BRPI1009215B1 - composição farmacêutica compreendendo uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) e uso de um polipeptídeo derivado de tat para tratar câncer - Google Patents

Abstract

composição farmacêutica compreendemdo uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) e uso de um polipeptídeo derivado de tat para tratar câncer são divulgados aqui métodos de tratamento de câncer administrando um polipeptídeo trans-ativador de transcrição (tat) do vírus da imunodeficiência humana (hiv) modificado com propriedades imunoestimuladoras aumentadas em relação ao polipeptídeo tat não modificado.

Description

“COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDEMDO UMA SEQUÊNCIA DE AMINOÁCIDOS MODIFICADA DA PROTEÍNA TRANS-ATIVADORA DE TRANSCRIÇÃO (Tat) DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA (HIV) E USO DE UM POLIPEPTÍDEO DERIVADO DE Tat PARA TRATAR CÂNCER”

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados [001 ]O presente pedido reivindica o benefício sob 35 USC § 119 (e) ao Pedido de Patente norte-americano números 61/162,605 depositado em 23 de março de 2009, 61/306,278 depositado em 19 de fevereiro de 2010 e 61/310,221 depositado em 03 de marco de 2010. Todo o conteúdo de cada um desses pedidos é incorporado por referência neste documento.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere ao campo de agentes imunoterapêuticos para o câncer.

FUNDAMENTOS [002]O trans-ativador de transcrição (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é um peptídeo de ligação de RNA variável de 86 a 110 aminoácidos de comprimento, que é codificado em dois éxons separados do genoma do HIV. Tat é altamente conservado entre todos os lentivírus humanos e é essencial para a replicação viral. Quando lentivírus Tat liga-se ao TAR (trans-ativação responsiva), região RNA, níveis de transcrição (conversão do RNA viral em DNA, em seguida, para RNA mensageiro), aumentam significativamente. Tem sido demonstrado que Tat aumenta transcrição do RNA viral e tem sido proposto que o Tat pode iniciar a apoptose (morte celular programada) das células T4 e macrófagos (uma parte fundamental do sistema do corpo de vigilância imunológica para a infecção pelo HIV) e, possivelmente, estimula a sobreprodução de alfa interferon (α-interferon é uma citocina imunossupressiva bem estabelecida).

[003]A presença extracelular de Tat no início do curso da infecção pelo HIV

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 13/64

2/36 pode reduzir a resposta imune de um paciente, dando ao vírus uma vantagem sobre o hospedeiro. Além disso, a destruição direta de células T4 e indução de produção de α-interferon poderíam ajudar a explicar a falta de uma resposta celular imunológica robusta vista em pacientes com Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA), bem como contagem de imunossupressão inicial profunda.

[004]No entanto, a proteína Tat isolada de não-progressores infectados pelo HIV a longo prazo (LTNP) é diferente de C-Tat encontrada em patentes com SIDA. A proteína Tat encontrada em LTNP é capaz de trans-ativação de RNA viral, no entanto, Tat LTNP (Doravante designado como IS-Tat para Tat imunoestimulante) não induz a apoptose em células T4 ou macrófagos e não é imunossupressora. Além disso, as células T4 infectadas ex vivo com o HIV isolado a partir de LTNP (tais linhagens celulares são designadas TcL Tat) podem resultar na sobre-expressão de proteínas IS-Tat, muitas vezes com a exclusão virtual de outras proteínas virais, que são fortemente promotoras do crescimento, em vez de pró-apoptóticas. Os genes Tat clonados a partir desses TcLs Tat revelam variações na sequência em duas regiões Tat, no terminal amino e dentro da primeira parte do segundo éxon. Estas descobertas surpreendentes podem ajudar a explicar por que a células T4 LTNP infectadas por HIV não morrem a uma taxa surpreendente vista em indivíduos infectados pelo HIV que progrediram para a SIDA.

[005]Além disso, as variantes de Tat que são encontradas em lentivírus que infectam espécies de macacos ainda não resultam no desenvolvimento de imunodeficiência e infecção epidêmica. Estas proteínas variantes Tat direcionam diferenciação de monócitos em células dendríticas (DCs) que estimulam respostas de linfócitos T citotóxicos (CTL). Essas variantes Tat símias, e outras variantes Tat que não são imunossupressoras, foram denominadas Tat atenuada ou imunoestimulante (IS-Tat).

