DE102020125457A1

DE102020125457A1 - Amidierte Peptide und ihre deamidierten Gegenstücke, die durch HLA-A*02-Moleküle präsentiert werden, zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten

Info

Publication number: DE102020125457A1
Application number: DE102020125457.1A
Authority: DE
Inventors: Jens Hukelmann; Heiko Schuster; Ricarda Hannen; Christoph Schräder; Jens FRITSCHE; Franziska Hoffgaard; Daniel Kowalewski; Oliver Schoor
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2020-09-29
Publication date: 2022-03-31
Also published as: US20240075118A1; US20240016911A1; US11904003B2; CR20230172A; US20230338488A1; US20230414734A1; TW202229311A; AR123634A1; BR112023005798A2; US20240016906A1; US11833195B2; US20240024441A1; US20240024440A1; US20240016910A1; JP2023542997A; US20230285525A1; WO2022069557A2; MX2023003367A; US20240075119A1; US20240016909A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102, und (ii) eine Sequenzvariante davon, die die Fähigkeit aufrechterhält, an MHC-Molekül(e) zu binden und/oder T-Zellen zu induzieren, die mit der Peptidvariante kreuzreagieren, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.

Description

QUERVERWEIS AUF ZUGEHÖRIGE ANMELDUNGEN
n/a
VERWEIS AUF EIN SEQUENZPROTOKOLL, DAS ALS EIN KONFORMER ASCII-TEXT ALS TEXTDATEI (.txt) EINGEREICHT WURDE
Gemäß dem EFS-Web-Rechtsrahmen und 37 CFR §§ 1.821-825 (siehe MPEP § 2442.03(a)), Regel 30 EPÜ und § 11 PatV wird gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung ein elektronisches Sequenzprotokoll nach dem WIPO-Standard ST.25 in Form einer ASCII-konformen Textdatei eingereicht, in das der gesamte Inhalt des Sequenzprotokolls durch Verweis aufgenommen wird. Wenn zwischen den in der Spezifikation genannten Sequenzen und dem elektronischen Sequenzprotokoll Diskrepanzen bestehen, werden zur Vermeidung von Zweifeln die Sequenzen in der Spezifikation als die Richtigen angesehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Zellen zur Verwendung in immuntherapeutischen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Immuntherapie von Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin tumorassoziierte T-Zell-Peptidepitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, die zum Beispiel als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren, oder um T-Zellen ex vivo zu stimulieren und Patienten zu verabreichen. Peptide, die an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, oder Peptide als solche, können auch Ziele von Antikörpern, löslichen T-Zell-Rezeptoren und anderen Bindungsmolekülen sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuartigen Peptidsequenzen und deren Variante, die von Molekülen der HLA-Klasse-I menschlicher Tumorzellen abgeleitet sind, welche in Impfstoffkompositionen zur Auslösung von antitumoralen Immunantworten, oder als Targets für die Entwicklung von pharmazeutisch / immunologisch aktiven Verbindungen und Zellen verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) gehörte Krebs 2012 zu den vier bedeutendsten nicht übertragbaren tödlichen Krankheiten weltweit. Im selben Jahr wurden Darmkrebs, Brustkrebs und Atemwegskrebs unter den Top 10 der Todesursachen in Ländern mit hohem Einkommen aufgeführt.
In Anbetracht der schweren Nebenwirkungen und der Kosten, die mit der Behandlung von Krebs verbunden sind, besteht die Notwendigkeit, Faktoren zu identifizieren, die bei der Behandlung von Krebs eingesetzt werden können.
Es besteht auch die Notwendigkeit, Faktoren zu identifizieren, die Biomarker für Krebs darstellen und zu einer besseren Krebsdiagnose, Beurteilung der Prognose und Vorhersage des Behandlungserfolgs führen.
KREBSIMMUNTHERAPIE
Die Immuntherapie von Krebs stellt eine Möglichkeit dar, Krebszellen gezielt anzusprechen und gleichzeitig Nebenwirkungen zu minimieren. Die Krebsimmuntherapie nutzt die Existenz von tumorassoziierten Antigenen.
Zurzeit umfasst die Klassifizierung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) die folgenden großen Gruppen:

a) Cancer-Testis-Antigene: Die ersten jemals identifizierten TAAs, die von T-Zellen erkannt werden können, gehören zu dieser Klasse, die ursprünglich Cancer-Testis-Antigene (CT) genannt wurde. Da die Zellen des Hodens keine Klasse-I und II HLA-Moleküle exprimieren, können diese Antigene nicht durch T-Zellen im Normalgewebe erkannt werden und werden deshalb als immunologisch tumorspezifisch betrachtet. Bekannte Beispiele für CT-Antigene sind die MAGE Familienangehörigen und NY-ESO-1.
b) Differenzierungsantigene: Diese TAAs werden zwischen Tumoren und Normalgewebe, aus dem der Tumor entstanden ist, geteilt. Die meisten der bekannten Differenzierungsantigene finden sich in Melanomen und normalen Melanozyten. Beispiele enthalten, sind aber nicht beschränkt, auf Tyrosinase und Melan-A/MART-1 für Melanom oder PSA für Prostatakrebs.
c) Überexprimierte TAAs: Gene, die häufig exprimierte TAAs kodieren, wurden in histologisch unterschiedlichen Typen von Tumoren sowie in vielen gesunden Geweben - dort im Allgemeinen mit niedrigeren Expressionsniveaus, gefunden. Es ist möglich, dass viele der Epitope, die von Normalgeweben prozessiert und potentiell präsentiert werden, unter dem Schwellenwert für eine T-Zell-Erkennung sind, während die Überexpression in Tumorzellen durch Aufbrechen der vorher etablierten Toleranz eine Reaktion gegen Krebs auslösen kann. Bekannte Beispiele für diese Klasse von TAAs sind Her-2/neu, Survivin, Telomerase oder WT1.
d) Tumorspezifische Antigene: Diese einzigartigen TAAs entstehen durch Mutationen von normalen Genen (wie z. B. β-Catenin, CDK4, etc.). Einige dieser molekularen Veränderungen werden mit neoplastischen Transformationen und/oder Progression assoziiert. Tumorspezifische Antigene sind in der Regel in der Lage, ohne das Risiko für Autoimmunreaktionen gegen normales Gewebe zu tragen, eine starke Immunreaktion zu induzieren. Andererseits sind diese TAAs in den meisten Fällen nur mit Bezug auf den genauen Tumor, von dem sie identifiziert wurden, relevant und werden in der Regel nicht von vielen Einzeltumoren geteilt. Tumorspezifität (oder -assoziation) eines Peptids kann auch dann auftreten, wenn das Peptid aus einem tumorspezifischen (-assoziierten) Exon stammt, wenn es sich um Proteine mit tumorspezifischen (-assoziierten) Isoformen handelt.
e) Onkovirale Proteine: Diese TAAs sind virale Proteine, die in dem onkogenen Prozess eine entscheidende Rolle spielen können, und weil sie fremde (nicht menschlichen Ursprungs) sind, können sie eine T-Zellantwort hervorrufen. Beispiele für derartige Proteine sind die menschlichen Papillomavirus Typ 16 Virusproteine E6 und E7, die in zervikalen Karzinomen (Zervixkrebs) exprimiert werden. Menschliche endogene Retroviren (HERVs) machen einen wesentlichen Teil (~8%) des menschlichen Genoms aus. Diese viralen Elemente wurden vor Millionen von Jahren in das Genom integriert und seither über Generationen vertikal übertragen. Die überwiegende Mehrheit der HERVs hat durch Mutation oder Trunkierung an funktioneller Aktivität verloren, aber einige endogene Retroviren, wie die Mitglieder der HERV-K-Klade, kodieren noch funktionelle Gene und bilden nachweislich retrovirusähnliche Partikel.. Die Transkription von HERV-Proviren wird epigenetisch kontrolliert und ist unter normalen physiologischen Bedingungen stillgelegt. Reaktivierung und Überexpression, die zu einer aktiven Translation viraler Proteine führt, wurde jedoch bei bestimmten Krankheiten und insbesondere bei verschiedenen Krebsarten beschrieben. Diese tumorspezifische Expression von HERV-basierten Proteinen kann für verschiedene Arten der Krebsimmuntherapie genutzt werden.
f) TAAs, die aus abnormalen posttranslationalen Modifikationen entstehen: Solche TAAs können aus Proteinen entstehen, die weder spezifisch für, noch überexprimiert in Tumoren sind, die aber nichtsdestotrotz durch posttranslationale Prozesse, die primär in Tumoren aktiv sind, tumorassoziiert werden. Beispiele für diese Klasse entstehen aus veränderten Glykosylierungsmustern, die zu neuartigen Epitopen in Tumoren, wie für MUC1, oder Ereignissen, wie dem Proteinsplicing während des Abbaus, die tumorspezifisch oder auch nicht sein können, führen.

Die Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie sind Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch MHC-Moleküle präsentiert werden. Die Antigene, die von den tumorspezifischen T-Lymphozyten erkannt werden, bzw. deren Epitope, können Moleküle aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor hochreguliert sind.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-ll. MHC Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer alpha- schweren Kette und beta-2-Mikroglobulin, MHC Klasse-II-Moleküle bestehen aus einer alpha- und einer beta-Kette. Die dreidimensionale Konformation resultiert in einer Bindungsfurche, welche für die nichtkovalente Wechselwirkung mit Peptiden benutzt wird.
MHC-Klasse-I Moleküle können auf den meisten Zellen mit einem Zellkern vorkommen. Sie präsentieren Peptide, die aus einer proteolytischen Spaltung vorwiegend endogener Proteine, defekten ribosomalen Produkten (DRIPs) und größerer Peptide entstehen. Jedoch werden Peptide, die von endosomalen Kompartimenten oder exogenen Quellen abgeleitet sind, häufig auf MHC-Klasse-I-Molekülen gefunden. Dieser nicht-klassische Weg der Klasse-I-Präsentation wird in der Literatur als Kreuzpräsentation bezeichnet (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC-Kasse-II-Moleküle können vorwiegend auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) vorkommen und in erster Linie präsentieren Peptide von exogenen oder transmembranen Proteinen, die von den APCs während des Ablaufes der Endozytose aufgenommen und anschließend prozessiert wurden.
Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-I werden von CD8-positiven T-Zellen erkannt, die den adäquaten T-Zellrezeptor (TCR) tragen, wobei Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-II-Molekülen von CD4-positiven T-Helferzellen, die den adäquaten TCR tragen, erkannt werden. Es ist sicher bekannt, dass der TCR, das Peptid und der MHC in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1:1 vorliegen.
CD4-positive T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Induzierung und dem Aufrechterhalten von effektiven Antworten durch CD8-positive zytotoxische T-Zellen. Die Identifizierung von CD4-positiven aus tumorassoziierten Antigenen (TAA) abgeleiteten T-Zell-Epitopen ist von großer Bedeutung für die Entwicklung pharmazeutischer Produkte für die Auslösung antitumoraler Immunantworten. An der Tumorstelle unterstützen T-Helferzellen ein zytotoxisch T-Zellen (CTL)-freundliches Zytokinmilieu und ziehen weitere Effektorzellen an, z. B. CTLs, NK-Zellen, Makrophagen und Granulozyten.
In Abwesenheit einer Entzündung ist die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems, besonders auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel Monozyten, von Monozyten abgeleiteten Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen, begrenzt. Bei Krebspatienten wurde festgestellt, dass Tumorzellen MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren (Dengjel et al., 2006).
Verlängerte (längere) Peptide der Erfindung können als aktive MHC-Klasse-II-Epitope fungieren.
Durch MHC-Klasse-II-Epitope aktiviert T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle beim Steuern der Effektorfunktion der zytotoxischen T-Zellen (CTL) in der antitumoralen Immunität. T-Helferzell-Epitope, die eine T-Helferzellantwort des TH1-Types auslösen, unterstützen die Effektorfunktionen der CD8-positiven Killer-T-Zellen, welche zytotoxische Funktionen gegen Tumorzellen, die tumorassoziierte Peptid/MHC Komplexe auf ihrer Zelloberfläche präsentieren, beinhalten. Auf diese Weise können tumorassoziierte T-Helferzellen Peptidepitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren.
Da die konstitutive Expression von HLA-Klasse-II-Molekülen normalerweise auf Immunzellen beschränkt ist, wurde die Möglichkeit, Klasse-II-Peptide direkt aus primären Tumoren zu isolieren, als unmöglich angesehen. Allerdings konnten Dengjel et al. erfolgreich eine Anzahl von MHC-Klasse-II-Epitopen direkt von Tumoren identifizieren ( WO 2007/028574 , EP 1 760 088 B1 , deren Inhalt in vorliegenden Kontext durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Damit ein MHC-Klasse-I-Peptid eine zelluläre Immunantwort auslösen (initiieren) kann, muss es auch an ein MHC-Molekül binden. Dieser Vorgang ist vom Allel des MHC-Moleküls und von dem spezifischen Polymorphismus der Aminosäuresequenz des Peptids abhängig. MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel 8-12 Aminosäurereste lang und enthalten in ihrer Sequenz gewöhnlich zwei konservierte Reste („Anker“), die mit der entsprechenden Bindungsfurche des MHC-Moleküls interagieren. Auf diesem Weg hat jedes MHC-Allel ein „Bindungsmotiv“, welches bestimmt, welche Peptide spezifisch an die Bindungsfurche binden können .
In einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort müssen die Peptide nicht nur in der Lage sein, an spezifische MHC-Klasse-I-Moleküle, die von Tumorzellen exprimiert werden, zu binden, sie müssen anschließend auch noch von T-Zellen, die spezifische TCR tragen, erkannt werden.
Damit die Proteine durch die T-Lymphozyten als tumorspezifisches oder -assoziiertes Antigen erkannt werden, und um somit in einer Therapie eingesetzt werden zu können, müssen bestimmte Voraussetzungen erfüllt sein. Das Antigen soll hauptsächlich von Tumorzellen und nicht oder nur in vergleichsweise geringen Mengen von gesunden Normalgeweben exprimiert werden. Es kann von Vorteil sein, dass ein Peptid von Tumorzellen im Vergleich zu normalem gesunden Gewebe überpräsentiert wird. Weiterhin ist wünschenswert, wenn das betreffende Antigen nicht nur in einer Tumorart, sondern auch in hoher Konzentration vorliegt (z. B. Kopienzahl des entsprechenden Peptids pro Zelle). Tumorspezifische und tumorassoziierte Antigene sind oft aus Proteinen abgeleitet, die direkt, aufgrund ihrer Funktion beispielsweise in der Zellzyklus-Steuerung oder der Suppression der Apoptose, in die Transformation einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beteiligt sind. Zusätzlich können nachgeschaltete (downstream) Ziele der Proteine, die direkt für eine Transformation verantwortlich sind, hochreguliert werden und sind somit indirekt tumorassoziiert. Solche indirekt tumorassoziierten Antigene können auch Ziele eines Vakzinierungsansatzes sein (Singh-Jasuja et al., 2004, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Es ist auch das Vorliegen von Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens essentiell, damit sichergestellt ist, dass ein solches von einem tumorassoziierten Antigen abgeleitetes Peptid („immunogenes Peptid“) zu einer T-Zellantwort in vitro oder in vivo führt.
TAAs können ein Ausgangspunkt für die Entwicklung einer T-Zell-basierten Immuntherapie sein. Die Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der TAAs beruhen normalerweise zum einen auf dem Einsatz von T-Zellen, die aus Patienten oder gesunden Individuen isoliert werden können, oder basieren auf der Erstellung differentieller Transkriptionsprofile oder differentieller Peptidexpressionsmuster zwischen Tumoren und Normalgeweben. Das Auffinden von Genen, die in Tumorgeweben oder humanen Tumor-Zelllinien überexprimiert sind, oder die in derartigen Geweben oder Zelllinien selektiv exprimiert werden, liefert jedoch keine präzise Information für einen Einsatz der von diesen Genen transkribierten Antigene in einer Immuntherapie. Dies beruht darauf, dass nur eine individuelle Subpopulation der Epitope dieser Antigene für eine solche Anwendung geeignet ist, da eine T-Zelle mit einem entsprechenden TCR vorhanden sein muss und die immunologische Toleranz für dieses bestimmte Epitop muss nicht vorhanden oder minimal sein.
Beim Targeting von Peptid-MHC durch spezifische TCRs (z.B. lösliche TCRs) und Antikörper oder andere Bindungsmoleküle (Scaffolds) nach der Erfindung ist die Immunogenität der zugrunde liegenden Peptide sekundär. In diesen Fällen ist die Präsentation der entscheidende Faktor.
DEGLYKOSYLIERUNG UND ANSCHLIEßENDE DEAMIDIERUNG, DIE TUMORASSOZIIERTE PEPTIDE ERZEUGEN
TAAs können nicht nur aus Proteinen entstehen, die entweder tumorspezifisch oder überexprimiert sind. Sie können auch durch abnormale posttranslationale Modifikationen (PTMs) von Proteinen entstehen, die in Tumoren weder spezifisch noch überexprimiert sind: Solche TAAs können jedoch durch posttranslationale Prozesse, die primär in Tumoren aktiviert sind, zu Tumoren assoziiert werden.
Während posttranslationale Modifikationen das Repertoire des Immunpeptidoms verändern und erweitern, haben sie vielfältige Funktionen und Konsequenzen. Einige PTMs behindern die Bindung von modifizierten Peptiden an HLA-Komplexe, (Andersen et al., 1999)die zu immunologischen Ausweichstrategien von Tumorzellen beitragen können. Andere Modifikationen führen zu einer höheren HLA-Affinität oder einer erhöhten Immunogenität, die mit Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht wurde, (Arentz-Hansen et al., 2000; McGinty et al., 2015; Sidney et al., 2018; Raposo et al., 2018), aber für Immuntherapien bei malignen Erkrankungen genutzt werden kann (Zarling et al., 2006; Purcell et al., 2007; Petersen et al., 2009; Cobbold et al., 2013; Marcilla et al., 2014; Lin et al., 2019; Brentville et al., 2020).
Frühere PTM-Analysen identifizierten die Deamidierung als eine ziemlich weit verbreitete Modifikation der von HLA I präsentierten Immunopeptide (Han et al., 2011; Mei et al., 2020). Diese chemische Reaktion führt zu einer Aminosäureumwandlung von Asparagin (N) in Asparaginsäure (D) (Knorre, Kudryashova, and Godovikova 2009; Mei et al., 2020).
N-Deamidierung ist in Peptiden angereichert, die von membranassoziierten Proteinen stammen und mit dem Sequenzmotiv N[X^P][ST] assoziiert sind, wobei X eine beliebige Aminosäure außer Prolin ist, gefolgt von entweder einem Serin (S) oder Threonin (T) (Han et al., 2011; Cao et al. 2017; Mei et al., 2020). Dieses Motiv ist ein etabliertes Erkennungsmotiv für N-Glykosyltransferasen (Yan and Lennarz 2005; Petersen, Purcell, and Rossjohn 2009), welches N-Deamidierung mit naszierender Glykosylierung im endoplasmatischen Retikulum (ER) verknüpft. Mechanistisch gesehen werden Proteine oder Polypeptide während ihrer Translation im ER glykosyliert. Nach ihrem Export in das Zytoplasma werden sie durch Peptid-N-Glykanase (PNGase) deglykosyliert. Während dieses hydrolytischen Abbauprozesses wird auch der N-Rest zu D deamidiert, was zur terminalen Änderung der Aminosäuresequenz führt. Nach weiterem Abbau der Proteine oder Polypeptide im Proteasom werden die Peptide in das ER zurücktransportiert. Hier binden sie an HLA-Komplexe, die an die Zellmembran translozieren und die deamidierten Peptide auf der Zelloberfläche präsentieren (siehe ) (Misaghi et al., 2004; Petersen, Purcell, and Rossjohn 2009; Mei et al., 2020). Dieser Mechanismus ermöglicht es T-Zellenmöglicherweise, Zellen mit gestörter Glykosylierung während Infektionen, aber auch infolge eines veränderten Tumorzellstoffwechsels, zu erkennen und zu beseitigen.
Frühere PTM-Analysen identifizierten die Deamidierung als eine ziemlich weit verbreitete Modifikation der von HLA I präsentierten Immunopeptide (Han et al., 2011; Mei et al., 2020). Diese chemische Reaktion führt zu einer Aminosäureumwandlung von Asparagin (N) in Asparaginsäure (D) (siehe ) (Knorre et al., 2009; Mei et al., 2020).
Während die aberrante Glykosylierung bei Krebs anfänglich mit einer immunhemmenden Rolle (Liu and Rabinovich 2005; Rodrlguez et al., 2018; De Bousser et al., 2020) in Verbindung gebracht wurde, zeigt der kumulative Nachweis, dass sie auch für T-Zell-basierte Therapien genutzt werden kann. Dabei dienen entweder die Glykoproteine selbst (Posey et al., 2016; Mäher et al., 2016; Rodriguez, Schetters, and van Kooyk 2018; De Bousser et al., 2020) oder glykosylierungsabhängige deamidierte Peptide als Neo-Antigene und können gezielt angegriffen werden. Es gibt einige gut beschriebene Beispiele für die immunogene Rolle deamidierter Peptide in der Literatur mit humanen Immunschwächevirus Typ 1 Hüllglykoprotein (GP) (Behrens et al., 2017; Ferris et al., 1999), Hepatitis C GP E1 (Selby et al., 1999) und lymphozytärem Choriomeningitis-Virus GP 1 (Hudrisier et al., 1999)mit Peptiden von Krankheitserregern, sowie Tyrosinase-Peptide beim Melanom (Mosse et al., 1998; Schaed et al., 2002; Altrich-VanLith et al., 2006; Ostankovitch et al., 2009).
Daher dienen deamidierte Peptide und der oben beschriebene nicht-kanonische Weg der Antigenpräsentation als interessante Ziele für eine T-Zell-basierte Tumorimmuntherapie.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 102, und Sequenzvarianten davon, die an MHC-Molekül(e) bindet und/oder T-Zellen induziert, die mit der Peptidvariante kreuzreagieren, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.

Die folgenden Tabellen (Tabelle 1 und 2) zeigen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, ihre jeweiligen SEQ ID NOs und die voraussichtlichen Quell-(zugrunde liegenden) Gene für diese Peptide. Tabelle 1: Peptide gemäß der Erfindung. Zu beachten ist, dass die beiden benachbarten Peptide in jeder Zeile die Wildtypsequenz (rechte Spalte) sind, die ein potentielles N-Glykosylierungsmotiv und eine mutierte Version ohne dieses N-Glykosylierungsmotiv (linke Spalte) umfasst, wobei ein N (Asn)-Rest durch seine deamidierte Variante D (Asp) ersetzt wurde.

SEQ ID NO	DEAMIDIERTE SEQUENZ	SEQ ID NO:	WT-SEQUENZ
1	ILDSTTIEI	103	ILNSTTIEI
2	RLLEGDFSL	104	RLLEGNFSL
3	YMDGTMSQV	105	YMNGTMSQV
4	YVWDRTELL	106	YVWNRTELL
5	ALPQFFNDV	107	ALPQFFNNV
6	NLYNDLTNV	108	NLYNNLTNV
7	ALADLTGTV	109	ALANLTGTV
8	KLAPDLTEL	110	KLAPNLTEL
9	SLDDSLNEL	111	SLNDSLNEL
10	FLGEDISNFL	112	FLGENISNFL
11	GLVDGSSVTV	113	GLVNGSSVTV
12	FVDEHTIDI	114	FVDEHTINI
13	VLMDGTLKQV	115	VLMNGTLKQV
14	YIYDGKDMSSL	116	YIYDGKNMSSL
15	VLDDTLVIF	117	VLNDTLVIF
16	KLISDMGKDVSA	118	KLISDMGKNVSA
17	NVDSTILNL	119	NVNSTILNL
18	ILDEAKDISF	120	ILDEAKNISF
19	RLLDTTDVYLL	121	RLLNTTDVYLL
20	SLFAYPLPDV	122	SLFAYPLPNV
21	FLNLFDHTL	123	FLNLFNHTL
22	HMIDLTIHL	124	HMINLTIHL
23	FLGPIVDL	125	FLGPIVNL
24	QLLGRDISL	126	QLLGRNISL
25	FMNDRSFIL	127	FMNNRSFIL
26	ILYDGSNIQL	128	ILYNGSNIQL
27	YLFEDISQL	129	YLFENISQL
28	FLLDGTDMFHM	130	FLLNGTDMFHM
29	KLLDLTVRI	131	KLLNLTVRI
30	QLMEKVQDV	132	QLMEKVQNV
31	TLIDATWLV	133	TLINATWLV
32	ALADLTGTVVNL	134	ALANLTGTVVNL
33	ILFDLTHRV	135	ILFNLTHRV
34	SLLDGSESAKL	136	SLLNGSESAKL
35	SLRDGTEVV	137	SLRNGTEW
36	SLYDFTGEQMAA	138	SLYNFTGEQMAA
37	AIDDTAARL	139	AINDTAARL
38	AVDGTDARL	140	AVNGTDARL
39	AVFDQTVTVI	141	AVFNQTVTVI
40	FLDQTDETL	142	FLNQTDETL
41	FLDTSTADV	143	FLNTSTADV
42	IQDTSHLAV	144	IQNTSHLAV
43	KLLNDLTSI	145	KLLNNLTSI
44	LLDATHQI	146	LLNATHQI
45	SLFDDSFSL	147	SLFNDSFSL
46	SLSDVSQAV	148	SLSNVSQAV
47	VIDSTLVKV	149	VINSTLVKV
48	AIYHDITGISV	150	AIYHNITGISV
49	ALDDYTITF	151	ALDNYTITF
50	ALYDSTRELL	152	ALYNSTRELL
51	HLCNHDVSL	153	HLCNHNVSL
52	ILFDDSVFTL	154	ILFNDSVFTL
53	ILTDITGHDV	155	ILTDITGHNV
54	KLEERVYDV	156	KLEERVYNV
55	KTWDQSIAL	157	KTWNQSIAL
56	LLDSTAHLL	158	LLNSTAHLL
57	SLDISLPNL	159	SLNISLPNL
58	SQDASLLKV	160	SQNASLLKV
59	SQTDLSPAL	161	SQTNLSPAL
60	TLDITIVNL	162	TLNITIVNL
61	FISDFTMTI	163	FISNFTMTI
62	FLKDVTAQI	164	FLKNVTAQI
63	GLDRTQLVNV	165	GLNRTQLVNV
64	ILFDPDNSSAL	166	ILFDPNNSSAL
65	ILLDKSTVL	167	ILLNKSTVL
66	LLDDQTVTF	168	LLDNQTVTF
67	LLDTTDVYL	169	LLNTTDVYL
68	RLQDTTIGL	170	RLQNTTIGL
69	SLLDENDVSSYL	171	SLLDENNVSSYL
70	SMASFLKDV	172	SMASFLKNV
71	YLGAVFDL	173	YLGAVFNL
72	ALDSTNSEL	174	ALNSTNSEL
73	ALMDVSQNV	175	ALMNVSQNV
74	KILDFTGPLFL	176	KILNFTGPLFL
75	KLHDTSFCL	177	KLHNTSFCL
76	SLLRDFTLV	178	SLLRNFTLV
77	YLHGFDLSL	179	YLHGFNLSL
78	AIDQTITEA	180	AINQTITEA
79	ALAGLVYDA	181	ALAGLVYNA
80	ALDSSLQLL	182	ALNSSLQLL
81	AVDKTQTSV	183	AVNKTQTSV
82	FLNPDGSDCTL	184	FLNPNGSDCTL
83	FLNVDVSEV	185	FLNVNVSEV
84	KMLDETVLV	186	KMLNETVLV
85	LLDITNPVL	187	LLNITNPVL
86	NLADNTILV	188	NLANNTILV
87	NMYDLTFHV	189	NMYNLTFHV
88	RLLDETVDVTI	190	RLLNETVDVTI
89	SLFIDVTRV	191	SLFINVTRV
90	VLDGTEVNL	192	VLNGTEVNL
91	VLKDGTLVI	193	VLKNGTLVI
92	YLADFSHAT	194	YLANFSHAT
93	YLDGTFRLL	195	YLNGTFRLL
94	YLWWVNDQSL	196	YLWWVNNQSL
95	KLAPEDLADLTAL	197	KLAPEDLANLTAL
96	KLDASLPAL	198	KLNASLPAL
97	KLLDGSQRV	199	KLLNGSQRV
98	NLLADVSTV	200	NLLANVSTV
99	NLLDHSSMFL	201	NLLNHSSMFL
100	SLLFQDITL	202	SLLFQNITL
101	TLDATVVEL	203	TLNATVVEL
102	WLIDKSMEL	204	WLINKSMEL

Tabelle 2: Nicht-deamidierte Peptide gemäß der Erfindung und eine beispielhafte Quelltranskript-ID (ENST-ID aus der Ensemble-Datenbank https://www.ensembl.org/), von der sie abgeleitet sind; Peptide können weiterhin aus anderen zusätzlichen oder alternativen Transkripten stammen, die hier nicht aufgeführt sind. Es ist wichtig zu verstehen, dass die Quellen zwar für die Wildtyp-Varianten angegeben sind, dass sie aber auch für die deamidierten Gegenstücke gelten, wie in der Zusammenfassung von Tabelle 1 gezeigt.

