DE102018115865A1

DE102018115865A1 - A*03-restringierte Peptide zur Verwendung in der Immuntherapie gegen Krebs und verwandte Verfahren

Info

Publication number: DE102018115865A1
Application number: DE102018115865.3A
Authority: DE
Inventors: Colette SONG; Heiko Schuster; Daniel Kowalewski; Oliver Schoor; Jens FRITSCHE; Toni Weinschenk; Harpreet Singh; Linus BACKERT
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-02-20
Also published as: AR115643A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Zellen zur Verwendung in immuntherapeutischen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Immuntherapie von Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin tumorassoziierte T-Zell-Peptidepitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, die zum Beispiel als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren, oder um T-Zellen ex vivo zu stimulieren und Patienten zu verabreichen. Peptide, die an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, oder Peptide als solche, können auch Ziele von Antikörpern, löslichen T-Zell-Rezeptoren und anderen Bindungsmolekülen sein.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Peptide, Proteine, Nukleinsäuren und Zellen zur Verwendung in immuntherapeutischen Verfahren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Immuntherapie von Krebs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin tumorassoziierte T-Zell-Peptidepitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, die zum Beispiel als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren, oder um T-Zellen ex vivo zu stimulieren und Patienten zu verabreichen. Peptide, die an Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) gebunden sind, oder Peptide als solche, können auch Ziele von Antikörpern, löslichen T-Zell-Rezeptoren und anderen Bindungsmolekülen sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reihe von neuartigen Peptidsequenzen und deren Variante, die von Molekülen der HLA-Klasse-I menschlicher Tumorzellen abgeleitet sind, welche in Impfstoffkompositionen zur Auslösung von antitumoralen Immunantworten, oder als Targets für die Entwicklung von pharmazeutisch / immunologisch aktiven Verbindungen und Zellen verwendet werden können.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) gehörte Krebs 2012 zu den vier bedeutendsten nicht übertragbaren tödlichen Krankheiten weltweit. Im selben Jahr wurden Darmkrebs, Brustkrebs und Atemwegskrebs unter den Top 10 der Todesursachen in Ländern mit hohem Einkommen aufgeführt (http://www.who.int/mediacentre/factsheets /fs310/en/).
Epidemiologie
Im Jahr 2012 wurden weltweit 14,1 Millionen neue Krebsfälle, 32,6 Millionen krebskranke Patienten (innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose) und 8,2 Millionen Krebstodesfälle geschätzt (Bray et al., 2013; Ferlay et al., 2013).
Innerhalb der Gruppen Hirnkrebs, Leukämie und Lungenkrebs konzentriert sich die aktuelle Erfindung insbesondere auf Glioblastom (GBM), chronische lymphatische Leukämie (CLL) und akute myeloische Leukämie (AML), nicht-kleinzelligen und kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC und SCLC).
GBM ist die häufigste Malignität des zentralen Nervensystems mit einer altersbereinigten Inzidenzrate von 3,19 pro 100.000 Einwohner in den USA. GBM hat eine sehr schlechte Prognose mit einer 1-jährigen Überlebensrate von 35% und einer 5-jährigen Überlebensrate von weniger als 5%. Männliches Geschlecht, Alter und ethnische Zugehörigkeit scheinen Risikofaktoren für GBM zu sein(Thakkar et al., 2014).
CLL ist die am weitesten verbreitete Leukämie in der westlichen Welt, wo sie etwa ein Drittel aller Leukämien ausmacht Die Inzidenzraten sind in den USA und Europa ähnlich und geschätzte neue Fälle liegen bei etwa 16.000 pro Jahr. CLL ist bei Kaukasiern häufiger anzutreffen als bei Afrikanern, seltener bei Hispanoamerikanern und Indianern und selten bei Asiaten. Bei Menschen asiatischer Herkunft sind die CLL-Inzidenzraten um das Dreifache niedriger als bei Kaukasiern(Gunawardana et al., 2008). Die fünfjährige Gesamtüberlebenszeit für Patienten mit CLL beträgt etwa 79%.
AML ist die zweithäufigste Form der Leukämie, die sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern diagnostiziert wird. Die geschätzte Anzahl der neuen Fälle beträgt etwa 21.000 pro Jahr in den USA. Die fünfjährige Überlebensrate von Menschen mit AML liegt bei etwa 25%.
Lungenkrebs ist die weltweit häufigste Krebsart und in vielen Ländern die häufigste Todesursache durch Krebs. Lungenkrebs wird in kleinzelligen Lungenkrebs und nicht-kleinzelligen Lungenkrebs unterteilt. NSCLC umfasst die histologischen Typen Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom und Großzellkarzinom und macht 85% aller Lungenkrebsarten in den USA aus. Die Inzidenz von NSCLC ist eng mit der Raucherprävalenz verbunden, einschließlich aktueller und ehemaliger Raucher, und die Fünfjahresüberlebensrate betrug 15%(Molina et al., 2008; World Cancer Report, 2014).
In Anbetracht der schwerwiegenden Nebenwirkungen und Kosten, die mit der Behandlung von Krebs verbunden sind, müssen Faktoren identifiziert werden, die bei der Behandlung von Krebs |im Allgemeinen und insbesondere [NA1]bei akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom verwendet werden können. Es besteht auch die Notwendigkeit, Faktoren zu identifizieren, die Biomarker für Krebs im Allgemeinen und akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom im Besonderen, was zu einer besseren Krebsdiagnose, Beurteilung der Prognose und Vorhersage des Behandlungserfolgs führt.
Die Immuntherapie von Krebs stellt eine Möglichkeit dar, Krebszellen gezielt anzusprechen und gleichzeitig Nebenwirkungen zu minimieren. Die Krebsimmuntherapie nutzt die Existenz von tumorassoziierten Antigenen.
Zur Zeit umfasst die Klassifizierung der tumorassoziierten Antigene (TAAs) die folgenden großen Gruppen:

a) Cancer-Testis-Antigene: Die ersten jemals identifizierten TAAs, die durch T-Zellen erkannt werden, gehören zu dieser Klasse, die zunächst Cancer-Testis (CT)-Antigene genannt wurden, weil die Expression ihrer Mitglieder in histologisch unterschiedlichen menschlichen Tumoren und - bei Normalgewebe - nur in Spermatozyten/Spermatogonia des Hodens und manchmal in der Placenta vorliegt. Da die Zellen des Hodens keine Klasse-I und II HLA-Moleküle exprimieren, können diese Antigene nicht durch T-Zellen im Normalgewebe erkannt werden und werden deshalb als immunologisch tumorspezifisch betrachtet. Bekannte Beispiele für CT-Antigene sind die MAGE Familienangehörigen und NY-ESO-1.
b) Differenzierungsantigene: Diese TAAs werden zwischen Tumoren und Normalgewebe, aus dem der Tumor entstanden ist, geteilt. Die meisten der bekannten Differenzierungsantigene finden sich in Melanomen und normalen Melanozyten. Viele dieser Melanozyten-Linie-verwandten Proteine sind in der Biosynthese von Melanin involviert und sind deshalb nicht tumorspezifisch, werden aber nichtsdestotrotz umfangreich in der Krebsimmuntherapie eingesetzt. Beispiele enthalten, sind aber nicht beschränkt, auf Tyrosinase und Melan-A/MART-1 für Melanom oder PSA für Prostatakrebs.
c) Überexpremierte TAAs: Gene, die häufig exprimierte TAAs kodieren, wurden in histologisch unterschiedlichen Typen von Tumoren sowie in vielen gesunden Geweben - dort im Allgemeinen mit niedrigeren Expressionsniveaus, gefunden. Es ist möglich, dass viele der Epitope, die von Normalgeweben prozessiert und potentiell präsentiert werden, unter dem Schwellenwert für eine T-Zell-Erkennung sind, während die Überexpression in Tumorzellen durch Aufbrechen der vorher etablierten Toleranz eine Reaktion gegen Krebs auslösen kann. Bekannte Beispiele für diese Klasse von TAAs sind Her-2/neu, Survivin, Telomerase oder WT1.
d) Tumorspezifische Antigene: Diese einzigartigen TAAs entstehen durch Mutationen von normalen Genen (wie z. B. β-Catenin, CDK4, etc.). Einige dieser molekularen Veränderungen werden mit neoplastischen Transformationen und/oder Progression assoziiert. Tumorspezifische Antigene sind in der Regel in der Lage, ohne das Risiko für Autoimmunreaktionen gegen normales Gewebe zu tragen, eine starke Immunreaktion zu induzieren. Andererseits sind diese TAAs in den meisten Fällen nur mit Bezug auf den genauen Tumor, von dem sie identifiziert wurden, relevant und werden in der Regel nicht von vielen Einzeltumoren geteilt. Tumorspezifität (oder - assoziation) eines Peptids kann auch dann auftreten, wenn das Peptid aus einem tumor-(-assoziierten) Exon stammt, wenn es sich um Proteine mit tumorspezifischen (assoziierten) Isoformen handelt.
e) TAAs, die aus abnormalen posttranslationalen Modifikationen entstehen: Solche TAAs können aus Proteinen entstehen, die weder spezifisch für, noch überexprimiert in Tumoren sind, die aber nichtsdestotrotz durch posttranslationale Prozesse, die primär in Tumoren aktiv sind, tumorassoziiert werden. Beispiele für diese Klasse entstehen aus veränderten Glykosylierungsmustern, die zu neuartigen Epitopen in Tumoren, wie für MUC1, oder Ereignissen, wie dem Proteinsplicing während des Abbaus, die tumorspezifisch oder auch nicht sein können, führen.
f) Onkovirale Proteine: Diese TAAs sind virale Proteine, die in dem onkogenen Prozess eine entscheidende Rolle spielen können, und weil sie fremde (nicht menschlichen Ursprungs) sind, können sie eine T-Zellantwort hervorrufen. Beispiele für derartige Proteine sind die menschlichen Papillomavirus Typ 16 Virusproteine E6 und E7, die in zervikalen Karzinomen (Zervixkrebs) exprimiert werden.

Die Ziele der T-Zell-basierenden Immuntherapie sind Peptidepitope, die von tumorassoziierten oder tumorspezifischen Proteinen abgeleitet sind, die durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) präsentiert werden. Die Antigene, die von den tumorspezifischen T-Lymphozyten erkannt werden, bzw. deren Epitope, können Moleküle aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein, welche exprimiert werden und, im Vergleich zu unveränderten Zellen der gleichen Herkunft, in dem jeweiligen Tumor hochreguliert sind.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen, MHC-Klasse-I und MHC-Klasse-II. MHC Klasse-I-Moleküle bestehen aus einer alpha- schweren Kette und beta-2-Mikroglobulin, MHC Klasse-II-Moleküle bestehen aus einer alpha- und einer beta-Kette. Die dreidimensionale Konformation resultiert in einer Bindungsfurche, welche für die nichtkovalente Wechselwirkung mit Peptiden benutzt wird.
MHC-Klasse-I Moleküle können auf den meisten Zellen mit einem Zellkern vorkommen. Sie präsentieren Peptide, die aus einer proteolytischen Spaltung vorwiegend endogener Proteine, defekten ribosomalen Produkten (DRIPs) und größerer Peptide entstehen. Jedoch werden Peptide, die von endosomalen Kompartimenten oder exogenen Quellen abgeleitet sind, häufig auf MHC-Klasse-I-Molekülen gefunden. Dieser nicht-klassische Weg der Klasse-I-Präsentation wird in der Literatur als Kreuzpräsentation bezeichnet (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC-Kasse-II-Moleküle können vorwiegend auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC) vorkommen und in erster Linie präsentieren Peptide von exogenen oder transmembranen Proteinen, die von den APCs während des Ablaufes der Endozytose aufgenommen und anschließend prozessiert wurden.
Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-I werden von CD8-positiven T-Zellen erkannt, die den adäquaten T-Zellrezeptor (TCR) tragen, wobei Komplexe aus Peptid und MHC-Klasse-Il-Molekülen von CD4-positiven T-Helferzellen, die den adäquaten TCR tragen, erkannt werden. Es ist sicher bekannt, dass der TCR, das Peptid und der MHC in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1:1 vorliegen.
CD4-positive T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Induzierung und dem Aufrechterhalten von effektiven Antworten durch CD8-positive zytotoxische T-Zellen. Die Identifizierung von CD4-positiven aus tumorassoziierten Antigenen (TAA) abgeleiteten T-Zell-Epitopen ist von großer Bedeutung für die Entwicklung pharmazeutischer Produkte für die Auslösung antitumoraler Immunantworten(Gnjatic et al., 2003). An dem Tumor unterstützen T-Helferzellen ein zytotoxisch T-Zellen (CTL)-freundliches Zytokinmilieu(Mortara et al., 2006) und ziehen weitere Effektorzellen an, z. B. CTLs, NK-Zellen, Makrophagen und Granulozyten(Hwang et al., 2007).
In Abwesenheit einer Entzündung ist die Expression von MHC-Klasse-Il-Molekülen hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems, besonders auf professionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel Monozyten, von Monozyten abgeleiteten Zellen, Makrophagen und dendritischen Zellen, begrenzt. Bei Krebspatienten wurde festgestellt, dass Tumorzellen MHC-Klasse-II-Moleküle exprimieren(Dengjel et al., 2006).
Längere (verlängerte) Peptide der Erfindung können als aktive MHC-Klasse-II-Epitope fungieren.
Durch MHC-Klasse-II-Epitope aktiviert T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle beim Steuern der Effektorfunktion der zytotoxischen T-Zellen (CTL) in der antitumoralen Immunität. T-Helferzell-Epitope, die eine T-Helferzellantwort des TH1-Types auslösen, unterstützen die Effektorfunktionen der CD8-positiven Killer-T-Zellen, welche zytotoxische Funktionen gegen Tumorzellen, die tumorassoziierte Peptid/MHC Komplexe auf ihrer Zelloberfläche präsentieren, beinhalten. Auf diese Weise können tumorassoziierte T-Helferzellen Peptid-Epitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren.
Es konnte in Tiermodellen an Säugetieren, z. B. bei Mäusen, gezeigt werden, dass auch in Abwesenheit von zCD8-positive T-Lymphozyten, CD4-positive T-Zellen ausreichend sind, die Manifestation von Tumoren durch Inhibition der Angiogenese durch Sekretion von Interferon-Gamma (IFNy) zu inhibieren(Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Es gibt Hinweise auf CD4 T-Zellen als direkte Anti-Tumor-Effektoren(Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).
Da die konstitutive Expression von HLA-Klasse-Il-Molekülen normalerweise auf Immunzellen beschränkt ist, wurde die Möglichkeit, Klasse-II-Peptide direkt aus primären Tumoren zu isolieren, als unmöglich angesehen. Allerdings konnten Dengjel et al. erfolgreich eine Anzahl von MHC-Klasse-II-Epitopen direkt von Tumoren identifizieren ( WO 2007/028574 , EP 1 760 088 B1 ).
Da beide Arten der Antwort, CD8- und CD4-abhängig, gemeinsam und synergistisch zu dem anti-Tumoreffekt beitragen, ist die Identifizierung und Charakterisierung von tumorassoziierten Antigenen, die entweder durch CD8+ T-Zellen (Ligand: MHC-Klasse-I-Molekül + Peptidepitop) oder durch CD4-positive T-Helferzellen (Ligand: MHC-Klasse-II-Molekül + Peptidepitop) erkannt werden, für die Entwicklung von Tumorvakzinen wichtig.
Damit ein MHC-Klasse-I-Peptid eine zelluläre Immunantwort auslösen (initiieren) kann, muss es auch an ein MHC-Molekül binden. Dieser Vorgang ist vom Allel des MHC-Moleküls und von dem spezifischen Polymorphismus der Aminosäuresequenz des Peptids abhängig. MHC-Klasse-I-bindende Peptide sind in der Regel 8-12 Aminosäurereste lang und enthalten in ihrer Sequenz gewöhnlich zwei konservierte Reste („Anker“), die mit der entsprechenden Bindungsfurche des MHC-Moleküls interagieren. Auf diesem Weg hat jedes MHC-Allel ein „Bindungsmotiv“, welches bestimmt, welche Peptide spezifisch an die Bindungsfurche binden können .
In einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort müssen die Peptide nicht nur in der Lage sein, an spezifische MHC-Klasse-I-Moleküle, die von Tumorzellen exprimiert werden, zu binden, sie müssen anschließend auch noch von T-Zellen, die einen spezifischen T-Zellrezeptor (TCR) tragen, erkannt werden.
Damit die Proteine durch die T-Lymphozyten als tumorspezifisches oder -assoziiertes Antigen erkannt werden, und um somit in einer Therapie eingesetzt werden zu können, müssen bestimmte Voraussetzungen erfüllt sein. Das Antigen soll hauptsächlich von Tumorzellen und nicht oder nur in vergleichsweise geringen Mengen von gesunden Normalgeweben exprimiert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte das Peptid im Vergleich zu normalem gesundem Gewebe von Tumorzellen überpräsentiert werden. Weiterhin ist wünschenswert, wenn das betreffende Antigen nicht nur in einer Tumorart, sondern auch in hoher Konzentration vorliegt (z. B. Kopienzahl des entsprechenden Peptids pro Zelle). Tumorspezifische und tumorassoziierte Antigene sind oft aus Proteinen abgeleitet, die direkt, aufgrund ihrer Funktion beispielsweise in der Zellzyklus-Steuerung oder der Suppression der Apoptose, in die Transformation einer normalen Zelle in eine Tumorzelle beteiligt sind. Zusätzlich können nachgeschaltete (downstream) Ziele der Proteine, die direkt für eine Transformation verantwortlich sind, hochreguliert werden und sind somit indirekt tumorassoziiert. Solche indirekt tumorassoziierten Antigene können auch Ziele eines Vakzinierungsansatzes sein(Singh-Jasuja et al., 2004). Es ist auch das Vorliegen von Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens essentiell, damit sichergestellt ist, dass ein solches von einem tumorassoziierten Antigen abgeleitetes Peptid („immunogenes Peptid“) zu einer T-Zellantwort in vitro oder in vivo führt.
Grundsätzlich kann jedes Peptid, das an ein MHC-Molekül binden kann, als T-Zellepitop dienen. Eine Voraussetzung für die Induktion einer in vitro oder in vivo T-Zellantwort ist die Anwesenheit einer T-Zelle mit einem entsprechenden TCR und das Fehlen einer immunologischen Toleranz für dieses bestimmte Epitop.
TAAs stellen somit ein Ausgangspunkt für die Entwicklung einer T-Zell-basierten Immuntherapie, umfassend aber nicht limitiert auf Tumorvakzinen dar. Die Verfahren zur Identifizierung und Charakterisierung der TAAs beruhen normalerweise zum einen auf dem Einsatz von T-Zellen, die aus Patienten oder gesunden Individuen isoliert werden können, oder basieren auf der Erstellung differentieller Transkriptionsprofile oder differentieller Peptidexpressionsmuster zwischen Tumoren und Normalgeweben. Das Auffinden von Genen, die in Tumorgeweben oder humanen Tumor-Zelllinien überexprimiert sind, oder die in derartigen Geweben oder Zelllinien selektiv exprimiert werden, liefert jedoch keine präzise Information für einen Einsatz der von diesen Genen transkribierten Antigene in einer Immuntherapie. Dies beruht darauf, dass nur eine individuelle Subpopulation der Epitope dieser Antigene für eine solche Anwendung geeignet ist, da eine T-Zelle mit einem entsprechenden TCR vorhanden sein muss und die immunologische Toleranz für dieses bestimmte Epitop muss nicht vorhanden oder minimal sein. In einer sehr bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist es daher wichtig, nur die über- oder selektiv präsentierten Peptide auszuwählen, gegen die eine funktionelle und/oder eine proliferierende T-Zelle gefunden werden kann. Solch eine funktionelle T-Zelle wird als eine T-Zelle definiert, die bei der Stimulation mit einem spezifischen Antigen klonal expandiert werden kann und in der Lage ist, Effektorfunktionen auszuführen („Effektor-T-Zelle“).
Beim Targeting von Peptid-MHC durch spezifische TCRs (z.B. lösliche TCRs) und Antikörper oder andere Bindungsmoleküle (Scaffolds) nach der Erfindung ist die Immunogenität der zugrunde liegenden Peptide sekundär. In diesen Fällen ist die Präsentation der entscheidende Faktor.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 besteht, oder eine Variantensequenz davon, die mindestens zu 77%, vorzugsweise mindestens zu 88%, homolog (vorzugsweise mindestens zu 77% oder mindestens zu 88% identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 ist, wobei die Variante an MHC bindet und/oder T-Zellen induziert, die mit dem Peptid kreuzreagieren, oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei das Peptid nicht das zugrundeliegende Polypeptid in voller Länge ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid der vorliegenden Erfindung, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 oder einer Variante davon ausgewählt ist, die mindestens zu 77%, vorzugsweise mindestens zu 88%, homolog (vorzugsweise mindestens zu 77% oder mindestens zu 88% identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 ist, wobei das Peptid oder die Variante davon eine Gesamtlänge zwischen 8 und 100, vorzugsweise zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 14 Aminosäuren aufweist.

Die folgenden Tabellen zeigen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, ihre jeweiligen SEQ ID NOs und die voraussichtlichen Quell-(Basis-)Gene für diese Peptide. In Tabelle 1 binden die Peptide mit den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 213 an HLA-A*03. Die Peptide in der Tabelle 2 wurden zuvor in umfangreichen Listen als Ergebnisse von Hochdurchsatz-Screenings mit hohen Fehlerraten oder mit Algorithmen berechnet, aber bisher überhaupt nicht mit Krebs in Verbindung gebracht. In Tabelle 2 binden die Peptide mit den SEQ ID NO: 214 bis SEQ ID NO: 226 an HLA-A*03. Die Peptide in der Tabelle 3 sind zusätzliche Peptide, die in Kombination mit den anderen Peptiden der Erfindung nützlich sein können. In Tabelle 3 binden die Peptide mit den SEQ ID NO: 227 bis SEQ ID NO: 249 an HLA-A*03. Tabelle 1: Peptide aemäß der vorliegenden Erfindung.

Seq ID No	Sequenz	Gen(e)
1	RVYPHKTLY	DCAF4L2
2	KVMPKQTWK	KCNU1
3	LLYGNGPGYVLK	ALPP, ALPPL2
4	RGLSGIGAFR	ADAM29
5	AMVPIYAAY	SLC6A3
6	SIFGLAPGK	ALPP, ALPPL2
7	RLVELAGQSLLK	PRAME
8	FSNNHPSTPK	CSAG1
9	HVLYPVPLESY	PRAME
10	KARDLRTPK	CTAG2
11	PLPRPGAVLK	CTAG2
12	KVLTRNIEY	CHRNA9
13	AVAFFVLPSK	SERPINA9
14	VAFFVLPSK	SERPINA9
15	RLYAPWNISRL	CYP4Z1
16	KVFAEHKISY	IGF2BP1
17	GGLSSQGVYY	NKX6-3
18	RLYYSFKNITK	SOX11
19	ALAAKLEVK	SCGB1D4
20	LLPTVLIKK	ADAMTS20
21	SSLAELIAK	NLRP11
22	EGLFLLGCVK	TRIM51, TRIM51BP, TRIM51EP
23	RLSPGPRAY	KISS1R
24	KLETGWKK	DCX
25	KTWAHCMSY	KISS1R
26	QLGYQAAVLK	PGR
27	SGSTLECILYK	PGR
28	STLECILYK	PGR
29	KVLSILSRLK	SPATA21
30	ILDSSLLK	FAM178B
31	HAFFPKTHR	MMP11
32	LLDAEPPILY	ESR1
33	KLLEDMVEK	SCGB2A1
34	AIGTPLIGK	HTR3A
35	VLLLLSLLH	NOTUM
36	QIRAELMKK	PRAMEF11
37	EVILTTKTPK	COL20A1
38	SLFPYYNNLY	DMRT1
39	KTQFPQLK	SMC1B
40	ALNDRFAGY	NEFH
41	RLGAARGQLR	NEFH
42	RVCMTVDSLVNK	DCT
43	TVYDSIWCNMK	SCGB2A1
44	HAFPPGPNY	MMP13
45	KCYEVGMMK	ESR1
46	WTGNVPLK	CXorf48, LOC650024, LOC728470
47	ALFGNALVFY	QRFPR
48	KGWNGQIFK	COL24A1
49	ITAPLMPLGK	LAMC2
50	HSAGIFSMY	EML6
51	VTADGALAMEK	LAMC2
52	GMYEYGSIEK	SLC45A2
53	KQALSLVRK	LAMC2
54	GVTITKTLK	ROPN1, ROPN1B
55	RLSAESKDLLK	OLIG3
56	TTYYPSPLNK	SEMA5B
57	RVLYRPQLEK	RHBG
58	VLYRPQLEK	RHBG
59	KINQYIIKK	SLC24A5
60	WFPFPVNKR	MYCN
61	SLYDSEPRKK	MEX3B
62	GIFPKIMPK	SSX3, SSX9
63	SSFRPLLSK	GREB1
64	SVLSRMLVR	GREB1
65	RTIEELQNK	KRT13, KRT17
66	RVKEIVINK	ENTHD1
67	WREILHAQTLK	RALGPS2
68	KGPMAGILAY	GAPDHS
69	GLSTILLYH	GPR143
70	VTAVASLLK	GPR143
71	VLYELGIIGNNK	SLC24A5
72	KLYPQCLQK	KBTBD8
73	RCFSGPYLNK	SFMBT1, SFMBT2
74	HSTLVALFY	NCAPD3
75	IIFVPEMNK	TMEM211
76	IINESLLFY	GPR143
77	WDDSQLPK	TRBV11-1, TRBV11-2
78	KTGTFVLYKS	VWDE
79	AVAAVLLSR	CXCR3
80	ALCGTQLFY	RALGPS2
81	HLFLPFSYK	APOB
82	CLANYTVNK	CCNA1
83	KLADSVMAGK	NFIA
84	QLYSPPSPSYR	ROS1
85	IMPTFDLTK	PAGE2, PAGE2B
86	RVSGSGGGGAGK	SOX11
87	RLASVGLDAK	EML6
88	GTHVWVGLYK	COL10A1
89	VIYVICRHK	KISS1R
90	RTALLWGLKK	PTHLH
91	IMKRQVKCITK	ADAMTS20
92	KRIPFRPLAK	HHIPL2
93	SVEGLSRRLK	PTHLH
94	GMTLLCEALK	NLRP9
95	FLGLAFHPK	HHIPL2
96	RAVSVNPGK	IGHE
97	RVRALGSQY	LAMC2
98	VSVAGSILAK	ROBO3
99	RTYTCQVTY	IGHE
100	TTNARILAR	UCN2
101	HMDEFKRTQK	LAMC2
102	RLLQHTPSAR	C6orf223
103	SIYKKAVYR	HEPHL1
104	AWQGLVEK	LAMC2
105	QVLDLQSVK	CBX2
106	LLRSGLTLR	RAPGEF5
107	ILNLNKMVK	PLA2G2D
108	KMPILSYWPY	PLA2G2D
109	KLQNLPTLLY	CDCA5, LOC256676
110	IIFIPATILLK	ACSM1
111	ATSPPASVR	GPR143
112	ASLAAAVLAK	ZNF648
113	VSIRNTLLY	FLT3
114	SLLTVSGAWAK	IGHE
115	AILHPFRAK	NMUR2
116	KGVKKELPQK	ZFP42
117	TVFVELWLK	LOC101060288, LOC101060295, LOC101060308, LOC645359, PRAMEF11, PRAMEF15, PRAMEF23, PRAMEF4, PRAMEF5, PRAMEF6, PRAMEF9
118	SLRGSFPILY	FCRL3
119	RMGFRTLSK	DNTT
120	TRMQKAGFLYY	DNTT
121	LLPAARATSR	LAMC2
122	LIGPLLICK	F5
123	SLQGLTISY	PTPRZ1
124	WYDTMIEK	PTPRZ1
125	WYDTMIEKF	PTPRZ1
126	KILETSLK	HMCN1
127	GLAAGALLLY	FCRL5
128	KIKKPLSYR	WNT7A
129	ALARVSSVKL	OXTR
130	KANSGNTFKY	AKNAD1
131	RVDSKQRYY	DCC
132	ASSFRPLLSK	GREB1
133	SFRPLLSK	GREB1
134	SLLKPSGDYFK	FERMT1
135	TFKSVLLNK	SYCP2
136	ALSRMSQQY	CYP1A1
137	TVYVAMCHKF	OTOG
138	VSLSKMLKK	CTLA4
139	KAIIRVIPLK	RNF43, SUPT4H1
140	RLLAAGQVIR	HMCN1
141	RLRDYISSLK	RALGPS2
142	SPRVYWLGLNDR	CLEC17A
143	KTLGKIAEK	SCGB1D1
144	PLAMLAATCNK	SP8, SP9
145	SLFEGIYTIK	FLT3
146	TLLSYELAFK	IL9R
147	KLFMPRPK	DSCR8
148	RIGNKGIYK	IL26
149	TVFLSKYLKK	CAPN6
150	LLLAAVTVK	CALHM3
151	KVASFTVIGY	TRIM71
152	KIICGVHYLY	SLC5A4
153	LASSPAGHK	HMCN1
154	TIASVLVAR	SLC24A5
155	ALSHAVNNY	APOB
156	VSLGIAVSK	ZNF479, ZNF679, ZNF716, ZNF731P
157	SLPLQRILAMSK	HSF2BP
158	RALGVPFVPR	NFE2L3
159	LLLLPFLLY	RDH11
160	RLLPGKVWVK	CAPN6
161	MKTLPAMLGTGK	BTLA
162	LLALGAAYVY	IL5
163	MLYYPSVSR	GPR143
164	RLAQYTIER	GABRP
165	AATIISSAK	TKTL2
166	KVIAPGVIY	ADAMTS12
167	MLKQARRPLFR	PDE11A
168	ATNGKVLKK	IL1A
169	ATNGKVLKKR	IL1A
170	LISGGSLRKL	NLRP11
171	ATIGLSVSK	ABCB11
172	SLLEADPFLK	CCNA1
173	VSYNRLIK	FERMT1
174	KMMKRLMTVEK	DPPA2
175	VIGTTSSPK	UMODL1
176	RLYDAYVNR	EFCAB3, HILPDA
177	ALLGVIIAKK	HAVCR1
178	RIYVYVKRK	LPAR3
179	KINPTASLK	FMN1
180	RLKMAQESVSK	FMN1
181	RVAEEILIK	RTL1
182	QICLPAIYK	MET
183	KVYIPPIINK	HMCN1
184	KVLEPPLGAR	MPL
185	SIINFKPLTY	SLC6A2
186	CTLPFKIFY	LPAR4
187	KTCQVSGLLY	NELL1
188	SSLPRAFQK	KIF26B
189	KVFEEPEDFLK	FOXP3
190	RSKWSNVFK	L1TD1
191	SLYNLGGAK	KRT75
192	RSYSHWLK	CHST4, CHST5, CHST6
193	IVYPSATDKTK	RBM46
194	PVLICLALSK	SLCO6A1
195	KLQAKVLQY	CEP250
196	AISSTVLGK	MET
197	RIVDYLLEK	MYO10
198	FLYGAQTVY	GEN1
199	IVFPDVISK	FREM2
200	RVLPPLTRILK	RASSF9
201	KVADFGLARLLK	SRMS
202	RLFPGLYLGY	ANKFN1
203	IVAFIPLSNK	RXFP1
204	VAFIPLSNK	RXFP1
205	RVYPRPPSK	AR
206	RLYEMILQR	FAM124B
207	ATLNLFQIVSK	CCDC42
208	KTGWFTLLY	PRLR
209	KILDRVLSRY	GABRQ
210	KIFQGQINK	ADCY10
211	VSLGTPIMK	ECT2
212	RTIDRSVFK	NUP155
213	KLYPTHACR	ABCA2, TPH1, TPH2

Tabelle 2: Zusätzliche Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung

Seq ID No	Sequenz	Gen(e)
214	KLFTSVFGVGLK	DNTT
215	KIWQNLRLK	OXTR
216	RVSSVKLISK	OXTR
217	RVYEGDGRNSLK	KBTBD8
218	KAFNQSSIFTK	ZNF92
219	ALERKFRQK	MSX1, MSX2
220	ALPRQAFHSK	CDK6
221	RLAVSTRGK	KIF26B
222	RSNPYFQNK	TSPY1, TSPY10, TSPY2, TSPY3, TSPY4, TSPY8, TSPY9P
223	GISNPITTSK	SERTAD4
224	SLYDGFLSY	DCHS2
225	RVYPRPPSKTY	AR
226	RVWLGKHYK	SMARCC1

Tabelle 3: Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, welche beispielsweise für personalisierte Krebstherapien nützlich sind.