[006]Com base em observações linhagens de células T CD4+ Tat de longo

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 14/64

3/36 prazo, observações clínicas e experimentos em animais, Tat atenuada (mais especificamente IS-Tat ou, alternativamente, proteínas Tat que tenham sido química ou fisicamente alteradas) podem atuar como um imuno estimulante ativando de células T4 que induz sua proliferação. Este princípio pode ajudar a explicar os níveis de T4 estáveis vistos em LTNP. Além disso, Tat atenuada pode ser útil como adjuvante quando co-administradas com outros componentes da vacina ativos, tais como, mas não limitados a, vacinas para outros vírus, bactérias, rickettsia e células cancerosas.

[007]Cânceres e infecções crônicas são os exemplos mais proeminentes de doenças humanas comuns que respondem a imunotratamentos. Embora as infecções foram as primeiras doenças a serem controladas pela imunização, os ensaios clínicos em seres humanos estabeleceram que uma resposta imune, especialmente do braço CTL do sistema imunológico, pode regredir alguns melanomas e cânceres humanos renais. Estas observações foram ampliadas pela descoberta de que DCs, uma classe específica de células que apresentam antígenos (APC), é particularmente eficaz em iniciar a atividade CTL contra o câncer e outras doenças. Tecnologias que visam e ativam DC renderam alguns sucessos iniciais contra pré-malignidades cervicais humanas, causadas pela infecção pelo Vírus do Papiloma Humano (HPV) e o câncer de pulmão humano. Em contraste com fármacos quimioterápicos usados atualmente contra o câncer, os agentes que provocam uma resposta CTL contra o câncer potencialmente são acompanhados por poucos efeitos colaterais, devido à grande especificidade da resposta imune.

[008]Os esforços para desenvolver fármacos imunoterápicos que tratam o câncer têm sido prejudicados por dificuldades técnicas de segmentação e ativação de DC para entregar e sustentar os sinais de entrada necessários para o CTL. Antígenos alvo para a indução de uma resposta CTL é um desafio na medida em que o processamento natural exige que o antígeno entre no citoplasma da célula, a

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 15/64

4/36 fim de se ligar a antígeno classe I do complexo de histocompatibilidade do sistema imunológico principal (MHC), um pré-requisito para a ativação de CTL porque o ligante para ativar o receptor de células T no CTL é um complexo de antígeno e MHC classe I. Em quase todos os casos, os antígenos de proteína, mesmo quando eles são acoplados com um DC co-ativador, entram exclusivamente no percurso de apresentação do antígeno de classe II de MHC alternativo que exclui a estimulação CTL. Isso pode ser superado, em parte, por tecnologias baseadas em peptídeo, porque peptídeos se ligam a classe I de MHC, que já está na superfície do DC. No entanto, esta tecnologia é não-específica e mais peptídeos são ativadores de DC pobres, que limitam a sua eficácia como tratamentos para o câncer humano.

[009]Um grupo limitado de proteínas biológicas é conhecido por estimular uma resposta CTL. Variantes e derivados do trans-ativador de transcrição (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana 1 (HIV-1) podem estimular essa resposta CTL. Biologias adicionais que são atualmente conhecidas diretamente desencadeando uma resposta CTL são baseadas em proteínas de choque térmico (HSP), ou na proteína de revestimento externo de certas bactérias. Proteínas de choque térmico têm demonstrado eficácia limitada no tratamento de certas neoplasias genitais relacionadas com a infecção pelo HPV.

[0010]O câncer de mama é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em mulheres no mundo. Aproximadamente 1 milhão de novos casos de câncer de mama ocorrem anualmente, resultando em 370.000 mortes em todo o mundo. Mais de 200.000 novos casos de câncer de mama invasivo são diagnosticados nos EUA a cada ano, com aproximadamente 45.000 de mortes atribuídas a esta doença tornando o câncer de mama a segunda maior causa de mortalidade por câncer nos EUA entre as mulheres, e a quinta causa de morte por câncer em geral. Após um declínio constante na morbidade por câncer de mama, a média de sobrevivência de câncer de mama desde o momento do diagnóstico de

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 16/64

5/36 doença amplamente invasiva (Fase 4) não mudou ao longo das últimas duas décadas. A taxa de sobrevivência de cinco anos para a fase 4 de câncer de mama tem se mantido em cerca de 20% desde 1988, o que significa que as vantagens de sobrevivência dos agentes mais novos têm percorrido seu curso por doença em estágio final.

