KR20230079160A

KR20230079160A - 상이한 유형의 암에 대한 면역요법에서의 사용을 위한 hla-a*02에 의해 디스플레이되는 아미드화된 펩티드 및 이들의 탈아미드화된 대응물

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Publication number: KR20230079160A
Application number: KR1020237014512A
Authority: KR
Inventors: 젠스 후켈만; 하이코 슈스터; 리카르다 한넨; 크리스토프 슈래더; 젠스 프리체; 프란지스카 호프가르드; 다니엘 코발르스키; 올리버 슈어
Original assignee: 이매틱스 바이오테크놀로지스 게엠베하
Priority date: 2020-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2023-06-05
Also published as: MX2023003367A; US11904003B2; US20240024440A1; US20240016910A1; BR112023005798A2; US20240016911A1; US20240016913A1; TW202229311A; WO2022069557A3; US20220111022A1; AR123634A1; CA3193564A1; US20240016912A1; AU2021353977A1; US11833195B2; US20240075119A1; US20240016909A1; WO2022069557A2; US20230338488A1; US20240016906A1

Abstract

본 발명은 (i) 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 및 (ii) MHC 분자(들)에 결합하고/하거나 상기 변이체 펩티드와 교차반응하는 T 세포를 유도하는 능력을 유지하는 변이체 서열, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

Description

상이한 유형의 암에 대한 면역요법에서의 사용을 위한 HLA-A*02에 의해 디스플레이되는 아미드화된 펩티드 및 이들의 탈아미드화된 대응물

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없음

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본 발명은 면역요법 방법에서의 사용을 위한 펩티드, 단백질, 핵산 및 세포에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암의 면역요법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종양 연관 T 세포 펩티드 에피토프를 단독으로 또는 예를 들어 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로 작용으로서 작용할 수 있는 다른 종양 연관 펩티드와 조합하여 항종양 면역 반응을 자극하거나 생체외(ex vivo)에서 T 세포를 자극하여 환자에게 이전하는 것에 관한 것이다. 또한, 주요 조직적합성 복합체(MHC)의 분자에 결합되는 펩티드 또는 이와 같은 펩티드는 항체, 가용성 T 세포 수용체 및 다른 결합 분자의 표적일 수 있다.

본 발명은 항종양 면역 반응을 유발하기 위한 백신 조성물에서 또는 약학적으로/면역학적으로 활성인 화합물 및 세포의 개발을 위한 표적으로써 사용할 수 있는 인간 종양 세포의 HLA 클래스 I 분자로부터 유래하는 여러 신규 펩티드 서열 및 이들의 변이체에 관한 것이다.

세계보건기구(WHO)에 따르면, 암은 2012년 전 세계적으로 4개 주요 비전염성 치명적 질환에 속하였다. 같은 해, 결장직장암, 유방암 및 호흡기암은 고소득 국가에서 10대 사망 원인에 등재되었다.

암 치료와 연관되는 중증 부작용과 비용을 고려할 때, 암 치료에서 사용할 수 있는 인자를 식별할 필요가 있다.

또한, 더 나은 암 진단, 예후 평가 및 치료 성공 예측으로 이어지는 암에 대한 바이오마커를 나타내는 요인을 식별할 필요가 있다.

암 면역요법

암 면역요법은 부작용을 최소화하면서 암 세포를 특이적으로 표적화하는 옵션을 나타낸다. 암 면역요법은 종양 연관 항원의 존재를 사용한다.

종양 연관 항원(TAA)의 현재 분류는 다음의 주요 군을 포함한다.

a) 암-고환 항원: T 세포에 의해 인식될 수 있는 것으로 최초로 식별된 TAA가 이 클래스에 속하며, 이는 기존에는 암-고환(CT) 항원으로 지칭되었다. 고환 세포는 클래스 I 및 II HLA 분자를 발현하지 않기 때문에, 이러한 항원은 정상 조직에서 T 세포에 의해 인식될 수 없으며, 따라서 면역학적으로 종양 특이적이라고 간주될 수 있다. CT 항원에 대한 잘 알려진 예는 MAGE 계열 구성원 및 NY-ESO-1이다.

b) 분화 항원: 이러한 TAA는 종양과 종양이 발생한 정상 조직 사이에서 공유된다. 대부분의 알려진 분화 항원은 흑색종 및 정상 멜라닌 세포에서 발견된다. 예는 티로시나아제 및 흑색종에 대한 멜란(Melan)-A/MART-1 또는 전립선암에 대한 PSA를 포함하나 이에 국한되지 않는다.

c) 과발현된 TAA: 광범위하게 발현된 TAA를 인코딩하는 유전자는 일반적으로 발현 수준이 낮은 조직학적으로 상이한 유형의 종양에서 그리고 많은 정상 세포에서 검출된 바 있다. 정상 조직에 의해 처리되고 잠재적으로 제시되는 다수의 에피토프가 T 세포 인식에 대한 임계 수준보다 낮을 수 있으며, 종양 세포에서 이들의 과발현은 이전에 확립된 내성을 파괴하여 항암 반응을 촉발할 수 있다. 이 클래스의 TAA에 대한 유력한 예는 Her-2/neu, 서바이빈, 텔로머라아제 또는 WT1이다.

d) 종양 특이적 항원: 이러한 고유한 TAA는 (β-카테닌, CDK4 등과 같은) 정상 유전자의 돌연변이로부터 발생한다. 이러한 분자 변화 중 일부는 신생물성 형질전환 및/또는 진행과 연관된다. 종양 특이적 항원은 일반적으로 정상 조직에 대한 자가면역 반응에 대한 위험성 없이 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 반면, 이러한 TAA는 대부분의 경우 식별된 해당 종양에만 관련되며 대개 많은 개별 종양 사이에서 공유되지 않는다. 또한, 펩티드의 종양 특이성(또는 연관성)은 펩티드가 종양 특이적(연관) 이소형을 갖는 단백질의 경우 종양 특이적(연관) 엑손으로부터 유래하는 경우 발생할 수 있다.

e) 종양바이러스 단백질: 이러한 TAA는 종양발생 과정에서 중요한 역할을 할 수 있는 바이러스 단백질이며, 이들은 (인간 기원이 아닌) 이물질이기 때문에, T 세포 반응을 일으킬 수 있다. 이러한 단백질의 예는 인간 유두종 유형 16 바이러스 단백질 및 자궁경부 암종에서 발현하는 E6 및 E7이다.

인간 내인성 레트로바이러스(HERV)는 인간 게놈의 유의한 부분(~8%)을 구성한다. 이러한 바이러스 요소는 수백만 년 전 게놈에 통합되었으며 그 후 세대를 거쳐 수직적으로 전달되었다. 대다수의 HERV는 돌연변이 또는 절단을 통해 기능적 활성을 상실하였으나, 예컨대 HERV-K 계통군의 구성원과 같은 일부 내인성 레트로바이러스는 여전히 기능적 유전자를 인코딩하며 레트로바이러스-유사 입자를 형성하는 것으로 나타난 바 있다. HERV 프로바이러스의 전사는 후생유전적으로 제어되며 정상 생리적 조건하에서 잠복성(silence)을 유지한다. 그러나, 바이러스 단백질의 활성 번역을 초래하는 재활성화 및 과발현은 특정한 질환 그리고 특히 상이한 유형의 암에 대해 설명된 바 있다. 이러한 HERV 유래 단백질의 종양 특이적 발현은 상이한 암 면역요법 유형을 위해 활용될 수 있다.

f) 비정상적인 번역 후 변형으로부터 발생하는 TTA: 이러한 TAA는 종양에서 특이적이 아니며 과발현되지도 않는 단백질로부터 발생할 수 있으나 종양에서 주로 활성인 번역 후 과정에 의해 종양과 연관된다. 이 클래스의 예는 변경된 글리코실화 패턴에서 발생하며 이는 종양 특이적일 수 있거나 종양 특이적이지 않을 수 있는 분해(degradation) 과정 동안 단백질 스플라이싱(splicing)과 같은 사건 또는 MUC1의 경우 종양에서 새로운 에피토프로 이어진다.

T 세포 기반 면역요법 표적은 종양 연관 또는 종양 특이적 단백질로부터 유래되는 펩티드 에피토프를 표적으로 하며, 이는 MHC 분자에 의해 제시된다. 종양 특이적 T 림프구에 의해 인식되는 항원, 즉, 이의 에피토프는 발현되고, 동일한 기원의 변경되지 않은 세포와 비교하여, 각각의 종양의 세포에서 대개 상향조절되는 세포인 효소, 수용체, 전사 인자 등과 같은 모든 단백질 클래스에서 유래되는 분자일 수 있다.

MHC 분자의 2가지 클래스인 MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II 가 있다. MHC 클래스 I 분자는 알파 중쇄 및 베타-2-마이크로글로불린으로 구성되며, MHC 클래스 II 분자는 알파 사슬 및 베타 사슬로 구성된다. 이들의 3차원 형태는 결합 그루브(groove)를 초래하며, 이는 펩티드와의 비공유 상호작용을 위해 사용된다.

MHC 클래스 I 분자는 대부분의 유핵 세포에서 발견할 수 있다. 이들은 대부분의 내인성 단백질, 결함 리보솜 생성물(DRIP) 및 보다 큰 펩티드의 단백질분해성 절단으로 인해 초래되는 펩티드를 제시한다. 그러나, 엔도솜 구획 또는 외인성 공급원으로부터 유래되는 펩티드 또한 MHC 클래스 I 분자에서 자주 발견된다. 이러한 비고전적인 클래스 I 제시 방법은 문헌에서 교차제시로 지칭된다 (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). MHC 클래스 II 분자는 대부분 전문적인 항원 제시 세포(APC)에서 발견할 수 있고 주로 내포작용 동안 APC에 의해 흡수되는 외인성 또는 막횡단 단백질의 펩티드를 제시하며 후속적으로 처리된다.

펩티드와 MHC 클래스 I 의 복합체는 적절한 T 세포 수용체(TCR)를 갖는 CD8 양성 T 세포에 의해 인식되며, 펩티드와 MHC 클래스 II 분자의 복합체는 적절한 TCR을 갖는 CD4 양성 보조 T 세포에 의해 인식된다. TCR, 펩티드 및 MHC가 이에 의해 1:1:1의 화학양론적 반응량으로 존재한다는 사실은 잘 알려져 있다.

CD4 양성 보조 T 세포는 CD8 양성 세포독성 세포에 의한 효과적인 반응을 유도하고 지속하는 데 중요한 역할을 한다. 종양 연관 항원(TAA)으로부터 유래되는 CD4 양성 T 세포 에피토프의 식별은 항종양 면역 반응을 촉발하기 위한 의약품의 개발을 위해 아주 중요하다. 종양 부위에서, T 보조 세포는 세포독성 T 세포(CTL) 친화적 사이토카인 환경을 지원하며 효과기 세포, 예를 들어, CTL, 자연 살해(NK) 세포, 대식세포 및 과립구를 유인한다.

염증이 부재한 경우, MHC 클래스 II 분자의 발현은 주로 면역계의 세포, 특히, 전문적 항원 제시 세포(APC), 예를 들어, 단핵구, 단핵구 유래 세포, 대식 세포, 수지상 세포로 제한된다. 암 환자에서, 종양의 세포는 MHC 클래스 II 분자를 발현하는 것으로 발견된 바 있다 (Dengjel et al., 2006).

본 발명의 신장된(더 긴) 펩티드는 MHC 클래스 II 활성 에피토프로서 작용할 수 있다.

MHC 클래스 II 에피토프에 의해 활성화되는 T 보조 세포는 항종양 면역에서 CTL 효과기 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 한다. TH1 유형의 T 보조 세포 반응을 촉발하는 T 보조 세포 에피토프는 CD8 양성 살해 T 세포의 효과기 기능을 지원하며, 이는 세포 표면 상에서 종양 연관 펩티드/MHC 복합체를 디스플레이하는 종양 세포에 대한 세포독성 기능을 포함한다. 이러한 방법으로, 종양 연관 T 보조 세포 펩티드 에피토프는, 단독으로 또는 다른 종양 연관 펩티드와 조합하여, 항종양 면역 반응을 자극하는 백신 조성물의 활성 약학적 성분으로서 작용할 수 있다.

HLA 클래스 II 분자의 구성적 발현이 대개 면역 세포로 국한되기 때문에, 클래스 II 펩티드를 원발성 종양으로부터 직접적으로 단리하는 가능성은 이전에는 가능한 것으로 간주되지 않았다. 그러나, Dengjel 등이 MHC 클래스 II 에피토프의 수를 종양으로부터 직접적으로 식별하는 데 성공하였다(WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

세포 면역 반응을 촉발(유발)하기 위한 MHC 클래스 I 펩티드의 경우, 이는 또한 MHC 분자에 결합해야 한다. 이러한 과정은 MHC 분자의 대립유전자 및 펩티드의 아미노산 서열의 특정 다형성에 의존한다. MHC 클래스 I 결합 펩티드는 대개 8 내지 12개 길이의 아미노산 잔기이며 대개 MHC 분자의 상응하는 결합 그루브와 상호작용하는 이의 서열 내에 2개의 보존된 잔기("앵커")를 함유하고 있다. 이러한 방식으로, 각각의 MHC 대립유전자는 결합 그루브에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 결정하는 "결합 모티프"를 갖는다.

MHC 클래스 I 의존 면역 반응에서, 펩티드는 종양 세포에 의해 발현되는 특정한 MHC 클래스 I 분자와 결합할 수 있어야 하며, 또한 후속적으로 특이적 TCR을 갖는 T 세포에 의해 인식되어야 한다.

단백질이 T 림프구에 의해 종양 특이적 또는 연관 항원으로 인식되고 치료에 사용되려면, 특정한 전제 조건이 충족되어야 한다. 항원은 주로 종양 세포에 의해 발현되어야 하며 정상적인 건강한 조직에 의해서는 발현되지 않거나 비교적 소량으로 발현되어야 한다. 정상적인 건강한 조직과 비교하여, 펩티드가 종양 세포에 의해 과제시되는 것이 유리할 수 있다. 또한, 각각의 항원이 종양 유형으로뿐만 아니라 높은 농도(즉, 세포당 각각의 펩티드의 복제 수)로 제시되는 것이 바람직하다. 종양 특이적 및 종양 연관 항원은, 예를 들어, 세포 주기 제어 또는 세포자멸사(apoptosis)의 억제에서, 흔히 기능 때문에 정상 세포를 종양 세포로 형질전환하는 데 직접적으로 관련되는 단백질로부터 유래된다. 또한, 형질전환에 대해 직접적인 원인이 되는 단백질의 하류 표적은 상향조절될 수 있으며, 따라서 간접적으로 종양 연관일 수 있다. 또한 이러한 간접적 종양 연관항원은 백신접종 접근법의 표적이 될 수 있다(Singh-Jasuja et al., 2004, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 종양 연관 항원에서 유래되는 이러한 펩티드("면역원성 펩티드")가 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) T 세포 반응을 야기하기 위해서는 에피토프가 항원의 아미노산 서열에서 제시되는 것이 필수적이다.

TAA는 T 세포 기반 면역요법의 개발을 위한 시작점일 수 있다. TAA를 식별하고 특성화하는 방법은 대개 환자 또는 건강한 대상체로부터 단리될 수 있는 T 세포의 사용에 기반하거나 종양과 정상 조직 사이의 차등 전사 프로필 또는 차등 펩티드 발현 패턴의 생성에 근거한다. 그러나, 종양 조직 또는 인간 종양 세포주에서, 또는 선택적으로 이러한 조직 또는 세포주에서, 과발현되는 유전자의 식별은 이러한 유전자로부터 전사된 항원의 면역 치료에서의 사용에 대한 정확한 정보를 제공하지 않는다. 이는 상응하는 TCR을 갖는 T 세포가 존재해야만 하며 이러한 특정 에피토프에 대한 면역적 내성이 없거나 최소한이어야 하기 때문에 이러한 항원의 에피토프의 개별 하위집단만이 이러한 응용에 적합하기 때문이다.

본 발명에 따른 특정 TCR(예를 들어, 가용성 TCR) 및 항체 또는 다른 결합 분자(스캐폴드)에 의해 펩티드-MHC를 표적화하는 경우, 기저 펩티드의 면역원성은 이차적이다. 이러한 경우, 제시는 결정 인자이다.

종양 연관 펩티드를 생성하는 탈글리코실화 및 후속적인 탈아미드화

TAA는 종양에 특이적이거나 과발현된 단백질로부터만 발생하는 것이 아닐 수 있다. 또한, 이들은 특이적이지 않거나 종양에서 과발현되지 않은 단백질의 비정상적인 번역 후 변형(PTM)에서 발생할 수 있다. 그러나, 이러한 TAA는 종양에서 주로 활성화되는 번역 후 과정과 연관되는 종양이 될 수 있다.

번역 후 변형은 면역펩티돔(immunopeptidome)의 레퍼토리를 변경하고 확장하며 다양한 기능과 결과를 갖는다. 일부 PTM은 종양 세포의 면역 회피 전략에 기여할 수 있는 HLA 복합체에 대한 변형된 펩티드의 결합을 방해한다(Andersen et al., 1999). 다른 변형은 자가면역 질환과 연관된 바 있는 더 높은 HLA 친화도 또는 증가된 면역원성을 야기하지만(Arentz-Hansen et al., 2000; McGinty et al., 2015; Sidney et al., 2018; Raposo et al., 2018), 악성종양에 있어서 면역요법을 위해 사용될 수 있다.

이전 PTM 분석은 탈아미드화를 HLA I 제시 면역펩티드의 상당히 일반적인 변형으로 식별하였다(Han et al., 2011; Mei et al., 2020). 이러한 화학적 반응은 아스파라긴(N)에서 아스파르트산(D)으로의 아미노산 전환을 야기한다(Knorre, Kudryashova, and Godovikova 2009; Mei et al., 2020).

N 탈아미드화는 막 연관 단백질로부터 유래되는 펩티드에서 농축되고 서열 모티프 N[X^P][ST]와 연관되며, 여기서 X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이고 세린(S) 또는 트레오닌(T)이 이어진다(Han et al., 2011; Cao et al., 2017; Mei et al., 2020). 이러한 모티프는 확립된 N-글리코실트렌스퍼라아제에 대한 인식 모티프이며(Yan and Lennarz 2005; Petersen, Purcell, and Rossjohn 2009), 이는 소포체(ER)에서 N 탈아미드화를 신생 글리코실화에 연결한다. 기전적으로, 단백질 또는 폴리펩티드는 ER에서 번역되는 동안 글리코실화된다. 이들은 세포질로 방출된 후 펩티드-N-글리카나아제(PNGase)에 의해 탈글리코실화된다. 또한, 이러한 가수 분해 과정 동안, N 잔기는 D로 탈아미드화되며, 이는 아미노산 서열에서 말단 변화를 야기한다. 프로테아좀에서 단백질 또는 폴리펩티드의 추가 분해 후, 펩티드는 ER로 재수송된다. 여기에서, 이들은 세포막으로 전위되는 HLA 복합체에 결합하며 세포 표면 상에 탈아미드화된 펩티드를 제시한다(도 1 참조)(Misaghi et al., 2004; Petersen, Purcell, and Rossjohn 2009; Mei et al., 2020). 이러한 기전은 잠재적으로 T 세포가 감염 동안 교란된 글리코실화를 갖는 세포를 인식하고 제거할 수 있게 하지만 또한 변경된 종양 세포 대사로부터 초래된다.

이전 PTM 분석은 탈아미드화를 HLA I 제시 면역펩티드의 상당히 일반적인 변형으로 식별하였다(Han et al., 2011; Mei et al., 2020). 이러한 화학적 반응은 아스파라긴(N)에서 아스파르트산(D)으로의 아미노산 전환을 야기한다(도 2 참조)(Knorre et al., 2009; Mei et al., 2020).

암의 비정상적 글리코실화는 초기에 면역억제 역할과 연관이 있었으나(Liu and Rabinovich 2005; Rodriguez et al., 2018; De Bousser et al., 2020), 누적된 증거는 T 세포 기반 요법을 위해서도 사용될 수 있음을 나타낸다. 이에 따라, 당단백질 자체 (Posey et al., 2016; Maher et al., 2016; Rodriguez, Schetters, and van Kooyk 2018; De Bousser et al., 2020) 또는 글리코실화 의존성 탈아미드화 펩티드는 신항원으로서 작용하며 표적화될 수 있다. 병원체의 인간 면역결핍 바이러스 제1형 외피 당단백질(GP)(Behrens et al., 2017; Ferris et al., 1999), C형 간염 GP E1(Selby et al., 1999) 및 림프구성 맥락수막염 바이러스 GP 1(Hudrisier et al., 1999) 펩티드뿐만 아니라 흑색종에 있는 티로시나아제 펩티드(Mosse et al., 1998; Schaed et al., 2002; Altrich-VanLith et al., 2006; Ostankovitch et al., 2009)를 사용하여 문헌에서 탈아미드화된 펩티드의 면역원성 역할에 대한 일부 잘 설명된 예가 있다.

따라서, 탈아미드화된 펩티드 및 위에서 설명한 항원 제시의 비표준 경로는 T 세포 기반 종양 면역요법의 관심 표적으로 작용한다.

제1 양태에서, 본 발명은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 및 이의 변이체 서열로서 MHC 분자(들)에 결합하고/하거나 상기 변이체 펩티드와 T 세포 교차-반응을 유도하는 변이체 서열, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

다음의 표(표 1A, 1B, 2A 및2B)는 본 발명의 따른 펩티드, 이들의 각각의 서열 번호 및 이러한 펩티드에 대한 장래의 기원(기저) 유전자를 나타낸다.

표 1A: 본 발명에 따른 펩티드. 각각의 행의 2개의 인접한 펩티드는 야생형 서열(우측 열)이며, 이는 잠재적인 N-글리코실화 모티프 및 상기 N-글리코실화 모티프가 없는 돌연변이 형태(좌측 열)를 포함하며, 여기서 N(Asn) 잔기는 이의 탈아미드화된 변이체 D(Asp)로 대체되었다.

표 2A: 본 발명에 따른 탈아미드화되지 않은 펩티드 및 이들이 유래되는 하나의 예시적인 기원 전사물 ID((Ensembl 데이터베이스(https://www.ensembl.org/)로부터 취득한 ENST ID), 그러나, 펩티드는 본원에 기재하지 않은 다른 추가적인 또는 대안적인 전사로부터 더 유래될 수 있다. 기원이 야생형 변이체에 대해 표시되어 있으나 표 1A의 개요에서 명시된 바와 같이 탈아미드화된 대응물에도 마찬가지로 적용된다는 점을 이해하는 것이 중요하다.

표 2B: 본 발명에 따른 펩티드 및 이들이 유래되는 하나의 예시적인 기원 전사물 ID( (Ensembl 데이터베이스(https://www.ensembl.org/)로부터 취득한 ENST ID), 그러나, 펩티드는 본원에 기재되지 않은 다른 추가적인 또는 대안적인 전사물로부터 더 유래될 수 있다.

또한 본 개시내용은 일반적으로 증식성 질환의 치료에서의 용도를 위한 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 문맥에서 증식성 질환은 예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암이다.

서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 본 발명에 따른, 단독으로 또는 조합하여, 펩티드가 특히 바람직하다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는, 증식성 질환의, 바람직하게는 조합된, 치료를 위한 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 MHC 분자 클래스 I 또는, 길이 변이체와 같은 신장된 형태로, MHC 클래스 II에 결합하는 능력을 갖는 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 신장된 펩티드에 관한 것으로, 이는 (예를 들어, 백신으로서) 투여 후 세포 내 처리되어 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산으로 구성되거나 본질적으로 구성되는 더 짧은 펩티드로 이어질 수 있으며, 이는 세포 표면의 HLA에 의해 제시된다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산으로 (각각) 구성되거나 본질적으로 구성된다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 비-펩티드 결합을 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것으로, 여기서 상기 펩티드는 융합 단백질, 특히, HLA-DR 항원 연관 불변 사슬(Ii)의 N-말단 아미노산 또는, 예를 들어, 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은, 항체에 (또는 이의 서열로) 융합되는 단백질이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 발현할 수 있고/있거나 발현하는 발현 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 질환의 치료에서의 또는 의학에서의, 특히, 암의 치료에서의 용도를 위한 본 발명에 따른 펩티드, 본 발명에 따른 핵산 또는 본 발명에 따른 발현 벡터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 MHC와 본 발명에 따른 상기 펩티드의 복합체에 대해 특이적인 항체 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

또한, 본 개시내용은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 이로 본질적으로 구성되는 펩티드와 복합체를 형성하는 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하는 방법에 관한 것일 수 있으며, 이는 상기 MHC 클래스 I 분자를 발현하는 세포를 함유하는 유전자 조작된 비인간 포유류를 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 이로 본질적으로 구성되는 펩티드와 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 분자로 면역화하는 단계; mRNA 분자를 상기 비인간 포유류의 항체 생성 세포로부터 단리하는 단계; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩되는 단백질 분자를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 단계; 및 적어도 하나의 파지를 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하는 단계;를 포함하며, 여기서 상기 적어도 하나의 파지는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 이로 본질적으로 구성되는 펩티드와 복합체를 형성하는 상기 MHC 클래스 I 분자에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 디스플레이한다. 다른 양태에서, 항체는 단클론 항체일 수 있다.

일 양태에서, 항체는 100 nM 미만, 더 바람직하게는 50 nM 미만, 더 바람직하게는 10 nM 미만, 더 바람직하게는 1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.01 nM 미만의 결합 친화도(K_d)를 갖는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열을 포함하거나, 이로 구성되거나 또는 이로 본질적으로 구성되는 항원과 복합체를 형성하는 상기 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있다.

다른 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 항체를 인간화하는 단계를 더 포함할 수 있다. 양태들에서, 항체를 생성하는 방법은 항체와 독소를 접합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 항체와 면역 자극 도메인을 접합하는 단계를 더 포함할 수 있다.

일 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 이중특이성 항체의 형태로 항체를 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 키메라 항체의 형태로 항체를 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 Fv의 형태로 항체를 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 Fab의 형태로 항체를 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 Fab'의 형태로 항체를 변형하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 항체를 생성하는 방법은 항체를 ¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ³H, ³²P 및 ³⁵S로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있는 방사성뉴클레오티드를 사용하여 표지하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 비인간 포유류는 마우스일 수 있다.

본 발명은 TCR, 특히 자가유래 및 동종이형 T 세포로 조작된 가용성 TCR 및 클로닝된 TCR 및 이의 제조 방법 및 상기 TCR을 갖거나 상기 TCR과 교차 반응하는 NK 세포 또는 다른 세포에 관한 것이다. 가용성 TCR은 100 nM 미만, 더 바람직하게는 50 nM 미만, 더 바람직하게는 10 nM 미만, 더 바람직하게는 1nM 미만, 더 바람직하게는 0.1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.01 nM 미만의 결합 친화도(K_d)를 가질 수 있다. 반면, 클로닝된 세포 기반 TCR은 50 μM 미만, 더 바람직하게는 25 μM 미만, 더 바람직하게는 10 μM 미만, 더 바람직하게는 1 μM 미만, 더 바람직하게는 0.1 μM 미만의 결합 친화도(K_d)를 가질 수 있다.

항체 및 TCR은 당면한 본 발명에 따른 펩티드의 면역요법 용도의 추가적인 실시양태이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 위에서 설명한 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 항원 제시 세포 및, 바람직하게는 수지상 세포인 본 발명에 따른 숙주 세포에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 상기 방법에 관한 것이며, 여기서 항원은 항원 제시 세포와 충분한 양의 항원을 접촉하게 하여 적합한 항원 제시 세포 또는 인공 항원 제시 세포의 표면 상에 발현되는 클래스 I 또는 II MHC 분자 상에 탑재된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 관한 것이며, 여기서 항원-제시 세포는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102를 함유하는 상기 펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.

또한, 본 발명은 활성화된 T 세포에 관한 것이며, 이는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성되고, 여기서 상기 T 세포는 본 발명에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포를 선택적으로 인식한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자 내 표적 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이며, 이 방법은 환자에게 본 발명에 따라 생성된 바와 같은 유효수의 T 세포를 투여하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 약제로서의 또는 약제의 제조에서의 임의의 설명된 바와 같은 펩티드, 본 발명에 따른 핵산, 본 발명에 따른 발현 벡터, 본 발명에 따른 세포, 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구, TCR 또는 항체 또는 다른 펩티드 및/또는 펩티드-MHC 결합 분자의 용도에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 약제는 암에 대해 활성이다.

바람직하게는 상기 약제는 가용성 TCR 또는 항체를 기반으로 하는 세포 요법, 백신 또는 단백질이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 용도에 관한 것이며, 여기서 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암, 그리고 바람직하게는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 세포이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른, 여기서 "표적"이라고 하는 펩티드를 기반으로 하는 바이오마커에 관한 것이며, 표적은 암, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암의 진단에서 사용될 수 있다. 마커는 펩티드(들) 자체의 과제시 또는 해당하는 유전자(들)의 과발현일 수 있다. 또한 마커는 치료, 바람직하게는 면역요법, 가장 바람직하게는 바이오마커에 의해 식별되는 동일한 표적을 표적으로 하는 면역요법의 성공 가능성을 예측하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 가용성 TCR은 MHC와의 복합체 내 관심 펩티드의 존재를 검출하기 위해 종양의 절편을 염색하는 데 사용될 수 있다.