SEQ ID NO:	SEQUENZ	TRANSCRIPT ID
103	ILNSTTIEI	ENST00000423485p915
104	RLLEGNFSL	ENST00000440542p117
105	YMNGTMSQV	ENST00000263321p369
106	YVWNRTELL	ENST00000295453p265
107	ALPQFFNNV	ENST00000304895p413
108	NLYNNLTNV	ENST00000251582p1094
109	ALANLTGTV	ENST00000294785p570
110	KLAPNLTEL	ENST00000369682p55
111	SLNDSLNEL	ENST00000380320p656
112	FLGENISNFL	ENST00000319136p273
113	GLVNGSSVTV	ENST00000294728p414
114	FVDEHTINI	ENST00000243077p267
115	VLMNGTLKQV	ENST00000230036p656
116	YIYDGKNMSSL	ENST00000261023p284
117	VLNDTLVIF	ENST00000326317p262
118	KLISDMGKNVSA	ENST00000223026p169
119	NVNSTILNL	ENST00000220244p418
120	ILDEAKNISF	ENST00000421865p1910
121	RLLNTTDVYLL	ENST00000225719p169
122	SLFAYPLPNV	ENST00000306243p360
123	FLNLFNHTL	ENST00000193322p189
124	HMINLTIHL	ENST00000265379p832
125	FLGPIVNL	ENST00000160262p314
126	QLLGRNISL	ENST00000392593p166
127	FMNNRSFIL	ENST00000477922p551
128	ILYNGSNIQL	ENST00000281772p112
129	YLFENISQL	ENST00000359650p35
130	FLLNGTDMFHM	ENST00000261800p2004
131	KLLNLTVRI	ENST00000219022p133
132	QLMEKVQNV	ENST00000264833p67
133	TLINATWLV	ENST00000305363p220
134	ALANLTGTWNL	ENST00000294785p570
135	ILFNLTHRV	ENST00000274276p323
136	SLLNGSESAKL	ENST00000225276p127
137	SLRNGTEVV	ENST00000258526p146
138	SLYNFTGEQMAA	ENST00000261023p293
139	AINDTAARL	ENST00000251081p627
140	AVNGTDARL	ENST00000278937p37
141	AVFNQTVTVI	ENST00000244763p188
142	FLNQTDETL	ENST00000227918p66
143	FLNTSTADV	ENST00000254508p924
144	IQNTSHLAV	ENST00000243776p359
145	KLLNNLTSI	ENST00000258341p646
146	LLNATHQI	ENST00000294785p53
147	SLFNDSFSL	ENST00000555868p168
148	SLSNVSQAV	ENST00000370454p67
149	VINSTLVKV	ENST00000256509p836
150	AIYHNITGISV	ENST00000368507p329
151	ALDNYTITF	ENST00000254508p1036
152	ALYNSTRELL	ENST00000238682p71
153	HLCNHNVSL	ENST00000388922p93
154	ILFNDSVFTL	ENST00000287497p1072
155	ILTDITGHNV	ENST00000265662p1670
156	KLEERVYNV	ENST00000262101p214
157	KTWNQSIAL	ENST00000367796p2211
158	LLNSTAHLL	ENST00000224721p2098
159	SLNISLPNL	ENST00000326654p27
160	SQNASLLKV	ENST00000240618p129
161	SQTNLSPAL	ENST00000367796p1268
162	TLNITIVNL	ENST00000397459p40
163	FISNFTMTI	ENST00000218436p80
164	FLKNVTAQI	ENST00000361866p801
165	GLNRTQLVNV	ENST00000264036p416
166	ILFDPNNSSAL	ENST00000305231p62
167	ILLNKSTVL	ENST00000271588p3724
168	LLDNQTVTF	ENST00000346145p529
169	LLNTTDVYL	ENST00000225719p170
170	RLQNTTIGL	ENST00000538324p109
171	SLLDENNVSSYL	ENST00000314191p3305
172	SMASFLKNV	ENST00000326303p240
173	YLGAVFNL	ENST00000367721p244
174	ALNSTNSEL	ENST00000355540p1393
175	ALMNVSQNV	ENST00000303354p1372
176	KILNFTGPLFL	ENST00000240487p298
177	KLHNTSFCL	ENST00000478191p59
178	SLLRNFTLV	ENST00000262607p181
179	YLHGFNLSL	ENST00000261800p325
180	AINQTITEA	ENST00000258341p1393
181	ALAGLVYNA	ENST00000371579p308
182	ALNSSLQLL	ENST00000380320p792
183	AVNKTQTSV	ENST00000281171p731
184	FLNPNGSDCTL	ENST00000358387p202
185	FLNVNVSEV	ENST00000237019p79
186	KMLNETVLV	ENST00000271588p1926
187	LLNITNPVL	ENST00000313984p155
188	NLANNTILV	ENST00000305139p343
189	NMYNLTFHV	ENST00000339381p429
190	RLLNETVDVTI	ENST00000266581p370
191	SLFINVTRV	ENST00000289547p134
192	VLNGTEVNL	ENST00000258796p349
193	VLKNGTLVI	ENST00000217939p1907
194	YLANFSHAT	ENST00000355396p420
195	YLNGTFRLL	ENST00000303375p1132
196	YLWWVNNQSL	ENST00000006724p177
197	KLAPEDLANLTAL	ENST00000360658p234
198	KLNASLPAL	ENST00000369762p168
199	KLLNGSQRV	ENST00000236040p464
200	NLLANVSTV	ENST00000268793p355
201	NLLNHSSMFL	ENST00000612687p765
202	SLLFQNITL	ENST00000221954p106
203	TLNATVVEL	ENST00000317620p268
204	WLINKSMEL	ENST00000374736p518

Die vorliegende Erfindung betrifft generell ferner die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von proliferativen Erkrankungen. Proliferative Erkrankungen im Kontext sind zum Beispiel akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom.
Besonders bevorzugt sind die Peptide - einzeln oder in Kombination - gemäß der vorliegenden Erfindung, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 ausgewählt sind.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft somit die Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zur - vorzugsweise kombinierten - Behandlung einer proliferativen Erkrankung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Fähigkeit aufweisen, an ein MHC-Molekül der Klasse-I oder - in längerer Form, wie beispielsweise einer Längenvariante - MHC-Klasse-II zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner verlängerte Peptide, die nach Verabreichung (z. B. als Impfstoff) intrazellulär prozessiert werden können, was zu kürzeren Peptiden führt, die im Wesentlichen aus den Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 bestehen oder aus diesen essentiell bestehen, die dann durch HLA auf der Zelloberfläche präsentiert werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin erfindungsgemäße Peptide, wobei die Peptide (jedes) aus einer Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 102 besteht oder im Wesentlichen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, das insbesondere an die N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR-Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii) fusioniert oder an (oder in die Sequenz) eines Antikörpers fusioniert ist, wie beispielsweise eines Antikörpers, der spezifisch für dendritische Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure, die die erfindungsgemäßen Peptide kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, und/oder sie exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten und in der Medizin, insbesondere bei der Behandlung von Krebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antikörper, die spezifisch gegen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung oder Komplexe dieser erfindungsgemäßen Peptide mit MHC sind, und Verfahren zu deren Herstellung.
Die vorliegende Offenlegung kann sich auch auf Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers beziehen, der spezifisch an ein MHC-Klasse-I-Molekül bindet, das mit einem Peptid komplexiert ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 umfasst, aus dieser besteht oder essentiell besteht, einschließlich der Immunisierung gentechnisch veränderter nicht-menschlicher Säugetierzellen, die Zellen enthalten, die das MHC-Klasse-I-Molekül mit einer löslichen Form eines MHC-Klasse-I-Moleküls exprimieren, das mit einem Peptid komplexiert ist, das aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 besteht oder essentiell besteht; Isolieren von mRNA-Molekülen aus Antikörper-produzierenden Zellen des nichthumanen Säugetiers; Herstellen einer Phagen-Display-Bibliothek, die Proteinmoleküle anzeigt, die von den mRNA-Molekülen kodiert werden; und Isolieren mindestens eines Phagen aus der Phagen-Display-Bibliothek, wobei der mindestens eine Phage den Antikörper anzeigt, der spezifisch an das MHC-Klasse-I-Molekül bindet, das mit einem Peptid komplexiert ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 umfasst, aus dieser besteht oder essentiell besteht. In einerm anderen Aspekt kann es sich bei dem Antikörper um einen monoklonalen Antikörper handeln.
In einem Aspekt kann der Antikörper an das MHC-Klasse-I-Molekül binden, das mit einem Antigen komplexiert ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 mit einer Bindungsaffinität (K_d) von <100 nM, bevorzugter <50 nM, bevorzugter <10 nM, bevorzugter <1 nM, bevorzugter <0,1 nM, bevorzugter <0,01 nM umfasst, aus dieser besteht oder essentiell besteht.
In einem anderen Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Humanisierung des Antikörpers umfassen. In Aspekten können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Konjugation des Antikörpers mit einem Toxin umfassen. In einem anderen Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Konjugation des Antikörpers mit einer immunstimulierenden Domäne umfassen.
In einem Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Modifikation des Antikörpers in Form eines bispezifischen Antikörpers umfassen. In einem anderen Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Modifizierung des Antikörpers in Form eines chimären Antikörpers umfassen. In einem anderen Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Modifizierung des Antikörpers in Form eines Fv umfassen. In einem Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Modifikation des Antikörpers in Form eines Fab umfassen. In einem weiteren Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers auch die Modifikation des Antikörpers in Form eines Fab' umfassen. In einem anderen Aspekt können die Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers ferner die Markierung des Antikörpers mit einem Radionukleotid umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt werden kann, die aus ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹l, ³H, ³²P, und ³⁵S besteht, umfassen. In einem anderen Aspekt kann das nicht-menschliche Säugetier eine Maus sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner TCRs, insbesondere lösliche TCR und klonierte TCRs, die in die autologen oder allogenen T-Zellen eingesetzt wurden, und Verfahren zu deren Herstellung, sowie auf NK-Zellen oder andere Zellen, die den TCR tragen oder mit den TCRs kreuzreagieren. Der lösliche TCR kann eine Bindungsaffinität (K_d) <100 nM haben, bevorzugter <50 nM, bevorzugter <10 nM, bevorzugter <1nM, bevorzugter <0,1 nM, bevorzugter <0,01 nM aufweisen. Wohingegen die auf klonierten Zellen basierende TCR eine Bindungsaffinität (K_d) <50 µM, bevorzugter <25 µM, bevorzugter <10 µM, bevorzugter <1 µM, bevorzugter <0,1 µM aufweisen kann.
Die Antikörper und TCRs sind weitere Ausführungsformen der immuntherapeutischen Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, oder einen Expressionsvektor, wie zuvor beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine antigenpräsentierende Zelle und bevorzugt eine dendritische Zelle ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Antigen auf ein MHC-Klasse-I oder Il-Molekül beladen ist, welches an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder künstlichen Antigen-präsentierende Zelle durch in Kontakt bringen einer ausreichenden Menge des Antigens mit der Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die antigenpräsentierende Zelle einen Expressionsvektor umfasst, der in der Lage ist, das Peptid, das SEQ ID No 1 bis SEQ ID NO: 102 enthält, exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner aktivierte T-Zellen, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wobei die T-Zelle selektiv eine Zelle erkennt, die ein Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend beliebige erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aberrant exprimieren, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Anzahl von T-Zellen an den Patienten, wie sie nach der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines beliebigen Peptids wie beschrieben, der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, des Expressionsvektors gemäß der vorliegenden Erfindung, der Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung, des aktivierten T-Lymphozyten, des TCR oder des Antikörpers oder anderer Peptid- und/oder Peptid-MHC-bindender Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung als Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments. Vorzugsweise ist das Medikament gegen Krebs wirksam. Vorzugsweise ist das Medikament eine Zelltherapie, ein Impfstoff oder ein Protein auf Basis eines löslichen TCRs oder Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebsarten Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Biomarker auf den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, die im vorliegenden Kontext „Targets“ genannt werden, welche bei der Diagnostik von Krebs, vorzugsweise akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, verwendet werden können. Der Marker kann eine Überpräsentation des(der) Peptids(e) selbst oder eine Überexpression des(der) entsprechenden Gens(e) sein. Die Marker können auch verwendet werden, um die Erfolgswahrscheinlichkeit einer Behandlung, vorzugsweise einer Immuntherapie, vorherzusagen, und am meisten bevorzugt ist eine Immuntherapie, die auf das gleiche Ziel abzielt, das durch den Biomarker identifiziert wird. So kann beispielsweise ein Antikörper oder ein löslicher TCR verwendet werden, um Abschnitte des Tumors zu färben, um das Vorhandensein eines Peptids von Interesse im Komplex mit MHC nachzuweisen.
Optional trägt der Antikörper eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder ein Toxin.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser neuartigen Targets im Rahmen einer Krebsbehandlung.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Stimulation einer Immunantwort hängt von der Präsenz von Antigenen ab, die vom Immunsystem des Wirts als fremd erkannt werden. Die Entdeckung der Existenz von tumorassoziierten Antigenen hat die Möglichkeiten erweitert, das Immunsystem des Wirts dafür zu nutzen, um ins Tumorwachstum einzugreifen. Gegenwärtig werden verschiedene Mechanismen zur Einbindung beider, sowohl der humoralen als auch der zellularen Zweige des Immunsystems für die Krebsimmuntherapie, untersucht.
Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind in der Lage, Tumorzellen spezifisch zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von T-Zellen aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen. Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen, die MHC-Moleküle der Klasse I erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 12 Aminosäurereste von Proteinen oder defekten ribosomalen Produkten (DRIPS), die im Zytosol lokalisiert sind, haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
Wie hier verwendet und wenn nicht anders beschrieben, werden alle Begriffe so verwendet, wie weiter unten definiert.
Die Bezeichnung „T-Zell Antwort“ meint die spezifische Proliferation und die Aktivierung von Effektorfunktionen, die durch ein Peptid in vitro oder in vivo induziert wird. Für die MHC-Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Zellen können die Effektorfunktionen der Lysis von Peptid-gepulsten, Peptid-Vorläufer-gepulsten oder natürlichen Peptidpräsentierenden Zielzellen, die Sekretion von Zytokinen, bevorzugt Interferon-gamma, TNF-alpha oder IL-2 induziert durch Peptide, die Sekretion von Effektormolekülen, bevorzugt Granzyme oder Perforine induziert durch Peptide oder Degranulation, sein.
Der Begriff „Peptid“ wird hier verwendet, um eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carboxylgruppen der angrenzenden Aminosäuren verbunden sind, zu kennzeichnen.
Darüber hinaus umfasst der Begriff „Peptid“ Salze einer Reihe von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carboxylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch akzeptable Salze der Peptide, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Triflurazetat) Salze. Es muss angemerkt werden, dass die Salze der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung erheblich von den Peptiden in ihrem Zustand / ihren Zuständen in vivo abweichen, da die Peptide in vivo nicht als Salze oder mit Gegenionen assoziiert vorliegen.
Der Begriff „Peptid“ umfasst auch „Oligopeptid“. Der Begriff „Oligopeptid“ wird hier verwendet, um eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carboxylgruppen der angrenzenden Aminosäuren verbunden sind, zu kennzeichnen. Die Länge des Oligopeptides ist für die Erfindung nicht entscheidend, solange das korrekte Epitop oder die korrekten Epitope darin beibehalten werden.
Der Begriff „Polypeptid“ kennzeichnet eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und den Carboxylgruppen der angrenzenden Aminosäuren verbunden sind. Die Länge des Polypeptides ist für die Erfindung nicht entscheidend, solange die korrekten Epitope beibehalten werden. Im Gegensatz zu den Begriffen „Peptid“ oder „Oligopeptid“ soll der Begriff „Polypeptid“ Proteinmoleküle bezeichnen, die mehr als 30 Aminosäureresten enthalten.
Ein Peptid, Oligopeptid, Protein oder Polynukleotid, welches ein solches Molekül kodiert, ist „immunogen“ (und somit ein „Immunogen“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung), wenn es in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen. Im Fall der vorliegenden Erfindung wird „Immunogenität“ spezieller definiert als die Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu induzieren. Somit wäre ein „Immunogen“ ein Molekül, welches in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, und im Fall der vorliegenden Erfindung, ein Molekül, welches in der Lage ist, eine T-Zellantwort zu induzieren. In einem weiteren Aspekt kann das Immunogen das Peptid, der Komplex des Peptids mit MHC-Molekül, ein Oligopeptid und/oder Protein, das verwendet wird, um spezifische Antikörper oder TCRs gegen es zu erzeugen, sein.
Ein Klasse-I T-Zell-„Epitop“ benötigt ein kurzes Peptid, das an einen Klasse-I-MHC-Molekül gebunden ist und einen tertiären Komplex bildet (MHC-Klasse-I alpha-Kette, beta-2-Microglobulin und Peptid), welcher durch eine T-Zelle erkannt werden kann, die einen passenden T-Zellrezeptor, der an den MHC/Peptid-Komplex mit einer angemessenen Affinität bindet. Peptide, die an MHC-Klasse-I-Moleküle binden, sind typischerweise 8-12 Aminosäuren lang und besonders typisch 9 Aminosäuren lang.
Bei Menschen gibt es drei verschiedene genetische Loci, die für MHC-Klasse-I-Moleküle kodieren (die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozytenantigene (HLA) bezeichnet): HLA-A, HLA-B und HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 und HLA-B*07 sind Beispiele für MHC-Klasse-I-Allele, die von diesen Loci exprimiert werden.
Die Peptide der Erfindung, vorzugsweise wenn sie in einem erfindungsgemäßen Impfstoff beinhaltet sind, wie im vorliegenden Kontext beschrieben ist, binden an HLA-A*02. Ein Impfstoff kann auch pan-bindende MHC-Klasse-II-Peptide beinhalten. Daher kann der erfindungsgemäße Impfstoff zur Behandlung von Krebs bei Patienten verwendet werden, die HLA-A*02-positiv sind, während aufgrund des pan-bindenden Charakters dieser Peptide keine Auswahl für MHC-Klasse-II-Allotypen erforderlich ist.
Wenn HLA-A*02-Peptide der Erfindung mit Peptiden kombiniert werden, die an ein anderes Allel, z. B. HLA-A*24, binden, kann ein höherer Prozentsatz jeder Patientenpopulation behandelt werden, als wenn man nur ein MHC-Klasse-I-Allel anspricht. Während in den meisten Populationen weniger als 50% der Patienten mit einem Allel allein behandelt werden könnten, kann ein Impfstoff, der HLA-A*24 und HLA-A*02-Epitope umfasst, mindestens 60% der Patienten in jeder relevanten Population behandeln. Insbesondere die folgenden Prozentsätze von Patienten werden für mindestens eines dieser Allele in verschiedenen Regionen positiv sein: USA 61%, Westeuropa 62%, China 75%, Südkorea 77%, Japan 86% (kalkuliert mit allelefrequencies.net).
In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff „Nukleotidsequenz“ auf ein Heteropolymer von Desoxyribonukleotiden.
Die Nukleotidsequenz, die ein bestimmtes Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid kodiert, kann natürlich vorkommen oder synthetisch konstruiert sein. Im Allgemeinen werden DNA-Segmente, die die Peptide, Polypeptide und Proteine dieser Erfindung kodieren, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder einer Serie von Oligonukleotidlinkern zusammengeführt, um ein synthetisches Gen zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, in einer rekombinanten Transkriptionsregulationseinheit, die regulatorische Elemente abgeleitet von mikrobiellen oder viralen Operons enthält, exprimiert zu werden.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „ein Nukleotid, das für (oder kodierend) ein Peptid kodiert“ auf eine Nukleotidsequenz, die für das Peptid kodiert, einschließlich künstlicher (durch Menschen gemacht) Start- und Stoppcodons, die für das biologische System kompatibel sind, wobei die Sequenz beispielsweise durch eine dendritische Zelle oder ein anderes Zellsystem exprimiert werden soll, das für die Herstellung von TCRs geeignet ist.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, umfasst ein Verweis auf eine Nukleinsäuresequenz sowohl Einzelstrang- als auch Doppelstrang-Nukleinsäuresequenzen. So bezieht sich, zum Beispiel für DNA, die spezifische Sequenz, solange der Zusammenhang nichts Gegenteiliges besagt, auf die Einzelstrang-DNA einer solchen Sequenz, den Duplex einer solchen Sequenz mit seinem Komplement (Doppelstrang-DNA) und dem Komplement einer solchen Sequenz.
Die Bezeichnung „kodierende Region“ bezieht sich auf den Teil eines Genes, der entweder natürlich oder normal das Expressionsprodukt des Genes in seinem natürlichen genomischen Umfeld kodiert, d. h. die Region, die in vivo das native Expressionsprodukt des Genes kodiert.
Die kodierende Region kann von einem nicht-mutierten („normalen“), mutierten oder geänderten Gen abgeleitet sein, oder kann sogar von einer DNA-Sequenz, oder einem Gen sein, die vollständig im Labor anhand der für den Fachmann bekannten Verfahren auf dem Fachgebiet der DNA-Synthese synthetisiert wurden, abgeleitet sein.
Der Begriff „Expressionsprodukt“ bedeutet das Polypeptid oder Protein, welches das natürliche Translationsprodukt des Genes ist und jeder Nukleinsäuresequenz, die Äquivalente, welche aus einer Degenerierung des genetischen Codes resultieren, und damit die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren.
Der Begriff „Fragment“, wenn er sich auf eine kodierende Sequenz bezieht, bedeutet einen Teil DNA, umfassend weniger als die komplette kodierende Region, dessen Expressionsprodukt essentiell die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das Expressionsprodukt der kompletten kodierenden Region behält.
Der Begriff „DNA-Segment“ bezieht sich auf einen DNA-Polymer in der Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren DNA-Konstruktes, welche von DNA erhalten wurde, die zumindest einmal in substantiell reiner Form isoliert wurde, d. h. frei von kontaminierendem endogenen Materialien und in einer Menge oder Konzentration, die die Identifikation, Manipulation und Recovery des Segmentes und seiner Nukleotidsequenzkomponenten durch biochemische Standardverfahren, zum Beispiel durch Nutzung von Klonvektoren, erlauben. Solche Segmente werden in der Form von offenen Leserastern (Open Reading Frames, ORFs), nicht unterbrochen durch interne nicht-translatierende Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorkommen, bereitgestellt. Die Sequenzen der nichttranslatierenden DNA können nachgeschaltet (downstream) des offenen Leserasters vorkommen, wo diese nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen interferieren.
Der Begriff „ein pharmazeutisch akzeptables Salz“ bezieht sich auf ein Derivat der offenbarten Peptide, wobei das Peptid durch Herstellung von Säure- oder Basensalzen des Agents modifiziert ist. Zum Beispiel werden Säuresalze aus der freien Base (typischerweise, wenn die neutrale Form des Wirkstoffes eine neutrale -NH2-Gruppe aufweist) unter der Einbeziehung der Reaktion mit einer geeigneten Säure hergestellt. Geeignete Säuren zur Herstellung von Säuresalzen schließen sowohl organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und ähnliche Säuren, als auch anorganische Säuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnliche, ein. Umgekehrt, werden Präparationen basischer Salze der sauren Reste, die in einem Peptid vorhanden sein können, unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Trimethylamin oder ähnlichen, hergestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Peptide als Salze der Essigsäure (Acetate), Trifluoracete oder der Salzsäure (Chloride).
Der Begriff „Promoter“ meint eine Region der DNA, die an der Bindung von RNA-Polymerase zur Initialisierung der Transkription beteiligt ist.
Der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass das Material aus seiner originären Umgebung entfernt wurde (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, welches in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, getrennt von einigen oder allen in dem natürlichen System vorkommenden Materialien, ist isoliert. Solche Polynukleotide können Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynukleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung sein und immer noch isoliert sein, indem so ein Vektor oder eine Zusammensetzung nicht Teil der natürlichen Umgebung ist.
Die Polynukleotide und die rekombinanten oder immunogenen Polypeptide, offenbart im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, können auch in „aufgereinigter“ Form vorliegen. Der Begriff „aufgereinigt“ verlangt keine absolute Reinheit, vielmehr ist er als relative Definition zu verstehen, und kann Zusammensetzungen enthalten, die hoch aufgereinigt sind, oder Zusammensetzungen, die nur teilweise aufgereinigt sind, da diese Begriffe sehr gut von Fachmännern in dem relevanten Gebiet verstanden werden. Zum Beispiel wurden individuelle Klone, die aus einer cDNA Bibliothek isoliert wurden, in herkömmlicher Weise durch elektrophoretische Homogenität aufgereinigt. Die Aufreinigung von Anfangsmaterialien oder natürlichen Materialien um zumindest eine Größenordnung, bevorzugt zwei oder drei Größenordnungen und weiter bevorzugt vier oder fünf Größenordnungen, ist ausdrücklich beinhaltet. Des Weiteren ist ein beanspruchtes Polypeptid, welches eine Reinheit von bevorzugt 99,999 %, oder zumindest 99,99 % oder 99,9 % und auch noch wünschenswerterweise 99 % per Gewicht oder höher hat, ausdrücklich erfasst.
Die Nukleinsäuren und polypeptidischen Expressionsprodukte, die entsprechend der vorliegenden Erfindung offenbart werden, sowie Expressionsvektoren, die solche Nukleinsäuren und/oder solche Polypeptide enthalten, können in „angereicherter Form“ vorliegen. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „angereichert“, dass die Konzentration des Materials zumindest das 2-, 5-, 10-, 100 oder 1000-fache ihrer natürlichen Konzentration (zum Beispiel) ist, vorteilhafterweise 0,01 %, per Gewicht, bevorzugt zumindest um 0,1 % per Gewicht. Angereicherte Abmischungen von etwa 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % und 20 % bei Gewicht werden auch in Betracht gezogen. Die Sequenzen, Konstrukte, Vektoren, Klone und andere Materialien, die die vorliegende Erfindung umfasst, können vorteilhafterweise in einer angereicherten oder isolierten Form vorliegen. Der Begriff das „aktive Fragment“ meint ein Fragment, normalerweise eines Peptids, Polypeptids oder einer Nukleinsäuresequenz, das eine Immunantwort auslöst (d.h. immunogene Aktivität), wenn es alleine oder gegebenenfalls mit einem geeigneten Adjuvans oder Vektor einem Tier, wie zum Beispiel einem Säugetier, zum Beispiel einer Maus, einer Ratte, Lama, Schaf, Ziege, Hund oder Pferd, und auch einem Menschen verabreicht wird, wobei die Immunantwort die Form einer stimulierenden T-Zellantwort innerhalb des behandelten Tieres, wie eines Menschen, annimmt. Alternativ kann das „aktive Fragment“ auch verwendet werden, um eine T-Zellantwort in vitro zu induzieren.
Wie in dieser Kontext verwendet, beziehen sich die Begriffe „Teil“, „Segment“ und „Fragment“, wenn sie in Bezug auf Polypeptide verwendet werden, auf eine fortlaufende Sequenz von Resten, so wie Aminosäurereste, die eine Untergruppe einer größeren Sequenz bilden. Zum Beispiel würden die Oligopeptide, die dadurch entstehen, wenn z. B. ein Polypeptid mit einer beliebigen der üblich verwendeten Endopeptidasen, wie beispielsweise Trypsin oder Chymotrypsin, behandelt wird, Teile, Segmente oder Fragmente der Ausgangspolypeptide darstellen. Wenn sie in Bezug auf Polynukleotide verwendet werden, beziehen sich diese Begriffe auf Produkte, die durch die Behandlung von den Polynukleotiden mit jeglicher Endonuklease erhalten werden.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „prozentuale Identität“ oder „prozentual identisch“ in Bezug auf eine Sequenz, dass eine Sequenz mit einer beanspruchten oder beschriebenen Sequenz nach einem Alignment der zu vergleichenden Sequenz (die „Vergleichssequenz“) mit der beschriebenen oder beanspruchten Sequenz (die „Referenzsequenz“) verglichen wird. Die prozentuale Identität wird dann entsprechend der folgenden Formel bestimmt: $Prozentuale Identit \ddot{a} t = 100 [I - (C/R)]$
wobei C die Anzahl der Unterschiede zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz über die Länge des Alignments zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz ist, wobei

(i) jede Base oder Aminosäure in der Referenzsequenz, die keine korrespondierende Base oder Aminosäure in der Vergleichssequenz hat, und
(ii) jeder Gap in der Referenzsequenz und
(iii) jede Base oder Aminosäure in der Referenzsequenz, die sich von der alignten Base oder Aminosäure in der Vergleichssequenz unterscheidet und
(iiii) das Alignment muss an Position 1 der alignten Sequenzen beginnen;

Wenn ein Alignment zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz besteht, für welches die prozentuale Identität, wie oben berechnet wird, gleich oder größer als eine spezifizierte minimale prozentuale Identität ist, dann besitzt die Vergleichssequenz die spezifizierte minimale prozentuale Identität zu der Referenzsequenz, auch wenn es Alignments geben mag, in denen die oben berechnete prozentuale Identität geringer als die spezifizierte prozentuale Identität ist.
Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung somit ein Peptid bereit, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 ausgewählt wird, oder einer Variante davon, die T-Zellen induzieren wird, mit dem Peptid kreuzzureagieren. Die Peptide der Erfindung weisen die Fähigkeit auf, an ein MHC-Molekül der Klasse-I oder verlängerte Versionen der Peptide - zu Klasse-II zu binden. In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „homolog“ auf den Grad der Identität (siehe prozentuale Identität oben) zwischen den Sequenzen von zwei Aminosäuresequenzen, d. h. Peptid oder Polypeptid-Sequenzen. Die zuvor erwähnte „Homologie“ wird durch den Vergleich von zwei Sequenzen, die unter optimalen Bedingungen auf die Sequenzen ausgerichtet sind, die verglichen werden müssen. Solch eine Sequenzhomologie kann durch das Bilden eines Alignments unter Benutzung von, zum Beispiel, dem ClustalW-Algorithmus, errechnet werden. Allgemein erhältliche Sequenzanalysesoftware, spezifischer, Vector NTI, GENETYX oder andere Tools werden durch öffentliche Datenbanken zur Verfügung gestellt.
Ein Fachmann wird in der Lage sein, zu beurteilen, ob die T-Zellen, die durch eine Variante eines spezifischen Peptids induziert wurden, in der Lage sind, mit dem Peptid selbst kreuzzureagieren (s. zum Beispiel Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Unter einer „Variante“ einer vorgegebenen Aminosäuresequenz verstehen die Erfinder, dass zum Beispiel die Seitenketten von einem oder zwei der Aminosäurereste in einer Weise verändert sind (zum Beispiel durch ihren Austausch durch die Seitenkette des Restes einer anderen natürlich vorkommenden Aminosäure oder einer anderen Seitenkette), so dass das Peptid immer noch in derselben Weise wie das Peptid bestehend aus der vorgegebenen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO: 102 an ein HLA-Molekül binden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid so modifiziert werden, dass es die Fähigkeit, mit der Bindungsfurche eines geeigneten MHC-Moleküls, wie HLA-A*2, zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert, und auf diese Weise die Fähigkeit, mit dem TCR aktivierter T-Zellen zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert.
Diese T-Zellen können anschließend mit den Zellen kreuzreagieren und Zellen töten, die ein Polypeptid exprimieren, welches die natürliche Aminosäuresequenz des verwandten Peptides, wie in den Aspekten der Erfindung definiert, enthält. Wie aus der wissenschaftlichen Literatur und den Datenbanken (Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997, which are incorpoarted by reference in their entireties) entnommen werden kann, sind bestimmte Positionen der HLA-bindenden Peptiden typischerweise Ankerreste, die eine Kernsequenz passend zu dem Bindungsmotiv des HLA-Moleküls bilden, der durch polare, elektrophysikalische, hydrophobe und räumliche Eigenschaften der Polypeptidketten, die die Bindungsfurche bilden, definiert ist. So wäre ein Fachmann in der Lage, die Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO 102 dargelegt sind, durch Beibehalten der bekannten Ankerreste zu modifizieren, und wäre in der Lage, zu bestimmen, ob solche Varianten die Fähigkeit behalten, an MHC-Klasse-I oder Il-Moleküle zu binden. Die Varianten der vorliegenden Erfindung behalten die Fähigkeit, an den TCR aktivierter T-Zellen zu binden, welches anschließend mit Zellen, die ein Polypeptid mit der natürlichen Aminosäuresequenz des verwandten Peptides exprimieren, kreuzreagieren und sie töten kann, wie in den Aspekten der Erfindung definiert ist.
Die ursprünglichen (nicht-modifizierten) Peptide, wie hier offenbart, können durch Substitution einer oder mehrerer Resten an verschiedenen, möglicherweise selektiven Stellen innerhalb der Peptidkette modifiziert werden, solange es nicht anderweitig beschrieben ist. Vorzugsweise befinden sich diese Substitutionen am Ende der Aminosäurekette. Solche Substitutionen können konservativer Natur sein, zum Beispiel dergestalt, dass eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Struktur und Eigenschaften ersetzt wird, so wie eine hydrophobe Aminosäure durch eine andere hydrophobe Aminosäure ersetzt wird. Noch konservativer wäre eine Ersetzung von Aminosäuren mit derselben oder ähnlichen Größe und chemischen Natur, wie beispielsweise, wenn Leucin durch Isoleucin ersetzt wird. In Studien zu Sequenzvariationen in Familien von natürlich vorkommenden homologen Proteinen werden bestimmte Aminosäuresubstitutionen öfter als andere toleriert, und diese zeigen oftmals Ähnlichkeiten in Größe, Ladung, Polarität und Hydrophobizität zwischen den originalen Aminosäuren und deren Ersetzungen, und dies ist die Basis für die Definition von „konservativen Substitutionen“.
Konservative Substitutionen werden hier als Austausch innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen definiert: Gruppe 1 - kleine aliphatische, nicht polare oder leicht polare Reste (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Gruppe 2 - polare, negativ geladene Reste und deren Amide (Asp, Asn, Glu, Gln); Gruppe 3 - polare, positiv geladene Reste (His, Arg, Lys); Gruppe 4 - große, aliphatische, unpolare Reste (Met, Leu, Ile, Val, Cys); und Gruppe 5 - große, aromatische Reste (Phe, Tyr, Trp).
In einem Aspekt können konservative Substitutionen diejenigen beinhalten, die von Dayhoff im „The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5“, Natl. Biomedical Research beschrieben werden, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird. So können beispielsweise in einem Aspekt Aminosäuren, die zu einer der folgenden Gruppen gehören, gegeneinander ausgetauscht werden und bilden somit einen konservativen Austausch: Gruppe 1: Alanin (A), Prolin (P), Glycin (G), Asparagin (N), Serin (S), Threonin (T); Gruppe 2: Cystein (C), Serin (S), Tyrosin (Y), Threonin (T); Gruppe 3: Valin (V), Isoleucin (I), Leucin (L), Methionin (M), Alanin (A), Phenylalanin (F); Gruppe 4: Lysin (K), Arginin (R), Histidin (H); Gruppe 5: Phenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptophan (W), Histidin (H); und Gruppe 6: Asparaginsäure (D), Glutaminsäure (E). In einem Aspekt kann eine konservative Aminosäuresubstitution aus T→A, G→A, A→l, T→V, A→M, T→I, A→V, T→G und/oder T→S ausgewählt werden.
In einem Aspekt kann eine konservative Aminosäuresubstitution die Substitution einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure der gleichen Klasse beinhalten, zum Beispiel (1) unpolar: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp; (2) ungeladen polar: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, GIn; (3) sauer: Asp, Glu; und (4) basisch: Lys, Arg, His. Andere konservative Aminosäuresubstitutionen können ebenfalls wie folgt vorgenommen werden: (1) aromatisch: Phe, Tyr, His; (2) Protonendonator: Asn, Gin, Lys, Arg, His, Trp; und (3) Protonenakzeptor: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, GIn (siehe z. B. US-Patent Nr. 10 106 805 , dessen Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).

In einem anderen Aspekt können konservative Substitutionen gemäß Tabelle 3 vorgenommen werden. Verfahren zur Vorhersage der Toleranz gegenüber Proteinmodifikationen finden sich in der Literatur (beispielsweise bei Guo et al., 2004, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Tabelle 3: Liste der Konservativen Aminosäuresubstitutionen.

