JP4439808B2 - T細胞レセプター融合体および結合体ならびにそれらの使用方法 - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は可溶性T細胞レセプター複合体、ならびにより詳細には可溶性T細胞レセプター融合複合体および可溶性T細胞レセプター結合複合体に、そしてこのような分子を作製および使用するための方法に関する。提供される分子は、多様な治療学的適用および診断の目的のために有用である。
【0002】
(発明の背景)
ガン、自己免疫、および感染性(ウイルス性、細菌性、寄生性、および真菌性を含む)の疾患のような疾患の治療に対する伝統的なアプローチは、外科手術、放射線化学療法、抗体、またはそれらを組み合わせた治療を含んでいる。しかし、このような治療は多数のこれらの徴候に対して有効であることが証明されていなかった。ヒト疾患の予防および/または治療するための代替の治療法の開発が重大である。近年において、抗体およびTリンパ球を利用する免疫治療および遺伝子治療アプローチが、ヒト疾患を治療するための新規で有望な方法として頭角を現してきた。
【0003】
治療のための1つのこのようなアプローチは、特定の標的に対して治療学的または診断的薬剤を標的化するための抗体の使用を包含している。多くのグループが、標的化薬剤としての抗体の使用を巡る開発をしている。このような開発は、種々のエフェクター分子(放射性分子、化学療法剤、トキシン、およびさらなる生体活性タンパク質)に抗体を連結する、抗体融合タンパク質および抗体結合分子の構築を包含している。このような分子を使用して開発された治療または診断は、連結された抗体によって標的される特定の効果を引き起こすように設計される。
【0004】
治療薬としての抗体の開発が本格化されてきたので、免疫系の卓越したエフェクター、T細胞レセプター(TCR)は、治療を開発するための基盤として独特の利点を有する。抗体は、血液および細胞外空間における病原体の、または細胞表面上のタンパク質標的に対する認識に制限されるが、T細胞レセプターは、細胞表面上のMHC分子で提示される抗原(細胞内タンパク質に由来する抗原を含む)を認識し得る。提示される抗原を認識しおよび活性化になるT細胞のサブタイプに依存して、T細胞レセプターおよびT細胞レセプターを保有するT細胞は、種々の免疫応答を制御することに関与し得る。例えば、T細胞は、抗体産生細胞へのB細胞の分化を介して体液性免疫応答の調節に関与する。さらに、活性化T細胞は、細胞媒介性免疫応答を開始するように作用する。従って、T細胞レセプターは抗体に利用可能でないさらなる標的を認識し得る。
【0005】
T細胞応答は、T細胞レセプター(TCR)への抗原の結合によって調節される。TCRの1つのタイプは、免疫グロブリン可変(V)および定常(C)領域と類似するαおよびβ鎖からなる膜結合性ヘテロ2量体である。TCRα鎖は共有結合されたV−αおよびC−α鎖を含み、一方β鎖はC−β鎖に共有結合的に連結されたV−β鎖を含む。V−αおよびV−β鎖は、超抗原または主要組織適合複合体(MHC)(ヒトにおいてHLA複合体として知られる)の情況において抗原を結合し得るポケットまたは間隙を形成する。概して、Davis Ann.Rev.of Immunology 3:537(1985) Fundamental Immunology 第3版、W.Paul編、Rsen Press LTD.New York(1993)を参照のこと。
【0006】
TCRは免疫系の発達および機能において重要な役割を果たすと考えられる。例えば、TCRは細胞殺傷を媒介し、β細胞増殖を促進し、そしてガン、アレルギー、ウイルス感染および自己免疫異常を含む種々の疾患の進行および深刻度に影響を与えることが報告されている。
【0007】
従って、T細胞レセプターに基づく新規な標的化薬剤、ならびに治療学的および診断の設定のために、このような薬剤を生成および使用するための方法を提供することは望ましい。抗体標的化に基づく先行技術の複合体に比較して利点を有するような分子を提供することは特に望ましい。
【0008】
(発明の要旨)
本発明者らは今や、潜在的な治療学的有用性を有するいくつかの異なる改変されたTCR複合体を作製した。これらの改変されたTCRは、局在化された毒性因子を、疾患のプロセスにおいて介入すべく、特定の部位に導き、標的化し、指向するために用いられる。例えば、TCRは、MHC分子によって提示されるガン関連性タンパク質に由来するペプチドを特異的に認識し、生物学的に活性な分子に融合または結合され得、それによって、所望の治療学的結果を達成するために、この分子をガン細胞に導く。
【0009】
本発明のTCRは、TCRを生物学的に活性な分子に連結する方法において改変され得る。本発明は、このような結合を達成する為の方法として遺伝子融合および化学的結合の用法を教示する。生物学的に活性な分子が付着できるTCRは、ネイティブなTCRヘテロ2量体またはその可溶性のバージョン、詳細には可溶性の、1本鎖TCRである。生物学的に活性な分子は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質、または非タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメイン、細胞傷害性因子、化学治療剤、放射性材料、検出可能な標識などを含むがこれらに制限されない多様な生体活性エフェクター分子であり得る。
【0010】
いくつかの例において、可溶性sc−TCRタンパク質は、1つ以上の融合されたエフェクターまたはタグを含む。例えば、ある場合において、タグは融合タンパク質に典型的に付随する天然に存在する細胞成分からTCRタンパク質融合複合体を精製するのを補助するために用いられる。他の場合において、タンパク質タグは、予め決定された化学的切断部位またはタンパク質分解性解裂部位を可溶性タンパク質に導入するために用いられる。詳細には、意図されるのは、タグを、例えば、融合タンパク質およびエフェクター分子鎖または適切なフラグメントをコードする配列間で、コードするセグメントのDNAベクターへの導入であり、それによってTCR分子は、所望される場合エフェクター鎖またはフラグメントから解裂(すなわち、分離)される。
【0011】
本発明における使用のために特に好ましいT細胞レセプター分子は、1本鎖T細胞レセプターである。
【0012】
本発明の好ましい局面において、TCR融合複合体は、IgG、IgM、またはIgA、またはそれらのフラグメント(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2)のような免疫グロブリンに共有結合的に連結される。適切なTCR融合複合体は、免疫グロブリンの定常領域に連結される。
【0013】
本発明の別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えばIL−2のようなサイトカインに共有結合的に連結される。
【0014】
本発明のなお別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えばMIP−1βのようなケモカインに共有結合的に連結される。
【0015】
さらに、本発明の別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えばGCSFのような増殖因子に共有結合的に連結される。
【0016】
本発明の別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えばリシンのようなタンパク質または非タンパク質トキシンに共有結合的に連結される。
【0017】
さらに、本発明の別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えばドキソルビシンのような細胞傷害性因子に共有結合的に連結される。
【0018】
本発明の別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えばI125のような放射性材料に共有結合的に連結される。
【0019】
本発明のなお別の好ましい局面において、TCR融合複合体は、例えば蛍光、放射性、または電子伝達因子のような検出可能な標識に共有結合的に連結される。
【0020】
具体的に提供されるのは、細胞トキシン、または診断、画像化、もしくは治療学的研究に適切な検出可能に標識される原子もしくは化合物であるエフェクターを含む可溶性TCR融合タンパク質およびTCR結合複合体である。TCR融合複合体およびTCR結合複合体は、インビボでの細胞または組織の検出および/または画像化、ならびにインビトロまたはインビボで細胞を傷害または殺傷するような治療学的使用を含む、多様な適用において用いられる。一般に、標的化される細胞または組織は、TCRを選択的に結合し得る1つ以上のリガンドを含む。例示的な細胞としては、黒色腫のような腫瘍細胞およびウイルス感染された細胞(例えば、それぞれサイトメガロウイルスまたはAIDSウイルスのような霊長類DNAまたはRNAウイルスで感染された細胞)を包含する。
【0021】
本発明の他の局面および実施態様は以下に考察される。
【0022】
(発明の詳細な説明)
抗体ベースの分子の性能に対する改良を行う試みにおいて、本発明者らはT細胞レセプター(TCR)の使用に基づく抗原特異的治療薬を開発した。TCRベースの試薬は抗体分子よりもいくつかの利点を有する。第1に、抗体ベースの治療はしばしば、腫瘍抗原の分断に起因して予測されるよりも低い腫瘍細胞殺傷効果を伴う。MHC分断の報告があるが、特異的MHC/腫瘍ペプチドの循環レベルは遊離に循環する腫瘍抗原よりも非常に低い。第2に、抗体分子は、これらは細胞の表面上に曝露されず、抗体分子に接近可能でないので、多くの潜在的な腫瘍抗原を認識できない。多くの潜在的な腫瘍特異的タンパク質は細胞内であるが、通常は細胞内でペプチドにプロセスされて、これは次いで腫瘍細胞の表面にMHCクラスIまたはMHCクラスII分子のいずれかで提示される。TCRとは異なり、抗体は通常は、MHC分子の結合間隙を占有するこれらのプロセスされた抗原を認識しない。第3に、抗体によって認識される抗原の多くは、生来異種遺伝子性であり、これは抗体の有効性を単一の腫瘍組織学に制限する。対照的に、多くのT細胞エピトープは、いくつかの異なる組織から起源する広範な範囲の腫瘍に共通である。
【0023】
上述にまとめられるように、本発明者らは今やTCR融合および結合複合体、そして生物学的に活性なペプチドまたは分子に共有結合的に連結されるTCR分子を含有する、このような複合体をコードする発現ベクター、そしてこのような融合および結合複合体、ならびに発現ベクターおよび結合複合体の産生および使用のための方法を作製した。
【0024】
T細胞は、細胞表面上に発現されるT細胞レセプターの働きによって、細胞の表面上に提示される抗体を認識する。TCRはジスルフィド結合されたヘテロ2量体であり、大部分αおよびβ鎖糖タンパク質からなる。T細胞は、B細胞で機能している抗体多様性を生み出すメカニズムに類似した方法で、T細胞もそのレセプター分子において多様性を生み出している(JanewayおよびTravers;Immunobiology 1997)。免疫グロブリン遺伝子に類似してTCR遺伝子はT細胞の発達の間に再配置するセグメントから構成される。TCRポリペプチドはアミノ末端可変領域およびカルボキシ末端定常領域からなる。カルボキシ末端領域は、膜貫通アンカーとして作用し、そしてレセプターが占有されている場合細胞内シグナル伝達に関与し、可変領域は抗原の認識を担う。TCRα鎖は、VおよびDセグメントのみによってコードされる可変領域を含むが、β鎖は更なる結合(J)セグメントを含む。これらのセグメントの再配置、ならびに可変領域の変異および成熟によって、それぞれのTCR分子の状況に於いて提示される途方もなく多数の異なる抗原を認識し得るという、TCRの多様なレパートリーを生じる。
【0025】