임의적으로, 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가 효과기 기능을 보유한다.

또한 본 발명은 암 치료의 맥락에서 이러한 새로운 표적의 용도에 관한 것이다.

[발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]

면역 반응의 자극은 숙주 면역계에 의해 이물질로 인식되는 항원의 존재에 의존적이다. 종양 연관 항원의 존재의 발견은 종양 성장에 개입하기 위한 숙주 면역계의 사용의 가능성을 제기하였다. 면역계의 체액성 및 세포성 아암(arm) 모두를 활용하는 다양한 기전이 현재 암 면역요법을 위해 탐색되고 있다.

세포 면역 반응의 특정 요소는 종양 세포를 특이적으로 인식하고 파괴할 수 있다. 종양 침윤 세포 집단으로부터의 또는 말초 혈액으로부터의 T 세포의 단리는 이러한 세포가 암에 대한 자연 면역 방어에 있어서 중요한 역할을 한다는 점을 시사한다. 특히, 시토졸에 위치한 단백질 또는 결함 리보솜 생성물(DRIPS)로부터 유래한 대개 8 내지 12개 아미노산 잔기의 펩티드를 갖는 MHC 클래스 I 분자를 인식하는 CD8 양성 T 세포는 이러한 반응에서 중요한 역할을 한다. 또한, 인간의 MHC 분자는 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭된다.

달리 언급된 경우를 제외하고 본원에서 사용되는 모든 용어는 아래와 같이 정의된다.

용어 "T 세포 반응"은 특정 증식 및 시험관내 또는 생체내 펩티드에 의해 유도되는 효과기 기능의 활성화를 의미한다. MHC 클래스 I 제한 세포독성 T세포의 경우, 효과기 기능은 펩티드 펄스, 펩티드 전구체 펄스 또는 자연 펩티드 제시 표적 세포의 용해, 사이토카인, 바람직하게는 펩티드에 의해 유도되는 인터페론-감마, TNF-알파 또는 IL-2의 분비, 또는 효과기 분자의 분비, 바람직하게는 펩티드에 의해 유도되는 그랜자임 또는 퍼포린의 분비 또는 탈과립일 수 있다.

용어 "펩티드"는 본원에서 인접한 아미노산의 알파-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 전형적으로 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지칭하는 데 사용된다.

또한, 용어 “펩티드”는 인접한 아미노산의 알파-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 전형적으로 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기의 염을 포함한다. 바람직하게는 염은, 예를 들어, 염화물 또는 아세트산(트리플루오로아세트산) 염과 같은, 펩티드의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 생체내에서의 이들의 상태(들)에 있어서 펩티드와 실질적으로 상이한데, 펩티드는 염의 형태가 아니며 생체내 상대이온과 연관되지 않기 때문이다.

또한. 용어 "펩티드"는 "올리고펩티드"를 포함한다. 용어 "올리고펩티드"는 본원에서 인접한 아미노산의 알파-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 전형적으로 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지칭하는 데 사용된다. 올리고펩티드의 길이는 정확한 에피토프 또는 에피토프들이 올리고펩티드에서 유지되는 한 발명에 중요하지 않다.

용어 "폴리펩티드"는 본원에서 인접한 아미노산의 알파-아미노 기와 카르복실 기 사이의 펩티드 결합에 의해 전형적으로 서로 연결되는 일련의 아미노산 잔기를 지칭하는 데 사용된다. 폴리펩티드의 길이는 올바른 에피토프가 유지되는 한 본 발명에 중요하지 않다. 펩티드 또는 올리고펩티드와 달리, 용어 폴리펩티드는 약 30개보다 많은 아미노산 잔기를 함유하는 분자를 의미한다.

이러한 분자를 코딩하는 펩티드, 올리고펩티드, 단백질 또는 폴리뉴클레오티드는 면역 반응을 유도할 수 있는 경우 "면역원성"이다(따라서 본 발명 내에서 "면역원"이다). 본 발명의 경우, 면역원성은 T 세포 반응을 유도하는 능력으로 더 구체적으로 정의된다. 따라서, "면역원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 분자이며, 본 발명의 경우, T 세포 반응을 유도할 수 있는 분자이다. 다른 양태에서, 면역원은 펩티드, MHC와 펩티드의 복합체, 올리고펩티드 및/또는 특정 항체나 이에 대한 TCR을 증가시키는 데 사용되는 단백질일 수 있다.

클래스 I T 세포 "에피토프"는 적절한 친화도를 갖는 MHC/펩티드 복합체에 결합하는 일치하는 T 세포 수용체를 갖는 T 세포에 의해 인식될 수 있는 삼성분(ternary) 복합체(MHC 클래스 I 알파 사슬, 베타-2-마이크로글로불린 및 펩티드)를 생성하는 클래스 I MHC 분자에 결합되는 짧은 펩티드를 필요로 한다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 펩티드는 전형적으로 8 내지 12개 길이의 아미노산이며, 가장 전형적으로 9개 길이의 아미노산이다.

인간에서, MHC 클래스 I 분자를 인코딩하는 3개의 상이한 유전자 부위인 HLA-A, HLA-B, 및 HLA-C가 있다(또한, 인간의 MHC 분자는 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭된다). HLA-A*01, HLA-A*02 및 HLA-A*07이 이러한 부위에서 발현될 수 있는 상이한 MHC 클래스 I 대립유전자의 예이다.

본 발명의 펩티드는, 바람직하게는 본원에서 설명되는 발명의 백신으로 포함되는 경우, HLA-A*02로 결합한다.

또한 백신은 범결합 MHC 클래스 II 펩티드를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 백신은 HLA-A*02-양성인 환자에서 암을 치료하기 위해 사용될 수 있는 반면, 이러한 펩티드의 범결합 특성으로 인해 MHC 클래스 II 동종이형에 대한 선택은 필요하지 않다.

본 발명의 HLA-A*02 펩티드가 다른 대립유전자에 결합하는 펩티드, 예를 들어, HLA-A*24와 조합되는 경우, MHC 클래스 I 대립형질을 단독으로 처리하는 것과 비교하여 더 높은 백분율의 임의의 환자 집단을 치료할 수 있다. 대부분의 집단에서 환자의 50% 미만을 대립유전자만으로 다룰 수 있었으며, HLA-A*24 및 HLA-A*02 에피토프를 포함하는 백신은 임의의 관련 집단에서 환자의 적어도 60%를 치료할 수 있다. 구체적으로, 다음 백분율의 환자는 다양한 지역에서 이러한 대립유전자 중 적어도 하나에 대해 양성일 것이다: 미국 61%, 서유럽 62%, 중국 75%, 한국 77%, 일본 86%(allelefrequencies.net으로부터 계산됨).

바람직한 실시양태에서, 용어 “뉴클레오티드 서열”은 데옥시리보뉴클레오티드의 이종중합체를 지칭한다.

특정 펩티드, 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 자연 발생하거나 합성하여 구성될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 인코딩하는 DNA 단편은 cDNA 단편 및 짧은 올리고뉴클레오티드 링커, 또는 일련의 올리고뉴클레오티드로부터 조립되어 미생물 또는 바이러스 오페론에서 유래되는 조절 요소를 포함하는 재조합 전사 단위에서 발현될 수 있는 합성 유전자를 제공한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "펩티드를 코딩(또는 인코딩)하는 뉴클레오티드"는 예를 들어, 수지상 세포 또는 TCR 생성을 위해 유용한 다른 세포계에 의해 서열이 발현되는 생물학적 체계와 호환 가능한 인공(사람이 만든) 시작 및 정지 코돈을 포함하는 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 핵산 서열에 대한 지칭은 단일 가닥 및 이중 가닥 핵산 모두를 포함한다. 따라서, 예를 들어, DNA의 경우, 특정 서열이란, 문맥에서 달리 명시되지 않는 한, 이러한 서열의 단일 가닥 DNA, 보완을 갖는 이러한 서열의 중복(이중 가닥 DNA) 및 이러한 서열의 보완을 지칭한다.

용어 "코딩 영역"은 자연적인 게놈 환경에서 유전자의 천연 발현 생성물을 자연적으로 또는 정상적으로 코딩하는 유전자의 부분(즉, 유전자 본래의 발현 생성물을 생체내 코딩하는 영역)을 지칭한다.

코딩 영역은 비변이("정상"), 변이 또는 변경된 유전자로부터 유래될 수 있거나, 심지어 DNA 서열, 또는 DNA 합성 기술을 보유한 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 실험실에서 전적으로 합성된 유전자로부터 유래될 수 있다.

용어 "발현 생성물"은 유전자의 자연 번역 생성물인 폴리펩티드 또는 단백질, 및 유전적 코딩 퇴화 및 이에 따른 동일한 아미노산(들)의 코딩으로 인해 초래되는 임의의 핵산 서열 코딩 등가물을 의미한다.

코딩 서열을 지칭하는 경우, 용어 "단편"은 발현 생성물이 완전한 코딩 영역의 발현 생성물과 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 필수적으로 유지하는 완전한 코딩 영역보다 적은 부분을 포함하는 DNA의 부분을 의미한다.

용어 "DNA 분절"은 적어도 1회 이상의 실질적으로 순수한 형태로, 즉, 오염 내인성 물질이 없고 표준 생화학적 방법에 의해, 예를 들어, 클로닝 벡터를 사용하여 분절 및 이의 구성 요소 뉴클레오티드 서열의 식별, 조작 및 복구를 가능하게 하는 양 또는 농도로 단리되는, DNA로부터 유래되는 별개의 단편의 형태로 또는 더 큰 DNA 구성체의 성분으로서 DNA 중합체를 지칭한다. 이러한 분절은 전형적으로 진핵 생물 유전자에 존재하는 내부 비번역 서열, 또는 인트론에 의해 방해되지 않는 오픈 리딩 프레임의 형태로 제공된다. 비번역 DNA 서열은 동일한 서열이 코딩 영역의 조작 또는 발현을 방해하지 않는 오픈 리딩 프레임의 하류에서 제시될 수 있다.

용어 “약학적으로 허용가능한 염"은 개시되는 펩티드의 유도체를 칭하며, 여기서 펩티드는 제제의 산성 또는 염기성 염의 제조에 의해 변형된다. 예를 들어, 산성 염은 적합한 산과의 반응을 수반하는 유리 염기(전형적으로 여기서 약물의 중성 형태는 중성 -NH₂ 기를 가짐)로부터 제조된다. 산성 염을 제조하기 위해 적합한 산은 유기산, 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등 및 무기산, 예를 들어, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등을 모두 포함한다. 반대로, 펩티드에서 제시될 수 있는 산 모이어티의 염기성 염의 제조는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 트리메틸아민 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 염기를 사용하여 제조된다. 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 아세트산(아세트산염), 트리플루오르 아세트산염 또는 염화수소산(염화물)의 염으로서 펩티드를 포함한다.

용어 "프로모터"는 전사를 개시하기 위한 RNA 폴리머라아제의 결합에 관여하는 DNA 영역을 의미한다.

용어 "단리"는 물질이 원래의 환경(예를 들어, 자연 발생하는 경우, 자연 환경)으로부터 제거되는 것을 의미한다. 예를 들어, 살아 있는 동물에서 존재하는 자연 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리되지 않으나, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부에서 분리되는 동일한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 단리된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분이고/이거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 조성물의 일부일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아닌 경우 여전히 단리될 수 있다.

또한 본 발명에서 개시되는 폴리뉴클레오티드 및 재조합 또는 면역원성 폴리펩티드는 "정제” 형태일 수 있다. 용어 "정제”는 절대적인 순도를 필요로 하지 않으며, 대신, 이는 상대적인 정의로 의도되며, 해당 용어가 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 고도로 정제되는 제조물 또는 단지 부분적으로 정제되는 제조물을 포함할 수 있다. 예를 들어, cDNA 라이브러리로부터 단리된 개별 클론은 통상적으로 전기영동 균질성으로 정제된다. 출발물질 또는 자연물질을 적어도 수십 배, 바람직하게는 수백 배 내지 수천 배, 더 바람직하게는 수만 배 내지 수십만 배로 정제하는 것이 명시적으로 고려된다. 또한, 바람직하게는 99.999중량%, 또는 적어도 99.99중량% 또는 99.9중량%; 및 심지어 바람직하게는 99중량%보다 높은 순도를 갖는 청구범위에 기재된 폴리펩티드가 명시적으로 고려된다.

본 발명에 따라 개시된 핵산 및 폴리펩티드 발현 생성물뿐만 아니라 이러한 핵산 및/또는 이러한 폴리펩티드를 함유하는 발현 벡터는 "농축된 형태"일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "농축"은 물질의 농도가 이의 자연적 농도의 적어도 약 2배, 5배, 10배, 100배, 또는 1,000배, (예를 들어), 유리하게는, 0.01중량%, 바람직하게는 적어도 약 0.1중량%임을 의미한다. 또한, 약 0.5중량%, 1중량%, 5중량%, 10중량%, 및 20중량%의 농축된 제조가 고려된다. 서열, 구성체, 벡터, 클론 및 본 발명의 다른 물질은 유리하게 농축되거나 단리된 형태일 수 있다. 용어 "활성 단편"은, 예를 들어, 마우스, 래트, 라마, 양, 염소, 개 또는 말 및 또한 인간을 포함한 포유류 같은 동물에게, 단독으로 또는 임의적으로 적합한 보조제와 함께 또는 벡터로 투여되는 경우, 인간과 같은 수용 동물 내에서 T 세포 반응을 자극하는 형태를 취하는 면역 반응과 같은 면역 반응을 생성하는(즉, 면역원성 활성을 갖는), 대개 펩티드, 폴리펩티드 또는 핵산 서열의, 단편을 의미한다. 대안적으로, "활성 단편"은 시험관내 T 세포 반응을 유도하기 위해 또한 사용될 수 있다.

본원에 사용된 "부분", "분절" 및 "단편"이라는 용어는, 폴리펩티드와 관련하여 사용되는 경우, 서열이 더 큰 서열의 하위집합을 형성하는, 아미노산 잔기와 같은, 잔기의 연속적인 서열을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드가 트립신 또는 키모트립신 같은 일반적인 엔도펩티다아제 중 어느 하나의 처리를 거치는 경우, 이러한 처리로부터 초래되는 올리고펩티드는 시작 폴리펩티드의 부분, 분절 또는 단편을 나타내게 된다. 폴리뉴클레오티드와 관련해서 사용되는 경우, 이러한 용어는 임의의 엔도뉴클레아제와 함께 상기 폴리뉴클레오티드의 처리에 의해 생성되는 생성물을 지칭한다.

본 발명에 따라, 서열을 지칭하는 경우, 용어 "백분율 동일성" 또는 "백분율 동일"은 서열이 설명되거나 청구범위에 기재된 서열("기준 서열")과 비교될 서열("비교 서열")의 정렬 후 서열이 청구범위에 기재되거나 설명되는 서열과 비교되는 것을 의미한다. 그 후, 백분율 동일성은 다음과 같은 식에 따라 결정된다:

백분율 동일성 = 100 [1 -(C/R)]

여기서 C는 기준 서열과 비교 서열 사이의 정렬의 길이에 비해 기준 서열과 비교 서열의 차이의 개수이며, 여기서

(i) 비교 서열에서 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 갖지 않는 기준 서열의 각 염기 또는 아미노산 및

(ii) 기준 서열의 각 공백 및

(iii) 비교 서열에서 정렬된 염기 또는 아미노산과 상이한 기준 서열의 각 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이를 구성하며 및

(iv) 정렬은 정렬된 서열의 위치 1에서 시작해야 하며;

및 R은 기준 서열에 생성되는 임의의 공백도 염기 또는 아미노산 수로 계수되는 비교 서열과의 정렬의 길이에 대한 기준 서열 염기 또는 아미노산의 수이다.

비교 서열과 참조 서열 사이에 정렬이 존재하고 이에 대해 위에서 계산된 동일성 백분율이 지정된 최소 동일성 백분율 이상인 경우, 본원에 위에서 계산된 백분율 동일성이 특정 백분율 동일성보다 작은 정렬이 존재할 수 있더라도 비교 서열은 기준 서열에 대한 특정된 최소 백분율 동일성을 갖는다.

따라서, 위에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 식별 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩티드 또는 상기 펩티드와 T 세포 교차-반응을 유도하는 이의 변이체를 제공한다. 본 발명의 펩티드는 MHC 분자 클래스 I 또는 클래스 II에 대한 상기 펩티드의 신장된 형태에 결합하는 능력을 갖는다.

본 발명에서, 용어 "상동"은 2개의 아미노산 서열, 즉, 펩티드 또는 폴리펩티드 서열 사이의 동일성의 정도(위의 백분율 동일성 참조)를 지칭한다. 전술한 "상동성"은 비교될 서열에 대한 최적의 조건하에서 정렬되는 2개의 서열을 비교하여 결정된다. 이러한 서열 상동성은, 예를 들어, ClustalW 알고리즘을 사용하여, 정렬을 생성하여 계산될 수 있다. 일반적으로 이용 가능한 서열 분석 소프트웨어, 더 구체적으로, Vector NTI, GENETYX 또는 다른 도구는 공용 데이터베이스에 의해 제공된다.

당업자는 특정 펩티드의 변이체에 의해 유도되는 T 세포가 펩티드 자체와 교차반응할 수 있을지 여부를 평가할 수 있을 것이다(예를 들어, Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

주어진 아미노산 서열의 "변이체"라고 할 때, 발명자들은, 예를 들어, 1개 또는 2개의 아미노산 잔기의, 측쇄가 (예를 들어, 이들을 다른 자연 발생 아미노산 잔기의 측쇄 또는 일부 다른 측쇄로 대체하여) 변경되어 해당 펩티드가 여전히 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102의 주어진 아미노산 서열로 구성되는 펩티드와 실질적으로 동일한 방법으로 HLA 분자와 결합할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 펩티드는 HLA-A*02와 같은 적합한 MHC 분자의 결합 그루브(groove)와 상호작용하고 이에 결합하는 능력을 개선하지는 않더라도 적어도 유지하며, 해당 방식으로, 펩티드는 활성화된 T 세포의 TCR에 결합하는 능력을 개선하지는 않더라도 적어도 유지하도록 변형될 수 있다.

이러한 T 세포는 후속적으로 본 발명의 양태에서 정의된 바와 같은 동족 펩티드의 자연 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차반응할 수 있고 세포를 사멸시킬 수 있다. 과학 문헌 및 데이터베이스(Rammensee et al., 1999; Godkin et al., 1997, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)로부터 유래될 수 있는 바와 같이, HLA 결합 펩티드의 특정한 위치는 전형적으로 HLA 분자의 결합 모티프에 일치하는 핵심 서열을 형성하는 고정 잔기이며, 이는 결합 그루브를 구성하는 폴리펩티드의 극성, 전기물리성, 소수성 및 공간적 특성에 의해 정의된다. 따라서, 당업자는 알려진 고정 잔기를 유지하여 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 제시되는 아미노산 서열을 변형할 수 있고 이러한 변이체가 MHC 클래스 I 또는 II 분자와 결합할 수 있는 능력을 유지할 수 있는지 여부를 결정할 수 있을 것이다. 본 발명의 변이체는 활성화된 T 세포의 TCR과 결합할 수 있는 능력을 유지하며, 이는 후속적으로 본 발명의 양태에서 정의된 바와 같은 동족 펩티드의 자연 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드를 발현하는 세포와 교차 반응할 수 있고 세포를 사멸시킬 수 있다.

본원에서 개시되는 원래의 (변형되지 않은) 팹티드는 달리 언급되지 않는 한 상이한, 어쩌면 선택적인, 펩티드 사슬 내 부위의 하나 이상의 잔기의 치환에 의해 변형될 수 있다. 바람직하게는 이러한 치환은 펩티드의 아미노산 사슬의 말단에 위치된다. 이러한 치환은, 예를 들어, 소수성 아미노산이 다른 소수성 아미노산으로 대체되는 것과 같이 한 아미노산이 유사한 구조 및 특성의 아미노산에 의해 대체되는 보존적 성격일 수 있다. 류신이 이소류신으로 대체되는 것과 같이 동일하거나 유사한 크기 및 화학적 특성을 가진 아미노산으로 대체되는 것이 더더욱 보존적이다. 자연 발생 동종 단백질의 계열의 서열 변이 연구에서, 특정한 아미노산의 치환은 다른 아미노산 치환보다 흔히 허용되고 있으며, 이들은 흔히 원래의 아미노산과 해당 치환 사이에서 크기, 전하, 극성 및 소수성이 유사성을 보이며, 이는 "보존적 치환"을 정의하는 데 기본이 된다.

보존적 치환은 본원에서 아래의 5개의 군 중 하나의 교환으로 정의된다: 군 1- 소형, 지방족, 무극성 또는 약한 극성의 잔기(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); 군 2- 극성, 음으로 하전된 잔기 및 이의 아미드(Asp, Asn, Glu, Gln); 군 3 - 극성, 양으로 하전된 잔기(His, Arg, Lys); 군 4- 대형, 지방족, 무극성 잔기(Met, Leu, Ile, Val, Cys); 및 군 5- 대형, 방향족 잔기(Phe, Tyr, Trp).

일 양태에서, 보존적 치환은 문헌[Dayhoff, The Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5", Natl. Biomedical Research]에서 설명되는 보존적 치환을 포함할 수 있으며, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다. 예를 들어, 일 양태에서, 다음의 군 중 하나에 속한 아미노산은 서로 교환될 수 있으며, 따라서, 보존적 교환을 구성한다: 군 1: 알라닌(A), 프롤린(P), 글리신(G), 아스파라긴(N), 세린(S), 트레오닌(T); 군 2: 시스테인(C), 세린(S), 티로신(Y), 트레오닌(T); 군 3: 발린(V), 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 알라닌(A), 페닐알라닌(F); 군 4: 리신(K), 아르기닌(R), 히스티딘(H); 군 5: 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W), 히스티딘(H); 및 군 6: 아스파르트산(D), 글루탐산(E). 일 양태에서, 보존적 아미노산 치환은 T→A, G→A, A→I, T→V, A→M, T→I, A→V, T→G, 및/또는 T→S의 순서로부터 선택될 수 있다.

일 양태에서, 보존적 아미노산 치환은 동일한 클래스의 다른 아미노산, 예를 들어, (1) 무극성: Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp; (2) 하전되지 않은 극성: Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln; (3) 산성: Asp, Glu; 및 (4) 염기성: Lys, Arg, His;에 의한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 또한, 다른 보존적 아미노산 치환은 다음과 같이 이루어질 수 있다: (1) 방향족: Phe, Tyr, His; (2) 양성자 주개: Asn, Gln, Lys, Arg, His, Trp; 및 (3) 양성자 받개: Glu, Asp, Thr, Ser, Tyr, Asn, Gln(미국 특허 제10,106,805호 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

다른 양태에서, 보존적 치환은 표 3에 따라 이루어질 수 있다. 단백질 변형에 대한 내성을 예측하는 방법은 문헌(예를 들어, Guo et al., 2004, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)에서 발견할 수 있다.

다른 양태에서, 치환은 표 4에서 나타낸 것일 수 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 초래하는 경우, 표 4에서 "예시적인 치환"이라고 명명된 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있으며, 필요한 경우, 생성물을 스크리닝할 수 있다.

물론, 이러한 치환은 일반적인 L-아미노산 외의 구조를 수반할 수 있다. 따라서, D-아미노산을 본 발명의 항원성 펩티드에서 일반적으로 발견되는 L-아미노산으로 치환할 수 있으며 본원에서 개시내용에 의해 계속 포함될 수 있다. 또한, 비표준 아미노산(즉, 일반적인 자연 발생 단백질생성 아미노산이 아닌 아미노산)은 본 발명에 따른 면역원 및 면역원성 폴리펩티드를 생성하기 위한 치환 목적으로 사용될 수 있다.

하나보다 많은 위치에서 치환이 아래에서 정의된 바와 실질적으로 동일하거나 더 큰 항원 활성을 갖는 펩티드를 초래하는 것으로 발견되는 경우,조합된 치환이 펩티드의 항원성에 부가적 효과 또는 시너지 효과의 결과를 야기하는지 결정하기 위해 이러한 치환의 조합을 시험한다.

본원에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드는, 비변형 펩티드와 비교하여, MHC 클래스 I 또는 클래스 II의 분자에 결합하는 능력이 실질적으로 달라지거나 부정적으로 영향을 받지 않고 교환되는 1개 또는 2개의 비고정 아미노산(고정 모티프에 대해서는 아래 참조)을 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에서 명시된 바와 같이 아미노산 서열로 본질적으로 구성된 펩티드에 있어서, 1개 또는 2개의 아미노산이 MHC 분자 클래스 I 또는 클래스 II에 결합하는 능력이, 비변형 펩티드와 비교하여, 실질적으로 달라지거나 부정적으로 영향을 받지 않고 이에 대한 보존적 교환 파트너(아래 참조)와 교환될 수 있다.

T 세포 수용체와 상호작용하는 데 실질적으로 기여하지 않는 아미노산 잔기는 편입이 T 세포의 반응성에 상당한 영향을 주지 않고 관련 MHC와의 결합을 제거하지 않는 다른 아미노산과의 대체에 의해 변형될 수 있다. 따라서, 주어진 조건 외에도, 본 발명의 펩티드는 아미노산 서열, 또는 주어진 이의 일부 또는 이의 변이체를 포함하는 임의의 펩티드(발명자들은 이 용어에 올리고펩티드 또는 폴리펩티드를 포함시킴)가 될 수 있다.

또한 더 긴(신장된) 펩티드가 적합할 수 있다. 대개는 8 내지 12개 길이의 아미노산이지만, MHC 클래스 I 에피토프는 더 긴 펩티드로부터 처리되는 펩티드 또는 실제 에피토프를 포함하는 단백질에 의해 생성될 가능성이 있다. 잔기가 실제 에피토프가 측면에 있으며 잔기는 처리 동안 실제 에피토프를 노출하는 데 필요한 단백질분해 절단에 실질적으로 영향을 미치지 않는 잔기인 것이 바람직하다.

본 발명의 펩티드는 최대 4개 아미노산까지 신장될 수 있으며, 즉, 1, 2, 3 및 4개 아미노산이 4:0과 0:4 사이에서 임의의 조합으로 양측 중 어느 한 말단에든지 첨가될 수 있다. 본 발명에 따른 신장의 조합은 표 5에서 찾아볼 수 있다.

신장/연장을 위한 아미노산은 단백질의 원래의 서열의 펩티드 또는 다른 모든 아미노산(들)일 수 있다. 신장은 펩티드의 안정성 또는 용해도를 향상하기 위해 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 에피토프는 자연 발생 종양 연관 또는 종양 특이적 에피토프와 동일할 수 있거나, 실질적으로 동일한 항원성 활성을 갖고 있는 한, 참조 펩티드와 비교 시 4개 이하의 상이한 잔기를 가지고 있는 에피토프를 포함할 수 있다.

대안적인 실시양태에서, 펩티드는 일측 또는 양측으로 4개보다 많은 아미노산, 바람직하게는 최대 30개 아미노산의 총 길이로 신장된다. 이는 MHC 클래스 II 결합 펩티드로 이어질 수 있다. MHC 클래스 II에 대한 결합은 당업계에서 알려진 방법으로 시험될 수 있다.

따라서, 본 발명은 MHC 클래스 I 에피토프의 펩티드 및 변이체를 제공하며, 여기서 펩티드 또는 변이체는 8 내지 100개, 바람직하게는 8 내지 30개, 가장 바람직하게는 8 내지 12개, 즉, 8, 9, 10, 11, 12개 아미노산의 전체 길이를 가지며, 신장된 클래스 II 결합 펩티드의 경우, 길이는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 아미노산일 수 있다.

물론, 본 발명에 따른 펩티드 또는 변이체는 MHC 분자 클래스 I 또는 II에 결합하는 능력을 갖는다. 펩티드 또는 변이체의 MHC 복합체로의 결합은 당업계의 방법에 의해 시험될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 펩티드에 특이적인 T 세포가 치환 펩티드에 대해 시험되는 경우, 치환 펩티드가 배경에 상대적으로 세포 용해의 최대 증가의 절반을 달성하는 펩티드 농도는 약 1 mM 이하, 바람직하게는 약 1 μM 이하, 더 바람직하게는 약 1 nM 이하, 여전히 더 바람직하게는 약 100 pM 이하, 그리고, 가장 바람직하게는 약 10 pM 이하이다. 또한, 치환 펩티드가 1명보다 많은, 적어도 2명, 그리고 더 바람직하게는 3명의 개체로부터의 T 세포에 의해 인식되는 것이 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산으로 구성되거나 본질적으로 구성된다.

"본질적으로 구성"이란 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 서열 또는 이의 변이체에 더해 본 발명에 따른 펩티드가 MHC 분자에 대한 에피토프로서 기능하는 펩티드의 일부를 필수적으로 형성하지 않는 아미노산의 추가적인 N 말단 및/또는 C 말단에 위치되는 스트레치를 함유하는 것을 의미한다.

