células B, o puede
interaccionar con las células T y/o con las células B.
La selección del epítopo y/o de los epítopos
puede realizarse en base a los criterios siguientes. Los epítopos se
seleccionan en primer lugar por su capacidad para inducir tolerancia
frente al péptido o a un antígeno que contiene el epítopo,
preferiblemente un antígeno asociado con una respuesta alérgica o
una respuesta autoinmune. En segundo lugar, si se desea tolerancia
frente a un antígeno grande y complejo, puede seleccionarse más de
un epítopo para combinarse en una inmunoglobulina de fusión.
Preferiblemente, el antígeno completo puede incluirse en la
inmunoglobulina de fusión. En tercer lugar, los epítopos pueden
seleccionarse si se desea tolerancia de células B y/o T. Las
personas especializadas en el campo conocen determinados epítopos
que son reconocidos por las células T y no por las células B y
viceversa. En cuarto lugar, los epítopos pueden seleccionarse en
base a la reactividad con suero inmune o con linfocitos de
individuos que tienen una respuesta alérgica o autoinmune frente a
un antígeno. Por ejemplo, un epítopo que se sabe que es
inmunodominante o que estimula una respuesta autoanticuerpo potente
puede seleccionarse de manera que la parte del antígeno incluida en
la inmunoglobulina de fusión incluya el epítopo. En quinto lugar, si
no existe información o la información es muy poca acerca de
epítopos del antígeno, puede resultar deseable incluir el antígeno
completo en la inmunoglobulina de fusión.
La secuencia de ADN que codifica un epítopo puede
incluir un epítopo de aproximadamente 5-6
aminoácidos o un antígeno que tiene un peso molecular de hasta
aproximadamente 100.000 daltons. El intervalo de tamaño preferido es
aproximadamente 9 aminoácidos hasta aproximadamente 50.000 daltons.
Por ejemplo, los epítopos que reconocen las células T tienen una
secuencia consenso que incluye aproximadamente 9 aminoácidos. Se
piensa que el tamaño mínimo de un epítopo es aproximadamente
5-6 aminoácidos. El tamaño máximo del antígeno que
puede presentarse en una proteína de fusión es el tamaño que permite
el plegamiento tanto del antígeno como de la molécula de
inmunoglobulina transportadora. Un antígeno preferido es el
fragmento A2 del factor de coagulación VIII que tiene un peso
molecular de aproximadamente 40.000 daltons.
Una vez que se ha seleccionado el epítopo y que
se ha obtenido la secuencia de ADN que codifica ese epítopo, la
secuencia de ADN que codifica el epítopo se combina con la secuencia
de ADN que codifica la inmunoglobulina para formar una secuencia de
ADN que codifica la inmunoglobulina de fusión. La secuencia de ADN
que codifica el epítopo se combina, preferiblemente, con una
secuencia de ADN de la inmunoglobulina en el extremo
N-terminal de la región variable de la cadena pesada
en la orientación y marco adecuados. La localización de la
combinación de la secuencia de ADN que codifica el epítopo puede
variar dependiendo de la localización deseada del epítopo en la
inmunoglobulina de fusión. Si el epítopo es el antígeno completo o
una parte amplia del antígeno (es decir, tiene un peso molecular de
aproximadamente 25.000 hasta aproximadamente 100.000 daltons), la
localización del epítopo en la inmunoglobulina de fusión es tal que
permitirá el plegamiento tanto de la molécula de inmunoglobulina
transportadora como del antígeno o de la parte del antígeno. Cuando
el antígeno y/o la parte del antígeno es un epítopo, se fusiona
preferiblemente con la inmunoglobulina en el extremo amino terminal
de la cadena pesada en los aminoácidos del extremo
N-terminal de la primera región marco. Los epítopos
más pequeños (es decir, aquellos que contienen aproximadamente
5-50 aminoácidos) pueden localizarse en el extremo
N-terminal de la primera región marco o en otras
regiones de la parte variable de la cadena de inmunoglobulina
siempre que el epítopo permanezca expuesto en la superficie exterior
de la molécula de la inmunoglobulina. Preferiblemente, los epítopos
pequeños también pueden combinarse con la inmunoglobulina en los
aminoácidos del extremo N-terminal de la primera
región marco de la cadena pesada.
De manera opcional, la secuencia de ADN que
codifica al menos un epítopo tolerogénico heterólogo puede incluir
secuencias de ADN flanqueantes en uno o en ambos extremos de la
secuencia de ADN. Estas secuencias de ADN flanqueantes pueden
incluir secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción
y/o pueden incluir una secuencia de ADN que codifica una parte de la
secuencia de la inmunoglobulina en el lugar donde las dos secuencias
de ADN se van a combinar. Por ejemplo, una secuencia de ADN que
codifica un epítopo que se combina en el extremo
N-terminal de la primera región marco de una cadena
pesada de una molécula de inmunoglobulina puede incluir una
secuencia de ADN flanqueante que codifica los primeros 5 aminoácidos
de la primera región marco en cualquier extremo o en ambos extremos
de la secuencia de ADN que codifica el epítopo. La secuencia de ADN
flanqueante también puede incluir una secuencia de reconocimiento de
una enzima de restricción. La secuencia de ADN flanqueante tiene
preferiblemente una longitud de aproximadamente 3 a aproximadamente
21 nucleótidos. Cuando la secuencia de ADN flanqueante codifica una
parte de la secuencia de aminoácidos de la inmunoglobulina, la
secuencia se selecciona en el sitio del punto de la combinación de
la secuencia de ADN del epítopo con la secuencia de la
inmunoglobulina. La secuencia de ADN flanqueante que codifica una
parte de los aminoácidos de la inmunoglobulina puede proporcionar
aminoácidos de la inmunoglobulina de fusión que ayuden a lograr el
plegamiento adecuado del epítopo y/o del antígeno y de la
inmunoglobulina en el punto de la fusión. La secuencia de ADN
flanqueante también puede asegurar que la secuencia de ADN que
codifica el epítopo se combina con la secuencia de ADN que codifica
la inmunoglobulina en el marco y en la orientación adecuados.
Las secuencias de ADN que codifican la
inmunoglobulina y el epítopo se combinan utilizando métodos de
subclonación estándar. Se puede ayudar a la combinación de las dos
secuencias de ADN mediante la formación de la secuencia de ADN que
codifica el epítopo con secuencias de ADN flanqueantes que tienen
determinadas secuencias de reconocimiento de enzimas de restricción.
Estas secuencias flanqueantes proporcionan a una persona
especializada en el campo la capacidad de seleccionar la
localización en la que se combinará la secuencia de ADN que codifica
el epítopo con la secuencia de ADN que codifica la inmunoglobulina
de fusión y aseguran que las secuencias se combinan en el marco y la
orientación apropiados. Cuando las secuencias de ADN que codifican
la inmunoglobulina y el epítopo se combinan, forman una secuencia de
ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión o una cadena pesada
de fusión de una molécula de inmunoglobulina.
Debe entenderse que, debido a la degeneración del
código genético, existen varias secuencias de ADN que pueden
codificar una inmunoglobulina y un epítopo que tienen la misma
secuencia de aminoácidos. Este conjunto de secuencias es un conjunto
finito que puede determinarse en base a la secuencia de aminoácidos
del epítopo y de la inmunoglobulina. Las secuencias alternativas de
ADN que codifican una molécula de inmunoglobulina y un epítopo con
la misma secuencia de aminoácidos se contemplan y se incluyen en el
alcance de la invención.
La secuencia de ADN que codifica una
inmunoglobulina de fusión puede combinarse entonces con regiones de
control de la transcripción y la traslación funcionales en una
célula hemopoyética o linfoide. Una región de control que es
importante para la expresión de la secuencia de ADN que codifica una
inmunoglobulina de fusión incluye un cebador. Un cebador adecuado es
el que puede funcionar en una célula hemopoyética o linfoide. El
cebador proporciona preferiblemente una expresión constitutiva de
las secuencias de ADN que codifican la inmunoglobulina de fusión.
Preferiblemente, el cebador también proporciona una cantidad de la
inmunoglobulina de fusión para inducir y/o mantener la tolerancia.
Los ejemplos adecuados de cebadores incluyen el cebador de
\beta-actina, el cebador de SV40, y el cebador del
virus del sarcoma de Rous LTR.
Otras regiones de control de la transcripción y
la traslación incluyen secuencias amplificadoras y secuencias de
terminación de la transcripción y de poliadenilación. Las secuencias
amplificadoras pueden combinarse con y normalmente se encuentran en
o adyacentes a secuencias de cebador. Determinadas secuencias
amplificadoras, tales como las de SV40, son activas en muchas
células de mamífero y proporcionan la estimulación de la
transcripción hasta 1.000 veces respecto a los cebadores homólogos o
heterólogos. Las secuencias de poliadenilación se encuentran por
debajo de la secuencia codificadora y proporcionan la formación
apropiada del ARNm. Las secuencias de poliadenilación pueden
obtenerse a partir de SV40. Las secuencias de terminación de la
transcripción se encuentran unos cientos de nucleótidos por debajo
de las secuencias de poliadenilación.
Estas regiones de control de la transcripción y
la traslación están disponibles en vectores que están disponibles
comercialmente. Una secuencia de ADN que codifica una
inmunoglobulina de fusión o una cadena pesada de fusión puede
combinarse con regiones de control de la transcripción y la
traslación en el marco y la orientación apropiados mediante la
subclonación en un vector que tiene esas regiones de control para
formar un casete de expresión.
Los vectores pueden seleccionarse en base a su
capacidad de proporcionar un mantenimiento y/o una expresión génica
estable en una célula hemopoyética o linfoide. Un vector se mantiene
de manera estable en una célula si puede proporcionar la expresión
de una inmunoglobulina de fusión durante toda la vida de la célula.