Seq ID No	Sequenz	Gen(e)
227	VLYPVPLESY	PRAME
228	LLQPPPLLAR	MMP11
229	KLAELEGALQK	KRT121P, KRT81, KRT83, KRT85, KRT86
230	LLDEGAMLLY	NLRP7
231	VLLDEGAMLLY	NLRP7
232	AVAPPTPASK	CBX2
233	KTYETNLEIKK	NLRP7
234	WFPFPVNK	MYCN
235	QQFLTALFY	NLRP2, NLRP7
236	AVFDKFIRY	BTBD17
237	VLYGPAGLGK	NLRP2
238	ATKSPAKPK	HIST1H1B
239	SVFEGDSIVLK	FCRL2
240	ALNPYQYQY	DLX5
241	TAFGGFLKY	LAMA1
242	KAFNQSSTLTK	ZNF431, ZNF714, ZNF92, ZNF93
243	VTDLISPRK	LAMA1
244	KTLPAMLGTGK	BTLA
245	KITDFGLAK	EGFR
246	KQVFPGLNY	APOB
247	ATFNKLVSY	DNMT3B
248	GLASRILDAK	LAMB3
249	ATSGVPVYK	SLC44A5

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner im Allgemeinen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von proliferativen Erkrankungen, wie z. B. akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom.
Besonders bevorzugt sind die Peptide - einzeln oder in Kombination - gemäß der vorliegenden Erfindung, welche aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 ausgewählt sind. Bevorzugter sind die Peptide - einzeln oder in Kombination - ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 49 (siehe Tabelle 1) und ihre Verwendung in der Immuntherapie von Krebs und vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom.
Somit ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung für die - vorzugsweise kombiniert - Behandlung von einer proliferativen Erkrankung, ausgewählt aus der Gruppe von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung, die die Fähigkeit aufweisen, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klasse I oder - in längerer Form, wie beispielsweise einer Längenvariante - der Klasse MHC -II zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin erfindungsgemäße Peptide, wobei die Peptide (jedes) aus einer Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 besteht oder im Wesentlichen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid modifiziert ist und/oder nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, das insbesondere an die N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR-Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii) fusioniert oder an (oder in die Sequenz) eines Antikörpers fusioniert ist, wie beispielsweise eines Antikörpers, der spezifisch für dendritische Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Nukleinsäure, die die erfindungsgemäßen Peptide kodiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäße Nukleinsäure, welche DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren, und/oder sie exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten und in der Medizin, insbesondere bei der Behandlung von Krebs.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Antikörper, die spezifisch gegen die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung oder Komplexe dieser erfindungsgemäßen Peptide mit MHC sind, und Verfahren zu deren Herstellung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner T-Zell-Rezeptoren (TCRs), insbesondere lösliche TCR (sTCRs) und klonierte TCRs, die in die autologen oder allogenen T-Zellen eingesetzt wurden, und Verfahren zu deren Herstellung, sowie auf NK-Zellen oder andere Zellen, die den TCR tragen oder mit den TCRs kreuzreagieren.
Die Antikörper und TCRs sind weitere Ausführungsformen der immuntherapeutischen Verwendung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, oder einen Expressionsvektor, wie zuvor beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine antigenpräsentierende Zelle und bevorzugt eine dendritische Zelle ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung und Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Antigen auf ein MHC-Klasse-I oder Il-Molekül beladen ist, welches an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder künstlichen Antigen-präsentierende Zelle durch in Kontakt bringen einer ausreichenden Menge des Antigens mit der Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Antigen-präsentierende Zelle einen Expressionsvektor umfasst, der in der Lage ist, das Peptid, das SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226, vorzugsweise SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 49, oder eine variante Aminosäuresequenz enthält, zu exprimieren oder es exprimiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner aktivierte T-Zellen, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wobei die T-Zelle selektiv eine Zelle erkennt, die ein Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend beliebige erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aberrant exprimieren, wobei das Verfahren die Verabreichung dem Patienten einer effektiven Menge von T-Zellen umfasst, die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines beliebigen Peptids wie beschrieben, der Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung, des Expressionsvektors gemäß der vorliegenden Erfindung, der Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung, des aktivierten T-Lymphozyten, des T-Zell-Rezeptors oder des Antikörpers oder anderer Peptid- und/oder Peptid-MHC-bindender Moleküle gemäß der vorliegenden Erfindung als Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments. Vorzugsweise ist das Medikament gegen Krebs wirksam.
Vorzugsweise ist das Medikament eine Zelltherapie, ein Impfstoff oder ein Protein auf Basis eines löslichen TCRs oder Antikörpers.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszellen Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Biomarker auf den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, die im vorliegenden Kontext „Targets“ genannt werden, welche bei der Diagnostik von Krebs, vorzugsweise akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom, verwendet werden können. Der Marker kann eine Überpräsentation des(der) Peptids(e) selbst oder eine Überexpression des(der) entsprechenden Gens(e) sein. Die Marker können auch verwendet werden, um die Erfolgswahrscheinlichkeit einer Behandlung, vorzugsweise einer Immuntherapie, vorherzusagen, und am meisten bevorzugt ist eine Immuntherapie, die auf das gleiche Ziel abzielt, das durch den Biomarker identifiziert wird. So kann beispielsweise ein Antikörper oder ein löslicher TCR verwendet werden, um Abschnitte des Tumors zu färben, um das Vorhandensein eines Peptids von Interesse im Komplex mit MHC nachzuweisen.
Optional trägt der Antikörper eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder ein Toxin.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser neuartigen Targets im Rahmen einer Krebsbehandlung.
Die Stimulation einer Immunantwort hängt von der Präsenz von Antigenen ab, die vom Immunsystem des Wirts als fremd erkannt werden. Die Entdeckung der Existenz von tumorassoziierten Antigenen hat die Möglichkeiten erweitert, das Immunsystem des Wirts dafür zu nutzen, um ins Tumorwachstum einzugreifen. Gegenwärtig werden verschiedene Mechanismen zur Einbindung beider, sowohl der humoralen als auch der zellularen Zweige des Immunsystems für die Krebsimmuntherapie, untersucht.
Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind in der Lage, Tumorzellen spezifisch zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von T-Zellen aus Tumor-infiltrierenden Zellpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen. Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen, die Moleküle der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 10 Aminosäurereste von Proteinen oder defekten ribosomalen Produkten (DRIPS), die im Zytosol lokalisiert sind, haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
Wie hier verwendet und wenn nicht anders beschrieben, werden alle Begriffe so verwendet, wie weiter unten definiert.
Die Bezeichnung „T-Zell Antwort“ meint die spezifische Proliferation und die Aktivierung von Effektorfunktionen, die durch ein Peptid in vitro oder in vivo induziert wird. Für die MHC-Klasse-I-restringierte zytotoxische T-Zellen können die Effektorfunktionen der Lysis von Peptid-gepulsten, Peptid-Vorläufer-gepulsten oder natürlichen Peptidpräsentierenden Zielzellen, die Sekretion von Zytokinen, bevorzugt Interferon-gamma, TNF-alpha oder IL-2 induziert durch Peptide, die Sekretion von Effektormolekülen, bevorzugt Granzyme oder Perforine induziert durch Peptide oder Degranulation, sein.
Der Begriff „Peptid“ wird hier verwendet, um eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind, zu kennzeichnen. Die Peptide sind vorzugsweise 9 Aminosäuren lang, können aber so kurz wie 8 Aminosäuren lang sein, und so lang wie 10, 11 oder 12 oder länger, und im Falle von MHC Klasse-II-Peptiden (verlängerte Varianten der Peptide der Erfindung) können sie so lang wie 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 oder 20 oder mehr Aminosäuren lang sein.
Darüber hinaus umfasst der Begriff „Peptid“ Salze einer Reihe von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch akzeptable Salze der Peptide, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Trifluoracetat) Salze. Es muss angemerkt werden, dass die Salze der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung erheblich von den Peptiden in ihrem Zustand / ihren Zuständen in vivo abweichen, da die Peptide in vivo nicht als Salze vorliegen.
Der Begriff „Peptid“ umfasst auch „Oligopeptid“. Der Begriff „Oligopeptid“ wird hier verwendet, um eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind, zu kennzeichnen. Die Länge des Oligopeptides ist für die Erfindung nicht entscheidend, solange das korrekte Epitop oder die korrekten Epitope darin beibehalten werden. Die Oligopeptide sind typischerweise weniger als etwa 30 Aminosäurereste in der Länge und mehr als etwa 15 Aminosäuren in der Länge.
Der Begriff „Polypeptid“ kennzeichnet eine Abfolge von Aminosäureresten, die typischerweise miteinander über Peptidbindungen zwischen den alpha-Amino- und den Carbonylgruppen der angehängten Aminosäuren verbunden sind. Die Länge des Polypeptides ist für die Erfindung nicht entscheidend, solange die korrekten Epitope beibehalten werden. Im Gegensatz zu den Begriffen „Peptid“ oder „Oligopeptid“ soll der Begriff „Polypeptid“ Proteinmoleküle bezeichnen, die mehr als 30 Aminosäureresten enthalten.
Ein Peptid, Oligopeptid, Protein oder Polynukleotid, welches ein solches Molekül kodiert, ist „immunogen“ (und somit ein „Immunogen“ im Rahmen der vorliegenden Erfindung), wenn es in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen. Im Fall der vorliegenden Erfindung wird „Immunogenität“ spezieller definiert als die Fähigkeit, eine T-Zellantwort zu induzieren. Somit wäre ein „Immunogen“ ein Molekül, welches in der Lage ist, eine Immunantwort auszulösen, und im Fall der vorliegenden Erfindung, ein Molekül, welches in der Lage ist, eine T-Zellantwort zu induzieren. In einem weiteren Aspekt kann das Immunogen das Peptid, der Komplex des Peptids mit MHC-Molekül, ein Oligopeptid und/oder Protein, das verwendet wird, um spezifische Antikörper oder TCRs gegen es zu erzeugen, sein.
Ein Klasse-I T-Zell-„Epitop“ benötigt ein kurzes Peptid, das an einen Klasse-I-MHC-Rezeptor gebunden ist und einen tertiären Komplex bildet (MHC-Klasse-I alpha-Kette, beta-2-Microglobulin und Peptid), welcher durch eine T-Zelle erkannt werden kann, die einen passenden T-Zellrezeptor, der an den MHC/Peptid-Komplex mit einer angemessenen Affinität bindet. Peptide, die an MHC-Klasse-I-Moleküle binden, sind typischerweise 8-14 Aminosäuren lang und besonders typisch 9 Aminosäuren lang.
Bei Menschen gibt es drei verschiedene genetische Loci, die für MHC-Klasse-I-Moleküle kodieren (Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozytenantigene (HLA) bezeichnet): HLA-A, HLA-B und HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 und HLA-B*07 sind Beispiele für MHC-Klasse-I-Allele, die von diesen Loci exprimiert werden.

Tabelle 4: Expressionsfrequenzen F für die Serotypen HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 und HLA-B*44. Die Haplotypfrequenzen Gf sind aus einer Studie entnommen, in welcher die HLA-Typisierungsdaten aus einer Datenbank von über 6,5 Millionen freiwilliger Spender in den USA benutzt wurden(Gragert et al., 2013). Die Haplotypfrequenz ist die Frequenz eines speziellen Allels auf einem einzelnen Chromosom. Aufgrund des diploiden Chromosomensatzes in Säugerzellen ist die Frequenz des genotypischen Auftretens dieser Allele höher und kann unter Verwendung des Hardy-Weinberg-Gleichgewichtes (F = 1 - (1-Gf)²) berechnet werden.

Allel	Bevölkerung	Aus der Allelfrequenz kalkulierter Phänotyp (F)
A*02	Afrikaner (N=28557)	32,3 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	49,3 %
	Japaner (N=24582)	42,7 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	46,1 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	30,4 %
A*01	Afrikaner (N=28557)	10,2 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	30,2 %
	Japaner (N=24582)	1,8 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	14,0 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	21,0 %
A*03	Afrikaner (N=28557)	14,8 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	26,4 %
	Japaner (N=24582)	1,8 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	14,4 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	10,6 %
A*24	Afrikaner (N=28557)	2,0 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	8,6 %
	Japaner (N=24582)	35,5 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	13,6 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	16,9 %
B*07	Afrikaner (N=28557)	14,7 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	25,0 %
	Japaner (N=24582)	11,4 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	12,2 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	10,4 %
B*08	Afrikaner (N=28557)	6,0 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	21,6 %
	Japaner (N=24582)	1,0 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	7,6 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	6,2 %
B*44	Afrikaner (N=28557)	10,6 %
	Europäische Kaukasier (N=1242890)	26,9 %
	Japaner (N=24582)	13,0 %
	Hispanoamerikaner, S + Zentr Amer. (N=146714)	18,2 %
	Südostliche Asiaten (N=27978)	13,1 %

Die Peptide der Erfindung, vorzugsweise wenn sie in einem erfindungsgemäßen Impfstoff beinhaltet sind, wie im vorliegenden Kontext beschrieben ist, binden an A*03. Ein Impfstoff kann auch pan-bindende MHC-Klasse-II-Peptide beinhalten. Daher kann der erfindungsgemäße Impfstoff zur Behandlung von Krebs bei Patienten verwendet werden, die A*03-positiv sind, während aufgrund des pan-bindenden Charakters dieser Peptide keine Auswahl für MHC-Klasse-II-Allotypen erforderlich ist.

Wenn A*03-Peptide der Erfindung mit Peptiden kombiniert werden, die an ein anderes Allel, z. B. A*24, binden, kann ein höherer Prozentsatz jeder Patientenpopulation behandelt werden, als wenn man nur ein MHC-Klasse-I-Allel anspricht (Tabelle 5). Während in den meisten Populationen weniger als 50% der Patienten mit einem Allel allein behandelt werden könnten, kann ein Impfstoff, der HLA-A*24 und HLA-A*02-Epitope umfasst, mindestens 60% der Patienten in jeder relevanten Population behandeln. Insbesondere die folgenden Prozentsätze von Patienten werden für mindestens eines dieser Allele in verschiedenen Regionen positiv sein: USA 61%, Westeuropa 62%, China 75%, Südkorea 77%, Japan 86% (kalkuliert mit www.allelefrequencies.net). Tabelle 5: Die HLA-Abdeckung der europäischen kaukasischen Bevölkerung (berechnet aus (Gragert et al., 2013)).

	Abdeckun g (zuminde st ein A-Allel)	kombinier t mit B*07	kombinier t mit B*44	kombinier t mit B07 und B44
A02 / A01	70%	78%	78%	84%
A02 / A03	68%	76%	76%	83%
A02 / A24	61%	71%	71%	80%
A'01 / A03	52%	64%	65%	75%
A01 / A24	44%	58%	59%	71%
A03 / A24	40%	55%	56%	69%
A02 / A01 / A*03	84%	88%	88%	91%
A02 / A01 / A*24	79%	84%	84%	89%
A02 / A03 / A*24	77%	82%	83%	88%
A01 / A03 / A*24	63%	72%	73%	81%
A02 / A01 / A03 / A24	90%	92%	93%	95%

In einer bevorzugten Ausführungsform bezieht sich der Begriff „Nukleotidsequenz“ auf ein Heteropolymer von Desoxyribonukleotiden.
Die Nukleotidsequenz, die ein bestimmtes Peptid, Oligopeptid oder Polypeptid kodiert, kann natürlich vorkommen oder synthetisch konstruiert sein. Im Allgemeinen werden DNA-Segmente, die die Peptide, Polypeptide und Proteine dieser Erfindung kodieren, aus cDNA-Fragmenten und kurzen Oligonukleotidlinkern oder einer Serie von Oligonukleotidlinkern zusammengeführt, um ein synthetisches Gen zur Verfügung zu stellen, das in der Lage ist, in einer rekombinanten Transkriptionsregulationseinheit, die regulatorische Elemente abgeleitet von mikrobiellen oder viralen Operons enthält, exprimiert zu werden.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „ein Nukleotid, das für (oder kodierend) ein Peptid kodiert“ auf eine Nukleotidsequenz, die für das Peptid kodiert, einschließlich künstlicher (durch Menschen gemacht) Start- und Stoppcodons, die für das biologische System kompatibel sind, wobei die Sequenz beispielsweise durch eine dendritische Zelle oder ein anderes Zellsystem exprimiert werden soll, das für die Herstellung von TCRs geeignet ist.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, umfasst ein Verweis auf eine Nukleinsäuresequenz sowohl Einzelstrang- als auch Doppelstrang-Nukleinsäuresequenzen. So bezieht sich, zum Beispiel für DNA, die spezifische Sequenz, solange der Zusammenhang nichts Gegenteiliges besagt, auf die Einzelstrang-DNA einer solchen Sequenz, den Duplex einer solchen Sequenz mit seinem Komplement (Doppelstrang-DNA) und dem Komplement einer solchen Sequenz.
Die Bezeichnung „kodierende Region“ bezieht sich auf den Teil eines Genes, der entweder natürlich oder normal das Expressionsprodukt des Genes in seinem natürlichen genomischen Umfeld kodiert, d. h. die Region, die in vivo das native Expressionsprodukt des Genes kodiert.
Die kodierende Region kann von einem nicht-mutierten („normalen“), mutierten oder geänderten Gen abgeleitet sein, oder kann sogar von einer DNA-Sequenz, oder einem Gen sein, die vollständig im Labor anhand der für den Fachmann bekannten Verfahren auf dem Fachgebiet der DNA-Synthese synthetisiert wurden, abgeleitet sein.
Der Begriff „Expressionsprodukt“ bedeutet das Polypeptid oder Protein, welches das natürliche Translationsprodukt des Genes ist und jeder Nukleinsäuresequenz, die Äquivalente, welche aus einer Degenerierung des genetischen Codes resultieren, und damit die gleiche(n) Aminosäure(n) kodieren.
Der Begriff „Fragment“, wenn er sich auf eine kodierende Sequenz bezieht, bedeutet einen Teil DNA, umfassend weniger als die komplette kodierende Region, dessen Expressionsprodukt essentiell die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das Expressionsprodukt der kompletten kodierenden Region behält.
Der Begriff „DNA-Segment“ bezieht sich auf einen DNA-Polymer in der Form eines separaten Fragments oder als eine Komponente eines größeren DNA-Konstruktes, welche von DNA erhalten wurde, die zumindest einmal in substantiell reiner Form isoliert wurde, d. h. frei von kontaminierendem endogenen Materialien und in einer Menge oder Konzentration, die die Identifikation, Manipulation und Recovery des Segmentes und seiner Nukleotidsequenzkomponenten durch biochemische Standardverfahren, zum Beispiel durch Nutzung von Klonvektoren, erlauben. Solche Segmente werden in der Form von offenen Leserastern (Open Reading Frames, ORFs), nicht unterbrochen durch interne nicht-translatierende Sequenzen oder Introns, die typischerweise in eukaryotischen Genen vorkommen, bereitgestellt. Die Sequenzen der nicht-translatierenden DNA können nachgeschaltet (downstream) des offenen Leserasters vorkommen, wo diese nicht mit der Manipulation oder Expression der kodierenden Regionen interferieren.
Der Begriff „Primer“ meint eine kurze Nukleinsäuresequenz, die mit einem DNA-Strang gepaart werden kann und ein freies 3'-OH-Ende bereitstellt, an welchem eine DNA-Polymerase die Synthese einer Desoxyribonukleotidkette beginnt.
Der Begriff „Promoter“ meint eine Region der DNA, die an der Bindung von RNA-Polymerase zur Initialisierung der Transkription beteiligt ist.
Der Begriff „isoliert“ bedeutet, dass das Material aus seiner originären Umgebung entfernt wurde (z. B. der natürlichen Umgebung, wenn es natürlich vorkommt). Zum Beispiel ist ein natürlich vorkommendes Polynukleotid oder Polypeptid, welches in einem lebenden Tier vorkommt, nicht isoliert, aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, getrennt von einigen oder allen in dem natürlichen System vorkommenden Materialien, ist isoliert. Solche Polynukleotide können Teil eines Vektors sein und/oder solche Polynukleotide oder Polypeptide können Teil einer Zusammensetzung sein und immer noch isoliert sein, indem so ein Vektor oder eine Zusammensetzung nicht Teil der natürlichen Umgebung ist.
Die Polynukleotide und die rekombinanten oder immunogenen Polypeptide, offenbart im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung, können auch in „aufgereinigter“ Form vorliegen. Der Begriff „aufgereinigt“ verlangt keine absolute Reinheit, vielmehr ist er als relative Definition zu verstehen, und kann Zusammensetzungen enthalten, die hoch aufgereinigt sind, oder Zusammensetzungen, die nur teilweise aufgereinigt sind, da diese Begriffe sehr gut von Fachmännern in dem relevanten Gebiet verstanden werden. Zum Beispiel wurden individuelle Klone, die aus einer cDNA Bibliothek isoliert wurden, in herkömmlicher Weise durch elektrophoretische Homogenität aufgereinigt. Die Aufreinigung von Anfangsmaterialien oder natürlichen Materialien um zumindest eine Größenordnung, bevorzugt zwei oder drei Größenordnungen und weiter bevorzugt vier oder fünf Größenordnungen, ist ausdrücklich beinhaltet. Des Weiteren ist ein beanspruchtes Polypeptid, welches eine Reinheit von bevorzugt 99,999 %, oder zumindest 99,99 % oder 99,9 % und auch noch wünschenswerterweise 99 % per Gewicht oder höher hat, ausdrücklich erfasst.
Die Nukleinsäuren und polypeptidischen Expressionsprodukte, die entsprechend der vorliegenden Erfindung offenbart werden, sowie Expressionsvektoren, die solche Nukleinsäuren und/oder solche Polypeptide enthalten, können in „angereicherter Form“ vorliegen. Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff „angereichert“, dass die Konzentration des Materials zumindest das 2-, 5-, 10-, 100 oder 1000-fache ihrer natürlichen Konzentration (zum Beispiel) ist, vorteilhafterweise 0,01 %, per Gewicht, bevorzugt zumindest um 0,1 % per Gewicht. Angereicherte Abmischungen von etwa 0,5 %, 1 %, 5 %, 10 % und 20 % bei Gewicht werden auch in Betracht gezogen. Die Sequenzen, Konstrukte, Vektoren, Klone und andere Materialien, die die vorliegende Erfindung umfasst, können vorteilhafterweise in einer angereicherten oder isolierten Form vorliegen. Der Begriff das „aktive Fragment“ meint ein Fragment, normalerweise eines Peptids, Polypeptids oder einer Nukleinsäuresequenz, das eine Immunantwort auslöst (d.h. immunogene Aktivität), wenn es alleine oder gegebenenfalls mit einem geeigneten Adjuvans oder Vektor einem Tier, wie zum Beispiel einem Säugetier, zum Beispiel einem Kaninchen oder einer Maus, und auch einem Menschen verabreicht wird, wobei die Immunantwort die Form einer stimulierenden T-Zellantwort innerhalb des behandelten Tieres, wie eines Menschen, annimmt. Alternativ kann das „aktive Fragment“ auch verwendet werden, um eine T-Zellantwort in vitro zu induzieren.
Wie in dieser Kontext verwendet, beziehen sich die Begriffe „Teil“, „Segment“ und „Fragment“, wenn sie in Bezug auf Polypeptide verwendet werden, auf eine fortlaufende Sequenz von Resten, so wie Aminosäurereste, die eine Untergruppe einer größeren Sequenz bilden. Zum Beispiel würden die Oligopeptide, die dadurch entstehen, wenn z. B. ein Polypeptid mit einer beliebigen der üblich verwendeten Endopeptidasen, wie beispielsweise Trypsin oder Chymotrypsin, behandelt wird, Teile, Segmente oder Fragmente der Ausgangspolypeptide darstellen. Wenn sie in Bezug auf Polynukleotide verwendet werden, beziehen sich diese Begriffe auf Produkte, die durch die Behandlung von besagten Polynukleotiden mit einer beliebigen Endonuklease erhalten werden.
In Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „prozentuale Identität“ oder „prozentual identisch“ in Bezug auf eine Sequenz, dass eine Sequenz mit einer beanspruchten oder beschriebenen Sequenz nach einem Alignment der zu vergleichenden Sequenz (die „Vergleichssequenz“) mit der beschriebenen oder beanspruchten Sequenz (die „Referenzsequenz“) verglichen wird. Die prozentuale Identität wird dann entsprechend der folgenden Formel bestimmt: $Prozentuale Identit \ddot{a} t = 100 [I - (C / R)]$
wobei C die Anzahl der Unterschiede zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz über die Länge des Alignments zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz ist, wobei

(i) jede Base oder Aminosäure in der Referenzsequenz, die keine korrespondierende Base oder Aminosäure in der Vergleichssequenz hat, und
(ii) jeder Gap in der Referenzsequenz und
(iii) jede Base oder Aminosäure in der Referenzsequenz, die sich von der alignten Base oder Aminosäure in der Vergleichssequenz unterscheidet und
(iiii) das Alignment muss an Position 1 der alignten Sequenzen beginnen;

Wenn ein Alignment zwischen der Referenzsequenz und der Vergleichssequenz besteht, für welches die prozentuale Identität, wie oben berechnet wird, gleich oder größer als eine spezifizierte minimale prozentuale Identität ist, dann besitzt die Vergleichssequenz die spezifizierte minimale prozentuale Identität zu der Referenzsequenz, auch wenn es Alignments geben mag, in denen die oben berechnete prozentuale Identität geringer als die spezifizierte prozentuale Identität ist.
Wie vorstehend erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung somit ein Peptid bereit, das eine Sequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 oder einer Variante davon ausgewählt ist, die zu 88% homolog zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 ist, oder einer Variante davon, die T-Zellen induzieren wird, mit dem Peptid kreuzzureagieren. Die Peptide der Erfindung weisen die Fähigkeit auf, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder verlängerter Versionen der Peptide zu Klasse-II zu binden.
In der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff „homolog“ auf den Grad der Identität (siehe prozentuale Identität oben) zwischen den Sequenzen von zwei Aminosäuresequenzen, d. h. Peptid oder Polypeptid-Sequenzen. Die zuvor erwähnte „Homologie“ wird durch den Vergleich von zwei Sequenzen, die unter optimalen Bedingungen auf die Sequenzen ausgerichtet sind, die verglichen werden müssen. Solch eine Sequenzhomologie kann durch das Bilden eines Alignments unter Benutzung von, zum Beispiel, dem ClustalW-Algorithmus, errechnet werden. Allgemein erhältliche Sequenzanalysesoftware, spezifischer, Vector NTI, GENETYX oder andere Tools werden durch öffentliche Datenbanken zur Verfügung gestellt.
Ein Fachmann wird in der Lage sein, zu beurteilen, ob die T-Zellen, die durch eine Variante eines spezifischen Peptids induziert wurden, in der Lage sind, mit dem Peptid selbst kreuzzureagieren(Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).
Unter einer „Variante“ einer vorgegebenen Aminosäuresequenz verstehen die Erfinder, dass zum Beispiel die Seitenketten von einem oder zwei der Aminosäurereste in einer Weise verändert sind (zum Beispiel durch ihren Austausch durch die Seitenkette des Restes einer anderen natürlich vorkommenden Aminosäure oder einer anderen Seitenkette), so dass das Peptid immer noch in derselben Weise wie das Peptid bestehend aus der vorgegebenen Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:1 bis SEQ ID NO: 226 an ein HLA-Molekül binden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid so modifiziert werden, dass es die Fähigkeit, mit der Bindungsfurche eines geeigneten MHC-Moleküls, wie HLA-A*2 oder -DR, zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert, und auf diese Weise die Fähigkeit, mit dem TCR aktivierter T-Zellen zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert.
Diese T-Zellen können anschließend mit den Zellen kreuzreagieren und Zellen töten, die ein Polypeptid exprimieren, welches die natürliche Aminosäuresequenz des verwandten Peptides, wie in den Aspekten der Erfindung definiert, enthält. Wie aus der wissenschaftlichen Literatur und den Datenbanken (Godkin et al., 1997; Rammensee et al., 1999) entnommen werden kann, sind bestimmte Positionen der HLA-bindenden Peptiden typischerweise Ankerreste, die eine Kernsequenz passend zu dem Bindungsmotiv des HLA-Rezeptors bilden, der durch polare, elektrophysikalische, hydrophobe und räumliche Eigenschaften der Polypeptidketten, die die Bindungsfurche bilden, definiert ist. So wäre ein Fachmann in der Lage, die Aminosäuresequenzen, die in den SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO 226 dargelegt sind, durch Beibehalten der bekannten Ankerreste zu modifizieren, und wäre in der Lage, zu bestimmen, ob solche Varianten die Fähigkeit behalten, an MHC-Klasse-I oder Il-Moleküle zu binden. Die Varianten der vorliegenden Erfindung behalten die Fähigkeit, an den TCR aktivierter T-Zellen zu binden, welches anschließend mit Zellen, die ein Polypeptid mit der natürlichen Aminosäuresequenz des verwandten Peptides exprimieren, kreuzreagieren und sie töten kann, wie in den Aspekten der Erfindung definiert ist.
Die ursprünglichen (nicht-modifizierten) Peptide, wie hier offenbart, können durch Substitution einer oder mehrerer Resten an verschiedenen, möglicherweise selektiven Stellen innerhalb der Peptidkette modifiziert werden, solange es nicht anderweitig beschrieben ist. Vorzugsweise befinden sich diese Substitutionen am Ende der Aminosäurekette. Solche Substitutionen können konservativer Natur sein, zum Beispiel dergestalt, dass eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlicher Struktur und Eigenschaften ersetzt wird, so wie eine hydrophobe Aminosäure durch eine andere hydrophobe Aminosäure ersetzt wird. Noch konservativer wäre eine Ersetzung von Aminosäuren mit derselben oder ähnlichen Größe und chemischen Natur, wie beispielsweise wenn Leucin durch Isoleucin ersetzt wird. In Studien zu Sequenzvariationen in Familien von natürlich vorkommenden homologen Proteinen werden bestimmte Aminosäuresubstitutionen öfter als andere toleriert, und diese zeigen oftmals eine Korrelation mit Ähnlichkeiten in Größe, Ladung, Polarität und Hydrophobizität zwischen den originalen Aminosäuren und deren Ersetzungen, und dies ist die Basis für die Definition von „konservativen Substitutionen“.
Konservative Substitutionen werden hier als Austausch innerhalb einer der folgenden fünf Gruppen definiert: Gruppe 1 - kleine aliphatische, nicht polare oder leicht polare Reste (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Gruppe 2 - polare, negativ geladene Reste und deren Amide (Asp, Asn, Glu, Gln); Gruppe 3 - polare, positiv geladene Reste (His, Arg, Lys); Gruppe 4 - große, aliphatische, unpolare Reste (Met, Leu, Ile, Val, Cys); und Gruppe 5 - große, aromatische Reste (Phe, Tyr, Trp).
Weniger konservative Substitutionen können die Ersetzung einer Aminosäure durch eine andere, die ähnliche Eigenschaften, aber gewisse Unterschiede in der Größe hat, beinhalten, solche wie eine Ersetzung eines Alaninrestes durch einen Isoleucinrest. Hoch nicht-konservative Ersetzungen können die Substitutionen einer sauren Aminosäure durch eine polare oder sogar eine basische Säure einschließen. Solche „radikalen“ Substitutionen können jedoch nicht als potentiell nicht effiziente verworfen werden, weil die chemischen Wirkungen nicht vollständig vorhersagbar sind, und die radikalen Substitutionen wohl zufällige Wirkungen verursachen könnten, die sonst nicht ausgehend aus den einfachen Gesetzen der Chemie vorhersagbar sind.
Solche Substitutionen können natürlich andere Strukturen einschließen, die sich von den weit verbreiteten L-Aminosäuren unterscheiden. So können die D-Aminosäuren durch die L-Aminosäuren ersetzt werden, die üblicherweise in den antigenen Peptiden der Erfindung vorkommen, und immer noch von der Offenbarung umfasst werden. Darüber hinaus können Nicht-Standardaminosäuren (d.h. andere als die üblichen natürlich vorkommenden proteinogenen Aminosäuren) auch zu Substitutionszwecken verwendet werden, um Immunogene und immunogene Polypeptide gemäß der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Wenn Substituierungen auf mehr als einer Position, wie es gefunden wurde, zu einem Peptid mit einer überwiegend äquivalenten oder größerer antigenen Wirksamkeit, wie es unten definiert wird, führen, so werden die Kombinationen von diesen Substituierungen getestet, um zu bestimmen, ob die Kombinationen zur additiven oder synergetischen Wirkung in Bezug auf die Antigenität des Peptides führen. Maximal werden nicht mehr als 4 Positionen innerhalb des Peptids gleichzeitig substituiert.
Ein Peptid, das im Wesentlichen aus der im vorliegenden Kontext angegebenen Aminosäuresequenz besteht, kann eine oder zwei Nicht-Anker-Aminosäuren (siehe unten bezüglich des Ankermotivs) austauschen, ohne dass die Fähigkeit, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) der Klassen-I oder -II zu binden, im Vergleich zum nicht modifizierten Peptid wesentlich verändert oder negativ beeinflusst wird. In einer weiteren Ausführungsform, in einem Peptid, das im Wesentlichen aus der im vorliegenden Kontext angegebenen Aminosäuresequenz besteht, können eine oder zwei Aminosäuren mit ihren konservativen Austauschpartnern (siehe den Kontext unten) ausgetauscht werden, ohne dass die Fähigkeit, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder -II zu binden, im Vergleich zum nicht-modifizierten Peptid wesentlich verändert oder negativ beeinflusst wird.

Die Aminosäurereste, die nicht substantiell zu der Wechselwirkung mit dem T-Zellrezeptor beitragen, können durch Substitution mit einer weiteren Aminosäure, deren Aufnahme die T-Zellreaktivität nicht substantiell beeinflusst und die Bindung an das relevante MHC nicht verhindert, modifiziert werden. So kann das Peptid gemäß der Erfindung, abgesehen von der angegebenen Bedingung, jedes Peptid (wobei die Erfinder in diesen Begriff auch Oligopeptide oder Polypeptide einschließen), welches die Aminosäuresequenz oder einen Teil oder eine Variante davon enthält, wie angegeben sein. Tabelle 6: Varianten und Motive der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung entsprechend SEQ ID No. 2, 12, 31, 166 und 211

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 2	K	V	M	P	K	Q	T	W	K
Variante		L
		L							Y
		L							R
		L							F
		I
		I							Y
		I							R
		I							F
		M
		M							Y
		M							R
		M							F
									Y
									R
									F
		T
		T							Y
		T							R
		T							F

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 12	K	V	L	T	R	N	I	E	Y
Variante		L							K
		L
		L							R
		L							F
		I							K
		I
		I							R
		I							F
		M							K
		M
		M							R
		M							F
									K
									R
									F
		T							K
		T
		T							R
		T							F

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 31	H	A	F	F	P	K	T	H	R
Variante		L							K
		L							Y
		L
		L							F
		I							K
		I							Y
		I
		I							F
		M							K
		M							Y
		M
		M							F
		V							K
		V							Y
		V
		V							F
		T							K
		T							Y
		T
		T							F

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 166	K	V	I	A	P	G	V	I	Y
Variante		L							K
		L
		L							R
		L							F
		I							K
		I
		I							R
		I							F
		M							K
		M
		M							R
		M							F
									K
									R
									F
		T							K
		T
		T							R
		T							F

Position	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SEQ ID No 211	V	S	L	G	T	P	I	M	K
Variante		L
		L							Y
		L							R
		L							F
		I
		I							Y
		I							R
		I							F
		M
		M							Y
		M							R
		M							F
		V
		V							Y
		V							R
		V							F
		T
		T							Y
		T							R
		T							F

Längere (verlängerte) Peptide können auch geeignet sein. Es ist möglich, dass die MHC-Klasse-I-Epitope, obwohl sie in der Regel zwischen 8 und 11 Aminosäuren lang sind, durch Peptidprozessierung von längeren Peptiden oder Proteinen, die das tatsächliche Epitop umfassen, erzeugt werden. Es ist bevorzugt, dass die Reste, die das tatsächliche Epitop flankieren, Reste sind, die die proteolytische Spaltung, die notwendig ist, um das tatsächliche Epitop während der Prozessierung auszusetzen, nicht wesentlich beeinflussen.