그럼에도 불구하고, 이러한 확대는 본 발명에 따른 펩티드의 세포 내로의 효율적인 도입에 중요한 역할을 할 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에서, 펩티드는, 예를 들어, NCBI, GenBank 수탁 번호 제X00497호에서 유래되는 바와 같이 HLA-DR 항원 연관 불변 사슬(p33, 다음의 "Ii")의 80개 N 말단 아미노산을 포함하는 융합 단백질의 일부이다. 다른 융합에서, 본 발명의 펩티드는 본원에 설명된 항체나 이의 기능적 일부, 특히, 항체의 서열에 대해, 상기 항체에 의해 특이적으로 표적화될 수 있도록, 또는, 예를 들어, 본원에 설명된 바와 같은 수지상 세포에 특이적인 항체에 대해 또는 이의 내로 융합될 수 있다.

또한, 펩티드 또는 변이체는 안정성 및/또는 MHC 분자에 대한 결합성을 개선하여 더 강한 면역 반응을 유발하도록 변형될 수 있다. 펩티드 서열의 이러한 최적화를 위한 방법은 당업계에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 역펩티드 결합 또는 비펩티드 결합의 도입을 포함한다.

역 펩티드 결합에서, 아미노산 잔기는 펩티드(-CO-NH-) 연결로 결합되지 않고 펩티드 결합이 역으로 되어 있다. 이러한 레트로 인버소 변형펩티드(retro-inverso peptidomimetic)는 예를 들어, 참조에 의해서 본원에 원용되는 Meziere 등에 의해 설명된 바와 같은 당업계에서에서 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다(Meziere et al., 1997, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 이러한 접근법은 측쇄의 배향이 아니라 백본과 관련되는 변화를 포함하는 유사펩티드(pseudopeptide)를 제조하는 단계를 수반한다 이는 MHC 결합 및 T 보조 세포 반응에 대하여 이러한 유사펩티드가 유용하다는 점을 나타낸다. CO-NH 펩티드 결합 대신 NH-CO 결합을 가지는 레트로 인버소 펩티드는 단백질가수분해에 대한 저항성이 훨씬 높다 (Meziere et al., 1997).

비펩티드 결합은 예를 들어, -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, 및 -CH₂SO-이다. US 4,897,445는 표준 절차에 의해 합성되는 폴리펩티드 그리고 아미노 NaCNBH₃ 존재하에서 아미노 알데히드와 아미노산이 반응하여 합성되는 비펩티드 결합을 포함하는 폴리펩티드 사슬의 비펩티드 결합(-CH₂-NH)의 고체상 합성을 위한 방법을 제공한다.

위에서 설명된 결합을 포함하는 펩티드는 펩티드의 안정성, 생체이용률 및/또는 친화도를 향상하기 위해 아미노 말단 및/또는 카르복시 말단에 존재하는 추가적인 화학 기를 추가하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 카보벤즈옥실, 단실 또는 t-부틸옥시카르보닐 기와 같은 소수성 기가 펩티드의 아미노 말단에 첨가될 수 있다. 마찬가지로, 아세틸 기 또는 9-플루오레닐메톡시-카르보닐 기가 펩티드의 아미노 말단에 위치할 수도 있다. 추가적으로, 소수성 기, t-부틸옥시카르보닐 또는 아미도 기가 펩티드의 카르복시 말단에 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드는 입체적 구조를 변경하도록 합성될 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 D-이성질체가 보통의 L-이성질체 대신 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드의 아미노산 잔기 중 적어도 하나가 잘 알려진 비자연 발생 아미노산 잔기 중 하나로 치환될 수 있다. 이와 같은 변경은 본 발명의 펩티드의 안정성, 생체이용률 및/또는 결합 활동이 증가하도록 작용할 수 있다.

유사하게, 본 발명의 펩티드 또는 변이체는 펩티드 합성 전후 특정 아미노산을 반응하게 하여 화학적으로 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예는 당업계에서 잘 알려져 있다(Lundblad, 2004, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 아미노산의 화학적 변형은 아실화, 아미딘화, 리신의 피리독실화, 환원성 알킬화, 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS)을 사용한 아미노기의 트리니트로벤질화, 카르복실 기의 아미드 변형 및 시스테인에서 시스테인산으로의 퍼포민산 산화에 의한 술피드릴 변형, 수은 유도체의 형성, 다른 티올 화합물과 혼합된 다이술피드 형성, 말레이미드와의 반응, 요오드화 아세트산 또는 요오드아세트아미드를 사용한 카르복시메틸화 및 알칼리성 pH에서의 시안산 염을 사용한 카르바모일화를 포함하나 이에 국한되지 않은 변형을 포함하나 이에 국한되지 않는다(Coligan et al., 1995, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

간단히 말하면, 예를 들어 단백질의 아르기닌 잔기의 변형은 흔히 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온 및 1,2-시클로헥산디온과 같은 인접한 디카르보닐 화합물의 반응에 기반하여 부가물을 형성한다. 다른 예는 메틸글로옥살과 아르기닌 잔기의 반응이다. 시스테인은 리신 및 히스티딘과 같은 다른 친핵성 부위의 동시 변형 없이 변형될 수 있다. 그 결과, 시스테인 변형에 대한 다수의 시약이 이용 가능하다. Sigma-Aldrich(www.sigma-aldrich.com)와 같은 회사의 웹사이트는 특정 시약에 관한 정보를 제공한다.

단백질의 이황화 결합의 선택적 환원 또한 흔히 사용된다. 이황화 결합은 바이오의약품의 열 처리 동안 형성되고 산화될 수 있다. 특정 글루탐산 잔기를 변형하기 위해 우드워드 시약 K(Woodward's Reagent K)가 사용될 수 있다. 리신 잔기와 글루탐산 잔기 사이에서 분자 내 가교를 형성하기 위해 N-(3-디메틸아미노)프로필)-N'-에틸카르보디이미드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 디메틸피로카르보네이트는 단백질에서 히스티딘 잔기의 변형을 위한 시약이다. 또한, 히스티딘은 4-히드록시-2-노네날을 사용하여 변형될 수 있다. 리신 잔기와 다른 α-아미노기의 반응은, 예를 들어, 표면에 대한 펩티드의 결합에서 또는 단백질/펩티드의 가교에서 유용하다. 리신은 폴리(에틸렌)글리콜의 부착 부위이며 단백질의 글리코실화에서 주요 변형 부위이다. 단백질의 메티오닌 잔기는 예를 들어, 요오드아세트아미드, 브로모에틸아민 및 클로르아민 T를 사용하여 변형될 수 있다.

테트라니트로메탄 및 N-아세틸이미다졸은 티로신 잔기의 변형에 사용될 수 있다. 디티로신의 형성을 통한 가교는 과산화수소/구리 이온을 사용하여 달성될 수 있다.

트립토판의 변형에 대한 최근의 연구에서 N-브로모숙신이미드, 2-히드록시-5-니트로벤질 브로마이드 또는 3-브로모-3-메틸-2-(2-니트로페닐메르캅토)-3H-인돌(BPNS-스카톨)이 사용된 바 있다.

PEG를 사용한 치료 단백질과 펩티드의 성공적인 변형은 흔히 순환 반감기의 연장과 연관되며, 단백질과 글루타르알데히드, 폴리에틸렌글리콜 디아크릴레이트 및 포름알데히드를 가교하는 것은 히드로겔의 제조를 위해 사용된다. 면역요법을 위한 알레르기 유발원의 화학적 변형은 흔히 시안산 칼륨의 카르바밀화에 의해 달성된다.

본 발명의 다른 실시양태는 비자연적 발생 펩티드에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드는 서열 번호:1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되며 약학적으로 허용 가능한 염으로서 합성적으로 생성되었다. 펩티드를 합성적으로 생성하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에 따른 펩티드의 염은 펩티드와는 생체내 상태(들)인 펩티드와 실질적으로 상이한데, 생체내에서 생성되는 펩티드는 염이 아니기 때문이다. 펩티드의 비자연 염 형태는, 특히, 펩티드, 예를 들어, 본원에 개시된 펩티드 백신을 포함하는 약학적 조성물의 맥락에서, 펩티드의 용해도를 매개한다. 치료될 대상체에게 펩티드를 효율적으로 제공하기 위해서는 펩티드(들)의 충분한 그리고 적어도 실질적인 용해도가 필요하다. 바람직하게는 염은 펩티드의 약학적으로 허용 가능한 염이다. 본 발명에 따른 이러한 염은 음이온 PO₄ ³, SO₄ ^2-, CH₃COO^-, Cl^-, Br^-, NO₃ ^-, ClO₄ ^-, I^-, SCN^-로서 그리고 양이온 NH₄ ⁺, Rb⁺, K⁺, Na⁺, Cs⁺, Li⁺, Zn²⁺, Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺ 및 Ba²⁺로서 포함하는 호프마이스터 계열의 염과 같은 알칼리염 및 알칼리 토염을 포함한다. 특히, 염은 (NH₄)₃PO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)H₂PO₄, (NH₄)₂SO₄, NH₄CH₃COO, NH₄Cl, NH₄Br, NH₄NO₃, NH₄CIO₄, NH₄I, NH₄SCN, Rb₃PO₄, Rb₂HPO₄, RbH₂PO₄, Rb₂SO₄, Rb₄CH₃COO, Rb₄Cl, Rb₄Br, Rb₄NO₃, Rb₄CIO₄, Rb₄I, Rb₄SCN, K₃PO₄, K₂HPO₄, KH₂PO₄, K₂SO₄, KCH₃COO, KCl, KBr, KNO₃, KClO₄, KI, KSCN, Na₃PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂SO₄, NaCH₃COO, NaCl, NaBr, NaNO₃, NaCIO₄, NaI, NaSCN, ZnCI₂ Cs₃PO₄, Cs₂HPO₄, CsH₂PO₄, Cs₂SO₄, CsCH₃COO, CsCl, CsBr, CsNO₃, CsCIO₄, CsI, CsSCN, Li₃PO₄, Li₂HPO₄, LiH₂PO₄, Li₂SO₄, LiCH₃COO, LiCl, LiBr, LiNO₃, LiClO₄, LiI, LiSCN, Cu₂SO₄, Mg₃(PO₄)₂, Mg₂HPO₄, Mg(H₂PO₄)₂, Mg₂SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCl₂, MgBr₂, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, MgI₂, Mg(SCN)₂, MnCl₂, Ca₃(PO₄),, Ca₂HPO₄, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCl₂, CaBr₂, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, CaI₂, Ca(SCN)₂, Ba₃(PO₄)₂, Ba₂HPO₄, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCl₂, BaBr₂, Ba(NO₃)₂, Ba(ClO₄)₂, BaI₂, 및 Ba(SCN)₂로부터 선택된다. 예를 들어, 염화물 또는 아세테이트(트리플루오로아세테이트) 염과 같은, NH 아세테이트, MgCl₂, KH₂PO₄, Na₂SO₄, KCl, NaCl 및 CaCl₂가 특히 바람직하다(예를 들어, Berge et al., 1977 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

일반적으로, (적어도 아미노산 잔기 사이에서 펩티드 결합을 포함하는) 펩티드 및 변이체는 Lukas 등(Lukas et al., 1981, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)에 의해 개시된 바와 같이 그리고 본원에 인용된 바와 같이 참조에 의해 고체상 펩티드 합성의 Fmoc-폴리아미드 모드에 의해 합성될 수 있다. 일시적인 N-아미노기 보호는 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(Fmoc) 기에 의해 제공된다. 염기에 매우 취약한 이 보호기의 반복적인 절단은 N,N-디메틸포름아미드의 20% 피페리딘을 사용하여 실시된다. 측쇄 작용기는 이들의 부틸 에테르(세린 트레오닌 및 티로신의 경우), 부틸 에스테르(글루탐산 및 아스파르트산의 경우), 부틸옥시카르보닐 유도체(리신 및 히스티딘의 경우), 트리틸 유도체(시스테인의 경우) 및 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤젠술포닐 유도체(아르기닌의 경우)로서 보호될 수 있다. 글루타민 또는 아스파라긴이 C-말단 잔기인 경우, 측쇄 아미도 작용기의 보호를 위해 4,4-디메톡시벤즈히드릴 기가 사용된다. 고체상 지지체는 3개의 단량체인 디메틸아크릴아미드(백본-단량체), 비스아크릴로일에틸렌 디아민(가교제) 및 아크릴로일사르코신 메틸 에스테르(작용기화제)로 구성되는 폴리디메틸-아크릴아미드 중합체에 기반한다. 사용되는 펩티드-대-수지의 절단 가능한 연결제는 산에 취약한 4-히드록시메틸-페녹시아세트산 유도체이다. 모든 아미노산 유도체는 역 N,N-디시클로헥실-카르보디이미드/1히드록시벤조트리아졸 매개의 결합 절차를 사용하여 첨가되는 아스파라긴 및 글루타민을 제외하고 이미 형성된 대칭적 무수물 유도체로서 첨가된다. 모든 결합 및 탈보호 반응은 닌히드린, 트리니트로벤젠 술폰산 또는 이소틴 시험 절차를 사용하여 모니터링된다. 합성이 완료되면, 50% 포착제 혼합물을 함유하는 95% 트리플루오로아세트산으로 처리하여 측쇄 보호기를 동시 제거하고 수지 지지체로부터 펩티드를 절단한다. 일반적으로 사용되는 포착제는 에탄디티올, 페놀, 아니솔 및 물을 포함하며, 정확한 선택은 합성되는 펩티드 구성 아미노산에 따른다. 또한, 펩티드의 합성에 대한 고체상 및 용액상 방법의 조합이 가능하다(예를 들어, Bruckdorfer et al., 2004 및 이에 인용된 참고문헌 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

트리플루오로아세트산은 진공하 증발로 제거되며, 후속적으로 디에틸 에테르로 분쇄되어 조(粗) 펩티드가 얻어진다. 존재하는 모든 포착제는 단순한 추출 절차로 제거되며 수상(aqueous phase)을 동결건조하면 포착제 없는 조(粗) 펩티드가 얻어진다. 펩티드 합성용 시약은 일반적으로 Calbiochem-Novabiochem(Nottingham, UK)로부터 이용 가능하다.

정제는 재결정화, 크기 배제 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 작용 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 (대개) 아세토니트릴/물 구배 분리를 사용하는 역상 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 기법 중 임의의 하나 또는 이의 조합에 의해 수행될 수 있다.

펩티드 분석은 박막 크로마토그래피, 특히, 모세관 전기영동법, 고체상 추출(CSPE), 역상 고성능 액체 크로마토그래피, 산 가수분해 후 아미노산 분석 및 고속 원자 충돌(FAB) 질량 분광분석법 및 MALDI 및 ESI-Q-TOF 질량 분광분석법을 사용하여 수행될 수 있다.

과제시된 펩티드를 선택하기 위해, 중간값 검체 제시 및 복제 변이를 나타내는 제시 프로필이 계산된다. 프로필은 관심 종양 개체의 검체를 정상 조직 검체의 기준선에 병치한다. 각각의 이러한 프로필은 오류 발견율(False Discovery Rate)로 여러 검사를 조정하는 선형 혼합 효과 모형(Linear Mixed-Effects Model)의 p-값을 계산하여 (Pinheiro et al., 2015) 과제시 점수로 통합될 수 있다(Benjamini 및 Hochberg, 1995, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

질량분석법에 의한 HLA 리간드의 식별 및 상대적 정량화를 위해, 충격동결된 조직 검체로부터 유래한 HLA 분자를 정제하고 HLA 연관 펩티드를 단리하였다. 단리된 펩티드는 분리되었으며, 서열은 온라인 나노-전기분무-이온화(nanoESI) 액체 크로마토그래피-질량분석(LC-MS) 실험으로 식별되었다. 결과로 얻어진 펩티드 서열을 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 검체(N >750 검체)로부터 기록되는 자연 종양 연관 펩티드(TUMAP)의 단편화 패턴과 동일한 서열의 상응하는 합성적 참조 펩티드의 단편화 패턴을 비교하여 확인하였다. 펩티드는 원발성 종양의 HLA 분자의 리간드로서 직접 식별되기 때문에, 이러한 결과는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 환자로부터 수득되는 원발성 암 조직으로부터 식별되는 펩티드의 자연 처리 및 제시에 대한 직접적 증거를 제공한다. (실시예 1, 도 3A 내지 도 3D 참조).

발견 파이프라인 XPRESIDENT® v2.1을 사용하면 여러 상이한 비암성 조직 및 장기와 비교하여 암 조직에 대한 HLA-제한 펩티드 수준의 직접적인 상대적 정량화를 기반으로 하는 면역요법에 대한 효능 있는 표적인 관련 있는 과제시된 펩티드의 식별 및 선택이 가능하다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 제2013/0096016호 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다. 이는 서열 식별, 스펙트럼 군집화, 이온 계수화, 머무름 시간 정렬, 전하 상태 디컨볼루션 및 정규화를 위한 알고리즘을 조합한 독점 데이터 분석 파이프라인에 의해 처리되는 획득한 LC-MS 데이터를 사용한 무표지 차등 정량화의 개발에 의해 달성되었다.

공개 리소스(Olexiouk et al., 2016; Subramanian et al., 2011, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)의 추가적인 서열 정보가 XPRESIDENT® 발견 파이프라인에 통합되어 비정규 기원으로부터 TUMAP을 식별할 수 있었다. 각각의 펩티드 및 검체에 대한 오류 추정치를 포함하는 제시 수준이 확립되었다. 종양 조직에 배타적으로 제시된 펩티드 및 종양에서 과제시된 펩티드 대비 비암성 조직 및 장기가 식별된 바 있다.

급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 조직 검체로부터 유래한 HLA-펩티드 복합체를 정제하였으며 HLA 연관 펩티드를 단리한 후 LC-MS로 분석하였다(실시예 1 참조). 본 출원서에 포함되는 모든 TUMAP를 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 및 이들의 조합에 대한 제시를 확인하는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 검체에 대한 이러한 접근법을 사용하여 식별하였다.

여러 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 및 정상 조직에 대해 식별되는 TUMAP는 무표지 LC-MS 데이터의 이온 계수화를 사용하여 정량화하였다. 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 검체의 존재비(abundance)와 상관관계가 있음을 가정한다. 다양한 LC-MS 실험에서 펩티드의 모든 정량적 신호를 중심 경향에 기반하여 정규화하고 검체당 평균화하였으며, 제시 프로필이라 지칭되는 막대 도표에 통합하였다. 제시 프로필은 단백질 데이터베이스 검색, 스펙트럼 군집화, 전하 상태 디컨볼루션(방전) 및 머무름 시간 정렬 및 정규화와 같은 상이한 분석 방법을 통합한다.

또한, 발견 파이프라인 XPRESIDENT®는 암 또는 다른 감염된 조직에서 MHC-펩티드, 바람직하게는 HLA 제한 펩티드 수준의 직접적인 절대 정량화를 허용한다. 요약하자면, 총 세포 수는 분석된 조직 검체의 총 DNA 함량으로부터 계산되었다. 조직 검체에 있는 TUMAP에 대한 총 펩티드 양은 자연 TUMAP의 비율 및 소위 내부 표준품으로 지칭되는 TUMAP의 동위원소 표지된 형태의 알려진 양으로 나노 LC-MS/MS로 측정하였다. TUMAP 단리 절차의 가능한 가장 이른 시점에 모든 선택된 조직 용해물에 TUMAP의 펩티드-MHC 복합체를 스파이크하고 펩티드 단리 절차 완료 후 나노 LC-MS/MS로 이들을 검출하여 TUMAP 단리의 효율성을 결정하였다. 총 세포 수 및 총 펩티드의 양을 조직 검체당 3중 측정으로부터 계산하였다. 펩티드 특이적 단리 효율성을 9회의 스파이크 실험의 평균으로서 계산하였다(실시예 4 및 표 12 참조).

펩티드의 과제시 외에도, 기저 유전자의 mRNA 발현을 시험하였다. mRNA 데이터를 정상 조직 및 암 조직의 RNASeq 분석을 통해 수득하였다(실시예 2, 도 4A 내지 도 4D 참조). 정상 조직 데이터의 추가적인 출처는 약 3000개 정상 조직 검체로부터 유래한 공개적으로 이용 가능한 RNA 발현 데이터의 데이터베이스였다(Lonsdale, 2013, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 코딩 mRNA가 암 조직에서 고도로 발현되나 필수 정상 조직에서 매우 낮거나 부재하는 단백질로부터 유래되는 펩티드는 본 발명에 바람직하게 포함되었다.

본 발명은 본 발명의 펩티드를 과제시하거나 배타적으로 제시하는 암/종양, 바람직하게는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암의 치료에서 유용한 펩티드를 제공한다. 이러한 펩티드는 MS로 원발성 인간 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 검체에서 HLA 분자에 의해 자연적으로 제시되는 것으로 나타났다.

펩티드가 유래된 기원 유전자/단백질("전장 단백질"이나 "기저 단백질"로도 지칭됨) 중 다수는 정상 조직과 비교하여 암에서 고도로 과발현되는 것으로 나타났다. 본 발명과 관련하여 "정상 조직"이란 건강한 혈액, 뇌, 심장, 간, 폐, 지방 조직, 부신, 담관, 방광, 뼈, 골수, 식도, 눈, 담낭, 두경부, 대장, 소장, 신장, 림프절, 중추 신경, 말초 신경, 췌장, 부갑상선, 복막, 뇌하수체, 흉막, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 갑상선, 기관 및 요관 세포 또는 유방, 난소, 태반, 전립선, 고환, 흉선 및 자궁과 같은 다른 정상 조직 세포를 의미하며, 이는 근원 유전자와 높은 정도의 종양 연관을 실증한다(실시예 2 참조) 더욱이 펩티드 자체가 종양 조직에서 강력하게 과제시된다. 본 발명과 관련하여 "종양 조직"은 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암을 앓는 환자로부터 유래하며 정상 조직은 아닌 검체를 의미한다(실시예 1 참조).

HLA 결합된 펩티드는 면역계 특히 T 림프구에 의해 인식될 수 있다. T세포는 인식된 HLA/펩티드 복합체를 제시하는 세포, 예를 들어, 유래된 펩티드를 제시하는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 세포를 파괴할 수 있다.

본 발명의 펩티드는 정상 세포와 비교하여 암 조직에서 과제시되며 따라서 본 발명에 따른 항체 및/또는 가용성 TCR과 같은 TCR의 생성을 위해 사용될 수 있다(표 9 참조). 또한, 각각의 MHC와 복합체를 형성하는 경우 펩티드는 본 발명에 따른 항체 및/또는 TCR, 특히, 가용성 TCR의 생성을 위해 사용될 수 있다. 각각의 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며 해당 문헌에서도 발견할 수 있다(또한 아래 참조). 따라서, 본 발명의 펩티드는 환자의 종양 세포를 파괴할 수 있는 면역 반응을 생성하는 데 유용하다. 환자의 면역 반응은 설명된 펩티드 또는 환자에게 적합한 전구체 물질(예를 들어, 이러한 펩티드를 인코딩하는 신장된 펩티드, 단백질 또는 핵산)을, 이상적으로는 면역원성을 향상할 수 있는 제제(즉, 보조제)와 조합하여, 직접 투여하는 것으로 유도될 수 있다. 이러한 치료적 백신접종으로부터 유래하는 면역 반응은 종양 세포에 대해 고도로 특이적인 것으로 예상될 수 있는데, 이는 본 발명의 표적 펩티드가 비교 가능한 복제 수로 정상 조직 상에 제시되어 있지 않기 때문에, 환자의 정상 세포에 대한 바람직하지 않은 자가면역 반응의 위험을 방지한다.

또한, 본 설명은 알파 사슬 및 베타 사슬("알파/베타 TCR")을 포함하는 TCR에 관한 것이다. 또한, MHC 분자에 의해 제시되는 경우 TCR 및 항체에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 펩티드가 제공된다.

또한, 본 설명은 HLA 분자에 의해 제시되는 경우 본 발명에 따른 펩티드 항원에 결합할 수 있는 본 발명에 따른 TCR의 단편에 관한 것이다. 해당 용어는 특히, 가용성 TCR 단편, 예를 들어, 막횡단 부분 및/또는 불변 영역이 누락된 TCR, 단쇄 TCR 및 예를 들어, 면역 글로불린에 대한 이들의 융합체에 관한 것이다.

또한, 본 설명은 본 설명의 TCR 및 펩티드를 발현하는 핵산, 벡터 및 숙주 세포; 및 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.

용어 "T세포 수용체"(약칭 TCR)는 알파 폴리펩티드 사슬(알파 사슬) 및 베타 폴리펩티드 사슬(베타 사슬)을 포함하는 이종이량체 분자를 지칭하며, 여기서 이종이량체 수용체는 HLA 분자에 의해 제시되는 펩티드 항원에 결합할 수 있다. 이 용어는 또한 소위 감마/델타 TCR도 포함한다.

일 실시양태에서, 본 설명은 본원에서 설명된 바와 같이 TCR을 생성하는 방법을 제공하며, 방법은 TCR의 발현을 촉진하기 위해 적합한 조건하에서 TCR을 발현시킬 수 있는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서의 설명은 본 설명에 따른 방법에 관한 것이며, 여기서 항원-제시 세포와 충분한 수량의 항원을 접촉하게 하여 항원이 적합한 항원 제시 세포 혹은 인공 항원 제시 세포의 표면에 발현되는 클래스 I 또는 II MHC 분자 상에 탑재되거나 항원/클래스 I 또는 II MHC 복합체 단량체를 사량체화하여 항원이 클래스 I 또는 II MHC 사량체 위에 탑재된다.

알파/베타 TCR의 알파 및 베타 사슬 그리고 감마/델타 TCR의 감마 및 델타 사슬은 일반적으로 각각 2개의 "도메인", 즉, 가변 및 불변 도메인을 갖는 것으로 간주된다. 가변 도메인은 가변 영역(V) 및 결합 영역(J)의 연속으로 구성된다. 또한, 가변 도메인은 선도 영역(L)을 포함할 수 있다. 또한, 베타 및 델타 사슬은 다양성 영역(D)을 포함할 수 있다. 또한, 알파 및 베타 불변 도메인은 세포막에 알파 및 베타 사슬을 고정시키는 C-말단 막횡단(TM) 도메인을 포함할 수 있다.

감마/델타 TCR에 대하여, 본원에서 사용된 용어 "TCR 감마 가변 도메인"은 선도 영역(L)이 없는 TCR 감마 V(TRGV) 영역과 TCR 감마 J(TRGJ) 영역의 연속을 지칭하며, 또한, 용어 TCR 감마 불변 도메인은 세포외 TRGC 영역 또는 C-말단 절단된 TRGC 서열을 지칭한다. 마찬가지로, 용어 "TCR 델타 가변 도메인"은 선도 영역(L)이 없는 TCR 델타 V(TRDV) 영역 및 TCR 델타 D/J(TRDD/TRDJ) 영역의 연속을 지칭하며, 용어 "TCR 델타 불변 도메인"은 세포외 TRDC 영역 또는 C-말단 절단된 TRDC 서열을 지칭한다.

본 설명의 알파/베타 이종이량체 TCR은 이들의 불변 도메인 사이에 도입된 이황화 결합을 가질 수 있다. 이러한 유형의 바람직한 TCR은 TRAC의 Thr 48 및 TRBC1 또는 TRBC2의 Ser 57이 시스테인 잔기에 의해 대체되는 것 외에 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 갖는 것을 포함하며, 상기 시스테인은 TCR의 TRAC 불변 도메인 서열과 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열 사이에서 이황화 결합을 형성한다.

상술된 도입된 쇄간 결합을 갖거나 갖지 않고, 본 설명의 알파/베타 이종이량체 TCR은 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열을 가질 수 있으며, TCR의 TRAC 불변 도메인 서열 및 TRBC1 또는 TRBC2 불변 도메인 서열은 TRAC의 엑손 2의 Cys4와 TRBC1 또는 TRBC2의 엑손 2의 Cys2 사이에서 천연 이황화 결합에 의해 결합될 수 있다.

본 설명의 TCR은 방사성핵종, 형광단 및 비오틴으로 구성되는 군으로부터 선택되는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 본 설명의 TCR은 같은 방사성핵종, 화학요법제 또는 독소와 같은 치료적 활성제에 접합될 수 있다.