[0011]Tratamento de câncer de mama em tratamentos adjuvantes apresentou melhoras significativas nos últimos 40 anos. Além de melhor tumorectomia, radioterapia, quimioterapia padrão e terapia de reposição hormonal, novas classes de terapias surgiram com mecanismos oncolíticos distintos, tais como o Taxol ® e Herceptin ®. Herceptin ® foi o último desses agentes a ser introduzido em 2003. Não foi expandido significativamente no alcance ao paciente desde 2007. Além disso, eficácia HERCEPTIN ® é limitada a apenas 20% das mulheres com câncer de mama, aquelas que superexpressam o oncogene HER2/neu mais proeminente. Assim, novos e mais agentes obliterantes são necessários para combater e prevenir o câncer de mama.

[0012]Sob investigação para melhorar a gestão de muitos cânceres, a imunoterapia é um mecanismo alvo que poderia controlar o crescimento do tumor e prevenir metástases, evitando muitos dos efeitos colaterais associados com as terapias padrão. Esta última consideração é particularmente importante na medida em que o câncer de mama é uma doença que afeta desproporcionalmente das mulheres mais jovens à idade de procriação. Pesquisa de imunoterapia de câncer de mama anterior concentra-se em maneiras de alcançar a resposta imune natural contra as células cancerosas através da administração de qualquer vacina ou anticorpo monoclonal a um antígeno do câncer de mama. Embora essa abordagem tenha bom senso em relação ao câncer de mama como sendo uma rica fonte de proteínas específicas de tumor (por exemplo, antígenos de lactação de mamaglobina A e lactaderina entre outros) revelou-se muito mal sucedida, porque

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 17/64

6/36 anticorpos, em contraste com a ativação de células T citolíticas, parece ter utilidade limitada para controlar o crescimento do tumor sólido na maioria dos estabelecimentos.

[0013]lmunoterapias de câncer de mama da próxima geração têm focado em maneiras de melhorar a resposta imune de anti-câncer de mama pré-existente do paciente baseada na teoria de que a imunossupressão também limitou a eficácia de estratégias que alcancem o tumor. Um tal imunoterápico é um anticorpo monoclonal direcionado contra CTLA4, um receptor de células T citolíticas implicado na supressão. Ao mesmo tempo demonstrando alguma promessa contra o melanoma e câncer de ovário, anti-CTLA4 se revelou ineficaz como agente autônomo em modelos animais de câncer de mama incluindo aqueles empregados nos estudos aqui relatados. A segunda classe de imunoestimulantes avaliada em cânceres, o agonistas de receptor toll-like (TLR), trabalhos iniciando novos sinais de acionamento para o sistema imune a partir de células dendríticas derivadas de monócitos. Estes agentes até hoje têm demonstrado utilidade limitada na maioria dos cânceres sólidos, incluindo câncer de mama, em parte porque eles rapidamente induzem imunossupressão concomitante à ativação de células T.

[0014]Infecção pelo Vírus da Imunodeficiência Humana inicia uma imunossupressão progressiva, que, sem tratamento, rotineiramente progride para SIDA e, posteriormente, a morte do indivíduo infectado. Como imunossupressão está implicada em vários modelos de progressão do câncer sólido, incluindo câncer de mama, não é surpreendente que pessoas infectadas pelo HIV tenham um risco aumentado para diversas neoplasias, especialmente linfoma não-Hodgkin (NHL), sarcoma de Kaposi (KS) e câncer cervical invasivo, que são câncers definidores de SIDA em indivíduos infectados pelo HIV. Paradoxalmente, pelo menos três grupos relataram uma diminuição do risco de câncer de mama invasivo em mulheres com doença HIV progressiva. Mulheres infectadas pelo HIV têm um padrão

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 18/64

7/36 estatisticamente significativo de diminuição do risco relativo (RR) para câncer de mama quando comparadas com a população francesa em geral. Após uma epidemia de SIDA na Tanzânia, um segundo grupo encontrou uma diminuição estatisticamente significativa na incidência de câncer de mama, em homens e mulheres. Em terceiro lugar, um consórcio norte-americano analisando cerca de 8500 casos de doença de HIV progressiva relatou uma diminuição de risco estatisticamente significante (p <0,05) no desenvolvimento do câncer de mama que voltou aos níveis basais uma vez que o controle da replicação viral foi alcançado.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0015]Divulgados aqui são derivados do Trans-ativador de proteínas de transcrição (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) para uso como agentes imunoterapêuticos de câncer.