Die Peptide der Erfindung können um bis zu vier Aminosäuren verlängert werden, d. h. 1, 2, 3 oder 4 Aminosäuren können an jeweiligem Ende in beliebiger Kombination zwischen 4:0 und 0:4 hinzugefügt werden. Kombinationen der Verlängerungen gemäß der Erfindung sind in Tabelle 7 zu finden. Tabelle 7: Kombinationen der Verlängerungen der erfindungsgemäßen Peptide

C-Terminus	N-Terminus
4	0
3	0 oder 1
2	0 oder 1 oder 2

C-Terminus	N-Terminus
1	0 oder 1 oder 2 oder 3
0	0 oder 1 oder 2 oder 3 oder 4
N-Terminus	C-Terminus
4	0
3	0 oder 1
2	0 oder 1 oder 2
1	0 oder 1 oder 2 oder 3
0	0 oder 1 oder 2 oder 3 oder 4

Die Aminosäuren für die Verlängerung / Erweiterung können die Peptide der ursprünglichen Sequenz des Proteins oder jeder anderen Aminosäure(n) sein. Die Verlängerung kann verwendet werden, um die Stabilität oder Löslichkeit der Peptide zu erhöhen.
So können die Epitope der vorliegenden Erfindung identisch zu den natürlich vorkommenden tumorassoziierten oder tumorspezifischen Epitopen sein, oder sie können Epitope beinhalten, die sich in nicht mehr als vier Resten von dem Referenzpeptid unterscheiden, solange sie eine substanziell identische Aktivität besitzen.
In einer alternativen Ausführungsform wird das Peptid auf einer oder beiden Seiten um mehr als 4 Aminosäuren verlängert, vorzugsweise auf eine Gesamtlänge von bis zu 30 Aminosäuren. Dies kann zu MHC-Klasse-II-bindenden Peptiden führen. Die Bindung an die MHC-Klasse-II kann mit den in der Technik bekannten Verfahren geprüft werden.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung Peptide und Varianten von Epitopen der MHC-Klasse-I zur Verfügung, wobei das Peptid oder die Variante eine Gesamtlänge zwischen 8 und 100, bevorzugt zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 14, und zwar 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 Aminosäuren, im Falle der verlängerten Klasse II-Bindungspeptide kann die Länge auch 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 oder 22 Aminosäuren betragen, aufweist.
Natürlich wird das Peptid oder die Variante gemäß der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit aufweisen, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder II zu binden. Die Bindung eines Peptides oder einer Variante an den MHC-Komplex kann mit im Stand der Technik bekannten Verfahren getestet werden.
Es wird bevorzugt, wenn die für ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung spezifischen T-Zellen gegen die substituierten Peptide getestet werden, dass die Konzentration des Peptides, bei der die substituierten Peptide eine Hälfte des maximalen Anstiegs der Lyse in Relation zum Hintergrund erreichen, nicht mehr als ca. 1 mM, bevorzugterweise nicht mehr als ca. 1 µM, bevorzugter nicht mehr als ca. 1 nM und noch bevorzugter nicht mehr als ca. 100 pM und am meisten bevorzugt nicht mehr als ca. 10 pM beträgt. Es wird auch bevorzugt, dass die substituierten Peptide von den T-Zellen von mehr als einem, mindestens von zwei und bevorzugter von drei Individuen, erkannt werden.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform der Erfindung, in der das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 besteht oder essentiell besteht.
„Besteht essentiell aus“ soll bedeuten, dass ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch zusätzlich zu der Sequenz entsprechend einer der SEQ ID NO: 1 bis zu SEQ ID NO: 226 oder einer Variante davon weitere N- und/oder C-terminal lokalisierte Abschnitte von Aminosäuren enthalten kann, die nicht unbedingt einen Teil des Peptids bilden, welches als Epitop für die MHC-Molekülepitope dient.
Gleichwohl können diese Abschnitte wichtig sein, um eine effiziente Einführung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in die Zellen zu ermöglichen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid ein Teil eines Fusionsproteins, welches zum Beispiel die 80 N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten unveränderlichen Kette (p33, im Folgenden „Ii“) umfasst, wie sie von der NCBI, GenBank Zugangsnummer X00497, zu erhalten ist. In anderen Fusionen können die Peptide der vorliegenden Erfindung mit einem Antikörper, wie im vorliegenden Kontext beschrieben, oder einem funktionellen Teil davon, insbesondere mit einer Sequenz eines Antikörpers, fusioniert werden, um von dem Antikörper spezifisch angegriffen zu werden, oder zum Beispiel mit oder in einen Antikörper, der spezifisch für dendritische Zellen ist, wie im vorliegenden Kontext beschrieben.
Zusätzlich kann das Peptid oder die Variante weiter modifiziert werden, um die Stabilität und/oder die Bindung an die MHC-Moleküle, um eine verstärkte Immunantwort hervorzurufen, zu verbessern. Methoden für eine solche Optimierung einer Peptidsequenz sind im Stand der Technik gut bekannt und umfassen beispielsweise die Einführung von umgekehrten (reversen) Peptid-Bindungen oder nicht-Peptidbindungen.
In einer reversen Peptidbindung sind die Aminosäurereste nicht über eine peptidische Bindung (-CO-NH-) verbunden, sondern die Peptidbindung ist in umgekehrter Reihenfolge. Solche retro-inverso Peptidomimetika können durch Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel so wie beschrieben in Meziere et al (Meziere et al., 1997), welches durch Referenz eingeschlossen ist. Dieser Ansatz beinhaltet die Herstellung von Pseudopeptiden, die zwar Änderungen im Rückgrat beinhalten, aber nicht in der Orientierung der Seitenketten. Meziere et al.(Meziere et al., 1997) zeigen, dass diese Pseudopeptide für die MHC-Bindung und T-Helferzellantworten nützlich sein können. Retro-inverso-Peptide, die NH-CO-Bindungen anstelle von CO-NH-Peptidbindungen besitzen, sind gegenüber der Proteolyse erheblich resistenter.
Eine nicht-peptidische Bindung kann zum Beispiel, -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, - CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- und -CH₂SO- sein. US-Patent 4,897,445 stellt ein Verfahren für die Festphasensynthese von nicht-Peptid-Bindungen (-CH₂-NH) in Polypeptid-Ketten bereit, welches die Synthese der Polypeptide durch Standardverfahren und die Synthese der nicht-Peptidbindung durch Reaktion eines Amino-Aldehyds und einer Aminosäure in Gegenwart von NaCNBH₃ umfasst.
Peptide, die die oben beschriebenen Sequenzen umfassen, können mit zusätzlichen chemischen Gruppen an ihren Amino- und/oder Carboxy-Termini synthetisiert werden, um die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder Affinität der Peptide zu erhöhen. Beispielsweise können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl oder t-Butyloxycarbonyl-Gruppen an die Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Ebenso kann eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe an die Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Zusätzlich kann eine hydrophobe Gruppe, t-Butyloxycarbonyl oder eine Amidogruppe an die Carboxytermini der Peptide hinzugefügt werden.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Peptide synthetisiert werden, um ihre sterische Konfiguration zu ändern. Beispielsweise kann das D-Isomer eines oder mehrerer der Aminosäurereste des Peptids verwendet werden, anstatt des üblichen L-Isomers. Noch weiter kann wenigstens eine der Aminosäurereste der Peptide der Erfindung durch eine der wohlbekannten nicht-natürlich vorkommenden Aminosäurereste substituiert werden. Änderungen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, Bioverfügbarkeit und/oder die Bindungsverhalten der Peptide der Erfindung zu erhöhen.
In ähnlicher Weise kann ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine Variante durch eine Reaktion spezifischer Aminosäuren entweder vor oder nach der Synthese des Peptids chemisch verändert werden. Beispiele für solche Modifikationen sind in der Technik gut bekannt und werden beispielsweise in der Arbeit von R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004) zusammengefasst, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird. Chemische Modifikation von Aminosäuren umfasst, ist aber nicht beschränkt auf, Modifikationen durch Acylierung, Amidierung, Pyridoxylierung von Lysin, reduktive Alkylierung, Trinitrobenzylierung von Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS), Amidmodifikation von Carboxylgruppen und Sulphydrylmodifikationen durch die Oxidation von Cystein zu Cysteinsäure, die Bildung von Quecksilberderivaten, die Bildung von gemischten Disulfiden mit anderen Thiolverbindungen, die Reaktion mit Maleimid, Carboxymethylierung mit lodessigsäure oder lodoacetamid und Carbamoylierung mit Cyanat bei alkalischem pH, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein. In dieser Hinsicht wird der Fachmann für eine weitergehende Methodologie zur chemischen Modifikation von Proteinen auf Kapitel 15 in Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995)verwiesen.
Kurz ausgedrückt, basiert die Modifikation von z. B. Arginylresten in Proteinen häufig auf der Reaktion von vicinalen Dicarbonylverbindungen wie Phenylglyoxal, 2,3-Butandion und 1,2-Cyclohexandion, um ein Addukt zu bilden. Ein anderes Beispiel ist die Umsetzung von Methylglyoxal mit Argininresten. Cystein kann ohne gleichzeitige Modifikation von anderen nukleophilen Stellen wie Lysin und Histidin modifiziert werden. Als Ergebnis ist eine große Anzahl von Reagenzien für die Modifikation von Cystein vorhanden. Die Webseiten von Unternehmen wie Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) stellen Informationen zu spezifischen Reagenzien zu Verfügung.
Die selektive Reduktion von Disulfidbindungen ist ebenso verbreitet. Disulfidbindungen können während der Wärmebehandlung von Biopharmazeutika gebildet und oxidiert werden. Woodward-Reagenz K kann verwendet werden, um spezifische Glutaminsäurereste zu modifizieren. N-(3-(Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid kann verwendet werden, um intramolekulare Vernetzungen zwischen einem Lysinrest und einem Glutaminsäurerest zu bilden. Zum Beispiel ist Diethylpyrocarbonat ein Reagenz für die Modifizierung von Histidylresten in Proteinen. Histidin kann auch unter Verwendung von 4-Hydroxy-2-Nonenal modifiziert werden. Die Reaktion der Lysinreste und anderer α-Amino-Gruppen ist beispielsweise für die Bindung von Peptiden an Oberflächen oder die Vernetzung (cross-linking) von Proteinen / Peptiden nützlich. Lysin ist die Stelle der Bindung von Poly(ethylen)glykol und die bedeutendste Stelle der Modifikation bei der Glykosylierung von Proteinen. Methioninreste in Proteinen können zum Beispiel mit lodacetamid, Bromethylamin und Chloramine T modifiziert werden.
Tetranitromethan und N-Acetylimidazol können für die Modifikation von Tyrosylresten verwendet werden. Eine Vernetzung durch die Bildung von Dityrosin kann mit Wasserstoffperoxid / Kupferionen erreicht werden.
Neuere Studien zur Modifizierung von Tryptophan haben N-Bromsuccinimid, 2-Hydroxy-5-nitrobenzylbromid oder 3-Brom-3-methyl-2-(2-nitrophenylmercapto)-3H-indol (BPNs-Skatol) verwendet.
Erfolgreiche Modifizierung von therapeutischen Proteinen und Peptiden mit PEG wird oft mit einer Verlängerung der Kreislaufhalbwertszeit assoziiert, während die Vernetzung von Proteinen mit Glutaraldehyd, Polyethylenglykoldiacrylat und Formaldehyd zur Herstellung von Hydrogelen verwendet wird. Eine chemische Modifizierung von Allergenen für die Immuntherapie wird oft durch Carbamylierung mit Kaliumcyanat erreicht.
Ein Peptid oder eine Variante, wobei das Peptid ist modifiziert oder enthält nicht-peptidische Bindungen, ist eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein nicht natürlich vorkommendes Peptid, wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 besteht oder im Wesentlichen besteht und synthetisch hergestellt (z. B. synthetisiert) als pharmazeutisch akzeptables Salz ist. Verfahren für die synthetische Herstellung von Peptiden sind im Stand der Technik wohlbekannt. Die Salze der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung unterscheiden sich erheblich von den Peptiden in ihrem Zustand/ihren Zuständen in vivo, da die Peptide, die erzeugt werden, in vivo nicht als Salze vorliegen. Die nicht-natürliche Salzform des Peptids vermittelt die Löslichkeit des Peptids, insbesondere im Zusammenhang mit pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Peptide umfassen, z. B. die im vorliegenden Kontext offenbarten Peptidimpfstoffe. Eine ausreichende und zumindest wesentliche Löslichkeit des/der Peptide(s) ist erforderlich, um die Peptide dem zu behandelnden Patienten effizient einzuführen. Vorzugsweise handelt es sich bei den Salzen um pharmazeutisch annehmbare Salze der Peptide. Diese Salze gemäß der Erfindung umfassen Alkali- und Erdalkalisalze, wie zum Beispiel Salze der Hofmeister-Reihe, welche folgende Anionen: PO₄ ^3-, SO₄ ^2-, CH₃COO^-, Cl^-, Br, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^- und folgende Kationen NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ und Ba²⁺ umfassen. Insbesondere werden Salze aus (NH₄)₃PO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, NH₄CH₃COO, NH₄Cl, NH₄Br, NH₄NO₃, NH₄ClO₄, NH₄I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb₄CH₃COO, Rb₄Cl, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄ClO₄, Rb₄I, Rb₄SCN, K₃PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH₃COO, KCl, KBr, KNO₃, KClO₄, Kl, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCI, NaBr, NaNO₃, NaClO₄, Nal, NaSCN, ZnCl₂ Cs₃PO₄, Cs₂HPO₄, CsH₂PO₄, Cs₂SO₄, CsCH₃COO, CsCl, CsBr, CsNO₃, CsClO₄, Csl, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, Li₂SO₄, LiCH₃COO, LiCl, LiBr, LiNO₃, LiClO₄, Lil, LiSCN, Cu₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCl₂, MgBr₂, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, Mgl₂, Mg(SCN)₂, MnCl₂, Ca₃(P0₄)₂ Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCI2, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, CaI₂, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCl₂, BaBr₂, Ba(NO₃)₂, Ba(ClO₄)₂, BaI₂ und Ba(SCN)₂ ausgewählt. Insbesondere bevorzugt sind NH-Azetat, MgCl₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCI, NaCI und CaCl₂, wie zum Beispiel Chlorid- oder Azetat- (Trifluoracetat) Salze.
Im Allgemeinen können Peptide und Varianten (zumindest die, die zwischen den Aminosäureresten Peptidbindungen besitzen) durch den Fmoc-Polyamid-Modus der Festphasenpeptidsynthese, wie durch Lukas et al. (Lukas et al., 1981) und den dort aufgeführten Referenzen offenbart, synthetisiert werden. Die N-amino-Gruppen werden zwischenzeitlich durch die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc) geschützt. Wiederholte Abspaltung dieser höchst basenlabilen Schutzgruppe wird mit einer 20%-igen Lösung von Piperidin in N, N-Dimethylformamid durchgeführt. Seitenkettenfunktionalitäten können als ihre Butylether geschützt werden (im Fall von Serin, Threonin und Tyrosin), Butylester (im Fall von Glutaminsäure und Aspartamsäure), Butyloxycarbonylderivat (im Fall von Lysin und Histidin), Tritylderivat (im Fall von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-Trimethylbenzenesulphonylderivat (im Fall von Arginin). Wenn Glutamin oder Asparagin die C-terminalen Reste sind, wird die 4,4'-Dimethoxybenzhydryl-Gruppe als Schutzgruppe für die Seitenkettenfunktionalitäten verwendet. Die Festphase basiert auf einem Polydimethyl-Acrylamid-Polymer, der aus den drei Monomeren besteht: Dimethylacrylamid (Rückgrat-Monomer), Bisacryloylethylendiamin (cross linker, Quervernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (Funktionalisierungsmittel). Als abspaltbarer Linker zwischen Peptid und Harz wird ein säurelabiles 4-Hydroxymethyl-phenoxyessigsäurederivat benutzt. Alle Aminosäurederivate, mit der Ausnahme von Asparagin und Glutamin, die über eine reverse N, N-Dicyclohexyl-carbodiimid/1-hydroxybenzotriazol vermittelte Kupplung eingesetzt werden, werden als vorgeformtes symmetrisches Anhydridderivat eingesetzt. Alle Kupplungs- und Entschützungsschritte werden mit Ninhydrin, Trinitrobenzensulfonsäure oder Isotin überwacht. Nach der Fertigstellung der Synthese werden die Peptide bei gleichzeitiger Entfernung der Schutzgruppen an den Seitenketten durch Verwendung von 95% Trifluoressigsäure, die eine 50% Mischung aus Radikalfängern enthält, vom Harz abgespalten. Die normalerweise verwendeten Radikalfänger enthalten Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser, wobei die genaue Wahl von der Zusammensetzung der Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptides abhängt. Es können weiterhin auch Kombinationen von Festphasensynthese und Verfahren für die Synthese von Peptiden in Lösung verwendet werden (siehe, zum Beispiel, (Bruckdorfer et al., 2004) und die dort zitierten Referenzen).
Trifluoressigsäure wird durch Vakuumdestillation entfernt, das rohe Peptid wird durch anschließende Ausfällung mit Diethylether erhalten. Alle vorhandenen Radikalfänger werden durch einfache Extraktion entfernt, die nach Lyophlisierung der wässrigen Phase die rohen Peptide in radikalfängerfreier Form liefert. Die Reagenzien für die Peptidsynthese sind im Allgemeinen z. B. von Calbiochem-Novabiochem (Nottingham Großbritannien), zu erhalten.
Die Aufreinigung kann durch Anwendung einer Technik oder einer Kombination mehrerer Techniken, wie zum Beispiel Rückkristallisation, Gelpermeationschromatographie (GPC), lonenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie (Hydrophobie Interaction Chromatography, HIC) und (normalerweise) Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Acetonitril/Wassergradienten durchgeführt werden.
Die Analyse der Peptide kann durch Dünnschichtchromatographie, Elektrophorese, im Besonderen Kapillarelektrophorese, Festphasenextraktion (CSPE), Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse und durch Fast-Atom-Bombardment (FAB) Massenspektrometrie sowie durch MALDI und ESI-Q-TOF massenspektrometrische Analyse erfolgen.
Um überpräsentierte Peptide zu selektieren, wird ein Präsentationsprofil berechnet, das die Medianprobenpräsentation sowie die Replikationsvariation zeigt. Das Profil stellt Proben der interessierenden Tumorentität einer Basislinie von normalen Gewebeproben gegenüber. Jedes dieser Profile kann durch die Berechnung des p-Wertes eines linearen gemischten Models (Pinheiro et al., 2015), das für mehrere Tests mit False Discovery Rate (Benjamini and Hochberg, 1995) (vgl. Beispiel 1, ) angepasst wurde, zu einem Überpräsentationswert zusammengezogen werden.
Für die Identifizierung und relative Quantifizierung von HLA-Liganden mittels Massenspektrometrie wurden HLA-Moleküle aus schockgefrorenen Gewebeproben gereinigt und HLA-assoziierte Peptide isoliert. Die isolierten Peptide wurden getrennt und die Sequenzen wurden durch Online-Nano-Elektrosprüh-Ionisation (nanoESI) Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Experimente identifiziert. Die resultierenden Peptidsequenzen wurden durch den Vergleich des Fragmentierungsmusters natürlicher tumorassoziierter Peptide (TUMAPs), die aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinomproben (N = 152 Proben) stammen mit den Fragmentierungsmustern entsprechender synthetischer Referenzpeptide gleicher Sequenz verifiziert. Da die Peptide direkt als Liganden von HLA-Molekülen von Primärtumoren identifiziert wurden, liefern diese Ergebnisse direkte Hinweise auf die natürliche Verarbeitung und Präsentation der identifizierten Peptide auf primärem Krebsgewebe, das von 151 Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom erhalten wurde.
Die Discovery-Pipeline XPRESIDENT® v2.1 (siehe z. B. US 2013-0096016 , die hiermit als Referenz in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird) ermöglicht die Identifizierung und Auswahl relevanter überpräsentierter Peptidimpfstoffkandidaten auf der Grundlage der direkten relativen Quantifizierung von HLA-beschränkten Peptidwerten auf Krebsgewebe im Vergleich zu mehreren verschiedenen nicht-kanzerösen Geweben und Organen. Dies wurde durch die Entwicklung einer markierungsfreien differentiellen Quantifizierung unter Verwendung der gewonnenen LC-MS-Daten erreicht, die von einer proprietären Datenanalysepipeline verarbeitet werden, die Algorithmen zur Sequenzidentifikation, Spektralclusterung, lonenzählung, Retentionszeitausrichtung, Ladezustandsdekonvolution und Normalisierung kombiniert.
Es wurden Präsentationsebenen mit Fehlerschätzungen für jedes Peptid und jede Probe ermittelt. Es wurden Peptide identifiziert, die ausschließlich auf Tumorgewebe präsentiert werden und Peptide, die im Tumor im Vergleich zu nicht-krebsartigen Geweben und Organen überpräsentiert werden.
HLA-Peptidkomplexe aus den Gewebeproben von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom wurden gereinigt und HLA-assoziierte Peptide isoliert und mit LC-MS analysiert (siehe Beispiel 1). Alle in der vorliegenden Anwendung enthaltenen TUMAPs wurden mit diesem Ansatz bei akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom identifiziert, was deren Präsentation bei akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphozytischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Kopf- und Halsplattenzellkarzinom, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs, Plattenepithelkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom bestätigt.
TUMAPs, die bei multipler akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom und im Normalgewebe identifiziert wurden, wurden durch lonenzählung von markierungsfreien LC-MS-Daten quantifiziert. Das Verfahren geht davon aus, dass LC-MS-Signalbereiche eines Peptids mit seiner Häufigkeit in der Probe korrelieren. Alle quantitativen Signale eines Peptids in verschiedenen LC-MS-Experimenten wurden basierend auf der zentralen Tendenz normiert, pro Probe gemittelt und zu einem Balkendiagramm, dem sogenannten Präsentationsprofil, zusammengeführt. Das Präsentationsprofil konsolidiert verschiedene Analysemethoden wie Proteindatenbank-Suche, Spektral-Clustering, Ladezustandsdekonvolution (Decharging) und Retentionszeitausrichtung und Normalisierung.
Neben der Überpräsentation des Peptids wurde auch die mRNA-Expression des zugrunde liegenden Gens getestet. mRNA-Daten wurden durch RNASeq-Analysen von normalem Gewebe und Krebsgewebe gewonnen (vgl. Beispiel 2, ). Eine weitere Quelle für Normalgewebedaten war eine Datenbank mit öffentlich zugänglichen RNA-Expressionsdaten von rund 3000 Normalgewebeproben (Lonsdale, 2013). Peptide, welche von Proteinen ableitet sind, deren kodierende mRNA im Krebsgewebe stark exprimiert wird, aber in lebenswichtigen normalen Geweben sehr niedrig oder nicht vorhanden ist, wurden vorzugsweise in die vorliegende Erfindung aufgenommen.
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide zur Verfügung, die bei der Behandlung von Krebs/Tumoren nützliche sind, vorzugsweise von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutterkrebs und Endometriumkarzinom, die die Peptide der Erfindung überpräsentieren oder ausschließlich präsentieren. Zu diesen Peptiden wurde durch Massenspektrometrie nachgewiesen, dass sie von HLA-Molekülen auf natürliche Weise auf menschlicher akuter myeloischer Leukämien, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich präsentiert werden, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutterkrebs- und Endometriumkarzinomproben präsentiert werden.
Viele der Ausgangsgene/Proteine (auch als „Volllängenproteine“ oder „zugrunde liegende Proteine“ bezeichnet), aus denen die Peptide gewonnen werden, erwiesen sich bei Krebs im Vergleich zu normalen Geweben als stark überexprimiert - „Normalgewebe“ im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet entweder gesunde Blutzellen, Zellen von Blutgefäßen, Gehirn, Herz, Leber, Lunge, Nebenniere, Gallenweg, Blase, Knochenmark, Speiseröhre, Gallenblase, Dickdarm, Dünndarm, Niere, Lymphknoten, peripherer Nerv, Bauchspeicheldrüse, Haut, Rückenmark, Milz, Magen, Schilddrüse, Luftröhre oder andere normale Gewebezellen, die einen hohen Grad an Tumorassoziation der Quellgene aufweisen (siehe Beispiel 2). Darüber hinaus sind die Peptide selbst stark überrepräsentiert auf Tumorgewebe - „Tumorgewebe“ im Zusammenhang mit dieser Erfindung bedeutet eine Probe eines Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, aber nicht auf normalen Geweben (siehe Beispiel 1).
HLA-gebundene Peptide können durch das Immunsystem, spezifisch durch T-Lymphozyten erkannt werden. T-Zellen können die Zellen zerstören, die den erkannten HLA/Peptidkomplex präsentieren, z. B. die Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, welche die abgeleiteten Peptide präsentieren.
Es wurde gezeigt, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, T-Zell-Antworten zu stimulieren und/oder überrepräsentiert sind und können daher für die Herstellung von Antikörpern und/oder TCRs, wie beispielsweise lösliche TCRs, nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe Beispiel 3, Beispiel 4). Darüber hinaus können die Peptide, wenn sie mit dem jeweiligen MHC einen Komplex bilden, auch für die Herstellung von Antikörpern und/oder TCRs, insbesondere sTCRs, gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann gut bekannt und können auch in der entsprechenden Literatur (siehe auch unten) gefunden werden. Somit sind die Peptide der vorliegenden Erfindung für die Erzeugung einer Immunantwort in einem Patienten nützlich, durch welche Tumorzellen zerstört werden können. Eine Immunantwort in einem Patienten kann durch eine direkte Verabreichung der beschriebenen Peptide oder durch geeignete Vorläufersubstanzen (z. B. verlängerte Peptide, Proteine oder Nukleinsäuren, die diese Peptide kodieren) an den Patienten, im Idealfall in Kombination mit einem Stoff, welcher die Immunogenität erhöht (d. h. eine Adjuvans) induziert werden. Es kann erwartet werden, dass die Immunantwort, die von einer solchen therapeutischen Vakzinierung ausgeht, sehr spezifisch gegen Tumorzellen ist, da die Ziel-Peptide der vorliegenden Erfindung nicht auf normalen Geweben in vergleichbaren Kopienzahl präsentiert werden, was der Gefahr einer unerwünschten Autoimmunreaktion gegen normale Zellen in dem Patienten vorbeugt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner T-Zellrezeptoren (TCRs) umfassend eine alpha-Kette und eine beta-Kette („alpha/beta-TCRs“). Ebenfalls bereitgestellt werden Peptide gemäß der Erfindung, die in der Lage sind, an TCRs und Antikörper zu binden, wenn sie von einem MHC-Molekül präsentiert werden.
Die vorliegende Beschreibung betrifft auch Fragmente der TCRs gemäß der Erfindung, die in der Lage sind, an ein Peptidantigen gemäß der vorliegenden Erfindung zu binden, wenn sie von einem HLA-Molekül präsentiert werden. Der Begriff bezieht sich insbesondere auf lösliche TCR-Fragmente, z. B. TCRs, welchen die Transmembranteile und/oder konstanten Bereiche fehlen, einkettige TCRs und deren Fusionen, z. B. mit Ig. Die vorliegende Beschreibung betrifft auch Nukleinsäuren, Vektoren und Wirtszellen zur Expression von TCRs und Peptiden der vorliegenden Beschreibung; und Verfahren zu deren Verwendung.
Der Begriff „T-Zell-Rezeptor“ (abgekürzt TCR) bezieht sich auf ein heterodimeres Molekül, das eine alpha-Polypeptidkette (alpha-Kette) und eine beta-Polypeptidkette (beta-Kette) umfasst, worin der heterodimere Rezeptor in der Lage ist, an ein Peptidantigen zu binden, das durch ein HLA-Molekül präsentiert wird. Der Begriff umfasst auch sogenannte Gamma/Delta-TCRs.
In einer Ausführungsform stellt die Beschreibung ein Verfahren zur Herstellung eines wie vorliegend beschriebenen TCRs bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle umfasst, die in der Lage ist, die TCRs unter Bedingungen zu exprimieren, die dafür geeignet sind, die Expression dieser TCRs zu fördern.
Die Beschreibung betrifft in einem weiteren Aspekt Verfahren gemäß der Beschreibung, wobei das Antigen auf MHC-Moleküle der Klasse I oder II geladen wird, die auf der Oberfläche einer geeigneten antigenpräsentierenden Zelle oder einer künstlichen antigenpräsentierenden Zelle exprimiert werden, indem eine ausreichende Menge des Antigens mit einer antigenpräsentierenden Zelle in Kontakt gebracht wird, oder das Antigen auf Tetramere der MHC-Klasse-I oder II durch Tetramerisierung von Monomeren der Antigen/Klasse I oder II MHC-Komplexe geladen wird.
Die alpha- und beta-Ketten von alpha/beta-TCRs und die gamma- und delta-Ketten von gamma/delta-TCRs werden im Allgemeinen als jeweils zwei „Domänen“ angesehen, nämlich variable und konstante Domänen. Die variable Domäne besteht aus einer Verkettung von variabler Region (V) und Verbindungsregion (J). Die variable Domäne kann auch eine Signalsequenz (L, leader) beinhalten. Beta- und delta-Ketten können auch eine Diversitätsregion (D) beinhalten. Die alpha- und beta-konstante Domänen können auch C-terminale Transmembrandomänen (TM) beinhalten, die die alpha- und beta-Ketten an der Zellmembran verankern.
In Bezug auf gamma/delta-TCRs bezieht sich der im vorliegenden Kontext verwendete Begriff „TCR-gamma-variable-Domäne“ auf die Verkettung der TCR-gamma-V-(TRGV)-Region ohne Leader-Abschnitt (L) und der TCR-gamma-J-(TRGJ)-Region, und der Begriff TCR-gamma-konstante-Domäne bezieht sich auf die extrazelluläre TRGC-Region oder auf eine C-terminal trunkierte TRGC-Sequenz. Ebenso bezieht sich der Begriff „TCR-delta-variable Domäne“ auf die Verkettung der TCR-delta-V (TRDV)-Region ohne Leader-Abschnitt (L) und der TCR-delta-D/J (TRDD/TRDJ)-Region, und der Begriff „TCR-delta-konstante Domäne“ bezieht sich auf die extrazelluläre TRDC-Region oder auf eine C-terminal trunkierte TRDC-Sequenz.
TCRs der vorliegenden Beschreibung binden bevorzugt an einen Peptid-HLA-Molekülkomplex mit einer Bindungsaffinität (KD) von ungefähr 100 µM oder weniger, ungefähr 50 µM oder weniger, ungefähr 25 µM oder weniger, oder ungefähr 10 µM oder weniger. Noch bevorzugter sind TCRs mit hoher Affinität, die Bindungsaffinitäten von ungefähr 1 µM oder weniger, ungefähr 100 nM oder weniger, ungefähr 50 nM oder weniger, ungefähr 25 nM oder weniger aufweisen. Rein beispielhaft liegen die bevorzugten Bereiche der Bindungsaffinität von TCRs der vorliegenden Erfindung bei ungefähr 1 nM bis ungefähr 10 nM; ungefähr 10 nM bis ungefähr 20 nM; ungefähr 20 nM bis ungefähr 30 nM; ungefähr 30 nM bis ungefähr 40 nM; ungefähr 40 nM bis ungefähr 50 nM; ungefähr 50 nM bis ungefähr 60 nM; ungefähr 60 nM bis ungefähr 70 nM; ungefähr 70 nM bis ungefähr 80 nM; ungefähr 80 nM bis ungefähr 90 nM; and ungefähr 90 nM bis ungefähr 100 nM.
Wie vorliegend in Verbindung mit TCRs der vorliegenden Beschreibung verwendet, werden die Begriffe „spezifische Bindung“ und grammatikalische Varianten davon mit der Bedeutung verwendet, dass sie ein TCR bezeichnen, der eine Bindungsaffinität (KD) für einen Peptid-HLA-Molekülkomplex von 100 µM oder weniger aufweist.
Alpha/beta heterodimere TCRs der vorliegenden Beschreibung können eine eingeführte Disulfidbindung zwischen ihren konstanten Domänen aufweisen. Bevorzugte TCRs dieses Typs sind solche, die eine TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und eine TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne aufweisen, mit der Ausnahme, dass Thr 48 von TRAC und Ser 57 von TRBC1 oder TRBC2 durch Cysteinreste ersetzt sind, wobei die Cysteine eine Disulfidbindung zwischen der TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und der TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne des TCR bilden.
Mit oder ohne die oben erwähnte eingeführte Zwischenkettenbindung können alpha/beta-heterodimere TCRs der vorliegenden Beschreibung eine TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und eine TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne aufweisen, und die TRAC-Sequenz der konstanten Domäne und die TRBC1- oder TRBC2-Sequenz der konstanten Domäne des TCR können durch die native Disulfidbindung zwischen Cys4 des Exons 2 des TRAC und Cys2 des Exons 2 des TRBC1 oder TRBC2 verbunden sein.
TCRs der vorliegenden Beschreibung können einen nachweisbaren Marker umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radionuklid, einem Fluorophor und Biotin. TCRs der vorliegenden Beschreibung können mit einem therapeutisch wirksamen Mittel, wie beispielsweise einem Radionuklid, einem Chemotherapeutikum oder einem Toxin, konjugiert werden.
In einer Ausführungsform weist ein TCR der vorliegenden Beschreibung mit mindestens einer Mutation in der alpha-Kette und/oder mit mindestens einer Mutation in der beta-Kette eine modifizierte Glykosylierung im Vergleich zum nicht mutierten TCR auf.
In einer Ausführungsform weist ein TCR, der mindestens eine Mutation in der TCR-alpha Kette und/oder die TCR-beta Kette umfasst, eine Bindungsaffinität für und/oder eine Bindungshalbwertszeit für einen Peptid-HLA-Molekülkomplex auf, die mindestens das Doppelte derer eines TCRs, der die nicht mutierte TCR-alpha-Kette und/oder die nicht mutierte TCR-beta-Kette umfasst, ist. Die Affinitätsverbesserung tumorspezifischer TCRs und ihre Nutzung beruht auf der Existenz eines Fensters für optimale TCR-Affinitäten. Das Vorhandensein eines solchen Fensters basiert auf Beobachtungen, dass TCRs, die spezifisch für zum Beispiel HLA-A3-restringierte Krankheitserreger sind, KD-Werte aufweisen, die im Allgemeinen etwa 10-mal niedriger sind, als TCRs, die spezifisch für zum Beispiel HLA-A3-restringierte tumorassoziierte Selbstantigene sind. Inzwischen ist bekannt, dass Tumorantigene zwar das Potenzial haben, immunogen zu sein, da Tumore aus den eigenen Zellen entstehen, nur mutierte Proteine oder Proteine mit veränderter translationaler Prozessierung vom Immunsystem als fremd angesehen werden. Hochregulierte oder überexprimierte Antigene (sogenannte Selbstantigene) lösen nicht unbedingt eine funktionelle Immunantwort gegen den Tumor aus: T-Zellen, die TCRs exprimieren, die gegenüber diesen Antigenen hochreaktiv sind, wurden im Thymus in einem Prozess, der als zentrale Toleranz bekannt ist, negativ ausgewählt, so dass nur T-Zellen mit niedrigaffinen TCRs für Selbstantigene übrig bleiben. Daher kann die Affinität von TCRs oder Varianten der vorliegenden Beschreibung zu Peptiden durch in der Technik bekannte Verfahren erhöht werden.
Die vorliegende Beschreibung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zur Identifizierung und Isolierung eines TCR gemäß der vorliegenden Beschreibung, wobei das Verfahren das Inkubieren von PBMCs aus - vorzugsweise - HLA-A*03-negativen gesunden Spendern mit A3/Peptidmonomeren, das Inkubieren der PBMCs mit Tetramer-Phycoerythrin (PE) und das Isolieren der hochaviden T-Zellen durch Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-Calibur-Analyse umfasst.
Die vorliegende Beschreibung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren und Isolieren eines TCR gemäß der vorliegenden Beschreibung, wobei das Verfahren das Erhalten einer transgenen Maus mit dem gesamten menschlichen TCRαβ Genlocus (1,1 und 0,7 Mb) umfasst, deren T-Zellen ein vielfältiges humanes TCR-Repertoire exprimieren, das den Maus-TCR-Mangel kompensiert, Immunisieren der Maus mit einem Peptid , Inkubieren des PBMCs aus den transgenen Mäusen mit Tetramer-Phycoerythrin (PE) und Isolieren der hochaviden T-Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS)-Calibur-Analyse.
In einem Aspekt werden zur Gewinnung von T-Zellen, die TCRs der vorliegenden Beschreibung exprimieren, Nukleinsäuren, die für TCR-alpha- und/oder TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung kodieren, in Expressionsvektoren wie gamma-Retrovirus oder -Lentivirus kloniert. Die rekombinanten Viren werden generiert und anschließend auf ihre Funktionalität wie Antigenspezifität und funktionelle Avidität getestet. Ein Aliquot des Endprodukts wird dann verwendet, um die Ziel-T-Zellpopulation (im Allgemeinen aus PBMCs von Patienten gereinigt) zu transformieren, die vor der Infusion in den Patienten expandiert wird.