검출 가능한 표지

검출 가능한 표지는 예를 들어, 형광 염색제, 효소, 기질, 생물발광 물질, 방사성 물질 및 화학발광 표지일 수 있다. 예시적인 효소 표지는 호스래디시 페록시다아제, 아세틸콜린에스테라제, 알칼리 포스파타아제, b-갈락토시다아제 및 루시페라아제를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예시적인 형광단(형광 물질)은 로다민, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시안산염, 움벨리페론, 디클로로트리아지닐아민, 피코에리트린 및 단실 염화물을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예시적인 화학발광물질 표지는 루미놀을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예시적인 생물발광물질 표지는 루시페린 및 에쿠오린을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예시적인 방사성 물질은 비스무트-213(²¹³Bs), 탄소-14(¹⁴C), 탄소-11(¹¹C), 염소-18(¹⁸Cl), 크로뮴-51(⁵¹Cr), 코발트-57(⁵⁷Co), 코발트-60(⁶⁰Co), 구리-64(⁶⁴Cu), 구리-67(⁶⁷Cu), 디스프로슘-165(¹⁶⁵Dy), 에르븀-169(¹⁶⁹Er), 불소-18(¹⁸F), 갈륨-67(⁶⁷Ga), 갈륨-68(⁶⁸Ga), 게르마늄-68(⁶⁸Ge), 홀뮴-166(¹⁶⁶Ho), 인듐-111(¹¹¹In), 요오드-123(¹²³I), 요오드-124(¹²⁴I), 요오드-125(¹²⁵I), 요오드-131(¹³¹I), 이리듐-192(¹⁹²Ir), 철-59(⁵⁹Fe), 크립톤-81(⁸¹Kr), 납-212(²¹²Pb), 루테튬-177(¹⁷⁷Lu), 몰리브덴-99(⁹⁹Mo), 질소-13(¹³N), 산소-15(¹⁵O), 팔라듐-103(¹⁰³Pd), 인-32(³²P), 칼륨-42(⁴²K), 레늄-186(¹⁸⁶Re), 레늄-188(¹⁸⁸Re), 루비듐-81(⁸¹Rb), 루비듐-82(⁸²Rb), 사마륨-153(¹⁵³Sm), 셀레늄-75(⁷⁵Se), 나트륨-24(²⁴Na), 스트론튬-82(⁸²Sr), 스트론튬-89(⁸⁹Sr), 황-35(³⁵S), 테크네튬-99m(⁹⁹Tc), 탈륨-201(²⁰¹Tl), 삼중수소(³H), 제논-133(¹³³Xe), 이테르븀-169(¹⁶⁹Yb), 이테르븀-177(¹⁷⁷Yb) 및 이트륨-90(⁹⁰Y)을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

방사성핵종

방사성핵종은 알파 또는 베타 입자(예를 들어, 방사성면역접합체)를 방출한다. 이러한 방사성 동위원소는 인-32(³²P), 스칸듐-47(⁴⁷Sc), 구리-67(⁶⁷Cu), 갈륨-67(⁶⁷Ga), 이트륨-88(⁸⁸Y), 이트륨-90(⁹⁰Y), 요오드-125(¹²⁵I), 요오드-131(¹³¹I), 사마륨-153(¹⁵³Sm), 루테튬-177(¹⁷⁷Lu), 레늄-186(¹⁸⁶Re), 레늄-188(¹⁸⁸Re)과 같은 베타-방출체, 그리고 아스타틴-211(²¹¹At), 납-212(²¹²Pb), 비스무트-212(²¹²Bi), 비스무트-213(²¹³Bi) 또는 악티늄-225(²²⁵Ac)와 같은 알파-방출체를 포함하나 이에 국한되지 않는다.

독소

독소는 메토트렉세이트, 아미노프테린, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 다카르바진; 알킬화제, 예컨대, 메클로레타민, 티오테파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU), 미토마이신 C, 로무스틴(CCNU), 1-메틸니트로소우레아, 시클로포스파미드, 메클로레타민, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴 및 카르보플라틴(파라플라틴); 다우노루비신(구 다우노마이신), 독소루비신(아드리아마이신), 데토루비신, 카미노마이신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론 및 비스안트렌을 포함하는 안트라시클린 ; 닥티노마이신(악티노마이신 D), 블레오마이신, 칼리케아미신, 미트라마이신 및 안트라마이신(AMC)을 포함하는 항생제; 및 항유사분열제, 예컨대, 빈카 알카로이드, 빈크리스틴 및 빈블라스틴을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 다른 세포독성제는 파클리탁셀(TAXOL®), 리신, 슈도모나스 외독소, 젬시타빈, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 브롬화 에티듐, 에메틴, 에토포시드, 테노포시드, 콜키신, 디히드록시 안트라신 디온, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 푸로마이신, 프로카르바진, 히드록시우레아, 아스파라기나아제, 코르티코스테로이드, 미토탄(O,P'-(DDD)), 인터페론 및 이러한 세포독성제의 혼합물을 포함한다.

치료제는 카르보플라틴, 시스플라틴, 파클리탁셀, 젬시타빈, 칼리케아미신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 시클로포스파미드, 빈크리스틴, 블레오마이신, VEGF 길항제, EGFR 길항제, 플라틴, 탁솔, 이리노테칸, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 류코보린, 스테로이드, 시클로포스파미드, 멜팔란, 빈카 알카로이드, 무스틴, 티로신 키나아제 억제제, 방사선요법, 성 호르몬 길항제, 선택적 안드로겐 수용체 조절제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, PDGF 길항제, TNF 길항제, IL-1 길항제, 인터루킨(예를 들어, IL-12 또는 IL-2), IL-12R 길항제, 독소 접합 단클론 항체, 종양 항원 특이적 단클론 항체, 에르비툭스(Erbitux®), 아바스틴(Avastin®), 퍼투주맙, 항-CD20 항체, 리툭산, RTM, 오크렐리주맙, 오파투무맙, DXL625, 허셉틴(Herceptin®) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 리신, 디프테리아 독소 및 슈도모나스 독소와 같은 식물 또는 박테리아로부터 유래한 독성 효소는 세포 유형 특이적 사멸 시약을 생성하기 위해 사용될 수 있다(Youle et al., 1980, Gilliland et al., 1980, Krolick et al., 1980). 다른 세포독성제는 세포독성 리보뉴클레아제를 포함한다(미국 특허 제6,653,104호 참조, 각 참조의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

일 실시양태에서, 알파 사슬에 적어도 하나의 돌연변이를 갖고/갖거나 베타 사슬에 적어도 하나의 돌연변이를 갖는 본 설명의 TCR은 변이되지 않은 TCR과 비교하여 변형된 글리코실화를 갖는다.

일 실시양태에서, TCR 알파 사슬 및/또는 TCR 베타 사슬에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 TCR은 펩티드-HLA 분자 복합체에 대한 결합 친화도 및/또는 결합 반감기를 가지며, 이는 변이되지 않은 TCR 알파 사슬 및/또는 변이되지 않은 TCR 베타 사슬을 포함하는 TCR의 적어도 2배이다. 종양 특이적 TCR의 친화성 강화 및 이의 사용은 최적의 TCR 친화도에 대한 창의 존재에 의존한다. 이러한 창의 존재는, 예를 들어, HLA-A*02 제한 병원체에 특이적인, TCR이, 예를 들어, HLA-A*02 제한 종양 연관 자가-항원에 특이적인, TCR과 비교되는 경우 일반적으로 약 10배 낮은 K_d 값을 갖는다는 관찰에 기반한다. 종양 항원이 면역원성일 수 있는 잠재성을 갖더라도, 종양이 개체 자체의 세포로부터 발생하기 때문에, 돌연변이된 단백질이나 변경된 번역 처리를 갖는 단백질만이 면역계에 의해 이물질로 보여지는 것으로 현재 알려져 있다. 상향조절되거나 과발현된 항원(소위 자가항원)이 종양에 대해 기능적 면역 반응을 필수적으로 유도하지는 않을 것이다. 이러한 항원에 대해 반응성이 높은 TCR을 발현하는 T 세포는, 중추 관용으로 알려진 과정에서 흉선 내에서 부정적으로 선택되었을 것이며, 이는 자가항원에 대해 낮은 친화도의 TCR을 가진 T 세포만 유지됨을 의미한다. 따라서, 펩티드에 대한 본 설명의 TCR 또는 변이체의 친화도는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 향상될 수 있다.

또한, 본 설명은 본 설명에 따른 TCR을 식별하고 단리하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 HLA-A*02-펩티드 단량체를 사용하여 HLA-A*02-음성 건강한 공여체로부터 유래한 PBMC를 배양하는 단계, 사량체-피코에리트린(PE)을 사용하여 PBMC를 배양하는 단계 및 형광 활성화된 세포 분리(FACS) 캘리버 분석으로 고 결합성 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

또한, 본 설명은 본 설명에 따른 TCR을 식별하고 단리하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 T 세포가 마우스 TCR 결핍을 보상하는 방대한 TCR 레퍼토리를 발현하는 전체 인간 TCRαβ 유전자 부위(1.1 및 0.7 Mb)를 사용하여 유전자이식 마우스를 수득하는 단계, 펩티드를 사용하여 마우스를 면역화하는 단계, 사량체-피코에리트린(PE)을 사용하여 유전자이식 마우스로부터 수득되는 PBMC를 배양하는 단계 및 형광 활성화된 세포 분리(FACS) 캘리버 분석에 의해 고 결합성 T 세포를 단리하는 단계를 포함한다.

일 양태에 있어서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하기 위해, 본 설명의 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 사슬을 인코딩하는 핵산을 감마 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 발현 벡터로 클로닝한다. 재조합 바이러스를 생성하고 그런 다음 항원 특이성 및 기능적 결합성과 같은 기능성에 대해 검사한다. 그런 다음, 최종 생성물의 일정 부분을 사용하여 표적 T 세포 집단(일반적으로 환자 PBMC로부터 정제됨)을 형질도입하며, 이는 환자에게 주입하기 전 확장된다.

다른 양태에서, 본 설명의 TCR을 발현하는 T 세포를 수득하기 위해, TCR RNA는 당업계에서 알려진 기법으로, 예를 들어, 시험관내 전사 시스템으로 합성한다. 그런 다음, 건강한 공여체로부터 수득한 원발성 CD8 양성 T 세포에 시험관내 합성된 TCR RNA를 전기천공으로 도입하여 종양 특이적 TCR-알파 및/또는 TCR-베타 사슬을 재발현한다.

발현의 증가를 위해, 본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 레트로바이러스 긴 말단 반복(LTR), 거대세포바이러스(CMV), 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV) U3, 포스포글리세르산 키나아제(PGK), β-액틴, 유비퀴틴 및 원숭이 바이러스 40(SV40)/CD43 복합 프로모터, 신장 인자(EF)-1a 및 비장 병소 형성 바이러스(SFFV) 프로모터와 같은 강력한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 프로모터는 발현 중인 핵산에 대해 이종이다.

강력한 프로모터에 더해, 본 설명의 TCR 발현 카세트는 이식유전자 발현을 향상할 수 있는 추가의 요소를 포함할 수 있으며, 이는 렌티바이러스성 구성체의 핵 전위를 촉진하는 중앙 폴리퓨린 트랙(cPPT) (Follenzi et al., 2000) 및 RNA 안정성의 증가에 의해 이식유전자 발현의 수준을 증가시키는 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(wPRE)를 포함할 수 있다(Zufferey et al., 1999, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

본 발명의 TCR의 알파 및 베타 사슬은 별개의 벡터에 위치한 핵산에 의해 인코딩될 수 있거나 동일한 벡터에 위치한 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩될 수 있다.

고수준의 TCR 표면 발현을 달성하려면 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 고수준으로 전사되는 것을 필요로 한다. 이를 위해, 본 설명의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬은 단일 벡터에서 비-시스트로닉(bi-cistronic) 구성체로 클로닝될 수 있으며, 이는 이 장애물을 극복할 수 있는 것으로 나타난 바 있다. TCR-알파 사슬과 TCR-베타 사슬 사이에 있는 바이러스성 내부 리보좀 유입 부위(IRES)를 사용하는 경우 두 사슬의 조정된 발현을 초래하며, 이는 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 번역 동안 2개의 단백질로 분해되는 단일 전사물로부터 생성되어, 동일한 몰 비율의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬이 생성되도록 보장하기 때문이다(Schmitt et al., 2009, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

본 설명의 TCR을 인코딩하는 핵산은 숙주 세포로부터 유래한 발현을 증가시키기 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 유전 코드의 중복성으로 인해 일부 아미노산은 하나보다 많은 코돈에 의해 인코딩될 수 있게 하나, 특정한 코돈은 다른 코돈보다 덜 "최적"인데 이는 tRNA는 물론 다른 인자의 일치에 대한 상대적 가용성 때문이다(Scholten et al., 2006, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 각각의 아미노산이 포유류 유전자 발현을 위해 최적의 코돈에 의해 인코딩되도록 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 서열의 변형은 물론 mRNA 불안정성 모티프 또는 비밀(cryptic) 스플라이스 부위의 제거가 TCR-알파 및 TCR-베타 유전자 발현을 유의하게 향상시키는 것으로 나타난 바 있다 (Scholten et al., 2006, 이러한 참조의 내용은 이의 전체가 참조로서 본원에 원용됨).

또한, 도입된 TCR 사슬과 내인성 TCR 사슬 사이의 미스페어링(mispairing)는 자가면역에 대해 유의한 위험을 제기하는 특이성의 획득을 초래할 수 있다. 예를 들어, 혼합 TCR 이량체의 형성은 적절하게 페어링(pairing)된 TCR 복합체를 형성하기 위해 이용 가능한 CD3 분자의 수를 감소시킬 수 있으며, 따라서, 도입된 TCR을 발현하는 세포의 기능적 결합성을 유의하게 감소시킬 수 있다(Kuball et al., 2007, 이의 내용은 전체가 본원에 참조에 의해 원용됨).

미스페어링을 감소시키기 위해, 내인성 TCR과 페어링하는 도입된 사슬의 능력을 감소하면서 쇄간 친화도를 촉진하도록 본 설명의 도입된 TCR 사슬의 C-말단 도메인을 변형할 수 있다. 이러한 전략은 인간 TCR-알파 및 TCR-베타 C-말단 도메인을 뮤린 대응물(뮤린화된 C-말단 도메인)로 대체하는 것; 도입된 TCR의 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 모두에 제2 시스테인 잔기를 도입하여 C-말단 도메인에서 제2 쇄간 이황화 결합의 생성하는 것(시스테인 변형); TCR-알파 및 TCR-베타 사슬 C-말단 도메인에서 상호작용하는 잔기의 교환하는 것(“놉-인-홀”(knob-in-hole)); 및 TCR-알파 및 TCR-베타 사슬의 가변 도메인을 CD3ζ에 직접 융합시키는 것(CD3ζ 융합)을 포함할 수 있다 (Schmitt et al., 2009).

일 실시양태에서, 숙주 세포는 본 설명의 TCR을 발현하기 위해 조작된다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 인간 T 세포 또는 T 전구체이다. 일부 실시양태에서, T 세포 또는 T 전구체는 암 환자로부터 수득된다. 다른 실시양태에서, T 세포 또는 T 전구체는 건강한 공여체로부터 수득된다. 본 설명의 숙주 세포는 치료될 환자에 대해 동종이형이거나 자가유래일 수 있다. 일 실시양태에서, 숙주는 알파/베타 TCR을 발현하기 위해 형질전환되는 감마/델타 T 세포이다.

"약학적 조성물"은 의학적 환경에서 인간에게 투여하는 데 적합한 조성물이다. 바람직하게는 약학적 조성물은 무균상태이며 GMP 지침에 따라 생성된다.

약학적 조성물은 유리 형태이거나 약학적으로 허용 가능한 염의 형태인 펩티드를 포함한다(위의 내용 또한 참조). 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 염"은 개시되는 펩티드의 유도체를 지칭하며, 여기서 펩티드는 제제의 산성 또는 염기성 염의 제조에 의해 변형된다. 예를 들어, 산성 염은 적합한 산과의 반응을 수반하는 유리 염기(전형적으로 중성 -NH₂ 기를 갖는 약물의 중성 형태)로부터 제조된다. 산성 염을 제조하기 위해 적합한 산은 예를 들어, 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 살리실산 등의 유기산 및 예를 들어, 염화수소산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등의 무기산을 모두 포함한다. 반대로, 펩티드에서 제시될 수 있는 산성 모이어티의 염기성 염의 제조는 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 수산화 암모늄, 수산화 칼슘, 트리메틸아민 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 염기를 사용하여 제조된다.

특히 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물은 아세트산(아세트산염), 트리플루오르 아세트산염 또는 염화수소산(염화물)의 염으로서 펩티드를 포함한다.

바람직하게는 본 발명의 약제는 백신 등의 면역요법제이다. 이는 환자에게 직접 투여될 수 있거나, 영향을 받은 기관에 투여될 수 있거나 정맥내(i.v.), 피하(s.c.), 피내(i.d.), 복강내(i.p.), 근육내(i.m.)로 전신적으로 투여되거나 환자로부터 유래되는 세포 또는 후속적으로 환자에게 투여되는 인간 세포주에 생체외로 적용될 수 있거나 환자에게 재투여되는 환자로부터 유래되는 면역 세포의 하위집단에 시험관내로 사용될 수도 있다. 핵산이 시험관내에서 세포에 투여되는 경우, 인터루킨-2와 같은 면역 자극 사이토카인과 공동발현되도록 세포가 형질주입되는 것이 유용할 수 있다. 펩티드는 실질적으로 순도가 높을 수 있거나 면역 자극 보조제(아래 참조)와 조합되어 있거나 면역 자극성 사이토카인과 조합하여 사용되거나, 적합한 전달 체계, 예를 들어, 리포좀와 함께 투여될 수 있다. 또한, 펩티드는 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 또는 만난과 같은 적합한 담체와 접합될 수 있다(WO 95/18145 및 Longenecker et al., 1993 참조, 둘 모두의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 또한, 펩티드는 표지될 수 있고, 융합 단백질일 수 있으며, 하이브리드 분자일 수 있다. 서열이 본 발명에서 제공되는 펩티드는 CD4 또는 CD8 T 세포를 자극할 것으로 예상된다. 단, CD8 세포의 자극은 CD4 보조 T 세포에 의해 제공되는 보조의 존재하에서 더 효율적이다. 따라서, CD8 T 세포를 자극하는 MHC 클래스 I 에피토프의 경우, 융합 파트너 또는 하이브리드 분자의 절편은 CD4 양성 T 세포를 자극하는 에피토프를 적합하게 제공한다. CD4 자극 에피토프 및 CD8 자극 에피토프는 당업계에서 잘 알려져 있으며 본 발명에서 식별된 것을 포함한다.

일 양태에서, 백신은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에서 제시되는 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 펩티드 및 적어도 하나의 추가적인 펩티드, 바람직하게는 2개 내지 50개, 더 바람직하게는 2개 내지 25개, 보다 더 바람직하게는 2개 내지 20개 및 가장 바람직하게는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 펩티드를 포함한다. 펩티드는 하나 이상의 특정 TAA로부터 유래될 수 있으며 MHC 클래스 I 분자에 결합할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명의 펩티드 또는 펩티드 변이체를 인코딩하는 핵산(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있고, 단일 가닥 및/또는 이중 가닥일 수 있으며, 천연적 형태이거나 예를 들어, 포스포로티오에이트 백본을 갖는 폴리뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드의 안정화된 형태일 수 있고, 펩티드를 코딩하는 한 인트론을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 물론, 자연 발생 펩티드 결합에 의해 결합이 되는 자연 발생 아미노산 잔기를 함유하는 펩티드만이 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩 가능하다. 본 발명의 추가적인 다른 양태는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현할 수 있는 발현 벡터를 제공한다.

폴리뉴클레오티드, 특히 DNA를 예를 들어 상보적 점착성 말단을 통해 벡터에 연결하는 다양한 방법이 개발되어 있다. 예를 들면, 벡터 DNA에 삽입할 DNA 분절에 상보성 동종중합체 트랙트를 첨가할 수 있다. 그런 다음, 벡터 및 DNA 분절은 상보성 동종중합체 꼬리 간 수소 결합에 의해 연결되어 재조합 DNA 분자를 형성할 수 있다.

하나 이상의 제한 부위를 포함하는 합성 링커는 벡터에 DNA 분절을 연결하는 대안적인 방법을 제공한다. 다양한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 합성 링커는 International Biotechnologies Inc.(New Haven, CN, 미국)를 비롯한 다수의 공급원으로부터 시판된다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA를 변형하는 바람직한 방법은 Saiki 등에 의해 개시된 바와 같은 폴리머라아제 연쇄 반응을 사용한다(Saiki et al., 1988, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 이 방법은, 예를 들어 적합한 제한 부위를 조작하여, 적합한 벡터에 DNA를 도입하는 데 사용될 수 있거나 당업계에서 알려진 다른 유용한 용도에서 DNA를 변형하는데 사용될 수 있다. 바이러스 벡터가 사용되는 경우, 폭스바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터가 바람직하다.

그런 다음, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 포함하는 폴리펩티드를 생성하기 위해 DNA(또는 레트로바이러스 벡터의 경우, RNA)가 적합한 숙주에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명의 펩티드 또는 변이체를 인코딩하는 DNA는 본원에 포함되는 교시의 관점에서 적절하게 변형된, 알려진 기법에 따라 발현 벡터를 구성하기 위해 사용될 수 있으며, 그런 다음, 이는 본 발명의 폴리펩티드의 발현 및 생성을 위해 적합한 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용된다. 이러한 기법은 예를 들어, 미국 특허 제4,440,859호, 제4,530,901호, 제4,582,800호, 제4,677,063호, 제4,678,751호, 제4,704,362호, 제4,710,463호, 제4,757,006호, 제4,766,075호 및 제4,810,648호에서 개시되는 기법을 포함하며, 각각의 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

본 발명의 화합물을 구성하는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA(또는 레트로바이러스 벡터의 경우, RNA)는 적절한 숙주로 도입하기 위해 광범위한 다른 DNA 서열과 연결될 수 있다. 동반 DNA는 숙주의 특성, DNA를 숙주에 도입하는 방식 및 에피솜 유지 또는 통합이 필요한지 여부에 좌우된다.

일반적으로, DNA는 발현을 위한 적절한 배향 및 정확한 리딩 프레임에서, 플라스미드와 같은, 발현 벡터에 삽입된다. 필요한 경우, DNA는 바람직한 숙주에 의해 인식되는 적절한 전사 및 번역 조절 제어 뉴클레오티드 서열에 연결될 수 있으며, 이러한 제어는 일반적으로 발현 벡터에서 이용 가능하다. 그런 다음, 벡터는 숙주에 표준 기법을 통해 도입된다. 일반적으로, 모든 숙주가 벡터에 의해 형질전환되지는 않을 것이다. 따라서, 형질전환된 숙주 세포를 선택하는 것이 필요할 것이다. 하나의 선택 기법은 임의의 필요한 제어 요소와 함께, DNA 서열을 항생제 저항성과 같은 형질전환된 세포에서 선택 가능한 특성을 코딩하는 발현 벡터에 통합시키는 것이다.

대안적으로, 이러한 선택 가능한 특성에 대한 유전자는 다른 벡터에 있을 수도 있으며, 이는 바람직한 숙주 세포를 공동형질전환하기 위해 사용된다.

그런 다음 본 발명의 재조합 DNA에 의해 형질전환되는 숙주 세포는 충분한 시간 동안 본원에서 개시되는 교시의 관점에서 당업자에게 알려진 적절한 조건하에서 배양되어 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하며, 이는 그런 다음 복구될 수 있다.

박테리아(예를 들어, 대장균(E. coli) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)), 효모(예를 들어, 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 사상성 진균류(예를 들어, 아스페르길루스 종(Aspergillus spec.)), 식물 세포, 동물 세포 및 곤충 세포를 포함하는 많은 발현 체계가 알려져 있다. 바람직하게는, 체계는 ATCC Cell Biology Collection으로부터 이용 가능한 CHO 세포와 같은 포유류 세포일 수 있다.

구조성 발현을 위한 전형적인 포유류 세포 벡터 플라스미드는 적합한 폴리 A 꼬리 및 네오마이신과 같은 저항성 마커와 함께 CMV 또는 SV40 프로모터를 포함한다. 일례는 Pharmacia, Piscataway, NJ, USA로부터 이용 가능한 pSVL이다. 유도 가능한 포유류 발현 벡터의 예는 pMSG이며, 이 또한 Pharmacia로부터 이용 가능하다. 유용한 효모 플라스미드 벡터는 pRS403-406 및 pRS413-416이며 이는 일반적으로 Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, 미국)로부터 이용 가능하다. 플라스미드 pRS403, pRS404, pRS405 및 pRS406은 효소 통합 플라스미드(YIp)이며 이는 효모 선택 가능한 마커 HIS3, TRP1, LEU2 및 URA3을 통합한다. 플라스미드 pRS413-416은 효모 동원체 플라스미드(Ycp)이다. CMV 프로모터 기반 벡터(예를 들어. Sigma-Aldrich 제품)는 일시적인 또는 안정한 발현, 세포질 발현 또는 분비, 및 FLAG, 3xFLAG, c-myc 또는 MAT의 다양한 조합으로 표지되는 N-말단 또는 C-말단 표지를 제공한다. 이러한 융합 단백질은 재조합 단백질의 검출, 정제 및 분석을 가능하게 한다. 이중 표지 융합은 검출에 있어 유연성을 제공한다.

강력한 인간 거대세포바이러스(CMV) 프로모터 조절 영역은 COS 세포에서 높게는 1 mg/L까지 구성적 단백질 발현 수준을 유도한다. 효능이 보다 낮은 세포주의 경우, 단백질 수준은 전형적으로 약 0.1 mg/L이다. SV40 복제 원점의 존재는 SV40 복제를 가능하게 하는 COS 세포에서 높은 DNA 복제 수준을 초래한다. CMV 벡터는 예를 들어, 박테리아 세포에서의 복제를 위한 pMB1(pBR322의 유도체) 원점, 박테리아에서의 암피실린 저항성 선택을 위한 b-락타마아제 유전자, hGH 폴리A 및 f1 원점을 포함할 수 있다. 프리-프로-트립신 선도(PPT) 서열을 포함하는 벡터는 항-FLAG 항체, 수지 및 플레이트를 사용하여 정제하기 위한 배양 배지에 FLAG 융합 단백질을 분비하도록 지시할 수 있다. 다른 벡터 및 발현 체계가 다양한 숙주 세포와의 사용에 대해 당업계에서 잘 알려져 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 2개 이상의 펩티드 또는 펩티드 변이체가 인코딩되며, 따라서, 연속적인 순서로 발현된다("염주 모양"(beads on a string) 구조와 유사). 그렇게 함으로써, 펩티드 또는 펩티드 변이체는 예를 들어, LLLLLL과 같은 링커 아미노산의 스트레치에 의해 함께 연결 또는 융합될 수 있거나 또는 이들 사이에서 추가적인 펩티드(들) 없이 연결될 수 있다. 또한, 이러한 구성체는 암 요법을 위해 사용될 수 있으며 MHC I 및 MHC II 둘 다 관여되는 면역 반응을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 벡터 구성체를 사용하여 형질전환되는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 세포이거나 진핵 세포일 수 있다. 박테리아 세포는 일부 상황에서 바람직한 원핵 숙주 세포일 수 있으며 전형적으로 예를 들어, Bethesda Research Laboratories Inc.(Bethesda, MD, 미국)로부터 이용 가능한 대장균 균주 DH5 및 American Type Culture Collection(ATCC)(Rockville, MD, 미국)(번호 ATCC 31343)으로부터 이용 가능한 RR1같은 대장균 균주이다. 바람직한 진핵 숙주 세포는 효모, 곤충 및 포유류 세포, 바람직하게는 마우스, 래트, 원숭이 또는 인간 섬유아세포 및 결장 세포주로부터 유래한 세포와 같은 척추 동물 세포를 포함한다. 효모 숙주 세포는 YPH499, YPH500 및 YPH501을 포함하며, 이는 일반적으로 Stratagene Cloning Systems(La Jolla, CA 92037, 미국)로부터 이용 가능하다. 바람직한 포유류 숙주 세포는 CCL61로서 ATCC로부터 이용 가능한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, CRL 1658로서 ATCC로부터 이용 가능한 NIH 스위스 마우스 배아 세포 NIH/3T3, CRL 1650로서 ATCC로부터 이용 가능한 원숭이 신장 유래 COS-1 세포 및 인간 배아 신장 세포인 293 세포를 포함한다. 바람직한 곤충 세포는 바큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 세포에 형질주입될 수 있는 Sf9 세포이다. 발현을 위한 적합한 숙주 세포의 선택에 대한 개요는 문헌(Balbas and Lorence, 2004)에서 찾아볼 수 있다.

본 발명의 DNA 구성체를 사용하여 적절한 세포 숙주를 형질전환하는 것은 전형적으로 사용되는 벡터의 유형에 따른 잘 알려진 방법에 의해 달성된다. 원핵 숙주 세포의 형질전환에 관해서는, 예를 들어 Cohen 등 또는 Green 및 Sambrook를 참조한다 (Cohen et al., 1972; Green and Sambrook, 2012). 효모 세포의 형질전환은 Sherman 등에서 설명되어 있다 (Sherman et al., 1986). 또한, Beggs의 방법 (Beggs, 1978)이 유용하다. 척추 동물 세포와 관련하여 이러한 세포를 형질주입하는 데 유용한 시약, 예를 들어, 인산칼슘 및 DEAE-덱스트란 또는 리포좀 제형은 Stratagene Cloning Systems 또는 Life Technologies Inc.(Gaithersburg, MD 20877, 미국)로부터 이용 가능하다. 또한, 전기천공법은 세포를 형질전환 및/또는 형질주입하는 데 유용하며 이는 효모 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포 및 척추 동물 세포의 형질전환에 대해 당업계에서 잘 알려져 있다. 이러한 각각의 참고문헌의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

성공적으로 형질전환된 세포, 즉, 본 발명의 DNA 구성체를 포함하는 세포는 PCR과 같은 잘 알려진 기법으로 식별될 수 있다. 대안적으로, 상층액에 있는 단백질 존재는 항체를 사용하여 검출될 수 있다.