Ursprünglicher Rest	Konservative Substitutionen (andere sind in der Technik bekannt)
Ala	Ser, Gly, Cys
Arg	Lys, Gln, His
Asn	Gln, His, Glu, Asp
Asp	Glu, Asn, GIn
Cys	Ser, Met, Thr
Gin	Asn, Lys, Glu, Asp, Arg
Glu	Asp, Asn, Gln
Gly	Pro, Ala, Ser
His	Asn, Gln, Lys
Ile	Leu, Val, Met, Ala
Leu	Ile, Val, Met, Ala
Lys	Arg, Gln, His
Met	Leu, Ile, Val, Ala, Phe
Phe	Met, Leu, Tyr, Trp, His
Ser	Thr, Cys, Ala
Thr	Ser, Val, Ala
Trp	Tyr, Phe
Tyr	Trp, Phe, His
Val	Ile, Leu, Met, Ala, Thr

In einem anderen Aspekt kann es sich bei den Substitutionen um die in Tabelle 4 aufgeführten handeln. Wenn solche Substitutionen zu einer Änderung der biologischen Aktivität führen, können wesentlichere Änderungen, die in der Tabelle 4 als „exemplarische Substitutionen“ bezeichnet werden, eingeführt und die Produkte bei Bedarf überprüft werden. Tabelle 4: Beispielhafte Aminosäuresubstitutionen

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte Substitutionen (andere sind in der Technik bekannt)
Ala	Val, Leu, Ile
Arg	Lys, Gln, Asn
Asn	Gln, His, Asp, Lys, Arg
Asp	Glu, Asn
Cys	Ser, Ala
Gln	Asn, Glu
Glu	Asp, GIn
Gly	Ala
His	Asn, Gln, Lys, Arg
Ile	Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucin
Leu	Norleucin, Ile, Val, Met, Ala, Phe
Lys	Arg, Gln, Asn
Met	Leu, Phe, Ile
Phe	Leu, Val, Ile, Ala, Tyr
Pro	Ala
Ser	Thr
Thr	Ser, Ala
Trp	Tyr, Phe
Tyr	Trp, Phe, Thr, Ser
Val	Ile, Leu, Met, Phe, Ala, Norleucin

Solche Substitutionen können natürlich andere Strukturen einschließen, die sich von den weitverbreiteten L-Aminosäuren unterscheiden. So können die D-Aminosäuren durch die L-Aminosäuren ersetzt werden, die üblicherweise in den antigenen Peptiden der Erfindung vorkommen, und immer noch von der Offenbarung umfasst werden. Darüber hinaus können Nicht-Standardaminosäuren (d.h. andere als die üblichen natürlich vorkommenden proteinogenen Aminosäuren) auch zu Substitutionszwecken verwendet werden, um Immunogene und immunogene Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Wenn Substituierungen auf mehr als einer Position, wie es gefunden wurde, zu einem Peptid mit einer überwiegend äquivalenten oder größerer antigenen Wirksamkeit, wie es unten definiert wird, führen, so werden die Kombinationen von diesen Substituierungen getestet, um zu bestimmen, ob die Kombinationen zur additiven oder synergetischen Wirkung in Bezug auf die Antigenität des Peptides führen.
Ein Peptid, das essentiell aus der im vorliegenden Kontext angegebenen Aminosäuresequenz besteht, kann eine oder zwei Nicht-Anker-Aminosäuren (siehe unten bezüglich des Ankermotivs) austauschen, ohne dass die Fähigkeit, an ein MHC-Molekül der Klassen-I oder -II zu binden, im Vergleich zum nicht modifizierten Peptid wesentlich verändert oder negativ beeinflusst wird. In einer weiteren Ausführungsform, in einem Peptid, das im Wesentlichen aus der im vorliegenden Kontext angegebenen Aminosäuresequenz besteht, können eine oder zwei Aminosäuren mit ihren konservativen Austauschpartnern (siehe den Kontext unten) ausgetauscht werden, ohne dass die Fähigkeit, an ein MHC-Molekül der Klasse-I oder -II zu binden, im Vergleich zum nicht-modifizierten Peptid wesentlich verändert oder negativ beeinflusst wird.
Die Aminosäurereste, die nicht substantiell zu der Wechselwirkung mit dem T-Zellrezeptor beitragen, können durch Substitution mit einer weiteren Aminosäure, deren Aufnahme die T-Zellreaktivität nicht substantiell beeinflusst und die Bindung an das relevante MHC nicht verhindert, modifiziert werden. So kann das Peptid gemäß der Erfindung, abgesehen von der angegebenen Bedingung, jedes Peptid (wobei die Erfinder in diesen Begriff auch Oligopeptide oder Polypeptide einschließen), welches die Aminosäuresequenz oder einen Teil oder eine Variante davon enthält, wie angegeben sein.
Längere (verlängerte) Peptide können auch geeignet sein. Es ist möglich, dass die MHC-Klasse-I-Epitope, obwohl sie in der Regel zwischen 8 und 12 Aminosäuren lang sind, durch Peptidprozessierung von längeren Peptiden oder Proteinen, die das tatsächliche Epitop umfassen, erzeugt werden. Es ist bevorzugt, dass die Reste, die das tatsächliche Epitop flankieren, Reste sind, die die proteolytische Spaltung, die notwendig ist, um das tatsächliche Epitop während der Prozessierung auszusetzen, nicht wesentlich beeinflussen.

Die Peptide der Erfindung können um bis zu vier Aminosäuren verlängert werden, d. h. 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren können an jeweiligem Ende in beliebiger Kombination zwischen 4:0 und 0:4 hinzugefügt werden. Kombinationen der Verlängerungen gemäß der Erfindung sind in Tabelle 5 zu finden. Tabelle 5: Kombinationen der Verlängerungen der erfindungsgemäßen Peptide

C-Terminus	N-Terminus
4	0
3	0 oder 1
2	0 oder 1 oder 2
1	0 oder 1 oder 2 oder 3
0	0 oder 1 oder 2 oder 3 oder 4
N-Terminus	C-Terminus
4	0
3	0 oder 1
2	0 oder 1 oder 2
1	0 oder 1 oder 2 oder 3
0	0 oder 1 oder 2 oder 3 oder 4

