ES2293748T3

ES2293748T3 - Moleculas de fijacion poliespecificas y usos de las mismas.

Info

Publication number: ES2293748T3
Application number: ES99970601T
Authority: ES
Inventors: Jon A. Weidanz; Kimberlyn Card; Linda A. Sherman; Norman R. Klinman; Hing C. Wong
Original assignee: Altor Bioscience Corp
Current assignee: ImmunityBio Inc
Priority date: 1998-10-21
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2008-03-16
Anticipated expiration: 2019-10-21
Also published as: JP2004537952A; EP1124568A4; WO2000023087A1; JP4467188B2; ATE370967T1; US6534633B1; AU1218000A; DE69936927D1; DE69936927T2; EP1124568A1; US8105830B2; EP1124568B1; US20120230995A1; US20030171552A1; DK1124568T3

Abstract

Una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo enlazado covalentemente a través de una primera secuencia enlazadora peptídica a al menos un anticuerpo monocatenario (sc-Ab) o fragmento funcional del mismo, en donde el sc-TCR o fragmento funcional del mismo se fija a un péptido particular combinado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno.

Description

Moléculas de fijación poliespecíficas y usos de las mismas.

Remisión a Solicitudes Afines

La presente solicitud reivindica prioridad respecto a la Solicitud Provisional U.S. No. 60/105.164, presentada el 21 de octubre de 1998.

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a moléculas de fijación poliespecíficas, así como métodos de producción de tales moléculas y sus usos. En un aspecto, la invención se caracteriza por moléculas de fijación poliespecíficas monocatenarias que pueden deteriorar o destruir células diana. La invención es útil para una diversidad de aplicaciones que incluyen el uso en asociación de células que expresan un receptor de células T o un dominio de fijación de
anticuerpos.

2. Antecedentes

Se ha reconocido que las células del sistema inmunitario y particularmente los linfocitos T citotóxicos (CTLs) pueden utilizarse para detectar antígenos asociados a tumores (TAAs). Por ejemplo, se han utilizado CTLs derivados de melanomas para identificar una diversidad de antígenos específicos del melanoma. Véase v.g., Bruggen et al., Science (1991), 254: 1643; Bakker et al., J. Exp. Med., (1994), 179: 1005; y Yanuck et al., Cancer Research, (1993), 53, 3257.

Varias terapias anti-tumor han intentado utilizar CTLs para tratar enfermedades tales como el cáncer. En un enfoque, se toman CTLs anti-tumor de un paciente, se expanden in vitro, y se devuelven luego al paciente para tratar el cáncer. Sin embargo, este enfoque adolece de inconvenientes importantes. Por ejemplo, no siempre es sencillo aislar cantidades suficientes de los CTLs del paciente. Adicionalmente, al menos algunos de los CTLs pueden tener especificidades que han sobrevivido a la auto-tolerancia, lo que podría conducir a complicaciones adicionales. Véase, v.g., Browning et al., Curr. Opin. Immunol., (1992), 4, 613; Mizoguchi et al., Science, (1992), 258: 1795, y George et al., J. Immunol., (1994), 152, 1802.

Se han registrado intentos de mitigar estos y otros inconvenientes por producción y utilización de moléculas inmunes recombinantes tales como aquéllas que se asemejan a anticuerpos. Un anticuerpo tiene una estructura reconocida que incluye una cadena pesada y una cadena ligera de inmunoglobulinas. Las cadenas pesada y ligera incluyen una región variable N-terminal (V) y una región constante C-terminal (C). La región variable de la cadena pesada se conoce en muchos casos como "V_{H}" y la región variable de la cadena ligera se conoce como "V_{L}". Las cadenas V_{H} y V_{L} forman una bolsa de unión a la que se ha hecho referencia como F(v). Véase en líneas generales Davis Ann. Rev. of Immunology (1985), 3: 537; y Fundamental Immunology, 3rd Ed., W. Paul, compilador, Raven Press Ltd. Nueva York (1993).

Se han descrito moléculas de anticuerpos recombinantes. Por ejemplo, se han consignado varias moléculas de anticuerpos recombinantes biespecíficos (bsFv). La mayoría de las moléculas bsFv incluyen una F(v) formateada como una cadena simple (sc-Fv). Moléculas sc-Fv más particulares incluyen una región V_{H} enlazada a una región V_{L} a través de una secuencia peptídica enlazadora. Véase v.g., Huston et al., PNAS (USA), (1988), 85: 5879; Bird et al., Science, 1988, 242: 423; WO 94/29350; y U.S. Pat. No. 5.455.030.

Se han descrito moléculas bsFv adicionales. Por ejemplo, se han consignado algunas moléculas bsFv que se fijan a una proteína de las células T denominada "CD3" y un TAA. Se ha reconocido que la fijación de la bsFv puede facilitar una respuesta del sistema inmunitario. Véase v.g., Jost, C.R. (1996) Mol. Immunol. 33: 211; Lindhofer, H. et al. (1996) Blood, 88: 4651; Chapoval, A.I. et al. (1995) J. of Hematotherapy, 4: 571.

Se han registrado intentos de desarrollar métodos directos de producción de moléculas de anticuerpos biespecíficas. Sin embargo, muchos de estos intentos han estado asociados a problemas. Por ejemplo, se ha informado que muchas de las moléculas son insolubles, especialmente en sistemas de expresión bacterianos. Véase v.g., Wels et al., (1992) Biotechnology, 10: 1128.

Se han consignado intentos de producir otras moléculas inmunes recombinantes. Por ejemplo, ha habido intentos específicos de manipular receptores de células T (TCRs). El TCR es un heterodímero fijado a la membrana constituido por una cadena \alpha y \beta que se asemeja a una región variable (V) y una región constante (C) de inmunoglobulina. La cadena \alpha de TCR incluye una cadena V-\alpha y una cadena C-\alpha enlazadas covalentemente. La cadena TCR \beta incluye una cadena V-\beta enlazada covalentemente a una cadena C-\beta. Véase en líneas generales Davis, supra.

Se han realizado esfuerzos específicos en cuanto a la manipulación del TCR por técnicas de DNA recombinante. Por ejemplo, en un enfoque, el TCR ha sido formateado como una proteína de fusión monocatenaria que comprende las regiones TCR V (sc-TCR). Se ha consignado que la molécuel sc-TCR tiene varios usos importantes. Véase, v.g., Soo Hoo, W.F. et al. PNAS (EE.UU.) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. y Plückthun, A.; J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al., PNAS (EE.UU.) 90 3830 (1993); PCT WO 96/13593; PCT WO 96/18105; y Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996).

Se cree que las moléculas inmunes recombinantes de la técnica anterior están asociadas con inconvenientes importantes.

Por ejemplo, se ha reconocido que muchos antígenos de tumores se "desprenden" de las células, proporcionando con ello sitios para la fijación inespecífica de moléculas inmunes. En particular, se ha propuesto que muchas moléculas de bsFv interaccionan inadvertidamente con los antígenos desprendidos, reduciendo con ello la eficiencia de destrucción de las células tumorales.

Las moléculas inmunes de la técnica anterior adolecen de inconvenientes adicionales. Por ejemplo, se ha reconocido que muchas moléculas bsFv no pueden fijarse a antígenos diana potenciales tal como ciertos péptidos en la superficie de las células tumorales. Como ilustración, la proteína afín a los tumores p53 no se expresa usualmente en las células tumorales como proteína intacta. En su lugar, se ha consignado que p53 se procesa y se presenta como un péptido en el contexto de una molécula clase I o clase II de la superficie celular. Así, en situaciones en las cuales es necesaria la fijación a péptidos específicos de la superficie celular, ello ha sido difícil o imposible en el caso de moléculas bsFv.

Adicionalmente, ha sido difícil aislar algunas moléculas de bsFv sin pasos importantes de aislamiento y/o re-plegamiento. Véase, p. ej., Jost, C.R. et al. supra y las referencias citadas en dicho lugar.

La preparación y el uso de muchos sc-TCRs se ha visto asociada también a problemas. Por ejemplo, varios métodos de la técnica anterior para producir los sc-TCRs han proporcionado moléculas insolubles y plegadas inadecuadamente. Se han desarrollado varias estrategias en un intento de mejorar los rendimientos de sc-TCR. Sin embargo, los sc-TCRs producidos por estos métodos requieren a menudo manipulaciones que consumen mucho tiempo para obtener cantidades incluso moderadas de proteína. Véase, v.g., Ward, E.S. et al. supra; Schlueter, C.J. supra; y las solicitudes PCT publicadas WO 96/18105 y WO 96/13593.

Existe por tanto una necesidad de moléculas inmunológicas recombinantes y particularmente moléculas de fijación poliespecífica monocatenarias que puedan deteriorar o eliminar (destruir) células diana in vitro e in vivo. Sería deseable disponer de métodos para producir las moléculas de fijación poliespecíficas con un mínimo de pasos preparativos difíciles.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a las moléculas inmunitarias y particularmente a proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias que deterioran o eliminan (destruyen) células diana deseadas. La presente invención está dirigida a una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo enlazado covalentemente a través de una primera secuencia enlazadora peptídica a al menos un anticuerpo monocatenario (sc-Ab) o fragmento funcional del mismo, en donde el sc-TCR o fragmento funcional del mismo se fija a un péptido particular combinado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno. Las presentes moléculas de fijación poliespecíficas monocatenarias son totalmente solubles y pueden aislarse en cantidades significativas con un mínimo de pasos preparativos difíciles.

Los autores de la invención han producido ahora moléculas de fijación poliespecíficas que se caracterizan por una gran diversidad de actividades útiles. Por ejemplo, las proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias pueden asociar células que expresan el MHC (HLA) del péptido ligado (cargado) a células que expresan el antígeno. En la mayoría de los casos, el MHC (HLA) y el antígeno se encontraban en células separadas. La asociación de las células de acuerdo con la invención facilita con preferencia una respuesta inmunitaria que puede deteriorar o destruir las células que expresan los complejos péptido ligado (cargado)-MHC (HLA). La presente invención tiene un amplio espectro de aplicaciones útiles que incluyen el uso en el tratamiento de ciertos cánceres e infecciones virales.

Mas particularmente, la presente invención se caracteriza por una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo enlazado covalentemente a través de una primera secuencia enlazadora peptídica a al menos un anticuerpo monocatenario (sc-Ab) o fragmento funcional del mismo, en donde el sc-TCR o fragmento funcional del mismo se fija a un péptido particular combinado (cargado) a un NHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno, o una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una sc-TCR o fragmento funcional de la misma, 2) una primera secuencia enlazadora polipeptídica, y 3) un anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo, en donde la sc-TCR o fragmento funcional de la misma une un péptido particular fijado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno. Una célula que expresa el MHC o HLA del péptido ligado (cargado) se denominará en lo sucesivo en esta memoria como "célula diana" o término similar. En la mayoría de las realizaciones, el antígeno fijado por el dominio de fijación de anticuerpo se expresará en una superficie celular, usualmente en la superficie de una célula inmune. En realizaciones particulares, el antígeno será selectivo para las células inmunes. Moléculas de fijación poliespecíficas monocatenarias más preferidas de esta invención son capaces de formar un complejo de fijación específico ("puente") entre el MHC o HLA del péptido ligado (cargado) en la célula diana y el antígeno en la célula inmune. Sin pretender quedar ligados por la teoría, se cree que la formación del puente de acuerdo con la invención facilita una respuesta inmunitaria que puede deteriorar o destruir las células diana.

Las moléculas de fijación poliespecíficas de esta invención se fijan específicamente a complejos de MHC o HLA. A no ser que se especifique otra cosa, el término MHC y HLA tal como se utilizan en esta memoria significa un complejo al cual está ligado (cargado) un péptido particular. En algunos casos, se hará referencia a los complejos de MHC (HLA) como "pMHC", "pHLA", o términos similares para denotar la ligación (carga) del péptido. Las moléculas de fijación poliespecíficas son por tanto útiles para ligar los complejos de MHC y HLA y para unir mediante puentes dichos complejos con una célula inmune que expresa un antígeno deseado. En algunos casos, se hará referencia al antígeno de la célula inmune ligado por una molécula de fijación poliespecífica particular como una molécula de "activación" o marcador para designar la activación preferida de la célula inmune después de la fijación por la molécula poliespecífica.

De acuerdo con ello, la presente invención se caracteriza por proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias que incluyen al menos un sc-TCR enlazado covalentemente (es decir fusionado), a al menos un anticuerpo monocatenario (sc-Ab). Las moléculas sc-TCR y sc-Ab pueden fusionarse directamente unas a otras, aunque generalmente se prefiere separar el sc-TCR y el sc-Ab uno de otro por una secuencia enlazadora peptídica adecuada (primera). Alternativamente, pueden emplearse en las proteínas fragmentos funcionales de las moléculas sc-TCR y/o sc-Ab. En realizaciones preferidas, las proteínas de fijación poliespecíficas incluirán el sc-TCR enlazado al sc-Ab a través de la primera secuencia enlazadora peptídica.

Más particularmente, el sc-TCR es con preferencia una cadena V monocatenaria. La cadena V incluirá típicamente una secuencia V\alpha,\beta en la cual una cadena V-\alpha está fusionada a una cadena V-\beta. En una realización específica, la fusión se consigue enlazando covalentemente las moléculas a través de una secuencia enlazadora peptídica (segunda). El producto de fusión puede estar enlazado luego covalentemente a través de la cadena V-\alpha o V-\beta a una cadena constante de inmunoglobulina (Ig-C_{L}) o fragmento de la misma en caso deseado.

En una realización más específica, el término C de la cadena sc-TCR V-\alpha está enlazado covalentemente por la segunda secuencia enlazadora peptídica al término N de la cadena V-\beta. Alternativamente, el término C de la cadena sc-TCR V-\beta puede estar enlazado covalentemente por la segunda secuencia enlazadora peptídica al término N de la cadena V-\alpha.

En otra realización, una cadena C-\beta de TCR o fragmento de la misma está enlazada covalentemente entre el término C de la cadena sc-TCR V-\beta y el término N de la primera secuencia enlazadora peptídica. Alternativamente, la cadena o el fragmento TCR C-\beta puede estar enlazada(o) covalentemente entre el término C de la cadena sc-TCR V-\alpha y el término N de la primera secuencia enlazadora peptídica.

En otra realización, una cadena TCR C-\alpha o fragmento de la misma está enlazada covalentemente entre el término C de la cadena sc-TCR V-\alpha y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica fusionada a la secuencia V-\beta. Alternativamente, la cadena o fragmento C-\alpha puede estar enlazada covalentemente entre el término C de la cadena V-\beta y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica fusionada con la secuencia V-\alpha.

En una realización particular, el sc-TCR incluye la cadena o fragmento TCR C-\alpha enlazada(o) covalentemente entre el término C de la cadena sc-TCR V-\alpha y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica fusionada(o) a la secuencia sc-TCR V-\beta. Adicionalmente, la cadena o fragmento TCR C-\beta está enlazada(o) covalentemente entre el término C de la cadena V-\beta y el término N de la primera secuencia enlazadora peptídica.

Como se ha expuesto, las moléculas de fijación poliespecíficas de esta invención incluyen al menos un sc-Ab. En una realización particular, el dominio de fijación de anticuerpo incluye al menos una sc-Fv. Proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias más preferidas incluyen una sc-Fv o un fragmento funcional del mismo. Un sc-Fv ilustrativo incluye al menos dos cadenas de inmunoglobulina y especialmente dos cadenas variables de inmunoglobulina, v.g. una cadena ligera (V_{L}) fusionada a una cadena pesada (V_{H}). En esta realización, las cadenas V_{L} y V_{H} pueden estar fusionadas una a otra, aunque generalmente se prefiere enlazar covalentemente las cadenas a través de una secuencia enlazadora peptídica(tercera).

En una realización particular, el término C de la cadena V_{L} está enlazado covalentemente por la tercera secuencia enlazadora peptídica al término N de la cadena V_{H}. En otra realización, el término C de la cadena V_{H} está enlazado covalentemente por la tercera secuencia enlazadora peptítica al término N de la cadena V_{L}.

En una realización más particular, el término C de la cadena sc-TCR V-\beta está enlazado covalentemente a la tercera secuencia enlazadora polipeptídica, secuencia que está enlazada ulteriormente al término N de la cadena V_{H}. Alternativamente, el término C del sc-TCR V-\beta está enlazado covalentemente a la tercera secuencia enlazadora polipeptídica como se ha expuesto, excepto que la secuencia polipeptídica está enlazada ulteriormente al término N de la cadena V_{L}. En otra realización, el término C de la cadena sc-TCR V-\beta está enlazado covalentemente a una cadena C-\beta, cadena que está enlazada covalentementea la tercera secuencia enlazadora polipeptídica, secuencia que está enlazada al término N de la cadena V_{H}. Alternativamente, el término C de la cadena sc-TCR V-\beta está enlazado covalentemente a una cadena C-\beta, cadena que está enlazada covalentemente a la tercera secuencia enlazadora polipeptídica, secuencia que está enlazada al término N de la cadena V_{L}.

En una realización preferida, la presente invención proporciona proteínas de fijación "biespecíficas" monocatenarias que incluyen al menos un sc-TCR (o fragmento del mismo), y al menos una sc-Fv (o fragmento del mismo) enlazados covalentemente uno a otro a través de una secuencia enlazadora peptídica adecuada. En los casos en que se utilizan más de un sc-TCR y/o sc-Fv, los sc-TCRs y sc-Fvs son con preferencia iguales. Se hará referencia algunas veces en esta memoria a la cadena de fijación biespecífica monocatenaria como "molécula híbrida biespecífica" o "molécula híbrida sc-TCR/sc-Fv" o expresión similar. Las moléculas híbridas biespecíficas de esta invención pueden incluir secuencias adicionales de aminoácidos tales como marcadores proteínicoss. Proteínas de fijación biespecíficas más preferidas se exponen como sigue.

Por ejemplo, en una realización, las moléculas de fijación biespecíficas incluyen, enlazados covalentemente en secuencia: 1) un sc-TCR o fragmento funcional del mismo de interés, 2) una secuencia enlazadora peptídica adecuada, y 3) una sc-Fv o fragmento funcional de la misma. En una realización más particular, el sc-TCR incluye adicionalmente, enlazados covalentemente en secuencia: 4) la cadena V-\alpha, 5) una secuencia enlazadora peptídica adecuada, 6) una cadena V-\beta, y 7) un fragmento de cadena C-\beta opcional. Alternativamente, el sc-TCR puede incluir, enlazados covalentemente en secuencia: 4) la cadena V-\beta, 5) la secuencia enlazadora, 6) la cadena V-\alpha, y 7) una cadena C-\beta opcional o fragmento de la misma. En otra realización particular, el sc-TCR incluye adicionalmente una cadena C-\alpha o fragmento de la misma enlazada covalentemente entre la cadena V-\alpha y la secuencia enlazadora peptídica fusionada a la cadena V-\beta.

En otra realización particular, las moléculas de fijación biespecíficas incluyen una sc-Fv que incluye, enlazados covalentemente en secuencia: 8) la cadena V_{H}, 9) una secuencia enlazadora polipeptídica adecuada, y 10) la cadena V_{L}. En otra realización la sc-Fv incluye, enlazados covalentemente en secuencia: 8) la cadena V_{L,} 9) la secuencia enlazadora polipeptítica, y 10) la cadena V_{H}.

Las proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias de esta invención pueden incluir adicionalmente al menos un marcador proteínico enlazado covalentemente a las mismas, con preferencia entre aproximadamente 1 y 3 marcadores de este tipo. Con preferencia, el marcador proteínico está fusionado al término C de una molécula de fijación deseada, aunque para algunas aplicaciones puede ser más preferida la fusión al término N.

En una realización más específica, la proteína de fijación poliespecífica monocatenaria incluye, enlazados covalentemente en secuencia: 1) la cadena V-\alpha de TCR, 2) una secuencia enlazadora peptídica, 3) la cadena V-\beta de TCR enlazada covalentemente a un fragmento de cadena C-\beta, 4) una secuencia enlazadora peptídica, 5) la cadena V_{L}, 5) [sic] una secuencia enlazadora peptídica, y 6) la cadena V_{H}. En otra realización, la proteína de fijación poliespecífica monocatenaria incluye, enlazados covalentemente en secuencia: 1) la cadena V-\alpha de TCR, 2) una secuencia enlazadora peptídica, 3) la cadena V-\beta de TCR enlazada covalentemente a un fragmento de cadena C-\beta, 4) una secuencia enlazadora peptídica, 5) la cadena V_{H}, 5) [sic] una secuencia enlazadora polipeptídica, y 6) la cadena V_{L}.

Significativamente, la presente invención es flexible. Es decir, la invención se caracteriza por moléculas de fijación poliespecíficas que pueden incluir una diversidad de componentes sc-TCR y componentes sv-FV. Como se apreciará, el orden en el que se producen o se ensamblan los componentes usualmente no es importante, con tal que se consigan las características deseadas de fijación y activación.

En esta memoria se describen también proteínas de fijación poliespecíficas multicatenarias que incluyen al menos un sc-TCR (fragmento funcional del mismo) y al menos un dominio de fijación de anticuerpos que puede ser, v.g., un
F(v) o sc-Fv. Las moléculas de fijación incluyen más específicamente al menos una "molécula de fijación" para enlazar el sc-TCR y el dominio de fijación de anticuerpo. Como se expondrá con mayor detalle más adelante, la molécula de fijación puede estar enlazada covalente o no covalentemente al sc-TCR, el dominio de fijación de anticuerpo, o ambos. Por ejemplo, en una realización preferida, dos moléculas de fijación compatibles están fusionadas cada una independientemente al sc-TCR y al sc-Fv.

El término "molécula de fijación" significa una secuencia de aminoácidos que es susceptible de fijación específica, sea covalente o no covalentemente, a una segunda secuencia de aminoácidos. A veces se hace referencia a la segunda secuencia de aminoácidos como una secuencia "cognada" para denotar la capacidad de formar un par de fijación específico. A la segunda secuencia puede hacerse referencia también a veces en esta memoria como una segunda molécula de fijación, pudiendo ser dicha segunda molécula de fijación igual a o diferente de la (primera) molécula de fijación. Moléculas de unión más particulares incluyen cadenas de inmunoglobulina, y particularmente cadenas constantes (H o L) o fragmentos adecuados de las mismas, motivos espirales en serpentín y motivos hélice-vuelta-hélice. Ejemplos más específicos de moléculas de fijación se describen a continuación.

A partir de la exposición que sigue será evidente que, en algunos casos, una molécula de fijación puede servir también como un marcador proteínico.

Una molécula de fijación poliespecífica multicatenaria más particular incluye más de una molécula de fijación y con preferencia aproximadamente 2 de tales moléculas de fijación. En una realización más específica, un sc-TCR se fusiona a la primera molécula de fijación. La primera molécula de fijación puede enlazarse covalente o no covalentemente a la segunda molécula de fijación que está enlazada ulteriormente al dominio de fijación de anticuerpo. Sin embargo, en algunas realizaciones, por ejemplo cuando las moléculas de fijación primera y segunda son cadenas adecuadas de inmunoglobulina, puede emplearse una combinación de enlaces covalentes y no covalentes para unir el sc-TCR y el dominio de fijación de anticuerpo a través de las moléculas de fijación primera y segunda.

Como ilustración, una proteína de fijación poliespecífica multicatenaria particular incluye, enlazados covalentemente a al menos un sc-TCR, con preferencia un solo sc-TCR, una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig-C_{H}) o fragmento funcional de la misma. A veces se hará referencia en esta memoria a dicho constructo como una "proteína de fusión sc-TCR/Ig", "sc-TCR/Ig" o expresión similar. Se apreciará que la porción de cadena pesada de inmunoglobulina de la proteína de fusión sc-TCR/Ig es representativa de un tipo de molécula de fijación como se define arriba y en la exposición que sigue. En una realización más específica, la molécula de fijación incluye adicionalmente una segunda molécula de fijación, que es con preferencia una cadena pesada de inmunoglobulina adecuada capaz de formar un complejo de fijación. El isotipo de las cadenas de inmunoglobulina puede ser diferente, pero con preferencia son iguales a fin de facilitar la fijación. La segunda molécula de fijación se fija al dominio de fijación de anticuerpo, que es con preferencia un F(v) y particularmente una sc-Fv. En otras realizaciones, el sc-TCR puede estar unido adicionalmente de modo covalente o no covalente a una cadena variable de inmunoglobulina y con preferencia una cadena variable ligera.

Las proteínas de fijación poliespecíficas mono- y multi-catenarias descritas en esta memoria incluyen con preferencia las cadenas TCR V-\alpha y V-\beta que son idénticas al menos en un 90% a las cadenas V del receptor de las células T presentes en una célula T citotóxica. Con preferencia, al menos la porción sc-TCR de la proteína ha sido humanizada, y más con preferencia la proteína de fijación entera ha sido humanizada para mejorar la compatibilidad con el paciente. En tales realizaciones, puede ser deseable incluir al menos un marcador proteínico que puede ser, v.g., una molécula marcada detectablemente, adecuada para estudios diagnósticos o de imagen.

Como se describirá más adelante, las moléculas de fijación poliespecíficas pueden no estar modificadas, o, si se desea, pueden estar enlazadas covalentemente a una molécula deseada, v.g., fármacos, toxinas, enzimas o sustancias radiactivas a través de una secuencia enlazadora peptídica enlazada.

Las moléculas de fijación poliespecíficas proporcionan varias ventajas importantes.

Por ejemplo, las proteínas de fijación poliespecíficas son capaces de asociarse a una célula diana que expresa el MHC y una célula inmune. Es decir, las presentes proteínas de fijación forman con preferencia un puente que une la célula inmune a la célula que expresa MHC o HLA. Como se ha indicado, se cree que dicha asociación mejora el reconocimiento y facilita el deterioro de o la destrucción de la célula diana. En contraste, la mayoría de las moléculas del sistema inmunitario anteriores y particularmente las moléculas bsFv no están optimizadas para fijarse a los complejos pMHC o pHLA. De acuerdo con ello, las moléculas proporcionan un medio eficaz para destruir células diana que expresan una molécula pMHC o pHLA.

Adicionalmente se cree que el uso de las presentes proteínas de fijación poliespecíficas está asociado con un menor número de actividades adversas cuando se compara con muchas moléculas inmunes anteriores. Como ilustración, se ha comunicado que muchas moléculas msFv de la técnica anterior se fijan a TAAs desprendidos. En contraste, las moléculas de fijación poliespecíficas preferidas de esta invención se fijan específicamente a TAAs en el contexto de las moléculas de MHC o HLA, reduciendo con ello sustancialmente o eliminando totalmente la fijación inespecífica a los residuos desprendidos. Significativamente, se ha registrado un número mucho menor de problemas en el campo relativo a cualquier desprendimiento de MHC y HLA.

Adicionalmente, las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria pueden fijarse a un espectro significativamente más amplio de moléculas que la mayoría de las moléculas inmunes recombinantes de la técnica anterior. En particular, se ha llegado a la comprensión de que los antígenos direccionablesson a menudo células internas ocultas que hacen difícil el reconocimiento y la fijación. Es un objeto de la presente invención describir moléculas de fijación que fijan específicamente estos antígenos ocultos. Por ejemplo, las moléculas de fijación poliespecíficas incluyen al menos un sc-TCR (o fragmento funcional) que puede fijar antígenos en el contexto de un MHC o HLA. Así, las moléculas de fijación son capaces de fijar una gran diversidad de antígenos que son usualmente células internas ocultas. En contraste, la mayoría de las moléculas del sistema inmunitario recombinantes de la técnica anterior no son capaces de fijar eficazmente los antígenos presentados por MHC o HLA.

La presente invención proporciona todavía ventajas adicionales. Por ejemplo, la práctica anterior requería por lo general una manipulación extensiva de las proteínas afines al TCR (v.g., receptores de TCR, heterodímeros de TCR, sc-TCRs), antes que pudieran obtenerse cantidades importantes de proteína. En contraste, las moléculas de fijación poliespecíficas de la presente invención son totalmente solubles y pueden aislarse en cantidades importantes. Adicionalmente, una gran diversidad de las moléculas de fijación poliespecíficas pueden presentarse para interacción con diversos componentes del sistema inmunitario tales como superantígenos o APCs.

Adicionalmente, las moléculas de fijación poliespecíficas mono- y multicatenarias incluyen cadenas de inmunogloblina que se aíslan fácilmente por métodos inmunológicos estándar. La presencia de estas cadenas puede facilitar usualmente la detección, el análisis y el aislamiento de las moléculas de fijación como se expone más ade-
lante.

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En otro aspecto, la invención se refiere a polinucleótidos (RNA, mRNA, cDNA, DNA genómico o quimeras de los mismos) que incluyen o están constituidos por una secuencia que codifica una proteína de fijación poliespecífica mono-catenaria. En una realización, el polinucleótido incluye una secuencia que codifica esencialmente la totalidad de la proteína de fijación, v.g., como en el caso en que la proteína de fijación es un constructo monocatenario.

En otra realización, los polinucleótidos incluyen una secuencia que codifica una porción de la proteína de fijación poliespecífica y particularmente parte de ciertas proteínas de fijación multicatenarias expuestas más adelante. Por ejemplo, un polinucleótido particular de esta invención puede codificar un sc-TCR fusionado a una cadena pesada de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma (v.g., una molécula sc-TCR/Ig). En esta realización, la parte restante de la proteína de fijación poliespecífica puede proporcionarse de diversas maneras. Por ejemplo, la misma puede ser proporcionada por una célula o extracto de la misma capaz de sintetizar moléculas de anticuerpo tales como un dominio de fijación de anticuerpo. El anticuerpo o dominio de fijación de anticuerpo puede estar codificado por el genoma de la célula o puede estar codificado por un segmento de DNA introducido. Con preferencia, la célula será una célula productora de anticuerpo tal como una célula de hibridoma. Alternativamente, la parte restante de la proteína de fijación es proporcionada por una segunda secuencia de polinucleótido que incluye el segmento de DNA. En esta realización, la proteína de fijación se construye con preferencia poniendo en contacto las porciones de proteína codificadas en condiciones que conducen a la formación de la proteína de fijación deseada. Como se expondrá más adelante, las proteínas de fijación poliespecíficas de esta invención pueden unirse por una o una combinación de estrategias que incluyen métodos celulares, genéticos y químicos.

Se contemplan particularmente vectores de DNA que incluyen o están constituidos por los polinucleótidos de esta invención. Vectores de DNA ilustrativos incluyen aquéllos que son compatibles con un sistema de expresión de proteínas procariotas o eucariotas convencional. Ejemplos más específicos de polinucleótidos y vectores de DNA [sic].

Los polinucleótidos proporcionan ventajas importantes. Por ejemplo, como será evidente por la exposición que sigue, los polinucleótidos preferidos de esta invención incluyen segmentos de DNA que codifican moléculas sc-TCR y sc-Ab enlazados covalentemente. Los segmentos de DNA están configurados con preferencia en un formato de "casete" de tal modo que un segmento que codifica un sc-TCR o sc-Ab puede conmutarse, en caso deseado, con otro segmento que codifica otro sc-TCR o sc-Ab.

Se describen también composiciones y métodos para seleccionar proteínas de fijación poliespecíficas. Más particularmente, las composiciones y los métodos pueden emplearse para seleccionar moléculas sc-TCR y sc-Ab con características deseadas, facilitando con ello la producción y el uso de proteínas de fijación poliespecíficas que incluyen estas moléculas.