In einem weiteren Aspekt, um T-Zellen zu erhalten, die TCRs der vorliegenden Beschreibung exprimieren, werden TCR-RNAs durch in der Technik bekannte Techniken synthetisiert, z. B. in vitro Transkriptionssysteme. Die in vitro-synthetisierten TCR-RNAs werden dann in primäre CD8+ T-Zellen eingebracht, die von gesunden Spendern durch Elektroporation gewonnen werden, um tumorspezifische TCR-alpha- und/oder TCR-beta-Ketten erneut zu exprimieren.
Um die Expression zu steigern, können Nukleinsäuren-kodierende TCRs der vorliegenden Beschreibung operativ mit starken Promotern verlinkt werden, wie zum Beispiel retroviralen langen terminalen Sequenzwiederholungen (LTRs), Zytomegalovirus (CMV), Mausstammzellvirus (MSCV) U3, Phosphoglyzeratkinase (PGK), β-Aktin, Ubiquitin, und einem zusammengesetzten Promoter des Affenvirus 40 (SV40) / CD43, Elongationsfaktor (EF)-1a und dem Promoter von Spleen [Milz] Focus-Forming Virus (SFFV). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Promotor für die exprimierte Nukleinsäure heterolog.
Zusätzlich zu starken Promotern können TCR-Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung zusätzliche Elemente enthalten, welche die Expression von Transgenen verstärken können, einschließlich einem zentralen Polypurintrakt (cPPT), welcher die nukleäre Translokation von lentiviralen Konstrukten fördert(Follenzi et al., 2000) und dem posttranskriptionalen regulatorischen Element des Woodchuck Hepatitis Virus (wPRE), welches das Niveau der transgenen Expression erhöht, indem es die RNA-Stabilität erhöht (Zufferey et al., 1999).
Die alpha- und beta-Ketten eines TCRs der vorliegenden Erfindung können durch Nukleinsäuren kodiert werden, die sich in separaten Vektoren befinden oder können durch Polynukleotide kodiert werden, die sich im selben Vektor befinden.
Um eine hochgradige TCR-Oberflächenexpression zu erreichen, müssen sowohl die TCR-alpha- als auch die TCR-beta-Ketten des eingeführten TCRs auf hohem Niveau transkribiert werden. Dazu können die TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten der vorliegenden Beschreibung in einem einzigen Vektor in bi-cistronische Konstrukte kloniert werden, der nachweislich in der Lage ist, dieses Hindernis zu überwinden. Die Verwendung einer viralen intraribosomalen Eintrittsstelle (IRES) zwischen den Ketten TCR-alpha und TCR-beta führt zur koordinierten Expression beider Ketten, da die Ketten TCR-alpha und TCR-beta aus einem einzigen Transkript erzeugt werden, das während der Translation in zwei Proteine zerlegt wird, wodurch sichergestellt wird, dass ein gleiches Molverhältnis von TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten erzeugt wird (Schmitt et al., 2009).
Nukleinsäuren, die für TCRs der vorliegenden Beschreibung kodieren, können mit Codon optimiert werden, um die Expression aus einer Wirtszelle zu erhöhen. Eine Redundanz im genetischen Code ermöglicht es, dass einige Aminosäuren durch mehr als ein Kodon kodiert werden, aber bestimmte Kodons sind aufgrund der relativen Verfügbarkeit von passenden tRNAs sowie anderen Faktoren weniger „optimal“ als andere(Gustafsson et al., 2004). Die Modifikation der TCR-alpha und TCR-beta, Gensequenzen, so dass jede Aminosäure durch das optimale Codon für die Genexpression von Säugetieren kodiert wird, sowie die Beseitigung von mRNA-Instabilitätsmotiven oder kryptischen Spleißstellen, hat sich als signifikante Verbesserung der Genexpression von TCR-alpha und TCR-beta erwiesen (Scholten et al., 2006).
Darüber hinaus kann ein Mispairing zwischen der eingeführten und der endogenen TCR-Kette zum Erwerb von Spezifitäten führen, die ein erhebliches Risiko für die Autoimmunität darstellen. So kann beispielsweise die Bildung von gemischten TCR-Dimeren die Anzahl der CD3-Moleküle reduzieren, die für die Bildung von richtig gekoppelten TCR-Komplexen zur Verfügung stehen, und somit die funktionelle Avidität der Zellen, die das eingeführte TCR exprimieren, deutlich verringern (Kuball et al., 2007).
Um Mispairing zu reduzieren, kann die C-Terminus-Domäne der eingeführten TCR-Ketten der vorliegenden Beschreibung modifiziert werden, um die Affinität zwischen den Ketten zu fördern und gleichzeitig die Fähigkeit der eingeführten Ketten zur Kopplung mit dem endogenen TCR zu verringern. Diese Strategien können das Ersetzen der humanen TCR-alpha- und TCR-beta-C-Terminus-Domänen durch ihre murinen Gegenstücke (murinisierte C-Terminus-Domäne) beinhalten; das Erzeugen einer zweiten Interchain-Disulfidbindung in der C-Terminus-Domäne durch Einbringen eines zweiten Cysteinrestes sowohl in die TCR-alpha- als auch in die TCR-beta-Ketten der eingeführten TCR (Cysteinmodifikation); Vertauschen von interagierenden Resten in den C-Terminus-Domänen der TCR-alpha- und TCR-beta-Kette („knob-in-hole“); und Verschmelzen der variablen Domänen der TCR-alpha- und TCR-beta-Ketten direkt zu CD3ζ (CD3ζ Fusion) (Schmitt et al., 2009).
In einer Ausführungsform ist eine Wirtszelle dafür konstruiert worden, einen TCR der vorliegenden Beschreibung zu exprimieren. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Wirtszelle eine menschliche T-Zelle oder ein T-Zell-Vorläufer. In einigen Ausführungsformen wird die T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem Krebspatienten gewonnen. In einigen Ausführungsformen wird die T-Zelle oder T-Zell-Vorläufer von einem gesunden Spender gewonnen. Wirtszellen der vorliegenden Beschreibung können im Hinblick auf einen zu behandelnden Patienten allogen oder autolog sein. In einer Ausführungsform ist der Wirt eine gamma/delta-T-Zelle, die transformiert wurde, um ein alpha/beta-TCR zu exprimieren.
Eine „pharmazeutische Zusammensetzung“ ist eine Zusammensetzung, die sich zur Verabreichung an einen Menschen in einem medizinischen Zusammenhang eignet. Vorzugsweise ist eine pharmazeutische Zusammensetzung steril und wird nach GMP-Richtlinien hergestellt.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen die Peptide entweder in der freien Form oder in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes (siehe auch oben). Wie hier verwendet, bezieht sich „ein pharmazeutisch akzeptables Salz“ auf ein Derivat der offenbarten Peptide, wobei das Peptid durch Herstellung von Säure- oder Basensalzen des Agents modifiziert ist. Zum Beispiel werden Säuresalze aus der freien Base (typischerweise wenn die neutrale Form des Wirkstoffes eine neutrale -NH2-Gruppe aufweist) unter der Einbeziehung der Reaktion mit einer geeigneten Säure hergestellt. Geeignete Säuren zur Herstellung von Säuresalzen schließen sowohl organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Glycolsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Apfelsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Salicylsäure und ähnliche Säuren, als auch anorganische Säuren, wie z. B. Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und ähnliche, ein. Umgekehrt, werden Präparationen basischer Salze der sauren Reste, die in einem Peptid vorhanden sein können, unter Verwendung von pharmazeutisch akzeptablen Basen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Calciumhydroxid, Trimethylamin oder ähnlichen, hergestellt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Peptide als Salze der Essigsäure (Acetate), Trifluoracetate oder der Salzsäure (Chloride).
Bevorzugt ist das Medikament der vorliegenden Erfindung ein Immuntherapeutikum, so wie ein Vakzin. Es kann dem Patienten direkt in das betroffene Organ oder systemisch i.d., i.m., s.c., i.p. und i.v. verabreicht werden oder auch ex vivo an Zellen angewandt werden, die vom Patienten oder einer menschlichen Zelllinie abstammen und dem Patienten anschließend verabreicht werden, oder es wird in vitro benutzt, um eine Subpopulation der Immunzellen, die aus dem Patienten gewonnen wurden, auszuwählen, die dem Patienten dann rückverabreicht werden. Wenn die Nukleinsäure den Zellen in vitro verabreicht wird, kann es für die Zellen nützlich sein, transfiziert zu sein, damit sie immunstimulierende Zytokine, wie zum Beispiel Interleukin-2, coexprimieren. Das Peptid kann im Wesentlichen rein sein oder es wird mit einem immunstimuliernden Adjuvans (siehe unten) kombiniert oder es wird in Kombination mit immunstimulierenden Zytokinen verwendet oder es wird mit einem geeigneten Abgabesystem, wie zum Beispiel Liposomen, eingesetzt. Das Peptid kann auch an einen geeigneten Träger befestigt werden, beispielsweise an Napfschnecken-Hämocyanin (KLH) oder Mannan (siehe WO 95/18145 und (Longenecker et al., 1993)). Das Peptid kann auch markiert sein, ein Fusionsprotein oder ein Hybridmolekül sein. Von den Peptiden, deren Sequenz in der vorliegenden Erfindung angegeben ist, wird erwartet, dass sie CD4 oder CD8 T-Zellen stimulieren. Jedoch ist die Stimulierung von CD8 T-Zellen in Anwesenheit von Hilfe durch CD4 T-Helferzellen effektiver. Somit stellen für MHC-Klasse-I-Epitope, die CD8 T-Zellen stimulieren, die Fusionspartner oder Teile eines geeigneten Hybridmoleküls Epitope bereit, die CD4-positive T-Zellen stimulieren. Die CD4- und CD8-stimulierende Epitope sind im Stand der Technik wohl bekannt und beinhalten diejenigen, die in der vorliegenden Erfindung identifiziert wurden.
Bei einem Aspekt umfasst das Vakzin mindestens ein Peptid, welches die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 aufgeführt ist, aufweist und zumindest ein weiteres Peptid, bevorzugt zwei bis 50, weiter bevorzugt zwei bis 25, noch weiter bevorzugt 2 bis 20 und am meisten bevorzugt zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht, neun, zehn, elf, zwölf, dreizehn, vierzehn, fünfzehn, sechzehn, siebzehn oder achtzehn Peptide enthält. Das Peptid /die Peptide können von einem oder mehreren spezifischen TAAs erhalten werden und können an MHC Klasse-I-Moleküle binden.
Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt eine Nukleinsäure (beispielsweise ein Polynukleotid), welche ein erfindungsgemäßes Peptid oder eine Variante des Peptides kodiert. Die Nukleinsäure kann, zum Beispiel, DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon, entweder einzel- und/oder doppelsträngig oder native oder stabilisierte Formen von Polynukleotiden, so wie, zum Beispiel, Polynukleotide mit einem Phosphorothioat-Rückgrat sein, und sie kann oder kann keine Introne enthalten, solange sie das Peptid kodiert. Natürlich können nur Peptide, die natürlich vorkommende Aminosäurereste enthalten, die wiederum über natürliche Peptidbindungen verbunden sind, durch ein Polynukleotid kodiert werden. Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Eine Vielzahl von Verfahren wurde entwickelt, um Polynukleotide, speziell DNA, zum Beispiel durch komplementäre klebrige Enden (complementary cohesive termini) an Vektoren zu binden. Zum Beispiel können komplementäre Homopolymer-Abschnitte an das DNA-Segment hinzugefügt werden, um in die Vektor-DNA eingefügt zu werden.
Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären homopolymerischen Enden zusammengehalten und formen so rekombinante DNA-Moleküle.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsstellen enthalten, stellen ein alternatives Verfahren zum Verknüpfen des DNA-Segmentes und Vektoren dar. Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Endonukleaserestriktionsstellen enthalten, sind aus einer Anzahl von Quellen einschließlich der International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, USA, kommerziell erhältlich.
Ein wünschenswertes Verfahren, die DNA, die das Polypeptid gemäß der Erfindung kodiert, zu modifizieren, ist die Verwendung der Polymerasekettenreaktion, wie sie von Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988)) offenbart wurde. Dieses Verfahren kann dazu verwendet werden, die DNA in einen geeigneten Vektor einzuführen, zum Beispiel durch gentechnische Veränderung an geeigneten Restriktionsstellen, oder es kann dazu verwendet werden, die DNA auf andere nützliche Arten zu modifizieren, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Falls virale Vektoren verwendet werden, so sind Pocken- oder Adenovirusvektoren bevorzugt.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA) kann dann in einem geeigneten Wirt exprimiert werden, um ein Polypeptid enthaltend ein Peptid oder ein Variante gemäß der Erfindung zu produzieren. Somit kann die DNA, die das Peptid oder eine Variante gemäß der Erfindung kodiert, entsprechend den bekannten Techniken verwendet werden, in Hinblick auf die hier enthaltene Lehre entsprechend modifiziert, um einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann dazu verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren und zu produzieren. Solche Techniken umfassen zum Beispiel die Offenbarten in den US-Patenten mit den Nummern: 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 und 4,810,648.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA), die das Polypeptid, welches eine Verbindung gemäß der Erfindung darstellt, kodiert, kann an eine Vielzahl verschiedener anderer DNA-Sequenzen gebunden werden, um in einen geeigneten Wirt eingeführt zu werden. Die Begleit-DNA ist von der Art des Wirts, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und davon, ob episomale Erhaltung oder Integration erwünscht ist, abhängig.
Im Allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie ein Plasmid, in der richtigen Orientierung und dem korrekten Leseraster für die Expression insertiert. Wenn notwendig, kann die DNA an eine geeignete nukleotidische Transkriptions- und Translationsregulierungssequenz gebunden werden, die durch den gewünschten Wirt erkannt wird, auch wenn solche Regulierungen im Allgemeinen in dem Expressionsvektor vorhanden sind. Der Vektor wird dann mit Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Daher wird es notwendig sein, die transformierten Wirtszellen auszuwählen. Eine Selektionstechnik beinhaltet den Einbau in den Expressionsvektor einer DNA-Sequenz, die die notwendigen regulatorischen Elemente enthält und die das genetische Merkmal in der transformierten Zelle, wie zum Beispiel Antibiotikaresistenz, kodiert.
Alternativ kann das Gen für solch eine auswählbare Eigenschaft ein anderer Vektor sein, der verwendet wird, um die gewünschte Wirtszelle gleichzeitig zu transformieren.
Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA transformiert wurden, werden dann für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, in Hinblick auf die Lehre der vorliegenden Offenbarung kultiviert, um die Expression des Polypeptides zu ermöglichen, welches dann gewonnen werden kann.
Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bakterien (zum Beispiel E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (zum Beispiel Aspergillus spec.), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen.
Vorzugsweise kann das System aus Säugetierzellen wie z. B. CHO-Zellen bestehen, die bei der ATCC Cell Biology Collection erhältlich sind.
Ein typisches Säugetierzellvektorplasmid für die konstitutive Expression umfasst die CMV oder SV40 Promoter mit einem geeigneten Poly-A-Schwanz und einem Resistenzmarker, so wie Neomycin. Ein Beispiel ist pSVL, welches über Pharmacia, Piscataway, NJ, USA erhältlich ist. Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, welcher auch über Pharmacia erhältlich ist. Nützliche Hefeplasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS413-416 und sind grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefe-integrierende Plasmide (Yeast Integrating Plasmids = Ylps) und schließen die Hefe-selektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3 ein. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefezentromerplasmide (Yeast Centromere plasmids = YCps). CMV-Promotor-basierende Vektoren (zum Beispiel von Sigma-Aldrich) stellen transiente oder stabile Expression, zytoplasmatische Expression oder Sekretion und N-terminale oder C-terminale Markierung in verschiedenen Kombinationen von FLAG, 3xFLAG, c-myc oder MAT bereit. Diese Fusionsproteine erlauben einen Nachweis, eine Aufreinigung und Analyse des rekombinanten Proteins. Dual-markierte Fusionen sorgen für Flexibilität bei der Erkennung
Die starke humane Cytomegalovirus (CMV)-Promotor-Regulationsregion verstärkt die konstitutiven Niveaus der Proteinexpressions bis auf 1 mg/L in COS-Zellen. Bei weniger potenten Zelllinien beträgt das Proteinniveau typischerweise -0,1 mg/L. Die Gegenwart des SV40-Replikationsursprungs führt zu hohen Konzentrationen in der DNA-Replikation von SV40 replikationspermissiven COS-Zellen. CMV-Vektoren können zum Beispiel pMB1 (Derivat von pBR322) Ursprung für die Replikation in Bakterienzellen enthalten, das b-Lactamase-Gen für die Selektion der Ampicillinresistenz in Bakterien, hGH-PolyA und den f1-Ursprung. Vektoren, die die Preprotrypsinleader (PPT)-Sequenz enthalten, können die Sekretion der FLAG-Fusionsproteine in das Kulturmedium für die Aufreinigung unter Verwendung von Anti-FLAG-Antikörpern, Harzen und Platten steuern. Andere Vektoren und Expressionssysteme sind für den Gebrauch mit einer Vielzahl von Wirtszellen aus dem Stand der Technik gut bekannt.
In einer weiteren Ausführungsform werden zwei oder mehr Peptide oder Peptidvarianten der Erfindung kodiert und damit in einer aufeinanderfolgenden Reihenfolge exprimiert (ähnlich den Konstrukten „Beads on a string“). Dabei können die Peptide oder Peptidvarianten durch Abschnitte von Linker-Aminosäuren, wie z. B. LLLLLL, miteinander verknüpft oder fusioniert werden oder ohne zusätzliche Peptide zwischen ihnen verknüpft werden. Diese Konstrukte können auch für die Krebstherapie eingesetzt werden und können Immunantworten auslösen, die sowohl MHC-I als auch MHC-II betreffen.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine mit einem Polynukleotidvektorkonsturkt gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterienzellen können unter bestimmten Umständen die bevorzugten prokaryotischen Wirtszellen sein und sind typischerweise ein Stamm von E. coli, wie zum Beispiel der E. Coli Stamm DH5, erhältlich über Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, und RR1, erhältlich über die American Type Culture Collection (ATCC) aus Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen beinhalten Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen, bevorzugt Wirbeltierzellen, wie zum Beispiel die der Maus, Ratte, Affe oder menschliche Fibroblasten- und Darmzelllinien. Hefewirtszellen schließen YPH499, YPH500 und YPH501 ein, die grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich sind. Bevorzugte Säugetierzellen enthalten Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO), zu erhalten über das ATCC als CCL61, NIH Embryozellen der Swiss-Mäuse NIH/3T3, zu erhalten über das ATCC als CRL 1658, von Affennieren erhaltene COS-1 Zellen, zu erhalten über das ATCC als CRL 1650, und 293-Zellen, welche embryonale menschliche Nierenzellen sind. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf9-Zellen, die mit Expressionsvektoren des Baculovirus transfiziert werden können. Eine Übersicht über die Wahl einer geeigneten Wirtszelle für die Expression kann zum Beispiel in dem Buch von Paulina Balbäs und Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,“ Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, und anderer, dem Fachmann bekannten Literatur, entnommen werden.
Die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt wird typischerweise durch sehr gut bekannte Verfahren, die üblicherweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen, erreicht. Bezüglich der Transformation prokaryotischer Wirtszellen siehe z. B. Cohen et al. (Cohen et al., 1972) Und (Green and Sambrook, 2012). Die Transformation von Hefezellen wird in Sherman et al. (Sherman et al., 1986) beschrieben. Das Verfahren von Beggs (Beggs, 1978) ist auch nützlich. In Bezug auf Wirbeltierzellen gibt es einige für die Transfektion solcher Zellen nützliche Reagenzien, wie zum Beispiel Kalziumphosphat und DEAE-Dextran oder liposomale Formulierungen, die über Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA zu erhalten sind. Elektroporation ist auch nützlich, um Zellen zu transformieren und/oder zu transfizieren, und ist im Stand der Technik für die Transformation von Hefezellen, Bakterienzellen, Insektenzellen und Wirbeltierzellen gut bekannt.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch wohlbekannte Techniken, wie beispielsweise PCR, identifiziert werden. Alternativ kann die Anwesenheit des Proteins in dem Überstand unter Verwendung von Antikörpern detektiert werden.
Dem Fachmann ist es selbstverständlich, dass bestimmte erfindungsgemäße Wirtszellen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefe, und Insektenzellen für die Herstellung von erfindungsgemäßen Peptiden nützlich sind. Jedoch können auch andere Wirtszellen für bestimmte therapeutische Verfahren nützlich sein. Zum Beispiel können Antigen-präsentierende Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, nützlich dazu verwendet werden, die erfindungsgemäßen Peptide so zu exprimieren, dass sie in geeignete MHC-Moleküle beladen werden. Deshalb stellt die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure oder einen Expressionsvektor entsprechend der Erfindung bereit.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Wirtszelle eine Antigen-präsentierende Zelle, insbesondere eine dendritische Zelle oder eine Antigen-präsentierende Zelle. APCs, die mit einem rekombinanten Fusionsprotein beladen sind, das Prostata-Säure-Phosphatase (PAP) enthält, wurden am 29. April 2010 von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zur Behandlung des asymptomatischen oder minimal symptomatischen metastatischen HRPC (Sipuleucel-T) zugelassen (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines tumorassoziierten Peptids oder seiner Varianten bereit, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle und das Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform wird das Peptid, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor der Erfindung in der Medizin verwendet. Zum Beispiel kann das Peptid oder seine Variante für eine intravenöse Injektion (i.v.), eine subkutane Injektion (s.c.), eine intradermale Injektion (i.d.), eine intraperitoneale Injektion (i.p.) oder eine intramuskuläre Injektion (i.m.) bereitgestellt werden. Bevorzugte Verfahren, die Peptide zu injizieren, umfassen s.c., i.d., i.p., i.m. und i.v. Bevorzugte Verfahren, die DNA zu injizieren, umfassen i.d., i.m., s.c., i.p. und i.v. Dosen von beispielsweise zwischen 50 µg und 1,5 mg, bevorzugt 125 µg bis 500 µg, des Peptides oder der DNA können verabreicht werden und hängen von dem jeweiligen Peptid oder der DNA ab. Dosen aus diesem Bereich wurden erfolgreich in früheren Studien verwendet (Walter et al., 2012).
Das Polynukleotid kann für die aktive Immunisierung im Wesentlichen rein oder enthaltend in einem geeigneten Vektor oder Abgabesystem verwendet werden. Die Nukleinsäure kann DNA, cDNA, PNA, RNA oder eine Kombination davon sein.
Verfahren für das Design und die Einführung solcher Nukleinsäuren sind im Stand der Technik wohlbekannt. Eine Übersicht wird z. B. durch Teufel et al. (Teufel et al., 2005) bereitgestellt. Polynukleotidimpfstoffe sind leicht herzustellen, allerdings ist die Wirkungsweise dieser Vektoren zur Induzierung einer Immunantwort nicht vollkommen verstanden. Geeignete Vektoren und Zufuhrsysteme beinhalten virale DNA und/oder RNA, solche Systeme basieren auf Adenovirus, Vacciniavirus, Retroviren, Herpesvirus, Adeno-assoziiertem Virus oder Hybriden, die Elemente von mehr als einem Virus enthalten. Nicht virale Zufuhrsysteme beinhalten kationische Lipide und kationische Polymere, wie sie im Stand der Technik für die Beförderung von DNA bekannt sind. Eine physikalische Verabreichung, wie zum Beispiel durch eine „Genkanone“ (genegun), kann auch verwendet werden. Das Peptid oder Peptide, die durch eine Nukleinsäure kodiert sind, können ein Fusionsprotein mit einem Epitop sein, das T-Zellen für das entgegengesetzte CDR, wie oben beschrieben, stimuliert.
Das Medikament der Erfindung kann auch eines oder mehrere Adjuvantien enthalten. Adjuvantien sind Substanzen, die unspezifisch die Immunantwort verstärken oder potenzieren (zum Beispiel durch CD8-positive T-Zellen, und T-Helferzellen (TH) vermittelte Immunantworten gegen ein Antigen) und werden somit als nützlich in einem Medikament der vorliegenden Erfindung angesehen. Geeignete Adjuvantien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf 1018 ISS, Aluminiumsalze, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, Flagellin oder TLR5-Liganden erhalten von Flagellin, FLT3-Ligand, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), Resiquimod, ImuFact IMP321, Interleukine wie IL-2, IL-13, IL-21, Interferon-alpha oder -beta, oder pegylierte Derivate davon, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, Monophosphoryl-Lipid A, Montanid IMS 1312, Montanid ISA 206, Montanid ISA 50V, Montanid ISA-51, Wasser-in-ÖI- und ÖI-in-Wasser-Emulsionen, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® Vectorsystem, Poly(lactid co-glycolid) [PLG]-basierende und Dextran-Mikropartikel, Talactoferrin, SRL172, Virosome und andere Virus-ähnliche Partikel, YF-17D, VEGF trap, R848, Beta-Glucan, Pam3Cys, Aquila's QS21 Stimulon, welches aus Saponin erhalten wird, Extrakte aus Mykobakterien und synthetische bakterielle Zellwandmimetika und urheberrechtlich geschützte Adjuvantien wie Ribi's Detox, Quil oder Superfos. Adjuvantien wie Freund's oder GM-CSF sind bevorzugt. Verschiedene immunologische Adjuvantien (zum Beispiel MF59), die spezifisch für dendritische Zellen sind, und deren Erzeugung wurden früher beschrieben(Allison and Krummel, 1995). Auch Zytokine können verwendet werden. Verschiedene Zytokine wurden direkt mit der Beeinflussung der Migration von dendritischen Zellen zu Lymphgeweben (zum Beispiel TNF-□), der Beschleunigung der Reifung von dendritischen Zellen in effiziente Antigen-präsentierende Zellen für T-Lymphozyten (zum Beispiel GM-CSF, IL-1 und IL-4) ( U.S. Pat. Nr. 5.849.589 ausdrücklich durch Referenz in seiner Gesamtheit aufgenommen) und der Funktion als Immunoadjuvans (beispielsweise IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alpha, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996) in Verbindung gebracht.
Es wurde auch beschrieben, dass CpG immunostimulatorische Oligonukleotide den Effekt von Adjuvantien in einer Impfstoffzusammensetzung verstärken. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, agieren CpG-Oligonukleotide durch Aktivierung des angeborenen (nicht adaptivem) Immunsystems via Toll-like Rezeptoren (TLR), vor allem TLR9. CpG-getriggerte TLR9-Aktivierung verstärkt die Antigen-spezifischen humoralen und zellulären Antworten auf eine große Vielfalt von Antigenen, enthaltend Peptid- oder Proteinantigene, lebende oder abgetötete Viren, dendritische Zellimpfstoffe, autologe Zellimpfstoffe und Polysaccharid-Konjugate sowohl in prophylaktischen als auch in therapeutischen Impfstoffen. Noch wichtiger ist, dass es die Reifung und Differenzierung der dendritischen Zellen verstärkt, was zu einer verstärkten Aktivierung der TH1-Zellen und starker Generierung von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL), auch in der Abwesenheit von CD4 T-Zellhilfe, führt. Die durch TLR9-Stimulation induzierte TH1-Prägung wird sogar in der Anwesenheit von Impfstoffadjuvantien, wie Alum oder nicht vollständigem Freundschem Adjuvans (IFA), welches normalerweise eine TH2-Prägung fördert, erhalten. CpG-Oligonukleotide zeigen eine noch größere Aktivität als Adjuvans, wenn sie mit anderen Adjuvantien formuliert oder in Formulierungen, wie Micropartikel, Nanopartikel, Lipidemulsionen oder ähnlichen Formulierungen zusammen verabreicht werden, welche besonders notwendig sind, um eine starke Antwort zu induzieren, wenn die Antigene relativ schwach sind. Sie beschleunigen auch die Immunantwort und ermöglichen es, die Dosierung des Antigens um ungefähr zwei Größenordnungen zu senken, die Antikörperantworten zu dem Volldosisimpfstoff ohne CpG sind dabei in manchen Experimenten vergleichbar ((Krieg, 2006)). Im US-Patent Nr. 6 406 705 B1 wird die kombinierte Verwendung von CpG-Oligonukleotiden, nicht-Nukleinsäure-Adjuvantien und einem Antigen beschrieben, um eine Antigen-spezifische Immunantwort zu erzeugen. Ein CpG TLR9 Antagonist ist dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) von Mologen (Berlin, Deutschland), welches ein bevorzugter Bestandteil der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung ist. Andere TLRbindende Moleküle, wie beispielsweise RNA-bindende TLR 7, TLR 8 und/oder TLR 9 können auch verwendet werden.
Andere Beispiele von nützlichen Adjuvantien enthalten, sind aber nicht limitiert auf modifizierte CpGs (beispielsweise CpR, Idera), dsRNA-Analoge wie Poly(I:C) und Derivate davon (z. B. AmpliGen®, Hiltonol®, poly(ICLC), poly(IC-R), poly(I:C12U)), nicht-CpG bakterielle DNA oder RNA sowie immunoaktive kleine Moleküle und Antikörper wie Cyclophosphamid, Sunitinib, Bevacizumab®, Celebrex, NCX-4016, Sildenafil, Tadalafil, Vardenafil, Sorafenib, Temozolomid, Temsirolimus, XL-999, CP-547632, Pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, andere Antikörper, die auf Schlüsselstrukturen des Immunsystems (z. B. anti-CD40, anti-TGFbeta, anti-TNFalpha Rezeptor) zielen, und SC58175, welche therapeutisch und/oder als ein Adjuvans wirken können. Die Mengen und Konzentrationen der Adjuvantien und Zusatzstoffe, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können durch den Fachmann einfach ohne unverhältnismäßige Experimente bestimmt werden.
Bevorzugte Adjuvantien sind anti-CD40, Imiquimod, Resiquimod, GM-CSF, Cyclophosphamid, Sunitinib, Bevacizumab, Interferon-alpha, CpG-Oligonucleotide und Derivate, poly-(I:C) und Derivate, RNA, Sildenafil und partikuläre Formulierungen mit PLG oder Virusomen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird das Adjuvans aus einer Gruppe bestehend aus koloniestimulierenden Faktoren, wie den Granulocyten-Macrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF, Sagramostim), Cyclophosphamid, Imiquimod, Resiquimod und Interferon-alpha, ausgewählt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung wird das Adjuvans aus einer Gruppe bestehend aus koloniestimulierenden Faktoren, wie den Granulocyten-Macrophagenkoloniestimulierenden Faktor (GM-CSF, Sagramostim), Cyclophosphamid, Imiquimod und Resiquimod, ausgewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung ist das Adjuvans Cyclophosphamid, Imiquimod oder Resiquimod. Noch bevorzugtere Adjuvantien sind Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poly-ICLC (Hiltonol®) und anti-CD40 mAB oder Kombinationen davon.
Diese Zusammensetzung dient der parenteralen Verabreichung, bspw. als subkutane, intradermale oder intramuskuläre oder orale Verabreichung. Dabei sind die Peptide und optional weitere Moleküle in einem pharmazeutisch akzeptablen, vorzugsweise wässrigen, Träger gelöst oder suspendiert. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung Hilfsstoffe, wie bspw. Puffer, Bindemittel, Sprengmittel, Verdünnungsmittel, Aromas, Gleitmittel etc. enthalten. Die Peptide können auch zusammen mit immunstimulierenden Substanzen, z. B. Zytokinen, verabreicht werden. Eine umfassende Darstellung von Hilfsstoffen, wie sie bei einer derartigen Zusammensetzung verwendet werden können, ist bspw. in A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Kibbe, 2000), aufgeführt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei zur Prävention, Prophylaxe und/oder Therapie von adenomatösen Erkrankungen oder Tumorerkrankungen eingesetzt werden. Beispielhafte Formulierungen können zum Beispiel in EP2113253 gefunden werden.
Es ist wichtig zu verstehen, dass die durch den Impfstoff nach der Erfindung ausgelöste Immunantwort den Krebs in verschiedenen Zellstadien und Entwicklungsstadien angreift. Darüber hinaus werden verschiedene krebsassoziierte Signalwege angegriffen. Dies ist ein Vorteil gegenüber Impfstoffen, die nur ein oder wenige Ziele ansprechen, was dazu führen kann, dass sich der Tumor leicht an den Angriff anpasst (Tumor-Escape). Außerdem zeigen nicht alle einzelnen Tumore das gleiche Muster von Antigenen. Eine Kombination mehrerer tumorassoziierter Peptide stellt daher sicher, dass jeder einzelne Tumor mindestens einen Teil der Ziele ausweist. Die Zusammensetzung ist so konzipiert, dass von jedem Tumor erwartet wird, dass er mehrere der Antigene exprimiert und mehrere unabhängige Wege abdeckt, die für das Wachstum und die Aufrechterhaltung des Tumors notwendig sind. So kann der Impfstoff problemlos „von der Stange“ für eine größere Patientenpopulation verwendet werden. Das bedeutet, dass eine Vorauswahl der mit dem Impfstoff zu behandelnden Patienten auf die HLA-Typisierung beschränkt werden kann, keine zusätzlichen Biomarker-Bewertungen für die Antigenexpression erforderlich sind, aber es ist dennoch sichergestellt, dass mehrere Ziele gleichzeitig durch die induzierte Immunantwort angegriffen werden, die für die Wirksamkeit wichtig ist (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Scaffold“ auf ein Molekül, das spezifisch an eine (z. B. antigene) Determinante bindet. In einer Ausführungsform ist ein Scaffold in der Lage, die Einheit, an die es gebunden ist (z. B. eine (zweite) Antigenbindungseinheit), an einen Zielort, z. B. an einen bestimmten Typ von Tumorzelle oder Tumorstroma mit der antigenen Determinante (z. B. den Komplex eines Peptids mit MHC, je nach Anwendung) zu leiten. In einer weiteren Ausführungsform ist ein Scaffold in der Lage, die Signalisierung durch sein Zielantigen zu aktivieren, zum Beispiel ein komplexes T-Zell-Rezeptor-Antigen. Scaffolds beinhalten, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper und Fragmente davon, Antigenbindungsdomänen eines Antikörpers, die eine variable Region der schweren Kette des Antikörpers und eine variable Region der leichten Kette des Antikörpers umfassen, Bindungsproteine, die mindestens ein sich wiederholendes Ankyrinmotiv und SDAB-Moleküle (Single Domain Antigen Binding), Aptamere, (lösliche) TCRs und (modifizierte) Zellen wie allogene oder autologe T-Zellen umfassen. Um zu beurteilen, ob ein Molekül ein Scaffold ist, das an ein Ziel bindet, können Bindungsassays durchgeführt werden.
„Spezifische“ Bindung bedeutet, dass das Scaffold den interessierenden Peptid-MHC-Komplex besser bindet als andere natürlich vorkommende Peptid-MHC-Komplexe, so dass ein Scaffold, das mit einem aktiven Molekül bewaffnet ist, das in der Lage ist, eine Zelle mit dem spezifischen Ziel zu töten, nicht in der Lage ist, eine andere Zelle ohne das spezifische Ziel, aber welche einen anderen(andere) Peptid-MHC-Komplex(e) präsentiert, zu töten. Die Bindung an andere Peptid-MHC-Komplexe ist irrelevant, wenn das Peptid des kreuzreaktiven Peptid-MHC nicht natürlich vorkommt, d.h. nicht aus dem menschlichen HLA-Peptidom stammt. Tests zur Beurteilung der Zielzelltötung sind in der Technik gut bekannt. Sie sollten mit Zielzellen (Primärzellen oder Zelllinien) mit unveränderter Peptid-MHC-Präsentation oder mit Peptiden beladenen Zellen durchgeführt werden, so dass natürlich vorkommende Protein-MHC-Niveaus erreicht werden.
Jedes Scaffold kann eine Markierung umfassen, die vorsieht, dass das gebundene Scaffold durch Bestimmen des Vorhandenseins oder Fehlens eines Signals der Markierung erkannt werden kann. So kann beispielsweise der Scaffold mit einem Fluoreszenzfarbstoff oder einem anderen geeigneten zellulären Markermolekül markiert werden. Solche Markermoleküle sind in der Technik wohlbekannt. So kann beispielsweise eine Fluoreszenzmarkierung, beispielsweise durch einen Fluoreszenzfarbstoff, eine Visualisierung des gebundenen Aptamers durch Fluoreszenz- oder Laserscanning-Mikroskopie oder Durchflusszytometrie ermöglichen.