El mantenimiento estable puede incluir el mantenimiento y la
expresión de un plásmido en una célula eucariota, preferiblemente
una célula como una célula linfoide. En este caso, el plásmido que
incluye un casete de expresión no se replica de manera autónoma o no
se integra en el cromosoma. La vida de una célula, como una célula
linfoide, es aproximadamente 14 a 60 días en el ratón o puede ser
varios años en los seres humanos. Un vector de plásmido que contiene
un casete de expresión también puede mantenerse en una línea celular
linfoide tal como células J558L sin
replicarse.
replicarse.
Un vector también puede seleccionarse para
proporcionar la integración del casete de expresión en el cromosoma
de la célula anfitriona, como una célula hemopoyética. En una célula
hemopoyética de la médula ósea de un animal, el vector se introduce
en una población mixta de células, algunas de las cuales son células
en división y algunas de las cuales todavía no han empezado a
dividirse. El vector puede integrarse en el cromosoma y después
replicarse junto al cromosoma y transferirse a las células de la
progenie. El vector se integra de manera estable si puede detectarse
la expresión génica en la población de células aproximadamente 1 a
12 semanas después de que las células infectadas se han introducido
en el animal o han sido cultivadas in vitro.
Los vectores adecuados incluyen los plásmidos
tales como pSNR1, pEMBL, pBR322, pRSA101, pUC118,
pUC119, pBluescript, y pComb (Barbas et al., PNAS, 88:7978 (1991)). Los vectores adecuados también incluyen vectores víricos tales como vectores de baculovirus y retrovirales tales como el vector MBAE (Chambers et al., PNAS, 89:1026 (1992)). El vector preferido para las células hemopoyéticas es el vector MBAE.
pUC119, pBluescript, y pComb (Barbas et al., PNAS, 88:7978 (1991)). Los vectores adecuados también incluyen vectores víricos tales como vectores de baculovirus y retrovirales tales como el vector MBAE (Chambers et al., PNAS, 89:1026 (1992)). El vector preferido para las células hemopoyéticas es el vector MBAE.
Una cepa bacteriana que contiene un vector de
plásmido que tiene una secuencia de ADN que codifica una cadena
pesada de fusión se ha denominado E. coli DH5\alpha
(pQ3.EZ). La cepa bacteriana posee el plásmido pQ3.EZ que codifica
la cadena pesada de fusión que tiene un epítopo de
12-26 aminoácidos de la proteína represora
\lambda-CI combinado en el extremo
N-terminal de la primera región marco de la cadena
pesada de un anticuerpo específico frente a nitrofenilo. La cepa
bacteriana se ha depositado en la American Type Culture Collection
en Rockville, MD el 7 de Febrero, 1994 con el No. 69555 de
Registro.
En una versión preferida, una secuencia de ADN
que codifica un epítopo como el epítopo 12-26 de la
proteína represora \lambda-CI se combina con la
secuencia de ADN que codifica una región variable de inmunoglobulina
en el extremo N-terminal de la primera región marco
de la cadena pesada para formar una secuencia de ADN que codifica
una cadena pesada de fusión. La secuencia de ADN que codifica una
cadena pesada de fusión se combina con un cebador de
\beta-actina en un vector retroviral MBAE. El
vector se utiliza preferiblemente para transformar células de médula
ósea u otras células del linaje de las células B que pueden producir
cadenas ligeras. Las cadenas ligeras se combinan con la cadena
pesada de fusión para formar una inmunoglobulina de fusión. De
manera alternativa, puede incluirse una secuencia de ADN que
codifica una cadena ligera en el mismo vector que codifica la cadena
pesada de fusión para proporcionar la expresión de una
inmunoglobulina de fusión.
Se utilizan vectores que contienen casetes de
expresión que codifican una inmunoglobulina de fusión. Las células
transformadas se utilizan en métodos para identificar epítopos
tolerogénicos nuevos y para producir una inmunoglobulina de fusión.
Las células transformadas también pueden introducirse en animales
para inducir y mantener la tolerancia frente al epítopo heterólogo
expresado por las células transformadas o frente a un antígeno que
contiene el epítopo heterólogo.
Las células adecuadas para la transformación
incluyen células hemopoyéticas, células linfoides, y líneas de
células linfoides. Las células incluyen células de la médula ósea,
células linfoides, y las células linfoides J558L. Las células
anfitrionas son, preferiblemente, aquellas que son capaces de formar
y secretar moléculas de inmunoglobulina. La población de células
transformada incluye preferiblemente células del linaje de las
células B y son aquellas que sintetizan cadenas ligeras de manera
endógena. Las células transformadas que se administrarán a los
animales son preferiblemente singénicas o comparten antígenos de
histocompatibilidad idénticos para evitar el rechazo de las células
inyectadas. Para los ensayos de cribado, pueden ser adecuadas las
células anfitrionas bacterianas como E. coli y
semejantes.
El vector puede introducirse en la células
utilizando diferentes métodos conocidos para las personas
especializadas en el campo como transfección mediada por fosfato
cálcico, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos,
electroporación, y transfección mediada por liposomas.
Una vez que el casete de expresión se ha
introducido en las células, las células transfectadas pueden
seleccionarse inicialmente mediante la detección de la presencia de
un gen marcador de selección presente en el vector. Si las células
transfectadas son células de médula ósea o células linfoides, puede
no utilizarse selección. Las células transfectadas se pueden
rastrear para detectar la presencia y/o expresión del casete de
expresión que codifica una inmunoglobulina de fusión. Las células
transfectadas se pueden rastrear para detectar la presencia de un
casete de expresión utilizando una o más técnicas tales como
transferencia Southern, transferencia Northern, PCR con
transcriptasa inversa, transferencia Western, ELISA, e
inmunofluorescencia. Pueden utilizarse sondas de ADN marcadas que se
pueden detectar en transferencias Southern y/o Northern. Las sondas
son lo suficientemente complementarias a las secuencias de
nucleótidos que codifican el epítopo o la parte del antígeno como
para que la sonda de aproximadamente 50 a 100 nucleótidos hibride
bajo condiciones altas de astringencia. Pueden diseñarse cebadores
para la PCR con transcriptasa inversa como se ha descrito
previamente para amplificar las secuencias de ADNc que codifican las
cadenas pesadas y ligeras variables de la molécula de
inmunoglobulina.
Las células transfectadas en las que se está
expresando la inmunoglobulina de fusión también pueden detectarse
utilizando transferencia Western, ELISA, o inmunofluorescencia. Las
cantidades de inmunoglobulinas de fusión que se expresan pueden
detectarse utilizando una transferencia Western cuantitativa.
La cantidad de inmunoglobulina de fusión
producida en un tipo particular de células anfitrionas y con una
secuencia de cebador/amplificador particular puede evaluarse
utilizando una transferencia Western cuantitativa. Las secuencias
del cebador/amplificador que proporcionan la mayor cantidad de
expresión constitutiva de la inmunoglobulina de fusión pueden
determinarse comparando la cantidad de inmunoglobulina de fusión
producida en el mismo tipo de célula anfitriona durante el mismo
periodo de tiempo. Un cebador/amplificador puede seleccionarse para
proporcionar una cantidad suficiente de inmunoglobulina de fusión
para inducir y/o mantener la tolerancia. La cantidad de una
inmunoglobulina de fusión que inducirá tolerancia puede variar de
acuerdo con factores descritos en la presente memoria y puede
determinarse utilizando métodos estándar.
También describimos composiciones farmacéuticas
que incluyen una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de
fusión en un excipiente aceptable desde un punto de vista
farmacéutico. La inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo
tolerogénico heterólogo en el extremo N-terminal de
la región variable de la inmunoglobulina. Preferiblemente, el
epítopo tolerogénico heterólogo se combina con la inmunoglobulina
adyacente al extremo N-terminal de la primera región
marco de la cadena pesada. La inmunoglobulina de fusión se combina
con un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico en
cantidades eficaces para inducir la tolerancia frente al epítopo
tolerogénico o frente a un antígeno que contiene el epítopo en un
animal. La composición farmacéutica puede administrarse a un animal
para inducir y/o mantener la tolerancia frente al epítopo
tolerogénico. La inducción de la tolerancia frente al epítopo o
epítopos puede minimizar las reacciones alérgicas del animal o los
síntomas de enfermedades autoinmunes.
Las inmunoglobulinas de fusión pueden aislarse a
partir de las células transformadas utilizando métodos estándar. Las
inmunoglobulinas de fusión pueden aislarse a partir de sobrenadantes
de las células haciéndolos pasar por columnas de proteína A o por
otras columnas de afinidad de acuerdo con métodos estándar.
Los epítopos tolerogénicos adecuados son aquellos
epítopos asociados con respuestas alérgicas o autoinmunes. Un
epítopo tolerogénico es el que puede administrarse de manera que
resulte en una falta de respuesta inmunológica frente al epítopo y/o
frente a un antígeno que contiene el epítopo. Si el epítopo estimula
una respuesta inmunodominante, la tolerancia frente a ese epítopo
también puede resultar en tolerancia frente a un antígeno que
contiene el epítopo. Los ejemplos específicos incluyen antígeno E o
antígeno K de polen de ambrosía, antígenos de los ácaros del polvo,
antígenos heterólogos de histocompatibilidad, factor de coagulación
VIII, receptores de acetilcolina, proteína básica de mielina, y
tiroglobulina. La inmunoglobulina de fusión puede contener un único
epítopo tolerogénico o múltiples epítopos tolerogénicos.
Preferiblemente, el epítopo tolerogénico es un epítopo que es
inmunodominante en la respuesta alérgica o autoinmune.