特定の抗原を認識し得る非常に特異的なT細胞レセプター(TCR)を生成するための技術が、以前に開発された。例えば、係属中の米国特許出願第08/813,781号、および米国特許出願第09/422,375号、本明細書中に参考として援用される;ならびに国際特許出願PCT/US98/04274およびPCT/US99/24645、およびそこにおいて考察される参考文献は、特異的TCRを調製するおよび使用する方法を開示する。さらに、特定の特異的TCRが、可溶性の、1本鎖TCR(scTCR)として、組換え法によって生成された。scTCRの生成および使用の方法が、係属中の米国特許出願第08/943,086号、および国際特許出願PCT/US98/20263において開示され、記載され、これらは本明細書中に参考として援用される。このようなTCRおよびscTCRは、得られるTCRおよびscTCRを治療薬として有用にするために融合物または結合体を作製するように変化され得る。本発明のTCR複合体は、TCR融合複合体を生成するために組換え的に生成されたTCRまたはscTCRコード領域を、生物学的に活性なタンパク質をコードする遺伝子に遺伝子融合することによって作製され得る。あるいは、TCRまたはscTCRはまた、TCR結合体タンパク質を生成するために生物学的に活性な分子と化学的に結合され得る。
【0026】
用語「融合分子」によって、これが本明細書中で使用されるように、TCR分子およびエフェクター分子の、通常組換え的、化学的、または他の適切な方法によって共有結合的に連結(すなわち融合される)タンパク質またはペプチド配列が意味される。所望される場合、融合分子は、ペプチドリンカーを介して1つまたはいくつかの部位で融合され得る。あるいは、ペプチドリンカーは、融合分子の構築において補助するために用いられる。具体的に好ましい融合分子は、融合タンパク質である。
【0027】
「ポリペプチド」は、その大きさにかかわらず好ましくは任意の20個の天然のアミノ酸から本質的になるポリマーをいう。用語「タンパク質」はしばしば、比較的大きなタンパク質に関して使用され、「ペプチド」は小さなポリペプチドに関して使用されるが、当該分野におけるこれらの用語の使用はしばしば重複する。用語「ポリペプチド」は概して、他で注記されない限りタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドをいう。概して本発明に有用なペプチドは、遠心分離またはSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的な分子サイズ分析技術によって判断されるように、約0.1〜100KDまたはより大きな約1000KDの間の、好ましくは約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、50KDとの間である。
【0028】
用語「結合分子」は、これが本明細書中で使用されるように、TCR分子およびエフェクター分子においては、通常化学的なまたは他の適切な方法によって共有結合的に連結される(すなわち、融合される)化学的なまたは合成された分子が意味される。所望される場合、結合分子は、1つまたはいくつかの部位にて、ペプチドリンカー配列またはキャリア分子を介して融合され得る。あるいは、ペプチドリンカーまたはキャリアは、結合体分子の構築において補助するために用いられる。具体的に好ましい結合分子は結合トキシンまたは検出可能な標識である。
【0029】
本発明のTCR融合複合体およびTCR結合複合体は、TCR分子に共有結合的に連結される生物学的に活性な分子またはエフェクター分子(本明細書中で交換可能に使用される用語)を含有する。本明細書中で使用されるように、用語「生物学的に活性な分子」または「エフェクター分子」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのようなアミノ酸配列;糖または多糖;脂質または糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、または本明細書中で考察されるような所望される効果を生成し得る化学薬剤が意味される。また意図されるのは、生物学的に活性なまたはエフェクタータンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするエフェクター分子核酸である。従って、適切な分子は、調節因子、酵素、抗体、または薬物、およびDNA、RNA、およびオリゴヌクレオチドを包含する。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は、天然に存在し得るか、または公知の成分から、例えば、組換えまたは化学合成によって合成され得、および異種成分を包含し得る。生物学的に活性なまたはエフェクター分子は一般に、約0.1〜100KDまたはより大きな約1000KDまでの間、好ましくは、遠心分離またはSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような標準的な分子サイズ分け技術によって判断されるように、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、および50KDの間である。本発明の所望される効果は例えば、細胞増殖または細胞死を誘導すること、免疫応答を開始すること、または以下に開示されるアッセイによって決定されるように診断目的のための検出分子として作用することのいずれかであり、アッセイは、細胞を細胞が増殖するように培養し、そして細胞と本発明のTCR融合複合体とを接触し、および次いでTCR融合複合体が細胞の発達をさらに阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含する。
【0030】
本明細書中で使用されるように、生物学的に活性な分子またはエフェクター分子は、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメイン、または酵素のような他の生体活性タンパク質を包含する。また含まれるのは、非タンパク質トキシン、細胞傷害剤、化学治療剤、検出可能な標識、放射性材料などである。
【0031】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響し、および細胞性免疫の任意の多くの複数の効果を担う細胞によって生成される任意の因子によって規定される。サイトカインの例としては、IL2、IL10、IL−4、IL−12、およびINF−γが挙げられるがこれらに制限されない。
【0032】
本発明のケモカインは、サイトカインに類似して、他の細胞に曝露される場合、細胞性免疫の任意の多くの複数の効果を担う任意の化学因子または分子として規定される。適切なケモカインは、MIP−1β、IL−8、MCP−1、およびRantesが挙げられるがこれらに制限されない。
【0033】
増殖因子は、特定の細胞に曝露される場合に、影響される細胞の増殖および/または分化を誘導する任意の分子を包含する。増殖因子は、タンパク質および化学分子を包含し、そのいくつかは:ヒト増殖因子および幹細胞増殖因子を包含する。さらなる増殖因子はまた、本明細書中に記載される用途のために適切である。
【0034】
トキシンおよび細胞傷害剤は、細胞に曝露される場合、致死効果または増殖に対する阻害効果を有する任意の物質を包含する。より詳細には、エフェクター分子は、例えば、ジフテリアトキシン(DT)、シガトキシン、アルビン、コレラトキシン、リシン、サポリン、シュードモナスエキソトキシン(PE)、ブタクサ抗ウイルスタンパク質、またはゲロニンのような植物または細菌起源の細胞トキシンであり得る。このようなトキシンの生物学的に活性なフラグメントは当該分野において周知であり、および例えば、DT A鎖およびリシンA鎖を包含する。さらに、トキシンは、例えば、ホスホリパーゼ酵素(例えば、ホスホリパーゼC)のような細胞表面で活性な薬剤であり得る。
【0035】
さらにエフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン、またはシスプラチンのような化学治療の薬物であり得る。
【0036】
さらに、エフェクター分子は、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン、チクローム、またはテキサスレッドのような蛍光標識;または放射性核種、例えば、ヨウ素−131、イットリウム−90、レニウム−188、またはビスマス−212のような診断または画像化研究のために適切な検出可能に標識された分子であり得る。エフェクターおよびタグを含むタンパク質を作製および使用することに関する開示について、例えば、Moskaugら、J.Biol.Chem.264、15709(1989);Pastan、I.ら、Cell 47、641、1986:Pantanら、新規な治療剤としての組換えトキシン、Ann.Rev. Biochem、61、331、(1992);「化学トキシン」OlsnesおよびPhil、Pharmac.Ther.、25、355(1982);公開されたPCT出願第WO94/29350号;公開されたPCT出願第WO94/04689号;および米国特許第5,620,939号を参照のこと。
【0037】
共有結合的に連結されるエフェクター分子を含むTCR融合または結合複合体は、いくつかの重要な用途を有する。例えば、TCR融合または結合複合体は、TCRを特異的に結合し得るある細胞にエフェクター分子を送達するために用いられ得る。従って、TCR融合または結合複合体は、リガンドを含む細胞を選択的に障害または殺傷する手段を提供する。TCR融合または結合複合体によって障害または殺傷され得る細胞または組織の例は、TCRによって特異的に結合され得る1つ以上のリガンドを発現する、腫瘍細胞およびウイルスまたは細菌で感染された細胞を包含する。障害または殺傷されることに敏感な細胞または組織は、本明細書中に開示される方法によって容易にアッセイされ得る。
【0038】
エフェクター分子に融合されるTCR融合複合体の特定の例は以下のようである;実施例5において以下に開示される、図1において図示される264 DNAベクターで哺乳動物の細胞をトランスフェクトすることによって生成され得るp264scTCRのようなscTCR。sc−TCR p264タンパク質融合複合体は、ヒトHLA抗原;HLA−2.1の情況において提示される野生型p53腫瘍抑制タンパク質からのプロセスされたペプチドフラグメントを認識する。sc−TCR p264およびそのペプチドリガンドは、Thebald、M.J.ら、PNAS(USA)(1995)、92:11993において開示されている。ペプチド配列はLLGRNSFEVである。腫瘍抑制タンパク質p53の発現は、悪性細胞においてアップレギュレートされる。全ての腫瘍細胞の50%が、表面上でp53の増加されたレベルを発現した(Holliston、M.D.ら、Science(1991)、253:49)。それゆえ、このエピトープについて特異的なscTCR分子は、トキシンで標識され、p53ペプチドフラグメントHLA−2.1リガンドを発現する悪性細胞に送達される。この標的特異的免疫治療は、悪性細胞のみを殺傷することに効果的である。インビトロでの細胞傷害性を測定するための方法は周知であり、以下に記載されるような従来の生存度アッセイを包含する。
【0039】
エフェクターに連結されるp149−TCRを含むsc−TCR分子は、他の重要な用途を有する。例えば、sc−TCR分子は、264ペプチドを発現するヒト乳ガン細胞を選択的に殺傷するために用いられる。トキシンで標識された264細胞が乳ガン細胞を殺傷する能力は、Eu3+放出細胞傷害性アッセイを用いる非放射性細胞・細胞傷害性アッセイで評価されるインビトロ研究が行われた。(Bouma、G.J.ら、(1992)Hum.Immunol.35:85)。融合されたエフェクター分子を含有するsc−TCR分子はインビボで容易に試験できる。例えば、インビトロ研究は、乳ガン細胞を発現するp264/HLA.A21をHLA/A2トランスジェニックマウスに移植することによって行われ得る(Theobaldら(1995)前出)。トキシンで標識されたscTCR p264分子は、予め決定された投薬量でマウスに注射され、sc−TCR分子の効力を調べるために腫瘍の大きさに対する効果が測定される。さらに、寿命の延長が、新規な抗腫瘍治療の効果を評価するための第2の基準として用いられる。
【0040】
その他の適切なエフェクターまたはタグ分子は公知である。例えば、1つのタグは生理学的pHで電荷を保有するポリペプチド、例えば6×HISである。この例において、TCR融合または結合複合体は、約pH6〜9にて6×HISタグを特異的に結合し得るNi−セファロースのような市販の金属−セファロース基質によって精製され得る。EEエピトープおよびmycエピトープは、適切なタンパク質タグのさらなる例であり、これらのエピトープは1つ以上の市販のモノクローナル抗体によって特異的に結合される。
【0041】