Jedes Scaffold kann mit einem zweiten aktiven Molekül wie z. B. IL-21, Anti-CD3 und Anti-CD28 konjugiert werden.
Weitere Informationen zu Polypeptidscaffolds finden sich z. B. im Hintergrundabschnitt der WO 2014/071978A1 und den darin zitierten Referenzen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Aptamere. Aptamere (siehe z. B. WO 2014/191359 und die darin zitierte Literatur) sind kurze einzelsträngige Nukleinsäuremoleküle, die sich zu definierten dreidimensionalen Strukturen falten und spezifische Zielstrukturen erkennen können. Sie haben sich als geeignete Alternativen für die Entwicklung gezielter Therapien erwiesen. Es hat sich gezeigt, dass Aptamere selektiv an eine Vielzahl von komplexen Targets mit hoher Affinität und Spezifität binden.
Aptamere, die Zelloberflächenmoleküle erkennen, wurden in den letzten zehn Jahren identifiziert und bieten Mittel zur Entwicklung diagnostischer und therapeutischer Ansätze. Da Aptamere nachweislich nahezu keine Toxizität und Immunogenität besitzen, sind sie vielversprechende Kandidaten für biomedizinische Anwendungen. Tatsächlich wurden Aptamere, wie z. B. prostata-spezifische Membran-Antigene, die Aptamere erkennen, erfolgreich für gezielte Therapien eingesetzt und haben sich in Xenograft-in-vivo-Modellen als funktionell erwiesen. Darüber hinaus wurden Aptamere identifiziert, die spezifische Tumorzelllinien erkennen.
DNA-Aptamere können so ausgewählt werden, dass sie Breitspektrum-Erkennungseigenschaften für verschiedene Krebszellen, insbesondere solche, die von soliden Tumoren abgeleitet sind, offenlegen, während nicht-tumorgene und primär gesunde Zellen nicht erkannt werden. Erkennen die identifizierten Aptamere nicht nur einen bestimmten Tumorsubtyp, sondern interagieren mit einer Reihe von Tumoren, so sind die Aptamere als sogenannte Breitbanddiagnostika und Therapeutika einsetzbar.
Weiterhin zeigte die Untersuchung des zellbindenden Verhaltens mit der Durchflusszytometrie, dass die Aptamere sehr gute scheinbare Affinitäten zeigten, die im nanomolaren Bereich liegen.
Aptamere sind für diagnostische und therapeutische Zwecke nützlich. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass einige der Aptamere von Tumorzellen aufgenommen werden und so als molekulare Vehikel für die gezielte Abgabe von Krebsmedikamenten wie siRNA an Tumorzellen funktionieren können.
Aptamere können gegen komplexe Ziele wie Zellen und Gewebe und Komplexe der Peptide ausgewählt werden, die vorzugsweise aus einer Sequenz gemäß einer der SEQ ID NO 1 bis SEQ ID NO 226 gemäß der vorliegenden Erfindung, die mit dem MHC-Molekül vorliegt, unter Verwendung der Cell-SELEX-Technik (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) bestehen.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können zur Erzeugung und Entwicklung von spezifischen Antikörpern gegen MHC / Peptid-Komplexe verwendet werden. Diese können in der Therapie dazu verwendet werden, Toxine oder radioaktive Substanzen zu dem erkrankten Gewebe zu führen. Eine weitere Verwendung dieser Antikörper kann es sein, zu Abbildungszwecken, wie PET, Radionuklide an das erkrankte Gewebe zu führen. Diese Verwendung kann dazu beitragen, kleine Metastasen zu erkennen oder um die Größe und genaue Lokalisierung von erkrankten Geweben zu bestimmen.
Daher ist es ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörpers bereitzustellen, der spezifisch an einen menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder II bindet, der mit einem HLA-restringierten Antigen (vorzugsweise einem Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung) komplexiert ist, wobei das Verfahren umfasst: Immunisierung eines genetisch modifizierten nicht-menschlichen Säugetiers umfassend Zellen, die den menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder -II mit einer löslichen Form eines MHC-Klasse-I oder -Il-Moleküls, welches mit einem HLA-restringierten Antigen komplexiert ist, exprimieren; Isolierung von mRNA-Molekülen der antikörperproduzierenden Zellen von dem nicht-menschlichen Säugetier; Herstellung einer Phagen-Display-Bibliothek, die Proteinmoleküle, die von den mRNA-Molekülen kodiert werden, zeigen; und Isolierung von zumindest einem Phagen aus der Phagen-Display-Bibliothek, wobei der zumindest ein Phage den Antikörper zeigt, der spezifisch an den menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder -II bindet, welcher mit dem HLA-beschränkten Antigen komplexiert ist.
Es ist somit ein weiterer Aspekt der Erfindung, einen Antikörper bereitzustellen, der spezifisch an einen menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) der Klasse-I oder II bindet, der mit einem HLA-restringierten Antigen komplexiert ist, wobei der Antikörper vorzugsweise ein polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler Antikörper, ein bi-spezifischer Antikörper und/oder ein chimärer Antikörper ist.
Entsprechende Verfahren zur Herstellung solcher Antikörper und einkettiger Klasse-I-Haupthistokompatibilitätskomplexe sowie andere Werkzeuge zur Herstellung dieser Antikörper sind in WO 03/068201 , WO 2004/084798 , WO 01/72768 , WO 03/070752 und in Veröffentlichungen (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) offenbart, die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung alle ausdrücklich durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden.
Vorzugsweise bindet ein Antikörper mit einer Bindungsaffinität von unter 20 nanomolar, vorzugsweise von unter 10 nanomolar an den Komplex, was auch als „spezifisch“ im Kontext der vorliegenden Erfindung angesehen wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid, das eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226, oder eine Variante davon, die mindestens zu 88% homolog (vorzugsweise identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 oder einer Variante davon ist, die T-Zellen induziert, die mit dem Peptid kreuzreagieren, wobei das Peptid nicht das zugrunde liegende Volllängen-Polypeptid ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Peptid, das eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 oder einer Variante davon, die mindestens zu 88% homolog (vorzugsweise identisch) zu SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 ist, wobei das Peptid oder die Variante eine Gesamtlänge von zwischen 8 und 100, vorzugsweise zwischen 8 und 30, und am meisten bevorzugt zwischen 8 und 14 Aminosäuren aufweist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, die die Fähigkeit aufweisen, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-I oder -II zu binden.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz entsprechend SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 besteht, oder im Wesentlichen besteht.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid (chemisch) modifiziert ist und/oder nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die erfindungsgemäßen Peptide, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, insbesondere umfassend N-terminale Aminosäuren der HLA-DR-Antigen-assoziierten invarianten Kette (li), oder wobei das Peptid an (oder in) einen Antikörper fusioniert ist, wie zum Beispiel einen Antikörper, der spezifisch für dendritische Zellen ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Nukleinsäure, die die erfindungsgemäßen Peptide kodiert, unter der Voraussetzung, dass das Peptid nicht das komplette (vollständige) menschliche Protein ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Nukleinsäure der Erfindung, welche DNA, cDNA, PNA, RNA oder Kombinationen davon ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine erfindungsgemäße Nukleinsäure zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Medizin, insbesondere zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Wirtszelle, umfassend eine Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung oder einen Expressionsvektor gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung, die eine antigenpräsentierende Zelle und bevorzugt eine dendritische Zelle ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Peptids gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung und Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Antigen auf ein MHC-Klasse-I oder Il-Molekül beladen ist, welches an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle durch in Kontakt bringen einer ausreichenden Menge des Antigens mit der Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die antigenpräsentierende Zelle einen Expressionsvektor umfasst, der in der Lage ist, das Peptid, das SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 oder die Aminosäuresequenz der Variante enthält, zu exprimieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner aktivierte T-Zellen, die nach dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, wobei die T-Zellen selektiv eine Zelle erkennen, die ein Polypeptid exprimiert, das eine Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend jede erfindungsgemäße Aminosäuresequenz aberrant exprimieren, wobei das Verfahren die Verabreichung einer effektiven Menge von T-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung an den Patienten umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines beschriebenen Peptids, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, einer erfindungsgemäßen Zelle oder eines erfindungsgemäßen aktivierten zytotoxischen T-Lymphozyten als Medikament oder bei der Herstellung eines Medikaments. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Medikament gegen Krebs wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Medikament ein Impfstoff ist. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der Erfindung, wobei das Medikament gegen Krebs wirksam ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Krebszellen Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom oder Zellen anderer soliden oder hämatologischen Tumoren, wie akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenepithelkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner spezifische Markerproteine und Biomarker basierend auf den Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung, die im vorliegenden Kontext „Targets“ genannt werden, welche bei der Diagnostik und/oder Prognose, akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, verwendet werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung dieser neuartigen Targets zur Krebsbehandlung.
Der Begriff „Antikörper“ oder „die Antikörper“ wird hier in einem weiten Sinn verwendet und schließt sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper ein. Zusätzlich zu intakten oder „vollen“ Immunglobulinmolekülen sind unter dem Begriff „Antikörper“ auch Fragmente (z. B. CDRs, Fv-, Fab- und Fc-Fragmente) oder Polymere dieser Immunglobulinmoleküle und humanisierte Versionen von Immunglobulinmolekülen enthalten, sofern sie eine der gewünschten Eigenschaften aufweisen (z. B, spezifische Bindung an einem Marker(poly)peptid von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, Abgabe eines Toxins an eine Zelle von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, die ein Krebsmarkergen auf erhöhtem Niveau exprimiert und/oder die Aktivität eines Markerpolypeptids von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom inhibiert) gemäß der Erfindung.
Wann immer möglich, können die Antikörper der Erfindung aus kommerziellen Quellen erworben werden. Die Antikörper der Erfindung können auch unter Verwendung bekannter Verfahren erzeugt werden. Der Fachmann wird verstehen, dass entweder Volllängen-Markerpolypeptide von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom oder deren Fragmente können zur Erzeugung der Antikörper der Erfindung verwendet werden. Ein Polypeptid, das zur Erzeugung eines Antikörpers der Erfindung eingesetzt wird, kann teilweise oder vollständig aus einer natürlichen Quelle gereinigt werden oder kann unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden.
So kann beispielsweise eine cDNA, die für ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung kodiert, wie beispielsweise ein Peptid gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 Polypeptid, oder eine Variante oder ein Fragment davon, in prokaryotischen Zellen (z. B. Bakterien) oder eukaryontischen Zellen (z. B., Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen) exprimiert werden, woraufhin das rekombinante Protein gereinigt und zur Erzeugung eines monoklonalen oder polyklonalen Antikörperpräparats verwendet werden kann, das spezifisch an den Markerpolypeptid von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, das zur Erzeugung des Antikörpers gemäß der Erfindung verwendet wird.
Ein Fachmann auf dem Gebiet wird feststellen, dass die Erzeugung von zwei oder mehr unterschiedlichen Gruppen von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern die Wahrscheinlichkeit, einen Antikörper mit der Spezifität und Affinität für die beabsichtigte Verwendung (bspw. ELISA, Immunohistochemie und in vivo-Bildgebung, Immuntoxin-Therapie) zu erhalten, maximiert. Die Antikörper werden auf ihre gewünschte Aktivität durch bekannte Verfahren entsprechend dem Zweck, zu dem die Antikörper verwendet werden, getestet (bspw. ELISA, Immunohistochemie, Immuntherapie usw.; für weitere Informationen zu der Erzeugung und Prüfung von Antikörpern siehe z. B. Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). Beispielsweise können die Antikörper in ELISA-Assays oder Western-Blots, immunhistochemischer Färbung von formalinfixierten Krebserkrankungen oder gefrorenen Gewebeschnitten untersucht werden. Nach ihrer anfänglichen in vitro Charakterisierung werden für therapeutische Benutzung oder die in vivo Diagnostik bestimmte Antikörper nach bekannten klinischen Testverfahren untersucht.
Der Begriff „monoklonaler Antikörper“, wie in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf einen aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern erhaltenen Antikörper, d. h. einzelne Antikörper, die die Population umfassen, sind mit Ausnahme möglicher natürlich vorkommenden Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch. Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen insbesondere „chimäre“ Antikörper, in denen ein Teil der schweren und / oder leichten Kette identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern sind, die von einer bestimmten Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder Unterklasse angehören, während der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu entsprechenden Sequenzen in Antikörpern ist, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörperklasse oder Unterklasse gehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die erwünschte antagonistische Wirkung aufweisen ( US-Patent Nr. 4.816.567 , welches hiermit in ihrer Gesamtheit aufgenommen wird).
Monoklonale Antikörper der Erfindung können unter Verwendung von Hybridomverfahren hergestellt werden. In einem Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier typischerweise mit einem immunisierenden Mittel immunisiert, um Lymphozyten hervorzurufen, die Antikörper produzieren, oder die in der Lage sind, Antikörper zu produzieren, die spezifisch an das immunisierende Mittel binden. Alternativ dazu können die Lymphozyten in vitro immunisiert werden.
Die monoklonalen Antikörper können auch durch DNA-Rekombinationsverfahren, wie sie in dem US-Patent Nr. 4.816.567 beschrieben sind, hergestellt werden. DNA, die die monoklonalen Antikörper der Erfindung kodiert, kann unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht isoliert und sequenziert werden (z. B. durch Verwendung von Oligonukleotidsonden, die in der Lage sind, spezifisch an Gene, die die schweren und leichten Ketten muriner Antikörper kodieren, zu binden).
In-vitro-Verfahren sind auch zur Herstellung monovalenter Antikörper geeignet. Die Verdauung von Antikörpern, um Fragmente davon, insbesondere Fab-Fragmente, herzustellen, kann unter Verwendung von Routinetechniken, die im Stand der Technik bekannt sind, erreicht werden. Zum Beispiel kann die Verdauung unter Verwendung von Papain durchgeführt werden. Beispiele für die Papain-Verdauung sind in der WO 94/29348 und in dem US-Patent Nr. 4.342.566 beschrieben. Die Papain-Verdauung von Antikörpern produziert typischerweise zwei identische Antigenbindungsfragmente, genannt Fab-Fragmente, jeweils mit einer einzelnen Antigenbindungsstelle, und einem Rest-Fc-Fragment. Die Pepsin-Behandlung erzeugt ein F(ab')2-Fragment und ein pFc'-Fragment.
Die Antikörperfragmente, ob an andere Sequenzen gebunden oder nicht, können auch Insertionen, Deletionen, Substitutionen oder andere ausgewählte Modifikationen bestimmter Regionen oder spezifische Aminosäurereste umfassen, sofern die Aktivität des Fragments nicht wesentlich im Vergleich zu dem nicht modifizierten Antikörper oder Antikörperfragment verändert oder verschlechtert ist. Diese Modifikationen können einige zusätzliche Eigenschaften bieten, wie zum Beispiel um Aminosäuren, die zu einer Disulfidbindung fähig sind, zu entfernen / hinzufügen, um seine bio-Langlebigkeit zu erhöhen, um seine sekretorischen Eigenschaften zu ändern usw. In jedem Fall muss das Antikörperfragment eine bioaktive Eigenschaft besitzen, wie zum Beispiel eine Bindungsaktivität, die Regulierung der Bindung an die Bindungsdomäne, usw. Funktionelle oder aktive Regionen des Antikörpers können durch Mutagenese einer spezifischen Region des Proteins identifiziert werden, gefolgt von der Expression und Testen des exprimierten Polypeptids. Solche Verfahren sind leicht ersichtlich für einen Fachmann auf dem technischen Gebiet und können die ortsspezifische Mutagenese der Nukleinsäure, die das Antikörperfragment kodiert, enthalten.
Die Antikörper der Erfindung können weiterhin humanisierte Antikörper oder menschliche Antikörper sein. Humanisierte Formen von nicht-menschlichen (z. B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z. B. Fv, Fab, Fab' oder andere Antigen-bindende Untersequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz von nicht-menschlichem Immunglobulin enthalten. Humanisierte Antikörper umfassen menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in welchen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Empfängers durch Reste aus einer CDR eines nicht-menschlichen Spezies (Spenderantikörper), wie Maus, Ratte oder Kaninchen, mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In manchen Fällen werden Fv-Gerüst (FR-)-Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Humanisierte Antikörper können auch Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer und typischerweise zwei variablen Domänen, in welchen alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen sind jene einer menschlichen Immunglobulin-Konsensussequenz, umfassen. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch mindestens einem Abschnitt von einer konstanten Immunoglobulinregion (Fe), typischerweise den Abschnitt von einem humanen Immunglobulin.
Verfahren zur Humanisierung nicht-menschlicher Antikörper sind im Stand der Technik gut bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer Quelle, die nicht menschlich ist, in ihn eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden oft als „Import“-Reste bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen „Import“-Domäne entnommen sind. Humanisierung kann im Wesentlichen durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers durchgeführt werden. Demgemäß sind solche „humanisierten“ Antikörper chimäre Antikörper ( US-Patent Nr. 4.816.567 ), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in welchen manche CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen der Nager-Antikörper substituiert sind.
Transgene Tiere (z. B. Mäuse), die fähig sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire menschlicher Antikörper in Abwesenheit einer endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren, können verwendet werden. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion-Gens in chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zur vollständigen Hemmung der endogenen Antikörperproduktion führt. Der Transfer der menschlichen Keimbahn-Immunglobulin-Genanordnung in solchen Keimlinien-mutierten Mäusen wird die Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigen-Exposition zur Folge haben. Menschliche Antikörper können auch in Phagendisplay-Bibliotheken hergestellt werden.
Antikörper der Erfindung werden vorzugsweise einem Patienten in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger verabreicht. Typischerweise wird eine geeignete Menge eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes in der Formulierung verwendet, um die Formulierung isotonisch zu machen. Beispiele für den pharmazeutisch annehmbaren Träger umfassen isotonische Salzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung. Der pH-Wert der Lösung ist vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 8 und weiter bevorzugt von etwa 7 bis etwa 7,5 Weitere Träger umfassen Retardpräparate, wie semipermeable Matrizes aus festen hydrophoben Polymeren, die den Antikörper enthalten, wobei die Matrizes in Form von Formkörpern, beispielsweise Folien, Liposomen oder Mikropartikel, sind. Es wird dem Fachmann auf dem Gebiet offensichtlich sein, dass bestimmte Träger bevorzugter sein können, beispielsweise abhängig von dem Verabreichungsweg und der Konzentration des Antikörpers, der verabreicht wird.
Die Antikörper können dem Individuum, Patienten oder Zellen durch Injektion (z. B. intravenös, intraperitoneal, subkutan, intramuskulär) oder durch andere Verfahren, wie Infusion, die die Abgabe an den Blutstrom in einer wirksamen Form sicherstellen, verabreicht werden. Die Antikörper können auch auf intratumoralen oder peritumoralen Wege, zur Ausübung lokaler sowie systemischer therapeutischer Wirkungen verabreicht werden. Lokale oder intravenöse Injektion wird bevorzugt.
Wirksame Dosierungen und Zeitpläne für die Verabreichung der Antikörper können empirisch bestimmt werden und die Durchführung dieser Bestimmung liegt innerhalb des Fachwissens in der Technik. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass die Dosierung von Antikörpern, die verabreicht werden müssen, beispielsweise abhängig von dem Individuum, das den Antikörper erhalten wird, dem Weg der Verabreichung, der speziellen Art des verwendeten Antikörpers und anderer Medikamente, die verabreicht werden, variiert. Eine typische tägliche Dosis eines allein verwendeten Antikörpers könnte von etwa 1 µg/kg bis zu 100 mg/kg des Körpergewichts oder mehr pro Tag erreichen, abhängig von den oben erwähnten Faktoren. Nach Verabreichung eines Antikörpers, vorzugsweise zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom, kann die Wirksamkeit des therapeutischen Antikörpers auf verschiedene Weise beurteilt werden, die dem Fachmann gut bekannt sind. Zum Beispiel kann die Größe, Anzahl und/oder Verteilung von Krebs bei einem Patienten, der die Behandlung erhält, unter Verwendung von Standardtechniken zur Tumorvisualisierung überwacht werden. Ein therapeutisch verabreichter Antikörper, der das Tumorwachstum anhält, resultiert in einer Schrumpfung des Tumors, und/oder verhindert die Entwicklung von neuen Tumoren, verglichen mit dem Krankheitsverlauf, der in Abwesenheit der Antikörperverabreichung erfolgt wäre, ist ein wirksamer Antikörper zur Behandlung von Krebs.
Es ist ein weiterer Aspekt der Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines löslichen T-Zell-Rezeptors (sTCR) bereitzustellen, der einen spezifischen Peptid-MHC-Komplex erkennt. Solche löslichen T-Zell-Rezeptoren können aus spezifischen T-Zell-Klonen erzeugt werden, und ihre Affinität kann durch Mutagenese erhöht werden, die auf die komplementaritätsbestimmenden Regionen abzielt. Für die Auswahl der T-Zell-Rezeptoren kann der Phagen-Display verwendet werden ( US 2010/0113300 ), (Liddy et al., 2012)). Zur Stabilisierung von T-Zell-Rezeptoren während des Phagen-Displays und bei praktischer Anwendung als Medikament kann die alpha- und beta-Kette z. B. durch nicht-native Disulfidbindungen, andere kovalente Bindungen (einkettiger T-Zell-Rezeptor) oder durch Dimerisationsdomänen verknüpft werden (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Der T-Zell-Rezeptor kann mit Toxinen, Medikamenten, Zytokinen (siehe z.B. US 2013/0115191 ) und Domänen, die Effektorzellen wie eine Anti-CD3-Domäne usw. rekrutieren, verknüpft werden, um bestimmte Funktionen gegen Zielzellen auszuführen. Darüber hinaus könnte es in T-Zellen exprimiert werden, die für den adoptiven Transfer verwendet werden. Weitere Informationen können in WO 2004/033685A1 und WO 2004/074322A1 gefunden werden. Eine Kombination von sTCRs ist in WO 2012/056407A1 beschrieben. Weitere Verfahren für die Produktion sind in WO 2013/057586A1 offenbart.
Darüber hinaus können die Peptide und/oder die TCRs oder Antikörper oder andere Bindungsmoleküle der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, um die Diagnose „Krebs“ eines Pathologen anhand einer Biopsieprobe zu überprüfen.
Die Antikörper oder TCRs können auch für Diagnosetests in vivo verwendet werden. Im Allgemeinen wird der Antikörper mit einem Radionuklid (wie ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ³H, ³²P oder ³⁵ S) markiert, so dass der Tumor unter Verwendung von Immunszintigrafie lokalisiert werden kann. In einer Ausführungsform binden Antikörper oder Fragmente davon an die extrazellulären Domänen von zwei oder mehreren Targets eines Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den oben genannten Proteinen, und der Affinitätswert (Kd) ist kleiner als 1 x 10µM.
Antikörper für diagnostische Zwecke können mit Sonden zur Detektion durch verschiedene bildgebende Verfahren markiert werden. Verfahren zum Nachweis von Sonden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluoreszenz, Licht, konfokale und Elektronenmikroskopie; Magnetresonanztomographie und Spektroskopie; Fluoroskopie, Computertomographie und Positronen-Emissions-Tomographie. Geeignete Sonden umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Fluorescein, Rhodamin, Eosin und andere Fluorophore, Radioisotope, Gold, Gadolinium und andere Lanthanide, paramagnetisches Eisen, Fluor-18 und andere Positronen-emittierende Radionuklide. Zusätzlich können Sonden bi- oder multi-funktional sein und können durch mehr als eins der aufgeführten Verfahren nachgewiesen werden. Diese Antikörper können direkt oder indirekt mit den besagten Sonden markiert werden. Die Befestigung der Sonden an die Antikörper umfasst, unter anderem, die in der Technik gut anerkannt sind, die kovalente Bindung der Sonde, Einbau der Sonde in den Antikörper und die kovalente Bindung einer chelatbildenden Verbindung zur Bindung von Sonden. Für die Immunohistochemie kann die Probe des erkrankten Gewebes frisch oder gefroren sein oder sie kann in Paraffin eingebettet und mit einem Konservierungsmittel wie Formalin fixiert sein. Die feste oder eingebettete Sektion der Probe wird mit einem markierten primären Antikörper und sekundären Antikörper in Kontakt gebracht, wobei der Antikörper verwendet wird, um die Expression der Proteine in situ nachzuweisen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfasst ein in vitro Verfahren zur Herstellung von aktivierten T-Zellen, wobei das Verfahren umfasst in vitro in Kontakt bringen von T-Zellen mit Antigen-beladenen menschlichen MHC-Molekülen, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert werden, für eine Zeitdauer, die ausreichend ist, um die T-Zellen auf eine Antigen-spezifische Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid gemäß der Erfindung ist. Vorzugsweise wird eine ausreichende Menge des Antigens mit einer Antigen-präsentierenden Zelle benutzt.
Bevorzugterweise fehlt der Säugetierzelle oder sie besitzt ein reduziertes Niveau oder eine reduzierte Funktion des Peptid-Transporters TAP. Geeignete Zellen, in welchen TAP Peptid-Transporter fehlt, beinhalten T2, RMA-S und Drosophila-Zellen. TAP ist der mit der Antigenprozessierung assoziierte Transporter.
Die menschliche Peptid-Iadungsdefiziente Zelllinie T2 ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA mit der Katalognummer CRL 1992 erhältlich; die Drosophilazelllinie Schneider Line 2 ist von der ATCC mit der Katalognummer CRL 19863 erhältlich; die Maus RMA-S-Zelllinie ist in Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985) beschrieben.
Bevorzugterweise exprimiert die Wirtszelle vor der Transfektion substantiell keine MHC-Klasse-I-Moleküle. Es ist auch bevorzugt, dass eine Stimulatorzelle ein Molekül, das für die Bereitstellung einer Ko-Stimulation für T-Zellen wichtig ist, wie eines der folgenden: B7.1, B7.2, ICAM-1 und LFA 3, exprimiert. Die Nukleinsäuresequenz zahlreicher MHC-Klasse-I-Moleküle und der Kostimulatormoleküle sind öffentlich über die GenBank und EMBL-Datenbanken erhältlich.
Wenn ein MHC-Klasse-I-Epitop als ein Antigen verwendet wird, sind die T-Zellen - CD8-positive T-Zellen.
Wenn eine Antigen-präsentierende Zelle transfiziert wird, um ein solches Epitop zu exprimieren, bevorzugt umfasst die Zelle einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Peptid enthaltend SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 oder eine Variante einer Aminosäuresequenz davon zu exprimieren.
Verschiedene andere Verfahren können zur Erzeugung von T-Zellen in vitro verwendet werden. So können beispielsweise autologe tumorinfiltrierende Lymphozyten zur Erzeugung von CTL eingesetzt werden. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) benutzen autologe periphere Blutlymphozyten (PLBs) für die Erzeugung von T-Zellen. Des Weiteren ist die Erzeugung von autologen T-Zellen durch Pulsen von dendritischen Zellen mit einem Peptid oder einem Polypeptid oder über eine Infektion mit einem rekombinanten Virus möglich. Außerdem können B-Zellen für die Produktion von autologen T-Zellen verwendet werden. Des Weiteren können mit einem Peptid oder Polypeptid gepulste oder mit einem rekombinanten Virus infizierte Makrophagen für die Erzeugung von autologen T-Zellen benutzt werden. S. Walter et al. (Walter et al., 2003)beschreiben das in vitro Priming von T-Zellen durch künstliche Antigen-präsentierende Zellen (aAPCs), was auch ein geeigneter Weg zur Erzeugung von T-Zellen gegen ein Peptid der Wahl ist. In der vorliegenden Erfindung wurden aAPCs durch Kopplung von vorgeformten MHC-Peptid Komplexen auf der Oberfläche von Polystyrenpartikeln (Microbeads) durch Biotin-Streptavidin-Biochemie generiert. Dieses System ermöglicht die genaue Steuerung der Dichte von MHC auf aAPCs, welche es möglich macht, selektive hoch- oder niedrig avide antigenspezifische T-Zellantworten mit hoher Effizienz aus Blutproben auszulösen. Abgesehen von den MHC-Peptid Komplexen sollten aAPCs andere Proteine mit kostimulierender Aktivität, wie anti-CD28 Antikörper, an ihre Oberfläche gekoppelt, tragen. Des Weiteren benötigen solche auf aAPC-basierende Systeme oft die Zugabe von geeigneten löslichen Faktoren, z. B. Zytokinen wie Interleukin-12.
Allogene Zellen können auch für die Erzeugung von T-Zellen verwendet werden und eine Methode ist in der Patentanmeldung WO 97/26328 ausführlich beschrieben, die hiermit durch Referenz eingeschlossen wird. Zum Beispiel können, um Antigene zu präsentieren, zusätzlich zu Drosophila- und T2-Zellen, andere Zellen verwendet werden, wie zum Beispiel CHO-Zellen, mit Baculovirus infizierte Insektenzellen, Bakterien, Hefe und Vaccinia-infizierte Zielzellen. Weiterhin können auch Pflanzenviren benutzt werden (siehe zum Beispiel Porta et al. (Porta et al., 1994)), welche die Entwicklung des Cowpea Mosaic Virus als ein System für die Präsentation von fremden Peptiden mit hohen Ausbeuten beschreiben.
Die aktivierten T-Zellen, die gegen das erfindungsgemäße Peptid gerichtet sind, sind für die Therapie nützlich. Somit betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung aktivierte T-Zellen, die nach den vorher beschriebenen erfindungsgemäßen Methoden zu erhalten sind.
Aktivierte T-Zellen, die durch das oben beschriebene Verfahren erzeugt wurden, werden selektiv eine Zelle erkennen, die aberrant ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 226 exprimiert.
Bevorzugt erkennt die T-Zelle die Zelle beim Interagieren durch ihren TCR mit dem HLA/Peptid-Komplex (zum Beispiel durch das Binden). Die T-Zellen sind in einem Verfahren zur Abtötung von Zielzellen bei einem Patienten nützlich, dessen Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, wobei dem Patienten eine effektive Menge aktivierter T-Zellen verabreicht wird. Die T-Zellen, die dem Patienten verabreicht werden, können von dem Patienten erhalten und, wie oben beschrieben, aktiviert werden (d. h. sie sind autologe T-Zellen). Alternativ werden die T-Zellen nicht von dem Patienten, sondern von einem anderen Individuum erhalten. Natürlich ist es bevorzugt, dass es sich hierbei um ein gesundes Individuum handelt. Mit „gesundem Individuum“ meinen die Erfinder, dass das Individuum im Allgemeinen bei guter Gesundheit ist, bevorzugt ein kompetentes Immunsystem besitzt und, weiter bevorzugt, unter keiner Krankheit leidet, auf die einfach getestet und die einfach entdeckt werden kann.
In vivo können die Zielzellen für die CD8-positiven T-Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Zellen eines Tumors (die manchmal MHC-Klasse-II exprimieren) und/oder Stromazellen in der Umgebung des Tumors (Tumorzellen) (die manchmal auch MHC-Klasse-II exprimieren (Dengjel et al., 2006)) sein.
Die T-Zellen der vorliegenden Erfindung können als aktive Wirkstoffe in einer therapeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen bei einem Patienten zur Verfügung, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge von T-Zellen, wie oben definiert.
Mit „aberrant exprimiert“ meinen die Erfinder auch die Bedeutung, dass das Polypeptid im Vergleich zu Werten der Expression auf Normalgewebe überexprimiert ist oder dass das Gen in dem Gewebe, aus dem der Tumor erhalten wurde, still ist, aber im Tumor exprimiert wird. Mit „überexprimiert“ meinen die Erfinder dass das Polypeptid in einem Niveau vorkommt, das mindestens dem 2-fachen Niveau in normalem Gewebe entspricht; bevorzugt mindestens dem 3-fachen und bevorzugter mindestens 5-fachem oder 10-fachem Niveau in normalem Gewebe entspricht.
Die T-Zellen können durch die aus der Literatur bekannten, z. B. die oben beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Protokolle für den sogenannten adoptiven Transfer von T-Zellen sind im Fachgebiet sehr gut bekannt. Rezensionen finden sich unter:Gattioni et al. and Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet die Verwendung der mit MHC-komplexierten Peptide zur Erzeugung eines T-Zell-Rezeptors, dessen Nukleinsäure kloniert und in eine Wirtszelle, vorzugsweise eine T-Zelle, eingebracht wird. Diese modifizierte T-Zelle kann dann auf einen Patienten zur Therapie von Krebs übertragen werden.
Jedes Molekül der Erfindung, d. h. das Peptid, die Nukleinsäure, der Antikörper, der Expressionsvektor, Zelle, aktivierte T-Zelle, T-Zellrezeptor oder die Nukleinsäure, die es kodiert, ist für die Behandlung von Erkrankungen, charakterisiert durch Zellen, die der Immunantwort entkommen, geeignet. Deshalb kann jedes Molekül der vorliegenden Erfindung als Medikament oder zur Herstellung eines Medikamentes verwendet werden. Das Molekül kann einzeln oder in Kombination mit (einem) anderen Molekül der Erfindung oder (einem) bekannten Molekül(en) verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf einen Kit umfassend:

(a) einen Behälter, welcher die oben beschriebene pharmazeutische Zusammensetzung in Lösung oder in lyophilisierter Form enthält;
(b) optional einen zweiten Behälter, der ein Verdünnungsmittel oder eine Rekonstitutionslösung für die lyophilisierte Formulierung enthält; und
(c) gegebenenfalls, Anweisungen zur (i) Verwendung der Lösung oder (ii) der Rekonstitution und/oder der Verwendung der lyophilisierten Formulierung.

Der Kit kann weiterhin ein oder mehr von (iii) einem Puffer, (iv) einem Verdünnungsmittel, (v) einem Filter, (vi) einer Nadel oder (v) einer Spritze enthalten. Das Gefäß ist bevorzugt eine Flasche, eine Phiole, eine Spritze oder ein Reagenzglas; und es kann ein Gefäß für die mehrfache Verwendung sein. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist bevorzugt lyophilisiert.
Kits der vorliegenden Erfindung umfassen bevorzugt eine lyophilisierte Formulierung der vorliegenden Erfindung in einem geeigneten Gefäß und Anweisungen für deren Rekonstitution und/oder Verwendung. Geeignete Gefäße schließen, beispielsweise, Flaschen, Phiolen (zum Beispiel Zweikammerphiolen), Spritzen (solche wie Zweikammerspritzen) und Reagenzgläser ein. Das Gefäß kann aus einer Vielzahl von Materialien wie Glas oder Plastik hergestellt werden. Bevorzugt enthält/enthalten der Kit und/oder das Gefäß Anweisungen über den oder die mit dem Gefäß assoziiert sind, die die Anleitungen für die Rekonstitution und/oder Verwendung beinhalten. Die Etikette kann beispielsweise aufzeigen, dass die lyophilisierten Formulierungen zu Peptidkonzentrationen wie oben beschrieben rekonstituiert werden. Die Etikette kann weiterhin anzeigen, dass die Formulierung für eine subkutane Verabreichung nützlich oder vorgesehen ist.
Das Gefäß, welches die Formulierung enthält, kann eine Mehrweg-Phiole sein, welche wiederholte Verabreichungen (z. B. 2 bis 6 Verabreichungen) der rekonstituierten Formulierung ermöglicht. Der Kit kann weiterhin ein zweites Gefäß, welches ein geeignetes Verdünnungsmittel (z. B. Natriumbicarbonatlösung) umfasst, umfassen.
Die endgültige Peptidkonzentration der rekonstituierten Formulierung nach der Mischung des Verdünnungsmittels und der lyophilisierten Formulierung beträgt vorzugsweise mindestens 0,15 mg/mL/Peptid (=75 µg) und bevorzugt nicht mehr als 3 mg/mL/Peptid (=1500 µg). Der Kit kann weiterhin andere Materialien, die ausgehend von einem kommerziellen oder Benutzerstandpunkt erstrebenswert sind, einschließend andere Puffer, Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anweisungen für die Verwendung enthalten.
Kits der vorliegenden Erfindung können ein einzelnes Gefäß aufweisen, welches die Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung mit oder ohne andere Komponenten (z. B. andere Verbindungen oder pharmazeutische Zusammensetzungen dieser anderen Verbindungen) enthält, oder können verschiedene Gefäße für jeden Komponenten haben.
Bevorzugt enthalten die Kits der Erfindung eine Formulierung der Erfindung, die für die Benutzung in Kombination mit der Co-Verabreichung einer zweiten Verbindung (wie beispielsweise Adjuvantien (z. B. GM-CSF, ein chemotherapeutisches Mittel, ein Naturprodukt, ein Hormon oder einen Antagonisten, ein anti-Angiogenmittel oder ein Inhibitor, ein Apoptose-induzierendes Mittel oder ein Chelator) gepackt ist, oder eine pharmazeutische Zusammensetzung davon. Die Komponenten des Kits können prekomplexiert sein oder jede Komponente kann vor der Gabe an einen Patienten in einem separaten getrennten Gefäß sein. Die Komponenten des Kits können in einer oder mehreren flüssigen Lösungen, bevorzugt einer wässrigen Lösung, bevorzugter in einer sterilen wässrigen Lösung zur Verfügung gestellt werden. Die Komponenten des Kits können auch als Feststoffe, die durch die Zugabe von geeigneten Lösungsmitteln, welche bevorzugt in einem anderen getrennten Gefäß zur Verfügung gestellt werden, in Flüssigkeiten überführt werden, zur Verfügung gestellt werden.
Das Gefäß eines therapeutischen Kits kann eine Phiole, ein Reagenzglas, ein Kolben, eine Flasche, eine Spritze oder ein anderes Mittel zum Aufbewahren einer Flüssigkeit oder eines Feststoffes sein. Wenn es mehr als eine Komponente gibt, enthält der Kit normalerweise eine zweite Phiole oder ein anderes Gefäß, was eine separate Dosierung erlaubt. Der Kit kann außerdem ein weiteres Gefäß für eine pharmazeutisch akzeptable Flüssigkeit enthalten. Bevorzugt enthält ein therapeutischer Kit ein Gerät (z. B., eine oder mehrere Nadeln, Spritzen, Augentropfer, Pipetten, etc.), welches die Verabreichung der Stoffe der Erfindung, welche Teile des vorliegenden Kits sind, ermöglicht.
Die vorliegende Formulierung ist für die Verabreichung der Peptide auf jedem akzeptablen Weg, wie oral (enteral), nasal, ophthal, subkutan, intradermal, intramuskulär, intravenös oder transdermal, geeignet. Bevorzugt erfolgt die Verabreichung s.c. und am meisten bevorzugt i.d. Die Verabreichung kann mit einer Infusionspumpe erfolgen.
Da die Peptide der Erfindung aus akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom isoliert wurden, wird das erfindungsgemäße Medikament vorzugsweise zur Behandlung von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines personalisierten pharmazeutischen Produkts für einen einzelnen Patienten, umfassend die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend mindestens ein Peptid, ausgewählt aus einem Warehouse an vorab gescreenten TUMAPs, wobei das mindestens ein in der pharmazeutischen Zusammensetzung verwendete Peptid für die Eignung in dem einzelnen Patienten ausgewählt ist. In einer Ausführungsform ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Impfstoff. Das Verfahren könnte auch angepasst werden, um T-Zellklone für Downstream-Anwendungen wie TCR-Isolationen oder lösliche Antikörper und andere Behandlungsmöglichkeiten herzustellen.
Ein „personalisiertes pharmazeutisches Produkt“ bezeichnet für einen einzelnen Patienten spezifisch zugeschnittene Therapien, die nur für die Therapie bei diesem einzelnen Patienten verwendet werden, einschließlich aktiv personalisierter Krebsimpfstoffe und adoptiver zellulärer Therapien mit autologem Patientengewebe.
Wie im vorliegenden Kontext verwendet, bezieht sich der Begriff „Warehouse“ auf eine Gruppe oder einen Satz von Peptiden, die auf Immunogenität und/oder Überpräsentation in einem bestimmten Tumortyp vorab geprüft wurden. Der Begriff „ Warehouse“ soll nicht implizieren, dass die einzelnen Peptide, die in dem Impfstoff enthalten sind, vorproduziert und in einer physischen Einrichtung gelagert wurden, obwohl diese Möglichkeit in Betracht gezogen wird. Es ist ausdrücklich vorgesehen, dass die Peptide de novo für jeden hergestellten individualisierten Impfstoff hergestellt oder vorproduziert und gelagert werden können. Das Warehouse (z. B. in Form einer Datenbank) besteht aus tumorassoziierten Peptiden, die im Tumorgewebe von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom bei Patienten mit verschiedenen HLA-A, HLA-B und HLA-C-Allelen hoch überexprimiert wurden. Es kann MHC-Klasse-I und MHC Klasse-II-Peptide oder verlängerte MHC-Klasse-I Peptide enthalten. Zusätzlich zu den tumorassoziierten Peptiden, die aus den Geweben von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom gewonnen wurden, kann das Warehouse HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 und HLA-B*44 Markerpeptide enthalten. Diese Peptide ermöglichen den quantitativen Vergleich des Ausmaßes der durch TUMAPS induzierten T-Zell-Immunität und ermöglichen somit wichtige Rückschlüsse auf die Fähigkeit des Impfstoffs, Antitumorreaktionen auszulösen. Zweitens fungieren sie als wichtige positive Kontrollpeptide, die von einem „nicht-Selbst-“ Antigen abgeleitet sind, für den Fall, dass keine durch Impfstoffe induzierten T-Zell-Reaktionen auf TUMAPs, die von „selbst“-Antigenen abgeleitet sind, bei einem Patienten beobachtet werden. Drittens kann es Rückschlüsse auf den Status der Immunkompetenz des Patienten erlauben.
TUMAPs für das Warehouse werden unter Verwendung eines integrierten funktionellen genomischen Ansatzes identifiziert, der Genexpressionsanalyse, Massenspektrometrie und T-Zell-Immunologie kombiniert (XPresident^®). Der Ansatz stellt sicher, dass nur TUMAPs, die bei einem hohen Prozentsatz von Tumoren tatsächlich vorhanden sind, aber nicht oder nur minimal im Normalgewebe exprimiert werden, für eine weitere Analyse ausgewählt werden. Für die anfängliche Auswahl der Peptide wurden Proben von Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom und Blutproben gesunder Spender in einem schrittweisen Ansatz analysiert.

1. HLA-Liganden aus dem malignen Material wurden durch Massenspektrometrie identifiziert.
2. Die genomweite Expressionsanalyse der Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) wurde verwendet, um Gene zu identifizieren, die im bösartigen Gewebe (akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom) im Vergleich zu einer Reihe von normalen Organen und Geweben überexprimiert wurden.
3. Die identifizierten HLA-Liganden wurden mit den Genexpressionsdaten verglichen. Überpräsentierte oder selektiv auf Tumoren präsentierte TUMAPs,die bevorzugt durch selektiv exprimierte oder überexprimierte Gene, wie in Schritt 2 festgestellt, kodiert werden, wurden als geeignete TUMAP-Kandidaten für einen Multipeptidimpfstoff betrachtet.
4. Es wurde eine Literaturrecherche durchgeführt, um weitere Nachweise für die Relevanz der identifizierten Peptide als TUMAPs zu identifizieren.
5. Die Relevanz der Überexpression auf mRNA-Ebene wurde durch die Wiedererkennung ausgewählter TUMAPs aus Schritt 3 auf Tumorgewebe und den fehlenden (oder seltenen) Nachweis an gesunden Geweben bestätigt.
6. Um zu beurteilen, ob eine Induktion von in vivo T-Zell-Antworten durch die ausgewählten Peptide möglich ist, wurden in vitro Immunogenitätstests mit menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern sowie Patienten mit akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom durchgeführt.

In einem Aspekt werden die Peptide vorab auf Immunogenität getestet, bevor sie in das Warehouse aufgenommen werden. Als Beispiel und nicht als Einschränkung wird die Immunogenität der im Warehouse enthaltenen Peptide durch ein Verfahren bestimmt, das in vitro T-Zell-Priming durch wiederholte Stimulationen von CD8+ T-Zellen von gesunden Spendern mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen, die mit Peptid/MHC-Komplexen und Anti-CD28-Antikörper beladen sind, umfasst.
Dieses Verfahren wird bevorzugt bei seltenen Krebsarten und Patienten mit einem seltenen Expressionsprofil eingesetzt. Im Gegensatz zu Multi-Peptid-Cocktails mit einer festen Zusammensetzung, wie sie derzeit entwickelt werden, ermöglicht das Warehouse eine deutlich höhere Übereinstimmung der tatsächlichen Expression von Antigenen im Tumor mit dem Impfstoff. Ausgewählte Einzel- oder Kombinationen mehrerer „von der Stange“-Peptide werden für jeden Patienten in einem Multitarget-Ansatz verwendet. In der Theorie würde ein Ansatz, der auf der Auswahl von z. B. 5 verschiedenen antigenen Peptiden aus einer Bibliothek von 50 Peptiden basiert, bereits zu etwa 17 Millionen möglichen Zusammensetzungen des Arzneimittels (DP) führen.
In einem Aspekt werden die Peptide für die Aufnahme in den Impfstoff basierend auf ihrer Eignung für den einzelnen Patienten basierend auf dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wie vorliegend oder wie unten beschrieben, ausgewählt.
Die HLA-Phänotyp-, transkriptomischen und peptidomischen Daten werden aus dem Tumormaterial des Patienten und Blutproben gesammelt, um die am besten geeigneten Peptide für jeden Patienten zu identifizieren, die „Warehouse“ und patientenindividuelle (d.h. mutierte) TUMAPs enthalten. Es werden diejenigen Peptide ausgewählt, die im Tumor des Patienten selektiv oder überexprimiert werden und, wenn möglich, eine starke in-vitro-Immunogenität aufweisen, wenn sie mit den individuellen PBMCs der Patienten getestet werden.
Vorzugsweise werden die in dem Impfstoff enthaltenen Peptide durch ein Verfahren identifiziert, das umfasst: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; (b) Vergleichen der in (a) identifizierten Peptide mit einem Warehouse (Datenbank) von Peptiden, wie vorstehend beschrieben; und (c) Auswählen mindestens eines Peptids aus dem Warehouse (Datenbank), das mit einem tumorassoziierten Peptid korreliert, das im Patienten identifiziert wird. So werden beispielsweise die TUMAPs, die von der Tumorprobe präsentiert werden, identifiziert durch: (a1) Vergleichen von Expressionsdaten aus der Tumorprobe mit Expressionsdaten aus einer Probe von normalem Gewebe, die dem Gewebetyp der Tumorprobe entsprechen, um Proteine zu identifizieren, die in der Tumorprobe überexprimiert oder aberrant exprimiert werden; und (a2) Korrelieren der Expressionsdaten mit Sequenzen von MHC-Liganden, die an MHC-Klasse-I und/oder Klasse-II-Moleküle in der Tumorprobe gebunden sind, um MHC-Liganden zu identifizieren, die von Proteinen abgeleitet sind, die durch den Tumor überexprimiert oder aberrant exprimiert werden. Vorzugsweise werden die Sequenzen von MHC-Liganden identifiziert, indem gebundene Peptide aus MHC-Molekülen, die aus der Tumorprobe isoliert wurden, eluiert und die eluierten Liganden sequenziert werden. Vorzugsweise werden die Tumorprobe und das Normalgewebe vom gleichen Patienten erhalten.
Zusätzlich oder alternativ zur Auswahl von Peptiden unter Verwendung eines Warehouse (Datenbank)-Modells können TUMAPs beim Patienten de novo identifiziert und dann in den Impfstoff aufgenommen werden. Als ein Beispiel können TUMAP-Kandidaten bei dem Patienten durch (a1) Vergleichen von Expressionsdaten aus der Tumorprobe mit Expressionsdaten aus einer Probe von normalem Gewebe, die dem Gewebetyp der Tumorprobe entsprechen, um Proteine zu identifizieren, die in der Tumorprobe überexprimiert oder aberrant exprimiert werden; und (a2) Korrelieren der Expressionsdaten mit Sequenzen von MHC-Liganden, die an MHC-Klasse-I und/oder Klasse-II-Moleküle in der Tumorprobe gebunden sind, um MHC-Liganden zu identifizieren, die von Proteinen abgeleitet sind, die durch den Tumor überexprimiert oder aberrant exprimiert werden, identifiziert werden. Als weiteres Beispiel können Proteine identifiziert werden, die Mutationen enthalten, die für die Tumorprobe im Vergleich zu normalem korrespondierendem Gewebe des einzelnen Patienten einzigartig sind, und es können TUMAPs identifiziert werden, die speziell auf die Mutation abzielen. So kann beispielsweise das Genom des Tumors und des entsprechenden Normalgewebes durch vollständige Genomsequenzierung sequenziert werden: Zur Entdeckung nicht-synonymer Mutationen in den proteinkodierenden Regionen von Genen werden genomische DNA und RNA aus Tumorgeweben extrahiert und normale nicht-mutierte genomische Keimbahn-DNA aus mononukleären peripheren Blutzellen (PBMCs) extrahiert. Der angewandte NGS-Ansatz beschränkt sich auf die Re-Sequenzierung von proteinkodierenden Regionen (exome Re-Sequenzierung). Zu diesem Zweck wird exonische DNA aus menschlichen Proben mit vom Hersteller bereitgestellten Target Enrichment-Kits erfasst, gefolgt von der Sequenzierung mit z. B. einem HiSeq2000 (Illumina). Zusätzlich wird die Tumor mRNA sequenziert, um die Genexpression direkt zu quantifizieren und um zu validieren, dass mutierte Gene in den Tumoren der Patienten exprimiert werden. Die daraus resultierenden Millionen von Sequenzreads werden durch Softwarealgorithmen verarbeitet. Die Output-Liste enthält Mutationen und Expression von Genen. Tumorspezifische somatische Mutationen werden durch Vergleich mit den PBMC-basierten Keimbahnvariationen bestimmt und priorisiert. Die de novo identifizierten Peptide können dann auf Immunogenität getestet werden, wie vorstehend für das Warehouse beschrieben, und die Kandidaten-TUMAPs mit geeigneter Immunogenität werden für die Aufnahme in den Impfstoff ausgewählt.
In einer exemplarischen Ausführungsform werden die im Impfstoff enthaltenen Peptide identifiziert durch: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren präsentiert werden; (b) Vergleichen der in a) identifizierten Peptide mit einem Warehouse von Peptiden, die im Vergleich zu entsprechendem Normalgewebe auf Immunogenität und Überpräsentation in Tumoren vorab geprüft wurden; (c) Auswählen mindestens eines Peptids aus dem Warehouse, das mit einem tumorassoziierten Peptid korreliert, das im Patienten identifiziert wurde; und (d) optional Auswählen mindestens eines Peptids, das de novo in (a) identifiziert wurde, um seine Immunogenität zu bestätigen.
In einer exemplarischen Ausführungsform werden die im Impfstoff enthaltenen Peptide identifiziert durch: (a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die von einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; und (b) Auswählen mindestens eines de novo in (a) identifizierten Peptids und Bestätigen seiner Immunogenität.
Sobald die Peptide für einen personalisierten peptidbasierten Impfstoff ausgewählt sind, wird der Impfstoff hergestellt. Der Impfstoff ist vorzugsweise eine flüssige Formulierung, die aus den einzelnen Peptiden besteht, die in zwischen 20-40% DMSO, vorzugsweise in etwa 30-35% DMSO, wie etwa 33% DMSO, gelöst sind.
Jedes Peptid, das in ein Produkt aufgenommen werden soll, wird in DMSO gelöst. Die Konzentration der einzelnen Peptidlösungen ist in Abhängigkeit von der Anzahl der Peptide, die in das Produkt aufgenommen werden sollen, zu wählen. Die einzelnen Peptid-DMSO-Lösungen werden zu gleichen Teilen gemischt, um eine Lösung zu erhalten, die alle in das Produkt aufzunehmenden Peptide mit einer Konzentration von -2,5 mg/ml pro Peptid enthält. Die gemischte Lösung wird dann 1:3 mit Wasser für Injektionszwecke verdünnt, um eine Konzentration von 0,826 mg/ml pro Peptid in 33% DMSO zu erreichen. Die verdünnte Lösung wird durch einen 0,22 µm Sterilfilter gefiltert. Die endgültige Bulklösung wird erhalten.
Die endgültige Bulklösung wird in Vials gefüllt und bis zur Verwendung bei -20°C gelagert. Ein Vial enthält 700 µL Lösung, die 0,578 mg jedes Peptids enthält. Davon werden 500 µL (ca. 400 µg pro Peptid) für die intradermale Injektion eingesetzt.
Zusätzlich dazu, dass die Peptide der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Krebs nützlich sind, sind sie auch als Diagnostika nützlich. Da die Peptide aus Zellen von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom gewonnen wurden und da festgestellt wurde, dass diese Peptide nicht oder auf einem niedrigeren Niveau im normalen Gewebe vorhanden sind, können diese Peptide zur Diagnose des Vorhandenseins eines Krebserkrankung verwendet werden.
Das Vorhandensein der beanspruchten Peptide in Gewebebiopsien oder in Blutproben kann einem Pathologen bei der Diagnose von Krebs hilfreich sein. Der Nachweis bestimmter Peptide mittels Antikörpern, Massenspektrometrie oder anderen in der Technik bekannten Methoden kann dem Pathologen bestätigen, dass die Gewebeprobe bösartig oder entzündet oder allgemein krankhaft ist, oder als Biomarker für akute myeloische Leukämie, Brustkrebs, cholangiozelluläres Karzinom, chronische lymphatische Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozelluläres Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom verwendet werden kann. Das Vorkommen von Gruppen der Peptide kann die Klassifizierung oder Subklassifizierung der erkrankten Gewebe ermöglichen.
Der Nachweis von Peptiden auf einer erkrankten Gewebeprobe kann die Entscheidung über den Nutzen von Therapien, die das Immunsystem betreffen, vor allem wenn bekannt ist oder erwartet wird, dass T-Lymphozyten an dem Wirkmechanismus beteiligt sind oder sein können, ermöglichen. Der Verlust der MHC-Expression ist ein gut beschriebener Mechanismus, mit dem infizierte oder maligne Zellen der Immunüberwachung entkommen können. Somit zeigt das Vorhandensein der Peptide, dass dieser Mechanismus von den analysierten Zellen nicht ausgenutzt wird.
Die erfindungsgemäßen Peptide können dazu verwendet werden, um Lymphozytenantworten gegen diese Peptide, wie T-Zellantworten oder Antikörperantworten gegen das Peptid oder den Peptid-Komplex mit dem MHC-Molekül, zu analysieren. Diese Lymphozytenantworten können als prognostischer Marker für die Entscheidung über die weitere Therapieschritte verwendet werden. Diese Antworten können auch als Ersatzantwortmarker in immunotherapeutischen Ansätzen verwendet werden, die darauf abzielen, Lymphozytenantworten durch unterschiedliche Methoden, z. B. Impfung des Proteins, der Nukleinsäuren, autologen Materialien, den adoptiven Transfer von Lymphozyten, zu induzieren. In gentherapeutischen Rahmen, können Lymphozytenantworten gegen Peptide bei der Beurteilung der Nebenwirkungen berücksichtigt werden. Die Überwachung der Lymphozytenreaktionen könnte auch ein wertvolles Werkzeug für die Nachsorgeuntersuchungen von Transplantationstherapien, z. B. für den Nachweis von Transplantat-gegen-Wirt und Wirt-gegen-Transplantat (graft versus host und host versus graft) Krankheiten sein.
Die vorliegende Erfindung wird nun in den folgenden Beispielen beschrieben, die bevorzugte Ausführungsformen darstellen, und unter Bezugnahme auf die begleitenden Abbildungen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist zitierte Literatur durch Referenz vollständig eingeschlossen.
Figurenliste

Die 1A bis 1I zeigen die Überpräsentation verschiedener Peptide in verschiedenen Krebsgeweben (schwarze Punkte). Oberer Teil: Mediane MS-Signalintensitäten aus technischen Replikationsmessungen werden als Punkte für einzelne HLA-A*03-positive Normalwerte (graue Punkte, linker Teil der Abbildung) und Tumorproben (schwarze Punkte, rechter Teil der Abbildung), auf denen das Peptid nachgewiesen wurde, dargestellt. Die Kästen zeigen den Median, den 25. und 75. Perzentilanteil der normierten Signalintensitäten an, während sich die Whisker auf den niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartiis liegt, und den höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. Normale Organe werden nach Risikokategorien geordnet (Blutzellen, Blutgefäße, Gehirn, Leber, Lunge: hohes Risiko, graue Punkte; Fortpflanzungsorgane, Brust, Prostata: geringes Risiko, graue Punkte; alle anderen Organe: mittleres Risiko; graue Punkte). Unterer Teil: Die relative Peptiddetektionsfrequenz in jedem Organ wird als Spine-Plot dargestellt. Die Zahlen unter dem Panel geben die Anzahl der Proben an, in denen das Peptid aus der Gesamtzahl der für jedes Organ analysierten Proben ermittelt wurde (N = 93 für normale Proben, N = 151 für Tumorproben). Wenn das Peptid in einer Probe nachgewiesen wurde, aber aus technischen Gründen nicht quantifiziert werden konnte, wird die Probe in diese Darstellung in der Nachweisfrequenz einbezogen, aber im oberen Teil der Abbildung ist kein Punkt dargestellt. Gewebe (von links nach rechts) Normale Proben: Blutzellen; Blutgefäße; Gehirn; Herz; Leber; Lunge; Nebenniere; Gallengang; Blase; Knochenmark; Speiseröhre; Gallenblase; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Lymphknoten; peripherer Nerv; Bauchspeich. (Bauchspeicheldrüse); Haut; Rückenmark; Milz; Magen; Schilddrüse; Luftröhre. Tumorpoben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphatische Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom und Gebärmutterkrebs) Peptid: KLLEDMVEK (SEQ ID NO.: 33), Peptid: SLYDSEPRKK (SEQ ID NO.: 61), ) Peptid: SSFRPLLSK (SEQ ID NO.: 63), ) Peptid: GLSTILLYH (SEQ ID NO.: 69), Peptid: IINESLLFY (SEQ ID NO.: 76), Peptid: AVAAVLLSR (SEQ ID NO.: 79), Peptid: RIYVYVKRK (SEQ ID NO.: 178), Peptid: KVFEEPEDFLK (SEQ ID NO.: 189) und ) Peptid: GISNPITTSK (SEQ ID NO.: 223).
Die bis zeigen ein exemplarisches Expressionsprofil von Quellgenen der vorliegenden Erfindung, die in verschiedenen Krebsproben überexprimiert sind. Tumor (schwarze Punkte) und normale (graue Punkte) Proben werden entsprechend dem Ursprungsorgan gruppiert. Box-and-whisker-Diagramme stellen den Median-FPKM-Wert, das 25. und 75. Perzentil (Box) plus Whisker dar, die sich bis zum niedrigsten Datenpunkt erstrecken, der noch innerhalb des 1,5 Interquartilbereichs (IQR) des unteren Quartiis liegt, und dem höchsten Datenpunkt, der noch innerhalb des 1,5 IQR des oberen Quartils liegt. Normale Organe werden nach Risikokategorien geordnet. FPKM: Fragmente pro Kilobase pro Million gemappter Reads. Normale Proben: Blutzellen; Blutgefäße; Gehirn; Herz; Leber; Lunge; Fett (Fettgewebe); Nebenniere; Gallengang; Blase; Knochenmark; Speiseröhre; Auge; Gallenbl. (Gallenblase); Kopf/Hals; Dickdarm; Dünndarm; Niere; Lymphkn. (Lymphknoten); periph. Nerv (peripherer Nerv); Pankreas (Bauchspeicheldrüse); Parathyr (Nebenschilddrüse); Perit (Peritoneum); Hypoph. (Hypophyse); Pleura; Skel. Musk. (Skelettmuskel); Haut; Milz; Magen; Schilddrüse; Luftröhre; Harnleiter; Brust; Eierstock; Plazenta; Prostata; Hoden; Thymus; Uterus. Tumorpoben: AML (akute myeloische Leukämie); BRCA (Brustkrebs); CCC (cholangiozelluläres Karzinom); CLL (chronische lymphatische Leukämie); CRC (Darmkrebs); GBC (Gallenblasenkrebs); GBM (Glioblastom); GC (Magenkrebs); HCC (hepatozelluläres Karzinom); HNSCC (Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich); MEL (Melanom); NHL (Non-Hodgkin-Lymphom); NSCLCadeno (nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom); NSCLCother (NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten); NSCLCsquam (Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelliger Lungenkrebs); OC (Eierstockkrebs); OSCAR (Speiseröhrenkrebs); PACA (Bauchspeicheldrüsenkrebs); PRCA (Prostatakrebs); RCC (Nierenzellkarzinom); SCLC (kleinzelliger Lungenkrebs); UBC (Harnblasenkrebs); UEC (Endometriumkarzinom und Gebärmutterkrebs)
Gensymbol: DCAF4L2, Peptid: RVYPHKTLY (SEQ ID No: 1), Gensymbol: PRAME, Peptid: RLVELAGQSLLK (SEQ ID No: 7), ) Gensymbol: CSAG1, Peptid: FSNNHPSTPK (SEQ ID No: 8), ) Gensymbol: CTAG2, Peptid: PLPRPGAVLK (SEQ ID No: 11), Gensymbol: IGF2BP1, Peptid: KVFAEHKISY (SEQ ID No: 16), Gensymbol: SOX11, Peptid: RLYYSFKNITK (SEQ ID No: 18), Gensymbol: PTHLH, Peptid: RTALLWGLKK (SEQ ID No: 90) und Gensymbol: LAMC2, Peptid: RVRALGSQY (SEQ ID No: 97).
zeigt exemplarische Ergebnisse von peptidspezifischen in vitro CD8+ T-Zell-Antworten eines gesunden HLA-A*03+-Spenders. CD8+ T-Zellen wurden mit künstlichen APCs geprimt, die mit Anti-CD28 mAb und HLA-A*03 im Komplex mit Peptid mit SeqlD No 248 ((GLASRILDAK) (A, linkes Feld) und Peptid mit SeqlD No 249 (ATSGVPVYK) (B, linkes Feld) beschichtet sind. Nach drei Stimulationszyklen wurde der Nachweis von peptidreaktiven Zellen durch 2D-Multimerfärbung mit A*03/SeqID No 248 (A) oder A*03/SeqID No 249 (B) durchgeführt. Die rechten Felder (A und B) zeigt die Kontrollfärbung von Zellen, die mit irrelevanten A*03/Peptidkomplexen stimuliert wurden. Lebensfähige Singletzellen wurden für CD8+ Lymphozyten gegated. Boolesche Gates halfen, falsch-positive Ereignisse auszuschließen, die mit Multimeren entdeckt wurden, die für verschiedene Peptide spezifisch sind. Es werden Frequenzen spezifischer Multimer+ Zellen unter den CD8+ Lymphozyten angegeben.