La cantidad de la inmunoglobulina de fusión
eficaz para inducir tolerancia en un animal depende de varios
factores pero puede determinarse fácilmente por una persona
especializada en el campo utilizando métodos estándar de dosis
respuesta. Los factores incluyen el tamaño del animal que se va a
tratar, el número y el tipo de los epítopos, el tipo de tolerancia,
la edad del animal, la vía y el número de veces de la
administración, y la duración deseada de la tolerancia.
La edad del animal puede ser un factor importante
para determinar la cantidad tolerogénica eficaz de un epítopo. Un
animal neonato o cría puede requerir aproximadamente 100 a 1.000
veces menos de una dosis única de una inmunoglobulina de fusión
administrada por vía intravenosa que la que requiere un adulto de la
inmunoglobulina de fusión con el fin de inducir tolerancia frente al
epítopo.
Una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina
de fusión también depende del tamaño del animal y típicamente es
aproximadamente 10 a 100 veces mayor (en el caso de tolerancia de
células B) que la cantidad del antígeno y/o del epítopo administrado
al animal para incitar una respuesta inmune protectora, excepto en
el caso de tolerancia de dosis baja. Una cantidad tolerogénica de un
antígeno por unidad de masa es típicamente aproximadamente 1 a 40
mg/kg de peso corporal para inducir tolerancia de dosis alta frente
a un epítopo o un antígeno administrado como una dosis única por vía
intravenosa a un animal. La tolerancia de dosis bajas también se
observa en algunos casos y puede obtenerse después de múltiples
(>4) dosis de cantidades de submicrogramos en disolución salina
en intervalos semanales por vía intraperitoneal o intravenosa.
Otro factor que puede variar la cantidad
tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión es si la
inmunoglobulina de fusión incluye más de un epítopo y si esos
epítopos son inmunodominantes. Si la inmunoglobulina de fusión tiene
múltiples epítopos, algunos de los cuales son inmunodominantes, una
dosis aproximadamente 10 veces menor de la inmunoglobulina de fusión
puede inducir tolerancia cuando se administra a un animal como una
dosis única por vía intravenosa.
La cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina
de fusión también puede variar dependiendo de si se desea tolerancia
de células T o de células B. Típicamente, la tolerancia de células T
requiere una dosis de antígeno o de epítopo aproximadamente 10 a 100
veces menor que la tolerancia de células B frente al mismo epítopo o
antígeno.
Otro factor es la persistencia de la
inmunoglobulina de fusión en la circulación del animal. Un antígeno
que se metaboliza más lentamente proporciona un mantenimiento de la
tolerancia durante periodos de tiempo más largos, típicamente
aproximadamente 2 a 10 veces más tiempo en el mantenimiento de la
tolerancia. La velocidad catabólica de los epítopos o los antígenos
depende de la vida media de la inmunoglobulina transportadora
isóloga o heteróloga así como de la naturaleza del epítopo o
epítopos. La vida media de la inmunoglobulina isóloga o heteróloga
es aproximadamente 7 a 21 días (ratón). Los epítopos que tienen
aminoácidos modificados o inusuales, tales como aminoácidos D, así
como los antígenos o los epítopos complejos, pueden no degradarse
tan rápido como otros tipos de epítopos.
La vía de administración también puede influir en
la cantidad tolerogénica necesaria de la inmunoglobulina de fusión.
En el caso más habitual, se prefiere la administración intravenosa
para inducir tolerancia. El número de veces que se administra el
antígeno también puede influir en la cantidad de inmunoglobulina de
fusión requerida por administración.
Se puede determinar una cantidad tolerogénica
eficaz para un epítopo tolerogénico heterólogo particular en una
inmunoglobulina de fusión mediante la realización de ensayos dosis
respuesta in vivo o in vitro. Los ensayos de dosis
respuesta in vitro pueden llevarse a cabo, por ejemplo,
utilizando ensayos estándar de proliferación de linfocitos. Por
ejemplo, se pueden combinar linfocitos de un animal alérgico o
autoinmune con diferentes dosis de la inmunoglobulina de fusión y
determinarse la proliferación.
La dosis respuesta in vivo puede
determinarse mediante la administración de diferentes dosis de la
inmunoglobulina de fusión en un excipiente a un animal. La falta de
respuesta inmune frente al epítopo tolerogénico heterólogo puede
determinarse evaluando la respuesta específica de anticuerpo frente
al epítopo tolerogénico heterólogo o la proliferación de linfocitos
en respuesta a un pulso de la inmunoglobulina de fusión.
La inducción de la tolerancia se evalúa mediante
la determinación de un descenso de la falta de respuesta
inmunológica. Los métodos para determinar la respuesta inmunológica
pueden llevarse a cabo con presentación y pulso con el antígeno
in vivo o in vitro y son conocidos para las personas
especializadas en el campo. Por ejemplo, se puede determinar la
cantidad de anticuerpo específico frente al epítopo y/o al antígeno
así como la proliferación de linfocitos en respuesta a un pulso con
el epítopo o con la inmunoglobulina de fusión. El descenso de la
respuesta inmunológica que indica que la tolerancia ha sido inducida
puede ser una reducción de aproximadamente 2 veces a 100 veces,
preferiblemente aproximadamente 20 veces a 100 veces, de la
respuesta de anticuerpos o linfocitos. El intervalo del descenso
puede variar dependiendo de la sensibilidad del ensayo utilizado
para determinar la respuesta inmunológica. Por ejemplo, se sabe que
un descenso del número de células productoras de anticuerpos es más
sensible que un descenso de la cantidad de anticuerpo. El intervalo
del descenso también puede variar si el epítopo es un epítopo
inmunodominante. Un cambio de 2 veces en la respuesta frente a un
epítopo inmunodominante puede resultar en niveles significativos de
tolerancia frente al epítopo y/o a un antígeno que contiene el
epítopo.
Una dosis única de una inmunoglobulina de fusión
puede inducir tolerancia. En algunos casos, la tolerancia inducida
por una dosis única en el ratón puede durar de aproximadamente 2
meses hasta aproximadamente 6 meses. Si embargo, para que la
tolerancia se mantenga en un animal, típicamente se requieren dosis
múltiples. El mantenimiento de la tolerancia puede resultar deseable
durante al menos la cantidad de tiempo inducida por una dosis única
de la inmunoglobulina de fusión hasta toda la vida del animal.
Una cantidad tolerogénica de la inmunoglobulina
de fusión se combina con un excipiente fisiológico como disolución
salina, disolución salina tamponada y adyuvante de Freund
incompleto. La inmunoglobulina de fusión puede administrarse por
diferentes vías tales como intraperitoneal, oral, e intravenosa pero
se administra preferiblemente por la vía intravenosa. Los animales
pueden tratarse entonces para inducir tolerancia frente a alergenos
o autoantígenos que incluyen ratones, seres humanos, ratas, conejos
y cobayas.
También describimos métodos para identificar
epítopos que pueden servir como epítopos tolerizantes. La
identificación de epítopos tolerogénicos nuevos podría ser útil para
el diagnóstico y tratamiento de respuestas autoinmunes y alérgicas.
Un método incluye las etapas de proporcionar un vector que incluye
una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión
unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción
y la traslación funcionales en una célula anfitriona. La
inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo heterólogo en el
extremo N-terminal de la región variable. El epítopo
puede ser uno que se sospeche que es capaz de inducir tolerancia.
Las células se transforman de manera estable con el vector como se
ha descrito previamente. Las células transformadas que expresan la
inmunoglobulina de fusión o la inmunoglobulina de fusión aislada se
analizan para detectar su capacidad de inmunoreaccionar con suero
inmune o linfocitos de animales alérgicos o autoinmunes. La
inducción de la tolerancia frente a una inmunoglobulina de fusión
que se ha identificado mediante reactividad con suero inmune o
linfocitos de animales autoinmunes o alérgicos puede evaluarse
mediante métodos in vitro o in vivo conocidos para las
personas especializadas en el campo. Por ejemplo, las
inmunoglobulinas de fusión que reaccionan con suero inmune y/o
estimulan la proliferación de linfocitos pueden administrarse a un
animal y se puede evaluar la inducción y el mantenimiento de la
tolerancia como se describe en la presente memoria.
En otro método, las células hemopoyéticas o
linfoides transformadas pueden introducirse en un animal y la
inducción y el mantenimiento de la tolerancia frente al epítopo
heterólogo pueden determinarse utilizando ensayos para evaluar la
respuesta inmunológica específica frente al epítopo como se ha
descrito previamente.
Se sabe que algunos epítopos y antígenos incitan
respuestas inmunes. Se sabe que algunos epítopos y antígenos incitan
respuestas inmunes inmunodominantes asociadas con respuestas inmunes
alérgicas o autoinmunes. Estos epítopos que incitan respuestas
inmunes pueden inducir tolerancia o no cuando se presentan en una
inmunoglobulina de fusión. No se han identificado los epítopos de
algunos antígenos que se sabe que están asociados con respuestas
inmunes alérgicas o autoinmunes. Los métodos de la invención pueden
utilizarse para determinar si un epítopo que se sabe que incita una
respuesta inmune puede inducir tolerancia cuando se presenta en una
inmunoglobulina de fusión o para identificar epítopos tolerogénicos
nuevos de antígenos.
En un método, un vector que comprende una
secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de
manera operativa a regiones de control de la transcripción y la
traslación funcionales en la célula hemopoyética o linfoide se
transforma en una célula hemopoyética o linfoide. La inmunoglobulina
de fusión puede incluir un epítopo que se sabe que incita una
respuesta inmune o un epítopo tolerogénico nuevo. Las secuencias del
cebador/amplificador proporcionan preferiblemente la expresión de la
inmunoglobulina de fusión en una célula hemopoyética o linfoide a un
nivel suficiente como para inducir tolerancia frente al epítopo
in vivo o in vitro. Dicho cebador puede identificarse
y rastrearse en un ensayo in vitro como se describe en la
presente memoria. La cantidad de inmunoglobulina de fusión que puede
inducir tolerancia en animales puede determinarse utilizando
metodología estándar de dosis respuesta.