본 발명의 특정한 숙주 세포, 예를 들어, 박테리아, 효모 및 곤충 세포는 본 발명의 펩티드의 제조에서 유용하다는 것을 알 수 있을 것이다. 그러나, 특정한 치료 방법에서는 다른 숙주 세포가 유용할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포와 같은 항원 제시 세포는 적절한 MHC 분자에 탑재될 수 있도록 본 발명의 펩티드를 발현하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 항원 제시 세포, 특히, 수지상 세포 또는 항원 제시 세포이다. 전립선산 포스파타아제(PAP)를 포함하는 재조합 융합 단백질을 사용하여 탑재된 APC는 무증상 또는 최소한의 증상성 전이성 HRPC(Sipuleucel-T)를 치료하기 위해 미국 식품의약품안전처(FDA)에서 2010년 4월 29일에 승인되었다(Rini et al., 2006; Small et al., 2006, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

본 발명의 다른 양태는 펩티드 또는 이의 변이체를 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 숙주 세포를 배양하는 단계 및 숙주 세포 또는 펩티드를 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함한다.

다른 실시양태에서, 본 발명의 펩티드, 핵산 또는 벡터 발현이 의학에서 사용된다. 예를 들어, 펩티드 또는 이의 변이체는 정맥내(i.v.) 투여, 피하(s.c.) 투여, 피내(i.d.) 투여, 복강내(i.p.) 투여, 근육내(i.m.) 주사용으로 제조될 수 있다. 펩티드 주사의 바람직한 방법은 피하(s.c.), 피내(i.d.), 복강내(i.p.), 근육내(i.m.) 및 정맥내(i.v.) 주사를 포함한다. DNA 주사의 바람직한 방법은 피내(i.d.), 근육내(i.m.), 피하(s.c.), 복강내(i.p.) 및 정맥내(i.v.) 주사를 포함한다. 50 μg 내지 1.5 mg, 바람직하게는 125 μg 내지 500 μg의 용량의 펩티드 또는 DNA가 투여될 수 있으며 이는 각각의 펩티드 또는 DNA에 따라 좌우된다. 이러한 범위의 용량이 이전의 임상시험에서 성공적으로 사용되었다 (Walter et al., 2012).

활성 백신접종을 위해 사용되는 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순도가 높거나 적합한 벡터 또는 전달 체계에 포함되어 있을 수 있다. 핵산은 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합일 수 있다. 이러한 핵산을 설계하고 도입하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 개요는 예를 들어 Teufel 등에 의해 제공된다(Teufel et al., 2005, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 폴리뉴클레오티드 백신은 제조하기 용이하지만, 면역 반응 유도에서 이러한 벡터의 작용 방식은 완전히 이해되지 않았다. 적합한 벡터 및 전달 체계는 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 아데노 연관 바이러스 또는 하나 이상의 바이러스의 요소를 함유하는 혼성체를 기반으로 하는 체계와 같은 바이러스 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 비바이러스 전달 체계는 양이온 지질 및 양이온 중합체를 포함하며 DNA 전달 분야에서 잘 알려져 있다. 또한, "유전자-총"(gene-gun)을 통한 전달과 같은 물리적 전달이 사용될 수 있다. 핵산에 의해 인코딩되는 펩티드(들)는, 예를 들어, 전술한 각각의 반대 CDR에 대한 T 세포를 자극하는 에피토프를 갖는, 융합 단백질일 수 있다.

또한, 본 발명의 약제는 하나 이상의 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 면역 반응, 예를 들어, 항원에 대한 CD8 양성 T 세포 및 보조 T(TH) 세포에 의해서 매개된 면역 반응을, 비특이적으로 향상시키거나 효능 있게 하는 물질이며, 따라서, 본 발명의 약제에서 유용하다고 간주될 것이다.

적합한 보조제는 1018 ISS, 알루미늄 염, 암플리박스(AMPLIVAX®), AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, 플라젤린 또는 플라젤린으로부터 유래되는 TLR5 리간드, FLT3 리간드, GM-CSF, IC30, IC31, 이미퀴모드(Imiquimod, ALDARA®), 레시퀴모드(Resiquimod), ImuFact IMP321, IL-2, IL-13, IL-21과 같은 인터루킨, 인터페론 알파 또는 베타, 또는 이들의 페길화된 유도체, IS 패치, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, 주브이뮨(JuvImmune®), LipoVac, MALP2, MF59, 모노포스포릴 지질 A, 몬타나이드(Montanide) IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 유중수형 및 수중유형 에멀젼, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, PepTel® 벡터 시스템, 폴리(락티드 코-글리콜리드)[PLG]-기반 및 덱스트란 마이크로입자, 탈락토페린, SRL172, 비로솜(Virosomes) 및 다른 바이러스-유사 입자, YF-17D, VEGF 트랩, R848, 베타-글루칸, Pam3Cys, 사포닌으로부터 유래되는 아퀼라(Aquila's) QS21 스틸물론, 마이코박테리아 추출물 및 합성 박테리아 세포 벽 모방제 및 리비 데톡스(Ribi's Detox), 쿠일(Quil) 또는 수퍼포스(Superfos)와 같은 다른 독점 보조제를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 프로인트(Freund's) 또는 GM-CSF와 같은 보조제가 바람직하다. 수지상 세포에 특이적인 여러 면역학적 보조제(예를 들어, MF59) 및 이의 제조 방법은 이전에 설명된 바 있다(Allison and Krummel, 1995, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

또한, 사이토카인이 사용될 수 있다. 여러 사이토카인이 수지상 세포가 림포이드 조직으로 이동하는 데 영향을 미치고(예를 들어, TNF-), 수지상 세포가 T 림프구에 대한 효율적인 항원 제시 세포로 성숙하도록 가속화하고(예를 들어, GM-CSF, IL-1 및 IL-4)(미국 특허 제5,849,589호, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨) 면역보조제로서의 작용하는 것(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IL-23, IFN-알파. IFN-베타)과 직접적으로 연결된 바 있다(Gabrilovich et al., 1996, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 일 양태에서, 사이토카인 및 면역학적 보조제는 예컨대 T 세포의 확장 또는 활성화를 위해 시험관내에서 또는 생체외 용도로 사용될 수 있다.

또한, CpG 면역자극 올리고뉴클레오티드는 백신 환경에서 보조제의 효과를 향상시키는 것으로 보고된 바 있다. 이론에 얽매이지 않고, CpG 올리고뉴클레오티드는 톨-유사 수용체(TLR), 주로, TLR9를 통해 선천(비적응) 면역계를 활성화하여 작용한다. CpG에 의해 촉발되는 TLR9 활성화는 펩티드 또는 단백질 항원, 살아 있거나 죽은 바이러스, 수지상 세포 백신, 자가유래 세포 백신 및 예방적 및 치료적 백신의 다당류 접합체를 포함한 광범위한 항원에 대한 항원 특이적 체액성 및 세포성 반응을 향상시킨다. 더 중요하게, 이는 수지상 세포 성숙 및 분화를 향상시키고, 이는, 심지어 CD4 T 세포 보조의 부재하에서, TH1 세포의 활성화 및 강한 세포독성 T 림프구(CTL) 생성의 향상을 초래한다. TLR9 자극에 의해 유도되는 TH1 편이는 심지어 일반적으로 TH2 편이를 촉진하는 백반(alum) 또는 불완전한 프로인트 보조제(IFA)와 같은 백신 보조제의 존재하에서도 유지된다. CpG 올리고뉴클레오티드는 항원이 상대적으로 약할 경우 강한 반응을 유도하는 데 특히 필요한 마이크로입자, 나노입자, 지질 에멀젼 또는 유사 제형과 같은 제제에서 또는 다른 보조제와 함께 제형화되거나 공동 투여되는 경우 보다 더 큰 보조제 활성을 나타낸다. 또한, 이는 면역 반응을 가속화하며 일부 실험에서 CpG 없이 전체 용량 백신에 대한 비교 가능한 항체 반응으로 항원 용량을 대략 수십 배 정도 감소시킬 수 있다 (Krieg, 2006). 전체가 참조에 의해 본원에 원용되는 US 6,406,705 B1은 항원 특이 면역 반응을 유도하는 CpG 올리고뉴클레오티드, 비-핵산 보조제 및 항원의 조합 사용을 설명한다. CpG TLR9 길항제는 Mologen(Berlin, Germany)의 dSLIM(double Stem Loop Immunomodulator)이며, 이는 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 성분이다. 또한, RNA 결합 TLR 7, TLR 8 및/또는 TLR 9와 같은 다른 TLR 결합 분자가 사용될 수 있다.

다른 유용한 보조제의 예는 화학적으로 변형된 CpGs(예를 들어, CpR, 아이데라(Idera)), 폴리(I:C)와 같은 dsRNA 유사체 및 이의 유도체(예를 들어, 앰프리젠(AmpliGen®), 힐토놀(Hiltonol®), 폴리(ICLC), 폴리(IC-R), 폴리(I:C12U), 비-CpG 박테리아 DNA 또는 RNA, 그리고 시클로포스파미드, 수니티닙, 면역 관문 억제제(이필리무맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 더발루맙 및 세미플리맙 포함), 베바시주맙(Bevacizumab®), 셀레브렉스(Celebrex), NCX-4016, 실데나필, 타달라필, 바르데나필, 소라페닙, 테모졸로마이드, 템시롤리무스, XL-999, CP-547632, 파조파닙, VEGF 트랩, ZD2171, AZD2171, 항-CTLA4, 면역계의 주요 구조를 표적화하는 다른 항체(예를 들어, 항-CD40, 항-TGF베타, 항-TNF알파 수용체) 및 SC58175와 같은 면역활성적인 소분자 및 항체를 포함하나 이에 국한되지 않으며, 이는 치료적으로 및/또는 보조제로서 작용할 수 있다. 본 발명의 맥락에서 유용한 보조제 및 첨가제의 양 및 농도는 과도한 실험을 하지 않고 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

바람직한 보조제는 항-CD40, 이미퀴모드, 레시퀴모드, GM-CSF, 시클로포스파마이드, 수리티닙, 베바시주맙, 인터페론-알파, CpG, 올리고뉴클레오티드 및 유도체 폴리-(I:C) 및 유도체, RNA, 실데나필 그리고 PLG 또는 비로솜이 있는 미립자 제형이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 실시양태에서, 보조제는 GM-CSF, 사르가라모스팀, 시클로포스파미드, 이미퀴모드, 레시퀴모드 및 인터페론-알파 또는 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 실시양태에서, 보조제는 시클로포스파미드, 이미퀴모드 또는 레시퀴모드이다. 보다 더 바람직한 보조제는 몬타나이드 IMS 1312, 몬타나이드 ISA 206, 몬타나이드 ISA 50V, 몬타나이드 ISA-51, 폴리-ICLC(Hiltonol®) 및 항-CD40 mAb 또는 이들의 조합이다.

이러한 조성물은 피하, 피내, 근육내와 같은 비경구 투여 또는 경구 투여를 위해 사용된다. 조성물은 피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 흉막내, 방광내, 척수강내, 국부, 경구 투여, 또는 경로의 조합을 통해 투여될 수 있다. 이를 위해, 펩티드 그리고 임의적으로 다른 분자는 약학적으로 허용 가능한, 바람직하게는 수용성 담체에 용해되거나 현탁된다. 또한, 조성물은 완충제, 결합제, 발파제, 희석제, 향미제, 윤활제 등과 같은 부형제를 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 부형제, 윤활제, 유화제, 안정화제, 용매, 희석제, 완충제, 비히클(vehicle) 또는 이들의 조합을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, MHC 분자를 갖는 복합체에서 본 개시내용의 펩티드를 인식하는 T 세포 또는 펩티드는 표 6에서 나타낸 사이토카인 같은 면역 자극 물질과 함께 투여될 수 있다.

또한, 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IFN-α, 및 IFN-β는 MHC 분자를 갖는 복합체에서 본 개시내용의 펩티드를 인식하는 T 세포와 같은 T 세포의 활성화 및/또는 확장에 사용될 수 있다.

이러한 조성물에서 사용될 수 있는 부형제의 확장적인 목록은 예를 들어, A. Kibbe, 약학적 부형제 핸드북 (Kibbe, 2000)에서 찾아볼 수 있다. 적합한 약학적 담체의 다른 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences(Gennaro, 1997; Banker 및 Rhodes, 2002, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)에서 설명되어 있다. 조성물은 선종성 또는 암성 질환의 방지, 예방 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 예시적인 제형은 예를 들어 EP2112253에서 발견할 수 있다.

본 발명에 따른 백신에 의해 촉발되는 면역 반응이 상이한 세포 단계 및 상이한 병기에서의 암을 공격한다는 점을 인지하는 것이 중요하다. 또한, 상이한 암 연관 신호전달 경로가 공격을 받는다. 이는 단 하나 또는 소수의 표적만을 다루어 종양이 공격에 용이하게 적응(종양 탈출)하도록 야기할 수 있는 백신에 비해 이점으로 작용한다. 더욱이, 모든 개별 종양이 동일한 항원의 패턴을 발현하는 것은 아니다. 따라서, 여러 종양 연관 펩티드의 조합은 모든 단일 종양이 적어도 표적의 일부를 갖도록 한다. 조성물은 각 종양이 여러 항원을 발현하며 종양 성장 및 유지에 필요한 여러 독립적 경로를 포함할 것으로 기대되는 방법으로 설계되었다. 따라서, 백신은 보다 큰 환자 집단을 위한 "기성품"으로 용이하게 사용될 수 있다. 이는 백신으로 치료할 환자의 사전 선택이 HLA 유형으로 제한될 수 있으며, 항원 발현을 위해 임의의 추가적인 바이오마커 평가를 필요로 하지 않음을 의미하지만, 이는 여전히 여러 표적이 효능에 중요한 유도된 면역 반응에 의해 동시적으로 공격되도록 보장한다(Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

본원에서 사용되는 용어 "골격"(scaffold)은 (예를 들어, 항원성) 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 일 실시양태에서, 골격은 골격에 부착되는 개체(예를 들어, (제2) 항원 결합 모이어티)를 표적 부위, 예를 들어, 특이적 유형의 종양 세포 또는 항원성 결정인자를 갖는 종양 기질(예를 들어, 쉽게 이용할 수 있는 용도에 따른 MHC를 갖는 펩티드의 복합체)로 배향할 수 있다. 다른 실시양태에서, 골격은 이의 표적 항원, 예를 들어, T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화할 수 있다. 골격은 항체 및 이의 단편, 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인, 적어도 하나의 안키린 반복 모티프 및 단일 도메인 항원 결합(SDAB) 분자를 포함하는 결합 단백질, 압타머, (가용성) TCR 및 동종이계 또는 자가유래 T 세포와 같은 (변형된) 세포를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 분자가 표적에 결합하는 골격인지 평가하기 위해, 결합 검정을 수행할 수 있다.

"특이적" 결합은 골격이 다른 자연 발생 펩티드-MHC-복합체보다 관심 대상의 펩티드-MHC-복합체에 더 잘 결합하는 것을 의미하며, 이는 특이적 표적을 갖는 세포를 사멸시킬 수 있는 활성 분자로 무장한 골격이 특이적 표적은 없으나 다른 펩티드-MHC 복합체를 제시하는 다른 세포는 사멸시킬 수 없는 정도이다. 교차-반응성 펩티드-MHC의 펩티드가 자연 발생하지 않는 경우, 즉, 인간 HLA-펩티돔으로부터 유래되지 않는 경우, 다른 펩티드-MHC 복합체에 대한 결합은 관련이 없다. 표적 세포 사멸을 평가하기 위한 시험은 당업계에서 잘 알려져 있다. 시험은 변경되지 않은 펩티드-MHC 제시를 갖는 표적 세포(일차 세포 또는 세포주) 또는 자연 발생 펩티드-MHC 수준이 도달되도록 펩티드가 탑재되는 세포를 사용하여 수행하여야 한다.

각각의 골격은 표지가 제공하는 신호의 존재나 부재를 측정하여 결합된 골격이 검출될 수 있도록 제공하는 표지하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 골격은 형광 염색제 또는 임의의 다른 해당하는 세포 마커 분자를 사용하여 표지될 수 있다. 이러한 마커 분자는 당업계에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 예를 들어, 형광 염색제에 의해 제공되는 형광 표지는 형광 또는 레이저 스캐닝 현미경 또는 유세포분석에 의해 결합된 압타머의 가시화를 제공할 수 있다.

각 골격은 예를 들어, IL-21, 항-CD3, 항-CD28과 같은 제2 활성 분자와 접합될 수 있다.

폴리펩티드 골격에 대한 추가 정보는 예를 들어, WO 2014/071978A1의 배경 부분과 이의 인용된 참조 문헌을 참조하며, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

본 발명의 펩티드는 MHC/펩티드 복합체에 대한 특정 항체를 생성하고 개발하는 데 사용될 수 있다. 이는 병변 조직에 대한 독소 또는 방사능 물질을 표적으로 하는 요법에 사용될 수 있다. 이러한 항체의 다른 용도는 PET와 같은 영상화 목적을 위해 병변 조직의 방사성핵종을 표적화하는 것일 수 있다. 이러한 용도는 작은 전이를 검출하거나 병변 조직의 크기 및 정밀한 위치를 결정하는 데 도움을 줄 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 HLA-제한 항원과 복합체를 형성하는 MHC 클래스 I 또는 II와 특이적으로 결합하는 재조합 항체(바람직하게는 본 발명의 펩티드)를 생성하기 위한 방법을 제공하는 것이며, 이 방법은 상기 인간 MHC 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유류를 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로 면역화하는 단계; mRNA 분자를 상기 비인간 포유류의 세포를 생성하는 항체로부터 단리하는 단계; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩되는 단백질 분자를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 단계; 및 적어도 하나의 파지를 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 하나의 파지는 상기 HLA-제한 항원과 복합체를 형성하는 상기 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 표시한다.

따라서, 본 발명의 다른 양태는 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 MHC 클래스 I 또는 II 분자에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이며, 여기서 항체는 바람직하게는 다클론 항체, 단클론 항체, 이중특이성 항체 및/또는 키메라 항체, 이들의 항체 단편 또는 이들의 조합이다.

이중특이성 항체

일 양태에서, 이중특이성 항체는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 다양한 방법으로 제조될 수 있고(Holliger & Winter, 1993, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨), 예를 들어, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있거나, 또는 전술한 임의의 이중특이성 항체 단편일 수 있다. scFv 이량체 또는 디아바디가 전체 항체 대신 사용될 수 있다. 디아바디 및 scFv는 Fc 영역 없이 구성될 수 있으며, 이는 (대개 기원 항체의 경쇄 및 중쇄 모두로부터 유래되는 가변 도메인 성분을 포함하는) 가변 도메인만을 사용하며, 이는 잠재적으로 항이디오타입 반응 효과를 감소시킨다. 다른 형태의 이중특이성 항체는 Traunecker 등에 의해 설명되는 단쇄 "자누신"(Janusin)을 포함한다(Traunecker et al., 1991,이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

이중특이성 항체는 일반적으로 2개의 상이한 결합 도메인을 포함하며, 각각의 결합 도메인은 2개의 상이한 항원 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이성 항체가 2개의 상이한 에피토프(제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 결합의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 결합 도메인의 친화성보다 적어도 수십 배 내지 수백 배 또는 수천 배 또는 수만 배 더 낮을 것이며 이의 반대도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 상이한 표적 상에 (예를 들어, 동일하거나 상이한 단백질 상에) 있을 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들어 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 결합 도메인을 조합하여 제조될 수 있다.

일부 예시적인 이중특이성 항체는 2개의 중쇄(각각은 3개의 중쇄 CDR을 가지며, 이어서 (N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 가짐) 및 각 중쇄와의 연관을 통해 항원 결합 특이성을 부여하는 2개의 면역글로불린 경쇄를 갖는다. 그러나, 경쇄(들)가 각각의 중쇄와 연관되나 항원-결합 특이성에 기여하지 않거나(또는 최소한으로 기여하거나), 또는 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합되는 에피토프 중 하나 이상을 결합할 수 있거나, 또는 각 중쇄와 연관될 수 있고 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 하나 또는 둘 모두의 중쇄가 결합할 수 있는 이중특이성 항체를 포함하는 추가적인 아키텍처가 구상된다.

특정 실시양태에서, 이중특이성 항체는 표적화된 질환 세포에 세포 방어 기전에 초점을 맞추고 이를 국소화하기 위해, 백혈구 상의 촉발 분자, 예컨대, T 세포 수용체 분자(예를 들어, CD3), 또는 IgG(Fc 감마 R)에 대한 Fc 수용체, 예컨대, Fc 감마 RI(CD64), Fc 감마 RII(CD32) 및 Fc 감마 RIII(CD16)에 결합하는 아암(arm)과 조합되는 항체 아암을 포함할 수 있다. 또한, 이중특이성 항체는 세포독성제를 표적화된 질환 세포에 국소화하기 위해 사용될 수 있다.

이중특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂ 이중특이성 항체)으로서 제조될 수 있다. WO 1996/016673; 미국 특허 제5,837,234호; WO 1998/002463; 미국 특허 제5,821,337호 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

이중특이성 항체는 연장된 반감기를 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 이중특이성 항체의 반감기 연장은 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 모방형 친수성 중합체와 같은 불활성 중합체에 커플링하여 항체의 유체역학적 부피를 증가시키는 방법; 큰 무질서한 펩티드에 대한 융합하거나 접합하는 방법; 또는 항체를 리간드에 융합하거나 커플링하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 변경 및 다수의 다른 방법은 다른 문헌에서 설명된다(미국 특허 제7,083,784호, 미국 특허 제7,670,600호, 미국 특허 출원 공보 제2010/0234575호, 및 Zwolak et al., 2017, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 연장된 반감기를 갖는 이중특이성 항체는 예를 들어, 미국 특허 제8,921,528호 및 미국 특허 출원 공보 제2014/0308285호에서 설명되며, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

이중특이성 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에서 알려져 있다. 전장 이중특이성 항체의 생성은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기반하며, 여기서 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다. 예를 들어, WO 1993/008829 및 Traunecker et al., 1991참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

다클론 항체

다클론 항체를 제조하기 위한 방법은 당업계에서 알려져 있다. 다클론 항체는 항원으로 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래되는 항체 분자의 이질성 집단이다. 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 펩티드 또는 이의 변이체 또는 이의 단편에 선택적으로 결합하는 다클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Howard & Kaser (2007) 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

키메라 항체

키메라 항체는 뮤린 항체로부터 유래되는 가변 영역과 인간 면역글로불린 불변 영역을 갖는 것과 같이 상이한 동물 종에서 유래되는 부분이 상이한 분자이며, 이는 예를 들어, 뮤린 단클론 항체가 하이브리도마로부터 더 높은 수율을 가지나 인간에서 더 높은 면역원성을 갖는 경우, 인간 뮤린 키메라 단클론 항체가 사용되도록, 응용에서 면역원성을 감소시키고 생성에서 수율을 높이기 위해 주로 사용된다. 키메라 항체 및 이의 생성을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Cabilly et al., 1984; Morrison et al., 1984; Boulianne et al., 1984; 유럽 특허 출원 제173494호(1986); WO 86/01533 (1986); European Patent Application 184187 (1986); Sahagan et al., 1986; Liu et al., 1987; Sun et al., 1987; Better et al., 1988; Harlow & Lane, 1998; 미국 특허 제5,624,659호, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

항체 단편

전체 면역글로불린(또는 이의 재조합 대응물)에 더해, 에피토프 결합 부위를 포함하는 면역 글로불린 단편(예를 들어, Fab', F(ab')₂) 또는 다른 단편)이 합성될 수 있다. "단편" 또는 최소 면역글로불린은 재조합 면역글로불린 기법을 활용하여 설계될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서의 용도를 위한 "Fv" 면역글로불린은 융합된 가변 경쇄 영역 및 가변 중쇄 영역을 합성하여 생성될 수 있다. 또한, 항체의 조합, 예를 들어 디아바디는 관심 대상이며, 이는 2개의 구별된 Fv 특이성을 포함한다. 면역글로불린의 항원 결합 단편은 SMIP(소분자 면역의약품), 카멜바디, 나노바디 및 IgNAR을 포함하나 이에 국한되지 않는다.

각각의 이러한 항체 및 단쇄 MHC 클래스 I 복합체를 생성하기 위한 방법 및 이러한 항체의 생성을 위한 다른 도구는 WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752에서 그리고 간행물 (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003, 이는 본 발명의 모든 목적을 위해 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)에서 개시된다.

바람직하게는, 항체는 복합체에 100 nM 미만, 더 바람직하게는 50 nM 미만, 더 바람직하게는 10 nM 미만, 더 바람직하게는 1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.01 nM 미만의 결합 친화도로 결합하며, 이는 또한 본 발명의 맥락에서 “특이적”이라고 간주된다.

본 발명은

· 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로

· 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열 및 MHC 분자(들)에 결합하고/하거나 상기 변이 펩티드와 함께 교차 반응하는 T 세포를 유도하는 능력을 유지하는 이의 변이체 서열을 포함하는 펩티드,

또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다.

개시되는 펩티드는 HLA-A*02 동종이형 MHC 분자에 결합한다. 마찬가지로, MHC 분자(들)에 결합하는 펩티드 변이체의 능력은 HLA-A*02 동종이형 MHC 분자에 관련된다.

일 실시양태에서, 위의 의미에서 청구된 펩티드의 변이체 서열은 소위 “고정 위치”에서 치환을 갖는 서열이다.

MHC 제한 펩티드의 이러한 고정 위치는 MHC의 펩티드 결합 그루브에 대한 펩티드의 결합을 매개하는 아미노산 잔기를 포함한다는 점에 유의한다.

이들은 결합 폴리펩티드와 펩티드-MHC 복합체 간의 결합 반응에서 주요하지 않은 역할만을 하며, 이는 이러한 위치에서의 치환이 이러한 방식으로 변형된 펩티드의 면역원성 또는 TCR/항체 결합에 유의한 영향을 미치지 않음을 의미한다. 　

HLA-A*02의 경우, 고정 위치는 각각의 MHC 제한 펩티드의 위치 2(P2) 및 위치 9(P9)에서 있다(표 7 참조). P2에서, 바람직한 아미노산 잔기는 가장 흔히 류신(L) 또는 메티오닌(M)이며, P9에서, 바람직한 아미노산 잔기는 류신(L) 또는 발린(V)이다.

또한, 본 발명은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 대해 적어도 88% 상동성인 이의 변이체에 관한 것이며, 단 이들은 MHC 분자(들)에 결합하고/하거나 상기 변이체 펩티드와 교차 반응하는 T 세포를 유도한다.

일 실시양태에서, 위의 의미에서 청구된 펩티드의 변이체 서열은 적어도 하나의 보존적 아미노산 치환으로 변형되는 서열이다. 용어 "보존적 아미노산 치환"의 정의 및 범위는 표 3 및 표 4와 이에 관한 설명에서 개시된다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드는 MHC 클래스 l 분자에 결합하는 능력을 가지며, 상기 MHC에 결합되는 경우, CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있다.

일 실시양태에서, MHC 클래스 l 분자는 HLA-A*02 동종이형 MHC 분자이다.

본 발명은 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 펩티드 및 서열 번호:1 내지 서열 번호:102와 적어도 88% 상동인(바람직하게는 동일한) 이의 변이체에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드 또는 변이체는 선택되는 펩티드가 9개의 아미노산의 길이를 갖는 경우 8개 내지 30개 및 바람직하게는 8개 내지 12개 또는 9개 내지 30개 및 바람직하게는 9개 내지 12개의 아미노산의 전체 길이를 가지며, 선택되는 펩티드가 10개의 아미노산의 길이를 갖는 경우 10개 내지 30개 및 바람직하게는 10개 내지 12개의 아미노산의 전체 길이를 갖는다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 각각의 서열의 C-말단 및/또는 N-말단에서 1개 내지 4개의 추가적인 아미노산을 포함한다. 추가 정보는 표 5를 참조한다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 최대 30개 아미노산의 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 최대 16개 아미노산의 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 최대 12개 아미노산의 길이를 갖는다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 8개 내지 30개 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 8개 내지 16개 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 8개 내지 12개 아미노산의 전체 길이를 갖는다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 9개 내지 30개 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 9개 내지 16개 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 9개 내지 12개 아미노산의 전체 길이를 갖는다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 10개 내지 30개 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 10개 내지 16개 아미노산의 전체 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 10개 내지 12개 아미노산의 전체 길이를 갖는다.

일 실시양태에서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 각각의 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 길이를 갖는다. 일 실시양태에서, 펩티드는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이며, 여기서 펩티드는 비펩티드 결합을 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 관한 것이며, 여기서 펩티드는, 특히, HLA-DR 항원-연관 불변 사슬(li)의 N-말단 아미노산을 포함하는, 융합 단백질의 일부이거나 또는 여기서 펩티드는, 예를 들어, 수지상 세포에 특이적인 항체와 같은, 항체에 (또는 항체 내로) 융합된다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체 또는 MHC 분자에 결합되는 경우 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하거나 이에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이다.