[0016]Em uma modalidade, uma composição farmacêutica é fornecida compreendendo uma sequência de aminoácido modificado do Trans-ativador de proteínas de transcrição (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) em que a sequência de aminoácido modificado tem mais de 85% de homologia de sequência para uma sequência de aminoácido selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, a composição compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

[0017]Em uma modalidade, um método de tratamento do câncer é fornecido compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo derivado de Tat para um indivíduo que dela necessita, e provocando a parada do crescimento do câncer ou regressão do câncer no indivíduo.

[0018]Em uma outra modalidade, um método de reduzir a carga tumoral é fornecido compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo derivado de Tat da reivindicação 1 a um indivíduo que dela necessita, e causando a regressão do câncer no indivíduo.

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 19/64

8/36 [0019]Em uma outra modalidade, o polipeptídeo derivado de Tat é administrado em uma pluralidade de doses.

[0020]Em ainda outra modalidade, a etapa de administração compreende um ciclo repetitivo de administração em que cada ciclo compreende administrar uma pluralidade de doses do polipeptídeo derivado de Tat em um período de tempo definido seguido por um período de descanso e no qual o ciclo repete-se uma pluralidade de vezes. Em outra modalidade, a etapa de administração compreende um ciclo repetitivo de administração em que cada ciclo compreende administrar uma pluralidade de doses do polipeptídeo derivado de Tat em um período de tempo definido seguido por uma administração de uma ou uma pluralidade de doses de um agente terapêutico em um período de tempo definido e em que o ciclo se repete uma pluralidade de vezes.

[0021 ]Em uma outra modalidade, o agente terapêutico é a ciclofosfamida.

[0022]Em ainda outra modalidade, o câncer é o câncer da mama. Em outra modalidade, o câncer é o câncer de ovário.

[0023]Em uma outra modalidade, o polipeptídeo derivado de Tat é pelo menos 85% homólogo à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0024]A figura 1 mostra a estimulação de monócitos humanos com derivativos Tat.

[0025]A figura 2 mostra uma curva dose-resposta de estimulação de monócitos humanos com derivativos Tat.

[0026]A figura 3 mostra o efeito da terapia com derivados de Tat no crescimento in vitro do tumor 4T1. Camundongos BALB/c injetados com 1x10⁴ de células tumorais 4T1 foram tratados com Nani-P1 ou Nani-P2 (400 ng, subcutânea [SC]) (FIG. 3A) ou Nani-P3 (400 ng ou 2 mg, SC) (FIG. 3B) nos dias 0, 7, 14 e 21 após a injeção das células tumorais. O grupo de controle foi tratado com PBS.

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 20/64

9/36

Dados representam o volume médio do tumor; bares ± SE. Cada grupo continha 10 camundongos. A partir do dia 15, as diferenças entre o grupo de controle e os grupos tratados com Nani-P1 ou Nani-P2 foram significativas (p <0,05 **). As diferenças entre controle e Nani-P1 ou Nani-P2 foram altamente significativas a partir do dia 22 (p <0,01 **). Não houve diferença entre Nani-P3 (ou dose) e controles.

[0027]A figura 4 descreve uma curva de dose-resposta para os efeitos de Nani-P2 purificado sobre crescimento de tumor de mama 4T1 in vivo. Quatro grupos de dez camundongos BALB/c cada foram implantados com 1x10⁴ de células 4T1. Três grupos receberam doses crescentes de 0,4 ng, 4 ng e 40 ng por camundongo, respectivamente, no flanco esquerdo quatro vezes durante 21 dias. O quarto grupo de controle foi injetado no flanco esquerdo com PBS. Dados representam o volume médio do tumor. As diferenças entre o grupo de controle e 0,4 ng de dose foi significativa (p <0.5 *) e a diferença entre controle e 4 ng ou 40 ng de grupos tratados com Nani-P2 foi altamente significativa (p <0,1 **, p <0,01 **).

[0028]A figura 5 mostra uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier de tratamento com Nani-P2 de camundongos portadores de tumores de mama 4T1. Os camundongos foram injetados SC com 1x10⁴ de células 4T1 no bloco mamário no dia 0. Tratamento foi iniciado no dia 0, com quatro doses de Nani-P2 (40 ng) administradas por via subcutânea. No dia 42, o grupo de tratamento teve melhor sobrevida estatisticamente significativa em relação aos de controle (**) (Fig. 5A). Em um grupo, a terapia foi adiada até o dia 13, momento em que uma série de três doses de Nani-P2 (40 ng) foram administradas semanalmente por via intravenosa (IV), SC em linfonodos de drenagem ou intratumoral (IT) (FIG. 5B). O benefício de sobrevivência de Nani-P2 IV foi altamente significativa no dia 47 (**), enquanto o benefício de sobrevivência de Nani-P2 SC também foi estatisticamente significativa.