いくつかの設定において、例えば、sc−TCRの結合価を増加するために、本発明の多原子価のTCR融合または結合複合体を作製することが有用であり得る。簡潔に述べると、多価TCRタンパク質は、例えば、標準的なビオチン/ストレプトアビジン標識化技術を使用することによって、またはラテックスビーズのような適切な固体支持体への結合によって、1〜4個のタンパク質(同じものかまたは異なる)を共に共有結合的に連結することによって作製される。化学的に架橋される(例えば、デンドリマーに架橋される)タンパク質はまた適切な多価種である。例えば、タンパク質は、CysまたはHisのような化学的に反応性の側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列によって改変され得る。化学的に反応性の側鎖を伴うこのようなアミノ酸は、融合タンパク質中の種々の位置に、好ましくはTCRの抗原結合領域に対して遠位に、配置され得る。例えば、可溶性融合タンパク質のc−β鎖フラグメントのC末端は、タンパク質精製タグまたはこのような反応性アミノ酸を含む他の融合されるタンパク質に共有結合的に連結され得る。適切な側鎖は、多価分子作製において適切なデンドリマー粒子に2つ以上の融合タンパク質を化学的に連結するために必要である。デンドリマーは、それらの表面の多くの異なる官能基の任意の1つを有する合成化学ポリマーである(D.Tomalia、Aldrichmina Acta、26:91:101(1993))。本発明に従う使用のために適切なデンドリマーは、例えば、E9スターバーストポリアミンデンドリマーおよびE9コンバーストポリアミンデンドリマーを包含し、これらはシステイン残基を連結し得る。
【0042】
本明細書中で使用されるように、用語「細胞」は、任意の霊長類細胞または不死細胞株、組織または器官におけるようなこのような細胞の任意の群を包含する。好ましくは細胞は、哺乳動物、特にヒト起源のものであり、ならびに1つ以上の病原体によって感染され得る。本発明に従う「宿主細胞」は、感染された細胞であり得るか、またはこれは本明細書中に記載される核酸を増殖するために用いられるE.coliのような細胞であり得る。
【0043】
本発明に従うTCRペプチドに共有結合的に連結されるエフェクター分子は、多くの異なる利点を提供する。単一のエフェクター分子を含む本発明のTCR融合複合体が、生成され得、公知の構造のこのようなペプチドを包含する。さらに、広範に多様なエフェクター分子が、類似のDNAベクターにおいて生成され得る。すなわち、異なるエフェクター分子のライブラリーが、感染されたまたは罹患された細胞の提示のためにTCR分子に連結され得る。さらに、被験体へのTCR分子の投与ではなく、治療的適用のために、エフェクターペプチドに連結されたTCR分子をコードするDNA発現ベクターが、TCR融合複合体のインビボ発現のために投与され得る。このようなアプローチは、組換えタンパク質の調製に典型的に付随される高価な精製工程を回避し、ならびに従来のアプローチに付随される抗原取込みおよびプロセシングの複雑性を回避する。
【0044】
注記されるように、本明細書中に開示される融合タンパク質、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質トキシン、免疫グロブリンドメインまたは他の生体活性な分子、および任意のペプチドリンカーのような生物学的に活性な産物は、ほとんど任意の様式において組織化され得るが、但し、融合タンパク質はこれが意図される機能を有する。特に、融合タンパク質の各成分は、所望により、別の成分から少なくとも1つ分の適当なペプチドリンカー配列間隔をおいて配置される。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の同定および/または精製を容易にするためにタグを含み得る。より特定の融合タンパク質は以下の実施例にある。
【0045】
本発明のTCR融合複合体は好ましくはまた、TCRと生物学的に活性なペプチドとの間に挿入される柔軟なリンカー配列を包含する。リンカー配列は、TCR分子結合溝に生物学的に活性なペプチドが効果的に配されるようにすべきで、それによってT細胞レセプターは、提示されるMHCペプチド複合体を認識し、所望の部位に生物学的に活性な分子を送達することができる。エフェクター分子の首尾よい提示は、T細胞を細胞が増殖するように培養し、そしてT細胞と本発明のTCR融合複合体とを接触し、および次いでTCR融合複合体がさらなる細胞の発達を阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含するインビトロアッセイを含む以下に開示されるアッセイによって決定されるように、T細胞増殖を誘導もしくは阻害するための、または特定の部位に免疫応答を開始または阻害するかのいずれかの細胞の活性を調節し得る。
【0046】
本明細書中に開示される手順によって、および例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、プラスミドDNA調整、制限酵素でのDNAの解裂、オリゴヌクレオチドの調製、DNAのライゲーション、mRNAの単離、適切な細胞へのDNAの導入、宿主の形質転換または増殖、宿主の培養を含む、認識される組換えDNA技術によって達成され得る。さらに、融合分子は、カオトロピック剤、ならびに周知の電気泳動、遠心分離、およびクロマトグラフィー法を使用して単離し精製され得る。これらの方法に関して開示されている、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版(1989);およびAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York(1989)を参照のこと。
【0047】
本発明はさらに、核酸配列、および特には本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列を提供する。好ましくは、DNA配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファージミド、コスミド、YAC、またはエピソームのような染色体外複製に適するベクターによって保有される。特に、所望される融合タンパク質をコードするDNAベクターは、本明細書中に記載される調製法を容易にするために、また融合タンパく質の有意な量を得るために用いられる。DNA配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されるタンパク質コード配列の転写および翻訳について必要なエレメントを含むベクター中に挿入され得る。多様な宿主−ベクター系が、タンパク質コード配列を発現するために利用される。これらとしてはウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど)で感染された哺乳動物細胞系;ウイルスで(例えば、バキュロウイルス)で感染された昆虫細胞系;酵母ベクターを含む酵母、またはバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、もしくはコスミドDNAで形質転換された細菌等の微生物を包含する。利用される宿主−ベクター系に応じて、多くの適切な転写および翻訳エレメントの任意の1つが用いられる。概要は前出、Sambrookら、およびAusubelら、を参照のこと。
【0048】
一般に、本発明に従う好ましいDNAベクターは、5’から3’方向において、エフェクター分子をコードする配列に作動可能に連結されたTCR鎖をコードする第1のヌクレオチド配列の導入のための第1のクローニング部位を含む、ホスホジエステル結合によって連結されるヌクレオチド配列を含む。
【0049】
たいていの場合、DNAベクターによってコードされる融合タンパク質の各成分は、「カセット」形式で提供されることが好ましい。用語「カセット」は、標準的な組換え法によって、各成分が別の成分と容易に置換されることを意味する。DNAベクターがコードする融合複合体が、抗原型を発生させる能力があるかまたは発生させることができる病原体に対して使用される場合に、DNAベクターがカセットに組み込まれている形態が特に望ましい。
【0050】
TCR融合複合体をコードするベクターを作製するために、TCR分子をコードする配列は、適切なリガーゼの使用によってエフェクターペプチドをコードする配列に連結される。示されるペプチドについてのコード配列は、適切な細胞株のような天然の供給源からDNAを単離することによって、または公知の合成法、例えば、リン酸トリエステル法によって得ることができる。例えば、Oligonucleotide Synthesis、IRL Press(M.J.Gait編、1984)を参照のこと。合成オリゴヌクレオチドはまた、市販の自動化オリゴヌクレオチド合成器を使用して調製される。一旦単離されると、TCR分子をコードする遺伝子が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、または当該分野において公知の他の手段によって増幅され得る。TCRペプチド遺伝子を増幅するために適切なPCRプライマーは、PCR産物に制限部位を付加する。PCR産物は好ましくは、エフェクターペプチドについてのスプライス部位、およびTCR−エフェクター融合複合体の適切な発現および分泌に必要なリーダー配列を含む。PCR産物はまた好ましくは、リンカー配列、このような配列のライゲーションのための制限酵素部位をコードする配列を含む。
【0051】
本明細書中で記載される融合タンパク質は好ましくは、標準的な組換えDNA技術によって生成される。例えば、一旦TCRタンパク質をコードするDNA分子が単離されると、配列は、エフェクターポリペプチドをコードする別のDNA分子にライゲーションされ得る。TCR分子をコードするヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードするDNA配列、またはより典型的には、TCR分子をコードする配列と、エフェクターペプチドをコードする配列との間に挿入され得る本明細書中に考察されるようなリンカー配列をコードするDNA配列に直接的に結合され得、および適切なリガーゼを使用して結合される。得られるハイブリッドDNA分子は、TCR融合複合体を生成するために適切な宿主細胞中で発現され得る。DNA分子は、ライゲーションの後に、コードされるポリペプチドの転写フレームが変化されない(すなわち、DNA分子は互いにインフレームに連結される)ように、5’から3’の方向に互いに連結される。得られるDNA分子は、インフレームな融合タンパク質をコードする。
【0052】
他のヌクレオチド配列がまた、遺伝子構築物において含まれ得る。例えば、プロモーター配列は、エフェクターペプチドに融合されたTCRペプチドをコードする配列の発現を制御し、またはリーダー配列は、細胞表面もしくは培養培地にTCR融合複合体を指向し、構築物中に含まれ得るか、または構築物が挿入される発現ベクターに存在し得る。免疫グロブリンまたはCMVプロモーターは特に好ましい。
【0053】
融合タンパク質の成分は、それぞれの意図される機能を発揮できれば、ほとんど任意の順で組織化され得る。例えば、1つの実施態様において、TCRは、エフェクター分子のCまたはN末端に配置される。
【0054】
本発明のエフェクター分子は、そのドメインが意図する機能に応じたサイズになっているのが好ましい。本発明のエフェクター分子は、周知の化学架橋方法を含む多様な方法によって作製されTCRに融合される。例えば、Means、G.E.およびFeeney、R.E.(1974)タンパク質の化学修飾、Holden−Dayを参照のこと。また、S.S.Wong(1991)タンパク質結合および架橋の化学、CRC Pressを参照のこと。しかし、インフレームな融合タンパク質を作製するために組換え操作を使用することが一般に好ましい。
【0055】
注記されるように、本発明に従う融合分子または結合分子は、いくつかの方法によって組織化され得る。例示的な構築において、TCRのC末端が、エフェクター分子のN末端に作動可能に連結される。連結は、所望される場合、組換え法によって達成され得る。しかし、別の構築においては、TCRのN末端が、エフェクター分子のC末端に連結され得る。
【0056】
あるいは、またはさらに、1つ以上のさらなるエフェクター分子が、必要に応じてTCR融合または結合複合体に挿入され得る。
【0057】