일 실시양태에서, MHC 분자는 HLA-A*02 동종이형 MHC 분자이다.

추가 실시양태에서, 이러한 항체는 가용성이거나 막결합성이다. 추가 실시양태에서, 이러한 항체는 단클론 항체 또는 이의 단편이다. 추가 실시양태에서, 이러한 항체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가 효과기 기능을 보유한다.

또한 본 발명은 T 세포 수용체 또는 이의 기능적 단편에 관한 것이며, 이는 MHC 리간드와 반응하거나 이에 결합하며, 여기서 상기 리간드는 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체 또는 MHC 분자에 결합되는 경우 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체이다.

일 실시양태에서, MHC 분자는 HLA-A*02 동종이형 MHC 분자이다.

추가 실시양태에서, 상기 T 세포 수용체는 가용성 분자로서 제공된다. 추가 실시양태에서, 상기 T 세포 수용체는 면역 자극 도메인 또는 독소와 같은 추가 효과기 기능을 보유한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편, 또는 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.

또한 본 발명은 DNA, cDNA, PNA, RNA 또는 이들의 조합인 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이다.

일 실시양태에서, 상기 핵산은 이종 프로모터 서열에 연결된다. 일 실시양태에서, 상기 핵산은 상기 핵산을 발현하고/하거나 포함하는 발현 벡터로서 제공된다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편 또는 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다.

또한 본 발명은 활성화된 T 림프구를 생성하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 항원 특이적 방식으로 T 세포를 활성화하기 위해 충분한 기간 동안 적합한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포를 모방하는 인공 구성체의 표면 상에 발현되는 항원 적재된 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자와 시험관내 T 세포를 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 항원은 각각의 설명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체이다.

일 실시양태에서, 항원 제시 세포는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102를 포함하는 상기 펩티드 또는 상기 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드를 생성하는 시험관내 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본 발명에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 및 펩티드를 상기 숙주 세포 또는 이의 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함한다.

또한 본 발명은 활성화된 T 림프구에 관한 것이며, 이는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성되며, 여기서 상기 T 림프구는 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 제시하는 세포를 선택적으로 인식한다. 상기 제시는 비정상적 제시 또는 비정상적 발현일 수 있다.

또한, 본 발명은

· 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체,

· 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편,

· 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편,

· 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터,

· 본 발명에 따른 숙주 세포

· 또는 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 약학적 조성물

및 약학적으로 허용 가능한 담체에 관한 것이다.

일 실시양태에서, 이러한 약학적 조성물은 개별 환자에 대한 맞춤화된 약학적 조성물이다. 일 실시양태에서, 약학적 조성물은 백신이다. 또한, 이러한 방법은 TCR 단리와 같은 다운스트림 애플리케이션 또는 가용성 항체 및 다른 치료 옵션을 위한 T 세포 클론을 생성하기 위해 조정될 수 있다.

"맞춤화된 의약품"은 능동적으로 맞춤화된 암 백신 및 자가유래 환자 조직을 사용하는 입양 세포 요법(adoptive cellular therapy)을 포함하여 개별 환자의 요법에서만 사용되는 한 명의 개별 환자를 위하여 구체적으로 맞춤화된 요법을 의미한다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편 또는 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 생성하고, 펩티드 또는 이의 변이체, 항체 또는 이의 단편 또는 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 상기 숙주 세포 및/또는 이의 배양 배지로부터 단리하기 위한 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 의학에서의 용도 또는 약물의 제조에서의 용도를 위한, 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자 내 표적 세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자에게 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구의 유효수를 투여하는 단계를 포함한다.

마찬가지로, 본 발명은 본 발명에 따른 임의의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 환자내 표적 세포를 사멸시키기 위한 용도 또는 상기 표적 세포를 사멸시키기 위한 약제의 제조에서의 용도를 위한 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구에 관한 것이다.

본 발명은 암을 진단받거나 암을 앓거나 또는 암이 생길 위험이 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 환자에게 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

마찬가지로, 본 발명은 또한 암을 진단받거나 암을 앓거나 또는 암이 발생할 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 용도 또는 상기 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서의 용도를 위한, 본 발명에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 본 발명에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 본 발명에 따른 숙주 세포 또는 본 발명에 따른 활성화된 T 림프구에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 용도에 관한 것이며 여기서 약제는 백신이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 용도를 위한 방법 또는 펩티드, 항체, T 세포 수용체, 핵산, 숙주 세포 또는 활성화된 T 림프구에 관한 것이며, 여기서 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.

또한, 본 발명은

(a) 용액으로 또는 동결건조 형태로 본 발명에 따른 약학적 조성물을 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 용기;

(b) 임의적으로, 동결건조 제형을 위한 희석제 또는 재구성 용액을 함유하는 제2 용기;

(c) 임의적으로, 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 펩티드;를 포함하는 키트에 관한 것이다.

추가 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 완충제, 희석제, 필터, 바늘 또는 주사기를 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩티드에 기반하는 특정 마커 단백질 및 바이오마커에 관한 것이며, 이는 본원에서 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암 중 적어도 하나의 진단 및/또는 예후에서 사용될 수 있는 "표적"으로 지칭된다.

용어 “항체” 또는 “항체들”은 본원에서 광범위한 의미로 사용되며 다클론 및 단클론 항체를 포함한다. 온전한 또는 "완전한" 면역글로불린 분자에 더해, "항체"라는 용어에는 본 발명에 따른 임의의 원하는 특성(예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암의 마커 폴리펩티드의 특이적 결합)을 나타내는 한 이러한 면역글로불린 분자의 단편(예를 들어, CDR, Fv, Fab 및 Fc 단편) 또는 중합체 및 면역글로불린 분자의 인간화 형태도 포함된다.

가능한 경우, 본 발명의 항체는 상업적 공급원으로부터 구입할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 잘 알려진 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 당업자는 전체 길이의 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암의 마커 폴리펩티드 또는 이들의 단편은 본 발명의 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 항체를 생성하는 데 사용되는 폴리펩티드는 자연 공급원으로부터 부분적으로 또는 완전히 정제될 수 있거나 재조합 DNA 기법을 사용하여 생성될 수 있다.

예를 들어, 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 펩티드와 같은 본 발명에 따른 펩티드, 폴리펩티드, 또는 이의 변이체 또는 이의 단편을 인코딩하는 cDNA는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아) 또는 진핵 세포(예를 들어, 효모, 곤충 또는 포유류 세포)에서 발현될 수 있으며, 그 후 재조합 단백질은 정제될 수 있으며 본 발명에 따른 항체를 생성하기 위해 사용되는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암의 마커 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단클론 또는 다클론 항체 제제를 생성하기 위해 사용될 수 있다.

당업자는 단클론 또는 다클론 항체의 2개 이상의 상이한 세트의 생성이 의도된 용도(예를 들어, ELISA, 면역조직화학, 생체내 영상화, 면역독성 요법)에 필요한 특이성 및 친화도를 갖는 항체를 수득할 가능성을 최대화한다는 것을 인식할 것이다. 항체는 항체가 사용되는 목적에 따라 알려진 방법으로 원하는 활성에 대해 시험된다(예를 들어, ELISA, 면역조직화학, 면역요법 등(Greenfield, 2014, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 예를 들어, 항체는 ELISA 검정 또는 웨스턴 블롯, 포르말린-고정 암 또는 동결 조직 절편의 면역조직화학적 염색에서 시험될 수 있다. 치료 또는 생체내 진단 용도를 위한 항체는 초기의 시험관내 특성화 이후 알려진 임상적 검사 방법에 따라 시험된다.

본원에서 사용되는 용어 "단클론 항체"는 실질적으로 균질인 항체 집단으로부터 수득되는 항체를 의미하며, 즉, 집단을 포함하는 개별 항체는 주요하지 않은 양으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이 이외에는 동일하다. 본원에서 단클론 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유래되거나 특정한 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체의 서열과 동일하거나 상동이고, 사슬(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되거나 다른 항체 부류 또는 하위부류에 속하는 항체와 동일하거나 상동인 "키메라"(chimeric) 항체 그리고 원하는 길항 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 특정적으로 포함한다(US 4,816,567, 이의 내용은 참조에 의해 전체가 본원에 원용됨).

본 발명의 단클론 항체는 하이브리도마 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물은 전형적으로 면역화제로 면역화되어 면역화제에 특이적으로 결합할 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유발한다. 대안적으로, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다.

또한, 단클론 항체는 US 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 단클론 항체를 인코딩하는 DNA는 용이하게 단리되고 종래의 절차를 사용하여(예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 염기서열 분석이 될 수 있다.

또한 시험관내 방법은 1가(monovalent) 항체를 제조하는 데 적합하다. 당업계에서 잘 알려진 일상적인 기법을 사용하여 항체를 분해하여 이의 단편, 특히, Fab 단편을 생성할 수 있다. 예를 들어, 분해는 파파인을 사용하여 수행될 수 있다. 파파인 분해의 예는 WO 94/29348 및 US 4,342,566에서 설명되어 있으며, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다. 항체의 파파인 분해는 전형적으로 각각 단일 항원 결합 부위 및 잔기 Fc 단편을 갖는 Fab 단편으로 지칭되는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생성한다. 펩신 처리를 하면 F(ab')2 단편 및 pFc' 단편이 생긴다.

또한, 항체 단편은, 다른 서열에 연결되는지 여부에 관계없이, 비변형 항체 또는 항체 단편과 비하여 단편의 활성이 유의하게 변경되거나 손상되지 않는 한, 삽입, 결실, 치환 또는 특정 영역이나 특정한 아미노산 잔기의 다른 선택된 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 이황화물 결합이 가능한 아미노산을 제거/첨가, 이의 생물적 수명의 증가, 분비 특징의 변경 등의 일부 추가적인 특성을 제공할 수 있다. 어떤 경우든, 항체 단편은 결합 활성, 결합 도메인에서의 결합 조절 등과 같은 생체활성 특성을 보유해야 한다. 항체의 기능적 또는 활성적 영역은 단백질의 특정 영역의 돌연변이 유발에 이어 발현 및 발현된 폴리펩티드의 실험에 의해 식별될 수 있다 이러한 방법은 당업자에게 용이하게 명백하며 항체 단편을 인코딩하는 핵산의 부위특이적 돌연변이 유발을 포함할 수 있다.

본 발명의 항체는 인간화된 항체 또는 인간 항체를 더 포함할 수 있다. 인간화된 형태의 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체는 비인간 면역글로불린 항체로부터 유래되는 최소한의 서열을 함유하는 키메라 면역글로불린항체, 면역글로불린 사슬 또는 이의 단편(예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab' 또는 다른 항원 결합 하위서열)이다. 인간화된 항체는 수용체의 상보성 결정 영역(CDR)으로부터 유래하는 잔기가 원하는 특이성, 친화력 및 수용력을 가진 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여체 항체)의 CDR로부터 유래하는 잔기로 대체되는 인간 면역글로불린(수용체 항체)을 포함한다. 일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임(FR) 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화된 항체는 수용체 항체 또는 유입된 CDR 또는 프레임 서열의 어디에서도 발견할 수 없는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 모든 적어도 하나 또는 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이며, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 면역글로불린의 CDR 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 면역글로불린 공통 서열의 FR 영역이다. 또한, 인간화된 항체는 최적으로, 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 보통 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이다.

비인간 항체를 인간화하는 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 비인간 공급원으로부터 도입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 비인간 아미노산 잔기는 흔히 "유입(import)" 잔기라고 지칭되며, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취득된다. 인간화는 본질적으로 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환하여 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체이며(US 4,816,567, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨), 여기서 온전한 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적게 비인간 종으로부터 유래한 상응하는 서열로 치환되었다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터 유래한 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.

면역화 시, 내인성 면역글로불린 생성의 부재하에서 전체 인간 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자이식 동물(예를 들어, 마우스)이 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 유전자의 동형접합 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 초래하는 것으로 설명되었다. 이러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열을 이전하면 항원 유발(antigen challenge) 시 인간 항체가 생성될 것이다. 인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리에서도 생성될 수 있다.

일 양태에서, 본 개시내용의 항체는 또한 파지 디스플레이, 또는 리보솜 디스플레이, 또는 효모 디스플레이, 또는 박테리아 디스플레이, 또는 바큘로바이러스 디스플레이, 또는 포유류 세포 디스플레이 또는 mRNA 디스플레이를 통해 수득될 수 있다. 이러한 방법은 모두 당업계의 종래의 기법이며, 이의 특정 작업은 상응하는 교재 또는 작동 매뉴얼에서 발견할 수 있다(Mondon et al., 2008, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 한 예로서 파지 디스플레이를 사용하여, 항원에 결합할 수 있는 항체 분자 상의 가변 영역이 파지의 캡시드 단백질에 커플링될 수 있도록 별개의 항체 유전자가 파지의 DNA에 삽입될 수 있다. 파지가 대장균을 감염시킨 후, 단일 가닥 DNA가 대장균에서 복제될 수 있고, 파지가 재조립되어 배양 배지로 분비될 수 있으며, 대장균은 용해되지 않을 수 있다. 파지는 표적 항원과 공동배양될 수 있으며, 결합된 파지를 단리한 후, 증폭 및 정제를 수행하여 많은 양의 클론을 스크리닝할 수 있다. 파지 디스플레이 기법은 문헌(Liu et al., 2004; 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)에서 발견할 수 있다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 파지 디스플레이 방법을 사용하여 단클론 항체를 생성하는 방법을 포함할 수 있다. 구체적으로, 동물을 면역화하기 위한 방법에 의해 면역화된 동물, 예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 기니피그, 햄스터, 염소, 말, 닭, 양 및 낙타류(예를 들어, 라마)로부터 mRNA가 제조될 수 있으며, 이때 mRNA를 주형으로 사용하여 cDNA가 제조될 수 있어, 항체 가변 영역만을 인코딩하는 단쇄 항체(scFv) 유전자가 제조될 수 있다. 유전자는 파지미드 벡터로 클로닝될 수 있다. 파지미드 벡터가 형질도입되는 대장균을 파지로 감염시켜 파지 캡시드에 scFV 항체를 발현시킨다. 항원 단백질에 대해 또는 펩티드-MHC 복합체에 대해 이러한 방식으로 발현된 scFv의 스크리닝은 항원 단백질 또는 펩티드-MHC 복합체에 특이적인 단클론 scFV 항체를 제조할 수 있다. 본원에서, mRNA의 제조, cDNA의 제조, 파지미드로의 서브클로닝 또는 대장균으로의 형질도입, 파지 감염, 항원 단백질 또는 펩티드-MHC 복합체에 특이적인 단클론 scFV 항체의 스크리닝은 각각 알려진 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 선도 서열(신호 서열) 및 파지 캡시드 단백질 III을 코딩하는 유전자 단편 및 M13의 복제 원점으로 구성되는 2개의 요소를 함유하는 파지미드 벡터에 scFV 유전자를 서브클로닝하고 M13 파지를 파지로 사용하면 M13 파지 상의 scFV 항체를 발현할 수 있다. 또한, 스크리닝에 의해 수득된 파지를 특정 박테리아에 감염시켜 배양하여, 항원 단백질에 특이적인 단클론 항체도 배지로부터 대량으로 채취할 수 있다. 본 개시내용의 단클론 항체를 생성하기 위한 방법에 따르면, scFV 항체뿐만 아니라 Fab 항체 단편과 같이 불변 영역을 갖지 않는 항체 단편도 제조될 수 있다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 거의 모든 가능한 특이성을 포함하도록 합성될 수 있는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 M13 이외의 파지를 함유하는 파지 디스플레이 라이브러리의 생성을 포함할 수 있다. 람다 파지와 같은 다른 박테리오파지 또한 본 개시내용의 방법에서 유용할 수 있다. 람다 파지 디스플레이 라이브러리가 생성되었으며, 이는 표면 상의 이종 DNA에 의해 인코딩되는 펩티드를 디스플레이한다(Sternberg et al., 1995; 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 또한, 본 개시내용의 방법은 진핵 바이러스와 같은, 박테리오파지 이외의 바이러스를 포함하도록 확장될 수 있다. 포유류에 전달하기 위해 적합한 유전자를 인코딩하고 유전자가 전달될 특정 세포 유형 또는 조직을 표적화할 수 있는 항체를 인코딩하고 디스플레이하는 진핵 바이러스가 생성될 수 있다. 예를 들어, 기능적 항체 단편을 디스플레이하는 레트로바이러스 벡터가 생성되었다(Russell et al., 1993; 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

다른 양태에서, 본 개시내용은 HLA 제한 항원(바람직하게는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102에 따른 아미노산 서열로 구성되거나 본질적으로 구성되는 펩티드)와 복합체를 형성하는 MHC 클래스 I 또는 II에 특이적으로 결합하는 재조합 항체를 생성하기 위한 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 MHC 클래스 I 또는 II를 발현하는 세포를 포함하는 유전자 조작된 비인간 포유류를 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 가용성 형태의 MHC 클래스 I 또는 II 분자로 면역화하는 단계; mRNA 분자를 상기 비인간 포유류 세포를 생성하는 항체로부터 단리하는 단계; 상기 mRNA 분자에 의해 인코딩되는 단백질 분자를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 단계; 및 적어도 하나의 파지를 상기 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 적어도 하나의 파지는 상기 HLA 제한 항원과 복합체를 형성하는 상기 MHC 클래스 I 또는 클래스 II에 특이적으로 결합하는 상기 항체를 디스플레이한다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 담체에 포함되어 대상체에게 투여된다. 전형적으로, 제형을 등장성으로 만들기 위해 적절량의 약학적으로 허용 가능한 염이 제형에 사용된다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함한다. 용액의 pH는 바람직하게는 약 5 내지 약 8, 더 바람직하게는 약 7 내지 약 7.5이다. 추가 담체는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스와 같은 지속 방출 제제를 포함하며, 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름, 리포좀 또는 마이크로입자의 형태이다. 예를 들어, 투여 경로 및 투여되는 항체의 농도에 따라 특정 담체가 더 바람직할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

항체는 대상체, 환자 또는 세포에 주사(예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 근육내)로, 또는 효과적인 형태로 혈류로의 전달을 보장하는 주입과 같은 다른 방법으로 투여될 수 있다. 또한, 항체는 국소 및 전신 요법 효과를 발휘하기 위해 종양내 또는 종양주위 경로로 투여될 수 있다. 국소 또는 정맥 투여가 바람직하다.

항체를 투여하기 위한 효과적인 투여량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정을 내리는 것은 당업계의 기술 범위 내에 있다. 당업자는 투여되어야 하는 항체의 용량은 예를 들어 항체를 받을 대상체, 투여 경로, 사용되는 항체의 특정 유형 및 투여되는 다른 약물에 따라 달라진다는 것을 이해할 것이다. 단독으로 사용되는 항체의 전형적인 일일 투여량은 상술한 요인에 따라 하루당 체중의 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 바람직하게는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암을 치료하기 위한 항체의 투여 후, 치료 항체의 효능은 당업자에게 잘 알려진 다양한 방식으로 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료를 받는 대상체에서 암의 크기, 수 및/또는 분포를 표준 종양 영상화 기법을 사용하여 모니터링할 수 있다. 항체 투여의 부재하에서 발생하는 질병 과정과 비교하여, 종양 성장을 정지시키고/시키거나 종양 수축을 초래하고/하거나 신규 종양의 발생을 방지하는 치료적으로 투여된 항체는 암 치료에 효과적인 항체이다.

본 발명의 추가적인 양태는 특정 펩티드-MHC 복합체를 인식하는 가용성 T 세포 수용체를 생성하는 방법을 제공하는 것이다. 이러한 가용성 T 세포 수용체는 특정 T 세포 클론으로부터 생성될 수 있으며, 이들의 친화도는 상보성 결정 영역을 표적화하는 돌연변이 유발에 의해 증가될 수 있다. T 세포 수용체 선택의 목적을 위해, 파지 디스플레이가 사용될 수 있다(US 2010/0113300, Liddy et al., 2012, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). 파지 디스플레이 동안 T 세포 수용체의 안정화를 위해 그리고 약물로서의 실용적인 사용의 경우, 알파 사슬 및 베타 사슬은 예를 들어, 비천연적 이황화 결합, 다른 공유 결합(단일 사슬 T 세포 수용체) 또는 이합체화 도메인에 의해 연결될 수 있다(Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨). T 세포 수용체는 표적 세포에 대한 특정 기능의 실행을 목적으로 독소, 약물, 사이토카인(예를 들어, US 2013/0115191 참조, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨) 및 항-CD3 도메인과 같은 효과기 세포를 모집하는 도메인 등과 연결될 수 있다. 또한, 이는 입양 전이(adoptive transfer)에 사용되는 T 세포에서 발견될 수 있다. 추가 정보는 WO 2004/033685A1 및 WO 2004/074322A1에서 발견할 수 있다. 가용성 TCR의 조합은 WO 2012/056407A1에서 설명되어 있다. 생성에 관한 추가 방법은 WO 2013/057586A1에서 개시되어 있으며, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

또한, 본 발명의 펩티드 및/또는 TCR 또는 항체 또는 다른 결합 분자는 생검 검체에 기반하는 병리학자의 암 진단을 확인하기 위해 사용될 수 있다.

항체 또는 TCR은 생체내 진단 검정에 사용될 수 있다. 일반적으로, 항체는 (¹¹¹In, ⁹⁹Tc, ¹⁴C, ¹³¹I, ³H, ³²P 또는 ³⁵S와 같은) 방사성뉴클레오티드를 사용하여 표지되어, 종양이 면역섬광조영술을 사용하여 국소화될 수 있다. 일 실시양태에서, 항체 또는 이의 단편은 상술한 단백질로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질의 2개 이상의 표적의 세포외 도메인에 결합하고 결합 친화도(K_d)는 100 nM 미만, 더 바람직하게는 50 nM 미만, 더 바람직하게는 10 nM 미만, 더 바람직하게는 1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.1 nM 미만, 더 바람직하게는 0.01 nM 미만이다.

진단 용도를 위한 항체는 다양한 영상 방법으로 검출하는 데 적합한 프로브로 표지될 수 있다. 프로브의 검출을 위한 방법은 형광, 광학, 공초점 및 전자 현미경; 자기 공명 영상법 및 분광법, 형광투시법, 전산화 단층촬영법 및 양전자 방사 단층촬영법을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 적합한 프로브는 플루오레세인, 로다민, 에오신 및 다른 형광체, 방사성 동위원소, 금, 가돌리늄 및 다른 란탄 계열 원소, 상자성(paramagnetic) 철, 불소-18 및 다른 양전자 방출 방사성핵종 등을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 또한, 프로브는 이중기능적이거나 다중기능적이며 기재된 방법 중 하나보다 많은 방법으로 검출 가능할 수 있다. 이러한 항체는 상기 프로브를 사용하여 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 항체에 대한 프로브의 부착은 프로브의 공유 부착, 프로브의 항체로의 혼입 및 프로브의 결합을 위한 킬레이트화 화합물의 공유 부착을 포함하며, 이는 특히 당업계에 잘 인식되어 있다. 면역조직화학을 위해, 질병 조직 검체는 신선하거나 동결되었을 수 있으며 파라핀에 포매된 후 포르말린과 같은 보존제로 고정되어 있을 수 있다. 검체를 함유하는 고정되거나 포매된 절편은 표지된 1차 항체 및 2차 항체와 접촉하며, 여기서 항체는 제자리(in situ) 단백질 발현의 검출을 위해 사용된다.

본 발명의 다른 양태는 활성화된 T 세포를 생성하는 시험관내 방법을 포함하며, 이 방법은 항원 특이적 방식으로 T 세포를 활성화하기 위해 충분한 기간 동안 적합한 항원 제시 세포의 표면 상에 발현되는 펩티드 탑재된 인간 MHC 분자와 시험관내 T 세포를 접촉하는 단계를 포함하며, 여기서 항원은 각 설명에 따른 펩티드이다. 바람직하게는 충분한 양의 항원이 항원 제시 세포와 함께 사용된다.

바람직하게는 포유류 세포는 TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있거나 이의 감소된 수준 또는 기능을 가지고 있다. TAP 펩티드 트랜스포터가 결핍되어 있는 적합한 세포는 T2, RMA-S 및 초파리 세포를 포함한다. TAP은 항원 처리에 연관되는 트랜스포터이다.

인간 펩티드 탑재 결핍 세포주 T2는 American Type Culture Collection,(12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, 미국)의 카탈로그 번호 CRL 1992로 이용 가능하고, 초파리 세포주 슈나이더(Schneider) 2는 ATCC의 카탈로그 번호 CRL 19863로 이용 가능하며, 마우스 RMA-S 세포주는 Ljunggren 등에서 설명되었다(Ljunggren and Karre, 1985, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

바람직하게는 형질주입 전, 숙주 세포는 실질적으로 MHC 클래스 I 분자를 발현하지 않는다. 또한, 자극기 세포가 B7.1, B7.2, ICAM-1 및 LFA3 중 임의의 것과 같은 T 세포를 위한 공동자극 신호의 제공에 중요한 분자를 발현하는 것이 바람직하다. 다수의 MHC 클래스 I 분자의 그리고 공동자극자 분자의 핵산 서열은 GenBank 및 EMBL 데이터베이스로부터 공개적으로 이용 가능하다.

MHC 클래스 I 에피토프가 항원으로 사용되는 경우, T 세포는 CD8 양성 T 세포이다.

항원 제시 세포가 이러한 에피토프를 발현하기 위해 형질주입되는 경우, 바람직하게는 세포는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102를 함유하는 상기 펩티드 또는 이의 변이체 아미노산 서열을 발현할 수 있는 발현 벡터를 포함한다.

다수의 다른 방법이 시험관내에서 T 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 자가유래 종양 침윤 림프구를 CTL의 생성에서 사용할 수 있다. Plebanski 등 (Plebanski et al., 1995)은 T 세포의 제조에서 자가유래 말초 혈액(PLB) 림프구를 사용하였다. 더욱이, 수지상 세포를 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스하여 또는 재조합 바이러스를 사용하는 감염을 통해 자가유래 조직 T 세포의 생성이 가능하다. 또한, B 세포는 자가유래 조직 T 세포의 생성에 사용될 수 있다 또한, 펩티드 또는 폴리펩티드로 펄스되거나 재조합 바이러스를 사용하여 감염된 대식 세포가 자가유래 조직 T 세포의 제조에 사용될 수 있다. S. Walter 등(Walter et al., 2003, 이의 내용은 이의 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)은 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하는 시험관내 T 세포의 프라이밍을 설명하며, 이는 또한 선택된 펩티드에 대해 T 세포를 생성하는 적합한 방법이다. 본 발명에서, aAPC는 수행된 MHC-펩티드 복합체를 폴리스티렌 입자(마이크로 비드)의 표면에 비오틴:스트렙트아비딘 생화학 방법으로 커플링하여 생성되었다. 이러한 체계는 aAPC의 정확한 MHC 밀도의 제어를 허용하며, 이는 혈액 검체로부터 유래하는 높은 효능을 갖는 고결합성 또는 저결합성의 항원 특이적 T 세포 반응을 선택적으로 유발할 수 있게 한다. MHC-펩티드 복합체와는 별도로, aAPC는 표면에 커플링된 항-CD28 항체와 같은 공동자극 활성을 갖는 다른 단백질을 운반해야 한다. 또한, 이러한 aAPC 기반 체계는 흔히 일반적으로 인터루킨-12와 같은 적절한 가용성 요소, 예를 들어, 사이토카인의 첨가를 필요로 한다.

동종이형 세포 또한 T 세포의 제조에서 사용될 수 있으며 방법은 WO 97/26328에서 더 상세하게 설명되며, 이는 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다. 예를 들어, 초파리(Drosophila) 세포 및 T2 세포에 더해, CHO 세포, 바큘로바이러스 감염 곤충 세포, 박테리아, 효모 및 백시니아 감염 표적 세포와 같은 다른 세포가 항원을 제시하기 위해 사용될 수 있다. 추가적으로 식물 바이러스를 사용할 수 있다. 예를 들어, 이물질 펩티드의 제시를 위한 고수율 체계로서 카우피 모자이크 바이러스의 개발에 대해 설명하는 Porta 등(Porta et al., 1994, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨)을 참조한다.

본 발명의 펩티드에 대해 배향되는 활성화된 T 세포는 요법에서 유용하다. 따라서 본 발명의 추가 양태는 본 발명의 위의 방법에 의해 수득 가능한 활성화 T 세포를 제공한다.

위의 방법으로 생성되는 활성화된 T 세포는 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 세포를 선택적으로 인식할 것이다.