[0029]A figura 6 representa a atividade antitumoral de Nani-P2 em TS/A e

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 21/64

10/36 modelos de carcinoma de mama SM1. Camundongos foram implantados SC com 1x10⁵ de células de câncer de mama TS/A (FIG. 6A) e tratados com doses crescentes de Nani-P2 SC (0,4, 4 e 40 ng). Mesmo com a menor dose, a diferença do anticâncer primário foi altamente significativa (p <0,01 **), enquanto a dose de 40 ng também foi altamente significativa (p <0,01 ***). FIG. 6B mostra camundongos implantados SC com 2x10⁵ de células de câncer de mama SM1 e tratados com NaniP2 SC (40 ng) nos dias 0, 7, 14 e 21. A diferença no crescimento do tumor primário entre controle e animais SM1 tratados com Nani-P2 foi altamente significativa (p <0,01 ***).

[0030]A figura 7 mostra produção de INF-γ as partir de células do baço de camundongos portadores de tumores de mama 4T1. Camundongos BALB/c foram injetados SC com 1x10⁴ de células 4T1. Animais de controle receberam injeções semanais de PBS, enquanto o tratamento com Nani-P2 compreendeu injeções SC uma vez por semana (40 ng) iniciadas no dia 0 e continuadas durante 4 semanas. No dia 33, quando os camundongos de controle estavam em estágio final, os camundongos foram sacrificados, o baço colhido e congelado como suspensões celulares únicas até à hora de ensaio. Células do baço (2x10⁵) e 1x10⁴ de mitomicina em células 4T1 estimuladoras (S) C-tratadas (50 mg / ml por 30 min) foram semeadas em placas de 96 poços. Após 72 horas de estimulação, os sobrenadantes foram coletados e concentração de IFN-γ foi determinada usando um kit ELISA de IFN-γ comercial. Produção de IFN-γ foi significativamente (p <0,05 *) maior em culturas de células do baço de camundongos tratados com Nani-P2 em todas as condições de cultura in vitro. 1: sem reestimulação; 2: IL-4 (50 ng / ml) / GM-CSF (100 mg / ml), 3: células estimuladoras /IL-4/GM-CSF; 4: apenas células estimuladoras. Adição de agonistas in vitro IL-4 e GM-CSF (2 e 3) induziu um aumento muito significativo em produção de IFN-γ (p <0,01 **).

[0031 ]A figura 8 mostra a regressão de tumores de mama 4T1 estabelecidos

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 22/64

11/36 e inibição da metástase pulmonar por tratamento com Nani-P2. Na FIG. 8A, dois grupos de 10 camundongos BALB/c foram injetados com 1x10⁴ de células 4T1 no bloco mamário no dia 0. Um grupo foi dosado com Nani-P2 (40 ng) semanalmente durante três semanas começando no dia 14. Um segundo grupo foi tratado com PBS e utilizado como controle. Carga tumoral foi altamente significativa a partir do dia 22 e assim permaneceu durante toda a duração do estudo (p <0,01 **). Camundongos foram sacrificados quando o diâmetro do tumor atingiu os 15 mm, em que metástases pulmonares de tempo foram contadas (Fig. 8B). Dados representam metástases pulmonares totais como quantificadas por dois observadores cegos para o tratamento do protocolo (p <0,01 **).

[0032]A figura 9 mostra o crescimento do tumor 4T1 e metástase pulmonar em camundongos BALB/c. Dois grupos de 10 camundongos BALB/c foram implantados subcutaneamente (SC) com 1x10⁴ de células 4T1, os camundongos injetados IV com 40ng de Nani-P2 ou PBS. No 28^s dia de tratamento, os camundongos foram mortos e os pulmões e o tumor foram removidos e nódulos tumorais foram contados a olho. Fotografias dos tumores e pulmões, que eram representativas de 10 camundongos, são mostradas. Lesões tumorais esbranquiçada podem ser observadas na superfície dos pulmões. Três experimentos obtiveram resultados semelhantes.