本発明に従う好ましい融合および結合複合体は典型的に、配列中に作動可能に連結される(NからC末端):1)TCR/1つ以上のリンカー分子/および生物学的に活性な分子;2)TCR/リンカー分子/および生物学的に活性な分子;ならびに3)TCR/第1のリンカー分子/第1の生物学的に活性な分子のサブユニット/第2のリンカー分子/および第2の生物学的に活性な分子のサブユニット。さらに、EE、HA、Myc、およびポリヒスチジン、特に6×HISのような1つ以上のタンパク質タグは、所望されるように、例えば、溶解度を改善するためにまたはTCR融合および結合複合体の単離および同定を容易にするために、TCR鎖のN末端に融合され得る。
【0058】
リンカー配列は好ましくは、提示する抗原の認識のために、TCR分子の結合溝を効果的に配置し得るペプチドをコードするヌクレオチド配列である。本明細書中で使用されるように、句「TCR分子を連結する生物学的に活性なペプチドは効果的に配置される」、または他の類似の句は、TCRタンパク質に連結される生物学的に活性なペプチドが、生物学的に活性なペプチドが、細胞増殖を誘導するために、免疫反応を開始または阻害するために、または以下に開示されるアッセイによって決定されるように細胞発達を阻害または不活性化するためのいずれかで、エフェクター分子と相互作用でき、提示する細胞の活性を調節することができるように配置されることを意図的に意味するもので、アッセイは、細胞を細胞が増殖するように培養し、そして細胞と本発明のTCR融合複合体とを接触し、および次いでTCR融合タンパク質が細胞の発達をさらに阻害するか否かを評価する連続的な工程を包含する。
【0059】
好ましくは、リンカー配列は約7〜20個のアミノ酸、より好ましくは約8〜16個のアミノ酸を含む。リンカー配列は好ましくは、単一の所望されない配座において生物学的に活性なペプチドを保持しないように柔軟である。リンカー配列は、例えば、融合された分子から認識部位を間隔を空けて配置するために用いられる。具体的には、ペプチドリンカー配列は、TCR鎖とエフェクターペプチドとの間に、例えば、これを化学的に架橋するために、および分子柔軟性を提供するために配置され得る。リンカーは好ましくは優先的に、柔軟性を提供するために、グリシン、アラニン、およびセリンのような、小さな側鎖のアミノ酸を含む。好ましくは約80または90パーセントまたはそれ以上のリンカー配列は、グリシン、アラニン、またはセリン残基、特にグリシンおよびセリン残基を含む。ヘテロ2量体TCRを含むTCR融合複合体について、リンカー配列はTCR分子のβ鎖に適切に連結されるが、リンカー配列はまた、TCR分子のα鎖に付着され得る。あるいは、リンカー配列はまた、TCR分子のαおよびβ鎖に連結され得る。TCR β鎖分子にエフェクター分子ペプチドを共有結合的に連結するために、リンカーのアミノ酸配列は、TCR β鎖のN末端残基からエフェクター分子ペプチドのC末端残基までの適切な距離をわたり得るべきである。このようなβ+ペプチド鎖がα鎖と共に発現される場合、図1において一般に描写されるように、連結されたTCR−エフェクターペプチドは折り畳まれ、機能的なTCR分子になる。1つの適切なリンカー配列は、ASGGGGSGGG(すなわち、Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)であり、好ましくはTCRのβドメインの第1のアミノ酸に連結される。異なるリンカー配列が使用され得、抗体可変領域をともに結合するために首尾よく使用されている任意の多くの柔軟性のリンカー設計を含む。Whitlow、M.ら、(1991)Methods:A Companion to Methods in Enzymology2:97−105を参照のこと。適切なリンカー配列は、経験的に容易に同定され得る。さらに、リンカー配列の適切な大きさおよび配列はまた、TCR分子の予測される大きさおよび形状に基づく従来のコンピューターモデリング技術によって決定され得る。
【0060】
本発明のTCR融合複合体を発現するために多くの方法が用いられる。例えば、上記のTCR遺伝子融合構築物は、ベクターに制限酵素で解裂を作り該構築物を挿入するといった公知の手段によって適切なベクターに導入されライゲーションされる。次いで遺伝子構築物を含むベクターは、TCR融合ペプチドの発現のために適切な宿主に導入される。概要は前出、Sambrookらを参照のこと。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコルに関する因子に基づいて経験的に作製され得る。例えば、ベクターは、用いられる宿主と適合性であり、および宿主について正確な複製を有する。さらにベクターは、発現されるTCR融合複合体をコードするDNA配列を備えていなければならない。適切な宿主細胞は、真核生物および原核生物細胞、好ましくは容易に形質転換され得、および増殖培地中で迅速な増殖を示し得るこれらの細胞を包含する。具体的に好ましい宿主細胞は、E.coli、Bacillus subtillusなどのような原核生物、および動物細胞および酵母株、例えばS.cerevisiaeのような真核生物である。哺乳動物細胞はまた一般に好ましく、特にJ558、NSO、SP2−O、またはCHOが好ましい、他の適切な宿主は、例えば、Sf9のような昆虫細胞を包含する。従来の培養条件が使用される。Sambrook、前出を参照のこと。次いで、適切な形質転換されたまたはトランスフフェクトされた細胞株が選択される。本発明のTCR融合複合体を発現する細胞は、公知の手順によって決定され得る。例えば、免疫グロブリンに連結されるTCR融合複合体の発現は、連結された免疫グロブリンに特異的なELISAによって、および/または免疫ブロッティングによって決定され得る。
【0061】
概ね上述のように、宿主細胞は、所望される融合タンパク質をコードする核酸を増殖するための調製目的のために用いられる。従って、宿主細胞は、融合タンパク質の産生が特異的に意図される原核生物または真核生物細胞を包含し得る。従って、宿主細胞は具体的には、融合物をコードする核酸を増殖し得る酵母、ハエ、ケムシ、植物、カエル、哺乳動物の細胞および器官を包含する。用いられる哺乳動物細胞株の制限されない例は、CHOdhfr細胞(UrlaubおよびChasm、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77:4216(1980))、293細胞(Grahamら、J.Gen.Virol.、36:59(1977))、または黒色腫細胞様SP2もしくはNSOを包含する(Galfre及びMilstein、Meth.Enzymol.、73(B):3(1981))。
【0062】
所望される融合タンパク質をコードする核酸を増殖し得る宿主細胞は、非哺乳動物真核生物細胞をまた包含し、昆虫(例えば、Sp.fungiperda)、酵母(例えば、S.cerevisiae、S.ponbe、P.pastoris、K.lactis、H.polymorpha;概して、Fleer、R.、Current Opinion in Biotechnology、3(5):486496(1992)によって概説される)、真菌、および植物細胞を含む。また意図されるのは、E.coliおよびBacillusのようなある原核生物である。
【0063】
所望される融合タンパク質をコードする核酸は、細胞をトランスフェクトするための標準的な技術によって宿主細胞に導入され得る。用語「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」は、核酸を宿主細胞に導入するための全ての従来の技術を包含することが意図され、カルシウムリン酸共沈降、DEAE−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ウイルス形質導入、および/または取込を包含する。宿主細胞をトランスフェクトするための適切な方法は、Sambrookら、前出および他の実験室教科書において見出され得る。
【0064】
本発明はさらに、目的の融合タンパク質を単離するための生成プロセスを提供する。プロセスにおいて、宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌、または動物の細胞)は、調節配列に作動可能に連結される目的のタンパク質をコードする核酸が導入され、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するための融合タンパク質の存在下で培養培地中で生成規模にて増殖される。続いて、目的の融合タンパク質は採集された宿主細胞から、または培養培地から単離される。標準的なタンパク質精製技術が、培地からまたは採集された細胞から目的のタンパク質を単離するために用いられる。特に、精製技術は、ローラーボトル、スピナフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター、または発酵器を含む多様な実施から大規模に(少なくともミリグラムの量において)所望される融合タンパク質を発現および精製するために用いられる。
【0065】
発現されるTCR融合複合体は、公知の方法によって単離および精製され得る。典型的に培養培地は、遠心分離され、次いで上清は、親和性または免疫親和性クロマトグラフィー、例えば、連結されるTCRまたはその免疫グロブリン領域のような発現される融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含むプロテインAまたはプロテインG親和性クロマトグラフィーまたは免疫親和性クロマトグラフィープロトコルによって精製される。本発明の融合タンパク質は、公知の技術の適切な組み合わせによって分離および精製される。これらの方法は、例えば、塩沈降および溶媒沈降のような溶解度を使用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような分子量における差異を使用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーのような電荷における差異を利用する方法、親和性クロマトグラフィーのような特異的な親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性における差異を利用する方法、および等電点電気泳動のような等電点における差異を利用する方法、Ni−NTAのような金属親和性カラムを包含する。これらの方法に関する開示について、概して、Sambrookら、前出およびAusubelら、前出を参照のこと。
【0066】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも80%または90%〜95%の均一性(w/w)において好ましくは存在するように、これに天然に付随する細胞基質から単離されている。少なくとも98〜99%の均一性を有する融合タンパク質が、多くの薬学的な、臨床的な、および研究的な適用について最も好ましい。一旦実質的に精製されると、融合タンパク質は治療学的適用についての混入物が実質的にあってはならない。一旦、部分的にまたは実質的な純度に精製されると、可溶性融合タンパク質は、治療学的に、または本明細書中に記載されるようなインビトロまたはインビボアッセイを行うにおいて、用いられる。実質的な純度は、クロマトグラフィーおよびゲル電気泳動のような多様な標準的な技術によって決定され得る。
【0067】
本発明の短縮されたTCR融合複合体は、TCR融合複合体が発現後に培養培地に分泌され得るように十分に短縮されるTCR分子を含む。従って、短縮されたTCR融合複合体は、疎水性残基が豊富な領域、主としてTCR分子の膜貫通および細胞質ドメインを含まない。従って、本発明の好ましい短縮されたDR1 TCR分子について、TCR分子のβ鎖の約199〜237残基およびα鎖の約193〜230残基が、短縮されたTCR融合複合体中に含まれない。
【0068】
用語「誤って折り畳まれた」は、融合タンパク質に関しては、部分的にまたは完全にアンフォールドされる(すなわち、変性される)タンパク質が意味される。融合タンパク質は、以下に考察されるような1つ以上のカオトロピック剤との接触によって部分的にまたは完全に誤って折り畳まれる。より一般には、本明細書中に開示される誤って折り畳まれた融合タンパク質は、対応するネイティブなタンパク質の高いGibbs遊離エネルギー(ΔG)の形態の代表である。好ましいのは、通常正確に折り畳まれるネイティブな融合タンパク質であり、これは水溶液中で十分に可溶性であり、およびこれは比較的低いΔGを有する。従って、ネイティブな融合タンパク質はほとんどの例において安定性がある。
【0069】