Las células transformadas se introducen en un
animal. Cuando las células hemopoyética transformadas se introducen
en un animal, preferiblemente el animal ha sido irradiado antes de
la introducción de las células transformadas con el fin de destruir
las células hemopoyéticas endógenas. Las células transformadas se
administran a un animal mediante una inyección intraperitoneal o
intravenosa. Después, los animales se analizan para detectar la
inducción de tolerancia frente al epítopo después de aproximadamente
2 a 20 días. La tolerancia puede detectarse mediante la
determinación de la respuesta de anticuerpos específica o de la
respuesta de proliferación de linfocitos frente al epítopo
tolerogénico heterólogo. Un descenso de la respuesta del anticuerpo
específico o de la proliferación de linfocitos frente al epítopo de
aproximadamente 2 a 100 veces, preferiblemente 10 a 100 veces,
indica tolerancia frente al epítopo.
Preferiblemente, los ensayos de rastreo para
identificar epítopos tolerogénicos se llevan a cabo en ratones. Las
células transformadas pueden ser células de ratón singénicas
derivadas de otro ratón idéntico genéticamente, o pueden ser células
hemopoyéticas o linfoides humanas. Por ejemplo, los ensayos de
rastreo pueden llevarse a cabo utilizando tejido de médula ósea
humano transformado con un vector. El tejido de médula ósea humano
se administra entonces a un ratón inmunodeficiente como al ratón
SCID-SCID de acuerdo con el método descrito por
Chambers et al., citado supra. La tolerancia puede
evaluarse en el ratón SCID-SCID mediante el examen
bien de la respuesta de anticuerpo específica frente al epítopo o de
la respuesta de la proliferación de linfocitos.
También describimos el rastreo de tolerógenos
nuevos, preferiblemente de aquellos asociados a respuestas
autoinmunes o alérgicas inmunes. En este método, se rastrean los
epítopos de los antígenos asociados con respuestas alérgicas o
autoinmunes para detectar su capacidad de inmunoreaccionar con suero
inmune o de estimular la proliferación de linfocitos de animales que
tienen respuestas alérgicas o autoinmunes. Por ejemplo, pueden
combinarse diferentes secuencias de ADNc que codifican partes de un
antígeno complejo como el factor de coagulación VIII con una
secuencia de ADN que codifica el extremo N-terminal
de la región variable de un anticuerpo para formar una biblioteca de
secuencias de ADNc que codifican inmunoglobulinas de fusión con
diferentes epítopos derivados del factor de coagulación VIII. Las
secuencias de ADN que codifican epítopos pueden generarse al azar, o
pueden seleccionarse para codificar secuencias de aminoácidos
lineales que se solapen, o pueden seleccionarse en base a la
probabilidad de que los aminoácidos codificados por la secuencia de
ADN estén expuestos (en base a su estructura terciaria) en la
superficie de la molécula del factor de coagulación VIII. Las
secuencias de ADNc que codifican diferentes partes del antígeno
pueden combinarse con secuencias de ADNc del extremo
N-terminal de la región variable de una
inmunoglobulina, preferiblemente en el extremo
N-terminal de la primera región marco de la cadena
pesada como se ha descrito previamente.
Puede utilizarse un sistema de vector fagémido
como pComb para generar una biblioteca de ADNc de cadenas pesadas y
ligeras de anticuerpos que tienen secuencias de ADNc que codifican
diferentes partes de un antígeno combinadas como se ha descrito más
arriba. El vector fagémido puede construirse para portar estas
secuencias de ADNc utilizando métodos estándar de ligación y
digestión con enzimas de restricción como se describe en Barbas
et al., PNAS, 88:7978 (1991). La biblioteca de
fagémidos puede rastrearse para detectar inmunoreactividad con suero
inmune de animales alérgicos o autoinmunes en un ensayo de
transferencia Western similar al descrito por Barbas et al.,
citado supra.
Brevemente, los vectores fagémidos que portan los
fragmentos Fab con al menos un epítopo heterólogo derivado de un
antígeno se transforman en una cepa de E. coli. La cepa de
E. coli se crece en presencia de antibióticos para
seleccionar aquellas cepas que portan el vector fagémido. Los fagos
pueden aislarse y después rastrearse para detectar su unión a
células recubiertas con suero inmune de un animal alérgico o
autoinmune como describe Barbas et al., citado supra.
Los fagos adherentes se eluyen utilizando un tampón de elución. Los
fagos eluidos pueden transferirse a células de E. coli y las
colonias pueden examinarse para detectar la presencia de un fagémido
que porta un fragmento Fab con un epítopo heterólogo utilizando un
ensayo del tipo transferencia Western a filtro con suero inmune de
un animal alérgico o autoinmune.
El ADN fagémido de los clones positivos puede
aislarse y la secuencia de ADN que codifica Fab de fusión puede
subclonarse en un vector que puede utilizase para transformar
células hemopoyéticas o linfoides. El vector puede contener
secuencias de ADN adicionales de manera que las células
transformadas producen una inmunoglobulina de fusión en lugar del
fragmento Fab. La inmunoglobulina de fusión que tiene un epítopo
heterólogo que reacciona con el suero inmune de animales alérgicos o
autoinmunes de un clon positivo identificado como se ha descrito,
puede aislarse y ensayarse para detectar su capacidad de inducir
tolerancia in vitro o in vivo. De manera alternativa,
las células transformadas que portan dicho vector pueden
introducirse en un animal y se puede determinar la inducción de la
tolerancia in vivo como se describe en la presente
memoria.
Una vez que se han identificado epítopos y/o
inmunoglobulinas de fusión nuevos que pueden inducir tolerancia,
éstos pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas y en métodos
para tolerizar animales frente a los epítopos. De manera
alternativa, la identificación de epítopos tolerogénicos nuevos
asociados con respuestas autoinmunes o alérgicas inmunes podría
utilizarse en ensayos estándar de diagnóstico para evaluar la
presencia de respuestas autoinmunes o alérgicas inmunes o para
evaluar la eficacia del tratamiento.
La invención también describe métodos para
inducir y mantener la tolerancia frente a un epítopo en un animal.
De acuerdo con la invención, la tolerancia puede inducirse y
mantenerse en un animal mediante la introducción de células
hemopoyéticas o linfoides que producen la inmunoglobulina de fusión
en el animal. También describimos una composición farmacéutica que
incluye una inmunoglobulina de fusión que se administra a un animal
como se ha descrito previamente. Sin limitar la invención de ninguna
manera, se piensa que la producción persistente in vivo de
una inmunoglobulina de fusión que porta el epítopo heterólogo por
las células transformadas puede permitir el mantenimiento de la
tolerancia de la misma manera o mejor que utilizando una composición
farmacéutica de la inmunoglobulina de fusión.
En un método, se proporciona un vector que
codifica una inmunoglobulina de fusión que puede mantenerse de
manera estable en una célula hemopoyética o linfoide. La
inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo tolerogénico
heterólogo. Las células hemopoyéticas o linfoides, tales como
células de sangre periférica, se transforman con un vector como MBAE
utilizando polibreno. Típicamente, las células transformadas no se
seleccionan y se administra al animal la población completa de
células hemopoyéticas o linfoides. Las células transformadas pueden
evaluarse para detectar la producción de una inmunoglobulina de
fusión in vivo o in vitro mediante la detección de la
presencia de una inmunoglobulina de fusión utilizando anticuerpos o
mediante la detección de la expresión del ARNm de una
inmunoglobulina de fusión utilizando RT-PCR o
transferencia Northern. Preferiblemente, la población de células
transformadas se analiza in vitro para detectar la producción
de una inmunoglobulina de fusión a un nivel suficiente como para
inducir y mantener la tolerancia frente al epítopo heterólogo en un
animal.
La población de células transformadas preparadas
de manera que la inmunoglobulina de fusión se produce a un nivel
suficiente como para inducir y/o mantener la tolerancia se introduce
en un animal. La cantidad de células introducidas en el animal es la
cantidad que proporciona la producción de una inmunoglobulina de
fusión a un nivel suficiente como para inducir tolerancia y,
preferiblemente para mantener la tolerancia. El animal se evalúa
para detectar la inducción y la persistencia de la tolerancia
frente al epítopo heterólogo utilizando ensayos como se ha descrito
previamente. En algunos casos, los animales se irradian lo
suficiente como para destruir las células hemopoyéticas o linfoides
endógenas antes de la introducción de las poblaciones de células
transformadas. Un animal se considera tolerante frente al epítopo si
se observa un descenso de aproximadamente 2 a 100 veces de la
respuesta inmunológica, como la proliferación de linfocitos o la
respuesta de anticuerpos. Se considera que la tolerancia se mantiene
si el estado tolerante se mantiene al menos el mismo tiempo que el
estado tolerante inducido con una inyección intravenosa única de una
composición farmacéutica tolerogénica. En ratones, una inyección
única de una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión
puede resultar en una tolerancia de aproximadamente 2 a 20 días y
tan prolongada como aproximadamente 2 meses a 6 meses. La tolerancia
podría mantenerse a lo largo de toda la vida del animal.
Las células transformadas adecuadas incluyen
células de la médula ósea y células linfoides de ratones o de seres
humanos. Los animales adecuados incluyen cepas endogámicas de
ratones que incluyen ratones inmunodeficientes como los ratones
SCID-SCID. La inducción y el mantenimiento de la
tolerancia frente a epítopos utilizando células humanas
transformadas pueden evaluarse mediante el desarrollo de tolerancia
frente a epítopos en poblaciones de células humanas transformadas
administradas a ratones SCID-SCID. Otras células de
animales transformadas, tales como células de bovino transformadas,
también pueden evaluarse para detectar inducción de tolerancia en
ratones SCID-SCID.