바람직하게는, T 세포는 HLA/펩티드-복합체를 사용한 TCR을 통한 상호작용(예를 들어, 결합)으로 세포를 인식한다. T 세포는 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자 내 표적 세포를 사멸시키는 방법에서 유용하며, 여기서 환자에게 유효수의 활성화된 T 세포가 투여된다. 환자에게 투여된 T 세포는 위에서 설명되는 바와 같이 환자로부터 유래될 수 있고 활성화될 수 있다(즉, 이는 자가유래 조직 T 세포이다). 대안적으로, T 세포는 환자로부터 유래되지 않고 다른 개체로부터 유래된다. 물론, 이 개체가 건강한 개체인 것이 바람직하다. 발명자들이 지칭하는 "건강한 개체"는 개체가 일반적으로 건강이 양호하며, 바람직하게는 적절히 기능하는 면역계를 가지고 있으며, 더 바람직하게는 용이하게 시험될 수 있고 검출될 수 있는 임의의 질환을 앓고 있지 않다는 의미이다.

생체내에서, 본 발명에 따른 CD8 양성 T 세포에 대한 표적 세포는 종양의 세포(종종 MHC 클래스 II를 발현함) 및/또는 종양을 감싸고 있는 간질 세포(종종 MHC 클래스 II를 발현함)일 수 있다 (Dengjel et al., 2006).

본 발명의 T 세포는 치료적 조성물의 활성 성분으로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 비정상적으로 발현하는 환자 내 표적 세포를 사멸시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 위에 정의된 바와 같이 환자에게 유효수의 T 세포를 투여하는 단계를 포함한다.

발명자가 지칭하는 "비정상적(으로) 발현"은 폴리펩티드가 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 과발현되거나 유전자가 종양이 유래하는 조직에서는 잠복성(silent)이나 종양에서는 발현되는 것을 의미한다. 발명자가 지칭하는 "과발현"은 폴리펩티드가 정상 조직에서 제시되는 수준의 적어도 1.2배 이상, 바람직하게는 정상 조직에서 제시되는 수준의 적어도 2배 및 더 바람직하게는 적어도 5배 또는 10배로 존재하는 것을 의미한다

T 세포는 예를 들어, 위에서 설명되는 바와 같은 당업계에 알려진 방법으로 수득될 수 있다.

이러한 소위 T 세포의 입양 전이에 대한 프로토콜은 당업계에서 잘 알려져 있다. 여러 문헌 고찰을 찾아볼 수 있다(Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006, 이의 내용은 전체가 참조에 의해 본원에 원용됨).

본 발명의 다른 양태는 핵산이 클로닝되어 숙주 세포 바람직하게는 T 세포에 도입되는 T 세포 수용체를 생성하기 위해 MHC와 복합체를 형성하는 펩티드의 용도가 포함된다. 그 후, 이러한 조작된 T 세포는 암 치료를 위해 환자로 전이될 수 있다.

본 발명의 임의의 분자 즉, 펩티드, 핵산, 항체, 발현 벡터, 세포, 활성화된 T 세포, T 세포 수용체 또는 이를 인코딩하는 핵산은 면역 반응을 회피하는 세포를 특징으로 하는 장애의 치료에 대해 유용하다. 따라서, 본 발명의 임의의 분자는 약제로서 또는 약제의 제조에서 사용될 수 있다. 분자는 단독으로 또는 본 발명의 다른 분자(들)와 함께 또는 알려진 분자(들)와 함께 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 키트는 바람직하게는 적합한 용기에 있는 본 발명의 동결건조 제형 및 이의 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알(예를 들어, 듀얼 챔버 바이알), 주사기(예컨대, 듀얼 챔버 주사기) 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리나 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 바람직하게는 키트 및/또는 용기는 재구성 및/또는 사용에 대한 지침을 표시하는 용기에 대한 또는 이와 연관되는 지침을 포함한다. 예를 들어, 라벨은 동결건조된 제형을 위에서 설명된 바와 같은 펩티드 농도로 재구성해야 한다고 표시할 수 있다. 라벨은 제형이 피하 투여에 대해 유용하거나 이를 위해 의도되었다는 것을 더 나타낼 수 있다.

제형이 들어 있는 용기는 재구성된 제제의 반복 투여(예를 들어, 2회 내지 6회의 투여)를 가능하게 하는 다용도 바이알일 수 있다. 키트는 적합한 희석제(예를 들어, 탄산수소나트륨 용액)를 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다.

희석제와 동결건조된 제형을 혼합할 시, 재구성된 제제의 최종 펩티드 농도는 바람직하게는 적어도 0.15 mg/mL/펩티드(=75 μg)이며 바람직하게는 3 mg/mL/펩티드(=1500 μg)를 초과하지 않아야 한다. 키트는 다른 완충제, 희석제, 여과기, 바늘, 주사기 및 사용에 대한 지침을 갖는 패키지 삽입물을 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 다른 성분(예를 들어, 다른 화합물 또는 이러한 다른 화합물의 약학적 조성물)을 갖거나 갖지 않는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형을 포함하는 단일 용기를 가질 수 있거나 각각의 조성물에 대해 구별된 용기를 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 키트는 제2 화합물(보조제(예를 들어, GM-CSF), 화학요법제, 자연 생성물, 호르몬 또는 길항제, 항혈관신생제 또는 억제제, 세포자멸사유도제 또는 킬레이트제) 또는 이의 약학적 조성물의 공동투여와 조합하여 사용하도록 포장되는 본 발명의 제형을 포함한다 키트의 성분은 미리 복합되어 있거나 환자에게 투여되기 전 별개의 구별된 용기에서 있을 수 있다. 키트의 성분은 하나 이상의 액체 용액, 바람직하게는 수용액, 더 바람직하게는 멸균상태의 수용액으로 제공될 수 있다. 키트의 성분은 적합한 용매를 첨가하여 액체로 변환될 수 있는 고체로 제공될 수 있으며, 이는 바람직하게는 이는 다른 구별된 용기에서 제공된다.

치료 키트의 용기는 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 주사기 또는 고체 또는 액체를 담을 수 있는 다른 임의의 수단일 수 있다. 대개, 하나 이상의 성분이 있을 경우, 키트는 제2 바이알 또는 다른 용기를 함유할 것이며, 이는 별개의 투여를 가능하게 한다. 키트는 또한 약학적으로 허용 가능한 액체를 위한 다른 용기를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 치료 키트는 본 키트의 성분인 본 발명의 제제를 투여할 수 있는 기구(예를 들어, 하나 이상의 바늘, 주사기, 점안기, 피펫 등)를 포함할 것이다.

본 제형은 구강(경구), 비강, 안구, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 또는 경피와 같은 허용 가능한 임의의 경로에 의한 펩티드의 투여에 적합한 약제이다. 바람직하게는 투여는 피하(s.c.) 투여이며, 가장 바람직하게는 주입 펌프에 의한 피내(i.d.) 투여이다.

본 발명의 펩티드는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암으로부터 단리되었기 때문에, 본 발명의 약제는 바람직하게는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암을 치료하기 위해 사용된다.

예시적인 일 실시양태에서, 백신에서 포함되는 펩티드는 (a) 개별 환자로부터 유래한 종양 검체에 의해 제시되는 종양 연관 펩티드(TUMAP)를 식별하여; 및 (b) (a)에서 새로(de novo) 식별되는 적어도 하나의 펩티드를 선택하고 이의 면역원성을 확인하여 식별된다.

개인화된 펩티드 기반 백신을 위한 펩티드가 선택되면, 백신이 생성된다. 백신은 20% ~ 40% DMSO, 바람직하게는 약 33% DMSO와 같은 약 30% ~ 35% DMSO에 용해되는 개별 펩티드로 구성되는 액상 제형이다.

생성물에 포함될 각 펩티드는 DMSO에서 용해된다. 단일 펩티드 용액의 농도는 생성물에 포함될 펩티드의 수에 따라 선택되어야 한다. 단일 펩티드-DMSO 용액을 동등한 비율로 혼합하여 최대 2.5 mg/ml/펩티드의 농도를 갖는 생성물에 포함될 모든 펩티드를 함유하는 용액을 달성할 수 있다. 그런 다음, 혼합된 용액을 주입을 위해 물로 1:3의 비율로 희석하여 33% DMSO 내 0.826 mg/ml/펩티드의 농도가 달성된다. 희석된 용액이 0.22 μm 무균 필터를 통해 여과된다. 최종 벌크 용액이 수득된다.

최종 벌크 용액을 바이알에 충전하여 사용 시까지 -20

에서 보관한다. 1개의 바이알에는 각 펩티드를 0.578 mg씩 함유하는 700 μL의 용액이 들어 있다. 이 중, 500 μL(펩티드 당 약 400 μg)가 피내 투여에 사용된다.

암 치료용으로 유용한 것에 더해, 본 발명의 펩티드는 진단용으로도 유용하다. 본 발명의 펩티드는 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암으로부터 생성되었기 때문에 그리고 이러한 펩티드가 정상 조직에 존재하지 않거나 더 낮은 수준으로 존재하는 것으로 판단되었기 때문에, 이러한 펩티드는 암의 존재를 진단하기 위해 사용될 수 있다.

혈액 검체 내 조직 생검 상에 청구되는 펩티드의 존재는 병리학자의 암 진단을 보조할 수 있다. 항체, 질량분석법 또는 당업계에 공지된 다른 방법에 의한 특정한 펩티드의 검출은 병리학자에게 조직 검체가 악성이거나 염증이 있거나 일반적으로 병변이 있다는 것을 알려줄 수 있거나 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암에 대한 바이오마커로 사용될 수 있다. 펩티드 군의 존재는 병변 조직의 분류 또는 하위 분류를 가능하게 할 수 있다.

병변 조직 검체에서 펩티드가 검출되면 특히 T 림프구가 작용 기전에서 관련되는 것으로 알려져 있거나 예상되는 경우, 면역계와 관련 있는 요법의 이점에 대해 결정할 수 있다. MHC 발현의 손실은 감염된 또는 악성 세포가 면역 감시를 회피하는 과정에서 잘 설명되어 있는 기전이다. 따라서, 펩티드의 존재는 이러한 기전이 분석된 세포에 의해 이용되지 않음을 나타낸다.

본 발명의 펩티드는 펩티드 또는 MHC 분자와 복합체를 형성하는 펩티드에 대한 T 세포 반응 또는 항체 반응 같은 펩티드에 대한 림프구 반응을 분석하기 위해 사용될 수도 있다. 이러한 림프구 반응은 추가 요법 단계에서의 결정에 대한 예후 마커로 사용될 수 있다. 또한, 이러한 반응은 상이한 수단, 예를 들어, 단백질 백신접종, 핵산, 자가유래 물질, 림프구의 입양 전이 등으로 림프구 반응을 유도하는 것을 목표로 하는 면역요법의 접근법에서 대리 반응 마커로서 사용될 수 있다. 유전자 요법 환경에서, 펩티드에 대한 림프구 반응은 부작용의 평가에서 고려될 수 있다. 림프구 반응의 모니터링은 이식 요법의 추적 검사를 위한, 예를 들어, 이식 대 숙주 및 숙주 대 이식 질환의 검출을 위한, 중요한 도구가 될 수 있다.

이제 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 이의 바람직한 실시양태를 설명하는 아래의 실시예에서 설명되나, 그럼에도 불구하고 이에 국한되지는 않는다. 본 발명의 목적을 위해, 본원에 인용된 모든 참조 문헌은 전체가 참조에 의해 본원에 원용된다.

또한, 실험 데이터 및 수치는 청구된 바와 같은 펩티드의 선택된 세트에 대해서만 본원에 개시될 수 있다는 점에 유의해야 한다. 본원에 개시되고 청구된 모든 펩티드에 대해 완전한 데이터 세트가 생성되어 있고 요청 시 제공될 수 있으나, 출원인은 이러한 모든 완전한 데이터 세트를 본원에 원용하지 않기로 결정하였는데, 이는 이러한 데이터 세트가 본 출원 내용의 관리 가능한 범위를 벗어나기 때문이다.

도 1은 탈아미드화된 펩티드의 항원 처리 경로와 HLA 클래스 I에 의한 이들의 제시를 나타낸다. 번역 동안 글리코실화 모티프 N[X^P][ST]가 있는 단백질은 ER의 N 잔기에서 글리코실화(1)된다. 외수송 후, 세포질 아미다제 PNGase는 N-결합 올리고당을 제거하며, 이는 아스파르트산염(D)으로 탈아미드화(2)된다. 프로테아좀에서의 추가 분해(3) 및 펩티드의 ER로의 재수송(4) 후, 이들은 HLA I 복합체에 결합(5)한다. 그런 다음, 펩티드-HLA I 복합체는 고전적인 항원 제시 경로를 따라 세포막으로 전위하고 세포 표면에 탈아미드화된 펩티드를 제시(6)한다.

도 2는 아스파라긴(N)에서 아스파르트산(D)으로의 탈아미드화 반응을 나타낸다(도 2).

도 3A 내지 도 3D는 정상 조직과 비교하여 상이한 암 조직에서의 다양한 펩티드의 과제시를 나타낸다. 상부: 기술적 복제 측정치의 중간값 MS 신호 강도가 펩티드가 검출된 단일 HLA-A*02 양성 정상(회색 점, 도면의 우측) 및 종양 검체(검은색 점, 도면의 좌측)에 대한 점으로 표시된다. 상자는 정규화된 신호 강도의 중간값, 25번째 및 75번째 백분위수를 표시하며, 수염은 하위 사분위수의 1.5 사분위수 범위(IQR) 이내에 여전히 있는 가장 낮은 데이터 포인트와 상위 사분위수의 1.5 IQR 이내에 여전히 있는 가장 높은 데이터 포인트까지 연장된다. 하부: 모든 장기의 상대적인 펩티드 검출 빈도가 스파인 도표(spine plot)로 나타나 있다. 패널 아래의 숫자는 각 장기(정상 검체의 경우 N > 750, 종양 검체의 경우 N > 675)에 대해 분석된 전체 검체 수 중 펩티드가 검출된 검체 수를 나타낸다.

펩티드가 검체에서 검출되었으나 기술적 이유로 정량화할 수 없는 경우, 검체가 본 검출 빈도의 제시에는 포함되었으나 점을 도면의 상부에 나타내지는 않았다. 조직(좌에서 우로): 정상 검체: 지방 조직; 부신; 담관; 방광; 혈액 세포; 혈관; 골수; 뇌; 유방; 식도; 눈; 담낭; 두경부; 심장; 대장; 소장; 신장; 간; 폐; 림프절; 중추 신경; 말초 신경; 난소; 췌장; 부갑상선; 복막; 뇌하수체; 태반; 흉막; 전립선; 골격근; 피부; 척수; 비장; 위; 고환; 흉선; 갑상선; 기관; 요관; 자궁. 종양 검체: AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); GEJC(위식도접합부암); HCC(신세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨 림프종); NSCLCadeno(비소세포 폐암 선암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 검체); NSCLCsquam(편평 세포 비소세포 폐암); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암). 도 3A) 펩티드: ILDSTTIEI(서열 번호: 1), 도 3B) 펩티드: RLLEGDFSL(서열 번호: 2), 도 3C) 펩티드: YMDGTMSQV(서열 번호: 3), 도 3D) 펩티드: YVWDRTELL(서열 번호: 4).

도 4A 내지 도 4D는 상이한 암 검체에서 과발현되는 본 발명의 기원 유전자의 예시적인 발현 프로필을 나타낸다. 종양(검은 점) 및 정상(회색 점) 검체는 근원 장기에 따라 그룹화된다. 상자 및 수염 도표(Box-and-whisker)는 중간값 FPKM 값, 25번째 및 75번째 백분위수(상자) 및 하위 사분위수의 1.5 사분위수 범위(IQR) 이내에 여전히 있는 가장 낮은 데이터 포인트와 상위 사분위수의 1.5 IQR 이내에 있는 가장 높은 데이터 포인트까지 연장된 수염을 나타낸다. FPKM: 매핑된 리드 백만개 당 킬로베이스당 단편. 조직(좌에서 우로): 정상 검체: 지방 조직; 부신; 담관; 방광; 혈액 세포; 혈관; 골수; 뇌; 유방; 식도; 눈; 담낭; 두경부; 심장; 대장; 소장; 신장; 간; 폐; 림프절; 말초 신경; 난소; 췌장; 부갑상선; 복막; 뇌하수체; 태반; 흉막; 전립선; 골격근; 피부; 척수; 비장; 위; 고환; 흉선; 갑상선; 기관; 요관; 자궁 종양 검체: AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); GEJC(위식도접합부암); HCC(신세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨 림프종); NSCLCadeno(비소세포 폐암 선암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 검체); NSCLCsquam(편평 세포 비-소세포 폐암); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암). 도 4A) Ensembl ID: ENST00000263321p369, 펩티드: YMNGTMSQV(서열 번호:105); 도 4B) Ensembl ID: ENST00000244763p188, 펩티드: SQTNLSPAL(서열 번호: 161); 도 4C) Ensembl ID: ENST00000254508p924, 펩티드: FISNFTMTI(서열 번호: 163); 도 4D) Ensembl ID: ENST00000314191p3305, 펩티드: KMLNETVLV(서열 번호: 186).

도 5는 하나의 예시적인 펩티드 AIYHDITGISV(서열 번호: 48)에 대한 IdentControl 실험의 결과를 나타낸다. 펩티드는 데이터 의존적 획득(DDA) 모드에서 안정한 동위원소 표지된(SIL) 표준품의 단편화를 비교하는 IdentControl에 의해 확인되었다. 동일성은 자체 결정된 스펙트럼 상관 임계값을 사용하여 확인되었다.

도 6은 펩티드 YMDGTMSQV(서열 번호: 3)에 대한 CoElution 실험에 대한 하나의 예시적인 결과를 나타낸다. 펩티드는 안정한 동위원소 표지된(SIL) 내부 표준품 및 표적 MS(sPRM 또는 IS-PRM)를 사용하여 CoElution에 의해 확인되었다. SIL-펩티드 및 자연 펩티드에 대해 비중첩 MS2 단리 창이 사용된다. SIL 내부 표준품의 동위원소 순도를 확인하기 위해 비-HLA 펩티돔 검체(예를 들어, 트립신 분해 또는 5% FA)를 매트릭스로 사용하는 대조 실험을 수행하였다. 전문가의 수동 검토로 객관적이고 사전에 정의된 기준에 기반하여 펩티드 동일성이 확인된다.

도 7A 내지 도 7E는 건강한 HLA-A*02+ 공여체의 펩티드 특이적 시험관내 CD8+ T 세포 반응의 예시적인 결과를 나타낸다. CD8+ T 세포를 서열 번호: 3(A, 좌측 패널), 서열 번호: 72(B, 좌측 패널), 서열 번호: 91(V, 좌측 패널), 서열 번호: 92(D, 좌측 패널) 또는 서열 번호: 98(E, 좌측 패널)과 복합체를 형성하는 항-CD28 mAb 및 HLA-A*02로 코팅된 인공 APC를 사용하여 프라이밍하였다. 3주기의 자극 후, 펩티드-반응성 세포의 검출은 A*02/서열 번호: 3(A), A*02/서열 번호: 6(B), A*02/서열 번호: 7(C), A*02/서열 번호: 47(D) 또는 A*02/서열 번호: 96(E)을 사용한 2D 다합체 염색에 의해 수행되었다. 우측 패널(A, B, C, D 및 E)은 무관한 A*02/펩티드 복합체로 자극된 세포의 대조 염색을 나타낸다. 생존 단일 세포는 CD8+ 림프구에 대해 게이팅(gating)되었다. 부울(Boolean) 게이트는 상이한 펩티드에 특이적인 다합체를 사용하여 검출된 위양성 사건을 제외하는 데 도움이 되었다. CD8+ 림프구 중 특정 다합체+ 세포의 빈도가 표시된다.

실시예

실시예 1

세포 표면 상에 제시되는 종양 연관 펩티드의 식별 및 정량화

조직 검체

환자의 조직을

BioIVT(Detroit, MI, USA & Royston, Herts, 영국); Bio-Options Inc.(Brea, CA, 미국); BioServe(Beltsville, MD, 미국); Capital BioScience Inc.(Rockville, MD, 미국); Conversant Bio(Huntsville, AL, 미국); Cureline Inc.(Brisbane, CA, 미국); DxBiosamples(San Diego, CA, 미국); Geneticist Inc.(Glendale, CA, 미국); Indivumed GmbH(Hamburg, 독일); Kyoto Prefectural University of Medicine(KPUM)(Kyoto, 일본); Osaka City University(OCU)(Osaka, 일본); ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, 미국); Tissue Solutions Ltd(Glasgow, 영국); Universitaet Bonn(Bonn, 독일); Asklepios Clinic St. Georg(Hamburg, 독일); Val d'Hebron University Hospital(Barcelona, 스페인); Center for cancer immune therapy(CCIT), Herlev Hospital(Herlev, 덴마크); Leiden University Medical Center(LUMC)(Leiden, 네덜란드); Istituto Nazionale Tumori "Pascale", Molecular Biology and Viral Oncology Unit(Naples, 이탈리아); Stanford Cancer Center(Palo Alto, CA, 미국); University Hospital Geneva(Geneva, 스위스); University Hospital Heidelberg(Heidelberg, 독일); University Hospital Munich(Munich, 독일); University Hospital Tuebingen(Tuebingen, 독일)으로부터 수득하였다.

수술이나 부검 전 모든 환자가 사전 서면 동의를 하였다. 조직은 절제 후 즉시 충격동결한 다음 TUMAP의 단리까지 -70

이하에서 보관하였다.

HLA 펩티드의 조직검체로부터의 단리

충격동결된 조직 검체로부터 HLA펩티드 풀을 HLA-A*02-특이적 항체 BB7.2, HLA-A-특이적 항체, HLA-B-특이적 항체, HLA-C-특이적 항체 W6/32, HLA-DR 특이적 항체 L243 및 HLA DP 특이적 항체 B7/21, CNBr-활성화된 세파로스, 산 처리 및 한외여과를 사용하는 다소 변형된 프로토콜 (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999)에 따라 고체 조직으로부터 면역 침전으로 수득하였다.

본 발명에 따른 모든 펩티드는 HLA-A*02에 결합한다. 그러나, 결합 패턴, 예를 들어, 고정 위치의 유사성으로 인해, 펩티드는 HLA-B*08, HLA-B*13 및 HLA-B*15를 포함하나 이에 국한되지 않는 다른 HLA 대립유전자에도 결합할 수 있다.

또한, 용어 HLA-A*02는 HLA-A*02:01, HLA-A*02:02, HLA-A*02:03, HLA-A*02:04, HLA-A*02:05, HLA-A*02:06, HLA-A*02:07, HLA-A*02:08, HLA-A*02:09, HLA-A*02:10, HLA-A*02:11를 포함하나 이에 국한되지 않는 HLA-A*02의 모든 하위유형을 지칭한다.

질량 분광분석법 분석

수득된 HLA 펩티드 풀을 역상 크로마토그래피(nanoAcquity UPLC 시스템, Waters)로 소수성에 따라 분리하였으며, 용출되는 펩티드를 ESI 소스가 장착된 LTQ Velos 및 융합 하이브리드 질량분석기(ThermoElectron)로 분석하였다. 펩티드를 1.7 μm C18 역상 물질(Waters)로 충전된 분석 용융-실리카 미세-모세관 컬럼(75 μm i.d. x 250mm)에 직접 로딩하여 분당 400 nL의 유속을 적용하였다. 후속적으로, 펩티드를 분당 300 nL의 유속으로 10% 내지 33% B의 2단계 180분 2용매 구배를 사용하여 분리하였다. 구배는 용매 A(물에 포함된 0.1% 포름산) 및 용매 B(아세토니트릴에 포함된 0.1% 포름산)로 구성되었다. 금 코팅 유리 모세관(PicoTip, New Objective)사용하여 nanoESI 소스로 도입하였다. LTQ-Orbitrap 질량분석기는 TOP5 전략을 사용하여 데이터 종속 모드에서 작동되었다. 요약하자면, Orbitrap(R = 30000)에서 높은 질량 정확도의 전체 스캔으로 스캔 주기가 개시되었으며, 그에 이어 이전에 선택한 이온을 동적 배제하며 5개의 가장 풍부한 전구체 이온에 대한 Orbitrap(R = 7500)에서 MS/MS 스캔이 수행되었다. 텐덤 질량 스펙트럼은 고정된 오류 발견율(q≤0.05) 및 추가적인 수동 제어로 SEQUEST에 의해 해석되었다. 식별되는 펩티드 서열이 불확실한 경우, 이를 생성된 자연 펩티드 단편화 패턴을 합성 서열-동일 참조 펩티드의 단편화 패턴과 비교하여 추가적으로 검증하였다.

이온 계수화, 즉 LC-MS 특징의 추출 및 분석으로 무표지 상대적 LC-MS 정량화를 수행하였다 (Mueller et al., 2007). 이 방법은 펩티드의 LC-MS 신호 영역이 검체 내 존재비와 상관관계가 있음을 가정한다. 추출된 특징을 전하 상태 디컨볼루션 및 머무름 시간 정렬로 더 처리하였다 (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). 마지막으로, 모든 LC-MS 특징을 서열 식별 결과와 상호 참조하여 상이한 검체 및 조직의 정량적 데이터를 펩티드 제시 프로필에 조합하였다. 정량적 데이터를 기술적 및 생물학적 복제 내의 변이를 설명하는 중심 경향에 따라 2계층 방식으로 정규화하였다. 따라서, 각 식별된 펩티드는 검체와 조직 사이의 상대적 정량화를 허용하는 정량적 데이터와 연관될 수 있다. 또한 펩티드 후보에 대해 획득한 모든 정량적 데이터를 수동으로 검사하여 데이터 일관성을 보장하고 자동 분석의 정확성을 검증하였다. 각 펩티드 대해 복제 변이뿐만 아니라 평균 검체 제시를 나타내는 제시 프로필을 계산하였다. 프로필은 AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); GEJC(위식도접합부암); HCC(신세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨 림프종); NSCLCadeno(비소세포 폐암 선암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 검체); NSCLCsquam(편평 세포 비-소세포 폐암); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암) 검체를 정상 조직 검체의 기준선에 병치한다. 예시적인 과제시된 펩티드의 제시 프로필이 도 3A 내지 도 3D에 나타나 있다. 도표는 HLA-A*02 특이적 항체를 사용하여 처리되었던 HLA-A*02 양성 조직 검체에서 제조되었던 펩티드의 점으로 표시된 해당 식별만을 나타낸다.

모든 펩티드(서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102)에 대한 다양한 적응증에 대한 펩티드 제시가 표 8에 나타나 있다. 이러한 표는 검체의 HLA 유형 또는 상기 검체를 처리하는 데 사용되는 항체와 독립적으로 각각의 펩티드가 적어도 1회 식별된 모든 적응증을 기재한다.

표 8: 본 발명에 따른 펩티드 대한 다양한 암 개체에 대한 설명, 따라서, 표시된 암의 진단 및/또는 치료를 위해 언급된 펩티드의 특정 관련성. 암 유형: AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); GEJC(위식도접합부암); HCC(신세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨 림프종); NSCLCadeno(비-소세포 폐 암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 검체); NSCLCsquam(편평 세포 비소세포 폐암 선암종); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암).

실시예 2

본 발명의 펩티드를 인코딩하는 유전자의 발현 프로파일링

정상 세포와 비교하여 종양 세포에 대한 펩티드의 과다 제시 또는 특이적인 제시는 면역요법에서의 유용성에 충분하며, 일부 펩티드는 정상 조직에서도 발생하는 기원 단백질에도 불구하고 종양 특이적이다. 여전히, mRNA 발현 프로파일링은 면역요법을 위한 펩티드 표적 선택에서 추가적인 안전성 수준을 추가한다. 특히, 친화도 성숙 TCR과 같이 안전성 위험이 높은 치료 옵션의 경우, 이상적인 표적 펩티드는 종양에 고유하고 정상 조직에서는 발견되지 않는 단백질에서 유래될 것이다.

RNA 기원 및 제조

사전 서면 동의를 각 환자로부터 수술적으로 제거된 조직 검체를 수득한 후 위에 표시된 대로 제공하였다(실시예 1 참조). 종양 조직 표본을 수술 직후 급속냉동하였으며 추후 액체 질소 하에서 막자사발과 막자로 균질화하였다. TRI 시약(Ambion, Darmstadt, 독일)을 사용하여 이러한 검체로부터 총 RNA를 제조한 후 RNeasy(QIAGEN, Hilden, 독일)로 세척하였다. 두 방법 모두 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.

RNASeq 실험을 위한 건강한 인간 조직의 총 RNA를 Asterand(Detroit, MI, USA & Royston, Herts, 영국); Bio-Options Inc.(Brea, CA, 미국); Geneticist Inc.(Glendale, CA, 미국); ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, 미국); Tissue Solutions Ltd(Glasgow, 영국)로부터 수득하였다.

RNASeq 실험을 위한 종양 조직의 총 RNA를 Asterand(Detroit, MI, 미국 & Royston, Herts, 영국); BioCat GmbH(Heidelberg, 독일); BioServe(Beltsville, MD, 미국); Geneticist Inc.(Glendale, CA, 미국); Istituto Nazionale Tumori "Pascale"(Naples, 이탈리아); ProteoGenex Inc.(Culver City, CA, 미국); University Hospital Heidelberg(Heidelberg, 독일)로부터 수득하였다.