従来のストラテジーの1つまたはその組み合わせによって融合タンパク質の誤った折り畳みを検出することが可能である。例えば、誤った折り畳みは、ネイティブな(コントロール)の分子および誤った折り畳みの分子を使用する旋光性測定を含む従来の生物理学的技術によって検出され得る。
【0070】
用語「可溶性」または類似の用語によって、融合分子、および特に融合タンパク質が、低い重力遠心分離(例えば、標準的な遠心分離における1分間あたり約30,000未満の回転)のもとでは、水性緩衝液、例えば細胞培地から、容易に沈降されないことが意味される。さらに、融合分子は、約5〜37℃以上の温度にて、またアニオンまたは非イオン洗浄剤の低濃度での存在下または非存在下、中性またはこれに近いpHで、水溶液中に残存する場合、可溶性である。これらの条件下、可溶性タンパク質はしばしば、低い沈降価、例えば、10〜50未満のsvedberg単位を有する。
【0071】
本明細書中で参照される水溶液は主に、約5〜9のpH範囲内にpHを、および約2mMと500mMとの間にイオン強度範囲を確立する緩衝化化合物を有する。時折、プロテアーゼインヒビターまたは穏やかな非イオン性洗浄剤が添加される。さらに、ウシ血清アルブミン(BSA)のようなキャリアタンパク質が、所望される場合、数mg/mlに添加される。例示的な水性緩衝液は、標準的なリン酸緩衝化生理食塩水、トリス緩衝化生理食塩水、または他の周知の緩衝液、および細胞培地処方物を包含する。
【0072】
本発明のTCR融合および結合複合体は、1つ以上の疾患によって感染される、または感染され得る多様な細胞を用いる、インビトロまたはインビボでの使用に適切である。
【0073】
TCR融合/結合治療の使用の説明として、培養された細胞が、単一の血清型の病原体によって感染され、次いで感染された細胞は、インビトロで特定の融合タンパク質と接触される。以前に考察されたように、融合タンパク質は、TCRの会合によって、感染された細胞にトキシンドメインが提示されるように配置される。細胞に生体活性分子の導入を提供した後(一般的に約30分未満)、細胞は約2〜24時間、通常約18時間までの間、その効力下に置かれ、その後適切な緩衝液または細胞培地中で洗浄され、次いで生存度について評価される。融合タンパク質による細胞殺傷または障害について割り当てられる時間は、選択される特定のエフェクター分子によって変わる。しかし生存度はしばしば、約2〜6時間、長くとも約24時間後に評価される。以下により詳細に記載されるように、細胞生存度は、周知の染料(例えば、トリパンブルー)または蛍光の取り込みをモニターすることによって容易に測定され、および定量される。
【0074】
本発明の融合分子によって形質導入された細胞は、標準的な方法によって生存度についてアッセイできる。1つのアプローチにおいて、細胞生存度は、形質導入後またはその間に、DNA複製を測定することによって容易にアッセイされる。例えば、好ましいアッセイは、放射線標識されたチミジンのような1つ以上の検出可能に標識されたヌクレオシドの細胞取り込みを包含する。取り込みは、トリクロロ酢酸(TCA)沈降、続いてシンチレーションカウンティングを含むいくつかの従来のアプローチによって簡便に測定され得る。他の細胞生存度法は、周知のトリパンブルー排除技術を包含する。
【0075】
本発明の融合複合体のTCR分子は適切に、天然に存在するTCR分子、例えば、ヒト、マウス、または他のげっ歯類、または他の哺乳動物のTCR分子にアミノ酸配列において対応する。
【0076】
従って、自己免疫または炎症応答の阻害のための本発明の1つの治療方法は、T細胞レセプターアンタゴニストエフェクター分子を含むTCR複合体を包含する。好ましくは、「短縮された」可溶性TCR複合体が投与され、すなわちTCR複合体は膜貫通部分を含まない。投与された可溶性TCR融合複合体のエフェクター分子としては、ある細胞に特異的であるか、所望される結果を作製するのに特異的であるものが選択され得る。このようなエフェクター分子は、当業者の方法によって容易に同定および選択され得る。エフェクターペプチド、すなわち、T細胞レセプターアンタゴニストまたは部分的なアゴニストを含むTCR融合複合体は、アレルギーおよび自己免疫疾患(例えば、多発性硬化症、インシュリン依存性真性糖尿病、および慢性リウマチ関節)の治療に有用である。
【0077】
免疫応答の誘導のための、本発明の別の治療方法は、サイトカインのような任意の同時刺激性エフェクター分子の存在下での本発明の1つ以上のTCR誘導複合体の有効量の投与を提供し、それによってTCRを結合する提示される抗原の位置で所望される免疫応答を誘導する。TCR融合複合体は、上記のように短縮された形態であり得、および可溶性タンパク質として投与され得る。あるいはTCR融合複合体は完全長であり得、すなわち、膜貫通部分を含む。これらの複合体での治療は、本発明の完全長TCR融合複合体およびエフェクター分子をコードするDNAベクターを含む有効量のDNA配列を哺乳動物に投与することを包含する。
【0078】
本発明に於ける様々な治療法は、疾患(disorder)のより有効な治療を提供するために、組み合わせて用いてもよいし、抗炎症薬等、他の公知の治療剤とともに用いてもよい。例えば、自己免疫異常およびアレルギーの治療のために、免疫抑制TCR融合複合体は、コルチコステロイドおよび非ステロイド剤等の抗炎症剤と組み合わせて用いてもよい。
【0079】
本発明の化合物は、悪性の疾病、疾患があるか、またはその疑いのあるヒト患者に特に有用である。本発明の化合物は、ヒト患者において特定の腫瘍抗原を標的化するのに特に有用である。本発明により治療される疾患の特定の例は、ガン(例えば、乳ガン、前立腺ガンなど);ウイルス感染(例えば、HCV、HIVなど)、ならびに本明細書中に言及される特定の疾患を包含する。
【0080】
理論に拘束されるのは望まないが、複合的また特異的に共有結合された本発明の化合物(すなわち、少なくとも1つのTCRと組み合わされた少なくとも1つの同定される抗ガン薬物)は、例えば被験体(患者)各々における標的抗原に薬物の標的化を増進することによって、抗ガン薬の効力を有意に向上させる。
【0081】
共有結合により、本発明の結合体はさらに、抗ガン剤およびTCRを、基本的に同時に対象の細胞に提示するが、該効果は、共有結合を伴わない本化合物の薬剤を「カクテル(混合)」処方にて投与する形態に於いては容易に得られないであろう。
【0082】
1つの薬物での治療は次いで、もう一つの薬物に患者を感作するという報告があった。従って、本発明の結合体を介する被験体細胞への、抗ガン薬およびTCRの基本的に同時の提示は、例えば、相乗効果的結果を提供することによって、および/または免疫応答の産生を増進することによって、薬物活性を向上させる。
【0083】
本発明の化合物の投与は、経口、局所(経皮、頬側、または舌下を含む)、鼻内、および非経口(腹腔内、皮下、静脈内、皮内、または筋肉内注射を含む)を含む多くの適切な経路によってなされ得、経口または非経口が一般に好ましい。投与の好ましい方法および投薬量は、例えば、レシピエント(患者)の状態および年齢によって異なる。
【0084】
本発明の化合物は、治療において、単独で、または所望の兆候を治療する認識された薬理学的活性を伴う医薬等、他の医薬と組み合わせて、用いられる。例示的な医薬としては、外科手術、放射線、化学治療、および他の形態の免疫治療(例えば、ワクチン、抗体ベースの治療)等、認識された治療を包含する。本発明の化合物は、必要に応じて、該治療の前に、間に、または後に投与される。
【0085】
本発明の1つ以上の化合物は単独で投与され得るが、これらはまた、従来の賦形剤、すなわち非経口、経口、または他の所望される投与に適切であり、および活性な化合物と有害に反応せず、およびそのレシピエントに対しても有害でない薬学的に受容される有機または無機キャリア物質との混合物中の薬学的組成物の部分として示される。本発明の薬学的組成物は一般に、本発明の1つ以上のTCR融合複合体、またはこのような融合複合体をコードするDNA構築物を、1つ以上の好ましいキャリアとともに包含する。キャリアは構築物の他の成分と適合性があるという意味で、「好ましい」のもでなくてはならず、およびそのレシピエント(患者)に対して有害であってはならない。適切な薬学的に受容されるキャリアは、水、塩溶液、アルコール、植物油、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸モノグリセリド、ジグリセリド、petroethral、ヒドロキシメチル−セルロース、ポリビニルピロリドンなどを含むが、これらに制限されない。薬学的調製物は滅菌され、そして所望により、補助剤、例えば、活性な化合物と有害に反応しない、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、浸透圧を影響するための塩、緩衝液、着色剤、香料、および/または芳香族物質などとともに混合される。
【0086】
非経口適用について、特に適切なものは、溶液、好ましくは、油性または水性溶液、ならびに懸濁液、乳化液、または座薬のような植え込み錠である。アンプルは、簡便な単位投薬量である。
【0087】
腸適用について、特に好ましいのは、錠剤、糖衣錠、またはタルクおよび/もしくは炭水化物キャリア結合剤を有するカプセルなどであり、キャリアは好ましくはラクトースおよび/またはコーンスターチ、および/またはジャガイモスターチである。甘味の媒体(vehicle)用にはシロップ、エリキシルなどが用いられる。これらを含む持続性放出組成物が処方され、その有効成分は、例えばマイクロカプセル化、多重コーティングのような、差別化分解性コーティング剤で保護される。
【0088】
本発明の治療化合物はまた、リポソームに取り込まれ得る。取り込みは、公知のリポソーム調製手順、例えば超音波処理および押し出し成形処理等のに従って行われる。リポソーム調製に適する従来の方法としては、例えば、A.D.Banghamら、J.Mol.Biol.、23:238−252(1965);F.Olsonら、Biochim.Biophys.Acta、557:9〜23(1979);F.Szokaら、Proc.Nat.Acad.Sci.、75:4194〜4198(1978);S.Kimら、Biochem.Biophys.Acta、728:339〜348(1983);およびMayerら、Biochim.Biophys.Acta、858:161〜168(1986)に開示される。
【0089】
本発明はまた、ヒトのような哺乳動物に免疫応答を誘起するための方法を提供し、感染因子またはガンのような標的される疾患に対して、ヒトのような哺乳動物をワクチン接種する工程を包含する。
【0090】
これらの方法は、本発明のTCR融合複合体をコードするDNAベクターを含むDNA配列の有効な量を哺乳動物に投与する工程を包含する。TCR融合複合体の発現ベクターの調製は上記され、および以降の実施例において記載される。プラスミドDNAの投与のための方法、投与された被験体の細胞によるDNAの取込み、およびタンパク質の発現は報告されている。例えば、Ulmer、J.B.ら、Science(1993)259:1745〜1749を参照のこと。
【0091】
本発明のTCR融合複合体をコードするDNAベクターは、好ましくは、筋肉内注入によってヒトを含む哺乳動物に適切に投与される。哺乳動物の骨格筋肉へのcDNAの投与は、その後の筋肉細胞による投与される発現ベクターの取込み、およびDNAによってコードされるタンパク質の発現とともに、Ulmerらによって記載されており、および例示的なプロトコルを示す[Ulmer、J.B.ら、Science 259:1745〜1749]。所定の治療に最適な投与量は従来の方法で決定される。
【0092】
ヒト疾患の治療に加えて、本発明のTCR融合および結合複合体、ならびにこのような融合複合体をコードする本発明のDNA構築物は、獣医学的適用、例えばウシ、ヒツジなどのような家畜、ならびにイヌおよび猫のようなペットの疾患の治療に有意に用いられる。
【0093】
所定の治療における本発明のTCR融合複合体またはこれをコードするDNA構築物の好ましい実際の投与量は、特定の活性化合物または使用される化合物、処方される特定の組成物、投与の態様、投与の特定の部位、患者の体重、健常度全般、性別等、治療されるべき特定の症状等、また担当医または獣医を含む当業者によって認識されるその他の因子によっても異なる。投与の所定のプロトコルについての最適な投与比率は、例えば、上述の指針に関して行われる従来の投薬量決定試験および本明細書中に開示されるアッセイにより、当業者によって容易に決定される。
【0094】