En una realización, la descripción menciona bacteriófagos que incluyen al menos un sc-TCR (o fragmento funcional) y al menos una sc-Fv (o fragmento funcional) como proteínas de fusión. Como se expondrá, los bacteriófagos pueden emplearse, v.g., para seleccionar moléculas sc-TCR y sc-Fv en cuanto a características de fijación deseadas. Se prefieren bacteriófagos biespecíficos. A los bacteriófagos recombinantes puede hacerse referencia a veces en esta memoria como "polifuncionales" o "poliespecíficos" a fin de denotar la fijación por las proteínas de fusión sc-TCR y sc-Fv. Los bacteriófagos recombinantes pueden derivarse de fagos filamentosos (fd) bien conocidos, aunque en algunos casos pueden utilizarse fagos afines.

Más particularmente, los bacteriófagos recombinantes descritos en esta memoria incluyen una pluralidad de proteínas de fusión que incluyen cada una: 1) al menos un sc-TCR o fragmento funcional del mismo fusionado a una primera proteína de la cubierta de bacteriófago, o 2) al menos un sc-Ab o fragmento funcional del mismo fusionado a una segunda proteína de la cubierta de bacteriófago igual o diferente de la primera proteína de la cubierta de bacteriófago. Proteínas de la cubierta de bacteriófago preferidas son esencialmente de longitud total, o pueden ser fragmentos de las mismas, con tal que el fragmento sea suficiente para presentar la proteína de fusión. Por "presentación" se entiende que la fusión de proteínas forma parte de la cubierta del bacteriófago y es fácilmente detectable en el bacteriófago por técnicas estándar de selección tales como las expuestas más adelante.

En un aspecto afín, se proporciona una genoteca de bacteriófagos recombinante que incluye una pluralidad de bacteriófagos recombinantes en la cual cada bacteriófago comprende una pluralidad de proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias, enlazadas cada una covalentemente a una proteína de la cubierta de bacteriófago como fusión de proteínas, en donde cada proteína de fijación monocatenaria comprende: 1) un sc-TCR o fragmento funcional del mismo fusionado a una primera proteína de la cubierta de bacteriófago o fragmento de la misma, o 2) un sc-Ab o fragmento funcional del mismo fusionado a una segunda proteína de la cubierta de bacteriófago o fragmento de la misma. Genotecas de bacteriófago recombinantes más preferidas incluyen bacteriófagos que presentan proteínas de fijación biespecíficas.

Las genotecas de bacteriófago recombinante pueden estar formateadasra incluir una diversidad de cadenas TCR V y/o cadenas variables de inmunoglobulina.

De acuerdo con ello, pueden utilizarse genotecas para seleccionar bacteriófagos recombinantes que presentan moléculas sc-TCR y sc-Ab deseadas.

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Los bacteriófagos recombinantes pueden aislarse por una diversidad de técnicas convencionales. En una realización, se describe un método para aislamiento de los bacteriófagos recombinantes, en el cual el método incluye al menos uno y con preferencia la totalidad de los pasos siguientes:

a) introducir en células hospedadoras un primer polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una primera proteína de fusión que comprende un sc-TCR enlazado covalentemente a una primera proteína de la cubierta de bacteriófago o fragmento de la misma,

b) introducir en las células hospedadoras un segundo polinucleótido que comprende

una secuencia que codifica una segunda proteína de fusión que comprende una sc-Fv enlazado covalentemente a una segunda proteína de la cubierta de bacteriófago o fragmento de la misma;

c) cultivar las células hospedadoras en un medio en condiciones que permiten la propagación de los bacteriófagos y la presentación de las proteínas de fusión; y

d) aislar los bacteriófagos recombinantes de la célula hospedadora o del medio.

En una realización particular, el método incluye adicionalmente poner en contacto un extracto de la células hospedadora o el medio cultivado con una matriz sintética capaz de fijarse específicamente a una de las proteínas de fusión, y purificar el bacteriófago recombinante a partir de la matriz sintética para aislar el bacteriófago. En una realización más particular, la matriz sintética incluye un fragmento de anticuerpo que es capaz de fijarse específicamente al bacteriófago recombinante. Técnicas de aislamiento de bacteriófagos más específicas se exponen más adelante.

Adicionalmente, se describe un kit que comprende los presentes bacteriófagos recombinantes, pudiendo incluir también dicho kit células procariotas adecuadas para propagar el bacteriófago e instrucciones para utilización del kit. Se describe también un kit que incluye la genoteca de bacteriófagos expuesta anteriormente.

Los bacteriófagos recombinantes tienen usos y ventajas adicionales. Por ejemplo, los bacteriófagos pueden utilizarse de acuerdo con técnicas de selección estándar para facilitar el análisis de una molécula de fijación poliespecífica deseada in vitro. Más particularmente, los bacteriófagos recombinantes pueden utilizarse para comprobar si un sc-TCR o sc-Ab tal como una sc-Fv tiene capacidad para reconocer, fijar y/o destruir células diana de interés. Ventajas adicionales incluyen un procedimiento relativamente rápido y directo para producir y ensayar moléculas sc-TCR/sc-Ab biespecíficas; un proceso de purificación corto y sencillo; y un método acelerado para ensayar grandes números de moléculas híbridas diferentes en cuanto a eficacia para el deterioro o la destrucción de células diana (v.g., destrucción de tumores).

Las proteínas de fijación poliespecíficas mono- y multicatenarias descritas en esta memoria pueden producirse como proteínas totalmente funcionales y solubles por uno o una combinación de métodos. En general, los métodos implican técnicas celulares, de DNA recombinante y químicas, o combinaciones de las mismas.

Por ejemplo, en una realización, se proporciona un método para construir una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo y al menos una Fv monocatenaria (sc-Fv) o fragmento funcional de la misma, en donde la sc-TCR o fragmento funcional de la misma une un péptido particular fijado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija unantígeno, comprendiendo el método:

a) introducir en una célula hospedadora un vector de DNA que codifica una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de interés,

b) cultivar la célula hospedadora en un medio en condiciones suficientes para expresar la proteína de fijación poliespecífica monocatenaria en la célula o el medio; y

c) purificar la proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de las células de hibridoma o del medio. Adicionalmente, se describen en esta memoria métodos para producir una proteína de fijación poliespecífica multicatenaria que comprende al menos un sc-TCR o fragmento funcional del mismo y un dominio de fijación de anticuerpo o fragmento funcional. En una realización del método, el dominio de fijación de anticuerpo es un F(v). En particular, se utiliza una célula o un extracto de células para formar al menos parte de la proteína de fijación multicatenaria. Más particularmente, se emplea una célula productora de anticuerpo tal como un hibridoma. En una realización, el método incluye al menos uno y con preferencia la totalidad de los pasos siguientes:

a): introducir en una célula de hidriboma un vector de DNA que codifica al menos un sc-TCR, con preferencia un sc-TCR (o fragmento funcional) enlazado covalentemente a una cadena pesada constante de inmunoglobulina o fragmento de la misma,

b): cultivar la célula de hibridoma en medios en condiciones que conducen a la formación de un complejo de fijación específico entre la cadena pesada constante de inmunoglobulina o fragmento codificada(o) por el vector de DNA y cadenas de inmunoglobulina producidas por el hibridoma; y

c): purificar la proteína de fijación poliespecífica multicatenaria a partir de las células de hibridoma o los medios.

En una realización más específica, el método proporciona una proteína de fijación poliespecífica multicatenaria que incluye una cadena ligera variable de inmunoglobulina enlazada covalentemente al sc-TCR, es decir, una proteína de fijación biespecífica.

La presente descripción proporciona métodos adicionales para producir las proteínas de fijación poliespecíficas multicatenarias. Por ejemplo, en una realización, cada cadena de una proteína de fijación deseada se produce independientemente, v.g., por métodos de DNA recombinante o métodos químicos. Con preferencia, la proteína de fijación incluye adicionalmente al menos una molécula de fijación, con preferencia dos moléculas de fijación iguales o diferentes. En una realización particular, el método incluye al menos uno y con preferencia la totalidad de los pasos siguientes:

a) proporcionar una primera secuencia que incluye al menos un sc-TCR o fragmento funcional del mismo enlazado covalentemente a una primera molécula de fijación,

b) poner en contacto la primera secuencia con una segunda secuencia que incluye al menos una sc-Fv o fragmento funcional del mismo enlazado a una segunda molécula de fijación, en donde el contacto se realiza en condiciones suficientes para formar un complejo de fijación específico entre las moléculas de fijación primera y segunda; y

c) formar la proteína de fijación poliespecífica multicatenaria. Con preferencia, la proteína de fijación poliespecífica multicatenaria es biespecífica.

Métodos de DNA recombinante y métodos químicos más específicos para producción de las proteínas de fijación poliespecíficas multicatenarias se exponen más adelante.

Como se ha expuesto, las presentes proteínas de fijación poliespecíficas tienen también usos importantes in vivo. Por ejemplo, las proteínas de fijación pueden utilizarse para redirigir la especificidad de ciertas células inmunes, v.g. para eliminar células diana tales como células infectadas por virus o células tumorales. En algunos casos, las células tumorales pueden estar también infectadas por virus. Como se ha expuesto, el uso preferido de las presentes moléculas de fijación puede aumentar el deterioro o la eliminación de las células diana. De acuerdo con ello, la presente invención puede utilizarse in vivo para destruir células diana por aumento de la activación del sistema inmunitario contra dichas células diana. El uso preferido in vivo de las presentes moléculas de fijación poliespecíficas incluye el uso en un mamífero tal como un roedor, primate o animal doméstico, y especialmente un paciente humano.

Así, en un aspecto, se proporcionan medios para deteriorar o con preferencia destruir una célula diana que comprende un MHC o HLA de interés. En una realización, esto incluye al menos uno y con preferencia la totalidad de los pasos siguientes:

a) poner en contacto una pluralidad de células con una proteína de fijación poliespecífica, en donde la pluralidad de células comprende células inmunes que comprenden un antígeno y células diana que comprenden el MHC o HLA,

b) formar un complejo de fijación específico (puente) entre el MHC o HLA en las células diana y el antígeno en las células inmunes suficiente para activar las células inmunes; y

c) destruir las células diana con las células inmunes activadas. Se apreciará que por el término "activadas" se entiende que las células inmunes son capaces de deteriorar o destruir la célula diana tal como se determina, v.g., por ensayos de citoquinas y de citotoxicidad descritos más adelante.

Si se desea, el método arriba descrito puede conducirse in vitro, por ejemplo en una cápsula de cultivo de células.

Las proteínas de fijación poliespecíficas mono- y multicatenarias tienen usos adicionales in vitro e in vivo.

Por ejemplo, moléculas de fijación poliespecíficas preferidas pueden utilizarse in vitro o in vivo para detectar y con preferencia formar un puente entre células diana y células inmunes. La formación del puente puede utilizarse para aislar células que expresan MHC, HLA o marcadores de antígenos deseados.

Las presentes proteínas de fijación poliespecíficas encuentran uso también en la detección y el análisis de moléculas de MHC o HLA y antígenos de la superficie celular. Las presentes proteínas de fijación pueden utilizarse también para propósitos de diagnóstico tales como para la detección de células del sistema inmunitario y especialmente células T con propiedades patógenas. Las presentes moléculas de fijación pueden emplearse adicionalmente en ensayos funcionales, celulares y moleculares, y en análisis estructurales, con inclusión de cristalografía de rayos X, formación de imágenes por resonancia magnética nuclear, y técnicas de computación tales como presentación de gráficos de ordenador.

En otro aspecto, la presente invención proporciona adicionalmente medios de tratamiento para reducir o eliminar la presencia de las células diana en un mamífero. En particular, los usos incluyen la administración de una proteína de fijación poliespecífica de esta invención en una formulación farmacéuticamente aceptable. Si se desea, la porción sc-TCR o sc-Ab de una molécula de fijación poliespecífica particular puede separarse antes de o durante la administración a fin de facilitar un método de tratamiento específico.

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En una realización más particular, puede realizarse el tratamiento del cáncer y de una infección viral. En particular, los usos incluyen la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una proteína de fijación poliespecífica de esta invención a un mamífero especialmente un paciente humano. Con preferencia la cantidad es suficiente para tratar el cáncer y/o la infección viral. La invención puede utilizarse para tratar una afección existente o puede utilizarse profilácticamente en caso necesario. Los presentes tratamiento pueden utilizarse solos o en combinación con otras terapias en caso deseado.

Los tratamientos preferidos reducen o eliminan la presencia de células diana específicas en un mamífero, particularmente un roedor o un primate tal como un humano. En una realización, los tratamientos incluyen la obtención de un sc-TCR o sc-Ab a partir de la molécula de fijación poliespecífica (v.g., por tratamiento con proteasas). El sc-TCR o sc-Ab así obtenido puede administrarse al mamífero en lugar de o en asociación con la molécula de fijación poliespecífica. Para la mayoría de las aplicaciones que implican uso en animales, se preferirá minimizar las respuestas inmunitarias no deseadas contra las presentes moléculas de fijación, v.g., por utilización de cadenas de inmunoglobulina de un haplotipo compatible con el animal que se utiliza.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A-1D son dibujos que muestran el receptor de las células T monocatenario (sc-TCR) y constructos Fv monocatenarios (sc-Fv) de DNA. (1A) constructo D011.10 sc-TCR, (1B) constructo p149 sc-TCR, (1C) 145-2C11 sc-Fv, (1D) constructo F23.1 sc-Fv de DNA.

Las Figuras 2A-2E son dibujos que muestran inserciones sc-TCR de diversos vectores: (2A) pSun22; (2B) pSun23; (2C) pSun21; (2D) pSun19; y (2E) pSun20.

La Figura 3 es una ilustración esquemática del vector pSUN23.

La Figura 4 es una ilustración esquemática del vector pNAG2.

La Figura 5 es un dibujo esquemático que muestra el vector pSUN27.

La Figura 6 es un dibujo que muestra moléculas híbridas biespecíficas preferidas pBISP/D011.10 y pBISP/149.

La Figura 7A es un dibujo esquemático que muestra un método para producir una molécula de anticuerpo biespecífica quimérica. El método utiliza una célula de expresión de hibridoma (hibridoma 145-2C11) para producir cadenas de anticuerpo (líneas gruesas) que se combinan con una molécula de fusión sc-TCR-Ig (cadena ligera) dentro de la célula. Una estructura preferida para la molécuel sc-TCR/Ig se ilustra en la Figura 7B.

La Figura 8 es un dibujo que muestra el vector pSUN7.

Las Figuras 9A-9B son gráficos que muestran los resultados de ensayos ELISA utilizados para detectar la proteína de fusión BISP/149. Los anticuerpos utilizados fueron (9A) \alphaEE (Ab de captura) y \alphaV_{\alpha 2} (B20.1, sonda Ab), (9B) \alphaV\beta11 (RR3-15, Ab de captura). RR3-15 es un anticuerpo monoclonal específico para la cadena \alphaV\beta11. B20.1 es un anticuerpo monoclonal específico para la cadena \alphaV\alpha2. La sonda Ab se encuentra en el eje x en la Figura 9B.

Las Figuras 10A-10B son gráficos que muestran los resultados de ensayos ELISA utilizados para detectar la proteína de fusión BISP/D011.10. Los anticuerpos utilizados fueron (10A) F23.1 (sonda Ab) o (10B) H57-597 (sonda Ab). Ab de captura se encuentra en el eje x en las figuras 9A y 9B.

La Figura 11 es un gráfico que muestra los resultados de ensayos ELISA utilizados para detectar moléculas biespecíficas quiméricas. Ab de captura es IgG2b anti-ratón de cabra (eje x). La sonda Ab es IgG anti-hámster de cabra.

La Figura 12 es una representación de una transferencia Western que muestra la expresión de moléculas híbridas biespecíficas BISP/D011.10 y BISP/p149. Se muestran también formas reducidas de las proteínas (flecha).

La Figura 13 es una representación de un gel de SDS teñido con azul Coomassie. El gel muestra la expresión de moléculas híbridas biespecíficas BISP/D011.10 y BISP/p149. Se muestran también formas reducidas de las proteínas (flecha).

La Figura 14 es un gráfico que muestra los niveles de IL-2 expresados por células de hibridoma T como función del anticuerpo monoclonal KJ-1.

La Figura 15 es un gráfico que muestra IL-2 expresada por células de hibridoma T como función de la adición del anticuerpo BISP o BISP más MR-5.

La Figura 16 es un gráfico que muestra la expresión de IL-2 de células de hibridoma T en función de la adición de un anticuerpo monoclonal.

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La Figura 17 es un gráfico que muestra la fijación por citometría de flujo de células pBisp149 a células 2B4 T.

La Figura 18 es un gráfico que muestra la fijación por citometría de flujo de la proteína purificada pBISP/D011.10 entre células 2B4 y células T.

La Figura 19 es un gráfico que muestra estudios de fijación por citometría de flujo entre \alpha-CD3 soluble y la proteína pBISP/149 purificada.

La Figura 20 es un gráfico que muestra los resultados de un ensayo de proliferación de células T. Se pre-estimularon esplenocitos BALB/c con rIL-2 y se incubaron en ausencia o presencia de 10 \mug/pocillo de una molécula scBisp149 enriquecida con células diana sin pulsar (T2) o células T2 pulsadas con el péptido p149.

La Figuras 21A-21B son dibujos que muestran iniciadores de oligonucleótidos específicos (SEQ ID Nos: 16-43).

Descripción detallada de la invención

La presente invención es como se especifica en las reivindicaciones.

Como se ha resumido arriba, la presente invención se caracteriza, en un aspecto, por proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias y métodos para producir las proteínas y su uso. El uso preferido de las presentes moléculas de fijación incluye el deterioro o la eliminación (destrucción) de células dianaque expresan MHC in vitro o in vivo. Se describen adicionalmente bacteriófagos recombinantes muy útiles así como métodos de utilización de los mismos que pueden emplearse para seleccionar las moléculas de fijación deseadas.

Como se utiliza en esta memoria, la expresión "proteína de fijación poliespecífica" o expresión similar significa una molécula monocatenaria o multicatenaria que incluye con preferencia 1) un dominio de fijación capaz de fijar un complejo de MHC o HLA, con preferencia una diana celular que expresa un pMHC o pHLA (o porción del mismo) y 2) un dominio de fijación de anticuerpo capaz de fijar una diana de antígeno, con preferencia una porción de antígeno o epítope del mismo expresada en la superficie de una célula inmune. Con preferencia, la porción de pMHC o pHLA es susceptible de ser fijada específicamente por un TCR, y la porción de antígeno es susceptible de ser fijada específicamente por un anticuerpo. En realizaciones preferidas, el antígeno es un antígeno de la superficie celular que es indicativo de la célula inmune. En realizaciones adicionalmente preferidas, cada uno de los dominios de fijación es suficiente para fijar el pMHC o pHLA, y dianas de antígeno en momentos alternados o al mismo tiempo. Tal como se expone en esta memoria, los dominios de fijación pueden estar presentes en la misma cadena (es decir en una cadena simple) o los dominios de fijación pueden estar presentes en más de una cadena (es decir en una cadena múltiple y particularmente entre aproximadamente 2 y 4 cadenas, siendo preferidas dos cadenas).

Por la expresión "dominio de fijación de anticuerpo" se entiende un sitio de fijación de anticuerpo que comprende al menos una y con preferencia dos cadenas variables de inmunoglobulina que son capaces de fijar específicamente el antígeno o epítope del mismo. Por ejemplo, en una realización preferida, el dominio de fijación de antígeno es un constructo monocatenario (sc-Ab) e incluye una sola región variable de inmunoglobulina (V_{L} o V_{H}); dos o más regiones variables (V_{L} + V_{H}; V_{L} + V_{L}; o V_{H} + V_{H}); o las regiones complementarias determinantes de las mismas. Un ejemplo más particular de un dominio de fijación de anticuerpo sc-Ab adecuado es una molécula sc-Fv. En otra realización, el dominio de fijación de anticuerpo incluye adicionalmente una cadena ligera constante de inmunoglobulina (Ig-C_{L}) y/o una cadena pesada de inmunoglobulina (Ig-C_{H}). Ejemplos preferidos incluyen, pero sin carácter limitante, moléculas Fab, F(v), Fab' y F(ab')2. Dominios de fijación de anticuerpos más específicos se exponen más adelante.

En una realización más particular, la proteína de fijación poliespecífica es un constructo monocatenario que incluye al menos un sc-TCR (o fragmento funcional) y al menos un sc-Ab y especialmente una sc-Fv (o fragmento funcional). La proteína de fijación poliespecífica monocatenaria puede incluir entre aproximadamente 1 y 5 moléculas sc-TCR y/o entre aproximadamente 1 y 5 moléculas sc-Fv, siendo generalmente preferidos un solo sc-TCR y un solo sc-Fv para la mayoría de las aplicaciones. En realizaciones en las cuales la proteína de fijación incluye al menos un sc-TCR o sc-Fv, las moléculas pueden estar enlazadas en tándem y están separadas con preferencia unas de otras por secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas.

Moléculas de fijación poliespecíficas más particulares de esta invención son moléculas de fijación biespecíficas e incluyen un solo sc-TCR y un solo sc-Ab, y particularmente una sola molécula sc-Fv. En esta realización, el sc-TCR y la sc-Fv están separados por una secuencia enlazadora peptídica adecuada.

En general, las presentes proteínas de fijación poliespecíficas incluyen especificidades de fijación predeterminadas. Es decir, la elección de un sc-TCR o dominio de fijación de anticuerpo particular estará guiada por parámetros reconocidos tales como el uso propuesto y las células diana y células inmunes de interés. En la mayoría de los casos, las especificidades de fijación serán diferentes tal como se determina por ensayos de fijación específicos descritos más adelante. Sin embargo, en algunas realizaciones, será útil seleccionar dominios de fijación con especificidades de fijación iguales o estrechamente afines. Métodos para seleccionar dominios de fijación deseados y para seleccionar las moléculas sc-TCR y sc-Ab apropiadas se describen más adelante.

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Como se ha expuesto, en una realización, las presentes proteínas de fijación poliespecíficas incluyen un sc-TCR o fragmento funcional del mismo que fija células diana que expresan pMHC o pHLA. En una realización más particular, el sc-TCR se selecciona de modo que fije específicamente una molécula pMHC de clase I o clase II (o un antígeno pHLA) en la célula diana.

Tal como se utiliza en esta memoria, el término "fragmento funcional" de sc-TCR significa una porción de un sc-TCR de longitud total (es decir, que comprende cadenas V de longitud total) que es capaz de fijar de modo específico al menos aproximadamente 70% y con preferencia al menos aproximadamente 80%, 90%, 95% hasta 100% o más de un MHC o HLA cuando se compara con un sc-TCR de longitud total. Un sc-TCR de longitud total se define como una molécula con una cadena V-\alpha y V-\beta de longitud total. Ensayos para detectar fijación específica se expone más adelante e incluyen citometría de flujo y BiaCore.

Como se ha mencionado anteriormente, el sc-TCR incluye cadenas TCR V-\alpha y V-\beta enlazadas covalentemente a través de una secuencia enlazadora peptídica adecuada. Por ejemplo, la cadena V-\alpha puede estar enlazada covalentemente a la cadena V-\beta a través de una secuencia enlazadora peptídica adecuada fusionada al término C de la cadena V-\alpha y al término N de la cadena V-\beta. Las cadenas V-\alpha y V-\beta de la proteína de fusión sc-TCR están codificadas por ácidos nucleicos que tienen por regla general aproximadamente 200 a 400 nucleótidos de longitud, con preferencia aproximadamente 300 a 350 nucleótidos de longitud, y serán idénticas al menos en un 90%, y con preferencia idénticas en un 100% a las cadenas V-\alpha y V-\beta del TCR existente naturalmente. Por el término "idéntico" se entiende que los aminoácidos de la cadena V-\alpha o V-\beta son 100% homólogos a las cadenas TCR V-\beta o V-\alpha correspondientes existentes naturalmente. Véanse los ejemplos 1-3 más adelante y las Solicitudes de Patente U.S. núms. de serie 08/813.981 y 08/943.086 pendientes para una descripción más específica con relación a las cadenas sc-TCR V.

Como se ha mencionado anteriormente, la cadena V-\alpha de la molécuel sc-TCR puede incluir adicionalmente una cadena TCR C-\beta o fragmento de la misma fusionada al término C de la cadena V-\beta. Adicionalmente, la cadena V-\alpha puede incluir una cadena TCR C-\alpha o fragmento de la misma fusionada al término C de la cadena V-\alpha, y al término N de la secuencia enlazadora peptídica. Generalmente, en aquellas proteínas de fusión sc-TCR que incluyen un fragmento de cadena C-\beta, el fragmento tendrá una longitud de aproximadamente 50 a 126 aminoácidos y usualmente no incluirá el último residuo cisteína en la posición 127. Para aquellas proteínas de fusión que comprenden una cadena C-\alpha, la longitud puede variar entre aproximadamente 1 y 90 aminoácidos (es decir la cadena C-\alpha hasta, pero sin inclusión de la cisteína final). Por ejemplo, en una realización, la proteína de fusión incluye un fragmento de cadena C-\alpha entre aproximadamente 1 y 72 aminoácidos partiendo del aminoácido 1 al 72. En otra realización, el fragmento de la cadena C-\alpha está comprendido entre aproximadamente 1 y 22 aminoácidos a partir del primer aminoácido hasta el aminoácido 22 (leucina). El fragmento de la cadena C-\alpha no incluye típicamente ningún residuo cisteína excepto la variante C_{\alpha 90}, que incluye dos residuos cys. En la mayoría de los casos, la elección de la longitud de la cadena C-\alpha y C-\beta estará guiada por varios parámetros que incluyen las cadenas V particulares seleccionadas y el uso propuesto de la proteína de fijación poliespecífica particular. Véase la exposición siguiente y los Ejemplos 1-2 más adelante para una exposición más específica con relación a las cadenas sc-TCR C-\beta y C-\alpha.

Es posible facilitar la expresión de proteínas de fusión sc-TCR totalmente solubles y funcionales por adición de una cadena Ig-C_{L} o un fragmento Ig-C_{L} adecuado de la misma. De modo más específico, la cadena Ig-C_{L} o el fragmento de la misma está enlazada(o) covalente a la molécuel sc-TCR, v.g., al término C de la cadena V-\beta o el fragmento C-\beta. Aunque típicamente no se prefiere, es posible enlazar covalentemente el fragmento Ig-C_{L} o fragmento del mismo al término N de la cadena V-\alpha. Si se desea, la cadena Ig-C_{L} puede separarse antes de la incorporación en una molécula de fijación poliespecífica.

Como se ha expuesto anteriormente, el sc-TCR de una proteína de fijación poliespecífica puede proporcionarse en una diversidad de formatos adecuados. Por ejemplo, el sc-TCR puede proporcionarse con v.g., dos secuencias enlazadoras peptídicas, estando fusionada la primera secuencia enlazadora peptídica entre el término C de la cadena V-\alpha y el término N de la cadena V-\beta. El término C de la cadena V-\beta puede estar fusionado al término N de un fragmento de cadena C-\beta en caso deseado. El segundo enlazador peptídico se fusiona entonces al término C de la cadena V-\beta o al fragmento de la cadena C-\beta y el término N de, v.g., un efector o marcador proteínico.

En otras realizaciones ilustrativas, el sc-TCR de la molécula de fijación poliespecífica incluye una cadena V-\beta fusionada a la cadena V-\alpha a través de un enlazador peptídico adecuado en el cual el término C de la cadena V-\beta o el fragmento de la cadena C-\beta del mismo y el término N de la cadena V-\alpha están enlazados covalentemente.

Las moléculas sc-TCR arriba mencionadas están fusionadas ulteriormente a una secuencia enlazadora peptídica, secuencia que está enlazada además covalentemente por regla general a un dominio de fijación de anticuerpo de interés. Proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias preferidas incluyen, enlazados covalentemente en secuencia, un sc-TCR, una secuencia enlazadora peptídica, y un sc-Ab tal como una sc-Fv.

Es posible producir y utilizar una diversidad de moléculas sc-TCR. En particular, generalmente se prefiere que el sc-TCR incluya cadenas V-\alpha,\beta para las cuales está fácilmente disponible una secuencia codificante de longitud total o sustancialmente de longitud total. Métodos para obtención de secuencias de cadena TCR V de longitud total a partir de fuentes de células son bien conocidos. Alternativamente, las regiones de cadena V\alpha,\beta pueden obtenerse por amplificación mediante PCR de cadenas V\alpha,\beta disponibles públicamente. Secuencias de genes V\beta ilustrativas incluyen las secuencias de genes V\beta 8.1, V\beta 6.1, V\beta 5.1, V\beta 5.2, V\beta 5.3, V\beta 2.1, y V\beta 2.3. Véase Abe et al., (1992) PNAS (USA) 89:4066; Wang, et al., 1993); PNAS (USA) 90:188; Lahesma et al. (1993) J. Immunol. 150:4125; Kotzin, et al., (1991) PNAS (USA) 88:9161; Uematsu, et al., (1991) PNAS (USA) 88:8534. Véase también, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5ª edición) (Public Health Science, NIH, y Chotia, C. et al., (1998) EMBO J. 7:3645 para secuencias adicionales de cadenas TCR V-\beta, V\alpha.

Adicionalmente, los Ejemplos 1-3 siguientes proporcionan iniciadores oligonucleotídicos para amplificación por PCR de cadenas V-\alpha y V-\beta específicas. Véanse también las Figuras 21A-21B para ejemplos de iniciadores oligonucleotídicos que pueden utilizarse para aislar las cadenas TCR V.

En los caos en que se desea obtener cadenas TCR V procedentes de una fuente biológica, puede identificarse un TCR deseado por métodos inmunológicos convencionales que incluyen el uso de anticuerpos específicos de TCR, que fijan predominantemente, y con preferencia son específicos para, un epítope de la región TCR V. Típicamente, la expresión en la superficie puede detectarse por utilización de técnicas conocidas tales como microscopía de fluorescencia, citometría de flujo, o inmunoquímica. Se conocen cierto número de anticuerpos que fijan específicamente regiones variables de TCR. Véase, v.g., la solicitud PCT publicada WO 90/06758.

El DNA o RNA del TCR detectado puede sondarse directamente, o con preferencia después de amplificación por PCR, por hibridación específica con sondas oligonucleotídicas para las diversas familias de genes TCR, utilizando métodos de hibridación bien conocidos en el campo. Generalmente, se utilizarán condiciones de hibridación de ácido nucleico de alta severidad. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "hibridación de alta severidad" significa condiciones de incubación de ácido nucleico a aproximadamente 65ºC en 0,1 x SSC. Véase Sambrook, et al., infra. La secuencia de DNA de TCR o porción deseada de la misma puede obtenerse directamente a partir del DNA o RNA amplificado y puede subclonarse a un vector adecuado en caso deseado.

Se conocen otros métodos para obtención de DNA de la región V de TCR. Por ejemplo, un TCR deseado que comprende genes de la región V puede identificarse por secuenciación del TCR o con preferencia una porción del mismo correspondiente a la región V. la secuencia de DNA puede determinarse, v.g., después de clonación del DNA en un vector de secuenciación adecuado como se conocen en el campo o determinando primeramente la secuencia de la proteína o al menos parte del TCR y determinación de la secuencia de DNA. Será fácilmente evidente para los expertos en este campo que las manipulaciones arriba mencionadas así como otras conocidas por los expertos pueden emplearse para identificar con éxito un TCR deseado y obtener los genes de la región V de dicho TCR de tal modo que pueda producirse un constructo V\alpha\beta monocatenario.