Die Aminosäuren für die Verlängerung / Erweiterung können die Peptide der ursprünglichen Sequenz des Proteins oder jeder anderen Aminosäure(n) sein. Die Verlängerung kann verwendet werden, um die Stabilität oder Löslichkeit der Peptide zu erhöhen.
So können die Epitope der vorliegenden Erfindung identisch zu den natürlich vorkommenden tumorassoziierten oder tumorspezifischen Epitopen sein, oder sie können Epitope beinhalten, die sich in nicht mehr als vier Resten von dem Referenzpeptid unterscheiden, solange sie eine substanziell identische Aktivität besitzen.
In einer alternativen Ausführungsform wird das Peptid auf einer oder beiden Seiten um mehr als 4 Aminosäuren verlängert, vorzugsweise auf eine Gesamtlänge von bis zu 30 Aminosäuren. Dies kann zu MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden führen. Die Bindung an die MHC-Klasse-II kann mit den in der Technik bekannten Verfahren geprüft werden.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung Peptide und Varianten von Epitopen der MHC-Klasse-I zur Verfügung, wobei das Peptid oder die Variante eine Gesamtlänge zwischen 8 und 100, bevorzugt zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 12, und zwar 8, 9, 10, 11, 12 Aminosäuren, im Falle der verlängerten Klasse II-Bindungspeptide kann die Länge auch 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder 22 Aminosäuren betragen, aufweist.
Natürlich wird das Peptid oder die Variante gemäß der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit aufweisen, an ein MHC-Molekül der Klasse-I oder II zu binden. Die Bindung eines Peptides oder einer Variante an einen MHC-Komplex kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren getestet werden.
Es wird bevorzugt, wenn die für ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung spezifischen T-Zellen gegen die substituierten Peptide getestet werden, dass die Konzentration des Peptides, bei der die substituierten Peptide eine Hälfte des maximalen Anstiegs der Lyse in Relation zum Hintergrund erreichen, nicht mehr als ca. 1 mM, bevorzugterweise nicht mehr als ca. 1 µM, bevorzugter nicht mehr als ca. 1 nM und noch bevorzugter nicht mehr als ca. 100 pM und am meisten bevorzugt nicht mehr als ca. 10 pM beträgt. Es wird auch bevorzugt, dass die substituierten Peptide von den T-Zellen von mehr als einem, mindestens von zwei und bevorzugter von drei Individuen, erkannt werden.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, in der das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 besteht oder essentiell besteht.
„Besteht essentiell aus“ soll bedeuten, dass ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch zusätzlich zu der Sequenz entsprechend einer der SEQ ID No: 1 bis zu SEQ ID No: 102 oder einer Variante davon weitere N- und/oder C-terminal lokalisierte Abschnitte von Aminosäuren enthalten kann, die nicht unbedingt einen Teil des Peptids bilden, welches als Epitop für die MHC-Moleküle dient.
Gleichwohl können diese Abschnitte wichtig sein, um eine effiziente Einführung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in die Zellen zu ermöglichen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ein Teil eines Fusionsproteins, welches zum Beispiel die 80 N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten unveränderlichen Kette (p33, im Folgenden „Ii“) umfasst, wie sie von der NCBI, GenBank Zugangsnummer X00497, zu erhalten ist. In anderen Fusionen können die Peptide der vorliegenden Erfindung mit einem Antikörper, wie im vorliegenden Kontext beschrieben, oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere mit einer Sequenz eines Antikörpers, fusioniert werden, um von dem Antikörper spezifisch angegriffen zu werden, oder zum Beispiel mit oder in einen Antikörper, der spezifisch für dendritische Zellen ist, wie im vorliegenden Kontext beschrieben.
Zusätzlich kann das Peptid oder die Variante weiter modifiziert werden, um die Stabilität und/oder die Bindung an die MHC-Moleküle, um eine verstärkte Immunantwort hervorzurufen, zu verbessern. Methoden für eine solche Optimierung einer Peptidsequenz sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen beispielsweise die Einführung von umgekehrten (reversen) Peptid-Bindungen oder nicht-Peptidbindungen.
In einer reversen Peptidbindung sind die Aminosäurereste nicht über eine peptidische Bindung (-CO-NH-) verbunden, sondern die Peptidbindung ist in umgekehrter Reihenfolge. Solche retro-inverso Peptidomimetika können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel so wie beschrieben in Meziere und Kollegen (Meziere et al., 1997, welches durch Referenz eingeschlossen ist. Dieser Ansatz beinhaltet die Herstellung von Pseudopeptiden, die zwar Änderungen im Rückgrat beinhalten, aber nicht in der Orientierung der Seitenketten. Sie zeigen, dass diese Pseudopeptide für die MHC-Bindung und T-Helferzellantworten nützlich sein können. Retro-inverso-Peptide, die NH-CO-Bindungen anstelle von CO-NH-Peptidbindungen besitzen, sind gegenüber der Proteolyse erheblich resistenter (Meziere et al., 1997).
Eine nicht-peptidische Bindung kann zum Beispiel, -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, - CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO- sein. US-Patent 4,897,445 stellt ein Verfahren für die Festphasensynthese von nicht-Peptid-Bindungen (-CH₂-NH) in Polypeptid-Ketten bereit, welches die Synthese der Polypeptide durch Standardverfahren und die Synthese der nicht-Peptidbindung durch Reaktion eines Amino-Aldehyds und einer Aminosäure in Gegenwart von NaCNBH₃ umfasst.
Peptide, die die oben beschriebenen Bindungen umfassen, können mit zusätzlichen chemischen Gruppen an ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini synthetisiert werden, um die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder Affinität der Peptide zu erhöhen. Beispielsweise können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen an die Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Ebenso kann eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe an die Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Zusätzlich kann eine hydrophobe Gruppe, t-Butyloxycarbonyl oder eine Amidogruppe an die Carboxytermini der Peptide hinzugefügt werden.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide synthetisiert werden, um ihre sterische Konfiguration zu ändern. Beispielsweise kann das D-Isomer eines oder mehrerer der Aminosäurereste des Peptids verwendet werden, anstatt des üblichen L-Isomers. Noch weiter kann wenigstens eine der Aminosäurereste der Peptide der Erfindung durch eine der wohlbekannten nicht-natürlich vorkommenden Aminosäurereste substituiert werden. Änderungen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder die Bindungsverhalten der Peptide der Erfindung zu erhöhen.
In ähnlicher Weise kann ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine Variante durch eine Reaktion spezifischer Aminosäuren entweder vor oder nach der Synthese des Peptids chemisch verändert werden. Beispiele für solche Modifikationen sind in der Technik gut bekannt (Lundblad, 2004, die hier durch Verweis aufgenommen wird) Chemische Modifikation von Aminosäuren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Modifikationen durch Acylierung, Amidierung, Pyridoxylierung von Lysin, reduktive Alkylierung, Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), Amidmodifikation von Carboxylgruppen und Sulphydrylmodifikationen durch die Oxidation von Cystein zu Cysteinsäure, die Bildung von Quecksilberderivaten, die Bildung von gemischten Disulfiden mit anderen Thiolverbindungen, die Reaktion mit Maleimid, Carboxymethylierung mit lodessigsäure oder lodoacetamid und Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein (Coligan et al., 1995, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Kurz ausgedrückt, basiert die Modifikation von z. B. Arginylresten in Proteinen häufig auf der Reaktion von vicinalen Dicarbonylverbindungen wie Phenylglyoxal, 2,3-Butandion und 1,2-Cyclohexandion, um ein Addukt zu bilden. Ein anderes Beispiel ist die Reaktion von Methylglyoxal mit Arginylresten. Cystein kann ohne gleichzeitige Modifikation von anderen nukleophilen Stellen wie Lysin und Histidin modifiziert werden. Als Ergebnis ist eine große Anzahl von Reagenzien für die Modifikation von Cystein vorhanden. Die Webseiten von Unternehmen wie Sigma-Aldrich (www.sigma-aldrich.com) stellen Informationen zu spezifischen Reagenzien zu Verfügung.
Die selektive Reduktion von Disulfidbindungen ist ebenso verbreitet. Disulfidbindungen können während der Wärmebehandlung von Biopharmazeutika gebildet und oxidiert werden. Woodward-Reagenz K kann verwendet werden, um spezifische Glutaminsäurereste zu modifizieren. N-(3-(Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid kann verwendet werden, um intramolekulare Vernetzungen zwischen einem Lysinrest und einem Glutaminsäurerest zu bilden. Zum Beispiel ist Diethylpyrocarbonat ein Reagenz für die Modifizierung von Histidylresten in Proteinen. Histidin kann auch unter Verwendung von 4-Hydroxy-2-Nonenal modifiziert werden. Die Reaktion der Lysinreste und anderer α-Amino-Gruppen ist beispielsweise für die Bindung von Peptiden an Oberflächen oder die Vernetzung (cross-linking) von Proteinen / Peptiden nützlich. Lysin ist die Stelle der Bindung von Poly(ethylen)glykol und die bedeutendste Stelle der Modifikation bei der Glykosylierung von Proteinen. Methioninreste in Proteinen können zum Beispiel mit lodacetamid, Bromethylamin und Chloramine T modifiziert werden.
Tetranitromethan und N-Acetylimidazol können für die Modifikation von Tyrosylresten verwendet werden. Eine Vernetzung durch die Bildung von Dityrosin kann mit Wasserstoffperoxid / Kupferionen erreicht werden.
Neuere Studien zur Modifizierung von Tryptophan haben N-Bromsuccinimid, 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder 3-Brom-3-methyl-2-(2-nitrophenylmercapto)-3H-indol (BPNs-Skatol) verwendet.
Erfolgreiche Modifizierung von therapeutischen Proteinen und Peptiden mit PEG wird oft mit einer Verlängerung der Kreislaufhalbwertszeit assoziiert, während die Vernetzung von Proteinen mit Glutaraldehyd, Polyethylenglykoldiacrylat und Formaldehyd zur Herstellung von Hydrogelen verwendet wird. Eine chemische Modifizierung von Allergenen für die Immuntherapie wird oft durch Carbamylierung mit Kaliumcyanat erreicht.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein nicht natürlich vorkommendes Peptid, wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 besteht oder im Wesentlichen besteht und synthetisch hergestellt (z. B. synthetisiert) als pharmazeutisch akzeptables Salz ist. Verfahren für die synthetische Herstellung von Peptiden sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Salze der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich erheblich von den Peptide in ihrem Zustand/ihren Zuständen in vivo, da die Peptide, die erzeugt werden, in vivo nicht als Salze vorliegen. Die nicht-natürliche Salzform des Peptids vermittelt die Löslichkeit des Peptids, insbesondere im Zusammenhang mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Peptide umfassen, z. B. die im vorliegenden Kontext offenbarten Peptidimpfstoffe. Eine ausreichende und zumindest wesentliche Löslichkeit des/der Peptide(s) ist erforderlich, um die Peptide dem zu behandelnden Patienten effizient einzuführen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch annehmbare Salze der Peptide. Diese Salze gemäß der Erfindung umfassen Alkali- und Erdalkalisalze, wie zum Beispiel Salze der Hofmeister-Reihe, welche folgende Anionen: PO₄ ^3-, SO₄ ^2-, CH₃COO^-, Cl^-, Br, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^- und folgende Kationen NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ und Ba²⁺ umfassen. Insbesondere werden Salze aus (NH₄)₃PO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, NH4CH3COO, NH4CI, NH4Br, NH4NO3, NH₄ClO₄, NH₄l, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb₄CH₃COO, Rb₄Cl, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄ClO₄, Rb₄l, Rb₄SCN, K₃PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH₃COO, KCl, KBr, KNO₃, KClO₄, KI, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCI, NaBr, NaNO₃, NaClO₄, Nal, NaSCN, ZnCl₂ Cs₃PO₄, CS₂HPO₄, CSH₂PO₄, CS₂SO₄, CsCH₃COO, CsCI, CsBr, CsNO₃, CsClO₄, Csl, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, Li₂SO₄, LiCH₃COO, LiCI, LiBr, LiNO₃, LiClO₄, Lil, LiSCN, CU₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH3COO)2, MgCI2, MgBr2, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, Mgl₂, Mg(SCN)2, MnCI2, Ca₃(PO₄), Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH3COO)2, CaCI2, CaBr2, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, Cal₂, Ca(SCN)2, Ba₃(PO₄)₂, Ba2HPO4, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH3COO)2, BaCl₂, BaBr2, Ba(NO₃)₂, Ba(ClO₄)₂, Bal2 und Ba(SCN)₂ ausgewählt. Insbesondere bevorzugt sind NH-Azetat, MgCl₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCI, NaCI und CaCl₂, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Triflurazetat) Salze (siehe z. B. Berge et al., 1977, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Im Allgemeinen können Peptide und Varianten (zumindest die, die zwischen den Aminosäureresten Peptidbindungen besitzen) durch den Fmoc-Polyamid-Modus der Festphasenpeptidsynthese, wie durch Lukas et al. (Lukas et al., 1981, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) und den dort aufgeführten Referenzen offenbart, synthetisiert werden. Die N-amino-Gruppen werden zwischenzeitlich durch die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc) geschützt. Wiederholte Abspaltung dieser höchst basenlabilen Schutzgruppe wird mit einer 20%-igen Lösung von Piperidin in N, N-Dimethylformamid durchgeführt. Seitenkettenfunktionalitäten können als ihre Butylether geschützt werden (im Fall von Serin, Threonin und Tyrosin), Butylester (im Fall von Glutaminsäure und Aspartamsäure), Butyloxycarbonylderivat (im Fall von Lysin und Histidin), Tritylderivat (im Fall von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-Trimethylbenzenesulphonylderivat (im Fall von Arginin). Wenn Glutamin oder Asparagin die C-terminalen Reste sind, wird die 4,4'-Dimethoxybenzhydryl-Gruppe als Schutzgruppe für die Seitenkettenfunktionalitäten verwendet. Die Festphase basiert auf einem Polydimethyl-Acrylamid-Polymer, der aus den drei Monomeren besteht: Dimethylacrylamid (Rückgrat-Monomer), Bisacryloylethylendiamin (cross linker, Quervernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (Funktionalisierungsmittel). Als abspaltbarer Linker zwischen Peptid und Harz wird ein säurelabiles 4-Hydroxymethylphenoxyessigsäurederivat benutzt. Alle Aminosäurederivate, mit der Ausnahme von Asparagin und Glutamin, die über eine reverse N, N-Dicyclohexylcarbodiimid/1hydroxybenzotriazol vermittelte Kupplung eingesetzt werden, werden als vorgeformtes symmetrisches Anhydridderivat eingesetzt. Alle Kupplungs- und Entschützungsschritte werden mit Ninhydrin, Trinitrobenzensulfonsäure oder Isotin überwacht. Nach der Fertigstellung der Synthese werden die Peptide bei gleichzeitiger Entfernung der Schutzgruppen an den Seitenketten durch Verwendung von 95% Trifluoressigsäure, die eine 50% Mischung aus Radikalfängern enthält, vom Harz abgespalten. Die normalerweise verwendeten Radikalfänger enthalten Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser, wobei die genaue Wahl von der Zusammensetzung der Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptides abhängt. Es können weiterhin auch Kombinationen von Festphasensynthese und Verfahren für die Synthese von Peptiden in Lösung verwendet werden (siehe, zum Beispiel, Bruckdorfer et al., 2004 und die dort zitierten Referenzen, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Trifluoressigsäure wird durch Vakuumdestillation entfernt, das rohe Peptid wird durch anschließende Ausfällung mit Diethylether erhalten. Alle vorhandenen Radikalfänger werden durch einfache Extraktion entfernt, die nach Lyophlisierung der wässrigen Phase die rohen Peptide in radikalfängerfreier Form liefert. Die Reagenzien für die Peptidsynthese sind im Allgemeinen z. B. von Calbiochem-Novabiochem (Nottingham Großbritannien), zu erhalten.
Die Aufreinigung kann durch Anwendung einer Technik oder einer Kombination mehrerer Techniken, wie zum Beispiel Rückkristallisation, Gelpermeationschromatographie (GPC), lonenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie (Hydrophobie Interaction Chromatography, HIC) und (normalerweise) Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Acetonitril/Wassergradienten durchgeführt werden.
Die Analyse der Peptide kann durch Dünnschichtchromatographie, Elektrophorese, im Besonderen Kapillarelektrophorese, Festphasenextraktion (CSPE), Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse und durch Fast-Atom-Bombardment (FAB) Massenspektrometrie sowie durch MALDI und ESI-Q-TOF massenspektrometrische Analyse erfolgen.
Um überpräsentierte Peptide zu selektieren, wird ein Präsentationsprofil berechnet, das die Medianprobenpräsentation sowie die Replikationsvariation zeigt. Das Profil stellt Proben der interessierenden Tumorentität einer Basislinie von normalen Gewebeproben gegenüber. Jedes dieser Profile kann durch die Berechnung des p-Wertes eines linearen gemischten Models (Pinheiro et al., 2015), das für mehrere Tests mit False Discovery Rate (Benjamini and Hochberg, 1995, (vgl. Beispiel 1, ) angepasst wurde, zu einem Überpräsentationswert zusammengezogen werden (deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Für die Identifizierung und relative Quantifizierung von HLA-Liganden mittels Massenspektrometrie wurden HLA-Moleküle aus schockgefrorenen Gewebeproben gereinigt und HLA-assoziierte Peptide isoliert. Die isolierten Peptide wurden getrennt und die Sequenzen wurden durch Online-Nano-Elektrosprüh-Ionisation (nanoESI) Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Experimente identifiziert. Die resultierenden Peptidsequenzen wurden durch den Vergleich des Fragmentierungsmusters natürlicher tumorassoziierter Peptide (TUMAPs), die aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinomproben (N = 750 Proben) stammen mit den Fragmentierungsmustern entsprechender synthetischer Referenzpeptide gleicher Sequenz verifiziert. Da die Peptide direkt als Liganden von HLA-Molekülen von Primärtumoren identifiziert wurden, liefern diese Ergebnisse direkte Hinweise auf die natürliche Verarbeitung und Präsentation der identifizierten Peptide auf primärem Krebsgewebe, das aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom gewonnen wurde (vgl. Beispiel 1, ).
Die Discovery-Pipeline XPRESIDENT® v2.1 ermöglicht die Identifizierung und Auswahl relevanter überpräsentierter Peptide, die potenzielle Ziele für eine Immuntherapie darstellen, auf der Grundlage einer direkten relativen Quantifizierung der HLAbeschränkten Peptidspiegel auf Krebsgeweben im Vergleich zu mehreren verschiedenen nicht-krebsartigen Geweben und Organen. Siehe z. B. die Veröffentlichung der US-Patentanmeldung 2013/0096016 , deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird. Dies wurde durch die Entwicklung einer markierungsfreien differentiellen Quantifizierung unter Verwendung der gewonnenen LC-MS-Daten erreicht, die von einer proprietären Datenanalysepipeline verarbeitet werden, die Algorithmen zur Sequenzidentifikation, Spektralclusterung, lonenzählung, Retentionszeitausrichtung, Ladezustandsdekonvolution und Normalisierung kombiniert.
Zusätzliche Sequenzinformationen aus öffentlichen Quellen (Olexiouk et al., 2016; Subramanian et al., 2011, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) wurden in die XPRESIDENT® Discovery-Pipeline integriert, um die Identifizierung von TUMAPs nicht-kanonischer Herkunft zu ermöglichen. Es wurden Präsentationsebenen mit Fehlerschätzungen für jedes Peptid und jede Probe ermittelt. Es wurden Peptide identifiziert, die ausschließlich auf Tumorgewebe präsentiert werden und Peptide, die im Tumor im Vergleich zu nicht-krebsartigen Geweben und Organen überpräsentiert werden.
HLA-Peptidkomplexe aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom wurden Gewebeproben gereinigt und HLA-assoziierte Peptide isoliert und mit LC-MS analysiert (siehe Beispiel 1). Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszellen Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, Leberzellkarzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom, Endometriumkarzinom und Kombinationen davon sind.
TUMAPs, die bei multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom und im Normalgewebe identifiziert wurden, wurden durch lonenzählung von markierungsfreien LC-MS-Daten quantifiziert. Das Verfahren geht davon aus, dass LC-MS-Signalbereiche eines Peptids mit seiner Häufigkeit in der Probe korrelieren. Alle quantitativen Signale eines Peptids in verschiedenen LC-MS-Experimenten wurden basierend auf der zentralen Tendenz normiert, pro Probe gemittelt und zu einem Balkendiagramm, dem sogenannten Präsentationsprofil, zusammengeführt. Das Präsentationsprofil konsolidiert verschiedene Analysemethoden wie Proteindatenbank-Suche, Spektral-Clustering, Ladezustandsdekonvolution (Decharging) und Retentionszeitausrichtung und Normalisierung.
Darüber hinaus ermöglicht die Forschungspipeline XPRESIDENT® die direkte absolute Quantifizierung von MHC-, vorzugsweise HLA-restringierten, Peptidniveaus auf Krebsgeweben oder anderen infizierten Geweben. Zusammenfassend wurde die Gesamtzellzahl aus dem Gesamt-DNA-Gehalt der analysierten Gewebeprobe berechnet. Die Gesamtpeptidmenge für ein TUMAP in einer Gewebeprobe wurde mittels nano LC-MS/MS als das Verhältnis des natürlichen TUMAP und einer bekannten Menge einer isotopenmarkierten Version des TUMAP, des so genannten internen Standards, gemessen. Die Effizienz der TUMAP-Isolierung wurde bestimmt, indem Peptid:MHC-Komplexe aller ausgewählten TUMAPs zum frühestmöglichen Zeitpunkt des TUMAP-Isolierungsverfahrens in das Gewebelysat eingespikt und nach Abschluss des Peptidisolierungsverfahrens mittels nano LC-MS/MS nachgewiesen wurden. Die Gesamtzellzahl und die Menge des Gesamtpeptids wurden aus dreifachen Messungen pro Gewebeprobe berechnet. Die peptidspezifischen Isolationseffizienzen wurden als Durchschnitt aus 9 Spike-Experimenten berechnet, die jeweils als Triplikat gemessen wurden (siehe Beispiel 4 und Tabelle 12).
Neben der Überpräsentation des Peptids wurde auch die mRNA-Expression des zugrunde liegenden Gens getestet. mRNA-Daten wurden durch RNASeq-Analysen von normalem Gewebe und Krebsgewebe gewonnen (siehe Beispiel 2, ). Eine weitere Quelle für Normalgewebedaten war eine Datenbank mit öffentlich zugänglichen RNA-Expressionsdaten von rund 3000 Normalgewebeproben (Lonsdale, 2013, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Peptide, welche von Proteinen ableitet sind, deren kodierende mRNA im Krebsgewebe stark exprimiert wird, aber in lebenswichtigen normalen Geweben sehr niedrig oder nicht vorhanden ist, wurden vorzugsweise in die vorliegende Erfindung aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide zur Verfügung, die bei der Behandlung von Krebs/Tumoren nützlich sind, vorzugsweise multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, die die Peptide der Erfindung überpräsentieren oder ausschließlich präsentieren. Zu diesen Peptiden wurde durch MS nachgewiesen, dass sie von HLA-Molekülen auf natürliche Weise an primärer menschlicher akuter myeloischen Leukämien, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom präsentiert werden.
Viele der Ausgangsgene/Proteine (auch als „Volllängenproteine“ oder „zugrunde liegende Proteine“ bezeichnet), aus denen die Peptide gewonnen werden, erwiesen sich bei Krebs im Vergleich zu normalen Geweben als stark überexprimiert - „Normalgewebe“ im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet entweder gesundes Blut, Gehirn, Herz, Leber, Lunge, Fettgewebe, Nebenniere, Gallenweg, Blase, Knochen, Knochenmark, Speiseröhre, Auge, Gallenblase, Kopf-Hals-Bereich, Dickdarm, Dünndarm, Niere, Lymphknoten, Zentralnerv, peripherer Nerv, Bauchspeicheldrüse, Nebenschilddrüse, Peritoneum, Hypophyse, Pleura, Skelettmuskel, Haut, Rückenmark, Milz, Magen, Schilddrüse, Luftröhre und Harnleiterzellen oder andere normale Gewebezellen wie Brust, Eierstock, Plazenta, Prostata, Hoden, Thymus und Gebärmutter, die einen hohen Grad an Tumorassoziation der Quellgene aufweisen (siehe Beispiel 2). Darüber hinaus sind die Peptide selbst stark überrepräsentiert auf Tumorgewebe - „Tumorgewebe“ im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet eine Probe eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, aber nicht auf normalen Geweben (siehe Beispiel 1).
HLA-gebundene Peptide können durch das Immunsystem, spezifisch durch T-Lymphozyten erkannt werden. T-Zellen können die Zellen zerstören, die den erkannten HLA/Peptidkomplex präsentieren, z. B. die Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, welche die abgeleiteten Peptide präsentieren.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind im Krebsgewebe im Vergleich zu normalen Geweben überpräsentiert und können daher zur Herstellung von Antikörpern und/oder TCRs, wie z. B. löslichen TCRs, verwendet werden (siehe Tabelle 9). Darüber hinaus können die Peptide, wenn sie mit dem jeweiligen MHC einen Komplex bilden, auch für die Herstellung von Antikörpern und/oder TCRs, insbesondere lösliche TCRs, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und können auch in der entsprechenden Literatur (siehe auch unten) gefunden werden. Somit sind die Peptide der vorliegenden Erfindung für die Erzeugung einer Immunantwort in einem Patienten nützlich, durch welche Tumorzellen zerstört werden können. Eine Immunantwort in einem Patienten kann durch eine direkte Verabreichung der beschriebenen Peptide oder durch geeignete Vorläufersubstanzen (z. B. verlängerte Peptide, Proteine oder Nukleinsäuren, die diese Peptide kodieren) an den Patienten, im Idealfall in Kombination mit einem Stoff, welcher die Immunogenität erhöht (d. h. eine Adjuvans) induziert werden. Es kann erwartet werden, dass die Immunantwort, die von einer solchen therapeutischen Vakzinierung ausgeht, sehr spezifisch gegen Tumorzellen ist, da die Ziel-Peptide der vorliegenden Erfindung nicht auf normalen Geweben in vergleichbaren Kopienzahl präsentiert werden, was der Gefahr einer unerwünschten Autoimmunreaktion gegen normale Zellen in dem Patienten vorbeugt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner TCRs umfassend eine alpha-Kette und eine beta-Kette („alpha/beta-TCRs“). Ebenfalls bereitgestellt werden Peptide gemäß der Erfindung, die in der Lage sind, an TCRs und Antikörper zu binden, wenn sie von einem MHC-Molekül präsentiert werden.
Die vorliegende Beschreibung betrifft auch Fragmente der TCRs gemäß der Erfindung, die in der Lage sind, an ein Peptidantigen gemäß der vorliegenden Erfindung zu binden, wenn sie von einem HLA-Molekül präsentiert werden. Der Begriff bezieht sich insbesondere auf lösliche TCR-Fragmente, z. B. TCRs, welchen die Transmembranteile und/oder konstanten Bereiche fehlen, einkettige TCRs und deren Fusionen, z. B. an Immunoglobuline.
Die vorliegende Beschreibung betrifft auch Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen, die TCRs und Peptide der vorliegenden Beschreibung exprimieren; und Verfahren zu deren Verwendung.
Der Begriff „T-Zell-Rezeptor“ (abgekürzt TCR) bezieht sich auf ein heterodimeres Molekül, das eine alpha-Polypeptidkette (alpha-Kette) und eine beta-Polypeptidkette (beta-Kette) umfasst, worin der heterodimere Rezeptor in der Lage ist, an ein Peptidantigen zu binden, das durch ein HLA-Molekül präsentiert wird. Der Begriff umfasst auch sogenannte Gamma/Delta-TCRs.
In einer Ausführungsform stellt die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorliegend beschriebenen TCRs bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle umfasst, die in der Lage ist, die TCRs unter Bedingungen zu exprimieren, die dafür geeignet sind, die Expression dieser TCRs zu fördern.
Die Beschreibung betrifft in einem weiteren Aspekt Verfahren gemäß der Beschreibung, wobei das Antigen auf MHC-Moleküle der Klasse I oder II geladen wird, die auf der Oberfläche einer geeigneten antigenpräsentierenden Zelle oder einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle exprimiert werden, indem eine ausreichende Menge des Antigens mit einer antigenpräsentierenden Zelle in Kontakt gebracht wird, oder das Antigen auf Tetramere der MHC-Klasse-I oder II durch Tetramerisierung von Monomeren der Antigen/Klasse I oder II MHC-Komplexe geladen wird.
Die alpha- und beta-Ketten von alpha/beta-TCRs und die gamma- und delta-Ketten von gamma/delta-TCRs werden im Allgemeinen als jeweils zwei „Domänen“ angesehen, nämlich variable und konstante Domänen. Die variable Domäne besteht aus einer Verkettung von der variablen Region (V) und der Verbindungsregion (J). Die variable Domäne kann auch eine Signalsequenz (L, leader) beinhalten. Beta- und delta-Ketten können auch eine Diversitätsregion (D) beinhalten. Die alpha- und beta-konstante Domänen können auch C-terminale Transmembrandomänen (TM) beinhalten, die die alpha- und beta-Ketten an der Zellmembran verankern.
In Bezug auf gamma/delta-TCRs bezieht sich der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „TCR-gamma-variable-Domäne“ auf die Verkettung der TCR-gamma-V-(TRGV)-Region ohne Leader-Abschnitt (L) und der TCR-gamma-J-(TRGJ)-Region, und der Begriff TCR-gamma-konstante-Domäne bezieht sich auf die extrazelluläre TRGC-Region oder auf eine C-terminal trunkierte TRGC-Sequenz. Ebenso bezieht sich der Begriff „TCR-delta-variable Domäne“ auf die Verkettung der TCR-delta-V (TRDV)-Region ohne Leader-Abschnitt (L) und der TCR-delta-D/J (TRDD/TRDJ)-Region, und der Begriff „TCRdelta-konstante Domäne“ bezieht sich auf die extrazelluläre TRDC-Region oder auf eine C-terminal trunkierte TRDC-Sequenz.
Alpha/beta heterodimere TCRs der vorliegenden Beschreibung können eine eingeführte Disulfidbindung zwischen ihren konstanten Domänen aufweisen. Bevorzugte TCRs dieses Typs sind solche, die eine TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und eine TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne aufweisen, mit der Ausnahme, dass Thr 48 von TRAC und Ser 57 von TRBC1 oder TRBC2 durch Cysteinreste ersetzt sind, wobei die Cysteine eine Disulfidbindung zwischen der TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und der TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne des TCR bilden.
Mit oder ohne die oben erwähnte eingeführte Zwischenkettenbindung können alpha/betaheterodimere TCRs der vorliegenden Beschreibung eine TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und eine TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne aufweisen, und die TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und die TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne des TCR können durch die native Disulfidbindung zwischen Cys4 des Exons 2 des TRAC und Cys2 des Exons 2 des TRBC1 oder TRBC2 verbunden sein.
TCRs der vorliegenden Beschreibung können einen nachweisbaren Marker umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radionuklid, einem Fluorophor und Biotin. TCRs der vorliegenden Beschreibung können mit einem therapeutisch wirksamen Mittel, wie beispielsweise einem Radionuklid, einem Chemotherapeutikum oder einem Toxin, konjugiert werden.
Nachweisbare Labels
Nachweisbare Labels können zum Beispiel Fluoreszenzfarbstoffe, Enzyme, Substrate, biolumineszierende Materialien, radioaktive Materialien und chemolumineszierende Labels sein. Beispiele für Enzymlabels sind unter anderem Meerrettichperoxidase, Acetylcholinesterase, alkalische Phosphatase, b-Galaktosidase und Luciferase. Zu den beispielhaften Fluorophoren (fluoreszierende Materialien) gehören unter anderem Rhodamin, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Umbelliferon, Dichlortriazinylamin, Phycoerythrin und Dansylchlorid. Beispielhafte chemolumineszierende Labels umfassen Luminol, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispielhafte biolumineszierende Materialien umfassen Luziferin und Aequorin, sind aber nicht darauf beschränkt. Beispielhafte radioaktive Materialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Wismut-213 (²¹³Bs), Kohlenstoff-14 (¹⁴C), Kohlenstoff-11 (¹¹C), Chlor-18 (¹⁸Cl), Chrom-51 (⁵¹Cr), Kobalt-57 (⁵⁷Co), Kobalt-60 (⁶⁰Co), Kupfer-64 (⁶⁴Cu), Kupfer-67 (⁶⁷Cu), Dysprosium-165 (¹⁶⁵Dy), Erbium-169 (¹⁶⁹Er), Fluor-18 (¹⁸F), Gallium-67 (⁶⁷Ga), Gallium-68 (⁶⁸Ga), Germanium-68 (⁶⁸Ge), Holmium-166 (¹⁶⁶Ho), lidium-111 (¹¹¹In), lod-123 (¹²³I), lod-124 (¹²⁴I), lod-125 (¹²⁵I), Iod-131 (¹³¹I), Iridium-192 (¹⁹²Ir), Eisen-59 (⁵⁹Fe), Krypton-81 (⁸¹Kr), Blei-212 (²¹²Pb), Lutetium-177 (¹⁷⁷Lu), Molybden-99 (⁹⁹Mo), Stickstoff-13 (¹³N), Sauerstoff-15 (¹⁵O), Palladium-103 (¹⁰³Pd), Phosphor-32 (³²P), Kalium-42 (⁴²K), Rhenium-186 (¹⁸⁶Re), Rhenium-188 (¹⁸⁸Re), Rubidium-81 (⁸¹Rb), Rubidium-82 (⁸²Rb), Samarium-153 (¹⁵³Sm), Selen-75 (⁷⁵Se), Natrium-24 (²⁴Na), Strontium-82 (⁸²Sr), Strontium-89 (⁸⁹Sr), Schwefel 35 (³⁵S), Technetium-99m (⁹⁹Tc), Thallium-201 (²⁰¹Tl), Tritium (³H), Xenon-133 (¹³³Xe), Ytterbium-169 (¹⁶⁹Yb), Ytterbium-177 (¹⁷⁷Yb) und Yttrium-90 (⁹⁰Y).
Radionuklide
Radionuklide emittieren Alpha- oder Betateilchen (z. B. Radioimmunkonjugate). Solche radioaktive Isotope umfassen, sind aber nicht beschränkt auf beta-Emittenten wie Phosphor-32 (³²P), Scandium-47 (⁴⁷SC), Kupfer-67 (⁶⁷Cu), Gallium-67 (⁶⁷Ga), Yttrium-88 (⁸⁸Y), Yttrium-90 (⁹⁰Y), Iod-125 (¹²⁵I), Iod-131 (¹³¹I), Samarium-153 (¹⁵³Sm), Lutetium-177 (¹⁷⁷Lu), Rhenium-186 (¹⁸⁶Re), Rhenium-188 (¹⁸⁸Re), und alpha-Emitter wo wie Astatin-211 (²¹¹At), Blei-212 (²¹²Pb), Wismuth-212 (²¹²Bi), Wismuth-213 (²¹³Bi) oder Actinium-225 (²²⁵Ac).
Toxine
Toxine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Methotrexat, Aminopterin, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin, 5-Fluorouracil-Dacarbazin; Alkylierungsmittel wie Mechlorethamin, Thiotepa-Chlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU), Mitomycin C, Lomustin (CCNU), 1-Methylnitrosoharnstoff, Cyclophosphamid, Mechlorethamin, Busulfan, Dibrommannitol, Streptozotocin, Mitomycin C, cis-Dichlordiamin-Platin (II) (DDP), Cisplatin und Carboplatin (Paraplatin); Anthracycline umfassen Daunorubicin (früher Daunomycin), Doxorubicin (Adriamycin), Detorubicin, Caminomycin, Idarubicin, Epirubicin, Mitoxantron und Biantren; Antibiotika umfassen Dactinomycin (Actinomycin D), Bleomycin, Calicheamicin, Mithramycin und Anthramycin (AMC) sowie Antimytotika wie die Vinca-Alkaloide, Vincristin und Vinblastin. Andere zytotoxische Wirkstoffe umfassen Paclitaxel (TAXOL®), Ricin, Pseudomonas-Exotoxin, Gemcitabin, Cytochalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Etoposid, Tenoposid, Colchicin, Dihydroxyanthracindion, 1-Dehydrotestosteron, Glucocorticoide, Procain, Tetracain, Lidocain, Propranolol, Puromycin, Procarbazin, Hydroxyharnstoff, Asparaginase, Kortikosteroide, Mytotan (O,P'-(DDD)), Interferone und Mischungen dieser zytotoxischen Wirkstoffe
Therapeutische Wirkstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Carboplatin, Cisplatin, Paclitaxel, Gemcitabin, Calicheamicin, Doxorubicin, 5-Fluorouracil, Mitomycin C, Actinomycin D, Cyclophosphamid, Vincristin, Bleomycin, VEGF-Antagonisten, EGFR-Antagonisten, Platine, Taxole, Irinotecan, 5-Fluorouracil, Gemcytabin, Leucovorin, Steroide, Cyclophosphamid, Melphalan, Vinca-Alkaloide, Mustine, Tyrosinkinase-Inhibitoren, Strahlentherapie, Sexualhormon-Antagonisten, selektive Androgenrezeptor-Modulatoren, selektive Östrogenrezeptor-Modulatoren, PDGF-Antagonisten, TNF-Antagonisten, IL-1-Antagonisten, Interleukine (z. B. IL-12 oder IL-2), IL-12R-Antagonisten, Toxin-konjugierte monoklonale Antikörper, Tumorantigen-spezifische monoklonale Antikörper, Erbitux®, Avastin®, Pertuzumab, Anti-CD20-Antikörper, Rituxan, RTM, Ocrelizumab, Ofatumumab, DXL625, Herceptin® oder irgendeine Kombination davon. Toxische Enzyme aus Pflanzen und Bakterien wie Ricin, Diphtherie-Toxin und Pseudomonas-Toxin können zur Herstellung zelltypspezifischer Abtötungsreagenzien verwendet werden (Youle et al., 1980, Gilliland et al., 1980, Krolick et al., 1980). Andere zytotoxische Stoffe umfassen zytotoxische Ribonukleasen (siehe US-Patent Nr. 6 653 104 , der Inhalt jeder Referenz, der durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
In einer Ausführungsform weist ein TCR der vorliegenden Beschreibung mit mindestens einer Mutation in der alpha-Kette und/oder mit mindestens einer Mutation in der beta-Kette eine modifizierte Glykosylierung im Vergleich zum nicht mutierten TCR auf.
In einer Ausführungsform weist ein TCR, der mindestens eine Mutation in der TCR-alpha Kette und/oder die TCR-beta Kette umfasst, eine Bindungsaffinität für und/oder eine Bindungshalbwertszeit für einen Peptid-HLA-Molekülkomplex auf, die mindestens das Doppelte derer eines TCRs, der die nicht mutierte TCR-alpha-Kette und/oder die nicht mutierte TCR-beta-Kette umfasst, ist. Die Affinitätsverbesserung tumorspezifischer TCRs und ihre Nutzung beruht auf der Existenz eines Fensters für optimale TCR-Affinitäten. Das Vorhandensein eines solchen Fensters basiert auf Beobachtungen, dass TCRs, die spezifisch für z. B. HLA-A*02-restringierte Krankheitserreger sind, K_D-Werte aufweisen, die im Allgemeinen etwa 10-mal niedriger sind, als TCRs, die spezifisch z. B. für HLA-A*02-restringierte tumorassoziierte Selbstantigene sind. Inzwischen ist bekannt, dass Tumorantigene zwar das Potenzial haben, immunogen zu sein, da Tumore aus den eigenen Zellen entstehen, nur mutierte Proteine oder Proteine mit veränderter translationaler Prozessierung vom Immunsystem als fremd angesehen werden. Hochregulierte oder überexprimierte Antigene (sogenannte Selbstantigene) lösen nicht unbedingt eine funktionelle Immunantwort gegen den Tumor aus: T-Zellen, die TCRs exprimieren, die gegenüber diesen Antigenen hochreaktiv sind, wurden im Thymus in einem Prozess, der als zentrale Toleranz bekannt ist, negativ ausgewählt, so dass nur T-Zellen mit niedrigaffinen TCRs für Selbstantigene übrig bleiben. Daher kann die Affinität von TCRs oder Varianten der vorliegenden Beschreibung zu Peptiden durch in der Technik bekannte Verfahren erhöht werden.
Die vorliegende Beschreibung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung eines TCR gemäß der vorliegenden Beschreibung, wobei das Verfahren das Inkubieren von PBMCs aus HLA-A*02-negativen gesunden Spendern mit HLA^*02/Peptidmonomeren, das Inkubieren der PBMCs mit Tetramer-Phycoerythrin (PE) und das Isolieren der hochaviden T-Zellen durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS)-Calibur-Analyse umfasst.
Die vorliegende Beschreibung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Isolieren eines TCR gemäß der vorliegenden Beschreibung, wobei das Verfahren das Erhalten einer transgenen Maus mit dem gesamten menschlichen TCRαβ Genlocus (1,1 und 0,7 Mb) umfasst, deren T-Zellen ein vielfältiges humanes TCR-Repertoire exprimieren, das den Maus-TCR-Mangel kompensiert, Immunisieren der Maus mit einem Peptid , Inkubieren des PBMCs aus den transgenen Mäusen mit Tetramer-Phycoerythrin (PE) und Isolieren der hochaviden T-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Calibur-Analyse.
In einem Aspekt werden zur Gewinnung von T-Zellen, die TCRs der vorliegenden Beschreibung exprimieren, Nukleinsäuren, die für TCR-alpha- und/oder TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung kodieren, in Expressionsvektoren wie gamma-Retrovirus oder -Lentivirus kloniert. Die rekombinanten Viren werden generiert und anschließend auf ihre Funktionalität wie Antigenspezifität und funktionelle Avidität getestet. Ein Aliquot des Endprodukts wird dann verwendet, um die Ziel-T-Zellpopulation (im Allgemeinen aus PBMCs von Patienten gereinigt) zu transformieren, die vor der Infusion in den Patienten expandiert wird.
In einem weiteren Aspekt, um T-Zellen zu erhalten, die TCRs der vorliegenden Beschreibung exprimieren, werden TCR-RNAs durch in der Technik bekannte Techniken synthetisiert, z. B. in vitro Transkriptionssysteme. Die in vitro-synthetisierten TCR-RNAs werden dann in primäre CD8-positive T-Zellen eingebracht, die von gesunden Spendern durch Elektroporation gewonnen werden, um tumorspezifische TCR-alpha- und/oder TCR-beta-Ketten erneut zu exprimieren.
Um die Expression zu steigern, können Nukleinsäuren-kodierende TCRs der vorliegenden Beschreibung operativ mit starken Promotern verlinkt werden, wie zum Beispiel retroviralen langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs), Zytomegalovirus (CMV), Mausstammzellvirus (MSCV) U3, Phosphoglyzeratkinase (PGK), β-Aktin, Ubiquitin, und einem zusammengesetzten Promoter des Affenvirus 40 (SV40) / CD43, Elongationsfaktor (EF)-1a und dem Promoter von Spleen [Milz] Focus-Forming Virus (SFFV). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor für die exprimierte Nukleinsäure heterolog.
Zusätzlich zu starken Promotern können TCR-Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung zusätzliche Elemente enthalten, welche die Expression von Transgenen verstärken können, einschließlich einem zentralen Polypurintrakt (cPPT), welcher die nukleäre Translokation von lentiviralen Konstrukten fördert (Follenzi et al., 2000) und dem post-transkriptionalen regulatorischen Element des Woodchuck Hepatitis Virus (wPRE), welches das Niveau der transgenen Expression erhöht, indem es die RNA-Stabilität erhöht (Zufferey et al., 1999, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Die alpha- und beta-Ketten eines TCRs der vorliegenden Erfindung können durch Nukleinsäuren kodiert werden, die sich in separaten Vektoren befinden oder können durch Polynukleotide kodiert werden, die sich im selben Vektor befinden.
Um eine hochgradige TCR-Oberflächenexpression zu erreichen, müssen sowohl die TCR-alpha- als auch die TCR-beta-Ketten des eingeführten TCRs auf hohem Niveau transkribiert werden. Dazu können die TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung in einem einzigen Vektor in bi-cistronische Konstrukte kloniert werden, der nachweislich in der Lage ist, dieses Hindernis zu überwinden. Die Verwendung einer viralen internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) zwischen den Ketten TCR-alpha und TCR-beta führt zur koordinierten Expression beider Ketten, da die Ketten TCR-alpha und TCR-beta aus einem einzigen Transkript erzeugt werden, das während der Translation in zwei Proteine zerlegt wird, wodurch sichergestellt wird, dass ein gleiches Molverhältnis von TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten erzeugt wird (Schmitt et al., 2009, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Nukleinsäuren, die für TCRs der vorliegenden Beschreibung kodieren, können mit Codon optimiert werden, um die Expression aus einer Wirtszelle zu erhöhen. Eine Redundanz im genetischen Code ermöglicht es, dass einige Aminosäuren durch mehr als ein Kodon kodiert werden, aber bestimmte Kodons sind aufgrund der relativen Verfügbarkeit von passenden tRNAs sowie anderen Faktoren weniger „optimal“ als andere (Gustafsson et al., 2004). Die Modifikation der TCR-alpha und TCR-beta, Gensequenzen, so dass jede Aminosäure durch das optimale Codon für die Genexpression von Säugetieren kodiert wird, sowie die Beseitigung von mRNA-Instabilitätsmotiven oder kryptischen Spleißstellen, hat sich als signifikante Verbesserung der Genexpression von TCR-alpha und TCR-beta erwiesen (Scholten et al., 2006,. der Inhalt dieser Referenzen ist durch Verweis in vollem Umfang übernommen).
Darüber hinaus kann ein Mispairing zwischen der eingeführten und der endogenen TCR-Kette zum Erwerb von Spezifitäten führen, die ein erhebliches Risiko für die Autoimmunität darstellen. So kann beispielsweise die Bildung von gemischten TCR-Dimeren die Anzahl der CD3-Moleküle reduzieren, die für die Bildung von richtig gekoppelten TCR-Komplexen zur Verfügung stehen, und somit die funktionelle Avidität der Zellen, die das eingeführte TCR exprimieren, deutlich verringern (Kuball et al., 2007, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Um Mispairing zu reduzieren, kann die C-Terminus-Domäne der eingeführten TCR-Ketten der vorliegenden Beschreibung modifiziert werden, um die Affinität zwischen den Ketten zu fördern und gleichzeitig die Fähigkeit der eingeführten Ketten zur Kopplung mit dem endogenen TCR zu verringern. Diese Strategien können das Ersetzen der humanen TCR-alpha- und TCR-beta-C-Terminus-Domänen durch ihre murinen Gegenstücke (murinisierte C-Terminus-Domäne) beinhalten; das Erzeugen einer zweiten Interchain-Disulfidbindung in der C-Terminus-Domäne durch Einbringen eines zweiten Cysteinrestes sowohl in die TCR-alpha- als auch in die TCR-beta-Ketten der eingeführten TCR (Cysteinmodifikation); Vertauschen von interagierenden Resten in den C-Terminus-Domänen der TCR-alpha- und TCR-beta-Kette („knob-in-hole“); und Verschmelzen der variablen Domänen der TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten direkt zu CD3ζ (CD3ζ Fusion) (Schmitt et al., 2009).
In einer Ausführungsform ist eine Wirtszelle dafür konstruiert worden, einen TCR der vorliegenden Beschreibung zu exprimieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine menschliche T-Zelle oder ein T-Zell-Vorläufer. In einigen Ausführungsformen wird die T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem Krebspatienten gewonnen. In einigen Ausführungsformen wird die T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem gesunden Spender gewonnen. Wirtszellen der vorliegenden Beschreibung können im Hinblick auf einen zu behandelnden Patienten allogen oder autolog sein. In einer Ausführungsform ist der Wirt eine gamma/delta-T-Zelle, die transformiert wurde, um ein alpha/beta-TCR zu exprimieren.
Eine „pharmazeutische Zusammensetzung“ ist eine Zusammensetzung, die sich zur Verabreichung an einen Menschen in einem medizinischen Zusammenhang eignet. Vorzugsweise ist eine pharmazeutische Zusammensetzung steril und wird nach GMP-Richtlinien hergestellt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen die Peptide entweder in der freien Form oder in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes (siehe auch oben). Wie hier verwendet, bezieht sich „ein pharmazeutisch akzeptables Salz“ auf ein Derivat der offenbarten Peptide, wobei das Peptid durch Herstellung von Säure- oder Basensalzen des Agents modifiziert ist. Zum Beispiel werden Säuresalze aus der freien Base (typischerweise wenn die neutrale Form des Wirkstoffes eine neutrale -NH2-Gruppe aufweist) unter der Einbeziehung der Reaktion mit einer geeigneten Säure hergestellt. Geeignete Säuren zur Herstellung von Säuresalzen schließen sowohl organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und ähnliche Säuren, als auch anorganische Säuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnliche, ein. Umgekehrt, werden Präparationen basischer Salze der sauren Reste, die in einem Peptid vorhanden sein können, unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Trimethylamin oder ähnlichen, hergestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Peptide als Salze der Essigsäure (Acetate), Trifluoracete oder der Salzsäure (Chloride).
Bevorzugt ist das Medikament der vorliegenden Erfindung ein Immuntherapeutikum, so wie ein Vakzin. Es kann dem Patienten direkt in das betroffene Organ oder systemisch intravenös (i.v.), subkutan (s.c.), intradermal (i.d.), intraperitoneal (i.p.), intramuskulär (i.m.) verabreicht werden oder auch ex vivo an Zellen angewandt werden, die vom Patienten oder einer menschlichen Zelllinie abstammen und dem Patienten anschließend verabreicht werden, oder es wird in vitro benutzt, um eine Subpopulation der Immunzellen, die aus dem Patienten gewonnen wurden, auszuwählen, die dem Patienten dann rückverabreicht werden. Wenn die Nukleinsäure den Zellen in vitro verabreicht wird, kann es für die Zellen nützlich sein, transfiziert zu sein, damit sie immunstimulierende Zytokine, wie zum Beispiel Interleukin-2, co-exprimieren. Das Peptid kann im Wesentlichen rein sein oder es wird mit einem immunstimuliernden Adjuvans (siehe unten) kombiniert oder es wird in Kombination mit immunstimulierenden Zytokinen verwendet oder es wird mit einem geeigneten Abgabesystem, wie zum Beispiel Liposomen, eingesetzt. Das Peptid kann auch an einen geeigneten Träger befestigt werden, beispielsweise an Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Mannan (siehe WO 95/18145 und Longenecker et al., 1993der Inhalt beider von welchen durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Das Peptid kann auch markiert sein, ein Fusionsprotein oder ein Hybridmolekül sein. Von den Peptiden, deren Sequenzen in der vorliegenden Erfindung angegeben sind, wird erwartet, dass sie CD4 oder CD8 T-Zellen stimulieren. Jedoch ist die Stimulierung von CD8 T-Zellen in Anwesenheit von Hilfe durch CD4 T-Helferzellen effektiver. Somit stellen für MHC-Klasse-I-Epitope, die CD8 T-Zellen stimulieren, die Fusionspartner oder Teile eines geeigneten Hybridmoleküls Epitope bereit, die CD4-positive T-Zellen stimulieren. Die CD4- und CD8-stimulierende Epitope sind im Stand der Technik wohl bekannt und beinhalten diejenigen, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
Bei einem Aspekt umfasst das Vakzin mindestens ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 aufgeführt ist, aufweist und zumindest ein weiteres Peptid, bevorzugt zwei bis 50, weiter bevorzugt zwei bis 25, noch weiter bevorzugt 2 bis 20 und am meisten bevorzugt zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn oder achtzehn Peptide enthält. Das Peptid /die Peptide können von einem oder mehreren spezifischen TAAs erhalten werden und können an MHC Klasse-I-Moleküle binden.
Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt eine Nukleinsäure (beispielsweise ein Polynukleotid), welche ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine Variante des Peptides kodiert. Die Nukleinsäure kann, zum Beispiel, DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon, entweder einzel- und/oder doppelsträngig oder native oder stabilisierte Formen von Polynukleotiden, so wie, zum Beispiel, Polynukleotide mit einem Phosphorothioat-Rückgrat sein, und sie kann oder kann keine Introne enthalten, solange sie das Peptid kodiert. Natürlich können nur Peptide, die natürlich vorkommende Aminosäurereste enthalten, die wiederum über natürliche Peptidbindungen verbunden sind, durch ein Polynukleotid kodiert werden. Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Eine Vielzahl von Verfahren wurde entwickelt, um Polynukleotide, speziell DNA, zum Beispiel durch komplementäre klebrige Enden (complementary cohesive termini) an Vektoren zu binden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymer-Abschnitte an das DNA-Segment hinzugefügt werden, um in die Vektor-DNA eingefügt zu werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären homopolymerischen Enden zusammengehalten und formen so rekombinante DNA-Moleküle.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, stellen ein alternatives Verfahren zum Verknüpfen des DNA-Segmentes und Vektoren dar. Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Endonukleaserestriktionsstellen enthalten, sind aus einer Anzahl von Quellen einschließlich der International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA, kommerziell erhältlich.
Ein wünschenswertes Verfahren, die DNA, die das Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, zu modifizieren, ist die Verwendung der Polymerasekettenreaktion, wie sie von Saiki et al. (Saiki et al., 1988, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) offenbart wurde. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, die DNA in einen geeigneten Vektor einzuführen, zum Beispiel durch gentechnische Veränderung an geeigneten Restriktionsstellen, oder es kann dazu verwendet werden, die DNA auf andere nützliche Arten zu modifizieren, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Falls virale Vektoren verwendet werden, so sind Pocken- oder Adenovirusvektoren bevorzugt.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA) kann dann in einem geeigneten Wirt exprimiert werden, um ein Polypeptid enthaltend ein Peptid oder ein Variante gemäß der Erfindung zu produzieren. Somit kann die DNA, die das Peptid oder eine Variante gemäß der Erfindung kodiert, entsprechend den bekannten Techniken verwendet werden, in Hinblick auf die hier enthaltene Lehre entsprechend modifiziert, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann dazu verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren und zu produzieren. Solche Techniken umfassen zum Beispiel die Offenbarten in den US-Patenten mit den Nummern: 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 und 4.810.648 , deren Inhalte durch Verweis in vollem Umfang übernommen werden.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA), die das Polypeptid, welches eine Verbindung gemäß der Erfindung darstellt, kodiert, kann an eine Vielzahl verschiedener anderer DNA-Sequenzen gebunden werden, um in einen geeigneten Wirt eingeführt zu werden. Die Begleit-DNA ist von der Art des Wirts, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon, ob episomale Erhaltung oder Integration erwünscht ist, abhängig.
Im Allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, in der richtigen Orientierung und dem korrekten Leseraster für die Expression insertiert. Wenn notwendig, kann die DNA an eine geeignete nukleotidische Transkriptions- und Translationsregulierungssequenz gebunden werden, die durch den gewünschten Wirt erkannt wird, auch wenn solche Regulierungen im Allgemeinen in dem Expressionsvektor vorhanden sind. Der Vektor wird dann mit Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher wird es notwendig sein, die transformierten Wirtszellen auszuwählen. Eine Selektionstechnik besteht darin, eine DNA-Sequenz mit allen notwendigen Kontrollelementen in den Expressionsvektor einzubauen, die für ein selektierbares Merkmal in der transformierten Zelle, wie z. B. Antibiotikaresistenz, kodiert.
Alternativ kann das Gen für solch eine auswählbare Eigenschaft ein anderer Vektor sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle gleichzeitig zu transformieren.
Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA transformiert wurden, werden dann für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, in Hinblick auf die Lehre der vorliegenden Offenbarung kultiviert, um die Expression des Polypeptides zu ermöglichen, welches dann gewonnen werden kann.
Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (zum Beispiel E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (zum Beispiel Aspergillus spec.), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen. Vorzugsweise kann das System aus Säugetierzellen wie z. B. CHO-Zellen bestehen, die bei der ATCC Cell Biology Collection erhältlich sind.
Ein typisches Säugetierzellvektorplasmid für die konstitutive Expression umfasst die CMV oder SV40 Promoter mit einem geeigneten Poly-A-Schwanz und einem Resistenzmarker, so wie Neomycin. Ein Beispiel ist pSVL, welches über Pharmacia, Piscataway, NJ, USA erhältlich ist. Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, welcher auch über Pharmacia erhältlich ist. Nützliche Hefeplasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS413-416 und sind grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefe-integrierende Plasmide (Yeast Integrating Plasmids = Ylps) und schließen die Hefeselektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3 ein. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefezentromerplasmide (Yeast Centromere plasmids = YCps). CMV-Promotorbasierende Vektoren (zum Beispiel von Sigma-Aldrich) stellen transiente oder stabile Expression, zytoplasmatische Expression oder Sekretion und N-terminale oder C-terminale Markierung in verschiedenen Kombinationen von FLAG, 3xFLAG, c-myc oder MAT bereit. Diese Fusionsproteine erlauben einen Nachweis, eine Aufreinigung und Analyse des rekombinanten Proteins. Dual-markierte Fusionen sorgen für Flexibilität bei der Erkennung
Die starke humane Cytomegalovirus (CMV)-Promotor-Regulationsregion verstärkt die konstitutiven Niveaus der Proteinexpression bis auf 1 mg/L in COS-Zellen. Bei weniger potenten Zelllinien beträgt das Proteinniveau typischerweise -0,1 mg/L. Die Gegenwart des SV40-Replikationsursprungs führt zu hohen Konzentrationen in der DNA-Replikation von SV40 replikationspermissiven COS-Zellen. CMV-Vektoren können zum Beispiel pMB1 (Derivat von pBR322) Ursprung für die Replikation in Bakterienzellen enthalten, das b-Lactamase-Gen für die Selektion der Ampicillinresistenz in Bakterien, hGH-PolyA und den f1-Ursprung. Vektoren, die die Preprotrypsinleader (PPT)-Sequenz enthalten, können die Sekretion der FLAG-Fusionsproteine in das Kulturmedium für die Aufreinigung unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern, Harzen und Platten steuern. Andere Vektoren und Expressionssysteme sind für den Gebrauch mit einer Vielzahl von Wirtszellen aus dem Stand der Technik gut bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform werden zwei oder mehr Peptide oder Peptidvarianten der Erfindung kodiert und damit in einer aufeinanderfolgenden Reihenfolge exprimiert (ähnlich den Konstrukten „Beads on a string“). Dabei können die Peptide oder Peptidvarianten durch Abschnitte von Linker-Aminosäuren, wie z. B. LLLLLL, miteinander verknüpft oder fusioniert werden oder ohne zusätzliche Peptide zwischen ihnen verknüpft werden. Diese Konstrukte können auch für die Krebstherapie eingesetzt werden und können Immunantworten auslösen, die sowohl MHC-I als auch MHC-II betreffen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine mit einem Polynukleotidvektorkonsturkt gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein.
Bakterienzellen können unter bestimmten Umständen die bevorzugten prokaryotischen Wirtszellen sein und sind typischerweise ein Stamm von E. coli, wie zum Beispiel der E. Coli Stamm DH5, erhältlich über Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, und RR1, erhältlich über die American Type Culture Collection (ATCC) aus Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen beinhalten Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen, bevorzugt Wirbeltierzellen, wie zum Beispiel die der Maus, Ratte, Affe oder menschliche Fibroblasten- und Darmzelllinien. Hefewirtszellen schließen YPH499, YPH500 und YPH501 ein, die grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich sind. Bevorzugte Säugetierzellen enthalten Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO), die über das ATCC als CCL61 erhältlich sind, NIH Embryozellen der Swiss-Mäuse NIH/3T3, die über das ATCC als CRL 1658 erhältlich sind, von Affennieren erhaltene COS-1 Zellen, die über das ATCC als CRL 1650 erhältlich sind, und 293-Zellen, welche embryonale menschliche Nierenzellen sind. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf9-Zellen, die mit Expressionsvektoren des Baculovirus transfiziert werden können. Einen Überblick über die Auswahl geeigneter Wirtszellen für die Expression ist in der Literatur zu finden (Balbás und Lorence, 2004).
Die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt wird typischerweise durch sehr gut bekannte Verfahren, die üblicherweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen, erreicht. Bezüglich der Transformation prokaryotischer Wirtszellen siehe z. B. Cohen et al. oder Green und SambrookGreen and Sambrook, 2012); (Cohen et al., 1972. Die Transformation von Hefezellen wird in Sherman et al. (Sherman et al., 1986) beschrieben. Das Verfahren von Beggs (Beggs, 1978) ist auch nützlich. In Bezug auf Wirbeltierzellen gibt es einige für die Transfektion solcher Zellen nützliche Reagenzien, wie zum Beispiel Kalziumphosphat und DEAE-Dextran oder liposomale Formulierungen, die über Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA zu erhalten sind. Elektroporation ist auch nützlich, um Zellen zu transformieren und/oder zu transfizieren, und ist im Stand der Technik für die Transformation von Hefezellen, Bakterienzellen, Insektenzellen und Wirbeltierzellen gut bekannt. Der Inhalt jeder dieser Referenzen wird hiermit durch Verweis vollständig übernommen.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch wohlbekannte Techniken, wie beispielsweise PCR, identifiziert werden. Alternativ kann die Anwesenheit des Proteins in dem Überstand unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden.
Dem Fachmann ist es selbstverständlich, dass bestimmte erfindungsgemäße Wirtszellen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefe, und Insektenzellen für die Herstellung von erfindungsgemäßen Peptiden nützlich sind. Jedoch können auch andere Wirtszellen für bestimmte therapeutische Verfahren nützlich sein. Zum Beispiel können Antigen-präsentierende Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, nützlich dazu verwendet werden, die erfindungsgemäßen Peptide so zu exprimieren, dass sie in geeignete MHC-Moleküle beladen werden. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor entsprechend der Erfindung bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle oder eine Antigen-präsentierende Zelle. APCs, die mit einem rekombinanten Fusionsprotein beladen sind, das Prostata-Säure-Phosphatase (PAP) enthält, wurden am 29. April 2010 von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung des asymptomatischen oder minimal symptomatischen metastatischen HRPC (Sipuleucel-T) zugelassen (Rini et al., 2006; Small et al., 2006, deren Inhalte durch Verweis in vollem Umfang übernommen werden).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines tumorassoziierten Peptids oder seiner Varianten bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle und das Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Peptid, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor der Erfindung in der Medizin verwendet. Zum Beispiel kann das Peptid oder seine Variante für eine Injektion i.v., s.c., i.d., i.p., i.m. vorbereitet werden.
Bevorzugte Verfahren, die Peptide zu injizieren, umfassen s.c., i.d., i.p., i.m. und i.v. Bevorzugte Verfahren, die DNA zu injizieren, umfassen i.d., i.m., s.c., i.p. und i.v. Dosen von beispielsweise zwischen 50 µg und 1,5 mg, bevorzugt 125 µg bis 500 µg, des Peptides oder der DNA können verabreicht werden und hängen von dem jeweiligen Peptid oder der DNA ab. Dosen aus diesem Bereich wurden erfolgreich in früheren Studien verwendet (Walter et al., 2012).
Das Polynukleotid kann für die aktive Immunisierung im Wesentlichen rein oder enthaltend in einem geeigneten Vektor oder Abgabesystem verwendet werden. Die Nukleinsäure kann DNA, cDNA, PNA, RNA oder eine Kombination davon sein. Verfahren für das Design und die Einführung solcher Nukleinsäuren sind im Stand der Technik wohl bekannt. Eine Übersicht wird durch Teufel et al. (Teufel et al., 2005, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) bereitgestellt. Polynukleotidimpfstoffe sind leicht herzustellen, allerdings ist die Wirkungsweise dieser Vektoren zur Induzierung einer Immunantwort nicht vollkommen verstanden. Geeignete Vektoren und Zufuhrsysteme beinhalten virale DNA und/oder RNA, solche Systeme basieren auf Adenovirus, Vacciniavirus, Retroviren, Herpesvirus, Adeno-assoziiertem Virus oder Hybriden, die Elemente von mehr als einem Virus enthalten. Nicht virale Zufuhrsysteme beinhalten kationische Lipide und kationische Polymere, wie sie im Stand der Technik für die Beförderung von DNA bekannt sind. Eine physikalische Verabreichung, wie zum Beispiel durch eine „Genkanone“ (gene-gun), kann auch verwendet werden. Das Peptid oder Peptide, die durch eine Nukleinsäure kodiert sind, können ein Fusionsprotein mit einem Epitop sein, das T-Zellen für das entgegengesetzte CDR, wie oben beschrieben, stimuliert.
Das Medikament der Erfindung kann auch eines oder mehrere Adjuvantien enthalten. Adjuvantien sind Substanzen, die unspezifisch die Immunantwort verstärken oder potenzieren (zum Beispiel durch CD8-positive T-Zellen, und T-Helferzellen (TH) vermittelte Immunantworten gegen ein Antigen) und werden somit als nützlich in einem Medikament der vorliegenden Erfindung angesehen.
Geeignete Adjuvantien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 1018 ISS, Aluminiumsalze, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, Flagellin oder TLR5-Liganden erhalten von Flagellin, FLT3-Ligand, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), Resiquimod, ImuFact IMP321, Interleukine wie IL-2, IL-13, IL-21, Interferon-alpha oder -beta, oder pegylierte Derivate davon, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, Monophosphoryl-Lipid A, Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid ISA-51, Wasser-in-Öl- und Öl-in-Wasser-Emulsionen, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® Vectorsystem, Poly(lactid co-glycolid) [PLG]-basierende und Dextran-Mikropartikel, Talactoferrin, SRL172, Virosome und andere Virus-ähnliche Partikel, YF-17D, VEGF trap, R848, Beta-Glucan, Pam3Cys, Aquila's QS21 Stimulon, welches aus Saponin erhalten wird, Extrakte aus Mykobakterien und synthetische bakterielle Zellwandmimetika und urheberrechtlich geschützte Adjuvantien wie Ribi's Detox, Quil oder Superfos. Adjuvantien wie Freund's oder GM-CSF sind bevorzugt. Verschiedene immunologische Adjuvantien (z. B. MF59), die spezifisch für dendritische Zellen sind, und deren Erzeugung wurden früher beschrieben (Allison and Krummel, 1995, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Zytokine können auch verwendet werden. Verschiedene Zytokine wurden direkt mit der Beeinflussung der Migration von dendritischen Zellen zu Lymphgeweben (zum Beispiel TNF-□), der Beschleunigung der Reifung von dendritischen Zellen in effiziente Antigen-präsentierende Zellen für T-Lymphozyten (zum Beispiel GM-CSF, IL-1 und IL-4) ( US-Pat. Nr. 5.849.589 durch Referenz in seiner Gesamtheit aufgenommen) und der Funktion als Immunoadjuvans (bspw. IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-23, IFN-alpha, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). In einem Aspekt können Zytokine und immunologische Adjuvantien in vitro verwendet werden, z. B. zur Expansion oder Aktivierung von T-Zellen oder für ex vivo-Anwendungen.
Es wurde auch beschrieben, dass CpG immunostimulatorische Oligonukleotide den Effekt von Adjuvantien in einer Impfstoffzusammensetzung verstärken. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, agieren CpG-Oligonukleotide durch Aktivierung des angeborenen (nicht adaptivem) Immunsystems via Toll-like Rezeptoren (TLR), vor allem TLR9. CpG-getriggerte TLR9-Aktivierung verstärkt die Antigen-spezifischen humoralen und zellulären Antworten auf eine große Vielfalt von Antigenen, enthaltend Peptid- oder Proteinantigene, lebende oder abgetötete Viren, dendritische Zellimpfstoffe, autologe Zellimpfstoffe und Polysaccharid-Konjugate sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Impfstoffen. Noch wichtiger ist, dass es die Reifung und Differenzierung der dendritischen Zellen verstärkt, was zu einer verstärkten Aktivierung der TH1-Zellen und starker Generierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), auch in der Abwesenheit von CD4 T-Zellhilfe, führt. Die durch TLR9-Stimulation induzierte TH1-Prägung wird sogar in der Anwesenheit von Impfstoffadjuvantien, wie Alum oder nicht vollständigem Freundschem Adjuvans (IFA), welches normalerweise eine TH2-Prägung fördert, erhalten. CpG-Oligonukleotide zeigen eine noch größere Aktivität als Adjuvans, wenn sie mit anderen Adjuvantien formuliert oder in Formulierungen, wie Micropartikel, Nanopartikel, Lipidemulsionen oder ähnlichen Formulierungen zusammen verabreicht werden, welche besonders notwendig sind, um eine starke Antwort zu induzieren, wenn die Antigene relativ schwach sind. Sie beschleunigen auch die Immunantwort und ermöglichen es, die Dosierung des Antigens um ungefähr zwei Größenordnungen zu senken, die Antikörperantworten zu dem Volldosisimpfstoff ohne CpG sind dabei in manchen Experimenten vergleichbar ((Krieg, 2006)). Im US-Patent Nr. 6.406.705 B1 , das durch Verweis in seiner Gesamtheit einbezogen wird, wird die kombinierte Verwendung von CpG-Oligonukleotiden, nicht-Nukleinsäure-Adjuvantien und einem Antigen beschrieben, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu erzeugen. Ein CpG TLR9 Antagonist ist dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) von Mologen (Berlin, Deutschland), welches ein bevorzugter Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist. Andere TLR-bindende Moleküle, wie beispielsweise RNA-bindende TLR 7, TLR 8 und/oder TLR 9 können auch verwendet werden.
Andere Beispiele von nützlichen Adjuvantien enthalten, sind aber nicht limitiert auf modifizierte CpGs (beispielsweise CpR, Idera), dsRNA-Analoge wie Poly(I:C) und Derivate davon (z. B. AmpliGen®, Hiltonol®, poly(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U)), nicht-CpG bakterielle DNA oder RNA sowie immunoaktive kleine Moleküle und Antikörper wie Cyclophosphamid, Sunitinib, Immunkontrollpunkt-Inhibitoren einschließlich Ipilimumab, Nivolumab, Pembrolizumab, Atezolizumab, Avelumab, Durvalumab und Cemiplimab, Bevacizumab®, Celebrex, NCX-4016, Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil, Sorafenib, Temozolomid, Temsirolimus, XL-999, CP-547632, Pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, andere Antikörper, die auf Schlüsselstrukturen des Immunsystems (z. B. anti-CD40, anti-TGF-beta, anti-TNF-alpha Rezeptor) abzielen, und SC58175, welche therapeutisch und/oder als ein Adjuvans wirken können. Die Mengen und Konzentrationen der Adjuvantien und Zusatzstoffe, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch den Fachmann einfach ohne unverhältnismäßige Experimente bestimmt werden.
Bevorzugte Adjuvantien sind anti-CD40, Imiquimod, Resiquimod, GM-CSF, Cyclophosphamid, Sunitinib, Bevacizumab, Interferon-alpha, CpG-Oligonucleotide und Derivate, poly-(I:C) und Derivate, RNA, Sildenafil und partikuläre Formulierungen mit PLG oder Virusomen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird das Adjuvans aus einer Gruppe bestehend aus koloniestimulierenden Faktoren, wie den GM-CSF, Sagramostim, Cyclophosphamid, Imiquimod, Resiquimod, Interferon-alpha, oder Mischungen daraus ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist das Adjuvans Cyclophosphamid, Imiquimod oder Resiquimod. Noch bevorzugtere Adjuvantien sind Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) und anti-CD40 mAb oder Kombinationen davon.