本明細書中で言及される全ての書類は、それらの全てが本明細書中に十分に援用される。以下の制限されない実施例は、本発明の説明である。
【0095】
【実施例】
実施例1
264 1本鎖(sc)TCRの構築
T細胞クローン、264は、HLA−A2.1によって制限されるヒト野生型腫瘍抑制タンパク質p53のペプチドフラグメント(アミノ酸264〜272;LLGRNSFEV)を認識する。T細胞受容体遺伝子は、可溶性TCRおよび機能的受容体分子を生成するために以前に示された3つのドメインの1本鎖形式にクローン化された。
【0096】
簡潔には、mRNAがT細胞クローンから単離され、cDNAがマラソン(Marathon)cDNA増幅キット(Clontech)を使用して作製された。cDNAクローンの配列決定は2つの異なるVα鎖(Vα3およびVα13)、ならびに単一のVβ鎖(Vβ3)を同定した。cDNAは、プライマーKC228およびKC229またはKC226およびKC227を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)における鋳型として使用されて、5’SfiI−3’SpeI Vα3またはVα13フラグメントをそれぞれ生成した。次いで同じDNAを、プライマーPRIB4およびKC176を用いるPCR鋳型として使用して、5’XhoI−3’XmaI VβCβ鎖フラグメントを作製した。Cβ鎖は、完全長Cβ鎖のアミノ酸127でのシステイン残基の直前を短縮された。
【0097】
αおよびβ鎖フラグメントは、DNA配列決定のためにpGEM−T Easy Vector System(Promega)にクローン化された。正確なフラグメントは、制限消化され、そして発現ベクターpKC60(係属中の米国特許出願第08/813,731号において以前に記載される)にクローン化されて、2つのVα−(G4S)4Vβ Cβ scTCR分子の、264−A(Vα3を伴う)および264−B(Vα13を伴う)を作製した。
【0098】
上記のDNA構築物(264−Aおよび264−B)は、それぞれ、プライマーET−TCRF1およびKC170またはET−TCRF2およびKC170を用いるPCRによって再増幅されて、5’AgeI−3’ClaI DNAフラグメントを作製した。フラグメントは、DNA配列決定のためにpGEM−T Easy Vector Systemにクローン化された。
【0099】
次いで、5’AgeI−3’ClaI DNAフラグメントは、それぞれ、プライマーKC232およびKC208またはKC231およびKC208を用いるPCRにおいて鋳型として使用されて、CD3ζ融合分子(以下に記載される)および最終的に264 IL−2融合分子(以下に記載される)へのクローニングのための、5’AgeI−3’HpaI DNAフラグメントを生成した。
【0100】
実施例2
CD3ζ融合ベクターの構築
2つのVα鎖のどちらが機能的であるかを決定するために、264−Aおよび264−B scTCRの両方が、CD3ζ融合分子として発現された。
【0101】
シャトルベクターの構築は、係属中の米国特許出願第09/422,375号において以前に記載されている。
【0102】
簡潔には、αおよびβ鎖TCRフラグメントを、発現ベクターpKC60にクローン化してVα−(G4S)4 Vβ Cβ scTCR分子を作製した。新規なベクターはpNAG2と命名された(図9)。次いで、pNAG2はプライマーKC203およびKC208を用いるPCRによって再増幅されて、5’AgeI−3’HpaI/BspEI/NruI/ClaI DNAフラグメントを作製した。scTCRフラグメントは、pGEM−T Easy Vector Systemにクローン化されて、そしてこの新規なpGEMベースのベクターは次いで、二特異的sc分子を作製するために他のDNAフラグメントの導入のための「シャトルベクター」として使用された。
【0103】
次いでSc−Fv DNAは制限消化され、そしてscTCRの下流に「シャトルベクター」にクローン化された。scTCRおよびscSc−Fvをともに、1本鎖融合タンパク質として連結するために、「シャトルベクター」を適切な制限酵素で消化して、以前のリンカーDNAフラグメントを除き、そしてscTCRとSc−Fvとの間のリンカー配列のライゲーションを可能にした。
【0104】
上述で概説されるように「シャトルベクター」設計において、停止コドンおよびスプライス部位が、「バック」プライマーKC208を用いるscTCRのPCR増幅の部分としてNruI制限部位とClaI制限部位との間に導入された。二特異的scタンパク質の下流精製を補助するために、アニールされたオリゴ(KC237およびKC238)のセットを、停止コドンおよびスプライス部位とともに3’EEタグ(EEEEYMPME)を導入するために設計した。アニールされたオリゴ対は、5’NruI−3’ClaIを、すでに完全な二特異的sc分子をコードする「シャトルベクター」にクローン化した。
【0105】
scTCR、Sc−Fv、リンカー、およびタグDNAフラグメントを「シャトルベクター」にクローニングして、二特異的sc分子設計を完了した後、DNAを制限消化(AgeI−ClaI)し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN27にクローン化した(図10)(pBISP/149を作製するための係属中の米国特許出願第08/943,086号において以前に記載される)(図11)。
【0106】
CD3ζ融合ベクターの構築
簡潔には、マウスcDNAを、プライマーKC312およびKC304を用いるポリメラーゼ連鎖反応における鋳型として使用して、5’HpaI−3’ClaIマウスCD3ζフラグメントを生成した。
【0107】
マウスCD3ζフラグメントを、DNA配列決定のためにpGEM−T Easy Vector Systemにクローン化した。正確なフラグメントを制限消化し、そして「シャトルベクター」にクローン化し、効果的に既存のリンカー、scFV、およびEEタグを除去した。
【0108】
CD3ζ遺伝子を「シャトルベクター」にクローニングした後、DNAをAgeI−HpaIで消化して、264−Aおよび264−B scTCRフラグメント(上記される)とのライゲーションを許容して、2つの新規なscTCR/CD3ζ融合体を作製した。最後に、新規なDNA調製物を制限消化(AgeI−ClaI)し、そして係属中の米国特許出願第09/422,375号において以前に記載される哺乳動物細胞発現ベクターpSUN28(pBISP/DO11.10ベクター)、図11にクローン化した。
【0109】
実施例3
264 scTCR/CD3ζ融合分子の発現
ジャーカット細胞を冷却DPBSで洗浄することによってトランスフェクションのために調製した。細胞をDPBS中に再懸濁し、そして20μgのPvuI直鎖化264−A/CD3ζまたは264−B/CD3ζDNAとともに混合した。氷上で5分間後、細胞を、250ボルトの1回のパルス、960u Fdまたは0.25u Fdを送達するために設定されたGene Pulser(BioRad)を使用してエレクトロポレートした。パルスされた細胞を、氷上に5分間置いた。細胞を10mlの10% IMDM培地(IMDM、10% FBS、2mM グルタミン)中に希釈し、そしてT−25cm2TCフラスコ中で、一晩、37℃にて5%CO2で増殖した。翌日、細胞を選択的な培地(10% IMDM+1.0mg/ml G418)を伴う96ウェルプレート中に置いた。1週間後、G418の濃度を2mg/mlに増加した。増殖するコロニーをトランスフェクションの約2週間後に再栄養補充し、そして約1週間後にスクリーニングした。
【0110】
トランスフェクトされたジャーカット細胞を、フローサイトメトリー分析を使用してscTCRの表面発現についてスクリーニングした。ポジティブなトランスフェクト体を、マウスTCRのCβドメインの部分を検出する、蛍光でタグされたmAb(H57−597)で染色することによって同定した。
【0111】
実施例4
正確な264 scTCR Vαドメインの同定
CD3ζ融合分子264−Aまたは264−Bバージョンのいずれかを発現するトランスフェクトされたジャーカット細胞を、細胞活性化アッセイにおいて使用した。アッセイにおいて、HLA−A2提示細胞株T2が、APCとして使用された。T2細胞を、264ペプチド(または非関連性のペプチド)とともに、一晩、37℃にて、5%CO2で負荷された。翌日、トランスフェクトされたジャーカット株を添加し、そしてペプチドでパルスされたAPCとの相互作用を一晩許容した。
【0112】
264で負荷されたAPCによるトランスフェクト体の特異的な刺激が、IL−2 ELISAを使用して評価された。抗ヒトIL−2 mAbを受動的に一晩、96ウェルプレート上でコートした。プレートを洗浄し、そして10% FBS/DPBSで1時間ブロックした。ブロッキング試薬を弾き落とし、そしてアッセイからの上清をプレートに1時間37℃にて添加した。洗浄後、結合されたIL−2を、ビオチンに結合された別の抗IL−2mAbを使用して検出した。37℃で45分間後、プレートを洗浄し、そしてストレプトアビジン−HRPを15分間添加した。最後、プレートを洗浄し、そしてABTS基質を使用して呈色した。吸光度を、405nmにて読み取った。
【0113】
細胞活性化アッセイに基づいて、Vα3ドメインは機能的であった。264−A分子のみが、264ペプチドで負荷されたAPCの存在下でIL−2を生成するために刺激された。
【0114】
実施例5
264 scTCR/IL−2融合分子の構築
scTCR/IL−2融合分子を作製するために、ヒトIL−2遺伝子が、DNA発現ベクターにクローン化されることが必要であった。
【0115】
簡潔には、全RNAを、Mini Total RNAキット(Qiagen)およびQiashredder(Qiagen)を使用して、ヒトジャーカット細胞から単離した。RNAを濃縮し、そして逆転写酵素および特異的なバックプライマー、KC328Bとの反応において使用し、そしてcDNAを作製した。cDNAを、プライマーKC327BおよびKC328Bを用いるPCRにおける鋳型として使用して、5’BspI−3‘NruIヒトIL−2遺伝子フラグメントを生成した。
【0116】
ヒトIL−2フラグメントを、配列決定のためにpGEM−T Easy Vector Systemにクローン化した。正確なフラグメントを制限消化し、そして「シャトルベクター」にクローン化し、効果的に既存するscFv遺伝子を取り出した。
【0117】
次いで「IL−2改変シャトルベクター」を、制限消化し(BspI−NruI)、そしてscTCR(上記される)をライゲーションして、scTCR/IL−2設計を完了した。最後に、DNAをAgeI−ClaI切断し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN28にクローン化した。
【0118】
実施例6
149scTCR/IL−2融合分子の構築
IL−2融合体の149scTCR(特許出願第09/422,375号において詳細に記載される)バージョンを作製するために、149scTCRを、5’AgeI−3’HpaIフラグメントとして「シャトルベクター」から切り出し(特許出願第09/422,375号の実施例7を参照のこと)、次いで「IL−2改変シャトルベクター」(上記される)にライゲーションした。次いで149scTCR/IL−2フラグメントを制限消化(AgeI−ClaI)し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN28にクローン化した。
【0119】
実施例7
scTCR/IL−2融合分子の発現
CHO細胞を、冷却DPBSで洗浄することによってトランスフェクションのために調製した。細胞をDPBS中に再懸濁し、そして20μgのPvuI直鎖化264scTCR/IL−2または149scTCR/IL−2とともに混合した。氷上で5分間後、細胞を、250ボルトの1回のパルス、960u Fdまたは0.25u Fdを送達するために設定されたGene Pulserを使用してエレクトロポレートした。パルスされた細胞を、氷上に5分間置いた。細胞を10mlの10% IMDM培地(IMDM、10% FBS、2mM グルタミン)中に希釈し、そしてT−25cm2TCフラスコ中で、一晩、37℃にて5%CO2で増殖した。翌日、細胞を選択的な培地(10% IMDM+1mg/ml G418)を伴う96ウェルプレート中に置き、約7日間後に再栄養補充した。
【0120】