En otro método, puede utilizarse una cantidad
tolerogénica de una inmunoglobulina de fusión para inducir
tolerancia y la tolerancia puede mantenerse mediante la
administración de células hemopoyéticas o linfoides transformadas
que expresan la misma inmunoglobulina de fusión. En el método, puede
administrarse una cantidad tolerogénica de una inmunoglobulina de
fusión como una dosis única como se describe en la presente memoria.
Después de que se obtiene un estado de falta de respuesta
inmunológica, pueden administrarse al animal las células
hemopoyéticas o linfoides transformadas que expresan la
inmunoglobulina de fusión. Sin pretender limitar la invención, se
piensa que las células hemopoyéticas o linfoides transformadas
resultarán en el mantenimiento de la tolerancia frente al epítopo.
La cantidad de inmunoglobulina de fusión que se debe expresar cuando
se utilizan las células transformadas para mantener en lugar de
inducir tolerancia puede ser menor que la requerida cuando las
células inducen y mantienen la tolerancia. Típicamente, se requiere
la administración de aproximadamente 10 a 100 veces menos de la
inmunoglobulina de fusión o del antígeno para mantener en lugar de
inducir la tolerancia.
Se estudió la tolerancia frente al epítopo que
comprende los restos 12-26 de la proteína cI del
bacteriófago \lambda debido a que este epítopo puede ser
reconocido tanto por las células T como B, y a que es el epítopo
inmunodominante principal de esta proteína en ratones
H-2^{d}. Este epítopo se expresó en una proteína
de fusión IgG de ratón que tiene el epítopo en el extremo
N-terminal. Se eligió IgG1 isóloga para la proteína
de fusión porque se sabe que es un transportador tolerogénico. Las
inmunoglobulinas isólogas (especialmente IgG) son probablemente
transportadores tolerogénicos eficaces debido a su capacidad de
entrecruzar receptores Fc de las células B y de persistir en la
circulación, así como a su falta de "inmunogenicidad
intrínseca", es decir, la falta del potencial de incitar una
respuesta inmune en una forma soluble. Las construcciones de ADN que
codifican un polipéptido de fusión de inmunoglobulina IgG que
contiene el epítopo 12-26 de la proteína represora
cI de \lambda se obtuvieron mediante la modificación del plásmido
pSNR-1. (Véase la Figura 1).
El péptido inmunodominante principal de la
proteína represora \lambda CI de (restos 1-102) se
encuentra en los restos 12-26, como se describe en
Nature, 343:381 (1990). La secuencia de ADN que
codifica este fragmento del péptido se sintetizó mediante métodos
automatizados estándar. El fragmento del oligonucleótido sintético
que codifica el epítopo 12-26 tiene la secuencia
siguiente (SEQ ID NO:1):
5' CTG GAG GAC GCG CGG CGG CTG AAG GCG ATA TAC
GAG AAG AAG AAG 3'
3' GAC CTC CTG CGC GCC GCC GAC TTC CGC TAT ATG
CTC TTC TTC CCT 5'
La secuencia de aminoácidos correspondiente
codificada por este fragmento es:
Leu-Glu-Asp-Ala-Arg-Leu-Lys-Ala-Ile-Tyr-Glu-Lys-Lys-Lys
(SEQ ID NO:2)
El plásmido pSNR-1 es un plásmido
que incluye una secuencia de ADN que codifica el dominio variable de
la cadena pesada (VH) y las regiones constantes de la cadena pesada
1-3 (CH1-3) de una inmunoglubulina
murina específica para
4-hidroxi-3-nitrofenilo.
El plásmido pSNR-1 se construyó como describe
Ballard et al., PNAS, 83:9626 (1986). El
plásmido pSNR-1 se obtuvo de Douglas Fearon (Johns
Hopkins, Baltimore, MD). Para introducir la secuencia de ADN que
codifica el epítopo 12-26 en el extremo
N-terminal de la cadena pesada variable, el plásmido
pSNR se manipuló como se describe más abajo. Se subclonó utilizando
métodos estándar una región de 1,3 kbp del plásmido
pSNR-1 que incluye la secuencia que codifica VH, 118
bp de secuencia de ADN 5' por encima del elemento cebador de la
secuencia de VH que codifica el elemento cebador, y 3' por debajo
del intrón y de las secuencias amplificadoras IgH. Esta secuencia se
define entre los sitios de las enzimas de restricción BamHI y EcoRI
y se subclonó en el plásmido pBS (Stratagene) utilizando
endonucleasas de restricción BamHI y EcoRI. El pBS/VH se digirió con
PstI en condiciones para aislar un único fragmento parcialmente
digerido por PstI, como se describe en Current Protocols in
Molecular Biology, citado supra.
El epítopo 12-26 se modificó y
después se insertó en la región VH de la inmunoglobulina en una
localización que proporciona un plegamiento adecuado de esta región.
La secuencia de ADN que codifica el epítopo 12-26 se
modificó mediante la adición de la secuencia que codifica los 5
primeros aminoácidos de la región marco (FRI) de la secuencia que
codifica VH en el extremo 3' de la secuencia de ADN sintética que
codifica el epítopo 12-26. Esta modificación
permitió el plegamiento adecuado y se seleccionó para producir una
alteración mínima de la estructura terciaria de la molécula de
inmunoglobulina. Las regiones de la molécula de Ig que son sitios
probables en los que la inserción de un epítopo probablemente no
altera la molécula pueden determinarse mediante el análisis de la
secuencia de aminoácidos de la molécula de Ig así como de la
estructura terciaria. El extremo N-terminal y las
regiones CDR de la cadena de Ig son regiones preferibles en las que
se pueden insertar los epítopos produciendo una alteración mínima de
la estructura terciaria. La inserción en la región
N-terminal permite la inserción de polipéptidos
mayores \geq 10 kDa.
La secuencia 12-26 modificada que
incluye la secuencia de los cinco primeros aminoácidos de la primera
región marco de la VH se obtuvo mediante la reacción en cadena de la
polimerasa. Se construyó un plásmido que contiene la secuencia de
nucleótidos de 45 pares de bases que codifica el epítopo
12-16 mediante la clonación de la secuencia
sintética de ADN de 45 bases de pares en el sitio BamHI/CIaI de un
plásmido pPX1647 que contiene el gen de H-1d
flagelina (proporcionado por el Dr. P. Brey,
Praxis-Lederle Corp.), un plásmido derivado de
pUC119. La secuencia 12-26 modificada se amplificó
utilizando técnicas de PCR y dos cebadores.
Los cebadores se denominaron OS-1
y OS-2. El cebador OS-1 contiene la
secuencia que codifica el sitio PstI y la secuencia que codifica los
5 primeros aminoácidos de la secuencia 12-26. La
secuencia de OS-1 (SEQ ID NO:3) es:
5' TGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG 3'.
El cebador OS-2 fue
complementario a la secuencia que codifica el sitio PstI y a la
secuencia que codifica los 5 primeros aminoácidos de la primera
región marco de VH y a los 6 últimos aminoácidos de la secuencia
12-26. La secuencia de OS-2 (SEQ ID
NO:4) es:
5' CGACCTCCTG CAGTTGGACC TGCTTCTTCT TCTCGTATAT
3'.
El producto de 82 bp del método de PCR, es decir,
la secuencia 12-26 modificada, se aisló mediante
tamiz de agarosa utilizando métodos estándar.
El fragmento de PCR de 82 pares de bases se
digirió con PstI para producir un fragmento de 65 pb que
codifica el epítopo 12-26 modificado que incluye los
5 primeros aminoácidos de FRI. El fragmento de 65 pb se subclonó en
el plásmido pBS en el sitio pST1. La subclonación se realizó
mediante la digestión de la secuencia 12-26
modificada con PstI. Los plásmidos seleccionados que
contienen el fragmento PstI de 12-26 modificado se
secuenciaron para confirmar la presencia de ese fragmento en la
orientación adecuada. Los plásmidos que contienen la secuencia
12-26 modificada se refieren como
pBS/12-26 y se secuenciaron para confirmar su
estructura.
El fragmento 12-26 modificado de
pBS/12-26 se subclonó en pBS/VH. La subclonación se
llevó a cabo realizando inicialmente una digestión parcial de pBS/VH
con PstI para cortar la región VH en el sitio PstI, que está
localizado en la secuencia que codifica los aminoácidos 4 y 5 del
primer marco de VH. pBS/12-26 se digirió totalmente
con PstI. Después de ligar, se seleccionaron los plásmidos que
contienen la secuencia 12-26 modificada insertada
después de la secuencia que codifica los 5 primeros aminoácidos de
la primera región marco de la VH mediante hibridación en filtro de
las colonias bacterianas utilizando como sonda un oligonucleótido
12-26 marcado con P^{32}. La secuencia de fusión
resultante de VH es como sigue:
L-FRI-12-26-FRI
(L = secuencia líder; FRI = los 5 primeros aminoácidos de la primera
región marco de VH). Se realizó una secuenciación de doble cadena
para confirmar el sitio adecuado de la inserción así como la
orientación. Estos plásmidos se denominaron
pBS/VH/12-26.