Diese Zusammensetzung dient der parenteralen Verabreichung, bspw. als subkutane, intradermale oder intramuskuläre oder orale Verabreichung. Die Zusammensetzung kann über subkutane, intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale, intrapleurale, intravesikuläre, intrathekale, topische, orale Verabreichung oder eine Kombination von Verabreichungswegen verabreicht werden. Dabei sind die Peptide und optional weitere Moleküle in einem pharmazeutisch akzeptablen, vorzugsweise wässrigen, Träger gelöst oder suspendiert. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung Hilfsstoffe, wie bspw. Puffer, Bindemittel, Sprengmittel, Verdünnungsmittel, Aromas, Gleitmittel etc. enthalten. Pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hilfsstoffe, Schmiermittel, Emulgatoren, Stabilisatoren, Lösungsmittel, Verdünnungsmittel, Puffer, Vehikel oder eine Kombination davon. Die Peptide oder T-Zellen, die das Peptid der vorliegenden Offenbarung in einem Komplex mit einem MHC-Molekül erkennen, können auch zusammen mit immunstimulierenden Substanzen verabreicht werden, wie z. B. den in Tabelle 6 dargestellten Zytokinen. Tabelle 6: Immunstimulierende Zytokine

Zytokine
EOTAXIN	IL-15
G-CSF	IL-17
GM-CSF	IP-10
INF-γ	MIP-2
IL-1α	KC
M-CSF	LIF
IL-1β	LIX
IL-2	MCP-1
IL-3	MIP-1α
IL-4	MIP-1β
IL-5	MIG
IL-6	RANTES
IL-7	TNFa
IL-10	IL-12 (P70)
IL-12 (p40)	VEGF
IL-123	IL-9
IL-18	IL-21

Zytokine, z. B. IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α und IFN-β, können auch bei der Aktivierung und/oder Expansion von T-Zellen eingesetzt werden, wie z. B. T-Zellen, die das Peptid der vorliegenden Offenbarung in einem Komplex mit einem MHC-Molekül erkennen.
Eine umfassende Darstellung von Hilfsstoffen, wie sie bei einer derartigen Zusammensetzung verwendet werden können, ist bspw. in A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Kibbe, 2000), aufgeführt. Weitere Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind in Remington's Pharmaceutical Sciences beschrieben (Gennaro, 1997; Banker und Rhodes, 2002, deren Inhalt diesem Dokument durch Verweis in ihrer Gesamtheit enthalten ist). Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei zur Prävention, Prophylaxe und/oder Therapie von adenomatöser Erkrankungen oder Tumorerkrankungen eingesetzt werden. Beispielhafte Formulierungen können z. B. in EP2113253 gefunden werden.
Es ist wichtig zu verstehen, dass die durch den Impfstoff nach der Erfindung ausgelöste Immunantwort den Krebs in verschiedenen Zellstadien und Entwicklungsstadien angreift. Darüber hinaus werden verschiedene krebsassoziierte Signalwege angegriffen. Dies ist ein Vorteil gegenüber Impfstoffen, die nur ein oder wenige Ziele ansprechen, was dazu führen kann, dass sich der Tumor leicht an den Angriff anpasst (Tumor-Escape). Außerdem zeigen nicht alle einzelnen Tumore das gleiche Muster von Antigenen. Eine Kombination mehrerer tumorassoziierter Peptide stellt daher sicher, dass jeder einzelne Tumor mindestens einen Teil der Ziele ausweist. Die Zusammensetzung ist so konzipiert, dass von jedem Tumor erwartet wird, dass er mehrere der Antigene exprimiert und mehrere unabhängige Wege abdeckt, die für das Wachstum und die Aufrechterhaltung des Tumors notwendig sind. So kann der Impfstoff problemlos „von der Stange“ für eine größere Patientenpopulation verwendet werden. Das bedeutet, dass eine Vorauswahl der mit dem Impfstoff zu behandelnden Patienten auf die HLA-Typisierung beschränkt werden kann, keine zusätzlichen Biomarker-Bewertungen für die Antigenexpression erforderlich sind, aber es ist dennoch sichergestellt, dass mehrere Ziele gleichzeitig durch die induzierte Immunantwort angegriffen werden, die für die Wirksamkeit wichtig ist (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Scaffold“ auf ein Molekül, das spezifisch an eine (z. B. antigene) Determinante bindet. In einer Ausführungsform ist ein Scaffold in der Lage, die Einheit, an die es gebunden ist (z. B. eine (zweite) Antigenbindungseinheit), an einen Zielort, z. B. an einen bestimmten Typ von Tumorzelle oder Tumorstroma mit der antigenen Determinante (z. B. den Komplex eines Peptids mit MHC, je nach Anwendung) zu leiten. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Scaffold in der Lage, die Signalisierung durch sein Zielantigen zu aktivieren, zum Beispiel ein komplexes T-Zell-Rezeptor-Antigen. Scaffolds beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper und Fragmente davon, Antigenbindungsdomänen eines Antikörpers, die eine variable Region der schweren Kette des Antikörpers und eine variable Region der leichten Kette des Antikörpers umfassen, Bindungsproteine, die mindestens ein sich wiederholendes Ankyrinmotiv und SDAB-Moleküle (Single Domain Antigen Binding), Aptamere, (lösliche) TCRs und (modifizierte) Zellen wie allogene oder autologe T-Zellen umfassen. Um zu beurteilen, ob ein Molekül ein Scaffold ist, das an ein Ziel bindet, können Bindungsassays durchgeführt werden.
„Spezifische“ Bindung bedeutet, dass das Scaffold den interessierenden Peptid-MHC-Komplex besser bindet als andere natürlich vorkommende Peptid-MHC-Komplexe, so dass ein Scaffold, das mit einem aktiven Molekül bewaffnet ist, das in der Lage ist, eine Zelle mit dem spezifischen Ziel zu töten, nicht in der Lage ist, eine andere Zelle ohne das spezifische Ziel, aber welche einen anderen(andere) Peptid-MHC-Komplex(e) präsentiert, zu töten. Die Bindung an andere Peptid-MHC-Komplexe ist irrelevant, wenn das Peptid des kreuzreaktiven Peptid-MHC nicht natürlich vorkommt, d.h. nicht aus dem menschlichen HLA-Peptidom stammt. Tests zur Beurteilung der Zielzelltötung sind in der Technik gut bekannt. Sie sollten mit Zielzellen (Primärzellen oder Zelllinien) mit unveränderter Peptid-MHC-Präsentation oder mit Peptiden beladenen Zellen durchgeführt werden, so dass natürlich vorkommende Protein-MHC-Niveaus erreicht werden.
Jedes Scaffold kann eine Markierung umfassen, die vorsieht, dass das gebundene Scaffold durch Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens eines Signals der Markierung erkannt werden kann. So kann beispielsweise der Scaffold mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen geeigneten zellulären Markermolekül markiert werden. Solche Markermoleküle sind in der Technik wohlbekannt. So kann beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung, beispielsweise durch einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Visualisierung des gebundenen Aptamers durch Fluoreszenz- oder Laserscanning-Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ermöglichen.
Jedes Scaffold kann mit einem zweiten aktiven Molekül wie z. B. IL-21, Anti-CD3 und Anti-CD28 konjugiert werden.
Weitere Informationen zu Polypeptidscaffolds finden sich z. B. im Hintergrundabschnitt der WO 2014/071978A1 und den darin zitierten Referenzen, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung und Entwicklung von spezifischen Antikörpern gegen MHC / Peptid-Komplexe verwendet werden. Diese können in der Therapie dazu verwendet werden, Toxine oder radioaktive Substanzen zu dem erkrankten Gewebe zu führen. Eine weitere Verwendung dieser Antikörper kann es sein, zu Abbildungszwecken, wie PET, Radionuklide an das erkrankte Gewebe zu führen. Diese Verwendung kann dazu beitragen, kleine Metastasen zu erkennen oder um die Größe und genaue Lokalisierung von erkrankten Geweben zu bestimmen.
Daher ist es ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers bereitzustellen, der spezifisch an ein MHC-Molekül der Klasse-I oder -II bindet, der mit einem HLA-restringierten Antigen (vorzugsweise einem Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung) komplexiert ist, wobei das Verfahren umfasst: Immunisierung genetisch manipulierter nicht-menschlicher Säugetiere, die Zellen umfassen, die das menschliche Molekül des MHC-Klasse I- oder -II mit einer löslichen Form eines MHC-Klasse I- oder Il-Moleküls exprimieren, das mit dem HLA-restingierten Antigen komplexiert ist; Isolierung von mRNA-Molekülen der antikörperproduzierenden Zellen von dem nicht-menschlichen Säugetier; Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek, die Proteinmoleküle, die von den mRNA-Molekülen kodiert werden, zeigen; und Isolierung von zumindest einem Phagen aus der Phagen-Display-Bibliothek, wobei der zumindest ein Phage den Antikörper zeigt, der spezifisch an das MHC-Molekül der Klasse-I oder -II bindet, welches mit dem HLA-beschränkten Antigen komplexiert ist.
Es ist daher ein weiterer Aspekt der Erfindung, einen Antikörper bereitzustellen, der spezifisch an ein MHC-Molekül der Klasse I- oder II bindet, das mit einem HLA-beschränkten Antigen komplexiert ist, wobei der Antikörper vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper, monoklonaler Antikörper, bispezifischer Antikörper, ein chimärer Antikörper, Antikörperfragmente davon oder eine Kombination davon ist.
Bispezifischer Antikörper
In einem Aspekt umfasst ein bispezifischer Antikörper einen Antikörper, der in der Lage ist, zwei oder mehr Epitope selektiv zu binden. Bispezifische Antikörper können auf verschiedene Weise hergestellt werden (Holliger & Winter, 1993, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird), z. B. chemisch hergestellt oder aus Hybridhybridomen, oder es kann sich um eines der oben erwähnten bispezifischen Antikörperfragmente handeln. scFv-Dimere oder Diabodies können anstelle von ganzen Antikörpern verwendet werden. Diabodies und scFv können ohne eine Fc-Region konstruiert werden, wobei nur variable Domänen verwendet werden (in der Regel einschließlich der variablen Domänenbestandteile von sowohl leichten als auch schweren Ketten des Quellantikörpers), wodurch die Auswirkungen der antiidiotypischen Reaktion potenziell reduziert werden können. Andere Formen von bispezifischen Antikörpern umfassen die von Traunecker und Kollegen beschriebene Einzelkette „Janusine“ (Traunecker et al., 1991, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Bispezifische Antikörper umfassen im Allgemeinen zwei verschiedene Bindungsdomänen, wobei jede Bindungsdomäne spezifisch ein anderes Epitop entweder an zwei verschiedene Antigene oder an dasselbe Antigen bindet. Wenn ein bispezifischer Antikörper in der Lage ist, zwei verschiedene Epitope (ein erstes Epitop und ein zweites Epitop) selektiv zu binden, wird die Affinität der ersten Bindung für das erste Epitop im Allgemeinen mindestens eine bis zwei oder drei oder vier Größenordnungen niedriger sein als die Affinität der ersten Bindungsdomäne für das zweite Epitop und umgekehrt. Die vom bispezifischen Antikörper erkannten Epitope können sich auf dem gleichen oder einem anderen Ziel (z. B. auf dem gleichen oder einem anderen Protein) befinden. Bisspezifische Antikörper können z. B. durch die Kombination von Bindungsdomänen hergestellt werden, die verschiedene Epitope desselben Antigens erkennen.
Einige Beispiele für bispezifische Antikörper haben zwei schwere Ketten (mit jeweils drei schweren Ketten-CDRs, gefolgt von (N-terminalen bis C-terminalen) einer CH1-Domäne, einem Gelenk, einer CH2-Domäne und einer CH3-Domäne) und zwei leichte Immunglobulinketten, die durch Assoziation mit jeder schweren Kette Antigen-bindende Spezifität verleihen. Es sind jedoch zusätzliche Architekturen vorgesehen, einschließlich bispezifischer Antikörper, bei denen die leichte(n) Kette(n) mit jeder schweren Kette assoziieren, aber nicht (oder nur minimal) zur Antigen-bindenden Spezifität beitragen, oder die eines oder mehrere der Epitope binden können, die von den Antigen-bindenden Regionen der schweren Kette gebunden werden, oder die mit jeder schweren Kette assoziieren können und die Bindung einer oder beider schwerer Ketten an ein oder beide Epitope ermöglichen.
In bestimmten Ausführungsformen kann ein bispezifischer Antikörper einen Antikörperarm umfassen, der mit einem Arm kombiniert ist, der an ein Triggermolekül auf einer Leukozytenzelle bindet, wie z. B. ein T-Zell-Rezeptormolekül (z. B. CD3), oder Fc-Rezeptoren für IgG (Fc gamma R), wie z. B. Fc gamma RI (CD64), Fc gamma RII (CD32) und Fc gamma RIII (CD 16), so dass die zellulären Abwehrmechanismen auf die anvisierte Krankheitszelle fokussiert und lokalisiert werden. Bispezifische Antikörper können auch verwendet werden, um zytotoxische Wirkstoffe auf anvisierte Krankheitszellen zu lokalisieren.
Bispezifische Antikörper können als Antikörper in voller Länge oder als Antikörperfragmente hergestellt werden (z. B. F(ab')₂ bispezifische Antikörper). Siehe z. B. WO 1996/016673 ; US-Patent Nr. 5.837.234 ; WO 1998/002463 ; US-Patent Nr. 5.821.337 , deren Inhalt durch Bezugnahme vollständig einbezogen ist.
Ein bispezifischer Antikörper kann eine verlängerte Halbwertszeit haben. Die Verlängerung der Halbwertszeit eines bispezifischen Antikörpers kann insbesondere durch folgende Maßnahmen erreicht werden: Erhöhung des hydrodynamischen Volumens des Antikörpers durch Kopplung an inerte Polymere wie Polyethylenglykol oder andere mimetische hydrophile Polymere; Fusion oder Konjugation an große ungeordnete Peptide; oder Fusion oder Kopplung des Antikörpers an einen Liganden. Diese und eine Reihe weiterer Änderungen sind an anderer Stelle beschrieben ( US-Patent Nr. 7.083.784 , US-Patent Nr. 7.670.600 , US -Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2010/0234575, und Zwolak et al.,2017, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Bispezifische Antikörper mit verlängerten Halbwertszeiten werden beispielsweise in US-Patent Nr. 8.921.528 und US-Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2014/0308285 beschrieben deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird.
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind im Stand der Technik bekannt. Die Herstellung von bispezifischen Antikörpern voller Länge basiert auf der Koexpression zweier Paare aus schwerer und leichter Immunglobulinkette, wobei die beiden Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen. Siehe z. B. WO 1993/008829 und Traunecker et al., 1991, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird.
Polyklonaler Antikörper
Verfahren zur Herstellung polyklonaler Antikörper sind im Stand der Technik bekannt. Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren stammen, die mit einem Antigen immunisiert wurden Polyklonale Antikörper, die ein Peptid gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 oder eine Variante oder ein Fragment davon selektiv binden, können nach in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden (siehe, z. B., Howard & Kaser, 2007, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird.
Chimärer Antikörper
Chimäre Antikörper sind Moleküle, die zu unterschiedlichen Anteilen von verschiedenen Tierspezies stammen, wie z. B. solche mit variabler Region, die von einem Maus-Antikörper und einer konstanten Region des menschlichen Immunglobulins stammen, und die in erster Linie verwendet werden, um die Immunogenität in der Anwendung zu verringern und die Ausbeuten in der Produktion zu erhöhen, z. B. wenn monoklonale Antikörper der Maus höhere Ausbeuten von Hybridomen, aber eine höhere Immunogenität beim Menschen haben, so dass humane chimäre monoklonale Antikörper der Maus verwendet werden. Chimäre Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind in der Technik bekannt (Cabilly et al., 1984; Morrison et al., 1984; Boulianne et al., 1984; Europäische Patentanmeldung 173494 (1986); WO 86/01533 (1986); Europäische Patentanmeldung 184187 (1986); Sahagan et al., 1986; Liu et al., 1987; Sun et al., 1987; Better et al., 1988; Harlow & Lane, 1998; US-Patent Nr. 5.624.659 , deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Antikörperfragmente
Neben ganzen Immunglobulinen (oder ihren rekombinanten Gegenstücken) können auch Immunglobulin-Fragmente, die die Epitop-Bindungsstelle umfassen (z. B. Fab', F(ab')₂ oder andere Fragmente), synthetisiert werden. „Fragmente“ oder minimale Immunglobuline können unter Verwendung rekombinanter Immunglobulin-Techniken entwickelt werden. Zum Beispiel können „Fv“-Immunglobuline zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung durch Synthese einer fusionierten variablen leichten Kettenregion und einer variablen schweren Kettenregion hergestellt werden. Auch Kombinationen von Antikörpern sind von Interesse, z. B. Diabodies, die zwei unterschiedliche Fv-Spezifitäten umfassen. Antigenbindende Fragmente von Immunglobulinen umfassen unter anderem SMIPs (engl. small molecule immunopharmaceuticals), Kamelkörper, Nanokörper und IgNAR.
Entsprechende Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und einkettiger MHC Klasse-I-Komplexe sowie andere Werkzeuge zur Herstellung dieser Antikörper sind in WO 03/068201 , WO 2004/084798 , WO 01/72768 , WO 03/070752 und in Veröffentlichungen (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003 offenbart, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden.
Vorzugsweise bindet der Antikörper mit einer Bindungsaffinität von <100 nM, mehr bevorzugt <50 nM, mehr bevorzugt <10 nM, mehr bevorzugt <1 nM, mehr bevorzugt <0,1 nM, mehr bevorzugt <0,01 nM, an den Komplex, der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls als „spezifisch“ angesehen wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102,
• und eine Sequenzvariante davon, die die Fähigkeit aufrechterhält, an MHC-Molekül(e) zu binden und/oder T-Zellen zu induzieren, die mit der Peptidvariante kreuzreagieren,

^*

In einer Ausführungsform sind variante Sequenzen der beanspruchten Peptide in der obigen Bedeutung Sequenzen, die in ihrer sogenannten „Ankerposition“ Substitutionen aufweisen.
Zu beachten ist, dass diese Ankerpositionen in MHC-beschränkten Peptiden Aminosäurereste enthalten, die die Bindung des Peptids an die Peptidbindungsfurche im MHC vermitteln.
Sie spielen in der Bindungsreaktion zwischen dem bindenden Polypeptid und dem Peptid-MHC-Komplex nur eine untergeordnete Rolle, so dass Substitutionen an diesen Positionen die Immunogenität oder die TCR/Antikörper-Bindung eines derart modifizierten Peptids nicht signifikant beeinflussen.
Für HLA-A^*02 befinden sich die Ankerpositionen in Position 2 (P2) und Position 9 (P9) des jeweiligen MHC-restringierten Peptids (siehe Tabelle 7). In P2 sind die bevorzugten Aminosäurereste am häufigsten Leucin (L) oder Methionin (M), während in P9 die bevorzugten Aminosäurereste Leucin (L) oder Valin (V) sind. Tabelle 7: Ankerposition und bevorzugte Aminosäuren in diesen Positionen für HLA-A^*02.

HLA-Subtyp Ankerposition 1 Akzeptierte Aminosäurereste Ankerposition 2 Akzeptierte Aminosäurereste

HLA-A*02 Position 2 L oder M Position 9 L oder V
Darüber hinaus bezieht sich die Erfindung auf Varianten davon, die mindestens zu 88% zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 homolog sind, vorausgesetzt, sie binden an MHC-Molekül(e) und/oder induzieren T-Zellen, mit dem Variantenpeptid kreuzzureagieren.
In einer Ausführungsform sind variante Sequenzen der beanspruchten Peptide in der obigen Bedeutung Sequenzen, die durch mindestens eine konservative Aminosäuresubstitution modifiziert sind. Die Definition und der Geltungsbereich des Begriffs „konservative Aminosäuresubstitution“ sind in Tabelle 3 und 4 und der damit verbundenen Beschreibung offenbart.
In einer Ausführungsform hat das Peptid die Fähigkeit, an ein MHC-Klasse-I-Molekül zu binden, und wenn es an den MHC gebunden ist, kann es von CD4- und/oder CD8-T-Zellen erkannt werden.
In einer Ausführungsform ist das MHC-Klasse-I-Molekül ein MHC-Molekül vom Allotyp HLA-A^*02.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Peptid, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 ausgewählt ist oder einer Variante davon, die mindestens zu 88% der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 homolog (vorzugsweise identisch), wobei das Peptid oder die Variante eine Gesamtlänge zwischen 8 und 30 aufweist, und bevorzugt zwischen 8 und 12 Aminosäuren oder zwischen 9 und 30, und bevorzugt zwischen 9 und 12 Aminosäuren, wenn das ausgewählte Peptid eine Länge von 9 Aminosäuren aufweist, oder zwischen 10 und 30, und bevorzugt zwischen 10 und 12 Aminosäuren, wenn das ausgewählte Peptid eine Länge von 10 Aminosäuren aufweist.
In einer Ausführungsform umfasst das Peptid oder eine Variante davon 1 bis 4 zusätzliche Aminosäuren am C- und/oder N-Terminus der jeweiligen Sequenz. Siehe Tabelle 5 für weitere Details.
In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von bis zu 30 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von bis zu 16 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von bis zu 12 Aminosäuren auf.
In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 8 bis 30 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 8 bis 16 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 8 bis 12 Aminosäuren auf.
In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 9 bis 30 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 9 bis 16 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 9 bis 12 Aminosäuren auf.
In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 10 bis 30 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 10 bis 16 Aminosäuren auf. In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge von 10 bis 12 Aminosäuren auf.
In einer Ausführungsform weist das Peptid oder eine Variante davon eine Länge gemäß der jeweiligen SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 auf. In einer weiteren Ausführungsform besteht oder besteht essentiell das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin erfindungsgemäße Peptide, wobei das Peptid nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner erfindungsgemäße Peptide, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, insbesondere umfassend N-terminale Aminosäuren der HLA-DR-Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii), oder wobei das Peptid an (oder in) einen Antikörper fusioniert ist, wie zum Beispiel einen Antikörper, der spezifisch für dendritische Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, der bzw. das das Peptid oder die Variante davon nach der vorliegenden Erfindung spezifisch erkennt oder bindet, oder an das Peptid oder die Variante davon nach der vorliegenden Erfindung, wenn es bzw. sie an ein MHC-Molekül gebunden ist.
In einer Ausführungsform ist das MHC-Molekül ein MHC-Molekül vom Allotyp HLA-A^*02.
In weiteren Ausführungsformen sind solche Antikörper löslich oder membrangebunden. In weiteren Ausführungsformen ist ein solcher Antikörper ein monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon. In weiteren Ausführungsformen trägt ein solcher Antikörper eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder ein Toxin.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen T-Zell-Rezeptor oder ein funktionelles Fragment davon, der mit einem MHC-Liganden reaktiv ist oder an einen MHC-Liganden bindet, wobei der Ligand das Peptid oder eine Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung ist, oder das Peptid oder die Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung ist, wenn es an ein MHC-Molekül gebunden ist.
In einer Ausführungsform ist das MHC-Molekül ein MHC-Molekül vom Allotyp HLA-A^*02. In weiteren Ausführungsformen wird der T-Zell-Rezeptor als lösliches Molekül zur Verfügung gestellt. In weiteren Ausführungsformen trägt der T-Zell-Rezeptor eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder ein Toxin.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine Nukleinsäure, die für ein Peptid oder eine Variante davon gemäß der Erfindung, einen Antikörper oder ein Fragment davon gemäß der Erfindung oder einen T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon gemäß der Erfindung kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleinsäure der Erfindung, welche DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon ist.
In einer Ausführungsform ist diese Nukleinsäure mit einer heterologen Promotorsequenz verbunden. In einer Ausführungsform wird die Nukleinsäure als ein Expressionsvektor bereitgestellt, der die Nukleinsäure exprimiert und/oder umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine rekombinante Wirtszelle, die ein Peptid oder eine Variante davon gemäß der Erfindung, einen Antikörper oder ein Fragment davon gemäß der Erfindung, einen T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon gemäß der Erfindung oder eine Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor gemäß der Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein in vitro Verfahren zur Herstellung von aktivierten T Lymphozyten, wobei das Verfahren ein in Kontakt bringen in vitro von T-Zellen mit Antigen-beladenen menschlichen Klasse-I oder -II MHC-Molekülen umfasst, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder eines künstlichen Konstrukts, das eine Antigen-präsentierende Zelle nachahmt, exprimiert werden, für eine Zeitdauer die ausreichend ist, um die T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid oder eine Variante davon gemäß der entsprechenden Beschreibung ist.
In einer Ausführungsform umfasst die Antigen-präsentierende Zelle einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, das Peptid, das SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 oder die variante Aminosäuresequenz enthält, zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein in vitro-Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung und Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf einen aktivierten T-Lymphozyten, der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wird, wobei der T-Lymphozyt selektiv eine Zelle erkennt, die ein Peptid oder eine Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung präsentiert. Diese Präsentation kann eine aberrante Präsentation oder eine aberrante Expression sein.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf eine pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

• dem Peptid oder einer Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung,
• dem Antikörper oder einem Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung,
• dem T-Zell-Rezeptor oder einem Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung,
• der Nukleinsäure oder dem Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung,
• der Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung
• oder dem aktivierten T-Lymphozyten gemäß der vorliegenden Erfindung,

In einer Ausführungsform ist eine solche pharmazeutische Zusammensetzung eine personalisierte pharmazeutische Zusammensetzung für einen einzelnen Patienten. In einer Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Impfstoff. Das Verfahren könnte auch angepasst werden, um T-Zellklone für Downstream-Anwendungen wie TCR-Isolationen oder lösliche Antikörper und andere Behandlungsmöglichkeiten herzustellen.
Ein „personalisiertes pharmazeutisches Produkt“ bezeichnet für einen einzelnen Patienten spezifisch zugeschnittene Therapien, die nur für die Therapie bei diesem einzelnen Patienten verwendet werden, einschließlich aktiv personalisierter Krebsimpfstoffe und adoptiver zellulärer Therapien mit autologem Patientengewebe. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Herstellung des Peptids oder einer Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung, des Antikörpers oder Fragments davon gemäß der vorliegenden Erfindung oder des T-Zell-Rezeptors oder Fragments davon gemäß der vorliegenden Erfindung, und zur Isolierung des Peptids oder der Variante davon, des Antikörpers oder Fragments davon oder des T-Zell-Rezeptors oder Fragments davon aus der Wirtszelle und/oder ihrem Kulturmedium.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Peptid oder eine Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung, den Antikörper oder ein Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung, den T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung, die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung, die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, oder den aktivierten T-Lymphozyten gemäß der vorliegenden Erfindung, zur Verwendung in der Medizin oder zur Verwendung bei der Herstellung eines Arzneimittels.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Abtöten von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid, das eine beliebige Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, aberrant exprimieren.
Dieses Verfahren umfasst die Verabreichung einer wirksamen Anzahl von aktivierten T-Lymphozyten an den Patienten, wie es der vorliegenden Erfindung entspricht.
Ebenso bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen aktivierten T-Lymphozyten gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen die Zielzellen von welchem ein Polypeptid präsentieren, das eine beliebige Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, oder zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Abtötung solcher Zielzellen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten,

• bei dem folgendes diagnostiziert wurde,
• der an folgenden Krankheiten leidet oder
• bei dem das Risiko besteht,

Ebenso bezieht sich die vorliegende Erfindung weiterhin auf das Peptid oder eine Variante davon gemäß der vorliegenden Erfindung, den Antikörper oder ein Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung, den T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon gemäß der vorliegenden Erfindung, die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung, die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung oder den aktivierten T-Lymphozyten gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten,

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Medikament ein Impfstoff ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf das Verfahren oder das Peptid, den Antikörper, den T-Zell-Rezeptor, die Nukleinsäure, die Wirtszelle oder den aktivierten T-Lymphozyten zur Verwendung gemäß der Erfindung, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom ausgewählt ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen Kit umfassend:

(a) einen Behälter, umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung in Lösung oder in lyophilisierter Form enthält;
(b) gegebenenfalls, einen zweiten Behälter enthaltend ein Verdünnungsmittel oder eine Rekonstitutionslösung für die lyophilisierte Formulierung;
(c) gegebenenfalls, mindestens ein weiteres Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 102.