トランスフェクト体をELISAアッセイ形式において可溶性融合分子の発現についてスクリーニングした。抗ヒトIL−2抗体を、受動的に一晩96ウェルプレート上にコートした。アッセイの日に、プレートを10%FBS/PBSで1時間ブロックした。ウェルを洗浄し、そしてトランスフェクト体からの上清をプレートに添加した。インキュベートおよび洗浄後、ビオチン化された抗Cβ mAb H57−597(細胞株はATCCから購入した)をプレートに添加し、続いて洗浄し、そしてストレプトアビジン−HRPとともにインキュベーションした。ポジティブなウェルをTMB基質の添加によって同定し、1N硫酸でクエンチし、そして450nMの吸光度にて読み取った。少数のポジティブなクローンが、増大のために使用され、そして限界希釈クローニングを、安定なトランスフェクト細胞株を確立するために行った。
【0121】
トランスフェクト体はまた、scTCRのそれぞれを特異的に認識するmAbを使用するELISAアッセイ形式において融合分子の発現についてスクリーニングされ、続いてビオチン化抗Cβ mAbおよびストレプトアビジン−HRPで検出された。149融合分子について、Vαドメイン(B20.1、Pharmagen)に対する立体配座的なmAbが、コーティング抗体として使用された。264融合分子は、そのVβドメインに対する立体配座的なmAbを使用して検出された(KJ25、Pharmingen)。
【0122】
実施例8
scTCR/IL−2融合タンパク質の精製
TCR/IL−2融合タンパク質を、標準的な親和性クロマトグラフィー法を使用して、トランスフェクト体上清から精製した。融合タンパク質を、濃縮するために抗TCR Coo特異的CNBr結合化アガロースカラムに適用した。簡潔には、上清は、カラム床を1回通過させ、PBSでの洗浄後、低pHのグリシン緩衝液(pH3.0)の添加によって結合したタンパク質をカラムから溶出して取り出し、そして1〜10希釈の2M Tris、pH8.0を添加して即座に中和した。次いで精製されたタンパク質を、30kD MVカットオフ濃度単位を使用してPBSに緩衝液交換した。最終的なタンパク質濃度は、OD280読み取りによって決定された。精製されたタンパク質のクマシーブルー染色(図2)および精製されたタンパク質の免疫ブロット解析(図2)は、264 scTCR−IL−2融合タンパク質の濃縮化を示す。
【0123】
実施例9
CTLL−2増殖アッセイ。
IL−2依存性マウスT細胞株、CTLL−2を、非放射性細胞増殖アッセイを使用して、264 scTCR−IL−2融合タンパク質のIL−2活性を評価するために使用した。264 scTCR−D融合タンパク質を、ネガティブコントロールとしてアッセイにおいて使用した。簡潔には、アッセイのために使用されたCTLL−2細胞を104細胞/mlで播種し、そして残余のIL−2を涸渇するために48時間増殖させた。48時間経過後、細胞は1.15×105細胞/mlの密度に増殖した。次いで細胞を採集し、そして10% IMDM(w/o IL−2)を使用して数回洗浄して、任意の残存するIL−2を除去した。96ウェル平底プレートをアッセイのために使用した。先ず、50μlの培地(10% IMDM)、培地w/IL−2または精製された264−IL−2もしくは264−k融合タンパク質を各ウェルに添加した。CTLL−2細胞を105細胞/50μlにて各ウェルに添加した。IL−2標準を同じプレートに対して行った。プレートを37℃にて5%CO2を伴って一晩インキュベートした。翌日、細胞死は、顕微鏡を使用して明らかに明白であった。細胞増殖/生存度を、Celltiter Assayを使用して評価した。CellTiter96アッセイは、Promega Corp.によって販売される水性の非放射性細胞増殖アッセイである。アッセイは、新規なテトラゾリウム化合物、MTS、および電子結合試薬;PMSの溶液から構成される。MTSは細胞によって、組織培養培地中で可溶性であるホルマザン(formazan)に生体還元される。490nmでのホルマザンの吸光度は、さらなるプロセシングを伴わないで96ウェルアッセイプレートから直接的に測定される。水性可溶性ホルマザンへのMTSの変換は代謝的に活性な細胞において見出される脱水素酵素によって達成される。490nm吸光度の量によって測定されるホルマザン産物の量は、培養物中における生存細胞の数の直接的な割合である。264/IL−2および264−k融合タンパク質は、1.25μg/ウェル〜0.0098μg/ウェルに希釈することによって活性について試験された。
【0124】
1つの実験からの結果は、図3において示される。IL−2依存性マウスT細胞株、CTLL−2は、非放射性細胞増殖アッセイで264 scTCR−IL−2融合タンパク質のIL−2活性を評価するために使用された。264 scTCR−k融合タンパク質は、ネガティブコントロールとしてアッセイにおいて使用された。
【0125】
実施例10
264 scTCR−IL−2融合タンパク質でのペプチドパルス化細胞の染色は機能的なscTCRを実証する。
【0126】
フローサイトメトリーおよび免疫蛍光染色が、ヒトBリンパ腫細胞株T2の表面上でのペプチド/HLA−A2複合体への、そのTCRを介する融合タンパク質の直接的な結合を示すために使用された(図4)。
A)0.5μg(10μg/ml)の264 scTCR−IL−2融合タンパク質での149または264ペプチドパルス化T2細胞の染色。264 scTCR−IL−2融合タンパク質は、264ペプチドを提示するT2細胞に特異的に結合するが、149ペプチドを提示するT2細胞には特異的に結合しない。
B)T2細胞を50μgの149または264ペプチドのいずれかでパルスした。各ペプチドのA2負荷を評価するために、ペプチドでの細胞の一晩のインキュベーション後に、細胞をHLA−A2特異的mAb BB7.2(0.05μg)で染色した。これらの実験からの結果は、いずれかのペプチドでパルスされたT2細胞上での等価なレベルのHLA−A2表面発現を示し、両方のペプチドの効果的なHLA−A2結合を示す。
【0127】
実施例11
264 scTCR−IL−2融合タンパク質によって特異的に媒介される細胞間結合
本実施例において、T2細胞は149または264ペプチドのいずれかでパルスされた。CTLL−2細胞を、ハイドロジエチジューム(HE)標識し、そして20分間室温で、50μgの149または264ペプチドのいずれかでパルスされた等数のカルセイン−AM標識化T2細胞とともにインキュベートした。図5は、1μgの融合タンパク質が、CTLL−2細胞および264ペプチドで負荷されたT2細胞を含有するインキュベーション混合物に添加された場合の細胞間の結合を示す(A;3.25%)。対照的に、149ペプチドでパルスされたT2細胞を含んだ混合物では結合体形成は観察されなかった(B;0.88%)。細胞サンプルを、フローサイトメーターでの分析の前に1回洗浄した。
【0128】
実施例12
scTCR/IgG(マウス)融合分子の構築は、係属中の米国特許出願第09/422,375号において以前に記載され、本明細書中に参考として援用される。
【0129】
145−2CII scScFv単独の、すなわち、二特異的sc分子の部分としてではない発現は非常に低いことが認識されていた。理論に拘束されることを望まないが、sc−Fv発現の低いレベルは、二特異的分子の発現における制限因子であり得る。ネイティブな145−2C 11ハイブリドーマ細胞株を抗体供給源として使用し、そして細胞をマウスIgG2b重鎖と融合されたscTCRでトランスフェクトした(図12)。トランスフェクトされたハイブリドーマ細胞株は、宿主ハムスターIgGがマウスIgG2b重鎖と効果的に対合され得る場合、いくつかの145−2C11/scTCRキメラ分子を分泌するはずである。
【0130】
p149scTCRをIgG融合体としてクローン化するために、先ず、部位特異的変異誘発を使用して、内部EcoRI制限部位を変異した。簡潔には所望される変異を含む、相補的なオリゴヌクレオチド、KC293およびKC294の対を設計した。pNAG2 DNA構築物を、Pfu DNAポリメラーゼを使用するプライマーを用いるPCRによって増幅した。得られるPCR産物を、親DNA鋳型を消化するDpnIで消化し、変異されたDNAインタクトを残した。変異されたscTCR DNAを配列決定し、次いでプライマーKC276およびKC268を用いるPCRによって再増幅して、5’NruI−3’EcoRI DNAフラグメントを作製した。変異されたscTCR DNAをDNA配列決定のために、pGEM−T Easy Vector Systemにクローン化した。正確なscTCR DNAを制限消化し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN7にクローン化して、p149 scTCR/IgG融合分子を作製した。
【0131】
DO 11.10 scTCR/IgG融合分子の構築
pKC60 DNA構築物を、プライマーKC275およびKC268を用いるPCRによって再増幅して、5’NruI−3’EcoRI DNAフラグメントを作製した。scTCRフラグメントを、DNA配列決定のためにpGEM−T Easy Vector Systemにクローン化した。正確なscTCR DNAを制限消化し、そして哺乳動物細胞発現ベクターpSUN7にクローン化して、DO 11.10scTCR/IgG融合分子(図12A/12Bを参照のこと)を作製した。
【0132】
マウスIgG2b発現ベクターの構築
マウスIgG2b(重鎖)発現ベクターの構築は以下のようであった。ベクターの主鎖は、プラスミドpCDNA3(Invitrogen)であった。プラスミドをHindIIIおよびXhoIで切断し、そして「軽鎖ポリリンカー」DNAフラグメントを挿入して、開始材料の「軽鎖ベクター」pCDNA3.LCPLを作製した。このリンカーは、制限部位HindIII、KpnI、ClaI、PmII、EcoRV、XmaI、BarnHI、およびXhoIを含み、その後のクローニング工程を容易にした。軽鎖リーダー、マウス抗CKMBκ軽鎖ゲノムフラグメント、および3’UTRを含有するSmaI−BclI DNAフラグメントを、pCDNA3.LCPLのEcoRV−BarnHI部位にクローン化した。次いで変異誘発を、NruI、MluI、およびBstBI部位を排除するために、ならびにNheIおよびBarnHI部位を導入するために行い、プラスミドpCDNA3mut.LCPL.LCVKを作製した。
【0133】
「重鎖ベクター」pCDNA3mut.HCPLを、軽鎖発現領域(HindIII−XhoI)を制限部位、HpaI、BspEI、EcoRV、KpnI、およびXhoIからなる「重鎖ポリリンカー」で置き換えることによって、pCDNA3mut.LCPL.LCVKプラスミドから構築した。このプラスミドは、EcoRVおよびKpnIで消化された。重鎖リーダーおよび抗CKMB IgG2bマウス重鎖ゲノムフラグメントを含むSmaIKpnI消化DNAフラグメント(Nearら、Molecular Immun.1990を参照のこと)は次いで、EcoRV−KpnI消化プラスミドにライゲーションされた。3’UTRおよびSalI部位の上流のNotI部位を含有するKpnI−SalIオリゴヌクレオチドフラグメントが続いて、KpnI−XhoI消化プラスミドにクローン化されて(XhoI部位をノックアウトする)、プラスミドpCDNA3mut.HCPL.HCV2bを作製し、これはまたマウスIgG2b発現ベクターpSUN7として知られる(図13)。
【0134】