La presencia de la secuencia recombinante
VH/12-26 en el plásmido se verificó mediante
metodologías de secuenciación de ADN. La secuencia de ADN VH que
está alrededor y que incluye el inserto 12-26
modificado (SEQ ID NO:5) es como sigue:
Se subclonó 12-26/VH modificado
recombinante de pBS/VH/12-26 en un plásmido
pSV2-neo en los sitios BamHI/ECORI. El plásmido
pSV2-neo se deriva a partir de pSNR (Dr. Al
Bothwell, Universidad de Yale, New Haven, CT) y contiene V_{H}
(unión de NP) insertado en una cadena pesada de IgG_{1}. El
fragmento EcoRI de 8,5 kbp de pSNR-1 que contiene
las regiones constantes 1-3 (CH 1-3)
de la cadena \alpha_{1} también se subclonó en el
pSV2-neo. La deleción de una región de 8,5 kbp entre
los sitios EcoRI del plásmido pSNR-1, que incluye la
secuencia que codifica CH1-3, se llevó a cabo
utilizando técnicas estándar como se describe en Current
Protocols in Molecular Biology, Vol 1: Suplemento 3.1.3, John
Wiley & Sons (1989). El plásmido completo contiene la secuencia
que codifica la cadena pesada variable con la secuencia de 65 pares
de bases que codifica el epítopo 12-26 insertada en
el extremo N-terminal de la primera región marco de
la cadena pesada variable y la secuencia que codifica las regiones
constantes 1-3 (CH1-3). Las
orientaciones de las secuencias de la región variable modificadas y
de las regiones constantes se verificaron mediante análisis de
restricción por Southern, como se describe en Current Protocols
in Molecular Biology, citado supra. Los recombinantes
exitosos se seleccionaron mediante ampicilina y se creció una
preparación a gran escala del plásmido utilizando métodos
estándar.
Los plásmidos recombinantes que contienen la
secuencia que codifica tanto la fusión VH/12-26 como
CH1-3 de IgG1 se introdujeron en células anfitrionas
y se detectó la expresión de la proteína de fusión. La
transformación y la detección de la expresión se llevaron a cabo
utilizando métodos estándar como se describe en Current Protocols
in Molecular Biology, citado supra.
La construcción de ADN 12-26 IgG1
(Q3) así como la construcción control pSNR (P6) se sometieron a
electroporación en células de mieloma J558L que sintetizan sólo
cadenas ligeras \lambda. Los integrantes estables se seleccionaron
mediante crecimiento en presencia del antibiótico G418. Los
transfectomas que expresan la proteína de fusión
12-26 IgG1 se identificaron mediante el análisis de
los sobrenadantes de los cultivos celulares por transferencia
Western y ELISA.
Los transfectomas se crecieron hasta lograr una
densidad alta en medio sin suero (RPMI-1640 con 5%
FCS) en botellas con rodillos y en cultivo. La purificación a partir
de los sobrenadantes sin suero de los transfectomas se consiguió
mediante la unión a
sefarosa-proteína-A a pH 8, con
elución a pH 4, así como con columnas de afinidad con anti IgG de
raton.
Los sobrenadantes purificados de clones
seleccionados se analizaron para detectar la expresión de epítopos
12-26 mediante transferencia Western y ELISA
mediante métodos estándar. (Véanse las Figuras 2 y 3). En el caso de
la transferencia Western, las muestras se sometieron a
electroforesis en 10% SDS-PAGE. Los geles se
transfirieron a nitrocelulosa y se ensayaron con anti IgG de ratón
(carriles de la izquierda) o con anticuerpo monoclonal B3.11 anti
12-26 (carriles de la derecha) y con anticuerpos
conjugados con fosfatasa alcalina como reactivos secundarios. Los
resultados se muestran en la Figura 2. Sólo los sobrenadantes de los
cultivos celulares de los transfectomas que contienen la
construcción 12-26 IgG1 (Q3) reaccionaron con los
anticuerpos específicos frente a IgG de ratón (carriles de la
izquierda) y con los anticuerpos específicos frente al epítopo
12-26 (carriles de la derecha).
En el caso de los ensayos de inhibición
competitiva de ELISA, se mezcló anticuerpo monoclonal B3.11
previamente titulado con cantidades crecientes del péptido
12-26, o del péptido 12-26 acoplado
químicamente a globulina gamma de conejo
(RGG/12-26), ó 12-26 IgG1 (Q3).
Mediante métodos estándar se determinó la capacidad de las mezclas
de unirse al péptido 12-26 inmovilizado. Los
resultados, mostrados en la Figura 3, indican que la proteína de
fusión 12-26 IgG fue capaz de inhibir de manera
eficaz la unión del anticuerpo monoclonal al epítopo
12-26 en comparación con el péptido
12-26 en disolución.
Los estudios de inhibición competitiva de ELISA
muestran que estas inmunoglobulinas de fusión pueden competir de
manera eficaz con el péptido sintético libre o con
12-26 conjugado químicamente con IgG de conejo en la
unión con el anticuerpo monoclonal B3.11 anti 12-26.
Además, 12-26-IgG es inmunogénico
frente al epítopo 12-26 cuando se emulsiona en CFA
(datos no mostrados). Esto sugiere que el péptido insertado puede
procesarse y presentarse de una manera relevante desde un punto de
vista fisiológico incluso en el contexto de una molécula IgG propia.
Los experimentos también indican que las inmunoglobulinas de fusión
12-26 pueden estimular la producción de
IL-2 (determinada por ensayo CTLL) en un hibridoma
específico para 12-26 de células T restringido para
H-2^{d} (9C127) (datos no mostrados).
Un pretratamiento de animales con el péptido
12-26 a dosis altas inyectado intravenosa o
intraperitonealmente en disolución salina o emulsionado en adyuvante
incompleto de Freund (IFA), puede inducir tolerancia de células T
colaboradoras después de una inmunización posterior con el péptido
en adyuvante completo de Freund (CFA). Sherer et al.,
Symp. on Quant. Biol., Cold Spring Harbor, NY, 54:497
(1989). La inducción de la tolerancia frente al epítopo
12-26 se ha confirmado en ensayos de proliferación
de células T. Sin embargo, los animales tratados con el péptido no
son tolerantes a nivel de las células B. Es decir, cuando se realiza
un pulso con flagelina 12-26 (que proporciona
"epítopos transportadores"), la respuesta no disminuyó (véase
más abajo). Esto indica que las reducciones con el pulso del péptido
se debieron a tolerancia de células T y no de células B.
Con el fin de determinar si la proteína de fusión
12-16 IgG1 puede inducir tolerancia de células B, se
llevó a cabo el experimento siguiente. Se cultivaron células de bazo
de ratón in vitro en RPMI-1640 + 5% FCS
durante 18 horas. Las células de bazo de ratón se incubaron entonces
con concentraciones crecientes bien del péptido
12-26 libre, de un conjugado químico de globulina
gamma de conejo con 12-26
(RGG-12-26) o de
12-26-IgG1 (Q3). A las 18 horas,
estas células de bazo se lavaron y después se sometieron a un pulso
bien con lipopolisacárido (un estímulo mitogénico, no mostrado) o
con la proteína de fusión A29 de Salmonella flagellin que
contiene el péptido 12-26. Previamente se ha visto
que la proteína de fusión de Salmonella flagellin que
contiene el epítopo 12-26 es inmunogénica tanto
in vivo como in vitro (datos no mostrados). Como
control para la inducción de la tolerancia, las células de bazo se
trataron con una anti inmunoglobulina de conejo que previamente se
había visto que induce falta de respuesta in vitro. G. Warner
et al., J. Immunol., 146: 2185 (1991). El efecto de
anti IgG se muestra como un círculo en blanco en el extremo derecho
de cada gráfico. La respuesta de las células se determinó por ELISA.
Los resultados se muestran como Figura 4 (proteína de fusión A29 con
pulso con péptido 12-26).
Los resultados indican que cuando las células de
bazo se someten a un pulso con la proteína de fusión A29, la
proteína de fusión 12-26 IgG1 (Q3.13), o el
conjugado químico (RGG-12-26) son
tolerogénicos a niveles de microgramo. Por el contrario, el péptido
libre no inhibe la respuesta de las células B a ninguna dosis. Por
lo tanto, estos resultados indican que las proteínas de fusión
12-26 IgG pueden inducir tolerancia en células B
in vitro. Se obtuvieron resultados similares in vivo
como sigue.
Las proteínas de fusión
12-26-IgG se ensayaron para detectar
inducción de la tolerancia in vivo. Se inyectaron ratones
CAF_{1} con 1 mg de la proteína de fusión
12-26-IgG, de
12-26-IgG o del péptido libre en
disolución salina. Los ratones control recibieron PBS en disolución
salina. Las células de bazo de estos ratones se sometieron a un
pulso 10 días después con la proteína de fusión
12-26-flagelina in vitro. Se
determinó la respuesta frente a 12-26 mediante
ensayos de ELISA 4 días después del pulso como se ha descrito para
la Figura 4. Los resultados se muestran en la Figura 5.
Los resultados indican que las proteínas de
fusión 12-26-IgG así como el
conjugado químico (RG-12-26) pueden
inducir tolerancia in vivo e in vitro. Véanse las
Figuras 4 y 5.
Se han preparado muchas construcciones de
retrovirus que están basadas en el vector retroviral murino de la
leucemia Moloney MBAE, como describe Kang et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 87:9803 (1990).
El vector retroviral MBAE puede obtenerse del Dr.
Hozumi o puede prepararse como describe Kang et al., citado
supra. Brevemente, el vector retroviral que contiene las
repeticiones terminales largas de leucemia Moloney murina y el gen
neo que codifica resistencia frente a G418 se modificó mediante la
inserción del cebador y de las secuencias amplificadoras de la
\beta-actina. Las secuencias del cebador y del
amplificador de la \beta-actina se clonaron por
debajo del gen neo. Los genes heterólogos pueden insertarse entonces
por debajo del cebador de la \beta-actina mediante
subclonación con HindIII y SalI.