Más específicamente, cuando se desea obtener DNA de la región TCR V a partir de una fuente biológica, puede obtenerse un segmento de DNA que codifica la cadena V-\alpha y V-\beta deseada a partir de células tales como hibridomas de células T o células T citotóxicas (CTLs). Las células T (v.g., células T_{S}, T_{C} o T_{H}) pueden obtenerse in vivo, o bien las células T pueden ser uno o más hibridomas de células T cultivado(s) (v.g., líneas de células D10 o B12). Véanse los Ejemplos 1-3 que siguen. Los CTLs pueden no estar inducidos o pueden estar asociados con una respuesta patógena del sistema inmunitario en un roedor (v.g., ratón, rata, conejo) o primate (v.g., humano o chimpancé). Por ejemplo, los CTLs u otras células T pueden derivarse de pacientes que sufren o que se sospecha padecen enfermedad de Lyme, enfermedad de Kawasaki, lepra, cáncer (es decir respuestas inmunitarias contra antígenos asociados a tumores tales como CEA), o un trastorno autoinmune, particularmente los asociados con rechazo de transplantes, esclerosis múltiple, diabetes dependiente de insulina, artritis reumatoide, y alergias; o una enfermedad infecciosa, en particular una enfermedad infecciosa que implica un virus de RNA o DNA. Virus particulares de interés incluyen los virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), citomegalovirus (CMV), gripe, hepatitis, poxvirus, Epstein-Barr, adenovirus o virus de polioma. Fuentes ilustrativas de CTLs son CTLs y TILs específicos del antígeno aislados de pacientes con carcinomas y melanomas establecidos (véase v.g., Cox A. et al., Science (1994) 264:716; Rosenberg, S.A. et al. N. Eng. J. Med. (1988) 319:1676; Kawakami, Y. et al., J. Exp. Med. (1994) 180:347); Kawakami, Y. et al., PNAS (1994) 91:6458).

Como se ha mencionado anteriormente con respecto a la obtención de cadenas V-\alpha y V-\beta a partir de fuentes celulares, pueden utilizarse varios procedimientos alternativos para preparar ácidos nucleicos aislados de las mismas. Más particularmente, para preparar DNA de la cadena V-\alpha y V-\beta, se aísla mRNA de aquellas células que demuestran una especificidad de fijación de TCR deseada. Tales métodos incluyen generalmente el uso de un protocolo PCR adecuado utilizando el molde de cDNA de la primera cadena producido a partir del mRNA. Pueden emplearse luego técnicas recombinantes estándar para producir las cadenas \alpha y \beta deseadas. El segmento de DNA que codifica las cadenas V-\alpha y V-\beta deseadas se modifica luego para incluir una secuencia enlazadora peptídica adecuada y uno o más marcadores proteínicos, en caso deseado.

Generalmente, un iniciador oligonucleotídico de DNA para uso en los métodos PCR tendrá una longitud comprendida entre aproximadamente 12 y 50 nucleótidos, con preferencia entre aproximadamente 20 y 25 nucleótidos. Los iniciadores oligonucleotídicos de PCR pueden incluir convenientemente sitios de restricción para añadir sitios de escisión por enzimas de restricción específicas al producto PCR en caso necesario, v.g., para introducir un sitio de ligación. En los ejemplos y dibujos que siguen se proporcionan iniciadores ilustrativos. Los productos PCR producidos incluirán secuencias de cadena V-\alpha y V-\beta amplificadas, y pueden modificarse para incluir, en caso deseado, secuencias de fijación de ribosoma, secuencias conductoras y secuencias promotoras para expresión óptima de la proteína de fusión.

Un segmento de DNA que codifica una molécuel sc-TCR deseada puede producirse en cantidades importantes (cantidades de miligramos por gramo de células) de acuerdo con los métodos descritos más adelante.

Sc-TCRs más particulares utilizados para producir las proteínas de fijación poliespecíficas presentes incluyen aquellos sc-TCRs con cadenas V-\alpha y V-\beta derivadas de un mamífero. Ejemplos incluyen primates, particularmente humanos y chimpancés; roedores, v.g., ratones inmunológicamente ingenuos tales como ratones atímicos o ratones que incluyen un transgén capaz de expresar un complejo de antígeno HLA-A2 (Vitiello, A. et al., J. Exp. Med., (1991) 175, 1002). Humanos de interés particulares incluyen aquéllos que padecen cualquiera de las patologías mencionadas anteriormente, tales como un trastorno autoinmune. Constructos quiméricos que comprenden secuencias de DNA V-\alpha y V-\beta derivadas de diferentes mamíferos pueden construirse de acuerdo con métodos conocidos y están también dentro del alcance de la presente invención.

Se prefiere que una secuencia enlazadora peptídica utilizada para producir el sc-TCR sea capaz de posicionar eficazmente las cadenas V-\alpha y V-\beta para formar una bolsa de fijación de ligando. El sc-TCR es por tanto con preferencia capaz de fijar específicamente un ligando deseado tal como un superantígeno o antígeno peptídico en el contexto de un complejo peptídico MHC/HLA, o una molécula pequeña. En algunas realizaciones de la presente invención, las moléculas de fijación poliespecíficas pueden utilizarse para competir con TCRs existentes naturalmente en la superficie de las células T. Por "competir" se entiende que la proteína de fusión soluble es capaz de fijar el ligando a un nivel que es igual a, o en algunos casos sobrepasa la afinidad de fijación específica del TCR para el mismo ligando. Por ejemplo, de acuerdo con los métodos descritos más adelante y en la solicitud U.S. No. 08/943086 pendiente, la proteína de fusión sc-TCR (o molécuel sc-TCR derivada de ella) puede exhibir una afinidad de fijación que es aproximadamente igual o hasta aproximadamente 2 a 10 veces mayor que el TCR existente naturalmente. Se describen en esta memoria ensayos de fijación ilustrativos e incluyen ensayos de transferencia Western estándar así como ensayos de resonancia de plasmón superficial descritos más adelante.

En general, las secuencias enlazadoras peptídicas descritas en esta memoria (a las que se hace referencia algunas veces como enlazador polipeptídico, secuencia espaciadora, enlazador peptídico o términos análogos) se seleccionan para maximizar las interacciones de fijación entre una molécula de fijación poliespecífica particular y su diana o dianas de fijación. Por ejemplo, una secuencia enlazadora peptídica adecuada para el sc-TCR se selecciona con preferencia de tal manera que el sc-TCR forme un sitio de fijación específica que se asemeja al de una cadena TCR V-\alpha y V-\beta existente naturalmente. Se seleccionan también secuencias enlazadoras peptídicas adicionales tales como las utilizadas para producción de moléculas sc-Ab, a fin de optimizar la fijación a antígenos específicos. En los constructos monocatenarios, se seleccionan típicamente secuencias enlazadoras peptídicas que fusionan el sc-TCR al sc-Ab que maximizan la interacción entre el sc-TCR, el sc-Ab, y dianas respectivas de dichas unidades de fijación.

Más particularmente, la secuencia enlazadora peptídica que separa las cadenas V\alpha,\beta del sc-TCR posiciona de modo preferentemente flexible las cadenas V en una bolsa que es capaz de fijar específicamente el ligando. Ligandos preferidos en este ejemplo son antígenos, y especialmente ligandos peptídicos presentados en el contexto de un MHC. Como se explicará con mayor detalle más adelante, en la exposición que sigue puede utilizarse la fijación de ligando al sc-TCR a fin de modular la actividad de las células T como se determina por ensayos específicos descritos más adelante. Ilustrativos de tales ensayos incluyen ensayos in vitro que implican pasos secuenciales de cultivo de células T que expresan un TCR, puesta en contacto de las células T con la proteína sc-TCR (o el sc-TCR obtenido de la misma) en condiciones que permiten la fijación entre el TCR y el ligando, y evaluación posterior de si la proteína de fusión soluble es capaz de modular la actividad de las células T.

En una realización más específica, la secuencia enlazadora polipeptídica comprende desde aproximadamente 7 a 25 aminoácidos, de modo más preferible desde aproximadamente 10 a 20 aminoácidos, de modo todavía más preferible aproximadamente 12 a 20 aminoácidos. La secuencia enlazadora está dispuesta típicamente de modo flexible en la proteína de fusión a fin de posicionar las cadenas V-\alpha y V-\beta en una configuración que proporciona la fijación específica de un ligando deseado tal como un antígeno peptídico. El enlazador comprende con preferencia de modo predominante aminoácidos con pequeñas cadenas laterales, tales como glicina, alanina y serina, a fin de proporcionar la flexibilidad óptima. De modo preferible, aproximadamente 80 ó 90% o más de la secuencia enlazadora comprende residuos glicina, alanina o serina, particularmente residuos glicina y serina. Con preferencia, la secuencia enlazadora no contiene residuos prolina, que podrían inhibir la flexibilidad. La secuencia enlazadora está convenientemente unida al término C de la cadena V-\alpha y al término N de la cadena V-\beta de una proteína de fusión. Véanse los Ejemplos 1-3 y 5 más adelante para la exposición relacionada con la producción y utilización de secuencias enlazadoras peptídicas específicas.

Más específicamente, las secuencias enlazadoras peptídicas adecuadas de acuerdo con la invención incluyen desde aproximadamente secuencias de 5 a 25 aminoácidos tales como la secuencia (GGGGS)_{4} (es decir, Gly Gly Gly Gly Ser)_{4} (SEQ ID NO: 1).

Con preferencia, una secuencia enlazadora peptídica seleccionada está enlazada covalentemente entre el residuo C-terminal de la cadena V-\alpha, y el primer aminoácido de la cadena V-\beta del sc-TCR. Se han descrito varias secuencias enlazadoras polipeptídicas como aceptables para uso en la unión de regiones variables de anticuerpos (véase M. Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97-105 (1991)). Muchas de dichas secuencias enlazadoras peptídicas comunicadas pueden utilizarse para producir el sc-TCR.

Alternativamente, pueden identificarse con facilidad empíricamente otras secuencias enlazadoras adecuadas. Por ejemplo, un vector de DNA que incluye un segmento de DNA que codifica una proteína de fusión que incluye la secuencia enlazadora puede clonarse y expresarse, y ensayarse la molécula de fusión para determinar si la molécula es capaz de fijar un antígeno. Un ensayo ilustrativo es un ensayo convencional de fijación de antígeno tal como los descritos en Harlow y Lane, supra. Alternativamente, la proteína de fusión expresada que comprende la secuencia enlazadora puede ensayarse en cuanto a capacidad para modular la actividad de una célula T como se determina por ensayos descritos en esta memoria. Secuencias de tamaño adecuado y secuencias de enlazadores pueden determinarse también por técnicas convencionales de modelización por ordenador basadas en el tamaño y la forma predichos de la proteína de fusión. Secuencias enlazadoras peptídicas ilustrativas son aquéllas que incluyen sitios de restricción adecuados (v.g. XhoI y SpeI) en los extremos de la secuencia enlazadora polipeptídica entre las cadenas V-\alpha y V-\beta.

Aunque la exposición que antecede se ha enfocado en la selección de secuencias enlazadoras peptídicas sc-TCR, se comprenderá que pueden utilizarse consideraciones similares para seleccionar otras secuencias enlazadoras peptídicas útiles para producir las moléculas de fijación poliespecíficas de esta invención. Secuencias enlazadoras peptídicas adicionales incluyen aquéllas que se utilizan para producir ciertos dominios de fijación de anticuerpos y particularmente las secuencias enlazadoras sc-Ab, así como secuencias enlazadoras peptídicas utilizadas para unir el sc-Ab al sc-TCR en constructos monocatenarios.

En particular, los enlazadores peptídicos preferidos para producir moléculas sc-Ab y especialmente moléculas sc-Fv tienen usualmente estructura helicoidal. En general, tales secuencias enlazadoras peptídicas facilitan el plegamiento apropiado de la sc-Fv y pueden mejorar la solubilidad de la sc-Fv y la proteína de fijación poliespecífica. Secuencias enlazadoras peptídicas más preferidas incluyen desde aproximadamente 5 a 25 aminoácidos y con preferencia entre aproximadamente 10 y 25 aminoácidos. Una descripción más específica o relativa a secuencias enlazadoras peptídicas sc-Fv adecuadas puede encontrarse en la patente U.S. No. 5637481 concedida a Ledbetter et al., cuya descripción se incorpora por referencia.

Secuencias enlazadoras peptídicas sc-Fv más preferidas incluyen las secuencias peptídicas siguientes: (G_{4}S)_{3} (es decir Gly Gly Gly Gly Ser)_{3} (SEQ ID NO. 2) y (G_{4}SG_{4}APG_{4}S) (es decir Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser) (SEQ ID NO. 3). Véanse las Figuras 1A-B y los Ejemplos 4 y 5 más adelante.

Secuencias enlazadoras peptídicas preferidas para unir el sc-TCR al sc-Fv incluyen [sic] pueden ser las mismas o ser estrechamente afines a las secuencias enlazadoras peptídicas utilizadas para producir el sc-TCR. Son más preferidas secuencias enlazadoras peptídicas que tienen las secuencias siguientes: (G_{4}S)_{4} SEQ ID NO. 1) y VNAKTTAPSVYPLEPVSGSSGSG (SEQ ID NO. 4). Véanse también la Figura 6 y el Ejemplo 7 más adelante.

El sc-TCR de las presentes moléculas de fijación puede prepararse como se ha expuesto anteriormente, así como en los ejemplos que siguen. Generalmente, DNA codificante de una cadena V-\alpha o V-\beta deseada puede obtenerse a partir de una fuente adecuada tal como una célula T, línea de hibridoma de células T, o secuencias de cadenas V-\alpha y V-\beta disponibles públicamente como se ha descrito arriba. El DNA puede amplificarse por PCR, clonación u otros medios adecuados, por ejemplo, DNA codificante en una cadena V-\alpha deseada puede clonarse en un vector adecuado, seguido por clonación del DNA codificante de una cadena V-\beta deseada y una secuencia enlazadora monocatenaria adecuada para producir un sc-TCR deseado. Como se ha descrito previamente, en algunos casos el sc-TCR incluirá un DNA que codifica un fragmento de cadena C-\alpha y/o C-\beta. En algunos casos puede ser útil fusionar ulteriormente una cadena o fragmento Ig-C_{L} al sc-TCR v.g., la cadena C\kappa murina o humana o fragmento de cadena C\kappa adecuado. Como se ha indicado con anterioridad, el DNA codificante de la cadena C\kappa puede amplificarse por PCR y ligarse a DNA codificante del sc-TCR. Alternativamente, la cadena C\kappa puede incluirse en un vector de DNA tal como los descritos por Near, et al., infra. El segmento de DNA que codifica la proteína de fusión se introduce luego en el vector de DNA. El vector de DNA se expresa después en una célula hospedadora y la proteína de fusión se recoge y se purifica en caso deseado.

sc-TCRs ilustrativos son codificados generalmente con un segmento de DNA que incluye, enlazados covalentemente en secuencia: promotor/secuencia conductora/cadena V-\alpha/secuencia enlazadora monocatenaria/cadena V-\beta; promotor/secuencia conductora/cadena V-\alpha/secuencia enlazadora monocatenaria/cadena V-\beta, fragmento de cadena C-\beta; promotor/secuencia conductora/cadena V-\alpha, cadena C-\alpha/secuencia enlazadora monocatenaria/cadena V-\beta/cadena C\kappa; o promotor/secuencia conductora/cadena V-\alpha, fragmento de cadena C-\alpha/secuencia enlazadora monocatenaria/cadena V-\beta, fragmento de cadena C-\beta. Moléculas sc-TCR adicionales son como se ha descrito arriba excepto que una cadena C\kappa está fusionada al segmento de DNA. Los vectores de DNA que codifican las proteínas sc-TCR se introducen en células deseadas, con inclusión de los sistemas de expresión específicos descritos en esta memoria, para expresión soluble de la proteína de fusión.

Como se ha expuesto, las regiones variables monocatenarias de las presentes moléculas de fijación pueden derivarse de prácticamente cualquier TCR o región variable de inmunoglobulina adecuado(a). Con respecto a la porción TCR de las presentes moléculas de fijación, cadenas V\alpha,\beta adecuadas serán aquéllas para las cuales se produce un aumento en la expresión génica después de inducción inmunológica. Métodos para ensayar un aumento en la expresión de las cadenas TCR V son conocidos (véase v.g., Hafler, D.A. et al. J. Exp. Med. 167:1313 (1988); y Mantgazza R., et al. Autoimmunity 3, 431 (1990)).

\newpage

Moléculas sc-TCR específicas incluyen adicionalmente aquellas moléculas capaces de fijación conocidas o TAAs todavía no descubiertas. TAAs ilustrativas incluyen p53 y Her-2 Neu.

Como se ha expuesto también, las presentes moléculas de fijación poliespecíficas incluyen adicionalmente un dominio de fijación de anticuerpo tal como un sc-Ab y particularmente una sc-Fv o fragmento funcional del mismo. Como se ha expuesto también, se han descrito métodos de producción y utilización de diversas moléculas sc-Fv. Véase v.g., la patente U.S. No. 5637481; Jost, C.R. et al., supra, y Lindhofer, H. et al., (1996), supra.

Moléculas sc-Ab más particulares incluyen generalmente cadenas de inmunoglobulina que son capaces de fijar específicamente antígeno. Las cadenas de inmunoglobulina pueden incluir cadenas de inmunoglobulina de longitud total, v.g., una cadena V_{L} y V_{H} de longitud total; o pueden incluir un fragmento funcional de una o ambas cadenas de inmunoglobulina de longitud total. La expresión "fragmento funcional" tal como se utiliza con respecto a un sc-Ab significa una porción de la cadena de inmunoglobulina de longitud total que constituye dicho sc-Ab que es capaz de fijar de modo específico al menos aproximadamente 70% y con preferencia al menos aproximadamente 80%, 90%, o 95% hasta aproximadamente 100% de un antígeno específico cuando se compara con la cadena de inmunoglobulina de longitud total. La fijación específica puede cuantificarse por una diversidad de técnicas tales como una transferencia Western u otro ensayo de fijación de anticuerpos adecuado como se describe más adelante.

Ejemplos más específicos de un dominio de fijación de anticuerpo de acuerdo con la invención incluyen, pero sin carácter limitante, (1) una región variable simple de un anticuerpo (V_{L} o V_{H}); (2) dos o más regiones variables monocatenarias (v.g. V_{L}+V_{H}; V_{L}+V_{L}, o V_{H}+V_{H}) o la región determinante complementaria (CDR) de las mismas. Cada fragmento de región variable (V_{L} o V_{H}) es codificado con preferencia por secuencias V_{L}+J_{L} o V_{H}+D_{H}+J_{H} y está compuesto por aproximadamente 100 aminoácidos. Dentro de estas secuencias existen tres regiones de hipervariabilidad denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que parecen contener los aminoácidos que alinean el sitio de combinación del anticuerpo. Las CDRs están inteercaladas en cuatro regiones de menor variabilidad denominadas regiones de entramado (FR).

En una realización, el dominio de fijación de anticuerpo de una molécula de fijación poliespecífica puede estar formado por la asociación de polipéptidos V_{L} y V_{H} en una conformación de hoja \beta plegada, con las regiones CDR contenidas en o cerca de los bucles entre cadenas. Ocasionalmente, los pares V_{L}+V_{L}, o los pares V_{H}+V_{H} o la V_{L} o V_{H} solas pueden fijar el antígeno.

En una realización más preferida, el dominio de fijación de anticuerpo es un sc-Ab y particularmente una sc-Fv que incluye al menos uno y con preferencia uno de los siguientes: (1) una cadena V_{L} y una cadena V_{H}; (2) una cadena V_{L} y una cadena V_{L}; (3) una cadena V_{H} y una cadena V_{H}; (4) una sola cadena V_{L}; o (5) una sola cadena V_{H}. El dominio de fijación puede incluir cadenas de inmunoglobulina de cualquier isotipo adecuado, v.g., IgG o IgM.

En realizaciones en las cuales la región de fijación poliespecífica incluye un dominio de fijación de anticuerpos que existe como dos regiones variables enlazadas como una sola cadena proteínica tal como una sc-Fv (v.g., V_{L}+V_{H}; V_{L}+V_{L}; V_{H}+V_{H}), la proteína monocatenaria incluirá con preferencia una secuencia enlazadora polipeptídica que enlaza los dos dominios variables uno a otro. Se conocen una diversidad de enlazadores peptídicos que son adecuados para la producción de constructos sc-Fv. Véase v.g., Huston, J.S. (1988) PNAS (USA) 85:5879; y Pluckthorn, A. (1992) Immunological Rev. 103:151. Un enlazador específicamente preferido tiene la fórmula general siguiente (Gly4Ser)_{n} en la cual n es desde aproximadamente 2 a 5 y con preferencia aproximadamente 3.

Se han descrito una diversidad de cadenas de inmunoglobulina V_{L} y V_{H} a los niveles de ácido nucleico y de proteínas. Véase, v.g. Davis en Fundamental Immunology, (1993), supra; Kabat E.A., supra; U.S. Pat. No. 5637481; Jost, C.R. et al. supra, y Lindhofer, H. et al. (1996) y el Banco de Datos de Proteínas Brookhaven (Brookhaven Protein Data Base, Chemistry Dept. Brookhaven National Laboratory, Upton, N.Y. (1973).

Como se ha mencionado anteriormente, se han consignado una diversidad de constructos sc-Fv. Los constructos pueden utilizarse de acuerdo con la invención para producir un amplio espectro de proteínas de fijación poliespecíficas. Véase generalmente, Pastan, I. y Fitzgerald D., (1991) Science 254:1173; Webber, et al., Molecular Immunol. (1995), 32:249; y las solicitudes de patente PCT publicadas núms. WO 96/05228 y WO 97/28191 para exposición relativa a la producción y utilización de anticuerpos monocatenarios.

Moléculas sc-Fv más específicas son aquéllas que son capaces de fijar específicamente dianas de la superficie celular tales como glicoproteínas y lipoproteínas. Ejemplos de glicoproteínas particulares incluyen, pero sin carácter limitante, CD3/TcR y CD28. Véase Gilliland L.K., et al., (1996) Tissue Antigens 47:1 para descripción relativa a la generación y caracterización de moléculas sc-Fv que fijan estas moléculas y otras moléculas de la superficie. Constructos sc-Fv específicos adicionales han sido descritos en Colcher, D. et al. (1990) J. Nat. Cancer Inst. 82:1191; y Yokota, T. et al. (1992) Cancer Res. 52:3402).

Información de secuencias adicional relativa a cadenas sc-TCR y sc-Ab específicas está disponible del National Center for Biotechnology Information (NCBI)-Genetic Sequence Data Bank (Genbank) en la National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD 20894. Genbank está disponible también en Internet en el sitio http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Véase Benson, D.A. et al. (1997) Nucl. Acids. Res. 25:1 para una descripción de Genbank.

La cadena Ig-C_{L} de una proteína de fijación poliespecífica de esta invención es una región de cadena ligera de inmunoglobulina de tipo \kappa o \lambda. Algunas veces se hará referencia en esta memoria a la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina tipo \kappa como "cadena C\kappa", mientras que se hará referencia a menudo a la región constante de la cadena ligera de inmunoglobulina de tipo \lambda como "cadena C_{\lambda}". Por ejemplo, la cadena Ig-C_{L} puede ser una cadena C\kappa o un fragmento adecuado de la misma tal como los descritos más adelante. Adicionalmente, una cadena Ig-C_{H} de la proteína de fijación poliespecífica puede ser de tipo \mu, \delta, \gamma, \alpha, o \varepsilon en caso deseado. Con preferencia, las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina son conocidas.

Como se ha indicado, las presentes moléculas de fijación poliespecíficas son totalmente funcionales y solubles. Por la expresión "totalmente funcional" o expresiones similares se da a entender que las moléculas de fijación pueden fijar específicamente otras moléculas a las cuales se desea fijación. Más específicamente, una molécula de fijación de esta invención es totalmente funcional si la parte sc-TCR de la molécula puede fijar específicamente un pMHC o pHLA (o una porción del mismo). El término significa también que la parte sc-Fv de la molécula de fijación puede fijar específicamente un antígeno o porción del mismo. Ensayos para detectar la fijación específica entre una molécula de fijación poliespecífica de interés y el pMHC (pHLA) o el antígeno incluyen transferencias Western y otros ensayos estándar tales como los descritos más adelante.

Por la expresión, "fijación específica" o una expresión similar se da a entender una molécula descrita en esta memoria que fija otra molécula, formando con ello un par de fijación específica. Sin embargo, la molécula no reconoce o se fija a otras moléculas tal como se determina , v.g., por transferencia Western ELISA, RIA, ensayo de desplazamiento de movilidad, inmunoensayo enzimático, ensayos competitivos, ensayos de saturación u otros ensayos de fijación de proteínas conocidos en la técnica. Véase generalmente, Ausubel, et al. infra; Sambrook, et al, infra; Harlow y Lane, supra y las referencias citadas en dichos lugares para ejemplos de métodos de detección de fijación específica entre moléculas.

Por la expresión "totalmente soluble" o expresión similar se entiende que la proteína de fusión no se sedimenta fácilmente bajo centrifugación a fuerza G baja a partir de un tampón acuoso v.g., medios celulares. Adicionalmente, una molécula específica de fijación poliespecífica de esta invención es soluble si puede mantenerse en solución acuosa a una temperatura superior a aproximadamente 5-37ºC y a pH neutro o próximo a la neutralidad en presencia de una concentración baja o nula de un detergente aniónico o no iónico. En estas condiciones, una proteína soluble tendrá a menudo un valor de sedimentación bajo v.g., menor que aproximadamente 10 a 50 unidades svedberg. Las soluciones acuosas citadas en esta memoria tienen típicamente un compuesto tampón para estabilizar el pH, típicamente dentro de un intervalo de pH de aproximadamente 5-9, y un intervalo de concentración iónica comprendido entre aproximadamente 2 mM y 500 mM. En ocasiones se añade un inhibidor de proteasas o detergente no iónico suave y puede añadirse una proteína portadora si se desea, tal como seroalbúmina bovina (BSA) hasta unos cuantos mg/ml. Tampones acuosos ilustrativos incluyen solución salina estándar tamponada con fosfato, solución salina tamponada con Tris, u otros tampones y formulaciones de medios celulares conocidos.

Convencionalmente, existen varios medios para enlazar las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria, con inclusión de métodos celulares, genéticos, químicos y bioquímicos. Como se apreciará, ciertas moléculas de fijación poliespecíficas de esta invención pueden unirse (reticularse) por reticulación química; reticulación natural por enlaces disulfuro; asociación natural sin enlaces disulfuro; y conexión con un enlazador peptídico codificado genéticamente (Bird, R.E. et al. (1988) Science 242; Huston et al., supra). Por ejemplo, el acoplamiento entre moléculas de fijación poliespecíficas deseadas incluirá reacciones estándar de acoplamiento de proteínas tales como las descritas generalmente en Means, G.E. y Feeney, R.E. (1974) en Chemical Modification of Proteins, Holden-Day. Véase también S.S. Wong (1991) en Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press.

Adicionalmente, se apreciará que los complejos de fijación poliespecíficos de la invención pueden modificarse de varias maneras bien conocidas para adaptarse a los usos propuestos. Por ejemplo, los complejos pueden estabilizarse con disulfuro de acuerdo con métodos conocidos, véase v.g. la solicitud PCT publicada No. WO /29350.

Las presentes moléculas de fijación pueden producirse también empleando polímeros inertes denominados dendrímeros. En una realización más específica, un dendrímero particular, conocido como el dendrímero facial Janice, puede utilizarse para unir o acoplar entre sí porciones de las presentes moléculas de fijación. En una realización específica de esta invención, puede hacerse que la molécula sc-Fv incluya un residuo cisteína C-terminal que puede utilizarse para reticular el anticuerpo al dendrímero, particularmente por enlaces disulfuro. El sc-TCR se acoplaría luego al dendrímero por grupos amina libres. Un promotor resultante preferido es una molécula de dendrímero polifuncional estable. Véase el Ejemplo 19 más adelante.

Como se ha expuesto anteriormente, la presente invención se caracteriza por una proteína de fijación poliespecífica multicatenaria que comprende al menos un sc-TCR y un dominio de fijación de anticuerpo. En una realización, la proteína de fijación se representa por la fórmula general siguiente:

1

en donde,

a) A representa un dominio de fijación de anticuerpo o fragmento funcional del mismo,

b) B1, B2 son cada uno independientemente una molécula de fijación igual o diferente,

c) C1, C2 son cada uno independientemente -H o un marcador proteínico; y

d) D representa al menos una molécuel sc-TCR o fragmento funcional de la misma.

Con respecto a la fórmula arriba indicada, una línea simple representa un enlace covalente (v.g., un enlace peptídico), mientras que una línea doble representa uno o más enlaces covalentes, v.g., un enlace disulfuro tal como los que enlazan cadenas pesadas de inmunoglobulina; o la línea doble representa enlaces de hidrógeno. Los corchetes indican flexibilidad en la disposición secuencial de las moléculas comprendidas entre ellos (es decir, subunidades). Así, el orden de las subunidades no es importante con tal que cada subunidad realice la función a la que está destinada.

En la fórmula arriba indicada, las subunidades A, B1, B2, C1, C2 y D representan cada una independientemente con preferencia una molécula o una pluralidad de moléculas. En los casos en que A o D representa una pluralidad de moléculas, cada molécula estará unida con preferencia al mismo tipo de molécula (v.g., sc-TCR fusionado a otro sc-TCR, sc-Fv fusionado a otro sc-Fv). Con preferencia, cada molécula de la pluralidad está separada de otra por una secuencia enlazadora peptídica adecuada. El número de moléculas enlazadas variará dependiendo del uso propuesto, pero por regla general estará comprendido entre aproximadamente 2 y 10, con preferencia entre aproximadamente 2 y 5, de modo más preferible 2 de tales moléculas, y de modo muy preferible 1 sola molécula. Cada una de las subunidades arriba descritas puede estar fusionada directamente a otra subunidad o puede estar separada de ella por un enlazador peptídico adecuado, v.g., para aumentar la flexibilidad o afinidad de fijación.

En una realización particular de que la molécula de fijación poliespecífica multicatenaria arriba representada, A representa una molécula F(v) o sc-Fv; D representa una molécuel sc-TCR, y cada uno de C1 y C2 es -H.

Pueden utilizarse una diversidad de moléculas de fijación de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, en una realización, cada uno de B1, B2 en la fórmula anterior puede representar una cadena de inmunoglobulina o un fragmento adecuado de la misma capaz de formar un complejo de fijación específico como se determina, v.g., por RIA, transferencia Western u otro ensayo de fijación adecuado. En una realización más particular, cada uno de B1 y B2 se deriva totalmente o en parte de una cadena pesada de inmunoglobulina. En esta realización, las moléculas de fijación pueden ser iguales o de clase diferente (clase IgG, IgA, IgM, IgD o IgE) con tal que las moléculas sean capaces de formar un par de fijación específico. Adicionalmente, moléculas de unión constituidas por cadenas pesadas de inmunoglobulina quiméricas están dentro del alcance de la presente invención. Moléculas de unión preferidas incluyen cadena pesada de inmunoglobulina de longitud total (Ig-C_{H}) o fragmentos de la misma tales como C_{H}^{1}; C_{H}^{1}-C_{H}^{2}; C_{H}^{1}-C_{H}^{3} y C_{H}^{1}-C_{H}^{2}-CH_{H}^{3}. Fragmentos adicionalmente preferidos son capaces de formar al menos un enlace disulfuro con otra cadena o fragmento de inmunoglobulina adecuada(o). Un par especialmente preferido de moléculas de fijación es un par de cadenas pesadas de inmunoglobulina que tiene un isotipo IgG.

En otra realización, cada uno de B1 y B2 es una cadena ligera de inmunoglobulina igual o diferente con tal que las cadenas ligeras sean capaces de formar un par de fijación específica como se determina por RIA, inmunotransferencia Western u otro ensayo de fijación adecuado. Las moléculas de fijación de cadena ligera de inmunoglobulina adecuadas pueden ser de longitud total o fragmentos de las mismas y pueden ser de tipo \kappa o \lambda. Como se apreciará, un fragmento adecuado de una molécula de fijación será uno que es capaz de formar un par de fijación específica como se determina por los ensayos descritos en esta memoria.