実施例13−scTCR/IgG(ヒト)融合分子の構築。(pJRS355へのscTCR264のクローニング、およびIgG1融合体としての発現)。Kin Cardによって提供された264 scTCRのDNA調製物を、このscTCR構築物のPCR増幅のための鋳型として使用した。scTCRの再増幅を、264 TCR1sおよびKC268のプライマーセットを使用して行った。新規に設計された264 TCR1s配列は以下のように読める、5’−TTTCgTACgTCTTgTCCCAgTCAgTgACgCAgC−3’。このオリゴヌクレオチドは、Bsi WI制限エンドヌクレアーゼ部位およびB6.2リーダーを伴うように設計された。Takara ExTagポリメラーゼを、標準的なPCRプロトコルに従う増幅反応において使用した。増幅プロフィールは以下のようであった、1サイクルについて96℃/2分間;5サイクルについて96℃/30秒間、62℃/15秒間、72℃/30秒間;および30サイクルについて96℃/30秒間、68℃/1分間。Clontechプロトコルに従って正確なMW(約1.3Kbまでの)DNAバンドをゲル精製し、そしてPromegaのpGem−T easyベクターにクローン化した。ライゲーションおよびXL−1 Blue細胞への形質転換後、6つのクローンが選択され、そしてKim Cardによって提供された2つのプライマー、KC285およびKC288を用いた診断PCRによってスクリーニングされた。6つのうちの5つのクローンが、正確なMWのDNAバンドを生成した。DNA配列分析を、2つのクローン、scTCR264/pGemAおよびBに対して行い、各クローンは正確であることが見出された。二重消化(Bsi WIおよびRcoRI)反応を、クローンAおよびBについて設定した。正確なDNAフラグメントをゲル精製し、そしてともにプールした。精製された264 scTCRを、以前に調製されたpJRS355ベクターDNAにクローン化した。ライゲーションおよびXL−1 Blueへの形質転換後、2つのコロニーを選択した(A2およびB1)。それらのDNAのAlw NI消化は正確な制限パターンを示した。A2 DNAを用いた一過性のトランスフェクションは、TCRおよびIgG1イソタイプに特異的な抗体を用いるELISAアッセイを使用して決定されるように、264 scTCr/IgG1分子を生成した。
【0135】
実施例14.インビトロでの改変されたTCRの抗腫瘍効果の実証。
実施例11において、本発明者らはTCR/IL−2融合タンパク質が、T細胞と、正確なペプチドでパルスされた抗原提示細胞との間の結合を媒介し得ることを示した。本発明者らは今や、融合タンパク質によって媒介される架橋が、標的細胞の破壊を生じるか否かに興味がある。実際にそうであるか否かを決定するために、本発明者らはインビトロ殺傷アッセイを使用する。簡潔には、エフェクター細胞が、単離されたマウス脾細胞から作製され、および3日間、37℃にて5%CO2中、可溶性組換えヒトIL−2(50ng/ml)および抗CD30mAb(145−2C11;10ng/ml)での刺激の存在下、培養する。刺激を伴った3日間の培養後、抗CD8および抗CD25 mAbを使用する細胞の二重染色、ならびにフローサイトメトリーを行う。二重にポジティブな集団の検出は、エフェクターCTLの首尾よい生成の指標である。
【0136】
殺傷アッセイを、カルセイン−AM染料で標識した標的細胞(例えばペプチドパルス化T2細胞、種々のガン腫)を用いて行う。生存細胞(標的)は染料を取り込み、次いで洗浄され、そしてエフェクター細胞およびTCR/IL−2融合タンパク質またはポジティブもしくはネガティブなコントロールタンパク質のIL−2およびTCR−k融合体をそれぞれ含有する96ウェルプレートに添加される。エフェクター対標的細胞の比率は一般に5:1、10:1、および20:1である。アッセイ成分は次いで、2〜4時間、37℃にてインキュベートされ、そして培養上清へのカルセイン−AMの放出が測定される。カルセイン−AMの特異的な放出が測定されるか、または自発的に放出されるカルセイン−AMの非特異的コントロールに比較される。
【0137】
実施例15
改変されたTCRの抗腫瘍効果のインビボ実証。
TCR/IL−2融合タンパク質が、A2およびp53の両方を天然に発現するヒト腫瘍の排除を促進する能力を試験するために、本発明者らは、このような腫瘍が、NudeおよびSCIDマウスにおいて確立されたモデルを用いる。このモデルはまた、T細胞クローンおよびヒト腫瘍に対して指向される免疫サイトカインの効力を試験するためにSherman博士の実験室において使用されている。p53を発現することが知られ、および264特異的CTLによって特異的に殺傷される腫瘍は、NudeおよびSCIDマウスにおいて増殖するそれらの能力について試験される。候補は、MDA−238、BT549、MCF−7、Caski(頚ガン腫)、およびHepG2細胞を含む。細胞(1×106)は、NudeおよびSCIDマウスの皮下に移植され、そして治療の前の7日間確立させる。最初に、本発明者らは、TCR−IL−2融合分子を単独でマウスが受ける場合、腫瘍増殖が阻害されるか否かの評価の下で各構築物について決定する。本発明者らは、T細胞が腫瘍排除のためにエフェクター細胞として必要とされることを予測しているが、NudeおよびSCIDに存在する漏出に起因する他のリンパ細胞が、融合タンパク質によって誘起されるエフェクター機能を有し、これが腫瘍増殖を阻害することも考えられる。これは特に、生得的な免疫系の非リンパ成分を刺激し得るFcDorサイトカインを有する二特異的抗体分子の存在下で確かに起こり得る。一旦本発明者らが、融合タンパク質が腫瘍増殖を影響する能力を決定すると、次いで本発明者らは、エフェクター機能について異なるT細胞集団を試験する。マウス腫瘍モデルにおける以前の実験は、ナイーブなまたは活性化T細胞が送達されるか否かを決定するために必要な情報を提供する。コントロールの目的のために、本発明者らは、同時のTCR−IL−2融合治療を伴わないで、活性化T細胞をエフェクターとしてマウスに送達する。
【0138】
実施例16
ドキソルビシン(Dox)結合体の調製および抗腫瘍特性のインビトロでの特徴付け。
本実施例の目的は、264 scTCR−kおよびドキソルビシンのような細胞傷害性薬物を使用する免疫結合体を開発することである。Dox、薬物の多くのアントラサイクリンファミリーは、公知の最も強力な抗ガン薬物の1つであるが、臨床的な適用はその心毒性に起因して制限されている。心毒性を克服するための試みは、腫瘍部位に特異的に薬物を送達するために、抗腫瘍mAbのようなキャリア分子にDoxを付着することであった。前臨床モデルにおける研究からの結果は、Dox−免疫結合体が、等量の遊離薬物よりも少ない毒性で腫瘍細胞をより効果的に殺傷し得ることを実証した。
【0139】
本実施例において、本発明者らは、264 scTCR−Dox結合体を調製および精製し、次いでインビトロおよびインビボでのその腫瘍殺傷効果を特徴づけするために免疫結合体を用いるいくつかの研究を行う。先ず、scTCR−k融合タンパク質に結合される最適な数のDox分子が決定される。細胞によって内部移行されるDoxの量は、腫瘍殺傷の度合いおよび効果に直接的に影響する。それゆえ、本発明者らが、腫瘍細胞上で提示されるペプチド/MHC標的の数が制限されると考える場合、漸増数のDox分子をscTCR上に結合することが所望され得る。しかし、scTCRとDox群との間の結合の安定性は、Doxの分断と関連されるインビボでの非特異的細胞傷害性を防止するために十分に高くなければならない。集合的に、これらの研究からの知見は、前臨床研究においてTCR−Dox結合体の性能を予測するために用いられる。
【0140】
本発明の好ましい実施態様が特定の用語を使用して記載されたが、このような記載は例示の目的のためのみであり、および請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく変化および改変がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、可溶性264 1本鎖(sc)T細胞レセプター−κ定常鎖融合タンパク質(TCR−κ)の構築物設計および発現である。
図1Aは、κ定常鎖領域に共有結合的に連結される3つのドメインscTCRとして構築された264TCRを表す模式図。
図1Bは、還元および非還元の条件下で泳動された、精製された264scTCR−κ融合タンパク質ゲルを含有するクマシーブルー染色。
図1Cは、抗κ西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識された結合体でプローブされた精製された264scTCR−κ融合タンパク質の免疫ブロット。
【図2】 図2は、可溶性264 scTCR−IL−2融合タンパク質の構築物設計および発現を示す。
図2Aは、分子の検出を容易にするために含まれたEEペプチドタグを用いてIL−2遺伝子に共有結合的に連結された264 scTCR遺伝子を示す模式図。
図2Bは、精製された264scTCR−IL−2および264 scTCR−κ融合タンパク質を含有するタンパク質ゲルのクマシーブルー染色。
図2Cは、抗EEタグmAbおよびヤギ抗マウスHRP結合体でプローブされた精製された264scTCR−IL−2融合タンパク質の免疫ブロット解析。
【図3】 図3はバイオアッセイにおけるIL−2活性の例証的な結果を示す。
【図4】 図4は、264 sc−TCR−IL2融合タンパク質で染色された抗原提示細胞の例証的な結果を示す。
【図5】 図5は細胞結合アッセイの例証的な結果を示す。
【図6】 図6は、T細胞レセプターベースの治療剤についての形式に対する模式図である。
【図7】 図7は、scTCR標的化薬物送達によって媒介される腫瘍細胞殺傷の模式図である。
【図8】 図8は、Fc依存性細胞媒介性の細胞傷害性によって媒介される腫瘍細胞殺傷の模式図である。
【図9】 図9はpNAG2ベクターの模式的図解である。
【図10】 図10はpSUN27ベクターを示す模式図である。
【図11】 図11は、好ましい2特異性ハイブリッド分子pBISP/D011.10およびpBISP/149を示す図である。
【図12】 図12Aは、キメラ2特異性抗体分子を作製するための方法を示す模式図である。方法は、細胞の内側でsc−TCR/Ig融合分子(軽鎖)と結合する抗体鎖(重鎖)を作製するためにハイブリドーマ発現細胞(145−2C11ハイブリドーマ)を使用する。図12Bはsc−TCR/Ig分子についての好ましい構造を説明する。
【図13】 図13は、ベクターpSUN7ベクターを示す模式図である。
Claims (6)
- 可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体であって、ペプチドリンカーによって結合されるT細胞レセプターおよび生物学的に活性なポリペプチドを含有し、
ここでT細胞レセプターが、癌抗原の認識に特異的な1つの認識結合部位を有し、および生物学的に活性なポリペプチドが異なる認識結合部位を有する可溶性T細胞レセプター融合複合体において、
前記生物学的に活性なポリペプチドが、IL−2若しくはそのフラグメントであり、そして
前記T細胞レセプターが、V−α鎖、V−β鎖及びC−β鎖を含む1本鎖T細胞レセプターである、
可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体。 - 可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体を調製する方法であって、方法は以下の工程:
V−α鎖、V−β鎖及びC−β鎖を含む1本鎖T細胞レセプターを含有して成り、癌抗原の認識に特異的であるT細胞レセプター鎖を提供する工程;
IL−2若しくはそのフラグメントを含む生物学的に活性なポリペプチド鎖を提供する工程;
T細胞レセプター鎖および生物学的に活性なポリペプチド鎖をペプチドリンカーに連結する工程;ならびに
連結されたT細胞レセプター融合ポリペプチド複合体を回収し、それによって、T細胞レセプターが1つの認識結合部位を有し、生物学的に活性なポリペプチドがそれとは異なる認識結合部位を有する、可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体を作製する工程;
を包含する、方法。 - 癌又は腫瘍を治療するための治療用組成物であって、治療に有効な量の請求項1に記載の可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体、および滅菌の、薬学的に許容される担体を含有する、治療用組成物。
- ペプチドリンカーによって連結されたT細胞レセプターおよび生物学的に活性なポリペプチドを含有する可溶性T細胞レセプター融合複合体をコードする核酸であって、ここでT細胞レセプターが、癌抗原の認識に特異的な1つの認識結合部位を有し、および生物学的に活性なポリペプチドが異なる認識結合部位を有する可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体をコードする核酸であり、
前記生物学的に活性なポリペプチドが、IL−2若しくはそのフラグメントであり、そして
前記T細胞レセプターが、V−α鎖、V−β鎖及びC−β鎖を含む1本鎖T細胞レセプターポリペプチドである、
可溶性1本鎖T細胞レセプター融合複合体をコードする核酸。 - 核酸がDNAである、請求項4に記載の核酸。
- 核酸がRNAである、請求項4に記載の核酸。
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