Las secuencias de ADN que se subclonaron en MBAE
se derivaron a partir de ARN amplificado por PCR con transcriptasa
inversa a partir de transfectoma Q3 que contiene la cadena pesada
12-26-IgG. El transfectoma Q3 se
preparó como se describe en el Ejemplo II. El ARN del transfectoma
Q3 se recogió y se incubó con transcriptasa inversa en una reacción
de PCR estándar como se describe en Current Protocols in
Molecular Biology, citado supra, para formar moléculas de
ADNc. Las moléculas de ADNc se amplificaron utilizando los cebadores
siguientes:
V_{H} 5' cebador (SEQ ID NO: 6):
5' TGG ACT AAG TCG ACA CCA TGG GAT GCA GC
pep 3' cebador (SEQ ID NO: 7):
5' GGC AAC AGA AGC TTT CAC TTC TTC TTC TCG TAT
3'
Este ADNc incluye una secuencia de ADN que
codifica la secuencia líder y el epítopo 12-26 del
gen de la cadena pesada variable seguido de un codón de parada. El
codón de parada se diseñó en el cebador de PCR en el extremo de la
secuencia de ADN que codifica el último aminoácido de
12-26 (en el cebador) para construir un minigen de
péptido.
Se subclonó una secuencia de ADN que codifica la
secuencia líder y la secuencia que codifica el epítopo
12-26 seguido de un codón de parada en pBluescript y
se secuenció y después se subclonó en el vector MBAE. La
subclonación se llevó a cabo utilizando SalI y HindIII para insertar
el minigen del péptido por debajo del cebador y las secuencias
amplificadoras de la \beta-actina, como se muestra
en la Figura 7.
Los vectores MBAE recombinantes se transfectaron
mediante lipofección en la línea celular \Psi-2
obtenida del Dr. N. Hozumi (Toronto, Canadá). Las líneas celulares
transfectadas se crecieron en RPMI 5% FCS en presencia de 0,8 mg/ml
de G418 crudo. Los clones resistentes a G418 se aislaron mediante
dilución limitante y la titulación vírica se determinó en células
NIH 3T3 en presencia de 0,8 mg/ml de G418 (peso crudo). En el caso
de la construcción del minigen de péptido, se eligió un clon
\Psi-2 transfectado (MBAE pEP19) con una
titulación de 10^{5}-10^{6} CFU/ml para
experimentos posteriores de transferencia génica. Se ensayó la
presencia de virus colaboradores utilizando métodos estándar (método
de "extensión horizontal de la infección"), como se describe en
Current Protocols in Molecular Biology, citado supra,
y no se detectó. Las líneas que producían virus se descongelaron
para cada experimento individual.
Una célula de linfoma de células B A20.2J,
disponible en ATCC, infectada con el vector vírico expresó y secretó
el péptido según se detectó mediante transferencia Western. Véase la
Figura 6A. Después de la infección de las células de linfoma de
células B A20.2J, las células se crecieron en G418 y se analizaron
200 \mul de los sobrenadantes mediante transferencia Western. Los
sobrenadantes de cuatro clones \Psi-2/A20.2J
infectados con minigen 12-26 retroviral se
transfirieron y se hicieron reaccionar con el anticuerpo monoclonal
B3.11 específico frente al epítopo 12-26. Como se
puede ver en la Figura 6A, el péptido se expresó en las células de
linfoma infectadas.
Las células A20.2J infectadas no sólo producen el
péptido sino que también lo presentan a un hibridoma de células T
reactivo frente a 12-26. Brevemente, se incubaron
volúmenes titulados de los sobrenadantes de células A20.2J
infectadas con clones de células T reactivos frente a
12-26 (T32) durante 24-48 horas. Los
clones de células T reactivos frente a 12-26 se
obtuvieron del Dr. Tom Briner y del Dr. M. Gefter (Massachussets
Institute of Technology, Cambridge, MA). La respuesta del clon de
células T se determinó mediante incorporación de
^{3}H-timidina y un ensayo de IL-2
estándar. Los resultados se muestran en la Figura 6B. Los resultados
indican que las células A20 procesan este péptido de manera que
puede presentarse a un clon de células T reactivo frente a
12-26. También se determinó la producción de
IL-2 por estos clones y los resultados muestran que
las células infectadas producen y secretan el péptido
12-26.
12-26.
Se prepararon ratones con células de médula ósea
transfectadas con el vector vírico MBAE 12-26 que
codifica el epítopo 12-26 (Figura 7). Se infectaron
progenitores de médula ósea de ratones Balb/c con el vector MBAE
12-26 como describe Chambers et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 89:1026 (1992). Los ratones Balb/c
donantes de médula se pretrataron por vía intravenosa con 150 mg/kg
de 5-fluoroacilo durante 3-4 días
antes de la recogida de la médula. Las células de la médula
fraccionadas se mantuvieron en hielo y después se lavaron con RPMI
completo con 15% FCS y 10 unidades/ml de IL-3.
Después, las células de la médula ósea se cocultivaron con una capa
confluente aproximadamente al 80% de líneas \Psi-2
irradiadas (2.000 rads). El cocoultivo con la línea
\Psi-2 adherente que produce virus se realizó a
37ºC durante 48 horas como sigue:
5 x 10^{6} células de médula por 6 pocillos en
10 ml de medio que contiene:
- 15% FCS
- 6 \mu/ml polibreno
- 100 unidades/ml IL-6
- 200 unidades/ml IL-3
Se recogieron las células de médula ósea no
adherentes después de 48 horas, se lavaron y se resuspendieron en
medio Eaglis tamponado con HEPES. Los ratones Balb/c singénicos
receptores se irradiaron letalmente con 900 rads y se inyectaron por
vía intravenosa 4 x 10^{6} células en un volumen de 400 \mul a
los ratones irradiados. Los ratones receptores se trataron en agua
acidificada de 1 a 2 semanas antes del transplante para evitar
infecciones por bacterias gram negativas y se mantuvieron en cajas
microisolator autoclavadas con alimento autoclavado, y agua
acidificada suplementada con antibióticos.
Después de dos semanas, se recogieron las células
linfoides de los ratones receptores a partir de sangrados de la cola
y se examinaron para detectar la presencia de la secuencia
12-26 mediante RT-PCR. Se detectaron
fragmentos de aproximadamente 100 pares de bases tanto en las
células linfoides infectadas como en la línea celular
\Psi-2 que contiene MBAE 12-26.
Véase la Figura 8.
Brevemente, el ARN de células de sangre
periférica obtenidas de animales a las dos semanas o de líneas
[\Psi]-2 infectadas se sometió a transcripción
inversa. Las secuencias de ADN que codifican el epítopo
12-26 se amplificaron utilizando los cebadores
V_{H} (SEQID NO: 6) y pep (SEQ ID NO: 7). Los productos
amplificados se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa
y los productos que contienen una secuencia de ADN que codifica el
epítopo 12-26 se detectaron mediante transferencia
Southern. La sonda utilizada para detectar las secuencias que
codifican 12-26 es como sigue (SEQ ID NO: 8):
5' - TGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG G - 3'
La hibridación se llevó a cabo bajo condiciones
estándar como se describe en Current Protocols, citado
supra. Un fragmento detectado en las células de sangre
periférica mediante hibridación con la sonda 12-26
indicó que la expresión del epítopo 12-26 se
producía en las células 2 semanas después de la administración.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Universidad de Rochester
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Inducción de Tolerancia Con Proteínas de Fusión Tolerogénicas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 8
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Schwegman, Lundberg y Woessner
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 3500 IDS Center
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Minneapolis
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Minesota
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Estados Unidos de América
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 55402
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA DE LECTURA EN EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA DE ORDENADOR: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE CUMPLIMENTACIÓN: 10-FEB-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Raasch, Kevin W.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 35.651
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 850.014WO1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 612-339-0331
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 612-339-3061
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGAGGACG CGCGGCGGCT GAAGGCGATA TACGAGAAGA AGAAG
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: desconocida
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Asp Ala Arg Arg Leu Lys Ala lle Tyr
Glu Lys Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG G
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGACCTCCTG CAGTTGGACC TGCTTCTTCT TCTCGTATAT
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 75 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 16..61
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGGTCCAAC TGCAG CTG GAG GAC GCG CGG CGG CTG AAG GCG ATA TAC GAG
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Asp Ala Arg Arg Leu Lys Ala Ile Tyr
Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAG AAG AAG C AGGTCCAACT GCAG
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\sac{Lys Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGGACTAAGT CGACACCATG GGATGCAGC
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCAACAGAA GCTTTCACTT CTTCTTCTCG TAT
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGATCTACTG CAGCTGGAGG ACGCGCGGCG G
\hfill
Claims (7)
1. Una composición farmacéutica para inducir
tolerancia en un individuo frente a un epítopo tolerogénico o a un
antígeno que contiene el epítopo tolerogénico, en la que dicho
epítopo tolerogénico es un epítopo frente al que se desea una falta
de respuesta inmunológica, dicha composición comprende:
- (a)
- una célula hemopoyética o linfoide que comprende un vector de expresión capaz de mantener de manera persistente la expresión del epítopo tolerogénico en el individuo, que comprende una secuencia de ADN que codifica una inmunoglobulina de fusión unida de manera operativa a regiones de control de la transcripción y la traslación funcional en la célula hemopoyética o linfoide, donde la inmunoglobulina de fusión tiene al menos un epítopo heterólogo insertado en el extremo N-terminal de la región variable de la inmunoglobulina, donde el epítopo heterólogo es el epítopo tolerogénico, y donde el vector de expresión mencionado se mantiene de manera estable en la célula hemopoyética o linfoide mencionada; y
- (b)
- un excipiente aceptable desde un punto de vista farmacéutico.
2. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que la célula es una célula de la médula
ósea o una célula linfoide.
3. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la inmunoglobulina de fusión es
una IgG.
4. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que el individuo es un ser humano.
5. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la célula hemopoyética o linfoide
se deriva a partir del individuo en el que se va a inducir la
tolerancia.
6. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, en la que la célula es una célula de la
médula ósea.