Der Kit kann in weiteren Ausführungsformen ein oder mehr von einem Puffer, einem Verdünnungsmittel, einem Filter, einer Nadel oder einer Spritze enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner bestimmte Markerproteine und Biomarker, die auf den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung basieren, im vorliegenden Kontext als „Targets“ bezeichnet, die zur Diagnose und/oder Prognose von zumindest einem von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom eingesetzt werden können.
Der Begriff „Antikörper“ oder „die Antikörper“ wird hier in einem weiten Sinn verwendet und schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper ein. Neben intakten oder „vollständigen“ Immunglobulinmolekülen umfasst der Begriff „Antikörper“ auch Fragmente (z. B. CDRs, Fv-, Fab- und Fc-Fragmente) oder Polymere dieser Immunglobulinmoleküle und humanisierte Versionen von Immunglobulinmolekülen, sofern sie eine der gewünschten Eigenschaften aufweisen (z. B. spezifische Bindung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom-Marker-Polypeptid) gemäß der Erfindung.
Wann immer möglich, können die Antikörper der Erfindung aus kommerziellen Quellen erworben werden. Die Antikörper der Erfindung können auch unter Verwendung bekannter Verfahren erzeugt werden. Der Fachmann wird verstehen, dass entweder Volllängen-Markerpolypeptide von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom oder deren Fragmente können zur Erzeugung der Antikörper der Erfindung verwendet werden. Ein Polypeptid, das zur Erzeugung eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt wird, kann teilweise oder vollständig aus einer natürlichen Quelle gereinigt werden oder kann unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden.
So kann beispielsweise eine cDNA, die für ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, wie beispielsweise ein Peptid gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 Polypeptid, oder eine Variante oder ein Fragment davon, in prokaryotischen Zellen (z. B. Bakterien) oder eukaryontischen Zellen (z. B., Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen) exprimiert werden, woraufhin das rekombinante Protein gereinigt und zur Erzeugung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörperpräparats verwendet werden kann, das spezifisch an den Markerpolypeptid von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom, das zur Erzeugung des Antikörpers gemäß der Erfindung verwendet wird.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird feststellen, dass die Erzeugung von zwei oder mehr unterschiedlichen Gruppen von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern die Wahrscheinlichkeit, einen Antikörper mit der Spezifität und Affinität für die beabsichtigte Verwendung (bspw. ELISA, Immunohistochemie und in vivo-Bildgebung, Immuntoxin-Therapie) zu erhalten, maximiert. Die Antikörper werden auf ihre gewünschte Aktivität durch bekannte Verfahren entsprechend dem Zweck, zu dem die Antikörper verwendet werden, getestet (bspw. ELISA, Immunohistochemie, Immuntherapie usw. (Greenfield, 2014, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird)). Beispielsweise können die Antikörper in ELISA-Assays oder Western-Blots, immunhistochemischer Färbung von formalinfixierten Krebserkrankungen oder gefrorenen Gewebeschnitten untersucht werden. Nach ihrer anfänglichen in vitro Charakterisierung werden für therapeutische Benutzung oder die in vivo Diagnostik bestimmte Antikörper nach bekannten klinischen Testverfahren untersucht.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper“, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf einen aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhaltenen Antikörper, d. h. einzelne Antikörper, die die Population umfassen, sind mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch. Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen insbesondere „chimäre“ Antikörper, in denen ein Teil der schweren und / oder leichten Kette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern sind, die von einer bestimmten Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse gehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die erwünschte antagonistische Wirkung aufweisen ( US-Patent Nr. 4.816.567 , welches hiermit in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird).
Monoklonale Antikörper der Erfindung können unter Verwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren, oder die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie sie in dem US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind, hergestellt werden. DNA, die die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. durch Verwendung von Oligonukleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene, die die schweren und leichten Ketten muriner Antikörper kodieren, zu binden).
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung monovalenter Antikörper geeignet. Die Verdauung von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, herzustellen, kann unter Verwendung von Routinetechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, erreicht werden. Zum Beispiel kann die Verdauung unter Verwendung von Papain durchgeführt werden. Beispiele für die Papain-Verdauung sind in der WO 94/29348 und in dem US-Patent Nr. 4.342.566 beschrieben, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird. Die Papain-Verdauung von Antikörpern produziert typischerweise zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt Fab-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigenbindungsstelle, und einem Rest-Fc-Fragment. Die Pepsin-Behandlung erzeugt ein F(ab')2-Fragment und ein pFc'-Fragment.
Die Antikörperfragmente, ob an andere Sequenzen gebunden oder nicht, können auch Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder andere ausgewählte Modifikationen bestimmter Regionen oder spezifische Aminosäurereste umfassen, sofern die Aktivität des Fragments nicht wesentlich im Vergleich zu dem nicht modifizierten Antikörper oder Antikörperfragment verändert oder verschlechtert ist. Diese Modifikationen können einige zusätzliche Eigenschaften bieten, wie zum Beispiel um Aminosäuren, die zu einer Disulfidbindung fähig sind, zu entfernen / hinzufügen, um seine bio-Langlebigkeit zu erhöhen, um seine sekretorischen Eigenschaften zu ändern usw. In jedem Fall muss das Antikörperfragment eine bioaktive Eigenschaft besitzen, wie zum Beispiel eine Bindungsaktivität, die Regulierung der Bindung an die Bindungsdomäne, usw. Funktionelle oder aktive Regionen des Antikörpers können durch Mutagenese einer spezifischen Region des Proteins identifiziert werden, gefolgt von der Expression und Testen des exprimierten Polypeptids. Solche Verfahren sind leicht ersichtlich für einen Fachmann auf dem technischen Gebiet und können die ortsspezifische Mutagenese der Nukleinsäure, die das Antikörperfragment kodiert, enthalten.
Die Antikörper der Erfindung können weiterhin humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper sein. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab' oder andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz von nicht-menschlichem Immunglobulin enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in welchen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR eines nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüst (FR-)-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in welchen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen sind jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz, umfassen. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch mindestens einem Abschnitt von einer konstanten Immunoglobulinregion (Fc), typischerweise den Abschnitt von einem humanen Immunglobulin.
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer Quelle, die nicht menschlich ist, in ihn eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import“-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import“-Domäne entnommen sind. Humanisierung kann im Wesentlichen durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten“ Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 , dessen Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in welchen manche CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen der Nager-Antikörper substituiert sind.
Transgene Tiere (z. B. Mäuse), die fähig sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit einer endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren, können verwendet werden. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-Gens in chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solchen Keimlinien-mutierten Mäusen wird die Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigen-Exposition zur Folge haben. Menschliche Antikörper können auch in Phagendisplay-Bibliotheken hergestellt werden.
In einem Aspekt kann der Antikörper der vorliegenden Offenlegung auch durch Phagen-Display, oder Ribosomen-Display, oder Hefe-Display, oder Bakterien-Display, oder Baculovirus-Display, oder Säugetierzellen-Display, oder mRNA-Display erhalten werden. Bei diesen Verfahren handelt es sich ausschließlich um konventionelle Techniken der Technik, deren spezifische Funktionsweise in entsprechenden Lehrbüchern oder Betriebsanleitungen nachzulesen ist (Mondon et al., 2008; deren Inhalt hiermit durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Am Beispiel des Phagen-Displays können separate Antikörpergene in die DNA von Phagen eingefügt werden, so dass die variablen Regionen auf den Antikörpermolekülen, die die Antigene binden können, an das Kapsidprotein des Phagen gekoppelt werden können. Nachdem der Phage E. coli infiziert hat, kann einzelsträngige DNA in E. coli repliziert werden, und der Phage kann wieder zusammengesetzt und in das Kulturmedium sezerniert werden, während die E. coli nicht lysiert werden dürfen. Der Phage kann mit Zielantigenen ko-inkubiert werden; und nachdem die gebundenen Phagen isoliert sind, kann dann eine Amplifikation und Reinigung durchgeführt werden, so dass große Mengen an Klonen gescreent werden können. Die Technik des Phagen-Displays ist in der Literatur zu finden (Liu et al., 2004; deren Inhalt hiermit durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
In einem anderen Aspekt kann die vorliegende Offenlegung Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers unter Verwendung eines Phagen-Display-Verfahrens umfassen. Konkret kann mRNA aus einem Tier, z. B. Kaninchen, Ratten, Mäusen, Meerschweinchen, Hamstern, Ziegen, Pferden, Hühnern, Schafen und Kameliden (z. B. Lamas), hergestellt werden, das anhand des Verfahrens zur Immunisierung eines Tieres immunisiert wurde, woraufhin cDNA unter Verwendung der mRNA als Vorlage hergestellt werden kann, so dass ein Einzelketten-Antikörper-Gen (scFv), das nur für eine variable Antikörperregion kodiert, hergestellt werden kann. Das Gen kann in einen Phagemidvektor kloniert werden. E. coli, in das der Phagemidvektor transduziert wird, wird mit dem Phagen infiziert, so dass der scFV-Antikörper auf dem Phagenkapsid exprimiert wird. Durch Screening des so exprimierten scFv gegen ein Antigenprotein oder gegen einen Peptid-MHC-Komplex kann ein monoklonaler scFV-Antikörper hergestellt werden, der spezifisch für das Antigenprotein oder den Peptid-MHC-Komplex ist. Dabei können die mRNA-Präparation, die cDNA-Präparation, die Subklonierung zum Phagemid oder die Transduktion zu E. coli, die Phageninfektion und das Screening eines monoklonalen scFV-Antikörpers, der spezifisch für ein Antigenprotein oder einen Peptid-MHC-Komplex ist, jeweils nach dem bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann die Subklonierung eines scFV-Gens in einen Phagemidvektor, der zwei Elemente enthält, die aus einem Genfragment, das eine Leadersequenz (Signalsequenz) und ein Phagenkapsidprotein III kodiert, und einem Replikationsursprung von M13 bestehen, und die Verwendung des M13-Phagen als Phagen einen scFV-Antikörper auf dem M13-Phagen exprimieren. Darüber hinaus kann ein durch Screening gewonnener Phage mit einem spezifischen Bakterium infiziert und kultiviert werden, so dass auch ein für ein Antigenprotein spezifischer monoklonaler Antikörper in großen Mengen aus der Kultur gewonnen werden kann. Nach dem Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers der vorliegenden Offenlegung kann nicht nur ein scFV-Antikörper, sondern auch ein Antikörperfragment ohne konstante Region, wie z. B. ein Fab-Antikörperfragment, hergestellt werden.
In einem anderen Aspekt kann die vorliegende Offenlegung Phagen-Display-Bibliotheken umfassen, in denen die variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines Antikörpers so synthetisiert werden können, dass sie fast alle möglichen Spezifitäten umfassen.
In einem anderen Aspekt kann die vorliegende Offenlegung die Erzeugung von Phagen-Display-Bibliotheken umfassen, die andere Phagen als M13 enthalten. Andere Bakteriophagen, wie z. B. der Lambda-Phage, können bei dem Verfahren der vorliegenden Offenlegung ebenfalls nützlich sein. Es wurden Lambda-Phage-Display-Bibliotheken generiert, die auf ihrer Oberfläche Peptide zeigen, die von heterologer DNA kodiert werden (Sternberg et al., 1995; deren Inhalt hiermit durch Verweise in vollem Umfang übernommen wird). Darüber hinaus kann das Verfahren der vorliegenden Offenlegung auf andere Viren als Bakteriophagen, wie z. B. eukaryotische Viren, ausgedehnt werden. Eukaryotische Viren können erzeugt werden, die für Gene kodieren, die für die Übertragung an einen Säuger geeignet sind, und die für einen Antikörper kodieren und diesen präsentieren, der auf einen bestimmten Zelltyp oder ein bestimmtes Gewebe abzielt, in das das Gen übertragen werden soll. So wurden z. B. retrovirale Vektoren generiert, die funktionelle Antikörperfragmente präsentieren (Russell et al., 1993; deren Inhalt hiermit durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Offenlegung Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers bereit, der spezifisch an die MHC-Klasse-I oder II im Komplex mit einem HLA-restringierten Antigen (vorzugsweise einem Peptid, das aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 besteht oder essentiell besteht) bindet, kann das Verfahren die Immunisierung eines genetisch veränderten nicht-menschlichen Säugetiers umfassen, das Zellen umfasst, die die MHC-Klasse-I oder II mit einer löslichen Form eines MHC-Klasse-I- oder Il-Moleküls exprimieren, das mit dem HLA-restringierten Antigen komplexiert ist; die Isolierung von mRNA-Molekülen aus Antikörper-produzierenden Zellen des nicht-menschlichen Säugetiers; Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek, die Proteinmoleküle präsentiert, die von den mRNA-Molekülen kodiert werden; und Isolierung mindestens eines Phagen aus der Phagen-Display-Bibliothek, wobei der mindestens eine Phage, der den Antikörper präsentiert, der spezifisch an den MHC-Klasse-I oder II im Komplex mit dem HLA-restringierten Antigen bindet.
Antikörper der Erfindung werden vorzugsweise einem Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele für den pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen isotonische Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Der pH-Wert der Lösung ist vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8 und weiter bevorzugt von etwa 7 bis etwa 7,5 Weitere Träger umfassen Retardpräparate, wie semipermeable Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizes in Form von Formkörpern, beispielsweise Folien, Liposomen oder Mikropartikel, sind. Es wird dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass bestimmte Träger bevorzugter sein können, beispielsweise abhängig von dem Verabreichungsweg und der Konzentration des Antikörpers, der verabreicht wird.
Die Antikörper können dem Individuum, Patienten oder Zellen durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) oder durch andere Verfahren, wie Infusion, die die Abgabe an den Blutstrom in einer wirksamen Form sicherstellen, verabreicht werden. Die Antikörper können auch auf intratumoralen oder peritumoralen Wege, zur Ausübung lokaler sowie systemischer therapeutischer Wirkungen verabreicht werden. Lokale oder intravenöse Injektion wird bevorzugt.
Wirksame Dosierungen und Zeitpläne für die Verabreichung der Antikörper können empirisch bestimmt werden und die Durchführung dieser Bestimmung liegt innerhalb des Fachwissens in der Technik. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass die Dosierung von Antikörpern, die verabreicht werden müssen, beispielsweise abhängig von dem Individuum, das den Antikörper erhalten wird, dem Weg der Verabreichung, der speziellen Art des verwendeten Antikörpers und anderer Medikamente, die verabreicht werden, variiert. Eine typische tägliche Dosis eines allein verwendeten Antikörpers könnte von etwa 1 µg/kg bis zu 100 mg/kg des Körpergewichts oder mehr pro Tag erreichen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren. Nach Verabreichung eines Antikörpers, vorzugsweise zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom, kann die Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers auf verschiedene Weise beurteilt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Zum Beispiel kann die Größe, Anzahl und/oder Verteilung von Krebs bei einem Patienten, der die Behandlung erhält, unter Verwendung von Standardtechniken zur Tumorvisualisierung überwacht werden. Ein therapeutisch verabreichter Antikörper, der das Tumorwachstum anhält, resultiert in einer Schrumpfung des Tumors, und/oder verhindert die Entwicklung von neuen Tumoren, verglichen mit dem Krankheitsverlauf, der in Abwesenheit der Antikörperverabreichung erfolgt wäre, ist ein wirksamer Antikörper zur Behandlung von Krebs.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen T-Zell-Rezeptors bereitzustellen, der einen spezifischen Peptid-MHC-Komplex erkennt. Solche löslichen T-Zell-Rezeptoren können aus spezifischen T-Zell-Klonen erzeugt werden, und ihre Affinität kann durch Mutagenese erhöht werden, die auf die komplementaritätsbestimmenden Regionen abzielt. Für die Auswahl der T-Zell-Rezeptoren kann der Phagen-Display verwendet werden ( US 2010/0113300 ) Liddy et al., 2012, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird)). Zur Stabilisierung von T-Zell-Rezeptoren während des Phagen-Displays und bei praktischer Anwendung als Medikament können die alpha- und beta-Ketten z. B. durch nicht-native Disulfidbindungen, andere kovalente Bindungen (einkettiger T-Zell-Rezeptor) oder durch Dimerisationsdomänen verknüpft werden Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird). Der T-Zell-Rezeptor kann mit Toxinen, Medikamenten, Zytokinen (siehe z. B. US 2013/0115191 , deren Inhalt hiermit durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) und Domänen, die Effektorzellen wie eine Anti-CD3-Domäne usw. rekrutieren, verknüpft werden, um bestimmte Funktionen gegen Zielzellen auszuführen. Darüber hinaus könnte es in T-Zellen exprimiert werden, die für den adoptiven Transfer verwendet werden. Weitere Informationen können in WO 2004/033685A1 und WO 2004/074322A1 gefunden werden. Eine Kombination von löslichen TCRs ist in WO 2012/056407A1 beschrieben. Weitere Verfahren für die Herstellung sind in der WO 2013/057586A1 offenbart, deren Inhalt hiermit durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird.
Darüber hinaus können die Peptide und/oder die TCRs oder Antikörper oder andere Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, um die Diagnose „Krebs“ eines Pathologen anhand einer Biopsieprobe zu überprüfen.
Die Antikörper oder TCRs können auch für Diagnosetests in vivo verwendet werden. Im Allgemeinen wird der Antikörper mit einem Radionuklid (wie ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ³H, ³²P oder ³⁵S) markiert, so dass der Tumor unter Verwendung von Immunszintigrafie lokalisiert werden kann. In einer Ausführungsform binden Antikörper oder Fragmente davon an die extrazellulären Domänen von zwei oder mehreren Targets eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den oben genannten Proteinen, und die Bindungsaffinität (K_d) beträgt <100 nM, mehr bevorzugt <50 nM, mehr bevorzugt <10 nM, mehr bevorzugt <1 nM, mehr bevorzugt <0,1 nM, mehr bevorzugt <0,01 nM.
Antikörper für diagnostische Zwecke können mit Sonden zur Detektion durch verschiedene bildgebende Verfahren markiert werden. Verfahren zum Nachweis von Sonden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluoreszenz, Licht, konfokale und Elektronenmikroskopie; Magnetresonanztomographie und Spektroskopie; Fluoroskopie, Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie. Geeignete Sonden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluorescein, Rhodamin, Eosin und andere Fluorophore, Radioisotope, Gold, Gadolinium und andere Lanthanide, paramagnetisches Eisen, Fluor-18 und andere Positronen-emittierende Radionuklide. Zusätzlich können Sonden bi- oder multi-funktional sein und können durch mehr als eins der aufgeführten Verfahren nachgewiesen werden. Diese Antikörper können direkt oder indirekt mit den Sonden markiert werden. Die Befestigung der Sonden an die Antikörper umfasst, unter anderem, die in der Technik gut anerkannt sind, die kovalente Bindung der Sonde, Einbau der Sonde in den Antikörper und die kovalente Bindung einer chelatbildenden Verbindung zur Bindung von Sonden. Für die Immunohistochemie kann die Probe des erkrankten Gewebes frisch oder gefroren sein oder sie kann in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel wie Formalin fixiert sein. Die feste oder eingebettete Sektion der Probe wird mit einem markierten primären Antikörper und sekundären Antikörper in Kontakt gebracht, wobei der Antikörper verwendet wird, um die Expression der Proteine in situ nachzuweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein in vitro Verfahren zur Herstellung von aktivierten T-Zellen, wobei das Verfahren umfasst in vitro in Kontakt bringen von T-Zellen mit Peptid-beladenen menschlichen MHC-Molekülen, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert werden, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die T-Zellen auf eine Antigen-spezifische Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid gemäß der Erfindung ist. Vorzugsweise wird eine ausreichende Menge des Antigens mit einer Antigen-präsentierenden Zelle benutzt.
Bevorzugterweise fehlt der Säugetierzelle oder sie besitzt ein reduziertes Niveau oder eine reduzierte Funktion des Peptid-Transporters TAP. Geeignete Zellen, in welchen TAP Peptid-Transporter fehlt, beinhalten T2, RMA-S und Drosophila-Zellen. TAP ist der mit der Antigenprozessierung assoziierte Transporter.
Die menschliche Peptid-Iadungsdefiziente Zelllinie T2 ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA mit der Katalognummer CRL 1992 erhältlich; die Drosophilazelllinie Schneider Line 2 ist von der ATCC mit der Katalognummer CRL 19863 erhältlich; die Maus RMA-S-Zelllinie ist in Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) beschrieben.
Bevorzugterweise exprimiert die Wirtszelle vor der Transfektion substantiell keine MHC-Klasse-I-Moleküle. Es ist auch bevorzugt, dass eine Stimulatorzelle ein Molekül, das für die Bereitstellung einer Ko-Stimulation für T-Zellen wichtig ist, wie eines der folgenden: B7.1, B7.2, ICAM-1 und LFA3, exprimiert. Die Nukleinsäuresequenz zahlreicher MHC-Klasse-I-Moleküle und der Kostimulatormoleküle sind öffentlich über die GenBank und EMBL-Datenbanken erhältlich.
Wenn ein MHC-Klasse-I-Epitop als ein Antigen verwendet wird, sind die T-Zellen - CD8-positive T-Zellen.
Wenn eine Antigen-präsentierende Zelle transfiziert wird, um ein solches Epitop zu exprimieren, bevorzugt umfasst die Zelle einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Peptid enthaltend SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 102 oder eine Variante einer Aminosäuresequenz davon zu exprimieren.
Mehrere andere Verfahren können zur Erzeugung von T-Zellen in vitro verwendet werden. So können beispielsweise autologe tumorinfiltrierende Lymphozyten zur Erzeugung von CTL eingesetzt werden. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) benutzen autologe periphere Blutlymphozyten (PLBs) für die Erzeugung von T-Zellen. Des Weiteren ist die Erzeugung von autologen T-Zellen durch Pulsen von dendritischen Zellen mit einem Peptid oder einem Polypeptid oder über eine Infektion mit einem rekombinanten Virus möglich. Außerdem können B-Zellen für die Produktion von autologen T-Zellen verwendet werden. Des Weiteren können mit einem Peptid oder Polypeptid gepulste oder mit einem rekombinanten Virus infizierte Makrophagen für die Erzeugung von autologen T-Zellen benutzt werden. S. Walter et al. (Walter et al., 2003, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird) beschreiben das in vitro-Priming von T-Zellen durch künstliche Antigen-präsentierende Zellen (aAPCs), was auch ein geeigneter Weg zur Erzeugung von T-Zellen gegen ein Peptid der Wahl ist. In der vorliegenden Erfindung wurden aAPCs durch Kopplung von vorgeformten MHC-Peptid Komplexen auf der Oberfläche von Polystyrenpartikeln (Microbeads) durch Biotin-Streptavidin-Biochemie generiert. Dieses System ermöglicht die genaue Steuerung der Dichte von MHC auf aAPCs, welche es möglich macht, selektive hoch- oder niedrig avide antigenspezifische T-Zellantworten mit hoher Effizienz aus Blutproben auszulösen. Abgesehen von den MHC-Peptid Komplexen sollten aAPCs andere Proteine mit kostimulierender Aktivität, wie anti-CD28 Antikörper, an ihre Oberfläche gekoppelt, tragen. Des Weiteren benötigen solche auf aAPC-basierende Systeme oft die Zugabe von geeigneten löslichen Faktoren, z. B. Zytokinen wie Interleukin-12.
Allogene Zellen können auch für die Erzeugung von T-Zellen verwendet werden und eine Methode ist in der Patentanmeldung WO 97/26328 ausführlich beschrieben, die hiermit in vollem Umfang durch Verweis übernommen wird. Zum Beispiel können, um Antigene zu präsentieren, zusätzlich zu Drosophila- und T2-Zellen, andere Zellen verwendet werden, wie zum Beispiel CHO-Zellen, mit Baculovirus infizierte Insektenzellen, Bakterien, Hefe und Vaccinia-infizierte Zielzellen. Weiterhin können auch Pflanzenviren benutzt werden, siehe zum Beispiel Porta et al. (Porta et al., 1994, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird), welche die Entwicklung des Cowpea Mosaic Virus als ein System für die Präsentation von fremden Peptiden mit hohen Ausbeuten beschreiben.
Die aktivierten T-Zellen, die gegen das erfindungsgemäße Peptid gerichtet sind, sind für die Therapie nützlich. Somit betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung aktivierte T-Zellen, die nach den vorher beschriebenen erfindungsgemäßen Methoden zu erhalten sind.
Aktivierte T-Zellen, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden, werden selektiv eine Zelle erkennen, die aberrant ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102 exprimiert.
Bevorzugt erkennt die T-Zelle die Zelle beim Interagieren durch ihren TCR mit dem HLA/Peptid-Komplex (zum Beispiel durch das Binden). Die T-Zellen sind in einem Verfahren zur Abtötung von Zielzellen bei einem Patienten nützlich, dessen Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, wobei dem Patienten eine effektive Menge aktivierter T-Zellen verabreicht wird. Die T-Zellen, die dem Patienten verabreicht werden, können von dem Patienten erhalten und, wie oben beschrieben, aktiviert werden (d. h. sie sind autologe T-Zellen). Alternativ werden die T-Zellen nicht von dem Patienten, sondern von einem anderen Individuum erhalten. Natürlich ist es bevorzugt, dass es sich hierbei um ein gesundes Individuum handelt. Mit „gesundem Individuum“ meinen die Erfinder, dass das Individuum im Allgemeinen bei guter Gesundheit ist, bevorzugt ein kompetentes Immunsystem besitzt und, weiter bevorzugt, unter keiner Krankheit leidet, auf die einfach getestet und die einfach entdeckt werden kann.
In vivo können die Zielzellen für die CD8-positiven T-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Zellen eines Tumors (die manchmal MHC-Klasse-II exprimieren) und/oder Stromazellen in der Umgebung des Tumors (die manchmal auch MHC-Klasse-II exprimieren (Dengjel et al., 2006)) sein.
Die T-Zellen der vorliegenden Erfindung können als aktive Wirkstoffe in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen bei einem Patienten zur Verfügung, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge von T-Zellen, wie oben definiert.
Mit „aberrant exprimiert“ meinen die Erfinder auch die Bedeutung, dass das Polypeptid im Vergleich zu Werten der Expression auf Normalgewebe überexprimiert ist oder dass das Gen in dem Gewebe, aus dem der Tumor erhalten wurde, still ist, aber im Tumor exprimiert wird. Mit „überexprimiert“ meinen die Erfinder dass das Polypeptid in einem Niveau vorkommt, das mindestens dem 1,2-fachen Niveau in normalem Gewebe entspricht; bevorzugt mindestens dem 2-fachen und mehr bevorzugt mindestens 5-fachem oder 10-fachem Niveau in normalem Gewebe entspricht.
Die T-Zellen können durch die aus der Literatur bekannten, z. B. die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Protokolle für den sogenannten adoptiven Transfer von T-Zellen sind im Fachgebiet sehr gut bekannt. Einige Rezensionen finden sich unter (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006, deren Inhalt durch Verweis in vollem Umfang übernommen wird).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Verwendung der mit MHCkomplexierten Peptide zur Erzeugung eines T-Zell-Rezeptors, dessen Nukleinsäure kloniert und in eine Wirtszelle, vorzugsweise eine T-Zelle, eingebracht wird. Diese modifizierte T-Zelle kann dann auf einen Patienten zur Therapie von Krebs übertragen werden.
Jedes Molekül der Erfindung, d. h. das Peptid, die Nukleinsäure, der Antikörper, der Expressionsvektor, Zelle, aktivierte T-Zelle, T-Zellrezeptor oder die Nukleinsäure, die es kodiert, ist für die Behandlung von Erkrankungen, charakterisiert durch Zellen, die der Immunantwort entkommen, geeignet. Deshalb kann jedes Molekül der vorliegenden Erfindung als Medikament oder zur Herstellung eines Medikamentes verwendet werden. Das Molekül kann einzeln oder in Kombination mit (einem) anderen Molekül der Erfindung oder (einem) bekannten Molekül(en) verwendet werden.
Kits der vorliegenden Erfindung umfassen bevorzugt eine lyophilisierte Formulierung der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Gefäß und Anweisungen für deren Rekonstitution und/oder Verwendung. Geeignete Gefäße schließen, beispielsweise, Flaschen, Vials (zum Beispiel Zweikammerphiolen), Spritzen (solche wie Zweikammerspritzen) und Reagenzgläser ein. Das Gefäß kann aus einer Vielzahl von Materialien wie Glas oder Plastik hergestellt werden. Bevorzugt enthält/enthalten der Kit und/oder das Gefäß Anweisungen über den oder die mit dem Gefäß assoziiert sind, die die Anleitungen für die Rekonstitution und/oder Verwendung beinhalten. Die Etikette kann beispielsweise aufzeigen, dass die lyophilisierten Formulierungen zu Peptidkonzentrationen wie oben beschrieben rekonstituiert werden. Die Etikette kann weiterhin anzeigen, dass die Formulierung für eine subkutane Verabreichung nützlich oder vorgesehen ist.
Das Gefäß, welches die Formulierung enthält, kann eine Mehrweg-Phiole sein, welche wiederholte Verabreichungen (z. B. 2 bis 6 Verabreichungen) der rekonstituierten Formulierung ermöglicht. Der Kit kann weiterhin ein zweites Gefäß, welches ein geeignetes Verdünnungsmittel (z. B. Natriumbicarbonatlösung) umfasst, umfassen.
Die endgültige Peptidkonzentration der rekonstituierten Formulierung nach der Mischung des Verdünnungsmittels und der lyophilisierten Formulierung beträgt vorzugsweise mindestens 0,15 mg/ml/Peptid (=75 µg) und bevorzugt nicht mehr als 3 mg/ml/Peptid (=1500 µg). Der Kit kann weiterhin andere Materialien, die ausgehend von einem kommerziellen oder Benutzerstandpunkt erstrebenswert sind, einschließend andere Puffer, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anweisungen für die Verwendung enthalten.
Kits der vorliegenden Erfindung können ein einzelnes Gefäß aufweisen, welches die Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung mit oder ohne andere Komponenten (z. B. andere Verbindungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen dieser anderen Verbindungen) enthält, oder können verschiedene Gefäße für jeden Komponenten haben.
Bevorzugt enthalten die Kits der Erfindung eine Formulierung der Erfindung, die für die Benutzung in Kombination mit der Co-Verabreichung einer zweiten Verbindung (wie beispielsweise Adjuvantien (z.B. GM-CSF, ein chemotherapeutisches Mittel, ein Naturprodukt, ein Hormon oder einen Antagonisten, ein anti-Angiogenmittel oder ein Inhibitor, ein Apoptose-induzierendes Mittel oder ein Chelator) gepackt ist, oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon. Die Komponenten des Kits können prekomplexiert sein oder jede Komponente kann vor der Gabe an einen Patienten in einem separaten getrennten Gefäß sein. Die Komponenten des Kits können in einer oder mehreren flüssigen Lösungen, bevorzugt einer wässrigen Lösung, bevorzugter in einer sterilen wässrigen Lösung zur Verfügung gestellt werden. Die Komponenten des Kits können auch als Feststoffe, die durch die Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln, welche bevorzugt in einem anderen getrennten Gefäß zur Verfügung gestellt werden, in Flüssigkeiten überführt werden, zur Verfügung gestellt werden.
Das Gefäß eines therapeutischen Kits kann eine Phiole, ein Reagenzglas, ein Kolben, eine Flasche, eine Spritze oder ein anderes Mittel zum Aufbewahren einer Flüssigkeit oder eines Feststoffes sein. Wenn es mehr als eine Komponente gibt, enthält der Kit normalerweise eine zweite Phiole oder ein anderes Gefäß, was eine separate Dosierung erlaubt. Der Kit kann außerdem ein weiteres Gefäß für eine pharmazeutisch akzeptable Flüssigkeit enthalten. Bevorzugt enthält ein therapeutischer Kit ein Gerät (z.B., eine oder mehrere Nadeln, Spritzen, Augentropfer, Pipetten, etc.), welches die Verabreichung der Stoffe der Erfindung, welche Teile des vorliegenden Kits sind, ermöglicht.
Die vorliegende Formulierung ist für die Verabreichung der Peptide auf jedem akzeptablen Weg, wie oral (enteral), nasal, ophthal, subkutan, intradermal, intramuskulär, intravenös oder transdermal, geeignet. Bevorzugt erfolgt die Verabreichung s.c. und am meisten bevorzugt ist i.d. Verabreichung mit einer Infusionspumpe.
Da die Peptide der Erfindung aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom isoliert wurden, wird das erfindungsgemäße Medikament vorzugsweise zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelliger Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom eingesetzt.
In einer exemplarischen Ausführungsform werden die im Impfstoff enthaltenen Peptide identifiziert durch: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; und (b) Auswählen mindestens eines de novo in (a) identifizierten Peptids und Bestätigen seiner Immunogenität.
Sobald die Peptide für einen personalisierten peptidbasierten Impfstoff ausgewählt sind, wird der Impfstoff hergestellt. Der Impfstoff ist vorzugsweise eine flüssige Formulierung, die aus den einzelnen Peptiden besteht, die in zwischen 20-40% DMSO, vorzugsweise in etwa 30-35% DMSO, wie etwa 33% DMSO, gelöst sind.
Jedes Peptid, das in ein Produkt aufgenommen werden soll, wird in DMSO gelöst. Die Konzentration der einzelnen Peptidlösungen ist in Abhängigkeit von der Anzahl der Peptide, die in das Produkt aufgenommen werden sollen, zu wählen. Die einzelnen Peptid-DMSO-Lösungen werden zu gleichen Teilen gemischt, um eine Lösung zu erhalten, die alle in das Produkt aufzunehmenden Peptide mit einer Konzentration von -2,5 mg/ml/Peptid enthält. Die gemischte Lösung wird dann 1:3 mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt, um eine Konzentration von 0,826 mg/ml/Peptid in 33% DMSO zu erreichen. Die verdünnte Lösung wird durch einen 0,22 µm Sterilfilter gefiltert. Die endgültige Bulklösung wird erhalten.
Die endgültige Bulklösung wird in Vials abgefüllt und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Ein Vial enthält 700 µL Lösung, die 0,578 mg jedes Peptids enthält. Davon werden 500 µL (ca. 400 µg pro Peptid) für die intradermale Injektion eingesetzt.
Zusätzlich dazu, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Krebs nützlich sind, sind sie auch als Diagnostika nützlich. Da die Peptide aus Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkrebs, Harnblasenkrebs und Endometriumkarzinom gewonnen wurden und da festgestellt wurde, dass diese Peptide nicht oder auf einem niedrigeren Niveau im normalen Gewebe vorhanden sind, können diese Peptide zur Diagnose des Vorhandenseins eines Krebserkrankung verwendet werden.
Das Vorhandensein der beanspruchten Peptide in Gewebebiopsien oder in Blutproben kann einem Pathologen bei der Diagnose von Krebs hilfreich sein. Der Nachweis bestimmter Peptide mittels Antikörpern, Massenspektrometrie oder anderen in der Technik bekannten Methoden kann dem Pathologen bestätigen, dass die Gewebeprobe bösartig oder entzündet oder allgemein krankhaft ist, oder als Biomarker für akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelliger Lungenkrebs, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligen Lungenkrebs, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom verwendet werden kann.
Das Vorkommen von Gruppen der Peptide kann die Klassifizierung oder Subklassifizierung der erkrankten Gewebe ermöglichen.
Der Nachweis von Peptiden auf einer erkrankten Gewebeprobe kann die Entscheidung über den Nutzen von Therapien, die das Immunsystem betreffen, vor allem wenn bekannt ist oder erwartet wird, dass T-Lymphozyten an dem Wirkmechanismus beteiligt sind oder sein können, ermöglichen. Der Verlust der MHC-Expression ist ein gut beschriebener Mechanismus, mit dem infizierte oder maligne Zellen der Immunüberwachung entkommen können. Somit zeigt das Vorhandensein der Peptide, dass dieser Mechanismus von den analysierten Zellen nicht ausgenutzt wird.
Die erfindungsgemäßen Peptide können dazu verwendet werden, um Lymphozytenantworten gegen diese Peptide, wie T-Zellantworten oder Antikörperantworten gegen das Peptid oder den Peptid-Komplex mit dem MHC-Molekül, zu analysieren. Diese Lymphozytenantworten können als prognostischer Marker für die Entscheidung über die weitere Therapieschritte verwendet werden. Diese Antworten können auch als Ersatzantwortmarker in immunotherapeutischen Ansätzen verwendet werden, die darauf abzielen, Lymphozytenantworten durch unterschiedliche Methoden, z. B. Impfung des Proteins, der Nukleinsäuren, autologen Materialien, den adoptiven Transfer von Lymphozyten, zu induzieren. In gentherapeutischen Rahmen, können Lymphozytenantworten gegen Peptide bei der Beurteilung der Nebenwirkungen berücksichtigt werden. Die Überwachung der Lymphozytenreaktionen könnte auch ein wertvolles Werkzeug für die Nachsorgeuntersuchungen von Transplantationstherapien, z. B. für den Nachweis von Transplantat-gegen-Wirt und Wirt-gegen-Transplantat (graft versus host und host versus graft) Krankheiten sein.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen beschrieben, die bevorzugte Ausführungsformen darstellen, und unter Bezugnahme auf die begleitenden Abbildungen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen.
Ferner ist zu beachten, dass experimentelle Daten und Zahlen hier nur für einen ausgewählten Satz von Peptiden wie beansprucht, offenbart werden können. Obwohl für alle Peptide, die hier offenbart und beansprucht werden, vollständige Datensätze erstellt wurden und auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden können, hat sich der Antragsteller entschieden, nicht alle diese vollständigen Datensätze hierin aufzunehmen, da dies einen überschaubaren Rahmen dieses Antragstextes sprengen würde.
Figurenliste