BEISPIELE
BEISPIEL 1
Identifizierung und Quantifizierung von tumorassoziierten Peptiden, die auf der Zelloberfläche präsentiert werden
Gewebeproben
Das Tumorgewebe der Patienten wurde erhalten von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien), BioServe (Beltsville, MD, USA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA), Leiden University Medical Center (LUMC) (Leiden, Niederlande), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA), Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Großbritannien), Universitätsklinik Bonn (Bonn, Deutschland), Universitätsklinikum Genf (Genf, Schweiz), Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland), Universitätsklinikum Tübingen (Tübingen, Deutschland), Universitätsklinikum Val d'Hebron (Barcelona, Spanien).
Normalgewebe wurde von Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien), BioServe (Beltsville, MD, USA), Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, USA), Zentrum für klinische Transfusionsmedizin Tübingen (Tübingen, Deutschland), Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA), Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Großbritannien), Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland), Universitätsklinikum Tübingen (Tübingen, Deutschland) erhalten.
Schriftliche informierte Einwilligungen wurden von allen Patienten vor der Operation oder der Autopsie erhalten. Die Gewebe wurden direkt nach der Entnahme schockgefroren und bis zur Isolierung der TUMAPs bei -70°C gelagert.
Isolierung von HLA Peptiden aus Gewebeproben
HLA-Peptid-Pools von schockgefrorenen Gewebeproben wurden durch Immunfällung von festen Geweben nach einem leicht modifizierten Protokoll ((Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)) unter Benutzung eines HLA-A*02-spezifischen Antikörpers BB7.2, eines HLA-A, -B, -C-spezifischen Antikörpers W6/32, eines HLA-2-spezifischen Antikörpers L243 und eines HLA-DP-spezifischen Antikörpers B7/21, DRCNBraktivierter Sepharose, Säurebehandlung und Ultrafiltration, erhalten.
Massenspektroskopieanalysen
Die erhaltenen HLA-Peptidpools wurden gemäß ihrer Hydrophobizität durch Umkehrphasen-Chromatographie (nanoAcquity UPLC System, Waters) getrennt und die eluierten Peptide in einem LTQ-Velos und Fusions-Hybridmassenspektrometern (Thermoelectron), das mit einer ESI-Quelle ausgestattet ist, analysiert. Die Peptidpools wurden direkt auf die analytische Quarzglasmikrokapillarsäule (75 µm i.d. × 250 mm) gepackt mit 1,7 µm C18 Umkehrphasenmaterial (Waters) und einer Flussrate von 400 nL pro Minute, geladen. Anschließend wurden die Peptide unter Benutzung eines zweistufigen 180 Minuten-binären Gradienten von 10% bis 33% B bei einer Flußrate von 300 nL pro Minute getrennt. Der Gradient war aus Lösemittel A (0,1 % Ameisensäure in Wasser) und Lösemittel B (0,1 % Ameisensäure in Acetonitril) zusammengesetzt. Eine mit Gold beschichtete Glaskapillare (PicoTip, New Objective) wurde für die Einführung in die Nano-ESI-Quelle verwendet. Die LTQ-Orbitrap Massenspektrometer wurden in dem datenabhängigen Modus unter Verwendung einer TOP5-Strategie betrieben. Zusammenfassend wurde ein Zyklus mit einem vollständigen Scan von hoher Massengenauigkeit in der Orbitrap (R = 30 000) initiiert, dem ein MS / MS Scan auch in der Orbitrap (R = 7500) auf den 5 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen mit dynamischem Ausschluss zuvor ausgewählter Ionen folgte. Tandem-Massenspektren wurden von SEQUEST mit einer festen Falscherkennungsrate (q≤0.05) und zusätzlicher manuellen Kontrolle interpretiert. In Fällen, in denen die identifizierte Peptidsequenz unsicher war, wurde sie zusätzlich durch Vergleich des erzeugten natürlichen Peptidfragmentierungsmusters mit dem Fragmentierungsmuster eines synthetischen Sequenz-identischen Referenzpeptids validiert.
Die markierungsfreie relative LC-MS-Quantifizierung erfolgte durch lonenzählung, d.h. durch Extraktion und Analyse der LC-MS-Merkmale (Mueller et al., 2007). Das Verfahren geht davon aus, dass der LC-MS-Signalbereich des Peptids mit seiner Häufigkeit in der Probe korreliert. Extrahierte Merkmale wurden durch Ladezustandsentfaltung und Retentionszeitausrichtung weiterverarbeitet (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). Schließlich wurden alle LC-MS-Funktionen mit den Ergebnissen der Sequenzidentifikation verglichen, um quantitative Daten verschiedener Proben und Gewebe zu Peptid-Präsentationsprofilen zu kombinieren. Die quantitativen Daten wurden entsprechend der zentralen Tendenz zweistufig normiert, um Abweichungen innerhalb technischer und biologischer Replikate zu berücksichtigen. So kann jedes identifizierte Peptid mit quantitativen Daten assoziiert werden, die eine relative Quantifizierung zwischen Proben und Gewebe erlauben. Darüber hinaus wurden alle quantitativen Daten, die für Peptidkandidaten erfasst wurden, manuell überprüft, um die Datenkonsistenz zu gewährleisten und die Genauigkeit der automatisierten Analyse zu überprüfen. Für jedes Peptid wurde ein Präsentationsprofil berechnet, das die mittlere Probenpräsentation sowie die Replikatvariationen zeigt. Die Profile stellen Proben von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom, nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und kleinzelligem Lungenkrebs), Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkrebs, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom einer Basislinie von normalen Gewebeproben gegenüber. Präsentationsprofile von exemplarisch überpräsentierten Peptiden sind in dargestellt.
Tabelle 8 zeigt die Präsentation von ausgewählten Peptiden auf verschiedenen Krebsentitäten und damit die besondere Relevanz der genannten Peptide für die Diagnose und/oder Behandlung der Krebserkrankungen wie angegeben (z. B. Peptid SEQ ID No. 1 für hepatozelluläres Karzinom und Harnblasenkarzinom, Peptid SEQ ID No. 25 für Brustkrebs, nicht-kleinzelligen Lungenkrebs und Nierenzellkarzinom).

Tabelle 8: Übersicht über die Präsentation ausgewählter tumorassoziierter Peptide der vorliegenden Erfindung über Entitäten hinweg AML: akute myeloische Leukämie; BRCA: Brustkrebs; CCC: cholangiozelluläres Karzinom; CLL: chronische lymphatische Leukämie; CRC: Darmkrebs; GBC: Gallenblasenkrebs; GBM: Glioblastom; GC: Magenkrebs; HCC: hepatozelluläres Karzinom; HNSCC: Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich; MEL: Melanom; NHL: Non-Hodgkin-Lymphom; NSCLCadeno: nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom; NSCLCother NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten; NSCLCsquam Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelliger Lungenkrebs; OC: Eierstockkrebs; OSCAR: Speiseröhrenkrebs; PACA: Bauchspeicheldrüsenkrebs; PRCA: Prostatakrebs; RCC: Nierenzellkarzinom; SCLC: kleinzelliger Lungenkrebs; UBC: Harnblasenkrebs; UEC: Endometriumkarzinom und Gebärmutterkrebs.

SEQ ID Nr.	Sequenz	Peptidpräsentation auf verschiedenen Krebsgeweben
1	RVYPHKTLY	HCC, UBC
2	KVMPKQTWK	HCC
3	LLYGNGPGYVLK	UEC
4	RGLSGIGAFR	HNSCC
5	AMVPIYAAY	RCC
6	SIFGLAPGK	UEC
7	RLVELAGQSLLK	UEC
8	FSNNHPSTPK	MEL
9	HVLYPVPLESY	MEL
10	KARDLRTPK	CRC
11	PLPRPGAVLK	NHL
12	KVLTRNIEY	GBC
13	AVAFFVLPSK	NHL
14	VAFFVLPSK	AML
15	RLYAPWNISRL	BRCA
16	KVFAEHKISY	HNSCC
17	GGLSSQGVYY	CCC
18	RLYYSFKNITK	NHL
19	ALAAKLEVK	GBM
20	LLPTVLIKK	AML, HCC, HNSCC, NSCLCother, OSCAR, UEC
21	SSLAELIAK	HNSCC
22	EGLFLLGCVK	NHL
23	RLSPGPRAY	RCC
24	KLETGWKK	RCC
25	KTWAHCMSY	BRCA, NSCLCadeno, RCC
26	QLGYQAAVLK	GBM
27	SGSTLECILYK	UEC
28	STLECILYK	UEC
30	ILDSSLLK	NHL
31	HAFFPKTHR	UEC
32	LLDAEPPILY	BRCA
33	KLLEDMVEK	UEC
34	AIGTPLIGK	CRC, NSCLCadeno, UEC
35	VLLLLSLLH	NSCLCadeno
36	QIRAELMKK	HNSCC, NHL
37	EVILTTKTPK	MEL
38	SLFPYYNNLY	NHL
39	KTQFPQLK	HCC
40	ALNDRFAGY	PRCA
41	RLGAARGQLR	NSCLCadeno
43	TVYDSIWCNMK	UEC
44	HAFPPGPNY	HNSCC
45	KCYEVGMMK	UEC
46	VVTGNVPLK	HCC, MEL
47	ALFGNALVFY	RCC
48	KGWNGQIFK	AML
49	ITAPLMPLGK	CCC, HNSCC
50	HSAGIFSMY	NHL
51	VTADGALAMEK	CCC, CRC, HNSCC, UEC
52	GMYEYGSIEK	MEL
53	KQALSLVRK	CCC, CRC, HNSCC, UEC
54	GVTITKTLK	BRCA, MEL
55	RLSAESKDLLK	GBM
56	TTYYPSPLNK	RCC
57	RVLYRPQLEK	HCC
58	VLYRPQLEK	HCC
59	KINQYIIKK	MEL
60	VVFPFPVNKR	AML
61	SLYDSEPRKK	AML, CCC, GBC, GBM, HNSCC, MEL, NHL, OSCAR, UBC, UEC
62	GIFPKIMPK	HCC
63	SSFRPLLSK	BRCA, CRC, GBM, HCC, MEL, PACA, PRCA, SCLC, UEC
64	SVLSRMLVR	MEL, UEC
65	RTIEELQNK	HNSCC
66	RVKEIVINK	MEL
67	WREILHAQTLK	MEL, NHL
68	KGPMAGILAY	AML, NHL
69	GLSTILLYH	CCC, CRC, GBC, GBM, MEL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, PACA, RCC, UEC
70	VTAVASLLK	MEL
71	VLYELGIIGNNK	MEL
72	KLYPQCLQK	NHL
73	RCFSGPYLNK	BRCA, MEL, NHL
74	HSTLVALFY	NHL
75	IIFVPEMNK	UEC
76	IINESLLFY	BRCA, CRC, GBC, MEL, NSCLCadeno, RCC, UEC
77	WDDSQLPK	CCC, CRC, MEL, NHL, NSCLCsquam, RCC
78	KTGTFVLYKS	HNSCC, NHL, SCLC
79	AVAAVLLSR	CCC, CLL, CRC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, RCC, UEC
80	ALCGTQLFY	AML, CCC, HCC, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, UEC
81	HLFLPFSYK	CCC, HCC
82	CLANYTVNK	UEC
83	KLADSVMAGK	BRCA, CRC, GBM, SCLC
84	QLYSPPSPSYR	HNSCC, NSCLCadeno
85	IMPTFDLTK	HCC
86	RVSGSGGGGAGK	NHL
87	RLASVGLDAK	HCC
88	GTHVWVGLYK	PACA
90	RTALLWGLKK	HNSCC
92	KRIPFRPLAK	HCC
95	FLGLAFHPK	SCLC
96	RAVSVNPGK	CCC, GBC, HNSCC
97	RVRALGSQY	CCC
98	VSVAGSILAK	GBC
100	TTNARILAR	MEL
101	HMDEFKRTQK	CRC
102	RLLQHTPSAR	CRC
103	SIYKKAVYR	CRC
104	AWQGLVEK	HNSCC
105	QVLDLQSVK	CRC
106	LLRSGLTLR	HCC, UEC
107	ILNLNKMVK	NHL
108	KMPILSYWPY	CRC
109	KLQNLPTLLY	RCC
110	IIFIPATILLK	AML, HCC
111	ATSPPASVR	HNSCC
112	ASLAAAVLAK	MEL
113	VSIRNTLLY	HCC
115	AILHPFRAK	UEC
116	KGVKKELPQK	UBC
117	TVFVELWLK	AML
118	SLRGSFPILY	CCC, MEL
119	RMGFRTLSK	AML
120	TRMQKAGFLYY	NSCLCsquam
121	LLPAARATSR	NSCLCsquam
122	LIGPLLICK	CCC, HCC, NSCLCadeno, RCC, UEC
123	SLQGLTISY	GBM
124	VVYDTMIEK	GBM
125	VVYDTMIEKF	HNSCC
127	GLAAGALLLY	NSCLCsquam
128	KIKKPLSYR	UEC
129	ALARVSSVKL	CRC
130	KANSGNTFKY	HCC
132	ASSFRPLLSK	MEL
134	SLLKPSGDYFK	CRC
135	TFKSVLLNK	RCC
137	TVYVAMCHKF	OSCAR
138	VSLSKMLKK	NHL
139	KAIIRVIPLK	CRC
140	RLLAAGQVIR	CCC, HCC, HNSCC, OSCAR
141	RLRDYISSLK	NHL
142	SPRVYWLGLNDR	NHL
143	KTLGKIAEK	CCC, CRC, GBC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, OSCAR, PRCA
144	PLAMLAATCNK	HCC
145	SLFEGIYTIK	AML
147	KLFMPRPK	GBC
148	RIGNKGIYK	AML
149	TVFLSKYLKK	UEC
151	KVASFTVIGY	CCC, NHL
152	KIICGVHYLY	CRC
154	TIASVLVAR	NHL
155	ALSHAVNNY	SCLC
156	VSLGIAVSK	AML, CCC, HNSCC
157	SLPLQRILAMSK	NSCLCadeno
158	RALGVPFVPR	CCC
159	LLLLPFLLY	CCC
160	RLLPGKVVWK	UEC
161	MKTLPAMLGTGK	HNSCC, NSCLCadeno, OSCAR
162	LLALGAAYVY	UEC
163	MLYYPSVSR	MEL
165	AATIISSAK	RCC
166	KVIAPGVIY	CCC
167	MLKQARRPLFR	NSCLCadeno
168	ATNGKVLKK	GBC, HNSCC
169	ATNGKVLKKR	CLL, GBM, HNSCC, UEC
171	ATIGLSVSK	AML, HCC
172	SLLEADPFLK	AML
173	VSYNRLIK	GBC, HCC, HNSCC, MEL, PRCA, RCC, UEC
174	KMMKRLMTVEK	NSCLCother
175	VIGTTSSPK	CCC, HCC
176	RLYDAYVNR	GBM, RCC
177	ALLGVIIAKK	RCC
178	RIYVYVKRK	AML, HNSCC, OSCAR, UBC, UEC
179	KINPTASLK	MEL
180	RLKMAQESVSK	MEL
181	RVAEEILIK	MEL
182	QICLPAIYK	CRC, GBC, NSCLCadeno, RCC
183	KVYIPPIINK	BRCA, HCC, HNSCC, MEL, UEC
184	KVLEPPLGAR	AML, CLL
185	SIINFKPLTY	HNSCC
186	CTLPFKIFY	HNSCC, NSCLCadeno, PACA, UEC
187	KTCQVSGLLY	BRCA, MEL
188	SSLPRAFQK	CCC, HNSCC
189	KVFEEPEDFLK	BRCA, CCC, CRC, GBC, GC, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, PACA, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
190	RSKWSNVFK	CRC
191	SLYNLGGAK	HNSCC, OSCAR, UEC
192	RSYSHWLK	BRCA, CRC, GBC, GBM
193	IVYPSATDKTK	BRCA, HNSCC
194	PVLICLALSK	AML, BRCA, CCC, CLL, CRC, GBM, GC, HCC, HNSCC,
		MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, PACA, RCC, SCLC, UBC, UEC
195	KLQAKVLQY	GBC, MEL
196	AISSTVLGK	GBC, PACA, UEC
197	RIVDYLLEK	CCC,HNSCC
198	FLYGAQTVY	CLL
199	IVFPDVISK	UEC
201	KVADFGLARLLK	BRCA, CRC, NHL
202	RLFPGLYLGY	HCC
205	RVYPRPPSK	CCC, HCC, UEC
206	RLYEMILQR	AML, BRCA, CLL, HCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, RCC, UEC
207	ATLNLFQIVSK	AML
208	KTGWFTLLY	BRCA, HCC
209	KILDRVLSRY	AML
210	KIFQGQINK	HCC
211	VSLGTPIMK	AML, GBM, HNSCC, UEC
212	RTIDRSVFK	MEL, UEC
213	KLYPTHACR	BRCA
214	KLFTSVFGVGLK	AML
215	KIWQNLRLK	CCC, CRC
216	RVSSVKLISK	CCC, CRC, NSCLCadeno, PRCA
217	RVYEGDGRNSLK	NHL
218	KAFNQSSIFTK	CCC, NHL, NSCLCadeno
219	ALERKFRQK	CRC, UEC
220	ALPRQAFHSK	AML
221	RLAVSTRGK	NSCLCadeno
223	GISNPITTSK	HCC, HNSCC, NHL, NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, PRCA, RCC, UEC
224	SLYDGFLSY	GBM, NSCLCadeno
225	RVYPRPPSKTY	HCC, UEC
226	RVWLGKHYK	BRCA, CRC, HCC, HNSCC, MEL, NSCLCother, OSCAR, SCLC, UBC, UEC

BEISPIEL 2
Expressionsprofile von Genen, die die Peptide der Erfindung kodieren
Eine Überpräsentation oder spezifische Präsentation eines Peptids auf Tumorzellen im Vergleich zu normalen Zellen ist ausreichend für seinen Nutzen in der Immuntherapie, und einige Peptide sind tumorspezifisch, obwohl ihr Ausgangsprotein auch im normalen Gewebe vorkommt. Dennoch bietet das mRNA-Expressionsprofiling ein zusätzliches Maß an Sicherheit bei der Auswahl von Peptid-Targets für Immuntherapien. Insbesondere für Therapieoptionen mit hohen Sicherheitsrisiken, wie z. B. affinitätsgereifte TCRs, wird das ideale Zielpeptid aus einem Protein gewonnen, das einzigartig für den Tumor ist und nicht im normalen Gewebe vorkommt.
RNA-Quellen und Herstellung
Operativ entfernte Gewebeproben wurden wie oben verdeutlicht zur Verfügung gestellt, (siehe Beispiel 1), nachdem von jedem Patienten eine informierte, schriftliche Einwilligung erhalten worden war. Tumorgewebeproben wurden unmittelbar nach der Operation schockgefroren und später mit Mörser und Stößel unter Flüssigstickstoff homogenisiert. Die gesamte RNA wurde aus diesen Proben unter Benutzung von TRI-Reagent (Ambion, Darmstadt, Deutschland) gefolgt von einer Aufreinigung mit RNeasy (QIAGEN, Hilden, Deutschland) hergestellt; beide Verfahren wurden nach den Protokollen der Hersteller durchgeführt.
Die gesamte RNA aus gesundem menschlichem Gewebe für RNASeq-Experimente wurde erhalten von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien); Bio-Options Inc. (Brea, CA, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Großbritannien). Die gesamte RNA aus Tumorgeweben für RNASeq-Experimente wurde erhalten von: Asterand (Detroit, MI, USA & Royston, Herts, Großbritannien); BioCat GmbH (Heidelberg, Deutschland); BioServe (Beltsville, MD, USA); Geneticist Inc. (Glendale, CA, USA); Istituto Nazionale Tumori „Pascale“ (Neapel, Italien); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, USA); Universitätsklinikum Heidelberg (Heidelberg, Deutschland).
Die Qualität und die Quantität aller RNA-Proben wurde an einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Deutschland) unter Benutzung des RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent) bewertet.
RNAseq Experimente
Die Genexpressionsanalyse von RNA-Proben aus Tumor- und Normalgewebe wurde durch Next Generation Sequenzierung (RNAseq) von CeGaT (Tübingen, Deutschland) durchgeführt. Zusammenfassend, werden Sequenzierungsbibliotheken mit dem Illumina HiSeq v4 Reagenzienkit gemäß dem Protokoll des Anbieters (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) erstellt, das RNA-Fragmentierung, cDNA-Konvertierung und Hinzufügen von Sequenzierungsadaptern beinhaltet. Bibliotheken, die aus mehreren Proben gewonnen werden, werden äquimolar gemischt und auf dem Illumina HiSeq 2500 Sequenzer gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert, wobei 50 bp Single End Reads erzeugt werden. Die prozessierten Reads werden mit der STAR-Software auf das menschliche Genom (GRCh38) gemappt. Expressionsdaten werden auf Transkriptionsebene als RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped Reads, erzeugt durch die Software Cufflinks) und auf Exon-Ebene (Total Reads, erzeugt durch die Software Bedtools), basierend auf der Anleitung aus der Ensembl-Sequenzdatenbank (Ensembl77), bereitgestellt. Exon-Werte werden auf Exon-Länge und Ausrichtungsgröße normiert, um RPKM-Werte zu erhalten.
Exemplarische Expressionsprofile von Quellgenen der vorliegenden Erfindung, die in akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom stark überexprimiert oder ausschließlich exprimiert sind, werden in gezeigt. Expressionswerte für weitere exemplarische Gene sind in Tabelle 9 dargestellt.

Tabelle 9: Expressionswerte Die Tabelle listet Peptide von Genen auf, die in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben sehr stark (+++) überexprimiert sind, in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben stark (++) überexprimiert sind oder in Tumoren im Vergleich zu einem Panel von normalen Geweben überexprimiert (+) sind. Die Basislinie für diesen Wert wurde aus Messungen der folgenden relevanten Normalgewebe berechnet: Fettgewebe, Nebenniere, Gallengang, Blutzellen, Blutgefäße, Knochenmark, Gehirn, Speiseröhre, Auge, Gallenblase, Herz, Kopf-Hals, Niere, Dickdarm, Leber, Lunge, Lymphknoten, Nerv, Nebenschilddrüse, Bauchspeicheldrüse, Hypophyse, Peritoneum, Skelettmuskel, Haut, Dünndarm, Milz, Magen, Schilddrüse, Luftröhre, Harnblase. Falls Expressionsdaten für mehrere Proben desselben Gewebetyps vorliegen, wurde für die Berechnung das arithmetische Mittel aller entsprechenden Proben verwendet.
AML: akute myeloische Leukämie; BRCA: Brustkrebs; CCC: cholangiozelluläres Karzinom; CLL: chronische lymphatische Leukämie; CRC: Darmkrebs; GBC: Gallenblasenkrebs; GBM: Glioblastom; GC: Magenkrebs; HCC: hepatozelluläres Karzinom; HNSCC: Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich; MEL: Melanom; NHL: Non-Hodgkin-Lymphom; NSCLCadeno: nicht-kleinzelliges Lungenkrebs-Adenokarzinom; NSCLCother NSCLC-Proben, die nicht eindeutig NSCLCadeno oder NSCLCsquam zugeordnet werden konnten; NSCLCsquam Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelliger Lungenkrebs; OC: Eierstockkrebs; OSCAR: Speiseröhrenkrebs; PACA: Bauchspeicheldrüsenkrebs; PRCA: Prostatakrebs; RCC: Nierenzellkarzinom; SCLC: kleinzelliger Lungenkrebs; UBC: Harnblasenkrebs; UEC: Endometriumkarzinom und Gebärmutterkrebs

Seq ID No	Sequenz	Genexpression in Tumorproben
Seq ID No	Sequenz	Überexprimiert (+)	Stark überexprimiert (++)	Sehr stark überexprimiert (+++)
1	RVYPHKTLY	BRCA, GBM, MEL, NSCLCadeno, OSCAR, SCLC	GBC	HCC
2	KVMPKQTWK	MEL, NSCLCadeno, PACA, PRCA, SCLC		HCC
3	LLYGNGPGYVLK		OC	UEC
4	RGLSGIGAFR	NHL		CLL
5	AMVPIYAAY	NSCLCadeno,		RCC
		NSCLCsquam, SCLC
6	SIFGLAPGK		OC	UEC
7	RLVELAGQSLLK	AML, BRCA, GC, HCC, NHL, OSCAR, UBC	GBC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCsquam, RCC	MEL, OC, SCLC, UEC
8	FSNNHPSTPK	CCC, GBC, GBM, NHL, OC, PACA	GC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, UBC	HCC, MEL, SCLC
9	HVLYPVPLESY	AML, BRCA, NHL, OSCAR, UBC	GBC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCsquam, RCC	MEL, OC, UEC
10	KARDLRTPK	GC, HNSCC, NSCLCsquam, UBC	HCC, OC, SCLC	GBC, MEL
11	PLPRPGAVLK	GC, HNSCC, NSCLCsquam, UBC	HCC, MEL, SCLC	GBC
12	KVLTRNIEY	MEL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OC, OSCAR, UBC, UEC	GBM, HNSCC, SCLC	NSCLCother
13	AVAFFVLPSK			NHL
14	VAFFVLPSK			NHL
15	RLYAPWNISRL	OC		BRCA
16	KVFAEHKISY	CCC, NSCLCother, PACA, RCC, UBC	CRC, GC, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OC, OSCAR, SCLC	GBC
17	GGLSSQGVYY	GBC, SCLC	PACA, UEC	GC
18	RLYYSFKNITK	CLL, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OC, PACA, RCC, UBC	BRCA, SCLC	GBM
19	ALAAKLEVK		OC	UEC
20	LLPTVLIKK	BRCA, CRC, GBC, GBM, GC, HCC, MEL,	HNSCC, NSCLCsquam, OC, OSCAR, UBC	SCLC
		NSCLCadeno, NSCLCother, PACA, PRCA, RCC
21	SSLAELIAK	CRC, GBM, MEL, NSCLCadeno, RCC, SCLC	HCC, NHL
22	EGLFLLGCVK		MEL
23	RLSPGPRAY	BRCA, NSCLCadeno, UEC	RCC
24	KLETGWKK		GBM, SCLC
25	KTWAHCMSY	BRCA, NSCLCadeno, UEC	RCC
26	QLGYQAAVLK	BRCA	UEC
27	SGSTLECILYK	BRCA	UEC
28	STLECILYK	BRCA	UEC
29	KVLSILSRLK	CRC	HCC, NHL
30	ILDSSLLK	GBC, HCC, HNSCC, OSCAR, SCLC	MEL
31	HAFFPKTHR	HCC, OC	BRCA, CCC, CRC, GBC, GC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, PACA, UBC, UEC
32	LLDAEPPILY		BRCA, OC, UEC
33	KLLEDMVEK		OC, UEC
34	AIGTPLIGK	NSCLCadeno	NHL, OC
35	VLLLLSLLH	GBC, SCLC, UEC	HCC
36	QIRAELMKK	BRCA, CRC, GBC, HNSCC, MEL, OC, SCLC	CCC, HCC
37	EVILTTKTPK		GBM
38	SLFPYYNNLY	GBC, NHL, NSCLCsquam, OC, OSCAR, UEC	SCLC
39	KTQFPQLK	MEL, NHL, NSCLCother, NSCLCsquam, OSCAR, UBC	BRCA, GBC, HCC, NSCLCadeno, OC, SCLC
40	ALNDRFAGY		PRCA
41	RLGAARGQLR		PRCA
42	RVCMTVDSLVNK		MEL
43	TVYDSIWCNMK		OC, UEC
44	HAFPPGPNY	NSCLCadeno, UBC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
45	KCYEVGMMK		BRCA, OC, UEC
46	WTGNVPLK	GBC, HCC, OC, SCLC	MEL
47	ALFGNALVFY	NSCLCsquam, OSCAR	RCC
48	KGWNGQIFK		AML
49	ITAPLMPLGK	GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, OC, PACA, UBC, UEC	CCC, HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
50	HSAGIFSMY	CLL	NHL
51	VTADGALAMEK	GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, OC, PACA, UBC, UEC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
52	GMYEYGSIEK		MEL
53	KQALSLVRK	GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, OC, PACA, UBC, UEC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
54	GVTITKTLK		MEL
55	RLSAESKDLLK	OC, PACA, RCC, UEC	SCLC
56	TTYYPSPLNK	GBM	RCC
57	RVLYRPQLEK		HCC
58	VLYRPQLEK		HCC
59	KINQYIIKK		MEL
60	VVFPFPVNKR	GBM, MEL, OC, SCLC, UBC	AML, UEC
61	SLYDSEPRKK	GBC, SCLC, UEC	AML
62	GIFPKIMPK		HCC
63	SSFRPLLSK	BRCA, HCC, MEL, OC, SCLC, UEC	PRCA
64	SVLSRMLVR	BRCA, HCC, MEL, OC, SCLC, UEC	PRCA
65	RTIEELQNK	NSCLCsquam	HNSCC, OSCAR
66	RVKEIVINK		MEL
67	WREILHAQTLK		CLL
68	KGPMAGILAY		MEL
69	GLSTILLYH		MEL
70	VTAVASLLK		MEL
71	VLYELGIIGNNK		MEL
72	KLYPQCLQK	NHL	CLL
73	RCFSGPYLNK		CLL
74	HSTLVALFY		PRCA
75	IIFVPEMNK	CRC	UEC
76	IINESLLFY		MEL
77	WDDSQLPK		NHL
78	KTGTFVLYKS	NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, OC, SCLC	CCC
79	AVAAVLLSR		CLL
80	ALCGTQLFY		CLL
81	HLFLPFSYK		HCC
82	CLANYTVNK	OC, OSCAR, UEC	AML
83	KLADSVMAGK	CRC, GBM
84	QLYSPPSPSYR	NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam
85	IMPTFDLTK	HCC, MEL
86	RVSGSGGGGAG K	CLL, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OC, PACA, RCC, UBC	BRCA, SCLC	GBM
87	RLASVGLDAK	CLL	NHL
88	GTHVWVGLYK	CRC, NSCLCsquam, OC, UBC, UEC	BRCA, CCC, GBC, GC, HNSCC, NSCLCadeno, OSCAR, PACA
89	VIYVICRHK	NSCLCadeno, UEC	RCC
90	RTALLWGLKK	CCC, NSCLCother, UBC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR, RCC
91	IMKRQVKCITK	HNSCC, NSCLCsquam, OC, OSCAR, UBC	SCLC
92	KRIPFRPLAK	BRCA, NSCLCadeno, OC	HCC
93	SVEGLSRRLK	CCC, NSCLCother, UBC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR, RCC
94	GMTLLCEALK	PACA	PRCA
95	FLGLAFHPK	BRCA, OC, PRCA	HCC, NSCLCadeno
96	RAVSVNPGK		NHL
97	RVRALGSQY	GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, OC, PACA, UBC, UEC	CCC, HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
98	VSVAGSILAK	SCLC	GBM
99	RTYTCQVTY		NHL
100	TTNARILAR	GBC, GC, NSCLCsquam	HNSCC, MEL, OSCAR, UBC
101	HMDEFKRTQK	CCC, GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, PACA, UBC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
102	RLLQHTPSAR	HCC, NSCLCadeno, NSCLCsquam, PACA, SCLC	CRC, GBC, GC, RCC
103	SIYKKAVYR	NSCLCother, OSCAR	HNSCC
104	AWQGLVEK	CCC, GBC, GC, NSCLCadeno, NSCLCother, PACA, UBC	HNSCC, NSCLCsquam, OSCAR
105	QVLDLQSVK	CRC, GBC, GBM, HCC, HNSCC, MEL, NSCLCadeno, OC, OSCAR, UBC, UEC	AML, BRCA, NSCLCother, NSCLCsquam, SCLC
106	LLRSGLTLR	NHL, OSCAR	CCC
107	ILNLNKMVK	MEL, NSCLCother	NHL
108	KMPILSYWPY	MEL, NSCLCother	NHL
109	KLQNLPTLLY		OC, SCLC
110	IIFIPATILLK	PRCA	HCC
111	ATSPPASVR		MEL
112	ASLAAAVLAK	BRCA	HCC
113	VSIRNTLLY		AML
114	SLLTVSGAWAK		NHL
115	AILHPFRAK	PACA, UEC	GC
116	KGVKKELPQK	CCC, NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, SCLC, UBC	GBC, HNSCC, OC, OSCAR
117	TVFVELWLK	BRCA, OC, SCLC	CCC, HCC
118	SLRGSFPILY		CLL, NHL
119	RMGFRTLSK		AML
120	TRMQKAGFLYY		AML
121	LLPAARATSR	GC, NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, OC, PACA, UBC, UEC	CCC, HNSCC, OSCAR
122	LIGPLLICK	CCC	HCC
123	SLQGLTISY		GBM
124	VVYDTMIEK		GBM
125	VVYDTMIEKF		GBM
126	KILETSLK		MEL
127	GLAAGALLLY	NHL	CLL
128	KIKKPLSYR	CCC, HNSCC, PACA, UBC	OC, UEC
129	ALARVSSVKL	GBM, OC	CCC
130	KANSGNTFKY	AML	GBM
131	RVDSKQRYY	HCC, NSCLCother, NSCLCsquam, SCLC	GBM
132	ASSFRPLLSK	BRCA, HCC, MEL, OC, SCLC, UEC	PRCA
133	SFRPLLSK	BRCA, HCC, MEL,	PRCA
		OC, SCLC, UEC
134	SLLKPSGDYFK	GC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, UBC	CRC
135	TFKSVLLNK	CLL, GC, OC, SCLC	BRCA
136	ALSRMSQQY		NSCLCother
137	TVYVAMCHKF	HCC	SCLC
138	VSLSKMLKK	NHL	CLL
139	KAIIRVIPLK	HCC	CRC
140	RLLAAGQVIR		MEL
141	RLRDYISSLK	NHL	CLL
142	SPRVYWLGLNDR		CLL, NHL
143	KTLGKIAEK	BRCA, SCLC, UEC	OC
144	PLAMLAATCNK	GBM, SCLC	PRCA
145	SLFEGIYTIK		AML
146	TLLSYELAFK	AML	UBC
147	KLFMPRPK	GBC, OC, UEC	HCC, MEL
148	RIGNKGIYK	CRC, GBC, GC, HNSCC	NHL
149	TVFLSKYLKK	GC	UEC
150	LLLAAVTVK	CCC, GBC, GC, NSCLCadeno, OC	PACA, UBC
151	KVASFTVIGY	HCC	AML
152	KIICGVHYLY		MEL
153	LASSPAGHK		MEL
154	TIASVLVAR		MEL
155	ALSHAVNNY		HCC
156	VSLGIAVSK	GBM, MEL, NHL, NSCLCadeno, OC	HCC
157	SLPLQRILAMSK	BRCA, CCC, HNSCC, MEL, NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, OC, OSCAR, PACA, UBC	GBC
158	RALGVPFVPR	CRC, MEL, OC, RCC, UEC	CCC, GBC
159	LLLLPFLLY		PRCA
160	RLLPGKVVVVK		UEC
161	MKTLPAMLGTGK	NHL	CLL
162	LLALGAAYVY	CRC	NSCLCother
163	MLYYPSVSR		MEL
164	RLAQYTIER	GBC, OC, UEC	PACA
165	AATIISSAK		CLL
166	KVIAPGVIY	BRCA, CRC, GBC, GC, HNSCC, NSCLCadeno, NSCLCother, NSCLCsquam, OSCAR, PACA, UBC	CCC
167	MLKQARRPLFR	BRCA, HCC, HNSCC, PRCA, SCLC, UEC	OC
168	ATNGKVLKK	OSCAR, UBC	HNSCC
169	ATNGKVLKKR	OSCAR, UBC	HNSCC
170	LISGGSLRKL	HCC	NHL
171	ATIGLSVSK		HCC
172	SLLEADPFLK	OC, OSCAR, UEC	AML
173	VSYNRLIK	GC, HNSCC, OSCAR, UBC	CRC
174	KMMKRLMTVEK	GBC, HNSCC, OC, OSCAR, UEC	NSCLCsquam
175	VIGTTSSPK	NSCLCother, OC, SCLC, UEC
176	RLYDAYVNR	GBM, RCC
177	ALLGVIIAKK	RCC
178	RIYVYVKRK	HNSCC, OC, OSCAR, PRCA
179	KINPTASLK	MEL
180	RLKMAQESVSK	MEL
181	RVAEEILIK	SCLC
182	QICLPAIYK	CRC, GBC, NSCLCadeno, RCC
183	KVYIPPIINK	MEL
184	KVLEPPLGAR	AML
185	SIINFKPLTY	HCC
186	CTLPFKIFY	AML, GBM
187	KTCQVSGLLY	MEL, NSCLCsquam, SCLC
188	SSLPRAFQK	BRCA, CCC, CRC, GBC, GC, HCC, HNSCC, MEL, NHL, NSCLCadeno, NSCLCsquam, OSCAR, PACA, PRCA, RCC, SCLC, UBC, UEC
189	KVFEEPEDFLK	NHL
190	RSKWSNVFK	CLL, CRC, NHL
191	SLYNLGGAK	HNSCC, OSCAR
192	RSYSHWLK	CCC
193	IVYPSATDKTK	BRCA, GBC, GBM, HCC, RCC
194	PVLICLALSK	HCC, HNSCC, SCLC, UBC
195	KLQAKVLQY	OC, SCLC
196	AISSTVLGK	CCC, GBC, RCC
197	RIVDYLLEK	MEL
198	FLYGAQTVY	CLL
199	IVFPDVISK	GBM, SCLC
200	RVLPPLTRILK	NSCLCsquam
201	KVADFGLARLLK	BRCA, CLL, OC, PRCA
202	RLFPGLYLGY	HCC
203	IVAFIPLSNK	UEC
204	VAFIPLSNK	UEC
205	RVYPRPPSK	BRCA, HCC, PRCA
206	RLYEMILQR	AML
207	ATLNLFQIVSK	AML, OC
208	KTGWFTLLY	BRCA
209	KILDRVLSRY	GBM, HNSCC, SCLC
210	KIFQGQINK	HCC
211	VSLGTPIMK	NSCLCsquam, OC
212	RTIDRSVFK	NSCLCsquam, SCLC
213	KLYPTHACR	SCLC
214	KLFTSVFGVGLK		AML
215	KIWQNLRLK	GBM, OC	CCC
216	RVSSVKLISK	GBM, OC	CCC
217	RVYEGDGRNSLK		CLL, NHL
218	KAFNQSSIFTK		CLL
219	ALERKFRQK		UEC
220	ALPRQAFHSK	GBM, GC	AML
221	RLAVSTRGK	BRCA, CCC, CRC, GBM, GC, HNSCC, MEL, NSCLCother, NSCLCsquam, OC, OSCAR, PACA, SCLC, UBC, UEC	GBC, NSCLCadeno
222	RSNPYFQNK	GBC	HCC
223	GISNPITTSK	BRCA, NSCLCadeno, OC, SCLC
224	SLYDGFLSY	GBM, NSCLCother, OC, UEC
225	RVYPRPPSKTY	BRCA, HCC, PRCA
226	RVWLGKHYK	OC