Adicionalmente, una molécula de fijación de inmunoglobulina de acuerdo con la invención puede ser de origen animal (v.g., un roedor tal como un ratón o una rata), o humano, o puede ser quimérica o humanizada (véase v.g., Morrison et al., PNAS 81, 6851 (1984); Jones et al., Nature 321, 522 81986)). Moléculas de unión ilustrativas incluyen aquéllas que son susceptibles de ser fijadas específicamente por anticuerpos anti-idiotipo tales como los descritos más adelante, así como anticuerpos anti-idiotipo disponibles comercialmente. Véase v.g., Linscott's Directory (40 Glen Drive, Mill Valley, California 94941), y por la American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md 20852.

Ejemplos más específicos de proteínas de fijación poliespecífica multicatenarias se representan en la Figura 7A. En dicha figura, la proteína de fijación incluye un sc-TCR enlazado a una primera cadena de inmunoglobulina (Ig-C_{H}). La primera Ig-C_{H} está enlazada a una segunda Ig-C_{H} para formar un par de fijación específica. La segunda Ig-C_{H} es del mismo isotipo (IgG) que primera cadena pesada de inmunoglobulina y está enlazada adicionalmente a un F(v) producido por una célula de hibridota. El sc-TCR está enlazado ulteriormente a una cadena ligera de inmunoglobulina producida por la célula de hibridoma. Complejos de fijación poliespecífica multicatenarios adicionales (a los que se hace referencia a veces como moléculas o anticuerpos "biespecíficos quiméricos") pueden producirse por utilización de otras células de hibridoma u otras moléculas sc-TCR/Ig.

Como se ha mencionado anteriormente, la presente invención se caracteriza también por proteínas de fijación poliespecíficas que incluyen moléculas de fijación distintas de inmunoglobulinas. Por ejemplo, cada uno de B1 y B2 en la fórmula arriba indicada puede ser un polipéptido que incluye (o está constituido por) un motivo de fijación proteína-proteína tal como, v.g., un motivo hélice-vuelta-hélice o motivo de cremallera de leucina. Muchos ejemplos de estos motivos de fijación han sido descritos y se conocen en este campo. Véase v.g. Horberg, et al., (1993) Science 262:1401; Kamtekar, et al., (1993) Science 262:1680; Harris, et al., J. Mol. Biol. (1996) 236:1356.

Más específicamente, cada uno de B1 y B2 puede ser un polipéptido que está constituido por un motivo de fijación proteína-proteína que es capaz de formar un par de fijación específico. Por ejemplo, cada uno de B1 y B2 puede ser un motivo de fijación proteína-proteína de un factor de transcripción tal como fos o jun. Ejemplos más específicos de motivos de fijación proteína-proteína incluyen birA (LXLIFEAQKIEWR; SEQ ID NO. 5), avidina (ARKCSLTGKWTNDLGSNMT; SEQ ID NO. 6), EE (EEEEYMPME; SEQ ID NO. 7), 6XHIS (GMAHHHHHH; SEQ ID NO. 8), fos/jun, y (TPPPEPET; SEQ ID NO. 9), ver Rhind, S.K. (1992) U.S. Pat. No. 5,354,554; Altman, J.D. (1996) Science, 274:94; Shatz, P. (1993) Biotechnology, 11:1138; véanse también los Ejemplos 1-3 más adelante.

Como se ha expuesto, la presente invención proporcionar polinucleótidos que codifican proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias (o porciones de las mismas). En una realización, la proteína de fijación poliespecífica está codificada por un polinucleótido que puede ser RNA, DNA, o una quimera de los mismos. Típicamente, el polinucleótido incluirá o estará constituido por una secuencia (segmento) de DNA que codifica la proteína de fijación.

Por ejemplo, un polinucleótido de acuerdo con la invención incluye típicamente una secuencia conductora enlazada operativamente para proporcionar señales de procesamiento de células apropiadas. La secuencia conductora puede estar fusionada al extremo 5' de la secuencia de DNA que codifica la molécuel sc-TCR. En particular, el conductor puede estar enlazado covalentemente al extremo 5' de la secuencia de DNA que codifica la cadena V-\alpha, o en algunas realizaciones, la cadena V-\beta del sc-TCR. En otras realizaciones, el conductor estará fusionado al sc-Ab y particularmente al sc-Fv. En una realización más específica, la secuencia conductora puede estar fusionada a la cadena V_{H} o la cadena V_{L} de la sc-Fv. Se reconocerá sin embargo que aunque una secuencia conductora específica esté enlazada a una secuencia sc-TCR o sc-Fv particular, la secuencia conductora puede intercambiarse a menudo utilizando técnicas recombinantes sin un efecto perjudicial sobre el procesamiento de la proteína de fusión. Así, en una realización, el extremo 5' de la cadena V-\alpha está enlazado covalentemente al extremo 3' de una secuencia conductora adecuada.

Una diversidad de secuencias conductoras específicas pueden utilizarse con los polinucleótidos. En una realización, la secuencia conductora tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 12 y 26 residuos de aminoácido. En una realización específica, una secuencia de DNA diseñada para inserción en un vector de expresión bacteriano puede incluir una secuencia conductora Pel B. Alternativamente, segmentos de DNA para inserción en vectores de expresión de mamífero pueden incluir un conductor Ig-C_{L} tal como una secuencia conductora C\kappa de mamífero. Un conductor C\kappa ilustrativo se proporciona más adelante.

Adicionalmente, se proporcionan polinucleótidos que codifican al menos una porción de una proteína de fijación poliespecífica y particularmente ciertas proteínas de fijación poliespecífica multicatenarias representadas en la fórmula mostrada anteriormente. En una realización más particular, la porción es suficiente para codificar al menos las subunidades A-B1 o D-B2. Véanse los Ejemplos 8, 9 y 12 más adelante.

Polinucleótidos adicionales de acuerdo con la invención incluyen una secuencia de DNA que codifica una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de esta invención. Más específicamente, el polinucleótido incluirá usualmente un promotor, una señal de iniciación de la traducción, y una secuencia conductora enlazados operativamente a la secuencia. Para expresión óptima en hospedadores bacterianos, el promotor es con preferencia phoA y el conductor es pelB de E. coli. En caso deseado, la secuencia de DNA puede comprender adicionalmente un sitio de fijación de ribosoma de una secuencia de gen 10. Para expresión óptima en hospedadores eucariotas, el promotor es con preferencia un promotor de citomegalovirus (CMV) enlazado operativamente a un elemento intensificador de CMV, y el conductor es un conductor de cadena kappa de ratón. Por la expresión "enlazado operativamente" se entiende una secuencia genética enlazada operativamente (es decir, funcionalmente) a un polinucleótido, o secuencias situadas aguas arriba (5') o aguas abajo (3') de un segmento o secuencia dado(a).

Polinucleótidos adicionales de acuerdo con la invención codifican al menos un sc-TCR o al menos una sc-Fv, fusionado cada uno independientemente a una secuencia de DNA que codifica una proteína de la cubierta de bacteriófago adecuada. Con preferencia, la proteína de la cubierta de bacteriófago es una proteína del gen VIII o del gen III. Métodos para producir y utilizar los polinucleótidos han sido descritos. Véase también la patente U.S. No. 5759817 para una exposición relativa a la construcción y utilización de proteínas de fusión de bacteriófago.

Polinucleótidos más específicos de esta invención incluyen una secuencia de DNA que codifica un sc-TCR que incluye una cadena V-\alpha enlazada covalentemente por una secuencia enlazadora peptídica adecuada al término N de una cadena V-\beta. Con preferencia, la secuencia de DNA codifica adicionalmente un dominio de fijación de anticuerpo y particularmente una sc-Fv como se ha expuesto anteriormente, separado del sc-TCR por una secuencia enlazadora peptídica adecuada.

Polinucleótidos que codifican las presentes proteínas de fijación poliespecíficas pueden obtenerse de una diversidad de fuentes que incluyen amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de secuencias de DNA disponibles públicamente. En una realización, el polinucleótido se proporciona en un vector de DNA capaz de expresar la molécula en un sistema de expresión de células eucariotas o procariotas adecuado. Como se ha expuesto, los polinucleótidos de esta invención pueden incluir elementos de transcripción enlazados operativamente tales como un promotor, secuencias conductora e intensificadora óptima para impulsar la expresión de la proteína de fusión sc-TCR soluble en un sistema de expresión celular deseado. Alternativamente, el vector de DNA puede seleccionarse para proporcionar algunos o la totalidad de los elementos de control.

El término "vector" como se utiliza en esta memoria significa una secuencia de ácido nucleico capaz de incorporarse y replicarse en una célula hospedadora dando como resultado típicamente la expresión de un segmento de ácido nucleico de interés, v.g., un polinucleótido que codifica una molécula de fijación poliespecífica como se describe en esta memoria. Los vectores pueden incluir v.g., segmentos o secuencias de ácido nucleico lineales, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levadura (YACs), fagémidos y DNA extra-cromosómico. Específicamente, el vector puede ser DNA recombinante. Tal como se utiliza también en esta memoria, debe entenderse que el término "expresión" o "expresión génica" se refiere a la producción del producto proteínico de la secuencia de ácido nucleico de interés, con inclusión de la transcripción del DNA y la traducción de la transcripción del RNA. Típicamente, un segmento de DNA que codifica una proteína de fusión sc-TCR de la invención se inserta en el vector, con preferencia un vector de DNA, para replicar el segmento de DNA en una célula hospedadora adecuada.

Vectores de DNA más particulares de acuerdo con la invención incluirán elementos de control que se seleccionan para optimizar la expresión en un hospedador para el cual está destinado. Por ejemplo, un vector de DNA para uso en un hospedador bacteriano puede incluir un promotor tal como el promotor del operón trp, el promotor lac, el promotor trp-lac, o el promotor lac^{uvs} o phoA. Promotores ilustrativos son aquéllos tales como phoA que proporcionan una expresión fuerte y regulada en condiciones de inducción lenta que tienen una duración aproximada de varias horas (v.g., 2 a 10 horas). En condiciones adecuadas de cultivo, la mayoría de los promotores fuertes son capaces de proporcionar proteína de fusión soluble a niveles de hasta aproximadamente 10% de la proteína de la célula hospedadora total y superiores.

En algunas realizaciones de la invención, un polinucleótido que codifica una proteína de fijación poliespecífica de interés se modificará recombinantemente por ingeniería genética en un vector de DNA apropiado. Por ejemplo, en realizaciones en las que el TCR o la cadena de inmunoglobulina deseado(a) se amplifica por PCR, los iniciadores oligonucleotídicos están configurados usualmente con sitios de restricción adecuados en ambos extremos de los iniciadores de tal manera que el polinucleótido pueda reemplazarse con otro DNA deseado. Así, un vector de DNA adecuado de la invención es uno en el cual la molécula de fijación deseada puede insertarse fácilmente en el vector. Algunas veces, como en el caso en que se desea un sc-TCR/IgG u otra fusión entre el sc-TCR o la cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento de la misma, la cadena o fragmento de cadena Ig-C_{L} estará codificada(o) por el vector y estará fusionada(o) al segmento de DNA por ligación. En otros casos, la cadena o el fragmento Ig-C_{L} estará fusionada al segmento de DNA antes de la ligación al vector.

En general, la preparación de las proteínas de las presentes proteínas de fijación poliespecíficas puede realizarse por procedimientos específicos descritos en esta memoria y por técnicas reconocidas de DNA recombinante. Por ejemplo, la preparación de DNA plasmídico, escisión de DNA con enzimas de restricción, ligación del DNA, introducción de DNA en una célula, cultivo de la célula, y aislamiento y purificación de la proteína expresada son técnicas conocidas. Véase generalmente Sambrook et al., en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989); y Ausubel et al., (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York.

Pueden emplease estrategias más particulares para expresar las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria. Por ejemplo, en un enfoque, un polinucleótido que codifica una proteína de fijación poliespecífica de interés puede incorporarse en un vector de DNA por medios conocidos, por ejemplo por el uso de enzimas que cortan el vector en sitios predeterminados, seguido por ligación del DNA en el vector. El vector que contiene la secuencia de DNA se introduce luego en un hospedador adecuado para expresión soluble de la proteína de fijación. La selección de vectores adecuados puede basarse empíricamente en factores relativos al protocolo de clonación. Por ejemplo, el vector debe ser compatible con, y tener el replicón apropiado para la célula hospedadora que se esté empleando. Adicionalmente, el vector tiene que ser capaz de acomodar la secuencia de DNA que codifica la proteína que va a expresarse. Vectores preferidos son aquéllos que son capaces de expresar las proteínas solubles en células de mamífero, v.g., pCDNA3 disponible de InVitrogen. Véase también Sambrook et al., supra y Ausubel et al., supra en cuanto a otros vectores adecuados para uso en células de mamífero. Típicamente, los vectores de DNA diseñados para expresión en bacterias y que codifican proteínas de fusión solubles no incluirán un intrón C\lambda o C\kappa de longitud total, aunque estas secuencias pueden incluirse en vectores diseñados para expresión en células de mamífero capaces de corte y empalme de RNA.

Vectores de DNA más preferidos están diseñados para expresar la proteína de fijación poliespecífica en células eucariotas, particularmente en células de mamífero. Los vectores de DNA pueden estar formateados para replicación en un hospedador bacteriano si se desea a fin de que puedan obtenerse cantidades adecuadas del vector de DNA. Por ejemplo, un vector de DNA incluirá usualmente (i) un origen de replicación (Ori) funcional en E. coli; (ii) un gen de resistencia a antibióticos seleccionables (v.g., resistencia a Amp, Tet, Neo o Kan); (iii) un promotor viral fuerte tal como el promotor de citomegalovirus (CMV) y elemento intensificador CMV opcional; (iv) una secuencia conductora Ig-C_{L}; (v) una molécuel sc-TCR de interés; (vi) un intrón Ig-C_{L} de longitud total enlazado a un exón Ig-C_{L}; (vii) una secuencia de poliadenilación de hormona del crecimiento, v.g. la secuencia poliA de la hormona del crecimiento de los bovinos (bgh), y (viii) DNA codificante de un marcador eucariota seleccionable tal como el promotor viral fuerte (v.g., el promotor del virus 40 de los simios (SV40)) enlazado al gen de resistencia a los antibióticos y fusionado a una secuencia de poliadenilación viral (v.g., la secuencia poliA de SV40). Alternativamente, el vector de DNA puede incluir la totalidad de (i)-(v), y (vii)-(viii) anteriores, sin el intrón (Ig-C_{L}) de longitud total enlazado al exón Ig-C_{L} de (vi). Una secuencia conductora Ig-C_{L} ilustrativa es el conductor kappa de ratón. Un ejemplo de un intrón y exón Ig-C_{L} de longitud total es el gen C\kappa de longitud total.

Un ejemplo de un vector de DNA específicamente preferido para expresión de las presentes proteínas de fijación poliespecíficas monocatenarias en células de mamífero es el vector pSUN27 ilustrado en la Figura 5. La construcción y utilización del vector pSUN27 ha sido descrita previamente. El vector pSUN27 ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC) en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209. El vector de DNA fue depositado en la ATCC en fecha 17 de septiembre de 1997 y le fue asignado el No. de acceso 209276. El vector pSUN27 incluye un promotor CMV, secuencia conductora de cadena ligera de murino, secuencia de consenso Kozak, y la secuencia de intrón y exón del gen C\kappa murino. Véase también Near, et al., Mol. Immunology (1990) para una exposición más específica relativa a la secuencia de cadena pesada de murino.

Se prefieren adicionalmente vectores de DNA adaptados para unir un sc-TCR deseado o un fragmento funcional a una cadena pesada de inmunoglobulina o fragmento. Por ejemplo, en una realización, el vector de DNA incluirá usualmente (i) un origen de replicación (Ori) funcional en E. coli; (ii) un gen de resistencia a antibióticos seleccionable (Amp, Tet, Neo o Kan); (iii) un promotor viral fuerte tal como el promotor CMV e intensificador CMV opcional; (iv) una cadena o fragmento V_{H}; (v) una cadena C_{H}; (vi) una secuencia de poliadenilación de hormona del crecimiento, v.g. la secuencia poliA de bgh; y (vii) un promotor viral fuerte (v.g., el promotor SV40) enlazado al gen de resistencia a los antibióticos y fusionado a una secuencia de poliadenilación viral (v.g., la secuencia poliA de SV40).

Un ejemplo de un vector de DNA específicamente preferido para unión de un sc-TCR deseado a las cadenas de inmunoglobulina es pSUN7 representado en la Figura 8.

Un vector de DNA de la invención puede modificarse de acuerdo con técnicas convencionales para optimizar la expresión en células de mamífero. Por ejemplo, el marcador eucariota que codifica el gen de resistencia a la neomicina del vector pSUN27 o pSUN7 arriba descrito puede estar reemplazado por DNA codificante del gen de timidina-quinasa (TK) para facilitar la expresión de la proteína de fusión sc-TCR en células de mamífero TK- (deficientes en TK). El vector de DNA puede modificarse de otras maneras bien conocidas en la técnica (v.g., cambio de promotores, genes de resistencia a los antibióticos, reemplazamiento del promotor CMV con un promotor obtenido de una inmunoglobulina, SV40, un promotor de adenovirus o virus de papiloma para optimizar la expresión de la proteína de fusión sc-TCR en una célula de mamífero deseada. Alternativamente, la secuencia de DNA que codifica la proteína sc-TCR puede insertarse en vectores bien conocidos adecuados para expresión en levadura o células de insecto, en caso deseado. Véase v.g. Ausubel, et al., supra y Summer y Smith, infra.

Un vector de DNA diseñado específicamente para replicación y expresión de una proteína de fijación deseada en bacterias incluye v.g. (i) un origen de replicación funcional en E. coli y derivado v.g., de pBR322, con preferencia de vectores pUC19 bien conocidos; (ii) un gen de resistencia a los antibióticos seleccionable, v.g., el gen de resistencia a ampicilina y/o neomicina; (iii) una región de terminación de la transcripción, v.g., la región de terminación del operón trp de E. coli; (iv) un promotor de transcripción (v.g., un promotor phoA, tac, tac-lac, lacZ, lac^{uvs}, T7, o T3; (v) una secuencia conductora, v.g., un conductor pelB u ompA; (vi) una secuencia de DNA codificante del sc-TCR fusionada a una sc-Fv deseado a través de una secuencia enlazadora peptídica adecuada; (vii) un terminador de la transcripción, v.g., la secuencia T1T2 del locus de RNA ribosómico de E. coli. Alternativamente, el vector puede incluir (i)-(vii), anteriores, excepto que el sc-TCR está provisto de una cadena o fragmento IG-C_{L} fusionada(o).

Células hospedadoras adecuadas pueden transformarse por una diversidad de métodos que incluyen transferencia retroviral, infección viral o por bacteriófago, transfección mediada por calcio, liposomas, o polibreno, transferencia biolística, u otros métodos de este tipo conocidos en la técnica.

Como se ha indicado previamente, en algunos casos puede ser deseable expresar la proteína de fijación poliespecífica en células que no son de mamífero. Por ejemplo, células hospedadoras adecuadas para expresar las proteínas de fusión en bacterias incluyen células capaces de transformarse fácilmente y exhibir crecimiento rápido en medio de cultivo. Células hospedadoras particularmente preferidas incluyen E. coli, Bacillus subtilis, etc. Otras células hospedadoras incluyen levaduras, v.g., S. cerevisiae y células de insecto. Células ilustrativas para expresión de células de insecto son aquéllas que son susceptibles de ser infectadas por un baculovirus tal como células SF9. Véase también, Summer y Smith (1988) A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555, College Station, Texas.

Aunque en los ejemplos que siguen se utilizaron células procedentes de mamífero, en principio, virtualmente cualquier célula eucariota es útil en la práctica de la presente invención. Ejemplos incluyen células de primate, v.g., células humanas tales como células de fibroblastos, y células de otros animales tales como células de ovino, porcino, murino, y bovino. Ejemplos específicos de células de mamífero incluyen células COS, HeLa, y CHO.

En general, se emplean condiciones de cultivo de células en las cuales se seleccionan líneas de células transformadas o transfectadas de manera estable, v.g., por incorporación de un marcador de selección de células adecuado en el vector (v.g. un gen de resistencia a antibióticos o G418). Células que expresan una proteína de fijación poliespecífica deseada de esta invención pueden determinarse por procedimientos conocidos, v.g., por ensayo ELISA utilizando anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente que se fijan específicamente a la molécula de fijación en un sitio deseado. Como ejemplos ilustrativos de tales sitios se incluye la cadena V-\alpha o V-\beta del sc-TCR o la cadena variable de un sitio de fijación de anticuerpos, v.g., la cadena V_{H} o V_{L} de la sc-Fv. Alternativamente, en realizaciones en las cuales una molécula de fijación poliespecífica incluye una cadena pesada de inmunoglobulina, v.g., una molécuel sc-TCR-IgG, puede seleccionarse un anticuerpo monoclonal que se fija específicamente a la cadena C\kappa o C\lambda (o fragmento). Ejemplos de anticuerpos monoclonales y ensayos adecuados se proporcionan en los ejemplos que siguen.

Si se incluye, una secuencia conductora en un vector de DNA dirige convenientemente la expresión de la proteína de fijación a membranas de células hospedadoras o a los medios de la célula hospedadora, y puede formatearse para incluir un sitio de restricción de tal manera que el DNA codificante, v.g., de una cadena V-\alpha de interés, puede ligarse convenientemente al constructo. Adecuadamente, el sitio de restricción se incorpora en el extremo 3' de la secuencia conductora, a la que se hace referencia algunas veces en esta memoria como una secuencia de unión, v.g. de una longitud aproximada de 2 a 10 codones, y enlazarse a la cadena V-\alpha de tal manera que la región codificante de la cadena V-\alpha es típicamente el primer aminoácido de la región codificante de V-\alpha. Alternativamente, la secuencia conductora puede enlazarse a la región codificante V_{H} o V_{L} de la cadena de sc-Fv. Por ejemplo, un sitio de restricción es el sitio Sfi I, aunque pueden incorporarse otros sitios de escisión antes de la región codificante de la cadena V-\alpha para aumentar la inserción conveniente de la cadena V-\alpha en el constructo vector. Como se ha expuesto anteriormente, el uso de un sitio de restricción de este tipo en combinación con un segundo sitio de restricción, posicionado típicamente al comienzo de la cadena V-\alpha, permite la inserción rápida y directa de secuencias codificantes de una gran diversidad de cadenas V-\alpha, o cadenas V-\alpha, C-\alpha. Secuencias conductoras preferidas contienen un sitio de iniciación de la traducción fuerte y pueden incluir a veces un sitio de protección terminal en el extremo 3' de su mRNA. Como se ha mencionado arriba, secuencias conductoras ilustrativas incluyen pelB, y OmpA para expresión en bacterias y una secuencia conductora de la cadena kappa de ratón C\kappa para expresión en mamíferos.

La presente descripción incluye también métodos para aislamiento de los polinucleótidos o vectores que codifican los mismos. En general, los métodos incluyen introducir el vector o polinucleótido en células hospedadoras deseadas, cultivar las células y purificar la molécula de fijación poliespecífica codificada (o porción de la misma) a partir de las células hospedadoras para obtener proteína sustancialmente pura. El vector o polinucleótido puede aislarse también en forma sustancialmente pura por métodos estándar. Típicamente, el vector o polinucleótido será DNA para la mayoría de las manipulaciones recombinantes.

En algunos casos, las proteínas de fijación poliespecíficas incluirán uno o más marcadores proteínicos fusionados (típicamente uno o dos). Por ejemplo, los marcadores proteínicos pueden utilizarse para ayudar a la purificación de la proteína de componentes celulares existentes naturalmente, los cuales acompañan típicamente a la proteína de fusión. En otros casos, el marcador proteínico puede utilizarse para introducir un sitio de escisión química o proteolítica predeterminado en la proteína de fusión soluble. Particularmente, se contempla la introducción de un segmento codificante de un marcador proteínico en un vector de DNA, v.g., entre la secuencia que codifica la proteína soluble de fusión y la cadena Ig-C_{L} o fragmento adecuado de tal modo que la molécuel sc-TCR puede escindirse (es decir separarse) de la cadena o fragmento Ig-C_{L} en caso deseado.

Moléculas de fijación poliespecíficas que incluyen un marcador proteínico pueden tener dicho marcador fusionado a la molécula por manipulaciones genéticas o químicas en caso necesario. En una realización, la molécula de fijación incluye un marcador proteínico fusionado al término C de la proteína. Alternativamente, el marcador proteínico puede estar fusionado al término N de la proteína de fijación. En otra realización, el marcador proteínico está fusionado entre las moléculas sc-TCR y sc-Ab de la proteína de fijación poliespecífica.

Las proteínas de fijación poliespecíficas de esta invención pueden purificarse por varias técnicas convencionales. Por ejemplo, como se ha mencionado previamente, las proteínas de fijación pueden incluir al menos un marcador proteínico (igual o diferente), con inclusión de marcadores que comprenden un sitio de escisión química o por proteasa. Particularmente, un marcador proteínico puede ser un polipéptido que lleva una carga a pH fisiológico, tal como p. ej. 6xHIS. En esta realización, puede utilizarse una matriz sintética adecuada para purificar la proteína de fusión. Más particularmente, la matriz sintética puede ser una matriz de sefarosa disponible comercialmente, tal como v.g. Ni-Sepharose u otras matrices adecuadas de este tipo capaces de fijar el marcador 6X HIS a aproximadamente pH 6-9. Otros marcadores adecuados incluyen epítopes EE o MYC, que están fijados específicamente por anticuerpos moleculares comercialmente disponibles. En general, una gran diversidad de epítopes capaces de ser fijados específicamente por un anticuerpo v.g., un anticuerpo molecular, son capaces de servir como marcador proteínico. Otras matrices sintéticas adecuadas incluyen aquéllas que están provistas de un anticuerpo fijado capaz de fijar específicamente las presentes proteínas sc-TCR. Marcadores proteínicos ilustrativos incluyen aquéllos que tienen un sitio de escisión por enteroquinasa, Factor Xa, veneno de serpiente o trombina. Véase v.g., la solicitud PCT publicada WO 96/13593. Véanse también los ejemplos 6-7 más adelante.

Una proteína de fijación poliespecífica expresada puede aislarse y purificarse por métodos conocidos que incluyen cromatografía de inmunoafinidad, inmunoabsorción, inmunoprecipitación y análogos. Es importante que los procedimientos preparativos no requerirán usualmente pasos prolongados de aislamiento para obtener rendimientos importantes de la proteína de fusión. De acuerdo con los métodos de purificación de proteínas descritos con mayor detalle más adelante, los rendimientos para la mayoría de las proteínas de fijación poliespecíficas están comprendidos en el intervalo de aproximadamente 2 a 6 mg por litro.

Como se ha expuesto, las proteínas de fijación poliespecíficas de esta invención pueden expresarse y purificarse por una combinación de estrategias. En un enfoque, una proteína de fijación poliespecíficada tal como una proteína de fusión monocatenaria se expresa en una célula adecuada. Con preferencia, la proteína de fijación se expresa en la célula o el medio celular. Un extracto celular o medio de cultivo de células hospedadoras se obtiene y se centrifuga luego. El sobrante resultante puede purificarse por cromatografía de afinidad o inmunoafinidad, v.g. cromatografía de afinidad con proteína-A o proteína-G o un protocolo de inmunoafinidad que comprende el uso de un anticuerpo que fija específicamente la proteína de fijación. Ejemplos de un anticuerpo de este tipo son anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente, que son capaces de fijar específicamente el sc-TCR, sc-Fv u otra porción de la molécula de fijación tal como el marcador proteínico o la porción de la cadena pesada de inmunoglobulina. Ejemplos más específicos de anticuerpos monoclonales adecuados son aquéllos que son capaces de fijar una cadena V-\alpha o cadena V-\beta del sc-TCR, v.g. H57, B20.1, MR5-2, y F23.1 (Pharmagen). Ejemplos específicos de tales anticuerpos son anticuerpos antiidiotípicos tales como los citados en los ejemplos que siguen.

Como se ha descrito arriba, las moléculas de fijación poliespecíficas de la presente invención se proporcionan en una forma soluble y totalmente funcional. Así, en una realización, las moléculas de fijación se secretan de manera estable en el medio de cultivo y son capaces de fijar específicamente un ligando de interés tal como un antígeno TCR o porción del mismo capaz de fijarse a la molécula de fijación. En realizaciones de la invención en las cuales está presente una molécula de fijación poliespecífica en forma monocatenaria, la molécula es con preferencia estable en condiciones fisiológicas en ausencia sustancial o completa de un agente caotrópico tal como un detergente o análogo. Así, las moléculas de fijación no incluirán usualmente regiones ricas en aminoácidos hidrófobos tales como los aminoácidos encontrados en una región transmembranal de TCR.

Las moléculas de fijación poliespecíficas proporcionadas en esta memoria pueden modificarse por métodos estándar para incluir una diversidad de marcadores proteínicos enlazados covalentemente (efectores). Por ejemplo, pueden añadirse uno o más efectores o marcadores a las moléculas de fijación para visualizar la formación de puentes entre las células fijadas y/o para reforzar el reconocimiento, el deterioro o la destrucción por las células inmunes. Sitios potenciales para adición de los efectores o marcadores incluyen el sc-TCR, sc-Fv o la porción de la cadena pesada de inmunoglobulina (en caso de estar presente). Los marcadores preferidos imparten generalmente una propiedad biológica, química o física deseada.

Ejemplos adicionales de marcadores proteínicos adecuados incluyen secuencias polipeptídicas que tienen una carga a pH fisiológico, tal como, v.g., 6xHIS. En este caso, una matriz sintética adecuada para purificar el complejo de fijación poliespecífico sería, v.g., una metalo-sefarosa disponible comercialmente tal como, v.g., Ni-sefarosa u otra matriz adecuada de este tipo capaz de fijar 6xHIS a aproximadamente pH 6-9. El epítope EE y el epítope myc son ejemplos adicionales de marcadores proteínicos adecuados, cuyos epítopes pueden ser fijados específicamente por uno o más anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente. Las moléculas efectoras pueden conjugarse a los complejos de fijación poliespecíficos por medio de un agente de reticulación de proteínas heterobifuncional tal como, v.g., SPDP, carbodiimida, o análogos. Véase Meany y Feeney, supra; y Wong, supra.

Será útil para algunas aplicaciones modificar de modo no recombinante los complejos de fijación poliespecíficos de la invención por medios no genéticos. Por ejemplo, los complejos de fijación pueden incluir una diversidad de agentes farmacéuticos además de los arriba descritos tales como fármacos, enzimas, hormonas, agentes quelantes capaces de fijar, v.g., un radionucleido, así como otras proteínas y polipéptidos útiles para diagnosis o tratamiento de enfermedades. Para propósitos de diagnóstico, la molécula de fijación poliespecífica puede estar marcada o no marcada. Por ejemplo, pueden emplearse convenientemente una gran diversidad de marcadores, tales como radionucleidos, agentes fluorescentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, ligandos tales como, v.g., haptenos, y análogos.

Para algunas aplicaciones, será deseable posicionar una molécula de fijación poliespecífica por inclusión de una secuencia enlazadora peptídica fusionada. Varios enlazadores peptídicos adecuados y métodos de ensayo de los mismos han sido descritos. En algunos casos puede ser útil añadir un agente al enlazador peptídico fusionado de acuerdo con técnicas bien conocidas. Ejemplos de agentes útiles incluyen marcadores fotométricamente detectables tales como, v.g., un colorante o un agente fluorscente; una enzima (tal como, v.g., \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina, o peroxidasa de rábano picante; enzimas que son capaces de formar un marcador fotométricamente detectable). Véase en líneas generales la patente U.S. No. 5434051 para una exposición de marcadores fotométricamente detectables adecuados. Alternativamente, los agentes pueden conjugarse directamente a las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria por una diversidad de otros medios que no implican un enlazador peptídico, algunos de cuyos medios se describen.