zeigt den Antigenprozessierungsweg deamidierter Peptide und ihre Präsentation durch die HLA-Klasse-I. Während der Translation werden Proteine mit dem Glykosylierungsmotiv N[X^P][ST] an ihren N-Resten in dem ER (1) glykosyliert. Nach deren Export entfernt die zytosolische Amidase PNGase die N-gebundenen Oligosaccharide, was zu einer Deamidierung zu einem Aspartat führt (D) (2). Nach weiterem Abbau im Proteasom (3) und Rücktransport der Peptide in das ER (4) binden sie an HLA I-Komplexe (5). Die Peptid-HLA I-Komplexe folgen dann dem klassischen Antigen-Präsentationsweg, translozieren zur Zellmembran und präsentieren die deamidierten Peptide auf der Zelloberfläche (6).
zeigt die Deamidierungsreaktionen von Asparagin (N) zu Asparaginsäure (D) ( ).
Die 3A bis 3D zeigen die Überpräsentation verschiedener Peptide in verschiedenen Krebsgeweben im Vergleich zu Normalgeweben. Oberer Teil: Mediane MS-Signalintensitäten aus technischen Replikationsmessungen werden als Punkte für einzelne HLA-A*02-positive Normalwerte (graue Punkte, linker Teil der Abbildung) und Tumorproben (schwarze Punkte, rechter Teil der Abbildung), auf denen das Peptid nachgewiesen wurde, dargestellt. Die Kästen zeigen den Median, den 25. und 75. Perzentilanteil der normierten Signalintensitäten an, während sich die Whisker auf den niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartils liegt, und den höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. Unterer Teil: Die relative Peptiddetektionsfrequenz in jedem Organ wird als Spine-Plot dargestellt. Die Zahlen unter dem Panel geben die Anzahl der Proben an, in denen das Peptid aus der Gesamtzahl der für jedes Organ analysierten Proben ermittelt wurde (N > 750 für normale Proben, N > 675 für Tumorproben). Wenn das Peptid in einer Probe nachgewiesen wurde, aber aus technischen Gründen nicht quantifiziert werden konnte, wird die Probe in diese Darstellung in der Nachweisfrequenz einbezogen, aber im oberen Teil der Abbildung ist kein Punkt dargestellt. Gewebe (von links nach rechts) Normale Proben: Fettgew. (Fettgewebe); Nebenniere; Gallengang; Blase; Blutzellen; Blutgefäße; Knochenmark; Gehirn; Brust; Speiseröhre; Auge; Gallenbl. (Gallenblase); Kopf/Hals; Herz; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Leber; Lunge; Lymphkn. (Lymphknoten); zentr. Nerv. (Zentralnervensystem); periph. Nerv (peripherer Nerv); Eierstock; Bauchsp. (Bauchspeicheldrüse); Nebensch. (Nebenschilddrüse); Perit. (Peritoneum); Hypophyse; Plazenta; Pleura; Prostata; skel. Musk. (Skelettmuskel); Haut; Rückenmark; Milz; Magen; Hoden; Thymus; Schilddrüse; Luftröhre; Harnleiter; Gebärmutter. Tumorproben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom). Peptid: ILDSTTIEI (SEQ ID NO: 1), Peptid: RLLEGDFSL (SEQ ID NO: 2), ) Peptid: YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 3), ) Peptid: YVWDRTELL (SEQ ID NO: 4).
Die bis zeigen ein exemplarisches Expressionsprofil von Quellgenen der vorliegenden Erfindung, die in verschiedenen Krebsproben überexprimiert sind. Tumor (schwarze Punkte) und normale (graue Punkte) Proben werden entsprechend dem Ursprungsorgan gruppiert. Box-and-whisker-Diagramme stellen den Median-FPKM-Wert, das 25. und 75. Perzentil (Box) plus Whisker dar, die sich bis zum niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartils liegt, und dem höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. FPKM: Fragmente pro Kilobase pro Million gemappter Reads. Gewebe (von links nach rechts) Normale Proben: Fettgew. (Fettgewebe); Nebenniere; Gallengang; Blase; Blutzellen; Blutgefäße; Knochenmark; Gehirn; Brust; Speiseröhre; Auge; Gallenbl. (Gallenblase); Kopf/Hals; Herz; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Leber; Lunge; Lymphkn. (Lymphknoten); periph. Nerv (peripherer Nerv); Eierstock; Bauchsp. (Bauchspeicheldrüse); Nebensch. (Nebenschilddrüse); Perit. (Peritoneum); Hypophyse; Plazenta; Pleura; Prostata; skel. Muskel (Skelettmuskel); Haut; Rückenmark; Milz; Magen; Hoden; Thymus; Schilddrüse; Luftröhre; Harnleiter; Gebärmutter. Tumorproben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom). Ensembl ID: ENST00000263321p369, Peptid: YMNGTMSQV(SEQ ID NO: 105) Ensembl ID: ENST00000244763p188, Peptid: SQTNLSPAL (SEQ ID NO: 161), Ensembl ID: ENST00000254508p924, Peptid: FISNFTMTI (SEQ ID NO: 163), Ensembl ID: ENST00000314191p3305, Peptid: KMLNETVLV (SEQ ID NO: 186).
zeigt die Ergebnisse der IdentControl-Experimente für ein beispielhaftes Peptid AIYHDITGISV (SEQ ID NO: 48). Das Peptid wurde durch IdentControl bestätigt, indem die Fragmentierungen stabiler isotopenmarkierter (SIL) Standards im Data-Dependent Acquisition (DDA)-Modus verglichen wurden. Die Identität wurde anhand eines intern festgelegten spektralen Korrelationsschwellenwertes bestätigt.
zeigt ein beispielhaftes Ergebnis für ein CoElution-Experiment für das Peptid YMDGTMSQV (SEQ ID NO: 3). Das Peptid wurde durch CoElution unter Verwendung eines internen Standards mit stabiler Isotopenmarkierung (SIL) und gezielter MS (sPRM oder IS-PRM) bestätigt. Es werden nicht überlappende MS2-Isolationsfenster für das SIL-Peptid und das natürliche Peptid verwendet. Kontrollexperimente mit einer Nicht-HLA-Peptidom-Probe (z. B. tryptischer Verdau oder 5% FA) als Matrix werden durchgeführt, um die Isotopenreinheit des internen SIL-Standards zu bestätigen. Die Peptididentität wird auf der Grundlage objektiver, vordefinierter Kriterien in einer manuellen Überprüfung durch Experten bestätigt.

BEISPIELE
BEISPIEL 1
Identifizierung und Quantifizierung von tumorassoziierten Peptiden, die auf der Zelloberfläche präsentiert werden
Gewebeproben
Das Gewebe der Patienten wurde erhalten von:

BiolVT (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); BioServe (Beltsville, MD, USA); Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, USA); Conversant Bio (Huntsville, AL, USA); Cureline Inc. (Brisbane, CA, USA); DxBiosamples (San Diego, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Indivumed GmbH (Hamburg, Deutschland); Kyoto Prefectural University of Medicine (KPUM) (Kyoto, Japan); Osaka City University (OCU) (Osaka, Japan); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, UK); Universität Bonn (Bonn, Deutschland); Asklepios Klinik St. Georg (Hamburg, Deutschland); Universitätsklinik Val d'Hebron (Barcelona, Spanien); Zentrum für Krebs-Immuntherapie (CCIT), Herlev-Krankenhaus (Herlev, Dänemark); Medizinisches Zentrum der Universität Leiden (LUMC) (Leiden, Niederlande); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“, Abteilung Molekularbiologie und virale Onkologie (Neapel, Italien); Stanford Cancer Center (Palo Alto, CA, USA); Universitätsklinikum Genf (Genf, Schweiz); Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland); Universitätsklinikum München (München, Deutschland); Universitätsklinikum Tübingen (Tübingen, Deutschland).

Schriftliche informierte Einwilligungen wurden von allen Patienten vor der Operation oder der Autopsie erhalten. Die Gewebe wurden direkt nach der Entnahme schockgefroren und bis zur Isolierung der TUMAPs bei -70°C gelagert.
Isolierung von HLA Peptiden aus Gewebeproben
HLA-Peptid-Pools von schockgefrorenen Gewebeproben wurden durch Immunfällung von festen Geweben nach einem leicht modifizierten Protokoll ( (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)) unter Benutzung eines HLA-A*02-spezifischen Antikörpers BB7.2, eines HLA-A, -B, -C-spezifischen Antikörpers W6/32, eines HLA-2-spezifischen Antikörpers L243 und eines HLA-DP-spezifischen Antikörpers B7/21, DRCNBr-aktivierter Sepharose, Säurebehandlung und Ultrafiltration, erhalten.
Alle Peptide nach der vorliegenden Erfindung binden an HLA-A*02. Aufgrund der Ähnlichkeit in den Bindungsmustern, z. B. in den Ankerpositionen, können die Peptide jedoch auch an andere HLA-Allele binden, die unter anderem HLA-B*08, HLA-B*13 und HLA-B*15 umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Darüber hinaus bezieht sich der Begriff HLA-A*02 auf alle Untertypen von HLA-A*02, die HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11 umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind.
Massenspektroskopieanalysen
Die erhaltenen HLA-Peptidpools wurden gemäß ihrer Hydrophobizität durch Umkehrphasen-Chromatographie (nanoAcquity UPLC System, Waters) getrennt und die eluierten Peptide in einem LTQ-Velos und Fusions-Hybridmassenspektrometern (Thermoelectron), das mit einer ESI-Quelle ausgestattet ist, analysiert. Die Peptidpools wurden direkt auf die analytische Quarzglasmikrokapillarsäule (75 µm i.d. x 250 mm) gepackt mit 1,7 µm C18 Umkehrphasenmaterial (Waters) und einer Flussrate von 400 nl pro Minute, geladen. Anschließend wurden die Peptide unter Benutzung eines zweistufigen 180 Minuten-binären Gradienten von 10% bis 33% B bei einer Flußrate von 300 nL pro Minute getrennt. Der Gradient war aus Lösemittel A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) und Lösemittel B (0,1 % Ameisensäure in Acetonitril) zusammengesetzt. Eine mit Gold beschichtete Glaskapillare (PicoTip, New Objective) wurde für die Einführung in die Nano-ESI-Quelle verwendet. Die LTQ-Orbitrap Massenspektrometer wurden in dem datenabhängigen Modus unter Verwendung einer TOP5-Strategie betrieben. Zusammenfassend wurde ein Zyklus mit einem vollständigen Scan von hoher Massengenauigkeit in der Orbitrap (R = 30000) initiiert, dem ein MS / MS Scan auch in der Orbitrap (R = 7500) auf den 5 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen mit dynamischen Ausschluss zuvor ausgewählter Ionen folgte. Tandem-Massenspektren wurden von SEQUEST mit einer festen Falscherkennungsrate (q≤0.05) und zusätzlicher manuellen Kontrolle interpretiert. In Fällen, in denen die identifizierte Peptidsequenz unsicher war, wurde sie zusätzlich durch Vergleich des erzeugten natürlichen Peptidfragmentierungsmusters mit dem Fragmentierungsmuster eines synthetischen Sequenz-identischen Referenzpeptids validiert.

Die markierungsfreie relative LC-MS-Quantifizierung erfolgte durch lonenzählung, d.h. durch Extraktion und Analyse der LC-MS-Merkmale (Mueller et al., 2007). Das Verfahren geht davon aus, dass der LC-MS-Signalbereich des Peptids mit seiner Häufigkeit in der Probe korreliert. Extrahierte Merkmale wurden durch Ladezustandsentfaltung und Retentionszeitausrichtung weiterverarbeitet (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Schließlich wurden alle LC-MS-Funktionen mit den Ergebnissen der Sequenzidentifikation verglichen, um quantitative Daten verschiedener Proben und Gewebe zu Peptid-Präsentationsprofilen zu kombinieren. Die quantitativen Daten wurden entsprechend der zentralen Tendenz zweistufig normiert, um Abweichungen innerhalb technischer und biologischer Replikate zu berücksichtigen. So kann jedes identifizierte Peptid mit quantitativen Daten assoziiert werden, die eine relative Quantifizierung zwischen Proben und Gewebe erlauben. Darüber hinaus wurden alle quantitativen Daten, die für Peptidkandidaten erfasst wurden, manuell überprüft, um die Datenkonsistenz zu gewährleisten und die Genauigkeit der automatisierten Analyse zu überprüfen. Für jedes Peptid wurde ein Präsentationsprofil berechnet, das die mittlere Probenpräsentation sowie die Replikatvariationen zeigt. Die Profile stellen Proben von AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Gebärmutter- und Endometriumkarzinom) einer Basislinie von Normalgewebeproben gegenüber. Präsentationsprofile von exemplarisch überpräsentierten Peptiden sind in - dargestellt. Die Plots zeigen nur die Identifizierungen von Peptiden als Punkte, die an HLA-A*02-positiven Gewebeproben vorgenommen wurden, die mit HLA-A*02-spezifischen Antikörpern bearbeitet wurden.
Die Peptidpräsentation für die verschiedenen Indikationen für alle Peptide (SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102) ist in Tabelle 8 dargestellt. Diese Tabelle listet alle Indikationen auf, bei denen das jeweilige Peptid mindestens einmal identifiziert wurde, unabhängig von der HLA-Typisierung der Probe oder des Antikörpers, der zur Bearbeitung der Probe verwendet wurde. Tabelle 8: Präsentation über verschiedene Krebsentitäten für Peptide gemäß der Erfindung und damit die besondere Bedeutung der genannten Peptide für die Diagnose und/oder Behandlung der angegebenen Krebsarten. Krebsarten: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom).

SEQ ID NO:	SEQUENZ	PEPTIDPRÄSENTATION AUF KREBSARTEN
1	ILDSTTIEI	NHL, OC, AML, UBC, OSCAR, NSCLCsquam, NSCLCother, NSCLCadeno, MEL, HNSCC, SCLC, HCC, GC, GBC, CRC, BRCA, UEC, RCC, PACA, GEJC, CLL
2	RLLEGDFSL	UEC, OSCAR, OC, NSCLCsquam, NSCLCother, HNSCC, HCC, GBC, CRC, NSCLCadeno, BRCA
3	YMDGTMSQV	MEL, NHL
4	YVWDRTELL	UEC
5	ALPQFFNDV	GC, RCC, GBC, HCC, PACA, UBC, PRCA, OSCAR, NSCLCadeno, BRCA, OC, NSCLCother, MEL, GEJC, AML
6	NLYNDLTNV	HNSCC, CRC, NSCLCsquam, NSCLCadeno, BRCA, SCLC, PACA, OSCAR, OC, NHL, HCC, CCC, UEC, MEL, GEJC, GC, GBC
7	ALADLTGTV	HCC, MEL, AML, UEC, SCLC, RCC, UBC, OSCAR, OC, NSCLCsquam, NSCLCother, NSCLCadeno, GBM, GBC, CRC, CLL, CCC, BRCA
8	KLAPDLTEL	NSCLCadeno, GBM, PRCA, RCC, PACA, CRC, BRCA, UEC, SCLC, OSCAR, NSCLCsquam, NSCLCother, HCC, CCC
9	SLDDSLNEL	PACA, MEL, GBC, OSCAR, OC, CRC, BRCA, UEC, UBC, PRCA, NSCLCadeno, NHL, HCC, AML
10	FLGEDISNFL	UBC, UEC, RCC, NSCLCadeno, GC, SCLC, PACA, OC, NSCLCsquam, NSCLCother, MEL, HCC, CCC
11	GLVDGSSVTV	RCC, NHL, OC, NSCLCsquam, HCC, NSCLCother, CRC, CCC, BRCA
12	FVDEHTIDI	GBC, PACA, OC, MEL, UBC, RCC, PRCA, NHL, BRCA
13	VLMDGTLKQV	HCC, CCC, SCLC
14	YIYDGKDMSSL	OSCAR, HCC, NHL, MEL, CRC, UBC, PRCA, OC, NSCLCsquam, GEJC, GBM
15	VLDDTLVIF	GBC, GC, UBC, RCC, PACA, OC, NHL, MEL, HCC, BRCA
16	KLISDMGKDVSA	HNSCC, OSCAR, NSCLCsquam, NSCLCother
17	NVDSTILNL	PACA, GBC, UBC, OSCAR, OC, NSCLCadeno, GC, BRCA
18	ILDEAKDISF	GBC, PACA, UBC, PRCA, OC, MEL
19	RLLDTTDVYLL	OC, SCLC, NSCLCsquam, NSCLCadeno, UEC, OSCAR
20	SLFAYPLPDV	SCLC, NSCLCsquam, NHL, MEL, OC, NSCLCother, GBM, CRC, AML
21	FLNLFDHTL	MEL, NSCLCsquam, CRC, CLL, BRCA, NSCLCadeno, HNSCC
22	HMIDLTIHL	UBC, NSCLCadeno, NSCLCother, MEL, BRCA
23	FLGPIVDL	NHL, CLL, AML, OC, NSCLCadeno
24	QLLGRDISL	CLL, BRCA, OC, NSCLCother, NHL, MEL, GC, GBM, AML
25	FMNDRSFIL	SCLC, CRC, BRCA, PACA, NSCLCsquam, GC, GBC
26	ILYDGSNIQL	RCC, PRCA, OSCAR, HNSCC
27	YLFEDISQL	HNSCC, OC, NSCLCadeno
28	FLLDGTDMFHM	HNSCC, UBC, OC
29	KLLDLTVRI	CRC, PACA, NSCLCsquam, GC, GBC
30	QLMEKVQDV	GBM, UEC, HNSCC, GBC
31	TLIDATWLV	NSCLCadeno, HNSCC, NSCLCother
32	ALADLTGTWNL	UEC, RCC, PRCA, OC, NSCLCadeno, HCC, CRC
33	ILFDLTHRV	RCC, NSCLCadeno, OSCAR, HNSCC, GC
34	SLLDGSESAKL	OC, MEL, HNSCC, BRCA
35	SLRDGTEVV	HNSCC, OSCAR, NSCLCsquam, NSCLCother, NHL
36	SLYDFTGEQMAA	OC, NSCLCother, NSCLCadeno, NHL, CCC
37	AIDDTAARL	PACA, OC, HCC, GC, GBC, AML
38	AVDGTDARL	RCC, GC, OC
39	AVFDQTVTVI	PRCA, OSCAR, MEL, HCC, GBM
40	FLDQTDETL	BRCA, UEC
41	FLDTSTADV	NHL, AML, CLL
42	IQDTSHLAV	RCC, OC, NSCLCsquam, NHL, GC, CRC
43	KLLNDLTSI	MEL, HCC, NSCLCsquam, NHL
44	LLDATHQI	HCC, RCC, NSCLCsquam, MEL, CRC
45	SLFDDSFSL	UBC, NSCLCsquam, HNSCC, CRC, CCC, BRCA
46	SLSDVSQAV	AML, NSCLCadeno, NHL, MEL, BRCA
47	VIDSTLVKV	NSCLCsquam, MEL, GBM
48	AIYHDITGISV	NSCLCadeno, OC, NSCLCsquam
49	ALDDYTITF	GC, UBC, HCC, AML
50	ALYDSTRELL	NSCLCadeno, BRCA, NSCLCsquam
51	HLCNHDVSL	BRCA, NSCLCadeno, CRC
52	ILFDDSVFTL	NHL, HNSCC, HCC, CLL, AML
53	ILTDITGHDV	OC, NSCLCother, NSCLCadeno, NHL, GBM
54	KLEERVYDV	UBC, NSCLCsquam, MEL, BRCA
55	KTWDQSIAL	HCC, OSCAR, CCC
56	LLDSTAHLL	PACA, OC, MEL, GC, GBM
57	SLDISLPNL	UEC, PRCA, CLL, BRCA
58	SQDASLLKV	RCC, OSCAR, NHL, GC, CLL
59	SQTDLSPAL	HCC, NSCLCsquam, CCC
60	TLDITIVNL	BRCA, RCC, OC, GBC
61	FISDFTMTI	MEL, SCLC
62	FLKDVTAQI	NHL, NSCLCsquam, MEL
63	GLDRTQLVNV	RCC, UBC, NSCLCadeno
64	ILFDPDNSSAL	RCC, HCC, GC, CCC
65	ILLDKSTVL	UBC, HNSCC, CRC
66	LLDDQTVTF	PACA, OC, GC
67	LLDTTDVYL	UEC, SCLC, OC, MEL
68	RLQDTTIGL	CRC
69	SLLDENDVSSYL	NHL, CLL
70	SMASFLKDV	HNSCC, NSCLCsquam
71	YLGAVFDL	UBC, SCLC, OC, NHL, CRC
72	ALDSTNSEL	CLL, NHL
73	ALMDVSQNV	NSCLCsquam, HNSCC
74	KILDFTGPLFL	CLL, NSCLCsquam
75	KLHDTSFCL	CRC, HCC
76	SLLRDFTLV	RCC, NHL, GC
77	YLHGFDLSL	HNSCC
78	AIDQTITEA	UEC, MEL
79	ALAGLVYDA	UEC, NHL
80	ALDSSLQLL	NHL, AML
81	AVDKTQTSV	SCLC, CRC
82	FLNPDGSDCTL	NHL, OC, AML, UBC, OSCAR, NSCLCsquam, NSCLCother, NSCLCadeno, MEL, HNSCC, SCLC, HCC, GC, GBC, CRC, BRCA, UEC, RCC, PACA, GEJC, CLL
83	FLNVDVSEV	NSCLCadeno, MEL
84	KMLDETVLV	MEL
85	LLDITNPVL	UEC, CLL
86	NLADNTILV	UBC, HCC
87	NMYDLTFHV	NHL
88	RLLDETVDVTI	NSCLCsquam, NSCLCadeno
89	SLFIDVTRV	HCC, GC
90	VLDGTEVNL	MEL
91	VLKDGTLVI	MEL, GEJC
92	YLADFSHAT	NHL, AML
93	YLDGTFRLL	OC, BRCA
94	YLWWVNDQSL	CRC
95	KLAPEDLADLTAL	AML, BC, CLL, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCsquam, NSCLCadeno, NSCLCother, SCLC
96	KLDASLPAL	NSCLCadeno, CRC, OC, NSCLCsquam, NSCLCother, HNSCC, HCC, NHL, MEL, BRCA, OSCAR, AML, UEC, UBC, RCC, GBC, PACA, GEJC, GBM, SCLC, PRCA, GC, CCC
97	KLLDGSQRV	HNSCC, PACA, OC, NSCLCsquam, HCC, BRCA, UEC, SCLC, OSCAR, NSCLCother, MEL
98	NLLADVSTV	OC, NSCLCadeno
99	NLLDHSSMFL	OC, NSCLCsquam, HCC, BRCA, RCC, NSCLCadeno, CRC, CLL, AML, OSCAR, UEC, PACA, NSCLCother, NHL, MEL, GC, CCC
100	SLLFQDITL	AML, OC
101	TLDATVVEL	UBC, HNSCC, BRCA, OC, OSCAR, UEC, PACA, GC, GBC
102	WLIDKSMEL	NSCLCadeno, OC, NSCLCsquam, NSCLCother, CRC, MEL, UEC, SCLC, OSCAR, NHL, HNSCC, HCC, GC, BRCA, RCC, CCC, GBC

BEISPIEL 2
Expressionsprofile von Genen, die die Peptide der Erfindung kodieren
Eine Überpräsentation oder spezifische Präsentation eines Peptids auf Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen ist ausreichend für seinen Nutzen in der Immuntherapie, und einige Peptide sind tumorspezifisch, obwohl ihr Ausgangsprotein auch im normalen Gewebe vorkommt. Dennoch bietet das mRNA-Expressionsprofiling ein zusätzliches Maß an Sicherheit bei der Auswahl von Peptid-Targets für Immuntherapien. Insbesondere für Therapieoptionen mit hohen Sicherheitsrisiken, wie z. B. affinitätsgereifte TCRs, wird das ideale Zielpeptid aus einem Protein gewonnen, das einzigartig für den Tumor ist und nicht im normalen Gewebe vorkommt.
RNA-Quellen und Herstellung
Operativ entfernte Gewebeproben wurden wie oben verdeutlicht zur Verfügung gestellt, (siehe Beispiel 1), nachdem von jedem Patienten eine informierte, schriftliche Einwilligung erhalten worden war. Tumorgewebeproben wurden unmittelbar nach der Operation schockgefroren und später mit Mörser und Stößel unter Flüssigstickstoff homogenisiert. Die gesamte RNA wurde aus diesen Proben unter Benutzung von TRI-Reagent (Ambion, Darmstadt, Deutschland) gefolgt von einer Aufreinigung mit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Deutschland) hergestellt; beide Verfahren wurden nach den Protokollen der Hersteller durchgeführt.
Für die RNASeq-Experimente wurde Gesamt-RNA aus gesunden menschlichen Geweben bezogen von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, UK).
Die Gesamt-RNA aus Tumorgeweben für RNASeq-Experimente wurde bezogen von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, UK); BioCat GmbH (Heidelberg, Deutschland); BioServe (Beltsville, MD, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“ (Neapel, Italien); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland).
Die Qualität und die Quantität aller RNA-Proben wurde an einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Deutschland) unter Benutzung des RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent) bewertet.
RNAseq Experimente
Die Genexpressionsanalyse von RNA-Proben aus Tumor- und Normalgewebe wurde durch Next Generation Sequenzierung (RNAseq) von CeGaT (Tübingen, Deutschland) durchgeführt. Zusammenfassend, werden Sequenzierungsbibliotheken mit dem Illumina HiSeq v4 Reagenzienkit gemäß dem Protokoll des Anbieters (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) erstellt, das RNA-Fragmentierung, cDNA-Konvertierung und Hinzufügen von Sequenzierungsadaptern beinhaltet. Bibliotheken, die aus mehreren Proben gewonnen werden, werden äquimolar gemischt und auf dem Illumina HiSeq 2500 Sequenzer gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert, wobei 50 bp Single End Reads erzeugt werden. Die prozessierten Reads werden mit der STAR-Software auf das menschliche Genom (GRCh38) gemappt. Expressionsdaten werden auf Transkriptionsebene als RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped Reads, erzeugt durch die Software Cufflinks) und auf Exon-Ebene (Total Reads, erzeugt durch die Software Bedtools), basierend auf der Anleitung aus der Ensembl-Sequenzdatenbank (Ensembl77), bereitgestellt. Exon-Werte werden auf Exon-Länge und Ausrichtungsgröße normiert, um RPKM-Werte zu erhalten.