7. La composición de cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en la que el antígeno es un antígeno
asociado a una enfermedad autoinmune o a una reacción alérgica en el
individuo.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/195,874 US5817308A (en) | 1994-02-14 | 1994-02-14 | Tolerogenic fusion proteins of immunoglobulins and methods for inducing and maintaining tolerance |
US195874 | 1994-02-14 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2233940T3 true ES2233940T3 (es) | 2005-06-16 |
Family
ID=22723177
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES95910220T Expired - Lifetime ES2233940T3 (es) | 1994-02-14 | 1995-02-10 | Induccion de tolerancia con proteinas de fusion tolerogenicas. |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5817308A (es) |
EP (1) | EP0741788B1 (es) |
JP (2) | JPH09509316A (es) |
AT (1) | ATE288494T1 (es) |
CA (1) | CA2182977A1 (es) |
DE (1) | DE69533979T8 (es) |
DK (1) | DK0741788T3 (es) |
ES (1) | ES2233940T3 (es) |
PT (1) | PT741788E (es) |
WO (1) | WO1995021926A1 (es) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5817308A (en) * | 1994-02-14 | 1998-10-06 | University Of Rochester | Tolerogenic fusion proteins of immunoglobulins and methods for inducing and maintaining tolerance |
US6485726B1 (en) * | 1995-01-17 | 2002-11-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Receptor specific transepithelial transport of therapeutics |
US5843462A (en) * | 1995-11-30 | 1998-12-01 | Regents Of The University Of Minnesota | Diphtheria toxin epitopes |
EP1037663A2 (en) | 1997-12-16 | 2000-09-27 | Regents Of The University Of Minnesota | Methods to treat undesirable immune responses |
WO1999060113A1 (fr) * | 1998-05-20 | 1999-11-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Nouveau procede d'isolation de gene |
US6884785B2 (en) * | 1999-06-17 | 2005-04-26 | The Scripps Research Institute | Compositions and methods for the treatment or prevention of autoimmune diabetes |
ES2292587T3 (es) * | 2000-04-22 | 2008-03-16 | Pharmedartis Gmbh | Agentes apoptoticos. |
MXPA03001673A (es) * | 2000-09-25 | 2003-06-09 | Nestle Sa | Bacteria de acido lactico capaz de reducir una tendencia individual a desarrollar reacciones alergicas. |
US8703146B2 (en) * | 2001-04-20 | 2014-04-22 | Institute For Systems Biology | Toll-like receptor 5 ligands and methods of use |
ATE463505T1 (de) | 2001-04-20 | 2010-04-15 | Inst Systems Biology | Toll-ähnlichen-rezeptor-5-liganden und verwendungsverfahren |
US20120148585A1 (en) * | 2001-05-01 | 2012-06-14 | Andrew Saxon | Fusion molecules and methods for treatment of immune diseases |
US7265208B2 (en) * | 2001-05-01 | 2007-09-04 | The Regents Of The University Of California | Fusion molecules and treatment of IgE-mediated allergic diseases |
US7744876B2 (en) | 2002-04-09 | 2010-06-29 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods and compositions for treatment, prevention, suppression, and/or delaying the onset of type 1 diabetes |
US8603471B2 (en) * | 2002-04-09 | 2013-12-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods and compositions for preventing the onset of type 1 diabetes |
US8609091B2 (en) | 2002-04-09 | 2013-12-17 | The Curators Of The University Of Missouri | Method for endocytic presentation of an immunosuppressive for the treatment of type 1 diabetes |
US8603472B2 (en) * | 2002-04-09 | 2013-12-10 | The Curators Of The University Of Missouri | Methods and compositions reversing pre-diabetes using fusion proteins comprising a GAD peptide |
US8029803B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-10-04 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8025873B2 (en) | 2002-06-20 | 2011-09-27 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for eliciting an immune response |
US8007805B2 (en) * | 2003-08-08 | 2011-08-30 | Paladin Labs, Inc. | Chimeric antigens for breaking host tolerance to foreign antigens |
AU2006301846A1 (en) * | 2005-10-13 | 2007-04-19 | Akshaya Bio Inc. | Chimeric antigen containing hepatitis C virus polypeptide and FC fragment for eliciting an immune response |
MX2009008230A (es) | 2007-01-30 | 2010-03-08 | Epivax Inc | Epitopes de celulas t reguladoras, composiciones y usos para los mismos. |
BRPI1009215B1 (pt) | 2009-03-23 | 2019-10-29 | Nanirx Inc | composição farmacêutica compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) e uso de um polipeptídeo derivado de tat para tratar câncer |
JP2015512371A (ja) | 2012-03-23 | 2015-04-27 | ザ・ユニバーシティ・オブ・クイーンズランド | 免疫調節性作用物質およびその使用 |
US9663556B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-05-30 | Pin Pharma, Inc. | Treatment of cancers with immunostimulatory HIV tat derivative polypeptides |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK0460076T3 (da) * | 1989-02-24 | 1996-03-25 | Univ California | Genetisk manipulerede immunoglobuliner |
GB9021679D0 (en) * | 1990-10-05 | 1990-11-21 | Gorman Scott David | Antibody preparation |
US6248332B1 (en) * | 1990-10-05 | 2001-06-19 | Medarex, Inc. | Targeted immunostimulation with bispecific reagents |
US5167956A (en) * | 1991-02-11 | 1992-12-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunotoxin with in-vivo t cell suppressant activity |
US5817308A (en) * | 1994-02-14 | 1998-10-06 | University Of Rochester | Tolerogenic fusion proteins of immunoglobulins and methods for inducing and maintaining tolerance |
-
1994
- 1994-02-14 US US08/195,874 patent/US5817308A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-02-10 DK DK95910220T patent/DK0741788T3/da active
- 1995-02-10 EP EP95910220A patent/EP0741788B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-10 DE DE69533979T patent/DE69533979T8/de not_active Expired - Fee Related
- 1995-02-10 ES ES95910220T patent/ES2233940T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-10 CA CA002182977A patent/CA2182977A1/en not_active Abandoned
- 1995-02-10 AT AT95910220T patent/ATE288494T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-02-10 WO PCT/US1995/001671 patent/WO1995021926A1/en active IP Right Grant
- 1995-02-10 JP JP7521334A patent/JPH09509316A/ja not_active Withdrawn
- 1995-02-10 PT PT95910220T patent/PT741788E/pt unknown
-
1998
- 1998-09-24 US US09/160,076 patent/US6838281B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-07-18 JP JP2007187377A patent/JP4214173B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2008001709A (ja) | 2008-01-10 |
DK0741788T3 (da) | 2005-05-30 |
JP4214173B2 (ja) | 2009-01-28 |
CA2182977A1 (en) | 1995-08-17 |
US20020048562A1 (en) | 2002-04-25 |
ATE288494T1 (de) | 2005-02-15 |
DE69533979D1 (de) | 2005-03-10 |
JPH09509316A (ja) | 1997-09-22 |
EP0741788B1 (en) | 2005-02-02 |
EP0741788A1 (en) | 1996-11-13 |
DE69533979T2 (de) | 2006-04-27 |
DE69533979T8 (de) | 2006-11-09 |
PT741788E (pt) | 2005-05-31 |
US5817308A (en) | 1998-10-06 |
WO1995021926A1 (en) | 1995-08-17 |
US6838281B2 (en) | 2005-01-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2233940T3 (es) | Induccion de tolerancia con proteinas de fusion tolerogenicas. | |
ES2305110T5 (es) | Anticuerpos contra il-1 beta humana. | |
US5866129A (en) | Method of producing an antibody with a peptide corresponding to membrane-bound IgA | |
ES2294793T3 (es) | Induccion de tolerancia inmunologica a un anticuerpo terapeutico usando variantes de dicho anticuerpo terapeutico. | |
ES2293748T3 (es) | Moleculas de fijacion poliespecificas y usos de las mismas. | |
ES2144424T5 (es) | Vacuna que comprende parte de la region constante de ige para el tratamiento de reacciones alergicas inducidas por ige. | |
JPH08505878A (ja) | 免疫原のリソソーム標的 | |
JPH05507197A (ja) | 結合部位を含む可溶性ペプチド類縁体 | |
US20060205016A1 (en) | Protein a based binding domains with desirable activities | |
WO1992007574A1 (en) | Glycoproteins associated with membrane-bound immunoglobulins as antibody targets on b cells | |
JP2000515363A (ja) | Mhc複合体及びその用途 | |
JP2001519143A (ja) | 可溶性の一本鎖t細胞レセプタータンパク質 | |
JPH09501159A (ja) | 合成多重縦列反復ムチンおよびムチン様ペプチド、並びにそれらの利用 | |
JPH03501927A (ja) | IgE産出性Bリンパ球上の独特な抗原決定基 | |
KR100328112B1 (ko) | 류마토이드관절염병원관련관절염성펩티드에대항하는면역보호유도에유용한백신조성물과방법 | |
RU2763001C1 (ru) | Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с RBD S белка вируса SARS-CoV-2, и способ их применения для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 | |
US5079344A (en) | Antigenic epitopes present on membrane-bound but not secreted IgA | |
WO1993019178A2 (en) | Peptides useful for inducing tolerance | |
JP3862752B2 (ja) | 全身性エリテマトーデス治療用の合成ベプチドおよびこれを含有する薬剤組成物 | |
Thomas et al. | Nature of T lymphocyte recognition of macrophage-associated antigens. V. Contribution of individual peptide residues of human fibrinopeptide B to T lymphocyte responses. | |
ES2254663T3 (es) | Peptidos capaces de enlazarse a cd64 y que comprenden uno o mas epitopos heterologos de celulas t, y sus usos. | |
US5362643A (en) | Antibodies to epitopes present on membrane-bound but not secreted IGA | |
US5310875A (en) | Peptides corresponding to membrane-bound IgA | |
US5484907A (en) | Nucleotides coding for the extracellular membrane-bound segment of IgA | |
Reitan et al. | The primary IgM antibody repertoire: a source of potent idiotype immunogens |