Adicionalmente, las proteínas de fijación poliespecíficas de la invención pueden modificarse con posterioridad a la traducción en caso deseado mediante, v.g., adición de carbohidrato o ácido graso. Por ejemplo, las moléculas de fijación pueden modificarse por glicosilación. Los sitios de glicosilación en las proteínas se conocen en la técnica y están típicamente o bien enlazados a N (enlazados a asparagina) o enlazados a O (enlazados a serina o treonina). Dichos sitios de glicosilación pueden identificarse fácilmente por inspección de la secuencia proteínica. Las presentes moléculas de fijación pueden estar glicosiladas por células eucariotas adecuadas como se evidencia mediante, v.g., electroforesis en gel SDS-PAGE. La electroforesis en gel SDS-PAGE y otros métodos afines pueden combinarse con técnicas bioquímicas convencionales tales como, v.g., digestión enzimática, a fin de detectar el carbohidrato fijado a las proteínas de fijación poliespecíficas de la invención. Ejemplos de enzimas digestivas preferidas incluyen, v.g., endoglicosidasas, y exoglicosidadas disponibles, v.g., de New England Biolabs (Beverly, MA). De acuerdo con ello, las moléculas de fijación poliespecíficas de la invención pueden analizarse fácilmente en cuanto a la presencia de grupos carbohidrato, particularmente grupos de oligosacáridos.

En algunos casos, puede ser útil obtener las moléculas de fijación poliespecíficas de la invención sustancialmente puras en forma glicosilada. Particularmente, tales moléculas glicosiladas pueden exhibir menos degradación in vivo cuando se administran como agente terapéutico, aumentando con ello la semi-vida circulante (véase v.g., Goto, M. et al. Bio/Technology 6:67 (1988)).

En particular, las presentes moléculas de fijación poliespecíficas son también adecuadas para una diversidad de usos in vitro e in vivo con inclusión de aplicaciones de diagnóstico y de producción de imágenes así como tipificación de HLA. Véase v.g., A.K. Abbas, Cellular and Molecular Immunology, página 328 (W.B. Saunders Co. 1991). Para aplicaciones de formación de imágenes in vivo, una proteína de fijación poliespecífica de interés puede marcarse detectablemente por adición de ^{125}I, ^{32}P, ^{99}Tc u otro marcador detectable. La molécula de fijación poliespecífica marcada puede administrarse luego a un mamífero y escasearse el individuo por procedimientos conocidos. Un análisis de este tipo del mamífero podría ayudar al diagnóstico y el tratamiento de cierto número de trastornos que incluyen, v.g. la expresión indeseable de APCs que acompañan a trastornos del sistema inmunitario.

Los pesos moleculares de las presentes moléculas de fijación poliespecíficas variarán dependiendo de diversos factores que incluyen si una molécula de fijación particular incluye una o más moléculas sc-TCR, del dominio de fijación de anticuerpos específico que se incluya, de si está presente una cadena de longitud total C\kappa o C\lambda, o de si se emplean uno o más marcadores proteínicos. En general, en realizaciones en las cuales la molécula de fijación poliespecífica está presente en forma monocatenaria, la molécula de fijación tendrá un peso molecular comprendido entre aproximadamente 80 y 110 kDA, y de modo particular entre aproximadamente 90 y 100 kDA. En esta realización, las cadenas V-\alpha y V-\beta del sc-TCR tendrán un peso molecular mayor que aproximadamente 16 kDA, comprendido de modo más típico entre aproximadamente 12 y aproximadamente 20 kDA. Adicionalmente, en realizaciones en las cuales la sc-Fv incluye una cadena V_{H} y una cadena V_{L}, las cadenas tendrán un peso molecular mayor que aproximadamente 18, de modo más general aproximadamente 12 a aproximadamente 20 kDA. El peso molecular de una molécula de fijación específica dependerá de varios parámetros que incluyen el número de moléculas sc-TCR o sc-Fv presentes.

Como se ha expuesto, algunas moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria son moléculas multicatenarias y especialmente anticuerpos quiméricos biespecíficos. Véanse las Figuras 7A y 7B. Típicamente, las moléculas multicatenarias tendrán un peso molecular comprendido entre aproximadamente 150 y aproximadamente 250 kDA o mayor dependiendo, v.g. del número de moléculas sc-TCR o sc-Fv presentes. Todos los pesos moleculares arriba mencionados se determinan por experimentos de dimensionamiento molecular convencionales tales como electroforesis en gel SDS-PAGE o centrifugación. Véase en general Sambrook, et al., supra, Harlow y Lane, supra; Ausubel et al., supra.

En algunas situaciones puede ser útil aumentar la valencia de una molécula de fijación poliespecífica particular. Por ejemplo, una vía para aumentar la valencia de una molécula de fijación poliespecífica consiste en enlazar covalentemente juntas entre 1 y 4 moléculas de fijación (iguales o diferentes) utilizando v.g., técnicas estándar de marcación biotina-estreptavidina o por conjugación a soportes sólidos adecuados tales como cuentas de látex. Proteínas reticuladas químicamente (por ejemplo reticuladas a dendrímeros) son también especies polivalentes adecuadas. Por ejemplo, la proteína puede modificarse por inclusión de secuencias que codifican residuos de aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas tales como Cys o His. Tales aminoácidos con cadenas laterales químicamente reactivas pueden estar situados en una diversidad de posiciones en la proteína de fusión, con preferencia distales a la región de fijación del sc-TCR o sc-Fv.

Como ejemplo específico, el término C de la molécula de fijación poliespecífica puede estar enlazado covalentemente a un marcador de purificación de proteínas u otra proteína fusionada que incluye uno o más aminoácidos reactivos de este tipo. Cadenas laterales adecuadas pueden incluirse para enlazar químicamente dos o más proteínas de fusión a una partícula de dendrímero adecuada a fin de obtener una molécula multivalente. Los dendrímeros son polímeros químicos sintéticos que pueden tener cualquiera de cierto número de grupos funcionales diferentes en su superficie (D. Tomalia, Aldrichimica Acta, 26:91:101 (1993)). Dendrímeros ilustrativos para uso de acuerdo con la presente invención incluyen v.g. el dendrímero de la poliamina de estallido en estrella E9 y el dendrímero de la poliamina "comburst" [sic] E9, que pueden enlazar restos cisteína.

Ensayos de fijación de células T in vitro e in vivo muy útiles han sido descritos. Los ensayos de fijación de células T descritos pueden utilizarse o adaptarse fácilmente en caso necesario para ensayar la función de las proteínas de fijación poliespecíficas de esta invención.

La capacidad de una proteína de fijación poliespecífica de la presente invención para modular la actividad de células inmunitarias y especialmente de una célula T (es decir causar o suscitar una actividad de las células T tal como proliferación) puede determinarse fácilmente de acuerdo con ensayos y materiales para realización de los ensayos conocidos. Véase también Matsui, et al. (1994) DNAs (USA) (1994) 91:12862.

Más específicamente, pueden realizarse ensayos in vitro para determinar si una molécula es capaz de modular la actividad de las células T. Tales ensayos pueden modificarse para determinar la funcionalidad de las proteínas de fijación poliespecíficas. Generalmente, un ensayo ilustrativo se conduce como sigue, por los pasos secuenciales 1-4 indicados a continuación. Las células T expresan convenientemente un marcador que puede ensayarse y que indica la activación de las células T, o la modulación de la actividad de las células T después de la activación. Así, como se describe en las solicitudes anteriores, puede emplearse el hibridoma de las células T murinas DO11.10 que expresa interleuquina-2 (IL-2) después de la activación. Las concentraciones de IL-2 pueden medirse para determinar si una molécula de fusión sc-TCR particular es capaz de modular la actividad del hibridoma de las células T (v.g., aumentar la producción
de IL-2). Un ejemplo general de un ensayo adecuado de este tipo se conduce por los pasos secuenciales siguientes:

1. Se obtienen hibridomas de células T o células T adecuados(as).

2. El hibridoma de las células T o las células T se cultivan luego en condiciones que permiten la proliferación.

3. El hibridoma de las células T o las células T proliferantes se ponen luego en contacto con una o más de las proteínas de fijación poliespecíficas. Las células no proliferarán típicamente (es decir están en reposo) hasta que se añade la proteína de fijación poliespecífica junto con células diana adecuadas.

4. En los casos en que se emplean células T que no son de hibridoma tales como células T ingenuas, puede ser útil añadir un factor co-estimulador adecuado para proporcionar las señales necesarias para la activación. Los hibridomas de células T o las células T se ensayan subsiguientemente respecto a un marcador; v.g., se mide la producción de IL-2. En realizaciones en las cuales se utiliza una molécula biespecífica, la producción de IL-2 es una vía para evaluar la extensión en la cual la molécula biespecífica puede modificar la respuesta de las células T. Se prefieren moléculas biespecíficas que proporcionan formación de puentes celulares y facilitan aproximadamente un aumento al doble hasta aproximadamente un aumento al triple de IL-2 respecto a un control adecuado (es decir una célula T no estimulada). Adicionalmente, se prefieren moléculas biespecíficas que, cuando se utilizan sin adición de células no darán como resultado una estimulación y producción significativa de IL-2 tal como se mide por el ensayo general arriba mencionado. Es decir, la adición de la molécula de fijación poliespecífica sin adición de células diana no dará como resultado una estimulación significativa de las células T (es decir la producción de IL-2). Véase el Ejemplo 14 más adelante para un ensayo más específico.

Como se ha expuesto previamente, las células T empleadas en los ensayos se incuban usualmente en condiciones adecuadas para proliferación. Por ejemplo, un hibridoma de células T DO11.10 se incuba de modo conveniente a aproximadamente 37ºC y 5% de CO_{2} en medio de cultivo completo (RPMI 1640 complementado con 10% de FBS, penicilina/estreptomicina, L-glutamina y 2-mercaptoetanol 5 x 10^{-5} M). Pueden añadirse diluciones en serie de una proteína de fusión al medio de cultivo de las células T en concentraciones comprendidas típicamente en el intervalo que va desde 10^{-8} a 10^{-5} M. Se proporcionan con preferencia señales de activación de las células T por células de presentación de antígenoque se han cargado con el antígeno apropiado.

Como se ha expuesto previamente, en lugar de la medida de una proteína expresada tal como IL-2, la modulación de la activación de las células T puede determinarse convenientemente por cambios en la proliferación de las células T dependientes de antígeno, tal como se mide por métodos de radiomarcación que están reconocidos en la técnica. Por ejemplo, un nucleótido marcado detectablemente (v.g., tritiado) puede introducirse en un medio de cultivo de ensayo. La incorporación de un nucleótido marcado de este tipo en DNA sirve como medida de la proliferación de las células T. Este ensayo no es adecuado para células T que no requieran presentación de antígeno para su crecimiento, v.g., los hibridomas de células T. El mismo es adecuado para medida de la modulación de la activación de las células T para células T no transformadas aisladas de mamíferos. La proliferación de las células T después del contacto con la proteína de fusión (únicamente en presencia de péptido/células diana MHC) indica que la molécula modula la actividad de las células T y puede suprimir la respuesta inmunitaria. El ensayo de proliferación de las células T in vitro se prefiere para medida de los efectos de proteínas de fusión sobre cambios específicos del antígeno en la expansión de colonias de células T in vivo. La medida de la proliferación de IL-2 o la proliferación de células T puede emplearse para determinar si la proteína de fijación poliespecífica es capaz de modificar la activación de las células T.

Moléculas de fijación biespecíficas adicionalmente preferidas incluyen aquéllas que son capaces de mediar la destrucción del CTL de las células diana deseadas como se determina por un ensayo de citotoxicidad tal como un ensayo convencional de liberación de cromo (Cr^{51}). En una realización específica, el ensayo de liberación de cromo se utiliza para medir la destrucción de CTL. La distribución de las células puede monitorizarse y cuantificarse en caso deseado por varios medios adecuados que incluyen la medición del cromo liberado. El ensayo de liberación de cromo es fácilmente adaptable para uso con prácticamente cualesquiera moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria y dianas de células tumorales adecuadas. Se prefieren moléculas de fijación biespecíficas que son capaces de liberar entre al menos aproximadamente 10 y 15% de lisis con respecto a la liberación espontánea por células de control adecuadas. Véase el Ejemplo 18 más adelante para información más específica con relación al ensayo de liberación de cromo.

En general, las células T adecuadas para los ensayos se proporcionan por líneas de células T transformadas tales como hibridomas de células T o células T aisladas de un mamífero, v.g. un primate tal como un humano o un roedor tal como un ratón, una rata o un conejo. Otras células T adecuadas incluyen: 1) hibridomas de células T que están disponibles públicamente o se pueden preparar por métodos conocidos, 2) células T adyuvantes, y 3) células T citotóxicas, con preferencia células CD8+ citotóxicas. Las células T pueden asilarse de un mamífero por métodos conocidos. Véase, por ejemplo, R. Shimonkevitz et al., J. Exp. Med., (1983) 158:303.

Ensayos in vitro e in vivo afines para ensayar moléculas sc-TCR han sido descritos. Dichos ensayos pueden adaptarse fácilmente para uso con las presentes moléculas de fijación poliespecíficas en caso necesario.

Véase el Ejemplo 14 más adelante para un ensayo especialmente preferido para detección de la estimulación de células T de hibridoma utilizando moléculas híbridas biespecíficas preferidas.

La presente descripción proporciona métodos adicionales para ensayar las proteínas de fijación poliespecíficas mono- y multicatenarias descritas en esta memoria. Por ejemplo, la funcionalidad del sc-TCR o la porción de fijación de anticuerpo de las moléculas de fijación puede demostrarse fácilmente por una diversidad de ensayos de fijación específica. Ensayos de fijación preferidos monitorizan y con preferencia cuantifican la fijación específica entre la porción de fijación de anticuerpo y una proteína deseada de la superficie celular. Ensayos de fijación específica preferidos incluyen transferencia Western, ELISA, RIA, ensayo de desplazamiento de movilidad, ensayo inmunoenzimático, ensayos competitivos, ensayos de saturación, ensayos citométricos u otros ensayos de fijación de proteínas conocidos en la técnica. Se prefieren ensayos que sean capaces de detectar una proteína de la superficie celular, v.g. un TCR, una glicoproteína u otra molécula adecuada.

Un ensayo preferido para analizar las presentes moléculas de fijación poliespecíficas es un ensayo ELISA. Por ejemplo, en una realización, células hospedadoras adecuadas que expresan una molécula híbrida biespecífica se seleccionan en un formato ELISA utilizando un anticuerpo que es capaz de fijar específicamente la molécula híbrida. Se prefieren moléculas híbridas biespecíficas que incluyen un marcador proteínico tal como una molécula marcada EE. En este caso, las moléculas marcadas pueden sondarse utilizando anticuerpos disponibles comercialmente que fijan específicamente el marcador. El anticuerpo fijado puede detectarse convenientemente utilizando ELISA estándar, v.g., por fijación de un segundo anticuerpo marcado detectablemente que fija el anticuerpo que reconoce el marcador EE. Alternativamente, la molécula híbrida biespecífica puede sondarse con un anticuerpo que fija específicamente el sc-TCR o el dominio de fijación de anticuerpo y particularmente la sc-Fv.

Los ensayos ELISA arriba descritos pueden utilizarse para detectar y caracterizar prácticamente cualquiera de las proteínas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria. Adicionalmente, los ensayos ELISA pueden utilizarse para seleccionar células en cuanto a su capacidad para expresar una proteína de fijación poliespecífica deseada. Véase el Ejemplo 3 y las Figuras 9A, 9B, 10A, 10B y 11 para resultados de ensayos ELISA ilustrativos.

Ensayos adicionalmente preferidos para analizar las presentes proteínas de fijación poliespecíficas incluyen inmunotransferencias Western. Resumidamente, una proteína de fijación poliespecífica particular tal como una molécula híbrida biespecífica puede separarse por electroforesis en gel convencional y transferirse a un medio de soporte adecuado. La mancha transferida puede sondarse luego con una gran diversidad de anticuerpos tales como los que fijan específicamente el sc-TCR o el dominio de fijación de anticuerpo, v.g., la sc-Fv. El anticuerpo fijado puede visualizarse por métodos de detección estándar. Véanse los Ejemplos siguientes y la Figura 12.

Ensayos adicionalmente preferidos para analizar las presentes proteínas de fijación poliespecíficas implican análisis por citometría de flujo. Por ejemplo, la fijación específica entre la porción sc-TCR o sc-Fv de una proteína híbrida biespecífica y una glicoproteína u otro marcador adecuado expresado en una célula puede determinarse por análisis citométrico de flujo. En un ejemplo más particular, células T de hibridoma u otras células adecuadas que expresan la molécula CD3 se ponen en contacto con la molécula híbrida biespecífica en condiciones que conducen a la formación de un complejo de fijación específico. Las células se lavan luego y se ponen en contacto con un anticuerpo marcado detectablemente (v.g. biotinilado) específico para una cadena V de el sc-TCR o un marcador proteínico fijado a la molécula híbrida biespecífica (v.g., el marcador EE). Se realiza luego un ensayo cromógeno estándar utilizando métodos de detección con estreptavidina marcada y espectrofotométricos. La funcionalidad de la sc-Fv puede demostrarse por tinción de las células T de hibridoma. La tinción inespecífica puede detectarse por una diversidad de métodos que incluyen el uso de células de hibridoma T que no expresan la molécula CD3. Para algunas aplicaciones puede ser útil comprobar la especificidad de fijación por inclusión de un anticuerpo adecuado que puede competir con la proteína híbrida biespecífica en cuanto a fijación a las células. Las proteínas de fijación biespecíficas preferidas exhibirán un aumento en citocromo entre aproximadamente 5 y 1000 veces y con preferencia entre aproximadamente 10 y 100 veces cuando se comparan con un control adecuado. Véase el Ejemplo 15 y las Figuras 17-19 para resultados de un análisis citométrico de flujo.

Como se ha expuesto, la presente descripción se caracteriza también por bacteriófagos recombinantes que incluyen proteínas de fusión que comprenden moléculas sc-TCR o sc-Fv fusionadas a una proteína de bacteriófago adecuada o fragmento de la misma. Como se ha expuesto, se conocen en la técnica proteínas de fusión sc-Fv que comprenden una proteína de la cubierta de bacteriófago. Métodos para producción y utilización de proteínas de fusión sc-TCR que comprenden una proteína de la cubierta de bacteriófago han sido expuestos en la patente U.S. No. 5.759.817. Será evidente a partir de los ejemplos que siguen que los métodos descritos pueden adaptarse, en caso necesario, para facilitar la producción de los presentes bacteriófagos recombinantes.

Más particularmente, los presentes bacteriófagos recombinantes presentan proteínas de fusión que incluyen cada una un sc-TCR o una sc-Fv enlazado(a) a una proteína o fragmento de la cubierta del bacteriófago. Los bacteriófagos recombinantes preferidos de esta invención son biespecíficos y se caracterizan por la especificidad de fijación de las proteínas de fusión sc-TCR y sc-Fv. La proteína de fusión sc-TCR incluye generalmente una proteína de la cubierta de bacteriófago o fragmento de la misma enlazada(o) covalentemente a una cadena V-\alpha fusionada a una cadena
V-\beta con preferencia a través de una secuencia enlazadora peptítica flexible. Con preferencia, la proteína de la cubierta de bacteriófago es una proteína del gen III o del gen VIII de bacteriófago. La proteína de fusión sc-Fv incluye típicamente una proteína o fragmento de la cubierta de bacteriófago enlazada(o) covalentemente a la cadena V_{H} o V_{L} con preferencia a través de una proteína enlazadora peptídica flexible.

Como se utiliza en esta memoria, "proteína de la cubierta de bacteriófago" incluye la proteína de la cubierta de longitud total. Un fragmento adecuado de dicha proteína de la cubierta es capaz de facilitar el empaquetamiento de el sc-TCR o sc-Fv y presentar el sc-TCR o sc-Fv como un componente de proteína de fusión de la cubierta de bacteriófago. El empaquetamiento satisfactorio puede demostrarse de varios modos que incluyen ensayos en placas que cuantifican la producción de partículas infecciosas. Una descripción más específica relativa a métodos de producción y utilización de los bacteriófagos puede encontrarse en los Ejemplos 21, 24, 26-28 más adelante.

En una realización, los bacteriófagos recombinantes presentan proteínas de fusión sc-TCR y sc-Fv que pueden incluir opcionalmente uno o más marcadores proteínicos fusionados (típicamente uno o dos). La fijación de al menos un marcador proteínico presenta varias ventajas que incluyen proporcionar una vía directa de purificación de los bacteriófagos de componentes celulares que pueden acompañarlos. Se prefieren marcadores proteínicos que facilitan el reconocimiento químico o inmunológico del bacteriófago tales como los marcadores específicos descritos más adelante. Un marcador especialmente preferido es la secuencia EE.

En particular, las proteínas de fusión sc-TCR y sc-Fv de los bacteriófagos recombinantes pueden incluir prácticamente cualquier molécuel sc-TCR o sc-Fv descrita en esta memoria. Por ejemplo, la proteína de fusión sc-TCR puede incluir, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una cadena V-\alpha, 2) una secuencia enlazadora peptídica adecuada, 3) una cadena V-\beta, 4) una cadena C_{\beta} y 5) una primera proteína o fragmento de la cubierta de bacteriófago. La proteína de fusión sc-Fv puede incluir, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una cadena V_{H}, 2) una secuencia enlazadora peptídica adecuada, 3) una cadena V_{L}, y 4) una segunda proteína o fragmento de la cubierta de bacteriófago. Las proteínas de la cubierta de bacteriófago primera y segunda pueden ser iguales o diferentes dependiendo, v.g., de la cantidad o calidad de presentación deseada.

En realizaciones en las cuales el bacteriófago recombinante incluye proteínas de fusión que comprenden cada una una proteína de fusión sc-TCR o sc-Fv, se hará referencia algunas veces en esta memoria a dicho bacteriófago como "bacteriófago biespecífico" o simplmente "fago biespecífico". Ilustrativos de tales fagos biespecíficos incluyen aquéllos que presentan una sc-TCR deseada fusionada a la proteína del gen VIII de bacteriófago y la sc-Fv fusionada a la proteína del gen III. Sin embargo, en algunos casos, puede ser útil producir bacteriófagos biespecíficos recombinantes que exhiben el sc-TCR fusionada a la proteína del gen III y la sc-Fv fusionada a la proteína del gen VIII.

Opcionalmente, un marcador proteínico puede estar enlazado covalentemente al término C del fragmento C-\beta y al término N de la proteína del gen III del bacteriófago. Se describe también una proteína de fusión sc-TCR que incluye un primer marcador proteínico enlazado covalentemente entre el término C de la cadena V-\beta y el término N de la proteína del gen III del bacteriófago y un segundo marcador proteínico enlazado covalentemente al término C de la proteína de fusión.

Se describe también una proteína de fusión sc-TCR que incluye, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una cadena V-\alpha, 2) una secuencia enlazadora peptítica, 3) una cadena V-\beta enlazada covalentemente a un fragmento de cadena C-\beta, y 4) una proteína del gen VIII del bacteriófago. Se expone también una proteína de fusión sc-TCR que incluye, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una cadena V-\alpha enlazada covalentemente a un fragmento de cadena C-\alpha, 2) una secuencia enlazadora peptídica, 3) una cadena V-\beta enlazada covalentemente a un fragmento de cadena C-\beta, y 4) una proteína del gen VIII del bacteriófago. En esta realización, el sc-TCR puede incluir adicionalmente un primer marcador proteínico enlazado covalentemente al término C de la cadena V-\beta y al término N de la proteína del gen VIII, y un segundo marcador proteínico enlazado covalentemente al término C de la proteína de fusión. Adicionalmente, un marcador proteínico puede estar enlazado covalentemente al término C del fragmento de la cadena C-\beta y el término N de la proteína del gen VIII.

Si se desea, los bacteriófagos recombinantes pueden manipularse para tener valencias comprendidas entre aproximadamente 2 y 10 y con preferencia entre aproximadamente 2 y 3. Es decir, los bacteriófagos pueden formatearse para incluir: 1) entre aproximadamente 2 y 3 proteínas de fusión sc-TCR, 2) entre aproximadamente 2 y 3 proteínas de fusión sc-Fv, o 3) entre aproximadamente 2 y 3 proteínas de fusión sc-TCR y sc-Fv. Tales bacteriófagos poliespecíficos son sumamente útiles, v.g., como en el caso en que se desea aumentar la avidez o afinidad de fijación de una proteína de fusión sc-TCR o sc-Fv presentada en el bacteriófago.

La presente descripción proporciona también métodos para producir los bacteriófagos poliespecíficos recombinantes descritos en esta memoria. Por ejemplo, en una realización, se transfectan células hospedadoras bacterianas con polinucleótidos que codifican una sc-TCR o sc-Fv en los cuales el sc-TCR o sc-Fv codificada está fusionada a una proteína o fragmento de la cubierta de bacteriófago adecuada(o). Se contemplan también polinucleótidos que codifican un fragmento funcional de el sc-TCR o sc-Fv. Se consideran también polinucleótidos que codifican copias múltiples (a saber, aproximadamente 2 a 5) de el sc-TCR o sc-Fv.

Los bacteriófagos recombinantes pueden producirse por una o una combinación de estrategias. Se prefieren métodos que utilizan células hospedadoras bacterianas tales como E. coli que son conducentes a la propagación del bacteriófago. En una realización particular, las células hospedadoras se transfectan con un polinucleótido que codifica la proteína de fusión sc-TCR en condiciones suficientes para presentar la misma como parte de la cubierta o cápsida del bacteriófago. La célula hospedadora puede infectarse al mismo tiempo o en un momento posterior con un polinucleótido que codifica la proteína de fusión sc-Fv en condiciones que conducen también a la presentación de la proteína de fusión sc-Fv en la cápsida. La producción de los bacteriófagos poliespecíficos puede detectarse y cuantificarse en caso deseado por una diversidad de métodos convencionales tales como RIA, ELISA, inmunotransferencia Western y cromatografía de afinidad.

En otra realización, los bacteriófagos poliespecíficos recombinantes se producen por infección de células hospedadoras adecuadas con bacteriófagos recombinantes "monoespecíficos" que llevan independientemente las proteínas de fusión sc-TCR o sc-Fv descritas en esta memoria. Una descripción más específica relativa a tales bacteriófagos puede encontrarse en la Patente U.S. No. 5.759.817. Por ejemplo, en una realización más específica, los bactgeriófagos poliespecíficos pueden producirse infectando primeramente células hospedadoras bacterianas adecuadas con un bacteriófago monoespecífico e infectando después las mismas células hospedadoras con el otro bacteriófago monoespecífico. Alternativamente, la infección puede conducirse por infección simultánea con ambos bacteriófagos monoespecíficos.

Se apreciará que los métodos para producción de los bacteriófagos poliespecíficos recombinantes son sumamente flexibles. Es decir, el orden en el que se transfectan (o infectan) las células hospedadoras con un polinucleótido (o bacteriófago recombinante) particular no es importante con tal que el bacteriófago recombinante resultante exhiba las especificidades de fijación deseadas.

Los bacteriófagos recombinantes proporcionan numerosos usos y ventajas importantes. Por ejemplo, los bacteriófagos presentan con preferencia moléculas sc-TCR y sc-Fv de longitud total o prácticamente total. De acuerdo con ello, el uso de las presentes genotecas de bacteriófago impacta positivamente en el análisis de moléculas sc-TCR y sc-Fv, particularmente bolsas de fijación sc-TCR y sc-Fv.

Los bacteriófagos recombinantes son particularmente útiles para un amplio espectro de selecciones tales como las formateadas para detectar y evaluar la fijación específica de moléculas sc-TCR y sc-Fv. Los bacteriófagos son también útiles para analizar una diversidad de moléculas de fijación tales como antígenos, anticuerpos, moléculas pequeñas, superantígenos y complejos peptídicos MHC/HLA. Es importante que las presentes genotecas de presentación de bacteriófagos expresan proteínas de fusión con una cadena V-\alpha y una cadena V-\beta, haciendo con ello las proteínas de fusión más plenamente representativas de los TCRs encontrados in vivo.

Adicionalmente, los bacteriófagos pueden manipularse para maximizar la formación de complejos de fijación específicos entre los bacteriófagos y moléculas de fijación deseadas o incluso células, aumentando con ello la detección de las moléculas o células de fijación que pueden ser raras o de fijación débil. Los bacteriófagos son especialmente adecuados para técnicas de biolavado en batea (v.g., lavado en batea de células e inmunolavado en batea).

Como se ha expuesto, los bacteriófagos recombinantes y genotecas de bacteriófagos pueden proporcionarse en forma de estuche (kit). El kit puede incluir bacteriófagos recombinantes que presentan un solo tipo de sc-TCR y sc-Fv. Alternativamente, el kit puede incluir una genoteca de bacteriófagos recombinantes, en cuyo caso la genoteca incluirá con preferencia una diversidad de proteínas de fusión sc-TCR y sc-Fv diferentes. Kits más específicos incluyen adicionalmente células hospedadoras pertinentes y/o reactivos para detectar los bacteriófagos, v.g., anticuerpos e instrucciones para utilizar el kit.

La presente descripción menciona también una diversidad de métodos para administrar al menos una proteína de fijación poliespecífica a un mamífero y con preferencia un roedor o un primate tal como un paciente humano. Por ejemplo, en una realización, se proporciona un método para administrar un polinucleótido que codifica una molécula de fijación poliespecífica y especialmente una molécula de fijación poliespecífica monocatenaria. Se prefieren polinucleótidos que pueden expresar la molécula de fijación monocatenaria en el mamífero. Con preferencia, DNA que lleva las regiones codificantes de la proteína de fijación, convenientemente bajo el control de un promotor eucariota fuerte tal como un promotor viral fuerte (v.g., CMV), se inyecta directamente en la musculatura esquelética del individuo de acuerdo con métodos conocidos. Métodos para administración de DNA plasmídico, absorción de dicho DNA por las células del individuo administrado y expresión de la proteína han sido consignados (véase J. Ulmer et al. Science, (1993) 259: 1745-1749). En realizaciones en las cuales la molécula de fijación poliespecífica se administra a un mamífero y especialmente un humano, se prefiere que el isotipo de la molécula sea compatible con el hospedador empleado.

Como se ha indicado previamente, las proteínas de fijación poliespecíficas de la presente invención tienen aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, como se ha expuesto, las moléculas de fijación pueden utilizarse para redireccionar la especificidad de ciertas células inmunes y particularmente una célula T, CTL, célula CD8+, célula NK, o macrófago para eliminar una célula diana deseada que expresa un MHC tal como una célula infectada por un virus o célula tumoral. La reticulación de las células inmunes con las células diana proporciona una respuesta inmunitaria potente, suficiente para deteriorar o destruir la célula diana.

Adicionalmente, las proteínas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria pueden administrarse para reducir o eliminar una respuesta inmunitaria en un mamífero, v.g., para tratar un mamífero tal como un humano que sufre o es propenso al cáncer y a una enfermedad infecciosa. Son también adecuados para tratamiento aquellos individuos que sufren o es probable que sufran una respuesta inmunitaria indeseada, v.g. pacientes sometidos a cirugía de transplante tal como transplante de corazón, riñón, piel u otros órganos. En situaciones que implican rechazo de transplante, un protocolo de tratamiento puede comenzarse convenientemente con anterioridad al procedimiento quirúrgico.

La administración de las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria puede hacerse por cualquier medio adecuado tal como administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fusión o el polinucleótido que codifica la misma. En algunas realizaciones en las cuales se desea administración de DNA, puede ser útil proporcionar dos o más polinucleótidos que codifican partes de una proteína de fijación poliespecífica deseada, por ejemplo cuando se desea el uso de una molécula híbrida biespecífica.