Beispielhafte Expressionsprofile von Quellgenen der vorliegenden Erfindung, die stark überexprimiert oder ausschließlich exprimiert werden in AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphozytäre Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); GEJC (Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithel-nicht-kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Gebärmutter- und Endometriumkarzinom) sind in den dargestellt. Expressionswerte für weitere exemplarische Gene sind in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9: Expressionswerte Die Tabelle listet Peptide von Genen auf, die in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben stark (++) überexprimiert sind oder in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben überexprimiert (+) sind. Die Basislinie für diesen Score wurde aus Messungen der folgenden relevanten Normalgewebe berechnet: Fettgewebe; Nebenniere; Gallengang; Blase; Blutzellen; Blutgefäße; Knochenmark; Gehirn; Brust; Speiseröhre; Auge; Gallenblase; Nacken und Hals; Herz; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Leber; Lunge; Lymphknoten; peripherer Nerv, Eierstock, Bauchspeicheldrüse, Nebenschilddrüse, Bauchfell, Hypophyse, Plazenta, Brustfell, Prostata, Skelettmuskel, Haut, Rückenmark, Milz, Magen, Hoden, Thymus, Schilddrüse, Luftröhre, Harnleiter, Gebärmutter. Falls Expressionsdaten für mehrere Proben desselben Gewebetyps vorliegen, wurde für die Berechnung das arithmetische Mittel aller entsprechenden Proben verwendet.

SEQ ID NO:	SEQUENZ	GENEXPRESSION IN TUMOREN
SEQ ID NO:	SEQUENZ	ÜBEREXPRIMIERT (+)	STARK ÜBEREXPRIMIERT (++)
104	RLLEGNFSL	HNSCC, OSCAR,SCLC, UEC
105	YMNGTMSQV		MEL
106	YVWNRTELL		CRC, GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, OC, OSCAR, PACA, UEC
126	QLLGRNISL	AML
129	YLFENISQL	HNSCC
139	AINDTAARL	HNSCC, OSCAR
150	AIYHNITGISV	NSCLCadeno	NSCLCother
161	SQTNLSPAL	HCC
163	FISNFTMTI		MEL
167	ILLNKSTVL	MEL
186	KMLNETVLV		MEL
189	NMYNLTFHV	NHL
190	RLLNETVDVTI	UBC
191	SLFINVTRV	CCC
193	VLKNGTLVI	PACA
196	YLWWVNNQSL	CRC
203	TLNATWEL	UBC

BEISPIEL 3
Validierung von Peptiden durch IdentControl und CoElution
Um die Peptide gemäß der Erfindung zu validieren, wurden alle Peptide unter Verwendung von Standard- und gut etablierter Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung der Fmoc-Strategie synthetisiert. Falls erforderlich, wurden stabile isotopenmarkierte (SIL-) Aminosäuren verwendet, um eine diskriminierende Massenverschiebung einzuführen und die Verwendung dieser markierten Peptide als interne Standards zu ermöglichen (z. B. wenn ein Peptid zur Identitätsbestätigung in CoElution-Experimenten ausgewählt wurde). Die Identität und Reinheit jedes einzelnen Peptids wurden durch Massenspektrometrie und analytische RP-HPLC bestimmt. Die Peptide wurden als weiße bis gebrochen weiße Lyophilisate (Trifluoracetatsalze) mit Reinheit >50% erhalten. Alle TUMAPs werden bevorzugt als Trifluoracetatsalze oder Acetatsalze verabreicht, es sind auch andere Salzformen möglich.

Die erste Validierung der Peptide wurde durch IdentControl mittels Spektralvergleich durchgeführt. Dazu wurden synthetische Peptide zur Validierung von Peptid-Identifikationen durch Aufnahme von hochauflösenden MS2-Referenzspektren unter Verwendung angepasster Fragmentierungsmodi und Kollisionsenergien wie bei der Aufnahme der natürlichen Spektren verwendet. Der automatisierte Spektralvergleich wurde unter Verwendung der empfindlichen Metrik der Spektralkorrelation mit einem Cutoff-Score durchgeführt, der so bestimmt wurde, dass auf der Grundlage eines Benchmark-Datensatzes, der >10.000 manuell validierte Spektren umfasst, eine Empfindlichkeit von 90% bei <1 % FDR erreicht wird. Mehrdeutige Identifikationen wurden in CoElution-Experimenten einer weiteren Validierung unterzogen. Tabelle 10: Ergebnisse von IdentControl. Die spektrale Korrelation zeigt die Ähnlichkeit der MS/MS-Spektren des endogen nachgewiesenen Peptids im Vergleich zum synthetischen Peptid an, je höher der Wert, desto ähnlicher sind die Spektren. Das Peptid wird validiert, wenn ein Schwellenwert von 0,75 erreicht ist oder die Spektren durch manuelle Überprüfung als identisch angesehen werden.

SEQ ID NO:	SEQUENZ	SPEKTRALKORRELATION
1	ILDSTTIEI	0,925
2	RLLEGDFSL	0,989
3	YMDGTMSQV	0,991
4	YVWDRTELL	0,941
5	ALPQFFNDV	0,984
6	NLYNDLTNV	0,913
7	ALADLTGTV	0,924
8	KLAPDLTEL	0,851
9	SLDDSLNEL	0,933
10	FLGEDISNFL	0,980
11	GLVDGSSVTV	0,885
12	FVDEHTIDI	0,951
13	VLMDGTLKQV	0,774
14	YIYDGKDMSSL	0,932
15	VLDDTLVIF	0,972
16	KLISDMGKDVSA	0,839
17	NVDSTILNL	0,950
18	ILDEAKDISF	0,936
19	RLLDTTDVYLL	0,802
20	SLFAYPLPDV	0,951
21	FLNLFDHTL	0,951
22	HMIDLTIHL	0,959
23	FLGPIVDL	0,827
24	QLLGRDISL	0,920
25	FMNDRSFIL	0,945
26	ILYDGSNIQL	0,839
27	YLFEDISQL	0,965
28	FLLDGTDMFHM	0,877
29	KLLDLTVRI	0,988
30	QLMEKVQDV	0,900
31	TLIDATWLV	0,785
32	ALADLTGTVVNL	0,843
33	ILFDLTHRV	0,943
34	SLLDGSESAKL	0,879
35	SLRDGTEVV	0,961
36	SLYDFTGEQMAA	0,969
37	AIDDTAARL	0,947
38	AVDGTDARL	0,952
39	AVFDQTVTVI	0,956
40	FLDQTDETL	0,900
41	FLDTSTADV	0,951
42	IQDTSHLAV	0,833
43	KLLNDLTSI	0,773
44	LLDATHQI	0,811
45	SLFDDSFSL	0,804
46	SLSDVSQAV	0,792
47	VIDSTLVKV	0,935
48	AIYHDITGISV	0,992
49	ALDDYTITF	0,879
50	ALYDSTRELL	0,973
51	HLCNHDVSL	0,964
52	ILFDDSVFTL	0,909
53	ILTDITGHDV	0,952
54	KLEERVYDV	0,847
55	KTWDQSIAL	0,848
56	LLDSTAHLL	0,968
57	SLDISLPNL	0,989
58	SQDASLLKV	0,931
59	SQTDLSPAL	0,906
60	TLDITIVNL	0,860
61	FISDFTMTI	0,985
62	FLKDVTAQI	0,944
63	GLDRTQLVNV	0,977
64	ILFDPDNSSAL	0,856
65	ILLDKSTVL	0,964
66	LLDDQTVTF	0,929
67	LLDTTDVYL	0,953
68	RLQDTTIGL	0,916
69	SLLDENDVSSYL	0,866
70	SMASFLKDV	0,897
71	YLGAVFDL	0,987
72	ALDSTNSEL	0,820
73	ALMDVSQNV	0,912
74	KILDFTGPLFL	0,963
75	KLHDTSFCL	0,838
76	SLLRDFTLV	0,974
77	YLHGFDLSL	0,847
78	AIDQTITEA	0,976
79	ALAGLVYDA	0,984
80	ALDSSLQLL	0,889
81	AVDKTQTSV	0,954
82	FLNPDGSDCTL	0,866
83	FLNVDVSEV	0,961
84	KMLDETVLV	0,964
85	LLDITNPVL	0,925
86	NLADNTILV	0,972
87	NMYDLTFHV	0,916
88	RLLDETVDVTI	0,876
89	SLFIDVTRV	0,823
90	VLDGTEVNL	0,805
91	VLKDGTLVI	0,866
92	YLADFSHAT	0,776
93	YLDGTFRLL	0,954
94	YLWWVNDQSL	0,800
95	KLAPEDLADLTAL	0,971
96	KLDASLPAL	0,739
97	KLLDGSQRV	0,871
98	NLLADVSTV	0,565
99	NLLDHSSMFL	0,948
100	SLLFQDITL	0,625
101	TLDATWEL	0,913
102	WLIDKSMEL	0,915

Zur weiteren Validierung wurden die Peptide CoELution-Experimenten unter Verwendung von SIL-internen Standardpeptiden unterzogen. Zu diesem Zweck wurden SIL-Peptide in HLA-Peptidomextrakte aus Proben eingespiked und einer Flüssigkeitschromatographie - gezielte Massenspektrometrie (LC-MS) - unterzogen, um die Peptididentität auf der Grundlage der spektralen Ähnlichkeit sowie der CoElution in der Dimension der Retentionszeit zu bestätigen. Gespikte SIL-Peptidmengen wurden, falls erforderlich, an die peptidspezifischen lonisationsfaktoren (bestimmt in Kalibrierkurven) angepasst. Die LC-MS wurde mit vordefinierten gezielten MS2-Scan-Ereignissen mit nicht überlappenden Isolationsfenstern für SIL-Peptide und natürliche Peptidspezies durchgeführt, um eine Ko-Fragmentierung zu vermeiden. Zur Bestätigung der Isotopenreinheit und des Fehlens einer Ko-Fragmentierung von SIL- und natürlichem Peptid wurden Kontrollexperimente in einem nicht-HLA-Peptid mit tryptischer Matrix durchgeführt, die das Fehlen eines unmarkierten Signals bestätigen mussten. Die Peptiderkennung und -validierung durch CoElution wurde durch manuelle Expertenüberprüfung auf der Grundlage mehrerer vordefinierter objektiver Kriterien bestimmt, darunter das Punktprodukt (dotP) des SIL-Peptids im Vergleich zu unmarkierten Peptid-MS2-Spuren, das Vorhandensein der intensivsten Übergänge in mehreren aufeinander folgenden Scans und ausgerichtete Peakspitzen. Eine Liste, welche Peptide durch CoElution validiert wurden, ist in Tabelle 11 zu finden. Tabelle 11: Peptide mit positivem CoElution-Experiment

SEQ ID NO:	SEQUENZ
1	ILDSTTIEI
3	YMDGTMSQV
5	ALPQFFNDV
6	NLYNDLTNV
7	ALADLTGTV
9	SLDDSLNEL
11	YLFEDISQL
13	VIDSTLVKV
14	SLDISLPNL
15	SQTDLSPAL
18	KLHDTSFCL
20	KMLDETVLV
32	FLGEDISNFL
33	FVDEHTIDI
34	NMYDLTFHV
35	FLGPIVDL
36	GLVDGSSVTV
37	VLMDGTLKQV
42	RLLDTTDVYLL
43	SLFAYPLPDV
44	FLNLFDHTL
46	QLLGRDISL
47	FMNDRSFIL
50	KLLDLTVRI
53	ALADLTGTVVNL
54	ILFDLTHRV
55	SLLDGSESAKL
57	AIDDTAARL
61	FLDTSTADV
63	KLLNDLTSI
66	SLSDVSQAV
67	AIYHDITGISV
68	ALDDYTITF
69	ALYDSTRELL
71	ILFDDSVFTL
72	ILTDITGHDV
79	GLDRTQLVNV
82	LLDTTDVYL
86	YLGAVFDL
87	ALDSTNSEL
88	ALMDVSQNV
89	KILDFTGPLFL
90	YLHGFDLSL
91	AIDQTITEA
92	ALAGLVYDA
93	ALDSSLQLL
94	AVDKTQTSV
95	FLNPDGSDCTL
96	FLNVDVSEV
97	LLDITNPVL
98	NLADNTILV
99	SLFIDVTRV
100	VLDGTEVNL
101	YLADFSHAT
102	YLDGTFRLL

BEISPIEL 4
Absolute Quantifizierung von tumorassoziierten Peptiden, die auf der Zelloberfläche präsentiert werden
Die Herstellung von Bindemitteln, wie z. B. Antikörpern und/oder TCRs, ist ein aufwändiger Prozess, der nur für eine Reihe ausgewählter Zielmoleküle durchgeführt werden kann. Im Fall von tumorassoziierten und -spezifischen Peptiden umfassen die Auswahlkriterien unter anderem die Exklusivität der Präsentation und die Dichte des auf der Zelloberfläche präsentierten Peptids. Zusätzlich zur Isolierung und relativen Quantifizierung von Peptiden, wie in BEISPIEL 1 beschrieben, analysierten die Erfinder absolute Peptidkopien pro Zelle, wie in der WO 2016/107740 beschrieben. Die Quantifizierung von TUMAP-Kopien pro Zelle in Proben von soliden Tumoren erfordert die absolute Quantifizierung des isolierten TUMAP, die Effizienz des TUMAP-Isolierungsprozesses und die Zellzahl der analysierten Gewebeprobe.
Peptidguantifizierung mittels nano LC-MS/MS
Für eine genaue Quantifizierung von Peptiden durch Massenspektrometrie wurde für jedes einzelne Peptid eine Kalibrierungskurve unter Verwendung von zwei verschiedenen isotopenmarkierten Peptidvarianten erstellt (eine oder zwei isotopenmarkierte Aminosäuren sind bei der TUMAP-Synthese enthalten). Diese isotopenmarkierten Varianten unterscheiden sich vom tumor-assoziierten Peptid nur in ihrer Masse, zeigen aber keinen Unterschied in anderen physiko-chemischen Eigenschaften (Anderson et al., 2012). Für die Peptidkalibrierungskurve wurde eine Reihe von Nano-LC-MS/MS-Messungen durchgeführt, um das Verhältnis der MS/MS-Signale von titrierten (einfach isotopenmarkierten Peptiden) zu konstanten (doppelt isotopenmarkierten Peptiden) isotopenmarkierten Peptiden zu bestimmen.
Das doppelt isotopenmarkierte Peptid, auch interner Standard genannt, wurde weiter in jede MS-Probe gespikt und alle MS-Signale wurden auf das MS-Signal des internen Standards normalisiert, um mögliche technische Abweichungen zwischen MS-Experimenten auszugleichen.
Die Kalibrierkurven wurden in mindestens drei verschiedenen Matrizes erstellt, d. h. HLA-Peptid-Eluate aus natürlichen Proben, die den routinemäßigen MS-Proben ähnlich sind, und jede Präparation wurde in doppelten MS-Läufen gemessen. Zur Auswertung wurden MS-Signale auf das Signal des internen Standards normalisiert und eine Kalibrierkurve durch logistische Regression berechnet.
Für die Quantifizierung von tumorassoziierten Peptiden aus Gewebeproben wurden die entsprechenden Proben ebenfalls mit dem internen Standard gespickt; die MS-Signale wurden auf den internen Standard normalisiert und mit Hilfe der Peptidkalibrierungskurve quantifiziert.
Wirkungsgrad der Peptid-/MHC-Isolierung
Wie bei jedem Proteinreinigungsverfahren ist die Isolierung von Proteinen aus Gewebeproben mit einem gewissen Verlust des interessierenden Proteins verbunden. Um die Effizienz der TUMAP-Isolierung zu bestimmen, wurden für alle zur absoluten Quantifizierung ausgewählten TUMAPs Peptid/MHC-Komplexe generiert. Um die gespikten von den natürlichen Peptid/MHC-Komplexen unterscheiden zu können, wurden Single-Isotopen-markierte Versionen der TUMAPs verwendet, d. h. eine Isotopen-markierte Aminosäure wurde in die TUMAP-Synthese einbezogen. Diese Komplexe wurden in die frisch präparierten Gewebelysate gespikt, d. h. zum frühestmöglichen Zeitpunkt des TUMAP-Isolierungsverfahrens, und dann wie die natürlichen Peptid/MHC-Komplexe in der folgenden Affinitätsreinigung eingefangen. Die Messung der Rückgewinnung der einzelmarkierten TUMAPs erlaubt daher Rückschlüsse auf die Effizienz der Isolierung einzelner natürlicher TUMAPs.
Die Effizienz der Isolierung wurde in einem kleinen Set von Proben analysiert und war zwischen diesen Gewebeproben vergleichbar. Im Gegensatz dazu unterscheidet sich die Isolierungseffizienz zwischen den einzelnen Peptiden. Dies deutet darauf hin, dass die Isolierungseffizienz, obwohl sie nur in einer begrenzten Anzahl von Gewebeproben bestimmt wurde, auf jede andere Gewebepräparation extrapoliert werden kann. Es ist jedoch notwendig, jedes TUMAP einzeln zu analysieren, da die Isolierungseffizienz möglicherweise nicht von einem Peptid auf andere extrapoliert werden kann.
Bestimmung der Zellzahl in festem, gefrorenem Gewebe
Um die Zellzahl der Gewebeproben, die einer absoluten Peptidquantifizierung unterzogen wurden, zu bestimmen, wandten die Erfinder die DNA-Gehaltsanalyse an. Diese Methode ist auf ein breites Spektrum von Proben unterschiedlichen Ursprungs und vor allem auf gefrorene Proben anwendbar (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). Während des Peptidisolierungsprotokolls wird eine Gewebeprobe zu einem homogenen Lysat verarbeitet, aus dem ein kleines Lysat-Aliquot entnommen wird. Das Aliquot wird in drei Teile geteilt, aus denen die DNA isoliert wird (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Deutschland). Der Gesamt-DNA-Gehalt aus jeder DNA-Isolierung wird mit einem Fluoreszenz-basierten DNA-Quantifizierungstest (Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland) in mindestens zwei Wiederholungen quantifiziert.
Zur Berechnung der Zellzahl wurde eine DNA-Standardkurve aus Aliquoten isolierter gesunder Blutzellen von mehreren Spendern mit einem Bereich definierter Zellzahlen erstellt. Die Standardkurve wird verwendet, um den Gesamtzellgehalt aus dem Gesamtgehalt an DNA aus jeder DNA-Isolierung zu berechnen. Die mittlere Gesamtzellzahl der für die Peptidisolierung verwendeten Gewebeprobe wird dann unter Berücksichtigung des bekannten Volumens der Lysat-Aliquots und des Gesamtlysatvolumens extrapoliert.
Peptid kopien pro Zelle
Mit den Daten der oben genannten Experimente berechneten die Erfinder die Anzahl der TUMAP-Kopien pro Zelle, indem sie die Gesamtpeptidmenge durch die Gesamtzellzahl der Probe teilten, gefolgt von der Teilung durch Isolierungseffizienz. Kopienzellanzahl für ausgewählte Peptide ist in Tabelle 12 dargestellt.
Eine ausführlichere Offenbarung der Methode zur absoluten Quantifizierung der Peptide ist in der internationalen Patentveröffentlichung WO2016107740A1 und der US-Patentanmeldung 14/969,423 offenbart, deren Inhalt hier durch Verweis aufgenommen wird. Tabelle 12: Absolute Kopienzahlen der Peptide gemäß der Erfindung. Die Tabelle listet die Ergebnisse der absoluten Peptidquantifizierung in Tumorproben auf. Für jedes Peptid ist die mittlere Anzahl der Kopien pro Zelle angegeben: ≥25 = +; ≥50 = ++; ≥75 = +++, ≥100 = ++++. Die Anzahl der Proben, in denen auswertbare, qualitativ hochwertige MS-Daten zur Verfügung stehen, wird angegeben.

SEQ ID NO: SEQUENZ KOPIEN PRO ZELLE (MEDIAN) PROBENANZAHL

2 RLLEGDFSL + 2

61 FISDFTMTI ++++ 2
Reference List

Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124.
Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933.
Altrich-VanLith, M. L. et al., J Immunol, 177 (2006): 5440-50.
Andersen, M.H. et al., J Immunol, 163 (1999): 3812-18.
Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878.
Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814.
Arentz-Hansen, H. et al., J Exp Med, 191: 603-12.
Balbas R and Lorence A. „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols“ (2004).
Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274.
Banker, G. and Rhodes, C. „Modern Pharmaceutics“, CRC Press (2002).
Beggs, J. D. et al., Nature 275 (1978): 104-109.
Behrens, A. J. et al., Expert Rev Proteomics, 14 (2017): 881-90.
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), Vol.57 (1995): 289-300.
Berge, S. M. et al., Journal of Pharmaceutical Science 66 (1977):1-19.
Better, M. et al., Science 240 (1988): 1041-1043.
Boulianne, G. L. et al. Nature 312 (1984):643-646.
Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711.
Brentville, V. A. et al., Semin Immunol, 47 (2020): 101393.
Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599.
Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43.
Cabilly, S. et al. Proc Natl Acad Sci 81 (1984): 3273-3277.
Cao, L. et al., Nat Commun, 8 (2017): 14954.
Card, K. F. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 345-357.
Cobbold, M. et al., Sci Transl Med, 5 (2013): 203ra125.
Cohen, C. J. et al., J Immunol. 170 (2003b): 4349-4361.
Cohen, C. J. et al., J Mol.Recognit. 16 (2003a): 324-332.
Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114.
Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995).
Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738
Dayhoff, M. O. et al. „The Atlas of Protein Sequence and Structure“ Natl Biomedical Research (1965).
De Bousser, E. et al., Hum Vaccin Immunother (2020): 1-15.
Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170.
Denkberg, G. et al., J Immunol. 171 (2003): 2197-2207.
Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296.
Ferris, R. L. et al., J Immunol, 162 (1999): 1324-32.
Follenzi, A. et al., Nat Genet. 25 (2000): 217-222.
Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 98 (2001): 8809-8814.
Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett. 31 (2009): 819-823.
Gabrilovich, D. I. et al., Nat.Med 2 (1996): 1096-1103.
Gattinoni, L. et al., Nat.Rev.lmmunol. 6 (2006): 383-393.
Gennaro, A. „Remington's: The Science and Practice of Pharmacy“, Lippincott Williams & Wilkins (1997).
Gilliland, D. G. et al., Proc Natl Acad Sci 77 (1980): 4539
Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012).
Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014).
Guo, H. H. et al., Proc Natl Acad Sci 101 (25): 9205-9210 (2004).
Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22 (2004): 346-353.
Han, X. et al., J Proteome Res, 10 (2011): 2930-6.
Harlow, E. & Lane, D. „Using Antibodies - A laboratory manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989).
Holliger, P. et al. Proc Natl Acad Sci, 90 (1993): 6444-6448.
Howard, G. C. & Kaser, M. R. „Making and Using antibodies: A practical handbook“, CRC Press (2007)
Hudrisier, D. et al., J Biol Chem, 274 (1999): 36274-80.
Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000).
Knorre, D. G. et al., Acta Naturae, 1 (2009): 29-51.
Krieg, A. M., Nat.Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484.
Krolick, K. A. et al., Proc Nat'l Acad Sci 77 (1980): 5419.
Kuball, J. et al., Blood 109 (2007): 2331-2338.
Liddy, N. et al., Nat.Med. 18 (2012): 980-987.
Lin, M. H. et al.,Vaccine X, 1 (2019): 100017.
Liu, et al., Proc Natl Acad Sci 84 (1987):3439-3443
Liu, F. T. et al., Nat Rev Cancer, 5: 29-41.
Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med 162 (1985): 1745-1759.
Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291
Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585
Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795
Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)
Mäher, J. et al., Immunity, 45: 945-46.
Marcilla, M. et al., Mol Cell Proteomics, 13: 462-74.
McGinty, J. W. et al., Curr Diab Rep, 15 (2015): 90.
Mei, S., R et al., Mol Cell Proteomics (2020).
Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237.
Misaghi, S. et al., Chem Biol, 11 (2004): 1677-87.
Mondon R et al Front BioSci 13 (2008):1117-1129, 1008.
Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129.
Morrison S. L. et al., Proc Natl Acad Sci (1984): 6851-6855.
Mosse, C. A. et al.,J Exp Med, 187 (1998): 37-48.
Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res. 7 (2008): 51-61.
Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480.
Olexiouk, V. et al., Nucleic Acids Res 44 (2016): D324-D329.
Ostankovitch, M. et al., J Immunol, 182 (2009): 4830-5.
Petersen, J. et al., J Mol Med (Berl), 87 (2009): 1045-51.
Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (CRAN.R-project.org/packe=nlme) (2015)
Plebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787.
Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955.
Posey, A. D. et al., Immunity, 44 (2016): 1444-54.
Purcell, A.W. et al., Nat. Rev. Drug Discov, 6 (2009): 404-14.
Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219
Raposo, B. et al., Nat Commun, 9 (2018): 353.
Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74.
Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921.
Rodriguez, E. et al., Nat Rev Immunol, 18 (2018): 204-11.
Russell, S. J. et al., Nucl Acids Res 21 (1993):1081-1085.
Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491
Schaed, S.G. et al., Clin. Cancer Res, 8: 967-72.
Schmitt, T. M. et al., Hum.Gene Ther. 20 (2009): 1240-1248.
Scholten, K. B. et al., Clin Immunol. 119 (2006): 135-145.
Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576.
Selby, M. et al., J Immunol, 162 (1999): 669-76.
Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986). Sidney, J. et al., BMC Immunol, 19 (2018): 12.
Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542.
Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195.
Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094.
Sternberg, N. et al. Proc Natl Acad Sci 92 (1995): 1609-1613.
Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163.
Subramanian, R. P. et al., Retrovirology. 8 (2011): 90.
Sun, L. K. et al., Proc Natl Acad Sci 84 (1987): 214-218.
Teufel, R. et al., Cell Mol.Life Sci. 62 (2005): 1755-1762.
Traunecker, A. et al., EMBO 10 (1991): 3655-3659.
Walter, S. et al., J.lmmunol. 171 (2003): 4974-4978.
Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261.
Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423.
Yan, A., and W. J. Lennarz, J Biol Chem, 280 (2005): 3121-4.
Youle, R. J. et al., Proc Natl Acad Sci 77 (1980): 5483-5486.
Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577.
Zarling, A.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 103 (2006): 14889-94.
Zufferey, R. et al., J Virol. 73 (1999): 2886-2892.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2007/028574 [0018]
EP 1760088 B1 [0018]
US 10106805 [0092]
US 4897445 [0110]
US 2013/0096016 [0123]
US 6653104 [0147]
WO 9518145 [0162]
US 4440859 [0168]
US 4530901 [0168]
US 4582800 [0168]
US 4677063 [0168]
US 4678751 [0168]
US 4704362 [0168]
US 4710463 [0168]
US 4757006 [0168]
US 4766075 [0168]
US 4810648 [0168]
US 5849589 [0188]
US 6406705 B1 [0189]
EP 2113253 [0195]
WO 2014/071978 A1 [0201]
WO 1996/016673 [0209]
US 5837234 [0209]
WO 1998/002463 [0209]
US 5821337 [0209]
US 7083784 [0210]
US 7670600 [0210]
US 8921528 [0210]
US 2014/0308285 [0210]
WO 1993/008829 [0210]
WO 86/01533 [0212]
EP 184187 [0212]
US 5624659 [0212]
WO 03/068201 [0214]
WO 2004/084798 [0214]
WO 0172768 [0214]
WO 03/070752 [0214]
US 4816567 [0260, 0262, 0265]
WO 9429348 [0263]
US 4342566 [0263]
US 2010/0113300 [0275]
US 2013/0115191 [0275]
WO 2004/033685 A1 [0275]
WO 2004/074322 A1 [0275]
WO 2012/056407 A1 [0275]
WO 2013/057586 A1 [0275]
WO 97/26328 [0285]
WO 2016/107740 [0331]
WO 2016107740 A1 [0339]
US 14969423 [0339]

Claims

Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus • SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 102, • und eine Sequenzvariante davon, die die Fähigkeit aufrechterhält, an MHC-Molekül(e) zu binden und/oder T-Zellen zu induzieren, die mit der Peptidvariante kreuzreagieren, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.
Das Peptid nach Anspruch 1, wobei • das Peptid die Fähigkeit aufweist, an ein MHC-Klasse-I-Molekül zu binden, und/oder • wobei das Peptid, wenn es an das MHC gebunden ist, von CD4 und/oder CD8 T-Zellen erkannt werden kann.
Das Peptid oder Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei das Peptid oder die Variante davon eine Gesamtlänge von 8 bis 30 Aminosäuren aufweist.
Das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 oder 4, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist.
Ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment davon, der spezifisch das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 erkennt oder daran bindet, oder das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , wenn er an ein MHC-Molekül gebunden ist, erkennt oder daran bindet.
T-Zell-Rezeptor oder ein funktionelles Fragment davon, der mit einem MHC-Liganden reaktiv ist oder an einen MHC-Liganden bindet, wobei der Ligand das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wenn er an ein MHC-Molekül gebunden ist, ist.
Nukleinsäure, die für ein Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einen Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 6, einen T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon nach Anspruch 7 kodiert.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, den Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 6, den T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon nach Anspruch 7 oder die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor nach Anspruch 8.
In vitro-Verfahren zur Herstellung von aktivierten T Lymphozyten, wobei das Verfahren ein in Kontakt bringen in vitro von T-Zellen mit Antigen-beladenen menschlichen Klasse-I oder II MHC-Molekülen umfasst, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder eines künstlichen Konstrukts, das eine Antigen-präsentierende Zelle nachahmt, exprimiert werden, für eine Zeitdauer die ausreichend ist, um die T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist.
Aktivierter T-Lymphozyt, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 11, der selektiv eine Zelle erkennt, die ein Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 präsentiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus • dem Peptid oder einer Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, • dem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 6, • dem T-Zell-Rezeptor oder Fragment davon nach Anspruch 7, • der Nukleinsäure oder dem Expressionsvektor nach Anspruch 8, • der Wirtszelle nach Anspruch 9 • oder den aktivierten T-Lymphozyten nach Anspruch 10 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Verfahren zur Herstellung des Peptids oder einer Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, des Antikörpers oder Fragments davon nach Anspruch 6 oder des T-Zell-Rezeptors oder Fragments davon nach Anspruch 7, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 9 und das Isolieren des Peptids oder der Variante davon, des Antikörpers oder des Fragments davon oder des T-Zell-Rezeptors oder des Fragments davon aus der Wirtszelle und/oder seinem Kulturmedium umfasst.
Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 6, der T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 7, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 8, die Wirtszelle nach Anspruch 9 oder der aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 11 zur Verwendung in der Medizin oder zur Verwendung in der Herstellung eines Medikamentes.
Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, festgelegt in einem der Ansprüche 1 bis 5, präsentieren, wobei das Verfahren die Verabreichung einer effektiven Anzahl von aktivierten T-Lymphozyten gemäß Anspruch 11 umfasst.
Aktivierter T-Lymphozyt nach Anspruch 11 zur a) Verwendung bei der Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen ein Polypeptid präsentieren, das eine Aminosäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 umfasst, oder b) zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Abtötung solcher Zielzellen.
Verfahren zur Behandlung eines Patienten, • bei dem Krebs diagnostiziert wird, • der an Krebs leidet oder • bei dem das Risiko besteht, Krebs zu entwickeln, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids oder einer Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, des Antikörpers oder eines Fragments davon nach Anspruch 6, des T-Zell-Rezeptors oder eines Fragments davon nach Anspruch 7, der Nukleinsäure oder des Expressionsvektors nach Anspruch 8, der Wirtszelle nach Anspruch 9 oder des aktivierten T-Lymphozyten nach Anspruch 11 an den Patienten umfasst.
Das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, der Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 6, der T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon nach Anspruch 7, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 8, die Wirtszelle nach Anspruch 9 oder der aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 11 zur Verwendung bei der Behandlung eines Patienten, • bei dem Krebs diagnostiziert wurde, • der an Krebs leidet oder • bei dem das Risiko besteht, Krebs zu entwickeln, oder zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines solchen Patienten.
Verfahren nach Anspruch 17 oder das Peptid, der Antikörper, der T-Zell-Rezeptor, die Nukleinsäure, die Wirtszelle oder der aktivierte T-Lymphozyt zur Verwendung nach Anspruch 18, wobei der Krebs aus der Gruppe bestehend aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, Adenokarzinom des ösophago-gastralen Übergangs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom, Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, kleinzelligem Lungenkarzinom, Harnblasenkarzinom und Endometriumkarzinom ausgewählt ist.
Kit umfassend: (a) einen Behälter, umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12 in Lösung oder in lyophilisierter Form enthält; (b) gegebenenfalls, einen zweiten Behälter enthaltend ein Verdünnungsmittel oder eine Rekonstitutionslösung für die lyophilisierte Formulierung; (c) gegebenenfalls, mindestens ein weiteres Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 102.
Der Kit gemäß Anspruch 20 weiterhin umfassend ein oder mehr von einem Puffer, einem Verdünnungsmittel, einem Filter, einer Nadel oder einer Spritze.