BEISPIEL 3
In vitro Immunogenität von MHC Klasse I-präsentierten Peptiden
Um Informationen über die Immunogenität der TUMAPs der vorliegenden Erfindung zu erhalten, führten die Erfinder Untersuchungen mit einem in vitro T-Zell-Priming-Assay durch, der auf wiederholten Stimulationen von CD8+ T-Zellen mit künstlichen antigenpräsentierenden Zellen (aAPCs) basiert, die mit Peptid/MHC-Komplexen und Anti-CD28-Antikörpern beladen sind. Auf diesem Weg zeigten die Erfinder die Immunogenität der HLA-A*03-restringierten TUMAPs der Erfindung, was veranschaulicht, dass diese Peptide T-Zell-Epitope sind, gegen die in Menschen CD8+ Vorläufer-T-Zellen existieren (siehe Tabelle 10).
In vitro Priming von CD8+ T-Zellen
Um in vitro Stimulationen mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPC), beladen mit einem Peptid-MHC-Komplex (pMHC) und einem Anti-CD28-Antikörper, durchzuführen, haben die Erfinder zuerst CD8+ T-Zellen aus frischen HLA-A*02 Leukaphereseprodukten, durch Positivselektion mit CD8-Mikroperlen (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Deutschland) von gesunden Spendern, erhalten von den Universitätskliniken Mannheim, Deutschland, nach Einverständniserklärung, isoliert.
PBMCs und isolierte CD8+-Lymphozyte wurden bis zur Benutzung in einem T-Zellmedium (TCM) bestehend aus RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem humanem AB-Serum (PAN-Biotech, Aidenbach, Deutschland), 100 U/ml Penicillin 100 µg/ml Streptomycin (Cambrex, Köln, Deutschland), 1 mM Natriumpyruvat (CCPro, Neustadt, Deutschland) und 20 µg/ml Gentamycin (Cambrex) inkubiert. 2,5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Deutschland) und 10 U/ml IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Deutschland) wurden auch dem TCM auf diesem Schritt zugegeben.
Die Erzeugung von pMHC/anti-CD28 beschichteten Beads, T-Zell-Stimulationen und Auslesen erfolgte in einem hoch definierten in vitro System mit vier verschiedenen pMHC-Molekülen pro Stimulationsbedingung und 8 verschiedenen pMHC-Molekülen pro Auslesezustand.
Das aufgereinigte kostimulatorische Maus-IgG2a anti human CD28 Ab 9.3 (Jung et al., 1987) wurde unter Verwendung von Sulfo-N-Hydroxysuccinimidobiotin entsprechend der Empfehlung des Herstellers (Perbio, Bonn, Deutschland) chemisch biotinyliert. Die benutzen Beads waren Streptavidin-beschichtete Polystyrol-Partikel mit einem Durchmesser von 5,60 µm (Bangs Laboratories, Illinois/USA).
Die für die positive und negative Kontrollstimulationen benutzten pMHCs waren jeweils A*0201/MLA-001 (Peptid ELAGIGILTV (SEQ ID NO. 250) aus modifiziertem Melan-A/MART-1) und A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI aus DDX5, SEQ ID NO. 251).
800.000 Beads / 200 µl wurden in 96-Well-Platten in Gegenwart von 4 × 12,5 ng verschiedenen Biotin-pMHC beschichtet, gewaschen und 600 ng Biotin anti-CD28 anschließend in einem Volumen von 200 µl zugegeben. Die Stimulationen wurden in 96-Well-Platten durch Koinkubierung von 1×10⁶ CD8+ T-Zellen mit 2×10⁵ gewaschenen, beschichteten Beads in 200 µl TCM ergänzt mit 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) für 3 Tage bei 37°C initiiert. Die Hälfte des Mediums wurde dann mit frischem TCM, ergänzt mit 80 U/ml IL-2, ausgetauscht und die Inkubation wurde für 4 Tage bei 37°C weitergeführt. Dieser Stimulationszyklus wurde insgesamt dreimal durchgeführt. Für die pMHC-Multimerauslesung unter Verwendung von 8 verschiedenen pMHC-Molekülen pro Testbedingung wurde, wie zuvor beschrieben (Andersen et al., 2012), ein zweidimensionaler kombinatorischer Kodierungsansatz verwendet, wobei kleinere Modifikationen die Kopplung an 5 verschiedene Fluorochrome umfassen. Schließlich wurden Multimeranalysen durch das Färben der Zellen mit Live/Dead-nah IR-Farbstoff (Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), CD8-FITC-Antikörper Klon SKI (BD, Heidelberg, Deutschland) und fluoreszierenden pMHC-Multimeren durchgeführt. Für die Analyse wurde ein BD LSRII SORP-Zytometer, ausgestattet mit geeigneten Lasern und Filtern, verwendet. Die peptidspezifischen Zellen wurden als Prozentsatz der Gesamt-CD8+ Zellen berechnet. Die Auswertung der Multimeranalyse wurde unter Verwendung von FlowJo Software (Tree Star, Oregon, USA) durchgeführt. Das in-vitro-Priming von spezifischen Multimer+ CD8+ Lymphozyten wurde durch Vergleich mit negativen Kontrollstimulationen nachgewiesen. Die Immunogenität für ein vorgegebenes Antigen wurde gemessen, wenn festgestellt wurde, dass zumindest ein evaluierbares in vitro stimuliertes Well eines gesunden Spenders eine spezifische CD8+ T-Zelllinie nach der in vitro Stimulierung enthält (d. h. dieses Well enthielt zumindest 1% der spezifischen Multimer+ unter den CD8+ T-Zellen und der Prozentsatz der spezifischen Multimer+ Zellen war zumindest das 10-fache des Medians der negativen Kontrollstimulierungen).
In vitro Immunogenität der Peptide
Für getestete HLA-Klasse-I-Peptide konnte die in vitro Immunogenität durch die Erzeugung von Peptid-spezifischen T-Zelllinien nachgewiesen werden. Beispiele für die Ergebnisse der Durchflusszytometrie nach TUMAP-spezifischer Multimer-Färbung für 2 Peptide der Erfindung werden in zusammen mit einer entsprechenden Negativkontrollen gezeigt. Die Ergebnisse für 6 der Peptide werden in Tabelle 10 zusammengefasst.
Tabelle 10: In vitro Immunogenität von HLA-Klasse-I-Peptiden
Exemplarische Ergebnisse von in vitro-Immunogenitätsexperimenten, die vom Anmelder für die Peptide der Erfindung durchgeführt wurden. <20 % = +; 20 % - 49 % = ++; 50 % - 69 %= +++; >= 70 % = ++++

Seq ID No Sequenz Positive Wells [%]

232 AVAPPTPASK +

233 KTYETNLEIKK +

234 WFPFPVNK +

237 VLYGPAGLGK +

248 GLASRILDAK +

249 ATSGVPVYK ++++
BEISPIEL 4
Synthese der Peptide
Alle Peptide wurden unter Verwendung von Standard- und gut etablierter Festphasenpeptidsynthese unter Verwendung der Fmoc-Strategie synthetisiert. Die Identität und Reinheit jedes einzelnen Peptids wurde durch Massenspektrometrie und analytische RP-HPLC bestimmt. Die Peptide wurden als weiße bis gebrochen weiße Lyophilisate (Trifluoracetatsalze) in Reinheiten >50% erhalten. Alle TUMAPs werden bevorzugt als Trifluoracetatsalze oder Acetatsalze verabreicht, es sind auch andere Salzformen möglich.
Referenzliste

Alcoser, S. Y. et al., BMC Biotechnol. 11 (2011): 124
Allison, J. P. et al., Science. 270 (1995): 932-933
Andersen, R. S. et al., Nat Protoc. 7 (2012): 891-902
Andersen, N. L. et al., J Proteome Res. 11 (2012): 1868-1878
Appay, V. et al., Eur J Immunol. 36 (2006): 1805-1814
Banchereau, J. et al., Cell. 106 (2001): 271-274
Beatty, G. et al., J Immunol. 166 (2001): 2276-2282
Beggs, J. D., Nature. 275 (1978): 104-109
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological),. Vol.57 (1995): 289-300
Boulter, J. M. et al., Protein Eng. 16 (2003): 707-711
Braumuller, H. et al., Nature.(2013)
Bray, F. et al., Int J Cancer. 132 (2013): 1133-1145
Brossart, P. et al., Blood. 90 (1997): 1594-1599
Bruckdorfer, T. et al., Curr Pharm Biotechnol. 5 (2004): 29-43
Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357
Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332
Cohen, C. J. et al., J Immunol. 170 (2003b): 4349-4361
Cohen, S. N. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (1972): 2110-2114
Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science.(1995)
Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738
Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 4163-4170
Denkberg, G. et al., J Immunol. 171 (2003): 2197-2207
Falk, K. et al., Nature. 351 (1991): 290-296
Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No 11 [Internet] (2013),
Follenzi, A. et al., Nat Genet. 25 (2000): 217-222
Fong, L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (2001): 8809-8814
Forsey, R. W. et al., Biotechnol Lett. 31 (2009): 819-823
Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103
Gattinoni, L. et al., Nat Rev Immunol. 6 (2006): 383-393
Gnjatic, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (2003): 8862-8867
Godkin, A. et al., Int Immunol. 9 (1997): 905-911
Gragert, L. et al., Hum Immunol. 74 (2013): 1313-1320
Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 4th (2012)
Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual. 2nd (2014)
Gunawardana, C. et al., Br J Haematol. 142 (2008): 606-609
Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22 (2004): 346-353
Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838
Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (1987): 4611-4615
Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients. rd (2000)
Krieg, A. M., Nat Rev Drug Discov. 5 (2006): 471-484
Kuball, J. et al., Blood. 109 (2007): 2331-2338
Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987
Ljunggren, H. G. et al., J Exp Med. 162 (1985): 1745-1759
Longenecker, B. M. et al., Ann N Y Acad Sci. 690 (1993): 276-291
Lonsdale, J., Nat Genet. 45 (2013): 580-585
Lukas, T. J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (1981): 2791-2795
Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification. 3rd (2004)
Meziere, C. et al., J Immunol. 159 (1997): 3230-3237
Molina, J. R. et al., Mayo Clin Proc. 83 (2008): 584-594
Morgan, R. A. et al., Science. 314 (2006): 126-129
Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443
Mueller, L. N. et al., J Proteome Res. 7 (2008): 51-61
Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480
Mumberg, D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1999): 8633-8638
Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (2015)
Plebanski, M. et al., Eur J Immunol. 25 (1995): 1783-1787
Porta, C. et al., Virology. 202 (1994): 949-955
Rammensee, H. et al., Immunogenetics. 50 (1999): 213-219
Rini, B. I. et al., Cancer. 107 (2006): 67-74
Rock, K. L. et al., Science. 249 (1990): 918-921
Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132
Saiki, R. K. et al., Science. 239 (1988): 487-491
Schmitt, T. M. et al., Hum Gene Ther. 20 (2009): 1240-1248
Scholten, K. B. et al., Clin Immunol. 119 (2006): 135-145
Seeger, F. H. et al., Immunogenetics. 49 (1999): 571-576
Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics.(1986)
Silva, L. P. et al., Anal Chem. 85 (2013): 9536-9542
Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 187-195
Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094
Sturm, M. et al., BMC Bioinformatics. 9 (2008): 163
Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762
Thakkar, J. P. et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (2014): 1985-1996
Tran, T. T. et al., Photochem Photobiol. 90 (2014): 1136-1143
Walter, S. et al., J Immunol. 171 (2003): 4974-4978
Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261
Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423
World Cancer Report (2014)
Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577
Zufferey, R. et al., J Virol. 73 (1999): 2886-2892

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

WO 2007/028574 [0022]
EP 1760088 B1 [0022]
US 4897445 [0114]
US 20130096016 [0131]
WO 9518145 [0169]
US 5849589 [0195]
US 6406705 B1 [0196]
EP 2113253 [0201]
WO 2014/071978 A1 [0207]
WO 2014/191359 [0208]
WO 03/068201 [0217]
WO 2004/084798 [0217]
WO 0172768 [0217]
WO 03/070752 [0217]
US 4816567 [0244, 0246, 0250]
WO 9429348 [0247]
US 4342566 [0247]
US 2010/0113300 [0255]
US 2013/0115191 [0255]
WO 2004/033685 A1 [0255]
WO 2004/074322 A1 [0255]
WO 2012/056407 A1 [0255]
WO 2013/057586 A1 [0255]
WO 97/26328 [0266]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Gragert et al., 2013 [0069]
Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006 [0091]
Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997 [0091]
Godkin et al., 1997 [0093]
Rammensee et al., 1999 [0093]
Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) [0117]
Coligan et al., 1995)verwiesen [0117]
Scholten et al., 2006 [0162]
Cohen et al., 2003a [0217]
Cohen et al., 2003b [0217]
Denkberg et al., 2003 [0217]
Liddy et al., 2012 [0255]
Ljunggren et al. (Ljunggren and Karre, 1985) [0261]
Gattioni et al. and Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006) [0274]
Jung et al., 1987) [0326]
Alcoser, S. Y. et al., BMC Biotechnol. 11 (2011): 124 [0331]
Allison, J. P. et al., Science. 270 (1995): 932-933 [0331]
Andersen, R. S. et al., Nat Protoc. 7 (2012): 891-902 [0331]
Andersen, N. L. et al., J Proteome Res. 11 (2012): 1868-1878 [0331]
Appay, V. et al., Eur J Immunol. 36 (2006): 1805-1814 [0331]
Banchereau, J. et al., Cell. 106 (2001): 271-274 [0331]
Beatty, G. et al., J Immunol. 166 (2001): 2276-2282 [0331]
Beggs, J. D., Nature. 275 (1978): 104-109 [0331]
Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society Series B (Methodological),. Vol.57 (1995): 289-300 [0331]
Boulter, J. M. et al., Protein Eng. 16 (2003): 707-711 [0331]
Braumuller, H. et al., Nature.(2013) [0331]
Bray, F. et al., Int J Cancer. 132 (2013): 1133-1145 [0331]
Brossart, P. et al., Blood. 90 (1997): 1594-1599 [0331]
Bruckdorfer, T. et al., Curr Pharm Biotechnol. 5 (2004): 29-43 [0331]
Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357 [0331]
Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332 [0331]
Cohen, C. J. et al., J Immunol. 170 (2003b): 4349-4361 [0331]
Cohen, S. N. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (1972): 2110-2114 [0331]
Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science.(1995) [0331]
Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738 [0331]
Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 4163-4170 [0331]
Denkberg, G. et al., J Immunol. 171 (2003): 2197-2207 [0331]
Falk, K. et al., Nature. 351 (1991): 290-296 [0331]
Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1 0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No 11 [Internet] (2013) [0331]
Follenzi, A. et al., Nat Genet. 25 (2000): 217-222 [0331]
Fong, L. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (2001): 8809-8814 [0331]
Forsey, R. W. et al., Biotechnol Lett. 31 (2009): 819-823 [0331]
Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103 [0331]
Gattinoni, L. et al., Nat Rev Immunol. 6 (2006): 383-393 [0331]
Gnjatic, S. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (2003): 8862-8867 [0331]
Godkin, A. et al., Int Immunol. 9 (1997): 905-911 [0331]
Gragert, L. et al., Hum Immunol. 74 (2013): 1313-1320 [0331]
Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 4th (2012) [0331]
Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual. 2nd (2014) [0331]
Gunawardana, C. et al., Br J Haematol. 142 (2008): 606-609 [0331]
Gustafsson, C. et al., Trends Biotechnol. 22 (2004): 346-353 [0331]
Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838 [0331]
Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (1987): 4611-4615 [0331]
Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients. rd (2000) [0331]
Krieg, A. M., Nat Rev Drug Discov. 5 (2006): 471-484 [0331]
Kuball, J. et al., Blood. 109 (2007): 2331-2338 [0331]
Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987 [0331]
Ljunggren, H. G. et al., J Exp Med. 162 (1985): 1745-1759 [0331]
Longenecker, B. M. et al., Ann N Y Acad Sci. 690 (1993): 276-291 [0331]
Lonsdale, J., Nat Genet. 45 (2013): 580-585 [0331]
Lukas, T. J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (1981): 2791-2795 [0331]
Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification. 3rd (2004) [0331]
Meziere, C. et al., J Immunol. 159 (1997): 3230-3237 [0331]
Molina, J. R. et al., Mayo Clin Proc. 83 (2008): 584-594 [0331]
Morgan, R. A. et al., Science. 314 (2006): 126-129 [0331]
Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443 [0331]
Mueller, L. N. et al., J Proteome Res. 7 (2008): 51-61 [0331]
Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480 [0331]
Mumberg, D. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1999): 8633-8638 [0331]
Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (2015) [0331]
Plebanski, M. et al., Eur J Immunol. 25 (1995): 1783-1787 [0331]
Porta, C. et al., Virology. 202 (1994): 949-955 [0331]
Rammensee, H. et al., Immunogenetics. 50 (1999): 213-219 [0331]
Rini, B. I. et al., Cancer. 107 (2006): 67-74 [0331]
Rock, K. L. et al., Science. 249 (1990): 918-921 [0331]
Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132 [0331]
Saiki, R. K. et al., Science. 239 (1988): 487-491 [0331]
Schmitt, T. M. et al., Hum Gene Ther. 20 (2009): 1240-1248 [0331]
Scholten, K. B. et al., Clin Immunol. 119 (2006): 135-145 [0331]
Seeger, F. H. et al., Immunogenetics. 49 (1999): 571-576 [0331]
Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics.(1986) [0331]
Silva, L. P. et al., Anal Chem. 85 (2013): 9536-9542 [0331]
Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 187-195 [0331]
Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094 [0331]
Sturm, M. et al., BMC Bioinformatics. 9 (2008): 163 [0331]
Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762 [0331]
Thakkar, J. P. et al., Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (2014): 1985-1996 [0331]
Tran, T. T. et al., Photochem Photobiol. 90 (2014): 1136-1143 [0331]
Walter, S. et al., J Immunol. 171 (2003): 4974-4978 [0331]
Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261 [0331]
Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423 [0331]
World Cancer Report (2014) [0331]
Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577 [0331]
Zufferey, R. et al., J Virol. 73 (1999): 2886-2892 [0331]

Claims

Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 und Variantensequenzen davon, die mindestens zu 88% homolog zu SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 sind, und wobei die Variante an Molekül(e) des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) bindet und/oder T-Zellen induziert, die mit dem Variantenpeptid kreuzreagieren; und ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon, wobei das Peptid kein Polypeptid voller Länge ist.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid die Fähigkeit aufweist, an ein MHC-Klasse-I- oder -Il-Molekül zu binden, und wobei das Peptid, wenn es an das MHC gebunden ist, von CD4 und/oder CD8 T-Zellen erkannt werden kann.
Peptid oder Variante davon nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Aminosäuresequenz davon einen kontinuierlichen Abschnitt von Aminosäuren gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 umfasst.
Peptid oder Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Peptid oder die Variante davon eine Gesamtlänge von 8 bis 100, vorzugsweise von 8 bis 30, und mehr bevorzugt von 8 bis 16 Aminosäuren aufweist, und am meisten bevorzugt wobei das Peptid aus einer Aminosäuresequenz gemäß einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 besteht oder im Wesentlichen besteht.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Peptid modifiziert ist und / oder nicht-peptidische Bindungen einschließt.
Das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Peptid Teil eines Fusionsproteins ist, insbesondere umfassend N-terminale Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten invarianten Kette (Ii).
Antikörper, insbesondere löslicher oder membrangebundener Antikörper, vorzugsweise monoklonaler Antikörper oder ein Fragment davon, der das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, vorzugsweise das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 spezifisch erkennt, wenn er an ein MHC-Molekül gebunden ist.
T-Zell-Rezeptor, vorzugsweise löslich oder membrangebunden, oder ein Fragment davon, der mit einem HLA-Liganden reagiert, wobei der Ligand das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 ist, vorzugsweise das Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wenn es an ein MHC-Molekül gebunden ist.
T-Zell-Rezeptor nach Anspruch 8, wobei die Liganden-Aminosäuresequenz mindestens zu 88% einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 identisch ist, oder wobei die Liganden-Aminosäuresequenz aus einer der SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 besteht.
T-Zell-Rezeptor nach Anspruch 8 oder 9, wobei der T-Zell-Rezeptor als lösliches Molekül bereitgestellt wird und optional eine weitere Effektorfunktion wie eine immunstimulierende Domäne oder Toxin trägt.
Aptamer, der das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5 spezifisch erkennt, vorzugsweise das Peptid oder die Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das an ein MHC-Molekül gebunden ist.
Nukleinsäure, die für ein Peptid oder eine Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 5, einen Antikörper oder ein Fragment davon nach Anspruch 7, einen T-Zell-Rezeptor oder ein Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, gegebenenfalls verbunden mit einer heterologen Promotorsequenz, oder einen Expressionsvektor, der die Nukleinsäure exprimiert, kodiert.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, den T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9 oder die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor nach Anspruch 12, wobei die Wirtszelle vorzugsweise aus einer antigenpräsentierenden Zelle, wie beispielsweise einer dendritischen Zelle, einer T-Zelle oder einer NK-Zelle, ausgewählt ist.
In vitro Verfahren zur Herstellung von aktivierten T Lymphozyten, wobei das Verfahren ein in Kontakt bringen in vitro von T-Zellen mit Antigen-beladenen menschlichen Klasse-I oder II MHC-Molekülen umfasst, die auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle oder eines künstlichen Konstrukts, das eine Antigen-präsentierende Zelle nachahmt, exprimiert werden, für eine Zeitdauer die ausreichend ist, um die T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
Aktivierte T-Lymphozyten, hergestellt nach dem Verfahren nach Anspruch 14, welche selektiv eine Zelle erkennen, die ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 präsentiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mindestens einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dem Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 7, dem T-Zell-Rezeptor oder Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, dem Aptamer nach Anspruch 11, der Nukleinsäure oder dem Expressionsvektor nach Anspruch 12, der Wirtszelle nach Anspruch 13 oder den aktivierten T-Lymphozyten nach Anspruch 15 oder einen konjugierten oder markierten Wirkstoff und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger und gegebenenfalls pharmazeutisch akzeptable Hilfsstoffe und/oder Stabilisatoren.
Verfahren zur Herstellung des Peptids oder einer Variante davon nach einem der Ansprüche 1 bis 6, des Antikörpers oder Fragments davon nach Anspruch 7 oder des T-Zell-Rezeptors oder Fragments davon nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 13 und das Isolieren des Peptids oder der Variante davon, des Antikörpers oder des Fragments davon oder des T-Zell-Rezeptors oder des Fragments davon aus der Wirtszelle und/oder seinem Kulturmedium umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, der T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, das Aptamer nach Anspruch 11, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 12, die Wirtszelle nach Anspruch 13 oder der aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 15 zur Verwendung in der Medizin.
Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz, festgelegt in einem der Ansprüche 1 bis 4, präsentieren, wobei das Verfahren die Verabreichung einer effektiven Menge von aktivierter T-Zellen, wie es im Anspruch 15 definiert ist, umfasst.
Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, der Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, der T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, das Aptamer nach Anspruch 11, die Nukleinsäure oder der Expressionsvektor nach Anspruch 12, die Wirtszelle nach Anspruch 13 oder der aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 15 zur Verwendung in der Diagnose und/oder Behandlung von Krebs oder zur Verwendung in der Herstellung eines Medikamentes gegen Krebs.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei der Krebs aus einer Gruppe von akuter myeloischer Leukämie, Brustkrebs, cholangiozellulärem Karzinom, chronischer lymphatischer Leukämie, Darmkrebs, >Gallenblasenkrebs, Glioblastom, Magenkrebs, hepatozellulärem Karzinom, Plattenzellkarzinom im Kopf-Hals-Bereich, Melanom, Non-Hodgkin-Lymphom, Lungenkrebs (einschließlich nicht-kleinzelligen Lungenkrebs-Adenokarzinoms; Plattenepithelkarzinom, nicht kleinzelligen Lungenkrebses; kleinzelligen Lungenkrebses) Eierstockkrebs, Speiseröhrenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Prostatakrebs, Nierenzellkarzinom, Harnblasenkarzinom, Gebärmutter- und Endometriumkarzinom und anderen Tumoren ausgewählt wird, die eine Überexpression eines Proteins, von dem ein Peptid gemäß SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 226 abgeleitet ist, aufweisen.
Kit umfassend: (a) einen Behälter umfassend eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das/die Peptid/e nach einem der Ansprüche 1 bis 6, den Antikörper oder das Fragment davon nach Anspruch 7, den T-Zell-Rezeptor oder das Fragment davon nach Anspruch 8 oder 9, das Aptamer nach Anspruch 11, die Nukleinsäure oder den Expressionsvektor nach Anspruch 12, die Wirtszelle nach Anspruch 13 oder den aktivierte T-Lymphozyt nach Anspruch 15 in Lösung oder in lyophilisierter Form enthält; (b) gegebenenfalls, einen zweiten Behälter enthaltend ein Verdünnungsmittel oder eine Rekonstitutionslösung für die lyophilisierte Formulierung; (c) gegebenenfalls, mindestens ein weiteres Peptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 to SEQ ID No. 249, und (d) gegebenenfalls, Anweisungen zur (i) Verwendung der Lösung oder (ii) der Rekonstitution und/oder der Verwendung der lyophilisierten Formulierung.
Der Kit gemäß Anspruch 22 weiterhin umfassend ein oder mehr von (iii) einem Puffer, (iv) einem Verdünnungsmittel, (v) einem Filter, (vi) einer Nadel oder (v) einer Spritze.
Verfahren zur Herstellung eines personalisierten Krebsimpfstoffs oder einer verbindungsbasierten und/oder zellulären Therapie für einen einzelnen Patienten, wobei das Verfahren umfasst: a) Identifizieren von tumorassoziierten Peptiden (TUMAPs), die auf einer Tumorprobe des einzelnen Patienten präsentiert werden; b) Vergleichen der in a) identifizierten Peptide mit einem Warehouse von Peptiden, die im Vergleich zu normalem Gewebe auf Immunogenität und/oder Überpräsentation in Tumoren vorab gescreent wurden; c) Auswählen mindestens eines Peptids aus dem Warehouse, das einem im Patienten identifizierten TUMAP entspricht; und d) Herstellen und/oder Formulieren des personalisierten Impfstoffs oder der verbindungsbasierten oder zellulären Therapie basierend auf Schritt c).
Das Verfahren nach Anspruch 24, wobei die TUMAPs identifiziert werden durch: a1) Vergleichen von Expressionsdaten aus der Tumorprobe mit Expressionsdaten aus einer Probe von Normalgewebe, die dem Gewebetyp der Tumorprobe entspricht, um Proteine zu identifizieren, die in der Tumorprobe überexprimiert oder aberrant exprimiert werden; und a2) Korrelieren der Expressionsdaten mit Sequenzen von MHC-Liganden, die an MHC-Klasse-I- und/oder Klasse-II-Moleküle in der Tumorprobe gebunden sind, um MHC-Liganden zu identifizieren, die von Proteinen abgeleitet sind, die vom Tumor überexprimiert oder aberrant exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei die Sequenzen von MHC-Liganden durch Eluieren gebundener Peptide aus MHC-Molekülen, die aus der Tumorprobe isoliert sind, und Sequenzieren der eluierten Liganden identifiziert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei das dem Gewebetyp der Tumorprobe entsprechende Normalgewebe vom gleichen Patienten erhalten wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die im Warehouse enthaltenen Peptide basierend auf den folgenden Schritten identifiziert werden: aa. Durchführung der genomweiten Expressionsanalyse von Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) durch hochparallele Methoden, wie Microarrays oder sequenzbasiertes Expressionsprofiling, umfassend die Identifizierung von Genen, die in einem malignen Gewebe im Vergleich zu einem normalen Gewebe oder normalen Geweben überexprimiert sind; ab. Auswählen von Peptiden, die von selektiv exprimierten oder überexprimierten Genen kodiert werden, wie in Schritt aa nachgewiesen, und ac. Bestimmen einer Induktion von in vivo T-Zellreaktionen durch die Peptide, wie ausgewählt, umfassend in vitro Immunogenitätsassays mit menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern oder dem Patienten; oder ba. Identifizierung von HLA-Liganden aus der Tumorprobe mittels Massenspektrometrie; bb. Durchführung der genomweiten Expressionsanalyse von Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA) durch hochparallele Methoden, wie Microarrays oder sequenzbasiertes Expressionsprofiling, umfassend die Identifizierung von Genen, die in einem malignen Gewebe im Vergleich zu einem normalen Gewebe oder normalen Geweben überexprimiert sind; bc. Vergleichen der identifizierten HLA-Liganden mit den Genexpressionsdaten; bd. Auswählen von Peptiden, die von selektiv exprimierten oder überexprimierten Genen kodiert werden, wie in Schritt bc nachgewiesen; be. Wiederholtes Nachweisen ausgewählter TUMAPs aus Schritt bd auf Tumorgewebe und fehlender oder seltener Nachweis an gesunden Geweben und Bestätigung der Relevanz der Überexpression auf mRNA-Ebene; und bf. Bestimmen einer Induktion von in vivo T-Zellreaktionen durch die Peptide, wie ausgewählt, umfassend in vitro Immunogenitätsassays mit menschlichen T-Zellen von gesunden Spendern oder dem Patienten; oder
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die Immunogenität der im Warehouse enthaltenen Peptide durch ein Verfahren bestimmt wird, das in-vitro-Immunogenitätsassays, Patientenimmunmonitoring zur individuellen HLA-Bindung, MHC-Multimerfärbung, ELISPOT-Tests und/oder intrazelluläre Zytokinfärbung umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Warehouse eine Vielzahl von Peptiden umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 1 bis SEQ ID No. 249.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, ferner umfassend das Identifizieren mindestens einer Mutation, die für die Tumorprobe im Verhältnis zu normalem entsprechendem Gewebe des einzelnen Patienten einzigartig ist, und das Auswählen eines Peptids, das mit der Mutation korreliert, zur Aufnahme in den Impfstoff oder zur Erzeugung von Zelltherapien.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei die mindestens eine Mutation durch vollständige Genomsequenzierung identifiziert wird.