Pueden emplearse varios enfoques específicos para reducir o destruir las células diana deseadas de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, un método de tratamiento para deteriorar y con preferencia destruir células diana estipula la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una molécula de fijación poliespecífica deseada para enlazarse a células diana que expresan un complejo MHC con células inmunes específicas que expresan un antígeno de la superficie celular. La asociación entre las células diana y las células inmunes facilita una reacción inmunitaria que deteriora y con preferencia elimina las células diana. En algunas realizaciones, puede administrarse en caso neceario más de una molécula de fijación poliespecífica. En algunos casos, pueden controlarse selectivamente respuestas inmunitarias mediadas por las células T tales como proliferación, diferenciación o activación de células T o estimulación de linfocitos B.

Las proteínas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria pueden administrarse a un mamífero por inyección, v.g., inyección intraperitoneal o intravenosa. En realizaciones preferidas, las proteínas de fijación poliespecíficas se producen con preferencia a partir de células de mamífero u otras células adecuadas y se purifican antes de su utilización a fin de que las mismas estén exentas esencial o completamente de pirógenos. La dosis óptima para una aplicación terapéutica dada puede determinarse por medios convencionales y variará generalmente dependiendo de varios factores que incluyen la vía de administración, el peso del paciente, el estado general de salud, el sexo, y otros factores de este tipo reconocidos por el experto en la técnica.

La administración puede realizarse en una dosis simple, o en una serie de dosis separadas por intervalos de días o semanas. El término "dosis simple", tal como se utiliza en esta memoria, puede ser una dosis única, y puede ser también una dosis de liberación sostenida. El individuo puede ser un mamífero (v.g., un humano o un ganado tal como ganado vacuno y mascotas tales como perros y gatos) y puede incluir tratamiento como una composición farmacéutica que comprende al menos una proteína de fijación poliespecífica y típicamente una proteína de este tipo. Tales composiciones farmacéuticas de la invención se preparan y utilizan de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, formulaciones que contienen una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína de fijación pueden presentarse en envases de dosis unitaria o multidosis, v.g. ampollas y viales herméticamente cerrados, y pueden guardarse en condiciones secadas por congelación (liofilizadas) que requieren únicamente la adición del vehículo líquido estéril, v.g. agua para inyecciones, inmediatamente antes de su utilización. También pueden ser preferidas formulaciones de liposomas para muchas aplicaciones. Otras composiciones para administración parenteral serán también adecuadas e incluirán soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del receptor propuesto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes.

Los usos de la invención que incluyen la reducción o eliminación de células diana que expresan v.g., un MHC cargado con un tumor o un péptido viral, pueden utilizarse en combinación con otras terapias tales como terapias antivirales, inmunosupresoras, anti-cáncer o anti-inframatorias a fin de proporcionar un régimen de tratamiento más eficaz. Por ejemplo, las proteínas de fijación poliespecíficas de esta invención pueden utilizarse con agentes anti-virales específicos tales como los utilizados para reducir o eliminar una infección de retrovirus y particularmente infección por el virus del SIDA. Adicionalmente, las proteínas de fijación poliespecíficas pueden utilizarse con terapias estándar anticáncer tales como quimioterapia o inmunoterapia.

Como se ha mencionado previamente, en algunos casos puede ser útil producir anticuerpos para las proteínas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria o fragmentos de las mismas.

Como se ha mencionado arriba, las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria pueden ser modificadas fácilmente por una o una combinación de estrategias para mejorar la fijación.

Proteínas de fusión solubles o ácidos nucleicos sustancialmente puras(os) tienen una pureza de al menos aproximadamente 90 a 95% y con preferencia al menos 98% o 99% o mayor, para uso farmacéutico. Una vez purificadas parcialmente o hasta una pureza sustancial, las proteínas de fusión solubles pueden utilizarse terapéuticamente (lo que incluye la vía extra-corpórea), o en el desarrollo o realización de ensayos in vitro o in vivo como se describen en esta memoria.

Los Ejemplos no limitantes siguientes son ilustrativos de la invención.

Ejemplo 1 Construcción de TSC monocatenario (sc) p-149

El clon de células T, p-149, reconoce un fragmento peptídico (STPPPGTRV, SEQ ID No. 10) de la proteína humana p53 de tipo salvaje supresora de tumores restringida por HLA-A2.1. (Véase Theobald et al., PNAS, 1995) El gen receptor de las células T se clonó en un formato monocatenario de tres dominios que se había ajustado previamente para producir TCR soluble y moléculas receptoras funcionales (Fig. 1A).

Resumidamente, se aisló mRNA del clon de células T y se produjo cDNA utilizando el Kit de Amplificación de cDNA Marathon (Clontech). El cDNA se utilizó como molde en una reacción en cadena de polimerasa (PCR) con iniciadores KC171 y KC174 a fin de producir un fragmento de cadena V\alpha 5'SfiI3'SpeI que incluía los 7 primeros aminoácidos del término N de la cadena C\alpha. Se utilizó luego el mismo cDNA como molde de PCR con iniciadores KC172 y KC176 para generar un fragmento de cadena 5'XhoI-3'XmaIV beta C beta. La cadena C beta estaba truncada inmediatamente delante del residuo cisteína en el aminoácido 127 de la cadena C beta de longitud total. Los fragmentos de cadena alfa y beta se clonaron en el Sistema Vector pGTM-T Easy (Promega) para determinación de la secuencia de DNA. Los fragmentos correctos se digirieron por restricción y se clonaron en el vector de expresión pCK60 para crear una molécuel sc-TCR V alfa-(G_{4}S)_{4} V beta C beta. En esta memoria se hace referencia al vector pKC60 como PSUN23 (Fig. 3). El vector pKC60 ha sido descrito en la solicitud de Patente U.S. No. 08/813.731 pendiente. El nuevo vector se designó pNAG2 (Fig. 4).

El constructo de DNA de E. coli pNAG2 se reamplificó luego por PCR con los iniciadores KC203 y KC208 para generar un fragmento de DNA 5'AgeI-3'HpaI/BspEI/NruI/ClaI. El fragmento sc-TCR se clonó en el Sistema Vector pGEM-T Easy para determinación de la secuencia de DNA.

Este nuevo vector basado en pGEM se utilizó luego como un "vector lanzadera" para introducción de otros fragmentos de DNA a fin de crear una molécula sc biespecífica.

1. Clonación y expresión de formas variantes sc-TCR p149 en E. coli

Es posible proporcionar el sc-TCR p-149 en una diversidad de constructos útiles. Por ejemplo, 4 variaciones del constructo pSUN21 descrito más adelante pueden utilizarse para expresar el sc-TCR. Se ha encontrado que el nivel de sc-TCR soluble aumenta cuando el sc-TCR se expresa en el diseño de sc-TCR pSUN21 que se representa en la Figura 1B. Por esta razón, se realizará una clonación inicial utilizando este constructo monocatenario como molde. Como se ha descrito, se utilizará un procedimiento de clonación en dos pasos para ensamblar el sc-TCR en el vector de expresión. Como se ha expuesto anteriormente, el cDNA p-149 que codifica las cadenas alfa y beta de longitud total de este receptor ha sido clonado. Métodos de clonación afines pueden utilizarse para producir las variantes.

Por ejemplo, una variante del constructo TCR p149 se asemejará estrechamente a el sc-TCR DO11.10 clonada en el vector pSUN21. Este constructo contiene el dominio V alfa, un tramo de 10-25 aminoácidos seguido por un enlazador (G4S)4, y los dominios V\beta/C\beta. Una secuencia marcadora EE se incluirá en la región del terminal carboxilo. Esto facilita la detección de la molécula en inmunotransferencias y puede utilizarse para reticulación de moléculas sc-TCR. Un segundo constructo ligeramente modificado codificará un sitio BirA (véase el Ejemplo 24 más adelante) en el extremo del terminal carboxilo. BirA ha sido caracterizada como una secuencia de biotinilación y se ha utilizado para producir formas tetrámeras de moléculas MHC. Véase Altman et al., Science, 274, 94-96 (1996). El sitio se utilizará para construir moléculas sc-TCR tetrámeras para evaluación de el sc-TCR en ensayos de fijación y bloqueo de células. Se contempla también la construcción de formas monómeras por reticulación de el sc-TCR con la sc-Fv que contiene los marcadores BirA y avidina (véase el Ejemplo 24 más adelante), respectivamente. La adición del sitio BirA por manipulación genética tiene la ventaja sobre métodos de biotinilación más tradicionales que están basados en protocolos de reticulación química. En muchos casos, el uso de tales agentes de acoplamiento da como resultado la desnaturalización de la proteína, lo cual podría evitarse por codificación al nivel del gen de un sitio para biotinilación. Otra ventaja de disponer del sitio BirA es que puede ensamblarse estequiométricamente una relación molar 1:1 de sc-TCR:sc-Fv.

En otro ejemplo, puede producirse una variante de sc-TCR p-149 que contendrá el DNA codificante de la secuencia jun. Ésta se clonará como un fragmento de DNA 3' en el diseño sc-TCR. La fusión sc-TCR/jun estará disponible para reticulación con la fusión sc-Fv/fos.

En otro ejemplo adicional de una variante p-149, puede producirse una proteína de fusión por la cual, la región terminal carboxilo del marcador c\beta/EE está fusionada genéticamente a pVIII, la proteína principal de la cubierta del fago filamentoso. Una diversidad de fusiones sc-TCR que comprenden proteínas de bacteriófago con inclusión de las proteínas pVIII y pIII han sido descritas en la Solicitud de Patente U.S. No. 08/813781 pendiente. Como se describe aquí, la construcción de un fago biespecífico (expresión de ambos fragmentos sc-TCR y sc-Fv en la superficie del fago) será la primera forma de esta molécula híbrida. La molécula tiene una diversidad de usos importantes que incluyen destrucción de células tumorales in vitro e in vivo, por formación de un "puente" entre CTL y las células diana. El vector pSUN21 se utilizará para clonar la fusión sc-TCR/pVIII. El vector tiene un promotor lacZ y ha sido utilizado en el desarrollo del modelo de presentación sc-TCR/fago expuesto en la sección de resultados preliminares. Éste es un vector pBluScript modificado que puede producir fago que expresa moléculas sc-TCR/pVIII después de superinfección con fago de tipo salvaje.

Como se expone en las solicitudes de Patente U.S. núms. 08/813.781 y 08/813.781 [sic] pendientes, pueden utilizarse una diversidad de vectores de DNA específicos para fusionar una sc-TCR deseada a proteínas de la cubierta de bacteriófago. Por ejemplo, las Solicitudes U.S. pendientes describen los vectores de DNA pKC46 (pSUN18) y pKC62 (pSUN19). Estos vectores han sido depositados de acuerdo con el Tratado de Budapest en la American Type Culture Collection (ATCC). Los vectores de DNA fueron depositados en la ATCC el 26 de febrero de 1997 y se les asignaron los números de acceso núms. 97895 (pSUN18) y 97896 (pSUN19). El vector de DNA pKC62 (pSUN19) incluye un promotor phoA, secuencia pelB modificada, sitio de fijación de ribosoma del gen 10 y proteína del gen VIII de bacteriófago. El vector de DNA pKC46 (pSUN18) incluye el promotor lac Z, un marcador EE y la proteína del gen III del bacteriófago. Los vectores de DNA pueden propagarse en E. coli u otras células hospedadoras adecuadas de acuerdo con métodos estándar.

Los vectores de DNA pKC46 (pSUN18) y pKC62 (pSUN19) se han diseñado para acomodar una diversidad de V\alpha, V\beta-C\beta y secuencias enlazadoras polipeptídicas. La cadena V\alpha de ambos vectores de DNA puede eliminarse por digestión de restricción con SFiI y SpeI. La cadena V\beta-C\beta puede separarse por digestión de restricción con ShoI-XmaI. Adicionalmente, los vectores de DNA permiten el intercambio de la secuencia enlazadora peptídica por digestión de restricción con SpeI y ShoI. Véanse las Figuras 2A-2E para ejemplos más específicos de constructos sc-TCR.

Ejemplo 2 Purificación y caracterización de la sc-TCR p-149

La solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/943.086 pendiente describe una diversidad de métodos para purificación de las proteínas sc-TCR con inclusión de las que comprenden la sc-TCR DO11.10. Estos métodos pueden adaptarse para purificar la proteína de fusión p-149. Por ejemplo, para purificar la sc-TCR, puede utilizarse un anticuerpo con especificidad para un epítope conformacional en V\beta11.0 o V\alpha2.3 de acuerdo con las líneas descritas en la solicitud U.S. pendiente. En particular, la sc-TCR p-149 puede purificarse en una columna de inmunoafinidad utilizando el procedimiento siguiente.

Una pasta de células generada en un fermentador puede suspenderse en tampón de extracción seguido por lisis mecánica de las células por paso a través de una prensa francesa. El sobrenadante se clarifica por centrifugación a 25.000 x g y se aplica a una columna de Q-Sepharosa. La sc-TCR se recoge en el flujo directo y se aplica luego a una columna de proteína-A-Sepharosa reticulada con mAb H57-95. Éste es un mAb de hámster específico para un epítope del dominio C-beta de TCRs murinas. Este anticuerpo exhibe características de fijación satisfactorias para TCRs de murino y ha sido utilizado previamente para purificar moléculas sc-TCR intactas así como productos de descomposición del lisado. Para eliminar los receptores degradados o plegados impropiamente, se utilizará una columna de afinidad de segundo anticuerpo que puede discriminar entre sc-TCR que está conformacionalmente intacta de la sc-TCR que se ha degradado. La sc-TCR fijada se eluye utilizando un tampón de glicina 50 mM, pH 11, y la preparación de sc-TCR se analizará por paso de la muestra sobre un gel de SDS-poliacrilamida a3 12% y tinción con azul brillante Coomassie o transferencia Western.

Para determinar si la proteína expresada es funcional, se ensayará la sc-TCR de acuerdo con ensayos descritos en las Solicitudes de Patente U.S. núms. de Serie 08/813.781 y 08/943.086, tales como un ensayo de fijación de células y un ensayo de bloqueo. El ensayo de fijación de células puede realizarse como se expone en las solicitudes U.S. pendientes. Alternativamente, los ensayos pueden modificarse para formar tetrámeros utilizando moléculas sc-TCR que incluyen una secuencia de biotina simple en el extremo del terminal carboxilo. Véase el Ejemplo 24 más adelante. Los tetrámeros se formarán por adición de éstreptavidina acoplada a PE seguido por incubación de estas moléculas con células tumorales conocidas que procesan y presentan naturalmente el péptido 149 asociado con HLA-A2.1. Los controles incluirán células que expresan únicamente el antígeno HLA-A2.1 y células que no expresan el HLA-A2.1 ni el péptido. Se anticipa que un desplazamiento de picos [sic] en la fluorescencia de las células que expresan el péptido asociado con HLA-A2.1.

Ejemplo 3 Construcción, Expresión y Caracterización de la sc-TCR DO11.10

La TCR DO11.10 reconoce el péptido OVA (323-339) en el contexto de la molécula de MHC clase II IA^{d}. (Véase Haskins et al., J. Exp. Med., 1983). El constructo de DNA de E. coli pKC60 se reamplificó por PCR con iniciadores KC169 y KC208 a fin de generar un fragmento 5'AgeI-3'HpaI/BspEI/NruI/ClaI. El fragmento de DNA sc-TCR se clonó en el Sistema Vector pGEM-T Easy para determinación de la secuencia de DNA. El DNA de sc-TCR correcto se digirió luego por restricción con AgeI y HpaI y se clonó en el "vector lanzadera", reemplazando el fragmento de DNA de sc-TCR previo, para generar una nueva molécula de sc biespecífica sc-TCR/scSc-Fv. La molécula sc biespecífica DO11.10 se clonó luego en pSUN27 para crear pBISP/DO11.10 (Fig. 6).

El vector pBISP/DO11.10 (pSUN28) ha sido depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en la ATCC en fecha 3 de septiembre, 1998 y le fue asignado el No. de acceso 203.186.

1. Expresión de moléculas sc-TCR variantes en E. coli

El efecto de los cambios en el diseño de la sc-TCR se investigó al nivel de la expresión proteínica. Se utilizaron vectores que codifican las diferentes sc-TCR y constructos de fusión para transformar células K91 de E. coli. Se llevaron a cabo experimentos de expresión cultivando células K91 transformadas durante una noche en medios que contenían fosfato inorgánico para prevenir la activación del promotor phoA e inducir la expresión de proteínas. A la mañana siguiente se inició un nuevo cultivo a partir del cultivo nocturno y se dejó crecer hasta que se hubo agotado el fosfato. La duración de la inducción se normalizó por monitorización del agotamiento de fosfato a lo largo del tiempo en el cultivo. Véanse las Solicitudes de Patente de EE.UU. núms. de serie 08/813.781 y 08/943.086 pendientes para exposición adicional relativa a la producción de moléculas de fusión sc-TCR.

Para comparar el nivel de expresión entre los diferentes constructos, se preparó proteína a partir de las muestras para análisis de lisados de células que se habían normalizado a la misma lectura de absorbancia a 600 nm (10 DO/ml). La proteína se liberó de las células por sonicación y la muestra se clarificó por centrifugación a 25.000 x g durante 20 minutos. Las muestras se cargaron luego en un gel SDS-PAGE al 12% y, después de electroforesis y transferencia de proteínas a una membrana de nailon, se detectó la TCR por sondeo con un anticuerpo específico para el marcador EE. Se observó en este experimento de expresión que las alteraciones al diseño básico de la sc-TCR pueden producir cambios importantes en el nivel de proteína soluble expresada. Por ejemplo, el constructo de sc-TCR pSUN22, que incluye los dominios V\alpha y V\beta unidos por un enlazador sintético, no es detectable en la fracción soluble a la concentración de material cargada. Puede detectarse una señal cargando una cantidad de muestra 50 veces mayor, aunque la señal no es equivalente todavía a los niveles observados con pSUN21. Estos datos indican que pueden producirse niveles altos de sc-TCR soluble en E. coli por modificación del diseño del constructo.

2. Caracterización de la sc-TCR soluble A. Inmunoprecipitación

La integridad de plegamiento de la proteína sc-TCR producida por los vectores de DNA pSUN23 y pSUN19 se analizó por realización de experimentos de ensayos de fijación utilizando dos mAb (MR5-2 y F23.1) con especificidad para epítopes plegados correctamente en V\beta8.2. Adicionalmente, se ensayaron sc-TCR que tenían cadenas V\alpha con V\beta apareadas correctamente, utilizando un mAb anti-idiotipo, KJ1, generado contra la TCR DO11.10. Los experimentos de ensayos de fijación han sido descritos en las Solicitudes de Patente U.S. núms. de Serie 08/813.781 y 08/943.086 pendientes. Los datos indican que la proteína sc-TCR tiene un dominio V\beta conformacionalmente correcto y dominios V\alpha y V\beta correctamente apareados.

B. Inmunoenayo unido a enzima (ELISA)

Se utilizó un ensayo ELISA de tipo sándwich para caracterizar adicionalmente los dominios de plegamiento de la sc-TCR. El uso del ensayo ELISA se describe más detalladamente en las Solicitudes de patente U.S. núms. de Serie 08/813.781 y 08/943.086 pendientes. Resumidamente, se capturaron diluciones diferentes de la sc-TCR por mAb anti- marcador EE aplicado en forma de capa en pocillos y se detectaron utilizando uno de los mAbs siguientes, H57 (C\beta), MR5-2 (V\beta8.2), F23.1 (V\beta8.2) y KJ1 (V\alpha/V\beta). Estos datos respaldan la presencia de una sc-TCR plegada correctamente e indicaban que la sc-TCR es estable incluso después de elución a pH alto (11,0) y almacenamiento a 4ºC durante varias semanas.

C. Estudios de fijación de resonancia de plasmón de superficie (BioCore) utilizando anticuerpos y superantígeno

La proteína de fusión sc-TCR/gen VIII se caracrterizó utilizando resonancia de plasmón de superficie. La técnica se describe más plenamente en la solicitud de patente U.S. No. de Serie 08/813.781 pendiente. Como se describe en la solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813.781, los datos indican que aunque los dos mAbs anti-TCR reconocen epítopes diferentes, exhibían un impedimento estérico que impedía la fijación de ambos mAbs a la cadena beta en este formato de ensayo. Para demostrar la presencia de la proteína pVIII del bacteriófago en la proteína de fusión sc-TCR, se fijó la sc-TCR por medio del anticuerpo anti-M-13. La fijación del SAg de estreptococo conocido como SEC3 (Toxin Tecnology, Tampa, FL) a la fusión sc-TCR/gen VIII se describe también en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813.781. Estos datos, junto con los datos de fijación de anticuerpo demuestran que la sc-TCR producida por E. coli está plegada correctamente.

3. Purificación de la sc-TCR DO11.10

Métodos para purificar proteínas de fusion sc-TCR han sido descritos en las Solicitudes de Patente U.S. núms. de Serie 08/813.781 y 08/943.086 pendientes. La sc-TCR DO11.10 puede purificarse por dichos métodos, con inclusión del método específico siguiente:

La proteína de fusión codificada por el vector pSUN23 se purificó a partir de las células transformadas por cromatografía de inmunoafinidad de acuerdo con métodos convencionales. Resumidamente, la purificación se realizó por fabricación de una columna de afinidad mediante acoplamiento de 4 mg de anticuerpo anti-idiotipo, KJ1 por ml de cuentas de Sepharosa recubiertas con proteína A (Pharmacia). Se prepararon lisados de E. coli por solubilización de 50 g de pasta de células derivada de fermentador en 600 ml de tampón de solubilización. Las células resuspendidas se lisaron mediante dos pasos a través de una prensa francesa. El material insoluble se separó por centrifugación a 27.000 g durante 30 minutos y el sobrenadante se aplicó a una columna de intercambio de anión de Q-Sepharosa. La proteína sc-TCR se recogió en la corriente de flujo directo y se aplicó posteriorsmente a la columna de anticuerpo. La sc-TCR fijada se eluyó con un tapón de glicina 50 mM, pH 11,0, y las fracciones que contenían proteína se utilizaron para caracterización.

Las preparaciones de proteína sc-TCR se evaluaron en cuanto a pureza por electroforesis sobre un gel SDS-PAGE seguido por tinción con azul brillante Coomassie. La integridad de la proteína se determinó por inmunotransferencia utilizando el anticuerpo H57-597 o el anticuerpo anti-marcador Glu-Glu (EE) como sonda. Finalmente, se sondó una parte alícuota de sc-TCR purificada en condiciones reducidas y no reducidas y, después de transferencia de proteínas, la membrana se sondó con el anticuerpo anti- marcador EE. Los resultados de la transferencia Western indicaron que la sc-TCR purificada estaba presente como monómero, dado que tanto las muestras reducidas como las no reducidas migraban con el marcador de peso molecular de 46 kD.

Ejemplo 4 Construcción de 145-2Cl 1sc-Fv

La línea de células de hibridoma de anticuerpos monoclonal CD-3-épsilon anti-murino 145-2C11 se adquirió de la American Type Culture Collection (véase Leo et al., PNAS, 1987). La secuencia de DNA de las regiones codificantes de la cadena variable del anticuerpo están disponibles de la web mundialmente.

La Sc-Fv se diseñó como un constructo génico VL-enlazador-V_{H}. (Véase Jost et al., J. Biol. Chem., 1994). En primer lugar, se diseñó un enlazador más corto (G_{4}S)_{3} y se fabricó por reasociación de oligonucleótidos complementarios KC245 y KC246 para formar un fragmento de DNA 5'SpeI-3'XhoI. Se digirió por restricción pKC60 con las enzimas de restricción apropiadas para desprender el fragmento de DNA enlazador previo y permitir la ligación con los oligonucleótidos reasociados.

Para preparar DNA codificante de las regiones V del mAb, se aisló mRNA a partir de 10^{6} células de hibridoma 145-2C 11 utilizando el kit de RNA total RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se fabricó cDNA de la cadena V_{H} por incubación de una mixtura que contenía el iniciador "de respaldo" KC244 junto con el mRNA 145-2C 11. Se añadieron cantidades estándar de nucleótidos y transcriptasa inversa a la mixtura para formar cDNA. El cDNA de la cadena VH se fabricó de manera similar con la excepción de que el iniciador "de respaldo" KC253 se utilizó en lugar del iniciador KC244. Se utiilzó cDNA de la cadena VL como molde con los iniciadores KC243 y KC244 en una reacción PCR para amplificar un fragmento de la cadena V_{L} 5'SfiI-3"SpeI de 320 pb. Se utilizó cDNA de la cadena V_{H} como molde con los iniciadores KC247 y KC253 de manera similar para amplificar un fragmento de cadena VH 5'XhoI-3"XmaI de 50 pb.

Los fragmentos de cadena V_{L} y V_{H} se clonaron en el sistema vector pGEM-T Easy para determinación de la secuencia de DNA. Los fragmentos correctos se digirieron por restricción y se clonaron en el vector de expresión pKC60 que contenía ya la secuencia enlazadora más corta arriba descrita.

Una vez que la Sc-Fv 145-2C11 estaba completa, el constructo de DNA se reamplificó por PCR con enlazadores KC250 y KC251 para generar un fragmento de DNA 5'BspEI-3'NruI. El fragmento se clonó en el Sistema Vector pGEM-T Easy para determinación de la secuencia de DNA. El DNA correcto se digirió luego por restricción y se clonó en el "vector lanzadera" aguas abajo de la sc-TCR. Véanse las Figuras 1C-1D para ilustraciones de las moléculas 145-2C11 sc-Fv (IC) y sc-Fv F23.1 (ID).

Ejemplo 5 Diseño de la Secuencia Enlazadora de la Molécula sc

Para conectar las sc-TCR y scSc-Fv juntas como una proteína de fusión monocatenaria, se diseñaron dos secuencias enlazadoras diferentes. Una serie de oligonucleótidos reasociados, KC209 y KC210, codificaban parte del dominio CH1 de la cadena pesada de murino seguida por la secuencia estándar (G4S). Se diseñó análogamente una segunda secuencia enlazadora más corta pero sin el dominio CH1 utilizando oligonucleótidos reasociados KC295 y KC296. Los oligonucleótidos se reasociaron para generar un fragmento de DNA 5'HpaI-3'BspEI. El "vector lanzadera" se digirió con las enzimas de restricción apropiadas para desprendeer el fragmento de DNA enlazador previo y hacer posible la ligación de cualquiera de las dos nuevas secuencias enlazadoras entre la sc-TCR y la Sc-Fv.

Ejemplo 6 Adición de un marcador peptídico 3' al constructo de la molécula sc

En el diseño de "vector lanzadera" expuesto anteriormente, se introdujeron un codón de parada y un sitio de corte y empalme entre los sitios de restricción NruI y ClaI como parte de la amplificación por PCR de la sc-TCR con el iniciador "posterior" KC208. Para facilitar la purificación aguas abajo de la proteína sc biespecífica, se diseñaron una serie de oligonucleótidos reasociados (KC237 y KC238) para introducir un marcador 3' EE (EEEEYMPME; SEQ ID No. 7) con codón de parada y sitio de corte y empalme. El par de oligonucleótidos reasociados se clonó 5'NruI-3'ClaI en el "vector lanzadera" que codificaba ya la molécula sc biespecífica completa. Alternativamente, se reasociaron oligonucleótidos KC239 y KC240 (sitio de corte y empalme únicamente) y se clonaron análogamente para permitir la expresión de la molécula sc biespecífica como una proteína de fusión de la cadena ligera kappa de murino.

Ejemplo 7 Copmpleción de la molécula sc biespecífica p149

Después de clonación de la sc-TCR, el enlazador, y los fragmentos de DNA marcadores en el "vector lanzadera" para completar el diseño de la molécula sc biespecífica, el DNA se digirió por restricción (AgeI-ClaI) y se clonó en el vector de expresión de células de mamífero pSUN27 (Fig. 5) (descrito previamente en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/943.086 pendiente) para crear pBISP/149 (Fig. 6).

Ejemplo 8 Construcción de la molécula de fusión sc-TCR/IgG p149

Se ha reconocido que la expresión de la scSc-Fv 145-2CII sola, es decir, no formando parte de una molécula sc biespecífica, es muy baja. Sin desear quedar ligados por la teoría, el bajo nivel de expresión de sc-Fv puede ser un factor limitante en la expresión de moléculas biespecíficas. Se utilizó la línea de células de hibridoma 145-2C11 nativa se utilizó como fuente de anticuerpos y se transfectaron células con sc-TCR fusionada a la cadena pesada de murino IgG2b (Fig. 7A-7B). La línea de células de hibridoma transfectada debería secretar algunas moléculas quiméricas 145-2C11/sc-TCR si la IgG de hámster del hospedador puede aparearse eficientemente con la cadena pesada IgG2b de murino.

Para clonar la sc-TCR p149 como una fusión IgG, se mutó primeramente un sitio de restricción interno EcoRI utilizando mutagénesis orientada. Resumidamente, se diseñaron un par de oligonucleótidos complementarios, KC293 y KC294, que contenían la mutación deseada. El constructo de DNA pNAG2 se amplificó por PCR con los iniciadores utilizando DNA-polimerasa de Pfu. El producto PCR resultante se digirió con DpnI que digiere el molde de DNa paterno, dejando el DNA mutado intacto. El DNA de sc-TCR mutado se secuenció y se reamplificó luego por PCR con iniciadores KC276 y KC268 para generar un fragmento de DNA 5'NruI-3'EcoRI. El DNA de sc-TCR mutado se clonó en el Sistema Vector pGEM-Teasy para determinación de la secuencia de DNA. El DNA de sc-TCR correcto se digirió por restricción y se clonó en el vector de expresión de células de mamífero pSUN7 para crear la molécula de fusión sc-TCR/IgG de p149.

Ejemplo 9 Construcción de la molécula de fusión sc-TCR/IgG DO 11.10

El constructo de DNA pKC60 se reamplificó por PCR con iniciadores KC275 y KC278 para generar un fragmento de DNA 5'NruI-3'EcoRI. El fragmento sc-TCR se clonó en el Sistema Vector pGEM-T Easy para determinación de la secuencia de DNA. El DNA de sc-TCR correcto se digirió por restricción y se clonó en el vector de expresión de células de mamífero pSUN7 para crear la molécula de fusión sc-TCR/IgG DO11.10 (véanse las Figuras 7A y 7B).

Ejemplo 10 Construcción del Vector de Expresión de Murino IgG2b

La construcción del vector de expresión de murino IgG2b (cadena pesada) se realizó como sigue. La cadena principal del vector era el plásmido pCDNA3 (Invitrogen). El plásmido se cortó con HindIII y XhoI, y se insertó un fragmento de DNA "polienlazador de cadena ligera" para crear el "vector de cadena ligera" pCDNA3.LCPL. Este enlazador contenía los sitios de restricción HindIII, KpnI, ClaI, PmlI, EcoRV, XmaI, BarnHI, y XhoI para facilitar los pasos de clonación subsiguientes. Un fragmento de DNA SmaI-BclI que contenía un conductor de la cadena ligera, fragmento genómico de la cadena ligera kappa anti-CKMB de ratón, y 3'UTR se clonó en los sitios EcoRV-BarnHI de pCDNA3.LCPL. La mutagénesis se realizó luego para eliminar un NruI-MluI, y el sitio BstBI y para introducir un sitio NheI y BarnHI con objeto de crear el plásmido pCDNA3mut.LCPL.LCVK.