모든 RNA 검체의 품질과 수량을 RNA 6000 Pico LabChip Kit(Agilent)를 사용하여 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent, Waldbronn, 독일)에서 평가하였다.

RNAseq 실험

종양 및 정상 조직 RNA 검체의 유전자 발현 분석을 CeGaT(Tuebingen, 독일)에 의해 차세대 염기서열 분석(RNAseq)을 통해 수행하였다. 간단히 말하면, 염기서열 분석 라이브러리는 RNA 단편화, cDNA 전환 및 염기서열 분석 어댑터의 추가를 포함하는 공급자 프로토콜(Illumina Inc., San Diego, CA, 미국)에 따라 Illumina HiSeq v4 시약 키트를 사용하여 제조된다. 여러 검체에서 유래되는 라이브러리는 등몰(equimolar)로 혼합되고 제조업체의 지침에 따라 Illumina HiSeq 2500 염기서열 분석기에서 염기서열 분석되며, 이는 50 bp 단일 말단 판독을 생성한다. 처리된 판독은 STAR 소프트웨어를 사용하여 인간 게놈(GRCh38)에 매핑된다. 발현 데이터는 ensembl 서열 데이터베이스(Ensembl77)의 주석을 기반으로 RPKM(Reads Per Kilobase per Million 매핑된 판독, 소프트웨어 Cupplinks에 의해 생성됨)으로서 전사물 수준에서 및 엑손 수준(총 판독, Bedtools 소프트웨어로 생성됨)에서 제공된다. 엑손 판독은 RPKM 값을 수득하기 위해 엑손 길이 및 정렬 크기에 대해 정규화된다.

AML(급성 골수성 백혈병); BRCA(유방암); CCC(담관세포 암종); CLL(만성 림프구성 백혈병); CRC(결장직장암); GBC(담낭암); GBM(교모세포종); GC(위암); GEJC(위식도접합부암); HCC(신세포 암종); HNSCC(두경부 편평 세포 암종); MEL(흑색종); NHL(비호지킨 림프종); NSCLCadeno(비-소세포 폐 암종); NSCLCother(NSCLCadeno 또는 NSCLCsquam에 명확하게 할당할 수 없는 NSCLC 검체); NSCLCsquam(편평 세포 비소세포 폐암 선암종); OC(난소암); OSCAR(식도암); PACA(췌장암); PRCA(전립선암); RCC(신세포 암종); SCLC(소세포 폐암); UBC(방광 암종); UEC(자궁내막암)에서 고도로 과발현되거나 배타적으로 발현되는 본 발명의 기원 유전자의 예시적인 발현 프로필이 도 4A 내지 도4D에서 나타나 있다. 추가적인 예시적인 유전자에 대한 발현 점수는 표 9에 나타나 있다.

표 9: 발현 점수. 표에는 정상 조직 패널과 비교하여 종양에서 고도로 과발현되거나(++) 정상 조직 패널과 비교하여 종양에서 과발현되는(+) 유전자의 펩티드가 기재되어 있다. 이러한 점수에 대한 기준선은 다음의 관련 정상 조직의 측정으로부터 계산되었다: 지방 조직; 부신; 담관; 방광; 혈액 세포; 혈관; 골수; 뇌; 유방; 식도; 눈; 담낭; 두경부; 심장; 대장; 소장; 신장; 간; 폐; 림프절; 말초 신경; 난소; 췌장; 부갑상선; 복막; 뇌하수체; 태반; 흉막; 전립선; 골격근; 피부; 척수; 비장; 위; 고환; 흉선; 갑상선; 기관; 요관; 자궁. 동일한 조직 유형의 여러 검체에 대한 발현 데이터가 이용 가능한 경우, 모든 각각의 검체의 산술 평균을 계산에 사용하였다.

실시예 3

IdentControl 및 CoElution에 의한 펩티드 검증

본 발명에 따른 펩티드를 검증하기 위해, 모든 펩티드를 Fmoc-전략을 사용하는 표준 및 잘 확립된 고체상 펩티드 합성을 사용하여 합성하였다. 필요한 경우, 식별 가능한 질량 이동을 도입하고 내부 표준품으로 이러한 표지된 펩티드를 사용할 수 있도록 하기 위해 안정한 동위원소 표지된(SIL-) 아미노산을 사용하였다(예를 들어, 펩티드가 CoElution 실험에서 동일성 확인을 위해 선택되는 경우). 각각의 개별 펩티드의 동일성 및 순도를 질량분석법 및 분석용 RP-HPLC로 결정하였다. 펩티드는 50%의 미만의 순도로 백색 내지 회백색 동결건조물(트리플루오로아세테이트 염)로 수득되었다. 모든 TUMAP는 바람직하게는 트리플루오로아세테이트 염 또는 아세테이트 염으로서 투여되며, 다른 염 형태도 가능하다.

펩티드의 초기 검증은 스펙트럼 비교를 통해 IdentControl에 의해 달성되었다. 이를 위해, 자연 스펙트럼 획득에 대해 일치하는 단편화 모드 및 충돌 에너지를 사용하여 고해상도 기준 MS2 스펙트럼을 획득하여 펩티드 식별을 검증하는 데 합성 펩티드가 사용되었다. 10,000개 미만의 수동으로 검증된 스펙트럼을 포함하는 벤치마크 데이터세트를 기반으로 1% 미만 FDR에서 90% 민감도를 초래한다고 결정된 컷오프 점수와 스펙트럼 상관관계의 민감한 매트릭스를 사용하여 자동화된 스펙트럼 비교를 수행하였다. 모호한 식별은 CoElution 실험으로 검증을 더 거쳤다.

표 10: IdentControl 결과. 스펙트럼 상관관계는 합성 펩티드와 비교하여 내인성 검출 펩티드의 MS/MS 스펙트럼의 유사성을 나타내며, 값이 높을수록 스펙트럼이 더 유사하다. 0.75의 임계값이 충족되거나 스펙트럼이 수동 검토에 의해 동일하다고 간주되는 경우 펩티드가 검증된다.

추가 검증을 위해 SIL 내부 표준 펩티드를 사용하여 펩티드에 대해 CoElution 실험을 하였다. 이를 위해, 검체로부터의 HLA 펩티돔 추출물에 SIL 펩티드를 스파이킹하였으며 액체 크로마토그래피 - 표적 질량 분석법(LC-MS)을 수행하여 머무름 시간 차원에서 CoElution뿐만 아니라 스펙트럼 유사성을 기반으로 펩티드 동일성을 확인하였다. 스파이킹된 SIL-펩티드 양을, 필요한 경우, 펩티드 특이적 이온화 인자(교정선에서 결정됨)로 조정하였다. 공동단편화를 회피하기 위해 SIL-펩티드 및 자연 펩티드 종에 대한 비중첩 단리 창을 사용하여 사전에 정의된 표적 MS2 스캔 사건을 사용하여 LC-MS를 수행하였다. SIL-펩티드 및 자연 펩티드의 동위원소 순도 및 공동단편화 부재를 확인하기 위해, 비-HLA 펩티드 함유 트립신 매트릭스에서 대조 실험을 수행하였고, 여기서 임의의 표지되지 않은 신호 부재가 확인되어야 하였다. 표지되지 않은 펩티드 MS2 트레이스와 비교한 SIL 펩티드 도트 생성물(dotP), 다중 연속 스캔에서 가장 강도 높은 전이의 존재 및 정렬된 피크 정점을 포함하는 여러 사전 정의된 객관적 기준에 기반하여 수동 전문가 검토로 CoElutation에 의한 펩티드 검출 및 검증을 결정하였다. CoElution에 의해 검증된 펩티드 목록은 표 11에서 발견할 수 있다.

실시예 4

세포 표면 상에 제시되는 종양 연관 펩티드의 절대 정량화

항체 및/또는 TCR과 같은 결합제의 생성은 번거로운 과정이며, 이는 다수의 선택된 표적에 대해서만 수행될 수 있다. 종양 연관 및 특이적 펩티드의 경우, 선택 기준은 제시의 배타성 및 세포 표면에 제시된 펩티드의 밀도를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 실시예 1에서 설명되는 바와 같은 펩티드의 단리 및 상대 정량화에 더하여, 발명자들은 WO 2016/107740에서 설명되는 바와 같이 세포당 절대 펩티드 복제수를 분석하였다. 고형 종양 검체에 있는 세포당 TUMAP 복제수의 정량화는 단리된 TUMAP의 절대 정량화, TUMAP 단리 과정의 효율성 및 분석된 조직 검체의 세포 수를 필요로 한다.

나노 LC-MS/MS에 의한 펩티드 정량화

질량분석법에 의한 펩티드의 정확한 정량화를 위해, 검량선을 2개의 상이한 동위원소 표지된 펩티드 변이체(1개 또는 2개의 동위원소 표지된 아미노산이 TUMAP 합성 동안 포함됨)를 사용하여 각 개별 펩티드에 대하여 생성하였다. 이러한 동위원소 표지된 변이체는 질량만 종양 연관 펩티드와 다를 뿐 다른 물리화학적 특성에서 차이를 나타내지 않는다 (Anderson et al., 2012). 펩티드 검량선의 경우, 일련의 나노 LC-MS/MS 측정을 수행하여 적정된 동위원소 표지된 펩티드(단일 동위원소 표지된 펩티드) 대 일정한 동위원소 표지된 펩티드(이중 동위원소 표지된 펩티드)의 MS/MS 신호 비율을 결정하였다.

내부 표준품이라고도 하는 이중 동위원소 표지된 펩티드를 각각의 MS 검체로 더 스파이크하였으며 모든 MS 신호는 내부 표준품의 MS 신호로 정규화되어 MS 실험 간의 잠재적인 기술적 편차를 평준화하였다.

검량선을 적어도 세 가지 다른 매트릭스, 즉, 일상적인 MS 검체와 유사한 자연 검체의 HLA 펩티드 용출액에서 제조하였으며 각각의 제조를 이중 MS 실행에서 측정하였다. 평가를 위해, MS 신호를 내부 표준품의 신호로 정규화하였으며 검량선을 로지스틱 회귀 분석으로 계산하였다.

조직 검체의 종양 연관 펩티드를 정량화하기 위해, 각 검체가 내부 표준품을 사용하여 또한 스파이크되었으며, MS 신호를 내부 표준으로 정규화하였으며 펩티드 검량선을 사용하여 정량화하였다.

펩티드-MHC 단리의 효율성

단백질 정제 과정의 경우, 조직 검체로부터의 단백질의 단리는 관심 단백질의 특정 손실과 연관된다. TUMAP 단리의 효율성을 결정하기 위해, 절대 정량화를 위해 선택되는 모든 TUMAP에 대하여 펩티드-MHC 복합체를 생성하였다. 천연 펩티드-MHC 복합체로부터 스파이크된 것을 식별할 수 있게 하기 위해, TUMAP의 단일 동위원소 표지된 형태를 사용하였다. 즉, 하나의 동위원소 표지된 아미노산이 TUMAP 합성에 포함되었다. 이러한 복합체는 새로 제조된 조직 용해물에, 즉, TUMAP 분리 절차의 가능한 가장 이른 시점에 스파이크되었으며, 그 후, 이어지는 친화성 정제에서 자연 펩티드-MHC 복합체와 같이 포획되었다. 따라서, 단일 표지된 TUMAP의 회수율을 측정하면 개별 자연 TUMAP의 단리 효율성에 관한 결론을 내릴 수 있다.

단리의 효율성은 소량의 검체 세트에서 분석되었으며 이러한 조직 검체를 통해 비교 가능하였다. 대조적으로, 단리 효율성은 개별 펩티드 사이에서 상이하다. 이는 제한된 수의 조직 검체에서만 결정되지만 단리 효율성이 다른 조직 제조에 외삽될 수 있음을 시사한다. 그러나, 단리 효율성이 한 펩티드에서 다른 펩타이드로 외삽되지 않을 수 있으므로 각 TUMAP를 개별적으로 분석해야 한다.

고체 동결 조직의 세포 수 결정

절대 펩티드 정량화를 거친 조직 검체의 세포 수를 결정하기 위해, 본 발명자들은 DNA 함량 분석을 적용하였다. 이러한 방법은 상이한 기원의 광범위한 검체 및, 가장 중요하게는, 동결 검체에 적용 가능하다 (Alcoser et al., 2011; Forsey and Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). 펩티드 단리 프로토콜 동안, 조직 검체는 균질한 용해물로 처리되며, 이로부터 소량의 용해물 분취물이 채취된다. 분취물은 DNA가 단리되는 세 부분으로 나뉜다(QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, 독일). 각각의 DNA 단리의 총 DNA 함량은 형광 기반 DNA 정량 검정(Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, 독일)을 적어도 2회 반복하여 사용하여 정량화된다.

세포 수를 계산하기 위해, 정의된 세포 수의 범위를 갖는 여러 공여체로부터 단리된 건강한 혈액 세포의 분취물로부터 DNA 표준 곡선이 생성되었다. 각각의 DNA 단리의 총 DNA 함량으로부터 총 세포 함량을 계산하기 위해 표준 곡선을 사용하였다. 그 후, 펩티드 단리를 위해 사용되는 조직 검체의 평균 총 세포 수는 알려진 용해물 분취물 부피 및 총 용해물 부피를 고려하여 추정되었다.

세포당 펩티드 복제수

전술한 실험의 데이터를 사용하여, 본 발명자들은 총 펩티드 양을 검체의 총 세포 수로 나누고 이어서 단리 효율성으로 나누어 세포 당 TUMAP 복제 수를 계산하였다. 선택된 펩티드에 대한 복제 세포 수가 표12에 나타나 있다.

펩티드를 절대적으로 정량화하기 위한 방법의 보다 자세한 개시내용은 국제 특허 공개 제WO2016107740A1호 및 미국 특허 출원 제14/969,423호에 개시되어 있으며, 이들의 내용은 참조에 의해 본원에 원용된다.

표 12: 본 발명에 따른 펩티드의 절대 복제수. 표에는 종양 검체 내 절대 펩티드 정량화의 결과가 기재되어 있다. 세포당 복제수의 중앙값은 각각의 펩티드에 대해 표시된다. ≥25 = +; ≥50 = ++; ≥75 = +++, ≥100 = ++++. 평가가능한 고품질 MS 데이터가 이용가능한 검체의 수가 표시된다.

실시예 5

MHC 클래스 I 제시 펩티드에 대한 시험관내 면역원성

본 발명자들은 본 발명의 TUMAP의 면역원성에 관한 정보를 수득하기 위해, 펩티드/MHC 복합체 및 항-CD28 항체가 탑재된 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용한 CD8+ T세포 반복 자극을 기반으로 하는 시험관내 T세포 프라이밍 검정을 사용하여 조사를 수행하였다. 이러한 방식으로 본 발명자들은 본 발명의 IHLA-A*02 제한된 TUMAP에 대한 면역원성을 나타낼 수 있었고, 이는 이들 펩티드가 인간에 존재하는 CD8+ 전구체 T 세포에 대한 T 세포 에피토프임을 실증하였다(표 13).

CD8+ T 세포의 시험관내 프라이밍

펩티드-MHC 복합체(pMHC) 및 항-CD28 항체가 탑재된 인공 항원 제시 세포에 의한 시험관내 자극을 수행하기 위해, 본 발명자들은 우선, 사전 동의 후, University clinics Mannheim, Germany로부터 수득한 건강한 공여체의 CD8 마이크로비드(Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, 독일)를 사용한 양성 선택을 통해 신선한 HLA-A*02 백혈구성분채집술 생성물로부터 CD8+ T 세포를 단리하였다.

PBMC 및 단리된 CD8+ 림프구를 사용 전까지 10% 열 불활성화 인간 AB 혈청(PAN-Biotech, Aidenbach, 독일), 100 U/ml 페니실린/100 μg/ml 스트렙토마이신(Cambrex, Cologne, 독일), 1 mM 피루브산 나트륨(CC Pro, Oberdorla, 독일), 20 μg/ml 겐타마이신(Cambrex)으로 보충된 RPMI-글루타맥스(Invitrogen, Karlsruhe, 독일)로 구성된 T세포 배지(TCM)에서 배양하였다. 또한, 이 단계에서 2.5 ng/ml IL-7(PromoCell, Heidelberg, 독일) 및 10 U/ml IL-2(Novartis Pharma, Nuernberg, 독일)가 TCM에 첨가되었다.

pMHC/항-CD28 코팅된 비드, T 세포 자극 및 판독의 생성을 자극 조건에 따라 4개의 상이한 pMHC 분자 및 판독 조건에 따라 8개의 상이한 pMHC 분자를 사용하여 고도로 정의된 시험관내 시스템에서 수행하였다.

정제된 동시자극 마우스 IgG2a 항 인간 CD28 Ab 9.3(Jung et al., 1987)은 제조업체(Perbio, Bonn, 독일)에서 권장하는 대로 술포-N-히드록시숙신이미도비오틴을 사용하여 화학적으로 비오티닐화되었다. 사용된 비드는 5.6 μm 직경의 스트렙트아비딘 코팅된 폴리스티렌 입자(Bangs Laboratories, Illinois, 미국)였다.

양성 및 음성 대조물질 자극에 사용된 pMHC는 각각 A*02:01/MLA-001(변형된 Melan-A/MART-1로부터 유래한 펩티드 ELAGIGILTV(서열 번호: 205)) 및 A*02:01/DDX5-001(DDX5로부터 유래한 YLLPAIVHI, 서열 번호: 206)이었다.

4 x 12.5 ng의 상이한 비오틴-pMHC의 존재하에 96-웰 플레이트에서 800.000 비드/200 μl를 코팅하고, 세척하였으며, 그 이후 600 ng 비오틴 항-CD28을 200 μl 부피에 첨가하였다. 37°C에서 3일 동안 5 ng/ml IL-12(PromoCell)가 보충된 200 μl TCM에서 2x10⁵ 세척된 코팅된 비드와 1x10⁶ CD8+ T 세포를 공동 배양하여 96-웰 플레이트에서 자극을 개시하였다. 그 후, 배지의 절반을 80 U/ml IL-2가 보충된 신선한 TCM으로 교환하였고 배양을 37°C에서 4일 동안 계속하였다. 이러한 자극 주기는 총 3회 수행되었다. 조건에 따라 8개의 상이한 pMHC 분자를 사용하는 pMHC 다합체 판독을 위해, 2차원 조합 코딩 접근법이 이전에 설명된 바와 같이(Andersen et al., 2012) 사용되었으며 5개의 상이한 형광색소에 대한 커플링을 포함하도록 약간 변경되었다. 마지막으로, 살아있는/죽은 근적외선 염료(Invitrogen, Karlsruhe, 독일), CD8-FITC 항체 클론 SK1(BD, Heidelberg, 독일) 및 형광 pMHC 다합체로 세포를 염색하여 다합체 분석을 수행하였다. 분석에는 적절한 레이저 및 여과기가 장착된 BD LSRII SORP 세포측정기를 사용하였다. 펩티드 특이적 세포는 총 CD8+ 세포의 백분율로 계산되었다. 다합체 분석의 평가를 FlowJo 소프트웨어(Tree Star, Oregon, USA)를 사용하여 수행하였다. 특정 다합체+ CD8+ 림프구의 시험관내 프라이밍을 음성 대조물질 자극과 비교하여 검출하였다. 주어진 항원에 대한 면역원성은 1명의 건강한 공여체의 적어도 하나의 평가 가능한 시험관내 자극된 웰이 시험관내 자극 후 특정 CD8+ T 세포주를 함유한다고 밝혀진 경우 검출되었다(즉, 이 웰은 CD8+ T 세포 중 특정 다합체+를 1% 이상 함유하였고 특정 다합체+ 세포의 백분율은 음성 대조물질 자극 중간값의 적어도 10배였다).

암 펩티드에 대한 시험관내 면역원성

시험된 HLA 클래스 I 펩티드의 경우, 시험관내 면역원성은 펩티드 특이적 T 세포주의 생성에 의해 실증될 수 있었다. 본 발명의 5개의 펩티드에 대한 TUMAP-특이적 다합체 염색 후의 예시적인 유세포분석 결과가 상응하는 음성 대조물질과 함께 도 7에 나타나 있다. 본 발명의 12개 펩티드에 대한 결과는 표 13에 요약되어 있다.

표 13: 본 발명의 HLA 클래스 I 펩티드의 시험관내 면역원성

본 발명의 HLA-A*02 제한 펩티드에 대한 청구인에 의해 수행된 시험관내 면역원성 실험의 예시적인 결과. 시험관내 면역원성 실험 결과가 표시되어 있다. 양성 웰 및 공여체(평가 가능)의 백분율은 표시된 바와 같이 요약된다. <20% = +; 20% - 49% = ++; 50% - 69%= +++; >= 70% = ++++

실시예 6

MHC 결합 검정

본 발명에 따른 T 세포 기반 요법을 위한 후보 펩티드를 그들의 MHC 결합 능력(친화도)에 대해 더 시험하였다. 개별 펩티드-MHC 복합체를 UV-리간드 교환으로 생성하였으며, 여기서 UV-민감성 펩티드를 UV-조사 시 절단하며 분석된 바와 같은 관심 펩티드와 교환한다. 펩티드-수용성 MHC 분자에 효과적으로 결합할 수 있고 이를 안정화시킬 수 있는 펩티드 후보만이 MHC 복합체의 해리를 방지한다. 교환 반응의 수율을 결정하기 위해, 안정화된 MHC 복합체의 경쇄(

2m) 검출에 기반하여 ELISA를 수행하였다. 검정은 일반적으로 Rodenko 등에서 설명된 바와 같이 수행하였다(Rodenko et al., 2006).

96웰 MAXISorp 플레이트(NUNC)를 실온에서 PBS 내 2 μg/ml 스트렙트아비딘으로 하룻밤 동안 코팅하였고, 4회 세척하였으며, 차단 완충액을 함유하는 2% BSA에서 37°C에서 1시간 동안 차단하였다. 리폴딩된 HLA-A*02:01/MLA-001 단량체는 15 내지 500 ng/ml 범위를 다루는 표준품으로서의 역할을 하였다. UV-교환 반응의 펩티드-MHC 단량체를 차단 완충액에서 100배 희석하였다. 검체를 37°C에서 1시간 동안 배양하였고, 4회 세척하였으며, 37°C에서 1시간 동안 2 μg/ml HRP 접합된 항-

2m과 함께 배양하였고, 다시 세척하였으며, NH₂SO₄로 중단된 TMB 용액으로 검출하였다. 450 nm에서 흡광도가 측정되었다. 높은 교환 수율(바람직하게는 50% 보다 높음, 가장 바람직하게는 75%보다 높음)을 나타내는 후보 펩티드가 항체 또는 이의 단편, 및/또는 T 세포 수용체 또는 이의 단편의 생성 및 생산에 일반적으로 바람직한데, 이들이 MHC 분자에 대한 충분한 결합성을 나타내고 MHC 복합체의 해리를 방지하기 때문이다.

본 발명의 102개 펩티드에 대한 MHC-펩티드 결합 결과는 표 14에 요약되어 있다.

표 14: MHC 클래스 I 결합 점수. HLA-A*02:01에 대한 HLA 클래스 I 제한 펩티드의 결합은 다음의 펩티드 교환 수율에 따라 범위가 결정되었다:

10% +; ≥20% = ++; ≥50% = +++; ≥75% = ++++

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Leu Ala Gly Leu Val Tyr Asn Ala 1 5 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide displayed by HLA-A*02 <400> 182 Ala Leu Asn Ser Ser Leu Gln Leu Leu 1 5 <210> 183 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide displayed by HLA-A*02 <400> 183 Ala Val Asn Lys Thr Gln Thr Ser Val 1 5 <210> 184 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide displayed by HLA-A*02 <400> 184 Phe Leu Asn Pro Asn Gly Ser Asp Cys Thr Leu 1 5 10 <210> 185 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide displayed by HLA-A*02 <400> 185 Phe Leu Asn Val Asn Val Ser Glu Val 1 5 <210> 186 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide displayed by HLA-A*02 <400> 186 Lys Met Leu Asn Glu Thr Val Leu Val 1 5 <210> 187 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide displayed by HLA-A*02 <400> 187 Leu Leu Asn Ile Thr Asn Pro Val Leu 1 5 <210> 188 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide 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Claims

서열 번호:
· 1 내지 서열 번호: 102
· 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 및 이의 변이체 서열로서 MHC 분자(들)에 결합하고/하거나 상기 변이체 펩티드와 교차반응하는 T 세포를 유도하는 능력을 유지하는 변이체 서열,
또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항에 있어서,
· 상기 펩티드는 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 능력을 갖고/갖거나
· 상기 펩티드는, 상기 MHC에 결합되는 경우, CD4 및/또는 CD8 T 세포에 의해 인식될 수 있는, 펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드 또는 이의 변이체는 8개 내지 30개 아미노산의 전체 길이를 갖는, 펩티드 또는 이의 변이체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 비펩티드 결합을 포함하는, 펩티드 또는 이의 변이체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩티드는 융합 단백질의 일부인, 펩티드 또는 이의 변이체.
항체 또는 이의 기능적 단편으로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하거나, 또는 MHC 분자에 결합되는 경우 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는, 항체 또는 이의 기능적 단편.
MHC 리간드와 반응성이거나 또는 이에 결합하는 T 세포 수용체 또는 이의 기능적 단편으로서, 상기 리간드는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체이거나 또는 MHC 분자에 결합되는 경우 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체인, T 세포 수용체 또는 이의 기능적 단편.
핵산으로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 인코딩하는, 핵산.
재조합 숙주 세포로서, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편 또는 제8항에 따른 핵산 또는 발현 벡터를 포함하는, 재조합 숙주 세포.
활성화된 T 림프구를 생성하기 위한 시험관내(in vitro) 방법으로서, 상기 방법은 적합한 항원 제시 세포 또는 항원 제시 세포를 모방하는 인공적인 구성체의 표면 상에서 발현되는 항원 탑재 인간 클래스 I 또는 II MHC 분자를 상기 T 세포를 활성화하는 데 충분한 기간 동안 시험관내 T 세포와 항원 특이적 방식으로 접촉하게 하는 단계를 포함하며, 상기 항원은 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체인, 방법.
활성화된 T 림프구로서, 제11항에 따른 방법으로 생성되며, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체를 제시하는 세포를 선택적으로 인식하는, 활성화된 T 림프구.
약학적 조성물로서,
· 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체,
· 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편,
· 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편,
· 제8항에 따른 핵산 또는 발현 벡터,
· 제9항에 따른 숙주 세포,
· 또는 제10항에 따른 활성화된 T 림프구로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 활성 성분
및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편, 또는 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 생성하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제9항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계 그리고 펩티드 또는 이의 변이체, 항체 또는 이의 단편 또는 T 세포 수용체 또는 이의 단편을 상기 숙주 세포 및/또는 이의 배양 배지로부터 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제8항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포 또는 제11항에 따른 활성화된 T 림프구의 의학에서의 용도 또는 약물의 제조에서의 용도.
환자 내 표적 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 표적 세포는 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하며, 상기 방법은 환자에게 제11항에 따른 활성화된 T 림프구의 유효수를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제11항에 따른 활성화된 T 림프구의,
a) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 제시하는 환자 내 표적 세포를 사멸시키기 위한 용도 또는
b) 상기 표적 세포를 사멸시키기 위한 약제의 제조에서의 용도.
암을 진단받거나 암을 앓거나 또는 암이 발생할 위험이 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 환자에게 유효량의 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제8항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포 또는 제11항에 따른 활성화된 T 림프구를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
암을 진단받거나 암을 앓거나 또는 암이 발생할 위험이 있는 환자를 치료하기 위한 용도 또는 상기 환자의 치료를 위한 약제의 제조에서의 용도를 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 이의 변이체, 제6항에 따른 항체 또는 이의 단편, 제7항에 따른 T 세포 수용체 또는 이의 단편, 제8항에 따른 핵산 또는 발현 벡터, 제9항에 따른 숙주 세포 또는 제11항에 따른 활성화된 T 림프구.
제17항에 따른 방법 또는 제18항에 따른 용도를 위한 펩티드, 항체, T 세포 수용체, 핵산, 숙주 세포 또는 활성화된 T 림프구에 있어서, 상기 암은 급성 골수성 백혈병, 유방암, 담관세포 암종, 만성 림프구성 백혈병, 결장직장암, 담낭암, 교모세포종, 위암, 위식도접합부암, 간세포 암종, 두경부 편평 세포 암종, 흑색종, 비호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 난소암, 식도암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암, 방광 암종 및 자궁내막암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법 또는 펩티드, 항체, T 세포 수용체, 핵산, 숙주 세포 또는 활성화된 T 림프구.
키트로서,
(a) 용액으로 또는 동결건조 형태로 제12항에 따른 약학적 조성물을 함유하는 약학적 조성물을 포함하는 용기;
(b) 임의적으로, 동결건조 제형을 위한 희석제 또는 재구성 용액을 포함하는 제2 용기;
(c) 임의적으로, 서열 번호: 1 내지 서열 번호: 102로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나 이상의 펩티드를 포함하는, 키트.
제20항에 있어서, 하나 이상의 완충제, 희석제, 여과기, 바늘 또는 주사기를 더 포함하는, 키트.