El "vector de la cadena pesada" pCDNA3mut.HCPL se construyó a partir del plásmido pCDNA3mut.LCPL.LCVK por reemplazamiento de la región de expresión de la cadena ligera (HindIII-XhoI) con un "polienlazador de la cadena pesada" constituido por los sitios de restricción HpaI, BspEI, EcoRV, KpnI, y XhoI. Este plásmido se digirió con EcoRV y KpnI. Un fragmento de DNA digerido con SmaI-KpnI que contenía un conductor de la cadena pesada y un fragmento genómico de la cadena pesada de ratón anti-CKMB IgG2b de ratón (véase Near et al., Molecular Immun., 1990) se ligó luego al plásmido digerido con EcoRV-KpnI. Un fragmento de nucleótido KpnI-SalI que contenía un 3'UTR y un sitio NotI aguas arriba del sitio SalI se clonó subsiguientemente en el plásmido digerido con KpnI-XhoI (silenciando el sitio XhoI) para crear el plásmido pCDNA3mut.HCPL.HCV2b, conocido también como el vector de expresión de murino IgG2b pSUN7 (Fig. 8).

Ejemplo 11 Expresión de Moléculas sc biespecíficas

Se prepararon células CHO por transfección mediante lavado con DPBS frío. Las células se resuspendieron en DPBS y se mezclaron con 10-40 \mug de pBISP-149 o pBISP/DO11.10 linealizado con PvuI. Después de 5 minutos sobre hielo, las células se sometieron a electroporación utilizando un equipo Gene Pulser (BioRad) para suministrar un pulso de 250 voltios, 970 \muFd o 0,25 \muFd. Las células mutadas se mantuvieron en hielo durante 5 minutos. Las células se diluyeron en 10 ml de medio IMDM al 10% (IMDM, 10% FBS, glutamina 2 mM, 5000 unidades/ml de penicilina, 5000 \mug/ml de estreptomicina) y se cultivaron en un matraz T25 cm^{2} TC a 37ºC con 10% de CO_{2}. Al día siguiente, las células se extendieron en placas de 96 pocillos con medio selectivo de neomicina (IMDM al 10% más 0,75 mg/ml de G418) y se realimentaron cada 3-7 días.

Los transfectantes se seleccionaron respecto a la expresión de moléculas sc biespecíficas solubles en un formato de ensayo ELISA. Las moléculas marcadas con EE se detectaron utilizando un anticuerpo anti- marcador EE recubierto pasivamente durante la noche en una placa de 96 pocillos. El día del ensayo, las placas se bloquearon con 10% FBS/PBS durante 1 hora. Los pocillos se lavaron y el sobrenadante de los transfectantes se añadió a la placa. Después de incubación y lavado, se añadieron a la placa mAb anti-C beta biotinilado, H57-597 (la línea de células se adquirió de la ATCC), seguido por lavado e incubación con estreptavidina-HRP (Sigma). Los pocillos positivos se identificaron por la adición de sustrato TMB, se extinguieron con ácido sulfúrico 1M, y se leyeron a una absorbancia de 450 nM. Se seleccionó un pequeño número de clones positivos para expansión y se lleva a cabo clonación por dilución limitante para establecer la línea de células transfectadas establemente (Figuras 9A-9B).

Los transfectantes se seleccionaron también respecto a la expresión de moléculas sc biespecíficas en un formato de ensayo ELISA utilizando mAbs que reconocen específicamente la sc-TCR, seguido por detección con mAb anti-C beta biotinilado y estreptavidina-HRP. Para la molécula sc biespecífica sc-TCR p149, se utilizó un mAb conformacional para el dominio V alfa (B20.1, Pharmagen), como el anticuerpo de recubrimiento. Las moléculas sc biespecíficas DO11.10 podían detectarse utilizando el mAb anti-idiotípico, anti-DO11.10 TCR KJ-1 (Figuras 9A-B, 10A-B). Los clones positivos se detectaron como se ha descrito arriba, se expandieron y se clonaron primariamente para esclarecer líneas de células transfectadas establemente. Se ha encontrado que las moléculas sc-BISP se expresan a niveles altos en células de mamífero (1 a 2 mg/l).

La información siguiente será útil para la comprensión de las Figuras 9A-B, 10A-b:

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Ejemplo 12 Expresión de moléculas biespecíficas quiméricas

La línea de células de hibridoma 145-2CI1 se transfectó con DNA de fusión sc-TCR/IgG p149 o DNA de fusión sc-TCR/IgG de DO11.10 utilizando el mismo método que se ha descrito arriba para la transfección de moléculas sc biespecíficas.

Se seleccionaron transfectantes para expresión de moléculas biespecíficas quiméricas solubles en un formato de ensayo ELISA. Placas de 96 pocillos se recubrieron pasivamente con IgG2b anti-ratón de cabra (Caltech). Los pasos de incubación y lavado se realizaron como se ha descrito arriba. Se utilizó IgG-HRP anti-hámster de cabra (Jackson Immuno) para sondar los pocillos (Fig. 11). Las colonias positivas se identificaron, expandieron y clonaron primariamente para establecer líneas de células transfectadas de manera estable.

La siguiente información será útil para la comprensión de la Fig.11.:

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Ejemplo 13 Purificación de la proteína sc biespecífica

Se purificaron proteínas sc biespecíficas a partir de los sobrenadantes transfectantes utilizando métodos estándar de cromatografía de afinidad. Para las proteínas marcadas con EE, se utilizó una columna de agarosa acoplada a CNBr con anti-marcador EE para enriquecimiento en moléculas sc de longitud total. Se pasó el sobrenadante a través del lecho de la columna una o más veces. Después de lavado con PBS, la proteína fijada se eluyó de la columna por la adición de tampón bicarbonato de sodio/carbonato de pH alto y se neutralizó por la adición de una dilución 1 a 10 de Tris 2M, pH 8,0. La proteína purificada se cambió de tampón a PBS utilizando una unidad de concentración con punto de corte por MW 30 kD. La concentración final de proteína se determinó por una lectura de DO280. El análisis por transferencia Western (sondado con anticuerpo anti-marcadorEE) (Fig. 12) y tinción con azul Coomassie de la proteína purificda (Fig. 13) demuestran el enriquecimiento en la proteína sc biespecífica de longitud total.

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Ejemplo 14 Estimulación por la molécula sc biespecífica de las células de hibridoma T

Se realizaron ensayos de estimulación de células de hibridoma T para evaluar si las moléculas sc biespecíficas exhibían actividad biológica. Los autores de la presente invención desarrollaron un sistema modelo de trabajo utilizando el hibridoma de células T murinas 2B4 (Matsui, et al., PNAS, EE.UU. (1994) 91, 12862). El hibridoma de las células T 2B4 tiene una /\beta TCR constituida por V11.0 y V\beta3.0, y reconoce los residuos de aminoácidos 88-104 del citocromo C de paloma presentado en el contexto de la molécula IE^{k} del MHC Clase II. Varios Abs inmovilizados diferentes, específicos para la TCR DO11.10 o 149 se ensayaron en cuanto a reactividad cruzada con la TCR 2B4, pero resultaron no reactivos frente a la TCR 2B4. Si un Ab inmovilizado demostrara reactividad cruzada para la TCR 2B4, podía esperarse que se observaría estimulación de las células de hibridoma T y secreción de L-2 en el sobrenadante de cultivo. El Abs evaluado incluía dos TCR específicas para 149, los anti-V2 y anti-V\beta11, y dos específicos para la TCR DO11.10, los anti-V\beta8.0 (F23.1) y el mAb anti-idiotípico (KJ-1). Asimismo, los autores de la invención evaluaron IA^{d}/OVA inmovilizado (el MHC/péptido cognado para la TCR DO11.10), pero no observaron estimulación alguna. Se inmovilizaron luego estas moléculas y se evaluó la actividad de las moléculas sc biespecíficas DO11.10 y 149. Para ensayar la molécula sc biespecífica DO11.10-2C11, se recubrieron los pocillos con KJ-1 o F23.1. Después de incubación durante 1 noche con 10^{5} células 2B4 utilizando cantidades diferentes de biespecífica [sic] se ensayó el sobrenadante en cuanto a la presencia de IL-2 que es un buen indicador de la estimulación celular. Como se muestra en Fig. 13, KJ-1 inmovilizada activaba efectivamente las células de hibridoma. Para evaluar si podría producirse una respuesta similar cuando se utilizaba IA^{b}/OVA inmovilizado, se incubaron a continuación las células 2B4 con moléculas biespecíficas durante una noche en presencia de IA^{d}/OVA fijado a placas. La presencia de IL-2 en el sobrenadante no se detectó en el ensayo ELISA de IL-2 (Fig. 14) lo que sugería que la TCR en la biespecífica [sic] no captura el ligando MHC/péptido de una manera suficiente para estimulación de las células. Basándose en estos descubrimientos y varios otros, los autores de la presente invención propusieron que puede ser esencial mejorar la avidez de las moléculas sc biespecíficas por dimerización utilizando un anticuerpo específico para la TCR pero que no interfiera con la fijación biespecífica al MHC/péptido. En el presente ejemplo, se eligió el mAb MR5-2 (PharMingen) que tiene especificidad para un epítope en V\beta8.2. Después de ensayar en estas condiciones modificadas, se observó una señal en los pocillos que contenían IA^{d}/OVA inmovilizado, pero no detectaron señal alguna en los pocillos en blanco. Adicionalmente, en los pocillos recubiertos con mAb KJ-1 el efecto de reticulación de la molécula sc biespecífica generaba una producción mayor de IL-2, lo que sugiere que la dimerización de la molécula sc biespecífica conduce quizás a una señalización y estimulación más fuerte y/o diferente (Fig. 15).

La información siguiente será útil para la compresión de lasFiguras 14 y 15:

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Para evaluar la molécula sc biespecífica 149-2C 11-marcador EE, se recubrieron pocillos con mAb anti-V2.0 o anti-V\beta11.0. Los pocillos en blanco se utilizaron como controles ingenuos. Los descrubrimientos generados en estos experimentos fueron similares a los consignados para las moléculas sc biespecíficas DO11.10-2C11 y demostraban que únicamente en presencia de Ab inmovilizado específico para la TCR 149 se observaba de hecho la producción de IL-2 (Fig. 16). Adicionalmente, en este Ejemplo, se demostró que la reticulación por el biespecífico [sic] para estimular los hibridomas T podría bloquearse eficazmente utilizando F(ab)'_{2} anti-CD3 145-2C 11 soluble. Estos descubrimientos argumentan a favor de las moléculas sc biespecíficas funcionales y demuestran que la porción anti-CD3 del biespecífico actúa por fijación directa a la molécula CD3 en las células T (Fig. 16).

La información siguiente será útil para la compresión de Fig. 16:

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Ejemplo 15 Análisis citométrico de flujo para Estudios de Fijación Directa de Células

Para demostrar la funcionalidad de la porción scSc-Fv de la molécula sc biespecífica, se utilizaron células T de hibridoma 2B4 en estudios de fijación con la proteína purificada. Las células 2B4 presentan CD3 en su superficie y la sc-Fv 145-2C11 plegada correctamente debería reconocer CD3\varepsilon. Para cada muestra de ensayo, se lavaron 10^{6} células 2B4 con DPBS frío y se resuspendieron en 40 \mul de FBS/DPBS al 1% (tampón de resuspensión y lavado) con o sin la adición de proteína sc biespecífica purificada. Después de incubación en hielo, las células se centrifugaron suavemente y se resuspendieron con 0,5 \mug de anticuerpo biotinilado (pBISP/149 se incubó con un anticuerpo para el dominio Va2 (B20.1); pBISP/DO11.10 se incubó con un anticuerpo para el dominio V\beta8 (F23.1).) Las muestras se incubaron en hielo, se centrifugaron, y se resuspendieron con estreptavidina-Cychrome (Becton Dickenson). Después de dos lavados, las células se resuspendieron de nuevo y se adquirieron/analizaron luego en un instrumento FACScan (Becton Dickenson) utilizando soporte lógico CellQuest (Becton Dickenson).

La incubación de células 2B4 con la proteína purificada pBISP/149 o pBISP/DO11.10 dio como resultado desplazamientos importantes en la tinción celular. A medida que se añadía más proteína sc biespecífica, el desplazamiento en fluorescencia era más pronunciado, demostrando la capacidad de la scSc-Fv para fijarse al CD3 en la superficie celular (Figs. 17-18).

La fijación de CD3 es específica y puede bloquearse por la adición de anti-CD3 soluble que compite con las moléculas sc biespecíficas para los sitios de fijación en la superficie de las células 2B4 (Fig. 19).

Las Figuras 17-19 se comprenden más plenamente a la vista de las Tablas I, II y III siguientes, a continuación.

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TABLA 1 Figura 17

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TABLA 2 Figura 18

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TABLA 3 Figura 19

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Ejemplo 16 Ensayo de proliferación de células T

Se realizó un ensayo de células T para determinar si la molécula sc-Bisp 149 podría mediar la activación de células T específicas. Se realizó un ensayo de proliferación utilizando células T cultivadas durante largo tiempo, que se cultivaron en presencia de células diana sin pulsar o pulsadas con el péptido 149 T2 (29) que se habían fijado en paraformaldehído al 1% antes de ser utilizadas en el ensayo. Se seleccionaron las condiciones para probar si la molécula sc-Bisp 149 podía activar las células T para proliferar cuando se incubaban con células diana T2 sin pulsar o pulsadas con el péptido p149. El ensayo se llevó a cabo como sigue. Resumidamente, se utilizaron bazos aislados de ratones BALB/c para preparar suspensiones de esplenocitos. Los RBCs se lisaron utilizando solución de Gey y los esplenocitos recuperados se cultivaron luego durante 10-15 días a razón de 1,25 x 10^{6} células/ml en medio IMAM complementado con Suero Bovino Fetal (FBI) al 10% que contenía 50 U/ml de rIL-2 murina. El medio se cambió cada 3 días y las células no adherentes se recuperaron, se contaron y se suspendieron de nuevo a razón de 1,25 x 10^{6} células/ml. Antes de utilizar las células en el ensayo de proliferación, se aislaron células vivas en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. Los cultivos se incubaron durante 3 días y se midió la proliferación de las células T utilizando el reactivo de proliferación colorimétrico WST-1 (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como se muestra en Fig. 20, únicamente las células T incubadas en presencia del biespecífico y las células T2 cargadas con el péptido 149 demostraron proliferación significativa, en tanto que los cultivos incubados en ausencia del péptido 149 o de la molécula scBishp 149 no exhibían proliferación. Estos datos eran importantes, dado que ilustran la "prueba de principio" de que sc-TCR utilizada en un formato de molécula híbrida scBisp puede mediar la respuestas de las células T para las células diana que presentan HLA-A2 y el péptido específico.

Los esplenocitos se prepararon a partir de bazos aislados de ratones Balb/c. Resumidamente, se separaron RPCs por lisis utilizando solución de Gey y los esplenocitos recuperados se cultivaron luego durante 10-15 días a razón de 1,25 x 10^{6} células/ml que contenía 50 U/ml de rIL-2 murina. Se cambió el medio cada 3 días y se recuperaron las células no adherentes, se contaron y se resuspendieron a razón de 1,25 x 10^{6} células/ml. Antes de utilizar las células en el ensayo de proliferación, se aislaron las células vivas (fundamentalmente las células T) en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque. En este ejemplo, se ensayó si la molécula sc 149-2C11 podría reconocer eficazmente y fijarse a MHC cognado/péptido en la presentación de células y facilitar la reticulación y activación de las células T. El ensayo de proliferación se llevó a cabo utilizando células T cultivadas a largo plazo, que se cultivaron en presencia de células diana T2 no pulsadas o pulsadas con el péptido 149 que se fijaron luego en paraformaldehído al 1% antes de ser utilizadas en el ensayo. Los cultivos se incubaron durante 3 días y se midió la proliferación de las células T utilizando el reactivo de proliferación colorimétrico WST-1 (Boehringer Mannheim) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de incubación durante 1 hora a 37ºC, se transfirieron 100 \mul de sobrenadante a una placa de fondo plano para lectura a longitud de onda dual (450-620 nary) [sic]. Como se muestra en la Figura 29, las células T incubadas en presencia del biespecífico y las células T2 cargadas con el péptido 149 demostraron una proliferación significativa, en tanto que los cultivos incubados en ausencia del péptido 149 o del biespecífico no exhibían proliferación significativa alguna. Estos datos respaldan los resultados de estimulación del hibridoma T arriba descritos y sugieren que la molécula sc biespecífica 149-2CI I es biológicamente activa.

Ejemplo 17 Perfilado de la Producción de citoquinas

Otro parámetro importante a evaluar es la capacidad de las molécula sc biespecífica para mediar la respuesta de citoquinas. La producción de citoquinas puede detectarse por un ensayo ELISA específico para la citoquina de interés. Placas de 96 pocillos se recubren pasivamente con anti-citoquina "A" durante una noche. El día del ensayo, los pocillos se bloquean con FBS 10%/PBS durante una hora antes de añadir sobrenadante procedente del experimento de tipo proliferación. Los pocillos se sondan con anti-citoquina "A" biotinidada seguido por incubación con estreptavidina-HRP. Los pocillos positivos se detectan por adición de sustrato ABTS y se leen a una absorbancia de 405 nM.

La producción de citoquinas puede examinarse también intracelularmente utilizando un protocolo de permeabilización de saponina. Las células se fijan con formaldehído y se tiñen luego para la citoquina de interés en presencia de saponina al 0,5%. Las muestras pueden analizarse luego utilizando citometría de flujo.

Ejemplo 18 Medida de la actividad citotóxica in vitro

Uno de los parámetros más importantes a medir será si la molécula biespecífica sc puede mediar la destrucción de la diana o células tumorales. Estos ensayos se llevarán a cabo utilizando un ensayo estándar de destrucción de CTL con liberación de Cr^{51}. El ensayo se llevará a cabo como sigue: Las células diana (es decir tumores) se marcan primeramente con el isótopo Cr^{51}. El Cr^{51} es absorbido por las células tumorales y se libera en el sobrenadante de cultivo después de lisis celular por las células T citotóxicas activadas específicamente. El Cr^{51} libre o liberado se cuenta luego y se determina la lisis de las células específicas. Se utilizará este tipo de ensayo para evaluar la capacidad de la molécula sc 149-2C11 para mediar la lisis de las células diana. En el presente ensayo, se utilizarán líneas de células tumorales (es decir MDA-238, BT-549, y MCF-7 disponibles de la ATCC) que se sabe expresan HLA-A2 en la superficie y producen niveles incrementados de p53 de tipo salvaje. Los controles incluirán líneas tumorales negativas a A2 (Ramos) y líneas de células positivas a A2 pero negativas a p53 (Saos-2).

Ejemplo 19 Generación de moléculas biespecíficas por reticulación química a dendrímeros

Para construir la molécula biespecífica utilizando un enfoque de reticulación química, se utilizaron el mAb 2C11 y el scTCR DO11.10. En lugar de reticular directamente las dos moléculas, se utilizaron dendrímeros como entramado para fijar las moléculas. Los dendrímeros son poliaminas cargadas positivamente que se sintetizan de modo uniforme. Dado que el tamaño y la forma de cada dendrímero derivado durante la síntesis es exactamente el mismo, la adición de proteínas al dendrímero da como resultado la formación de moléculas homogéneas. El dendrímero es también inerte y soluble en condiciones fisiológicas. Se digirió con pepsina mAb 2C11 de longitud total para producir fragmentos F(ab)'_{2} que se aislaron por filtración en gel. El pico F(ab)'_{2} se agrupó y se sometió a intercambio de tampón, y se produjeron moléculas Fab' por incubación de la preparación F(ab)'_{2} en condiciones de reducción suaves seguido por purificación en una columna de clasificación. Las moléculas Fab' aisladas se acoplaron luego directamente mediante grupos sulfidrilo libres a dendrímeros derivatizados con (4-yodoacetil)-aminobenzoato de sulfo-succinimidilo (sulfo-SIAB) en una relación de 1 Fab' a 1 dendrímero derivatizado con SIAB. Se generaron grupos reactivos con aldehído en los residuos carbohidrato terminales de la molécula scTCR DO11.10 para acoplamiento a los grupos amino libres en los dendrímeros. La scTCR se acopló al dendrímero Fab' 2C11 en una relación 1:1 para producir una molécula biespecífica. La molécula biespecífica se evaluó respecto a su capacidad para activar las células de hibridoma T en un ensayo de estimulación. Se desarrolló un sistema modelo de trabajo utilizando el hibridoma 2B4 de células T murinas. Véase Davis, M.M. et al. Ciba Fund. Symp. (1997). El hibridoma de células T 2B4 tiene un /\betaTCR constituida por V11,0 y V\beta3,0 y reconoce los residuos de aminoácidos 88-104 del citocromo C de paloma presentado en el contexto de la molécula IE^{k} del MHC clase II. Cuando se añadió el biespecífico/dendrímero a pocillos que contenía células T 2B4 se consignaron niveles altos de IL-2, lo que indicaba que se había producido estimulación. El análisis ulterior reveló que la carga positiva fuerte en el complejo dendrímero causaba fijación inespecífica para la superficie de las células T, dando como resultado estimulación.

Ejemplo 20 Modelos de ratón: Evaluación de la actividad de la molécula biespecífica in vivo

Se han establecido 3 modelos de murino diferentes establecidos a fin de evaluar la actividad potencial de supresión de tumores de las moléculas biespecíficas. El primer modelo incluye la utilización de una cepa de ratón normal (a saber, ratón Balb/c) e inyección en este ratón de células EL-4 transformadas con pS3/HLA-A2. Estas células tumorales proliferan rápidamente y en el transcurso de unos pocos días matan al ratón. Se utilizará inicialmente el protocolo de tratamiento siguiente. Para evaluar la molécula biespecífica de los autores de la invención se pretratarán ratones con 0,5 mg de molécula sc biespecífica 149-2C11 el día 0. Al día siguiente, los ratones recibirán una segunda dosis de la molécula sc biespecífica junto con las células EL-4 transfectadas positivas para p53/A2. El parámetro principal a medir en este modelo será si los ratones que reciben la molécula biespecífica sobreviven durante un periodo de tiempo más largo que los ratones de control (aquellos que no reciben la molécula biespecífica). Dado que las líneas de tumor EL-4 exhiben dicho crecimiento rápido, puede ser necesario modificar el régimen de tratamiento para que pueda observarse cualquier tiempo de supervivencia incrementado con la molécula biespecífica sc.

El segundo modelo utilizará rsatones SCID implantados con tumores murinos transfectados para expresar HLA-A2 y p53 humana de tipo salvaje. Este modelo se realiza usualmente a lo largo de 2 a 3 semanas. Resumidamente, después de implantar los tumores, puede medirse el crecimiento del tumor e introducir luego en estos ratones células T CD8+ murinas purificadas e inyectar cantidades diferentes de la molécula biespecífica. En algunos casos, será necesario pre-activar las células T y esto se llevará a cabo por incubación de células T in vitro en presencia de rIL-2. Se evaluará luego el efecto sobre el crecimiento del tumor y el cambio del tiempo de supervivencia para determinar si la molécula sc biespecífica tiene la actividad antitumoral in vivo.

El tercer modelo y más relevante evaluará la capacidad de la molécula sc biespecífica para mediar la destrucción de tumores humanos in vivo. Se implantar ratones SCID con líneas de carcinoma de mama humano (es decir MDA-238, BT549, MCf-7) y se dejarán crecer durante 4 a 6 semanas. Posteriormente las células T purificadas y poblaciones de subconjuntos pre-activadas in vivo con rIL-2, se introducirán en los ratones. La actividad antitumoral potencial se evaluará por medida de la reducción del tumor y el tiempo de supervivencia incrementado. Estos estudios se utilizarán para determinar si una versión "humanizada" de la molécula biespecífica debería construirse.

Ejemplo 21 Molécula sc biespecífica "humanizada"

Dado que el anticuerpo utilizado en la molécula sc biespecífica corriente de los autores es específica para CD3\varepsilon murino, será preciso modificar el mismo para uso en el tratmeinto de neoplasmas humanos. Adicionalmente, si se utiliza tecnología de hibridoma, se aislarán muy probablemente mAbs murinos específicos para TCRs o CD3 humana que tendrá que sufrir "humanización". La humanización se logrará realizando injerto de CDR. Esto tiene usualmente el efecto negativo de disminuir la avidez de fijación del Ab. La TCR puede "humanizarse" fundamentalmente por intercambio del dominio constante C beta con la región constante humana C beta.

Ejemplo 22 Presentación de las proteínas de fusión sc-TCR en bacteriófagos

Como se describe en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781 pendiente, es posible presentar una diversidad de constructos sc-TCR en la superficie del bacteriófago fd. Resumidamente, la solicitud de patente pendiente describe métodos de expresión de una sc-TCR de 3 dominios deseada como una fusión con la proteína mayor de la cubeirta, pVIII, del fago filamentoso. La base racional para esto es aumentar la valencia de la sc-TCR en la superficie del fago, que debería dar como resultado un aumento en la avidez de sc-TCR/pVIII para el complejo MHC/péptido. Como se describe en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781, las proteínas de fusión sc-TCR en el bacteriófago exhiben una TCR funcional.

A. Caracterización de la proteína de fusión sc-TCR presentada 1. Datos de transferencia Western

Se han publicado muchos estudios que muestran proteínas de fusión scFv/pVIII expresadas en la superficie de fago. Véase Castagnoli et al., J. Mol. Biol., (1991), 222:301 y Huset et al., J. Immunol., (1992) 149:2914. La Solicitud de Patente U.S. pendiente No. de Serie 08/813781 describe métodos de producción y uso de bacteriófagos recombinantes específicos que presentan proteínas de fusión sc-TCR. En este caso, se utilizó análisis por transferencia Western para confirmar la presentación de la molécula sc-TCR/pVIII en la cubierta de la cápsida del fago. Resumidamente, se purificaron bacteriófagospor medio de un procedimiento de presentación estándar con polietilenglicol (PEG), y subsiguientemente una parte alícuota del fago purificado se corrió en un gel SDS-PAGE. La fusión sc-TCR/pVIII se detectó en el fago recombinante (pero no el bacteriófago de control que expresaba sc-TCR sin el marcador EE) por sondeo de las membranas con un mAb contra la secuencia del marcador EE. Aunque se observaron varias bandas más pequeñas que representaban productos de descomposición de la fusión sc-TCR, la presencia de una banda de proteína de 50 kD indicaba que se había incorporado un \alpha/\beta ac-TCR de longitud total en la cápsida del fago.

2. Datos ELISA

Como se describe en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781 pendiente, pueden utilizarse ensayos ELISA para caracterizar bacteriófagofago recombinante que incluye una proteína de fusión sc-TCR deseada. La integridad de conformación de la cadena V\beta8.2 se evaluó utilizando dos mAbs dependientes de la conformación, MR5-2 y F23.1; y se evaluaron el plegamiento preciso de los dominios de V\alpha13.1, J\alpha DO, V\beta8.2, D\beta1, y J\beta1.1 que forman la bolsa de fijación CDR3 del receptor, utilizando el anti-idiotipo mAb KJ1. Se consideró la señal del ruido de fondo como la fijación de fago a pocillos recubiertos con BSA o mAb anti-V\beta17 y se sustrajo de la señal total observada. Los 4 anticuerpos reaccionaban específicamente con el TCR de fago, lo que indicaba que la fusión sc TCR/pVIII se presentaba en el fago en orientación apropiada.

B. Lavado en batea del fago

El lavado en batea de anticuerpos y genotecas de péptidos está firmemente establecido como método para seleccionar fiablemente moléculas de fijación específicas, Greenwood supra. Métodos para lavado en batea de bacteriófago que presentan proteínas de fusión sc-TCR han sido descritos en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781 pendiente. Resumidamente, los métodos incluyen anticuerpo estándar, lavado en batea de células, y lavado en batea con complejos sc-MHC/péptido descritos en la Solicitud de Patente PCT No. U.S. 95/09816 publicada, así como en las Solicitudes de Patentes U.S. núms. de Serie 08/382454 y 08/596387. Los resultados de estos estudios de enriquecimiento están bien correlacionados con otros descubrimientos de lavado en batea de anticuerpos publicados. Véase, Winter et al., Ann. Rev. Immunol., (1994), 12.

C. Ensayo de bloqueo

Para caracterizar la especificidad de fijación MHC/péptido del fago portador de TCR, se realiza un ensayo de bloqueo competitivo. El ensayo de bloqueo competitivo ha sido descrito en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/943086. Resumidamente, el objetivo de este ejemplo era determinar si el fago portador de TCR podría competir con el TCR nativo en las células T de hibridoma DO11.10 respecto a fijación a los complejos MHC/péptido en un ensayo basado en células. Los resultados demuestran que el receptor DO11.10 en fago era funcional y era capaz de discriminar entre secuencias peptídicas diferentes.

Para eliminar la posibilidad de que el fago portador TCR hubiera afectado quizás a la producción de IL-2 en las células D11.10 de manera no específica, se recubrieron pocillos con mAb anti-CD3 épsilon para estimular los hibridomas a través de la molécula CD3 del complejo receptor de las células T para producir IL-2. Los resultados de los experimentos indican que el fago no tenía un efecto inhibidor inespecífico sobre las células T de hibridoma. Así pues, los sc-TCRs se presentan en la superficie del bacteriófago como moléculas funcionales que son capaces de interaccionar con dianas específicas MHC/péptido.

Ejemplo 23 Clonación y expresión del F23.1 scFv

Un componente preferido de las moléculas de fijación poliespecíficas descritas en esta memoria es un scFv con especificidad para una sub-población particular de receptores de células T. Como se ha expuesto, puede utilizarse un amplio espectro de moléculas sc-Fv diferentes de acuerdo con la presente invención.

Una molécula de fijación poliespecífica más específica es una molécula biespecífica que incluye una forma monocatenaria del mAb murino F23.1. Es posible clonar y expresar dicha scFv por técnicas estándar. El anticuerpo F23.1 nativo ha sido bien caracterizado (1) y se ha demostrado que activa las células T portadoras de V\beta8.2 por reticulación del TCR en su superficie, Hiller et al., Biochem. J., (1991) 278:573. La sc-Fv y scFv1 puede clonarse y expresarse por los pasos generales siguientes.

1. Síntesis de cDNA y clonación de los genes de las cadenas pesada y ligera de F23.1

La síntesis del cDNA de la primera cadena puede realizarse con mRNA aislado de células 107 F23.1. Utilizando el iniciador JS300 (GAAX_{1}TAX_{2}CCCTTGACCAGGC donde X_{1} = A, G y X_{2} = A, C, G; SEQ ID NO. 11), se sintetizó cDNA de la cadena pesada. Este iniciador codifica los dos primeros aminoácidos del dominio CH1 de la cadena pesada. El cDNA de la cadena ligera se sintetizó esencialmente del mismo modo excepto que se utilizó el iniciador OKA57 (GCACCTCCAGATGTTAACTGCTC; SEQ ID NO. 2) que es específico para el extremo 3' del entramado cuatro de la cadena kappa.

Se construyó DNA bicatenario por amplificación del cDNA como sigue. La cadena pesada se amplificó utilizando el juego de iniciadores PMC18 (anterior) (CCCGGGCCACCATGGX_{1}ATGX_{2}AGCTGX_{3}GTX_{4}ATX_{5}CTC, en donde X_{1} = A, G; X_{2} = C, G; X_{3} = G, T; X_{4} = A, C; X_{5} = C, G; SEQ ID NO. 13 y JS300 y la cadena ligera se amplificó utilizando el juego de iniciadores PMC14 (frontal) (CCCGGGCCACCATGGAGX_{1}CACAX_{2}X_{3}CTCAGGTC, en donde X_{1} y X_{3} son ___[sic] y X_{2} es G, T; SEQ ID NO. 44) y OKA57. Los productos PCR amplificados se clonaron luego en el vector pGEMT-Easy (Promega) y se sometieron a determinación de la secuencia de nucleótidos. Un paso subsiguiente consistirá en clonar las cadenas pesada y ligera en un formato monocatenario para expresión de fragmento scFv.

Ejemplo 24 Clonación y expresión del anticuerpo F23.1 como molécula monocatenaria

Es posible clonar una versión monocatenaria del anticuerpo F23.1 que se ha demostrado reconoce un determinante conformacional en células T murinas que llevan TCRs V\beta8.2. En general, la familia V\beta8.2 del TCRs se expresa con una frecuencia de 20% en las células T en la mayoría de las variedades de ratones, Staertz, U., J. Immunol., (1995) 134, 3994. Después que el gen del anticuerpo ha sido clonado, será posible expresar la molécula scFv en E. Coli para caracterización.

Las cadenas pesada y ligera de longitud total (es decir V/CH; V/CL) que representan el anticuerpo F23.1 han sido clonadas por separado en el vector pGMT-Easy (Promega) y los genes VH y VL se han confirmado por secuenciación. El gen del anticuerpo F23.1 se clonará en una molécula monocatenaria cortando y empalmando juntos los genes que codifican los dominios VH y VL. Por ejemplo, un enfoque consiste en clonar el scFv en el vector de expresión pEN2, para producción de fragmentos scFv en E. coli. El vector pEN2 ha sido descrito v.g., en la patente U.S. No. 5763284.

El protocolo de clonación puede realizarse utilizando un proceso de amplificación PCR de dos pasos. En la primera tanda, los genes VH y VL se amplificarán por separado utilizando un juego de iniciadores específico que se reasocia al "frente" y al "respaldo" de los genes VH y VL. En experimentos futuros, las células T se direccionarán a tumores, utilizando como la producción de anticuerpo, anticuerpos reactivos para CD3, CD4, y a TCRs particulares. Sin embargo, este anticuerpo particular se prefiere, v.g. debido a que el mismo puede activar las células T, y activar más específicamente CTLs. Para producir el constructo scFv, se llevará a cabo una amplificación del segundo paso utilizando metodología PCR solapante para "cortar y empalmar" juntos los genes VH y VL. Las dos cadenas se enlazan utilizando un enlazador de 16 aminoácidos (G4SG4APG4S) que contiene el sitio de restricción para el cortador de 8 bases AcsI. En aquellos casos en que debe emprenderse la PCR solapante, puede utilizarse dos iniciadores como sigue: JSS32(T) (GGTGGCGGCGCGCCGGGAGGCGGCGGTTC; SEQ ID NO. 14) que se superpone con la secuencia enlazadora en el extremo 5' de la cadena ligera y el iniciador de fondo JSS33(B) (GGCTCCCGGCGCGCCGCCACCACCGCTGC
CACCGCCACC; SEQ ID NO. 15) que se superpone con la región enlazadora y corre hacia el extremo 3' de la cadena pesada. El producto PCR de solapamiento se digiere con SfiI y SpeI y se aísla luego haciendo pasar la muestra sobre un gel de agarosa al 1% y cortando la banda scFv.

El gen scFv se clona luego en el vector de expresión pEN2 como un fragmento SfiI a SpeI y la inducción de la proteína es controlada por el promotor phoA. Se cree que aproximadamente 50% de las moléculas scFv pueden expresarse en E. coli como proteína soluble y funcional. Si una célula hospedadora o condición de cultivo particulares producen proteína insoluble, el sc-Fv puede plegarse de nuevo de acuerdo con técnicas estándar para obtener proteína soluble.

Ejemplo 25 Construcción de fusiones scFv/pIII para expresión en bacteriófagos

Como se ha expuesto, es posible expresar una diversidad de proteínas de fusión sc-Fv en la superficie de un bacteriófago como un componente de la cápsida de fago. Por ejemplo, es posible realizar un bacteriófago biespecífico dotado de afinidad de fijación para un epítope en un receptor de células T deseado y en una célula tumoral diana.

De modo más específico, para presentar un ejemplo de fago biespecífico, la molécula de anticuerpo C23.1 se clonará como una fusión scFv/genIII. Como se expone en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781 pendiente, la proteína genIII es un proteína de 406 aminoácidos que se expresa como 5 copias en la superficie del fago. Un bacteriófago específico fd tet ha sido modificado por adición conveniente de sitios SpeI y NotI para clonación de genes scFv como fusiones pIII. Por amplificación del gen F23.1 scFv del vector pEN2 arriba descrito en el Ejemplo 23, el gen se clonará como un fragmento SpeI-NotI en la región N-terminal de la proteína pIII de tipo salvaje. Dado que la inducción de la fusión scFv/pIII se encuentra bajo el control del promotor tac, la expresión ocurrirá después de la adición de 1 mM de IPTG. Generalmente, se ha consignado que una sola copia del scFv es presentada por fago como una fusión del gen III. Por esta razón, el fago representa un sistema atractivo a utilizar para la presentación de copias simples de la molécula de anticuerpo. Esto contribuirá a minimizar las interacciones inespecíficas y permitirá que el fago mimetice estrechamente el concepto ideal de presentación de moléculas scFv monovalentes. Véanse las Figuras 2B-2E para ejemplos de constructos de fusión sc-TCR.

1. Modificaciones del constructo scFv por adición de marcadores específicos

Se utilizarán varias vías alternativas para construir moléculas scFv que contengan marcadores de la región terminal carboxilo. El DNA codificante de la secuencia de cada marcador se fusionará al extremo 3' del gen de la cadena ligera. La inclusión de un marcador carboxil-terminal dará como resultado la detección de la molécula. Ejemplos de marcadores incluyen los KT3, TPPPEPET; (SEQ ID NO. 9); 6xHis, GMAHHHHHH; (SEQ ID NO. 8) avidina; ARKCSLTGKWTNDLGSNMT; (SEQ ID NO. 6) fos, BirA, LXLIFEAQKIEWR (SEQ ID NO. 5) o jun. La molécula KT3EE (EEEEYMPME, SEQ ID NO. 7) puede utilizarse también en algunos casos. Véase Hiller et al., (1991), Biochem., J., 278, 573; Patel et al., (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994), 91, 7360; Kruif et al., J. Biol. Chem., 271:7630 y Schatz, P., Bio/Technology, (1993) 11, 1138.

Ejemplo 26 Purificación y análisis de scFv F23.1 para fijación a TCR nativo y monocatenario

La cromatografía de quelación de metales se ha convertido en un procedimiento altamente utilizado en la purificación de proteínas recombinantes. Esta tecnología puede utilizarse para purificar la molécula scFv. Un marcador 6xHis se ha modificado por ingeniería genética en el diseño de la molécula scFv para permitir la purificación simple en una columna Ni2+NTA. La preparación de fracción soluble se realiza por suspensión de una pasta de células de E. coli en tampón de extracción, después de lo cual las células se lisan en una prensa francesa. La muestra se aplicará luego a una columna Ni2+NTA en condiciones que permiten la fijación de proteínas marcadas con 6xHis y la proteína fijada será eluida utilizando imidazol, pH 7,4. Las muestras se analizarán respecto a pureza por SDS-PAGE y tinción del gel con azul Coomassie. Se utilizará análisis por transferencia Western para evaluar la integridad de la scFv por sondeo de membranas con un anticuerpo específico para un marcador KT3.

Si se desea, puede realizarse una purificación adicional de la scFv como sigue. Por ejemplo, puede prepararse una columna de afinidad acoplando primero covalentemente el mAb del anti-marcadorEE a cuentas de proteína-A Sefarosa. Las cuentas recubiertas con el anti-marcadorEE se utilizarán luego para capturar el scTCR DO11.10 purificado que se reticulará luego al mAb. La columna puede utilizarse para purificar el anticuerpo scFv (F23.1) debido a que la misma tiene especificidad para el dominio V\beta8.2. Este esquema de purificación en dos pasos producirá una preparación homogénea de scFv.

Para evaluar si el scFv F23.1 purificado es funcional, pueden utilizarse estudios de resonancia de superficie de plasmón para medir las asociaciones de constantes de fijación de la scFv a proteína scTCR (DO11.10) biotinilada y acoplada a un chip recubierto con estreptavidina. Como control, la asociación de constantes de fijación del anticuerpo F23.1 nativo puede determinarse para comparación con el anticuerpo F23.1 recombinante. Véase la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781 pendiente para exposición con relación a la realización de este ensayo.

Además de comparar los perfiles de fijación entre los anticuerpos F23.1 nativos y recombinantes para la scTCR, es posible investigar la aptitud de estos anticuerpos para fijarse a la TCR nativa en células T DO11.10. Se emplearán análisis citométricos de flujo para detectar la fijación de anticuerpos marcados con biotina a los receptores en las células. Se anticipa que los datos de estos experimentos predecirán la capacidad del fragmento scFv para activar células T por fijación de los receptores que llevan V\beta8.2. Una descripción relativa a la realización de análisis citométricos de flujo pueden encontrarse en las Solicitudes de Patentes U.S. núms. de Serie 08/813781 y 08/943086, pendientes.

Ejemplo 27 Expresión del F23.1 scFv como una fusión del gen III en la superficie del bacteriófago

Como se ha expuesto, el f23.1 scFv puede expresarse como una fusión de pIII para presentación en la superficie del bacteriófago. Este enfoque representa una vía singular para caracterizar rápidamente la molécula scFv antes de realizar el esfuerzo de expresar y purificar el anticuerpo a partir de E. coli. Para realizar muchos de los estudios de caracterización descritos, pueden obtenerse números suficientes de fago a partir de 2 a 5 litros de un cultivo nocturno. Además, como alternativa a la purificación de la molécula sc-Fv como se describe en el Ejemplo 6 (en lugar de utilizar un sistema de purificación por afinidad elaborado como se ha descrito para la purificación de las moléculas sc-Fv a partir del lisado de E. coli), la purificación de bacteriófago puede realizarse fácilmente mediante dos tandas de precipitación con polietilenglicol (PEG). Si es necesario purificar ulteriormente el fago, puede utilizarse enriquecimiento en un gradiente de CsCl. Después de la clonación, el fago que expresa el scFv puede producirse, purificarse y ponerse a disposición para ensayos dentro de un periodo de tiempo más corto en comparación con la expresión y purificación de las moléculas scFv solubles. Pueden utilizarse ensayos de fijación de células para ensayar si el fago expresa las fusiones scFv/pIII. Esto se realizará por incubación del fago con células T DO11.10 y ensayo del fago fijado utilizando un anticuerpo marcado con biotina específico para el fago. Una exposición más específica relativa a la realización del ensayo de fijación de células puede encontrarse en la Solicitud de Patente U.S. No. de Serie 08/813781 pendiente. La detección de fago marcado con anticuerpo se realizará por adición de un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (PE). Las moléculas scFv expresadas como fusiones de pIII retienen normalmente la actividad conformacional y en muchos casos se comportan mejor que el fragmento Fv recombinante. Una meta es confirmar que un fragmento scFv funcional se presente únicamente en el extremo del fago.

Ejemplo 28 Capacidad del bacteriófago recombinante para activar las células T

La molécula sc-Fv de F23.1 exhibe preferiblemente capacidad para estimular los hibridomas de células T Do11.10 o activar una población de células T murinas no enriquecidas. Todos los experimentos utilizarán el anticuerpo F23.1 nativo como control positivo, especialmente dado que informes publicados han demostrado que el mismo puede activar las células T. véase Staerz, supra. En el primer experimento, el bacteriófago que expresa el sc-Fv/fusión se adsorberá directamente al pocillo de plástico o se inmovilizará por captura con un anticuerpo para el fago. Otro enfoque utilizará el fago en suspensión. resumidamente, se añadirán 10^{5} células de hibridoma T DO11-10 a pocillos que contienen fago como se ha descrito arriba. Después de incubación durante una noche, se centrifugarán las placas para reducir las células a un pelet, y el sobrenadante se aislará y se ensayará respecto a IL-2 utilizando un ELISA anti-IL-2.

El segundo experimento utilizará células T aisladas de ratones Balb/C. Se medirán dos parámetros para evaluar la activación. El primer parámetro consistirá en ensayar los niveles de IL-2 después de la incubación de 10^{6} células ingenuas en presencia del fago de anticuerpo. El segundo método consistirá en teñir células ingenuas para marcadores de activación identificados en las células T después de incubación con el fago. Es posible ensayar cierto número de marcadores superficiales que se expresan o se regulan en sentido creciente después de la activación. Pueden realizarse estudios paralelos utilizando el scFv purificado en lugar del fago. Sin embargo, en este caso se prefiere que la molécula se inmovilice con un mAb que tiene especificidad para el marcador KT3 localizado en la región terminal carboxilo de la molécula scFv. A partir de estos dos experimentos, es posible evaluar la eficacia de la utilización del fago scFv para estimular o activar las células T.

Ejemplo 29 Modificación por ingeniería genética de moléculas híbridas biespecíficas (es decir bacteriófago biespecífico) y caracterización de sus propiedades destructoras de tumores in vitro

Un objetivo de la presente invención consiste en ilustrar que las presentes moléculas de fijación poliespecíficas y particularmente las moléculas biespecíficas sc-TCR/sc-Fv pueden destruir células tumorales in vitro. Las moléculas biespecíficas pueden producirse de cierto número de maneras de acuerdo con la invención, que incluyen los métodos específicos siguientes.

Un enfoque para producir moléculas biespecíficas será utilizar bacteriófago como vehículo para la presentación simultánea del scTCR y el scFv. El fago biespecífico se producirá por infección de células de E. coli K91 transformadas previamente con el vector fagémido pSUN26, y luego con el fago de expresión scFv/pIII. Después de purificación con PEG del fago biespecífico, el fago puede caracterizarse para asegurar que ambas funciones scTCR y scFv se expresan en la superficie. Esto se hará por ensayo ELISA en el cual los pocillos se recubrirán a razón de 1 \mug/pocillo de scTCR purificado (DO11.10) que lleva el epítope V8.2. Los fagos que expresan una scFv F23.1 funcional deberían fijarse al scTCR DO11.10. Se utilizará estreptavidina-HRP para detectar el scTCR p-149 presentado en la superficie del fago. Se utilizará mAb anti-V2,3 o anti-V11,0 (PharMingen) seguido por estreptavidina-HRP.

Ejemplo 30 Estrategias para enlazar moléculas scTCR y scFv con moléculas de unión

Como se ha expuesto, las presentes moléculas de fijación poliespecíficas pueden unirse por una o una combinación de moléculas de unión diferentes. Varias moléculas de unión específicas incluyen cadenas pesadas de inmunoglobulina y las moléculas arriba descritas que son capaces de formar complejos de fijación específicos.

Por ejemplo, un tipo específico de moléculas de unión es el motivo de fijación de avidina con biotina. Esta molécula de unión ha sido codificada genéticamente en el diseño de la molécula scFv p-149. Por tanto, se expresarán moléculas scFv con una secuencia de aminoácidos derivada de avidina que contiene un motivo de fijación de biotina (véase Hiller et al., Biochem., (1991), 978, 573-585). La scTCR se expresará que contiene la secuencia de biotinilación del terminal carboxilo, BirA, váse Schatz, P., Bio/Technology, 11, 1138-1143 (1993), como se describe en la finalidad 2 [sic], que puede fijar biotina libre in vivo o in Vitro en presencia de biotina-ligasa, Schatz, P. supra, una enzima capaz de añadir una molécula simple de biotina al sitio BirA. Moléculas biespecíficas monovalentes pueden formarse eficientemente por este enfoque. Una atracción para la utilización de este enfoque es la interacción fuerte entre avidina y biotina (10^{-15}M) (véase, Green, N., Methods Enzymol., (1990), 184, 85-133, y la alta probabilidad de formación de heterodímeros (sc-TCR:sc-Fv) comparada con la formación de homodímeros (sc-TCR:sc-TCR o sc-Fv:sc-FV).

Se contempla el uso de moléculas de unión adicionales. Por ejemplo, puede utilizarse otro enfoque en el cual es posible enlazar una sc-TCR y sc-Fv juntas mediante la utilización de la cremallera de leucina fos/jun, véase por ejemplo Patel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1994), 91, 7360-7364 y Segal et al., Annals New York Academy of Sciences, (1991) 636, 288-294. De nuevo, cada molécula se construirá por separado. Por ejemplo, la sc-FV tendrá una secuencia fos en el terminal carboxilo y la sc-TCR se modificará por ingeniería genética para tener una secuencia jun en el terminal carboxilo. Un único residuo de cisteína flanqueará cada lado de los restos fos y jun para facilitar la formación de enlaces disulfuro a fin de mejorar la estabilidad de la interacción. Del mismo modo que el enfoque avidina/biotina, esta tecnología tiene la ventaja de producir heterodímeros con una frecuencia muy alta comparada con la formación de homodímeros, Patel et al., supra.

La invención se ha descrito con referencia a las realizaciones preferidas de la misma; sin embargo, se apreciará que los expertos en la técnica, una vez considerada esta descripción, pueden realizar modificaciones y mejoras dentro del alcance de la invención.

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<110> Sunol Molecular Corporation

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<120> POLYSPECIFIC BINDING MOLECULES AND USES THEREOF

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<130> 11530

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<140> 99 970 601.3

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<141> 1990-10-21

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<150> US 60/105.164

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<151> 1998-10-21

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<160> 44

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Peptide Linker

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<400> 1

100

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<210> 2

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Peptide Linker

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<400> 2

101

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<210> 3

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<211> 12

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<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Peptide Linker

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Peptide Linker

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Protein binding motif

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> UNSURE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa = any amino acid

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Protein binding motif

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Protein binding motif

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Protein binding motif

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Protein binding motif

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Peptide fragment of the human tumor-suppressor protein p53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g or a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> v = a, c or g

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaartavccc ttgaccaggc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcacctccag atgttaactg ctc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> r = g or a

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (20,32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> s = g or c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (29)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> m = a or c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (26)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> k = g or t

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccgggccac catggratgs agctgkgtma tsctc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggtggcggcg cgccgggagg cggcggttc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcctcccggc gcgccgccac caccgctgcc accgccacc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtgaccg gtgagcaggt ggagcagctt cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtggagg cccagccggc catggcccag caggtgagac aaag

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtggagc tcgagcaatg ctggtgtcat ccaaac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtggaga ctagtagctt ctgggttctg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtggagc ccggggtctg ctcggcccca ggc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtgaccg gtcagcaggt gagacaaagt cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

110

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgcaaaga caaccgcccc ttcagtatat ccactagcgc ccgttt

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence : Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggaaacgg gcgctagtgg atatactgaa ggggcggttg tcgcgtt

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagaggaag aagagtacat gccgatggaa taatgaaaac gtaagtacac ttat

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> unsure

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> m = a or c

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgataagtgt acttacgtmc attattccat cggcatgtac tcttcttcct ctcg

\hfill

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgaaaacgta agtacactta t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgataagtgt acttacgttt tcg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtggccc agccggccat ggccgacatc cagatgacc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Description of Artificial Sequence: Primer

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtgacta gttttgattt ccagcttggt g

\hfill

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 31

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\hskip-.1em\dddseqskip

ctagtggagg tggcggatca ggaggcggag gttctggcgg aggtgggagt c

\hfill

51

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<210> 32

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<211> 51

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 32

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\hskip-.1em\dddseqskip

tcgagactcc cacctccgcc agaacctccg cctcctgatc cgccacctcc a

\hfill

51

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<210> 33

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 33

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtgctcg aggaggtgca gctggtgg

\hfill

28

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<210> 34

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<211> 27

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 34

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gaggtgtccg gagacatcca gatgacc

\hfill

27

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<210> 35

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 35

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gaggtgtcgc gatgaggaga cggtgacc

\hfill

28

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<210> 36

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<211> 43

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 36

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gaggtggaat tctcattacc cgggtgagga gacggtgacc atg

\hfill

43

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<210> 37

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<211> 28

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 37

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gtggaggaat tcgtctgctc ggccccag

\hfill

28

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<210> 38

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<211> 52

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 38

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\hskip-.1em\dddseqskip

gaggtgtcgc gacagctacc ggtgtccact ccgagcaggt ggagcagctt cc

\hfill

52

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<210> 39

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<211> 52

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 39

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gaggtgtcgc gacagctacc ggtgtccact cccagcaggt gagacaaagt cc

\hfill

52

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<210> 40

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 40

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caagcagcct caggaactct ggaaatacgc tc

\hfill

32

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<210> 41

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 41

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gagcgtattt ccagagttcc tgaggctgct tg

\hfill

32

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<210> 42

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 42

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aacggtggag ggggctcat

\hfill

19

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<210> 43

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<211> 23

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<400> 43

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ccggatgagc cccctccacc gtt

\hfill

23

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<210> 44

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<211> 32

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<212> DNA

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<213> Artificial Sequence

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<220>

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<223> Description of Artificial Sequence: Primer

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<220>

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<221> unsure

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<222> (18,24)

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<223> n = a, t, c or g

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<220>

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<221> unsure

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<222> (23)

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<223> k = g or t

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<400> 44

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cccgggccac catggagnca caknctcagg tc

\hfill

32

Claims

1. Una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo enlazado covalentemente a través de una primera secuencia enlazadora peptídica a al menos un anticuerpo monocatenario (sc-Ab) o fragmento funcional del mismo, en donde el sc-TCR o fragmento funcional del mismo se fija a un péptido particular combinado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno.

2. La proteína de fijación de la reivindicación 1, en la cual el sc-TCR comprende una cadena V\alpha enlazada covalentemente a una cadena V\beta por una segunda secuencia de enlazador peptídico.

3. La proteína de fijación de la reivindicación 2, en la cual el término C de la cadena V\alpha está enlazado covalentemente por la segunda secuencia de enlazador peptídico al término N de la cadena V-\beta.

4. La proteína de fijación de la reivindicación 2, en donde el término C de la cadena V-\beta está enlazado covalentemente por la segunda secuencia de enlazador peptídico al término N de la cadena V-\alpha.

5. La proteína de fijación de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una cadena C-\beta o fragmento enlazada covalentemente entre el término C de la cadena V-\beta y el término N de la primera secuencia de enlazador peptídico.

6. La proteína de fijación de la reivindicación 2, que comprende adicionalmente una cadena o fragmento C-\alpha enlazada covalentemente entre el término C de la cadena V-\alpha y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica.

7. La proteína de fijación de la reivindicación 5, que comprende adicionalmente una cadena o fragmento C-\alpha enlazada(o) covalentemente entre el término C de la cadena V-\beta y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica.

8. La proteína de fijación de la reivindicación 6 ó 7, en la cual el fragmento de cadena C-\alpha tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 5 y 25 aminoácidos.

9. La proteína de fijación de la reivindicación 5, en la cual el fragmento de cadena C-\beta tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 50 y 126 aminoácidos.

10. La proteína de fijación de la reivindicación 2, en la cual las secuencias enlazadoras peptídicas primera y segunda tienen cada una independientemente una longitud comprendida entre aproximadamente 2 y 25 aminoácidos.

11. La proteína de fijación de la reivindicación 2, en la cual el anticuerpo monocatenario comprende una primera y una segunda cadenas variables de inmunoglobulina enlazadas covalentemente juntas por una tercera secuencia enlazadora polipeptídica.

12. La proteína de fijación de la reivindicación 11, en la cual la primera cadena variable es una cadena ligera (V_{L}) y la segunda cadena variable es una cadena pesada (V_{H}).

13. La proteína de fijación de la reivindicación 12, en donde el término C de la cadena V_{L} está enlazado covalentemente por la tercera secuencia enlazadora peptídica al término N de la cadena V_{H}.

14. La proteína de fijación de la reivindicación 12, en donde el término C de la cadena V_{H} está enlazado covalentemente por la tercera secuencia enlazadora peptídica al término N de la cadena V_{L}.

15. La proteína de fijación de la reivindicación 12, en donde la tercera secuencia enlazadora peptídica tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 2 y 25 aminoácidos.

16. La proteína de fijación de la reivindicación 12, en donde el término C de la cadena V-\beta de sc-TCR está enlazado covalentemente a la tercera secuencia enlazadora polipeptídica, secuencia que está enlazada al término N de la cadena V_{H} o V_{L}.

17. La proteína de fijación de la reivindicación 16, en donde el término C de la cadena V-\beta de sc-TCR está enlazada covalentemente a una cadena C-\beta, cadena que esta enlazada covalentemente a la tercera secuencia enlazadora polipeptídica, secuencia que está enlazada al término N de la cadena V_{H} o V_{L}.

18. La proteína de fijación de la reivindicación 17, en donde la sc-TCR comprende una cadena V-\alpha enlazada covalentemente a una cadena o fragmento C-\alpha, en donde la cadena o fragmento C-\alpha está enlazada covalentemente entre el término C de la cadena V-\alpha y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica.

\newpage

19. Una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende, enlazados covalentemente en secuencia: 1) una sc-TCR o fragmento funcional de la misma, 2) una primera secuencia enlazadora polipeptídica, y 3) un anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo, en donde la sc-TCR o fragmento funcional de la misma une un péptido particular fijado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno.

20. La proteína de fijación de la reivindicación 19, en donde la sc-TCR comprende adicionalmente, enlazados covalentemente en secuencia: 4) una cadena V-\alpha, 5) una segunda secuencia enlazadora peptídica, 6) una cadena V-\beta, y 7) un fragmento de cadena C-\beta.

21. La proteína de fijación de la reivindicación 19, en donde la sc-TCR comprende adicionalmente, enlazados covalentemente en secuencia: 4) una cadena V-\beta, 5) una segunda secuencia enlazadora peptídica, 6) una cadena V-\alpha, y 7) una cadena C-\beta o fragmento de la misma.

22. La proteína de fijación de la reivindicación 20, que comprende adicionalmente una cadena C-\alpha o fragmento de la misma enlazada(o) covalentemente entre la cadena V-\alpha y la primera secuencia enlazadora polipeptídica.

23. La proteína de fijación de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo monocatenario comprende adicionalmente, enlazados covalentemente en secuencia: 4) una cadena V_{H}, 5) una tercera secuencia enlazadora polipeptídica, y 6) una cadena V_{L}.

24. La proteína de fijación de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo monocatenario comprende adicionalmente, enlazados covalentemente en secuencia: 4) una cadena V_{L}, 5) una tercera secuencia enlazadora polipeptídica, y 6) una cadena V_{H}.

25. La proteína de fijación de la reivindicación 19, que comprende adicionalmente al menos un marcador proteínico enlazado covalentemente a ella.

26. La proteína de fijación poliespecífica de la reivindicación 1, en donde al menos la sc-TCR de la proteína ha sido humanizada.

27. La molécula de fijación de la reivindicación 26, en donde la sc-TCR y las regiones del anticuerpo monocatenario han sido humanizadas.

28. La proteína de fusión soluble de la reivindicación 25, en donde el marcador proteínico es una molécula marcada detectablemente, adecuada para diagnóstico o estudios de producción de imágenes.

29. Un polinucleótido que codifica la molécula de fijación poliespecífica monocatenaria de la reivindicación 1.

30. El polinucleótido de la reivindicación 29, en donde el polinucleótido comprende adicionalmente un promotor, señal de iniciación de la traducción, y secuencia conductora enlazados operativamente a una primera secuencia que codifica la molécula de fijación poliespecífica.

31. El polinucleótido de la reivindicación 30, en donde la sc-TCR codificada por la primera secuencia comprende una cadena V-\alpha enlazada covalentemente por una segunda secuencia enlazadora peptídica al término N de una cadena V-\beta.

32. El polinucleótido de la reivindicación 31, en donde el término C de la cadena V-\alpha está enlazado covalentemente por la segunda secuencia enlazadora peptídica al término N de la cadena V-\beta.

33. El polinucleótido de la reivindicación 31, en donde el término C de la cadena V-\beta está enlazado covalentemente por la segunda secuencia polipeptídica al término N de la cadena V-\alpha.

34. El polinucleótido de la reivindicación 32, en donde el término C de la cadena V-\alpha comprende adicionalmente un fragmento de cadena C-\alpha enlazado covalentemente entre el término C de la cadena V-\alpha y el término N de la segunda secuencia enlazadora peptídica.

35. El polinucleótido de la reivindicación 32, en donde la cadena V-\beta comprende adicionalmente una cadena C-\beta o fragmento enlazado covalentemente entre el término C de la cadena V-\beta y la primera secuencia enlazadora peptídica.

36. El polinucleótido de la reivindicación 30, en donde el promotor es phoA y el conductor es pelB de E. coli, en donde el segmento de DNA comprende adicionalmente un sitio de fijación de ribosona de una secuencia del gen 10.

37. El polinucleótido de la reivindicación 30, en donde el promotor es un promotor de citomegalovirus (CMV) enlazado operativamente a un elemento intensificador de CMV, y el conductor es un conductor de la cadena kappa de ratón.

38. Un vector de DNA que comprende el polinucleótido de la reivindicación 29.

39. Un kit que comprende al menos uno de una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 19 y un polinucleótido que codifica la proteína.

40. Un método para construir una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo y al menos una Fv monocatenaria (sc-Fv) o fragmento funcional de la misma , en donde la sc-TCR o fragmento funcional de la misma fija un péptido particular fijado (cargado) a un MHC (HLA) y el anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo fija un antígeno, comprendiendo el método:

c) purificar la proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de las células de hibridoma o del medio.

41. Uso de una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo y al menos una Fv monocatenaria (sc-Fv) o fragmento funcional de la misma para la fabricación de una preparación médica para destruir una célula diana que comprende un complejo de histocompatibilidad principal (MHC) o antígeno asociado a leucocitos humanos (HLA), donde la célula diana es una célula tumoral, una célula infectada por un virus o una célula tumoral infectada por un virus, estando adaptada la preparación médica para:

a) poner en contacto una pluralidad de células con dicha preparación médica en donde la pluralidad de células comprende adicionalmente células inmunitarias y las células diana que comprenden el MHC,

b) mientras que el paso a) da como resultado la formación de un complejo de fijación específico (puente) entre el MHC en las células diana y una molécula de activación (marcador) en las células inmunitarias suficiente para activar las células inmunitarias; y

c) destruir las células diana con las células inmunitarias activadas.

42. El uso de la reivindicación 41, en donde la proteína de fijación poliespecífica monocatenaria es biespecífica y comprende una sc-TCR enlazada covalentemente a y un anticuerpo monocatenario a través de una secuencia enlazadora peptídica.

43. El uso de la reivindicación 41, en donde las células diana son células tumorales o células infectadas por un virus que expresan un péptido específico en el contexto de una molécula HLA (pHLA).

44. El uso de la reivindicación 41, en donde las células inmunitarias con células T, células NK, o macrófagos.

45. El uso de la reivindicación 44, en donde las células inmunitarias comprenden un antígeno (marcador) seleccionado del grupo constituido por p53, CD3/TCR, CD28 y Her2-Neu.

46. Uso de una proteína de fijación poliespecífica monocatenaria que comprende al menos un receptor de células T monocatenario (sc-TCR) o fragmento funcional del mismo y al menos un anticuerpo monocatenario o fragmento funcional del mismo para la fabricación de una preparación médica para prevención o tratamiento de un cáncer en un paciente en el cual el cáncer se caracteriza por células tumorales que expresan pHLA, estando adaptada la preparación médica para:

a) ser administrada al paciente,

b) en tanto que el paso a) da como resultado la formación de un complejo de fijación específica (puente) entre las células tumorales que expresan pHLA y células inmunitarias suficiente para activar las células inmunitarias; y

c) deteriorar o destruir las células tumorales suficientemente para prevenir o tratar el cáncer en el paciente.

47. La proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de la reivindicación 1, en donde el receptor de las células T monocatenario (sc-TCR) es un sc-TCR de p149.

48. La proteína de fijación poliespecífica monocatenaria de la reivindicación 1, en donde el fragmento sc-TCR se fija específicamente a un de histocompatibilidad principal (MHC) [sic] o antígeno asociado a leucocitos humanos (HLA) complejado con un péptido que tiene al menos aproximadamente 70% de afinidad cuando se compara con la fijación específica de la cadena V-\alpha y V-\beta de longitud total y, adicionalmente en donde el fragmento sc-Ab se fija específicamente al antígeno específico con al menos aproximadamente 70% de afinidad cuando se compara con la fijación específica de la cadena de inmunoglobulina de longitud total.