[0033]A figura 10 mostra regressão induzida pelo tratamento com Nani-P2 de tumores de mama 4T1 estabelecidos. Um dos 10 camundongos foi submetido a uma remissão completa e permaneceu livre de doença durante 50 dias, ponto em que o estudo foi encerrado. Dois grupos de 10 camundongos BALB/c foram injetados com 1x10⁴ de células 4T1 no bloco mamário no dia 0. Um grupo foi dosado com Nani-P2 (40 ng) por camundongo IV semanalmente durante três semanas com início no dia 14 e o outro grupo foi tratado com PBS e serviu como controle. A diferença no crescimento do tumor primário entre controle e grupos tratados com

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 23/64

12/36

Nani-P2 foi altamente significativa (p <0,01 **).

[0034]A figura 11 mostra o crescimento do tumor após o tratamento com doses repetidas de Nani-P2 e ciclofosfamida.

[0035]A figura 12 mostra o benefício de sobrevivência de doses repetidas de Nani-P2 e ciclofosfamida versus ciclofosfamida semanais.

DESCRIÇÃO DETALHADA [0036]Uma série de derivados de peptídeo de trans-ativador de transcrição (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana artificial (HIV) foi designada que são muito ativos em modelos animais de câncer da mama. As moléculas são aqui referidas como derivados de Tat ou ImunoEstimulantes de Precisão (PINS) e compreendem moléculas Tat tendo exclusão de elementos que poderíam estar contribuindo para imunossupressão mediada por HIV. Um destes derivados, NaniP2, causa regressão da doença metastática do câncer de mama estabelecido. Nas doses aqui relatadas, nenhuma toxicidade significativa foi associada com administração por via subcutânea ou intravenosa de derivados altamente purificados (> 95% puro).

[0037]Apesar de uma abundância relativa de antígenos específicos do tumor, o câncer de mama tem provado ser um alvo difícil para imunoterapêuticos. Evidência foi acumulada em que o estado refratário de câncer de mama e outros cânceres, a imunoterapêuticos poderia derivar de imunossupressão que acompanha cânceres estabelecidos. Pelo menos três estudos epidemiológicos distintos têm mostrado que as mulheres com a infecção pelo HIV e até Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA) foram paradoxalmente protegidas de desenvolver câncer de mama, mesmo em fase final de doença quando imunodeficiência é pronunciada.

[0038]Com base na análise molecular, a proteína Tat (SEQ ID NO: 1) codifica quatro diferentes atividades de peptídeo ligado. Esta presente divulgação

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 24/64

13/36 descreve composições polipeptídicas que são derivatizadas da estrutura canônica HIV-1 Tat, no pelo menos primeiro ou amino peptídeo, de forma a aumentar o potencial de imunoterapia do polipeptídeo. A porção amino terminal de Tat inclui uma região de peptídeo curta a partir de um fator de transcrição nuclear (TF) tipicamente flanqueado por resíduos de prolina. Esta região determina, pelo menos em parte, como estimular ou suprimir o polipeptídeo Tat é para as células do sistema imune, particularmente as células imunes inatas, como as células dendríticas (DC) e macrófagos (células apresentadoras de antígenos ou APCs). Consequentemente, é previsto que as modificações para a região TF podem tornar os polipeptídeos mais ativos na terapia de câncer e outras doenças crônicas.

[0039]Proteína HIV-1 Tat (SEQ ID NO: 1) MEPVDPRLEPWKHPG SQPKTACTTCYCKKCCFHCQVCFTKKALGISYGRKKRRQRRRAPEDSQTHQVSPP KQPAPQFRGDPTGPKESKKKVERETETHPVD [0040]Análise in silico descobriu que o HIV-1 Tat codifica um domínio de ligação SH3 curto idêntico à sequência encontrada em uma outra proteína TF, hairless (hr), que já havia sido demonstrada que têm propriedades imunossupressoras em camundongos. Camundongos portadores da mutação hr desenvolvem uma desregulação imunitária, agora mais comumente chamada de o deslocamento TH1 para TH2, que é a condição sine qua non de indivíduos infectados pelo HIV que estão progredindo para a SIDA. Análise mais aprofundada estabeleceu que sequência de ligação SH3 derivada do gene hr é uma característica quase invariante de Tat isolada de HIV-1, e uma característica muito consistente de HIV-2. Indivíduos infectados pelo HIV-1 ou HIV-2 progridem para SIDA exceto em raras circunstâncias.

[0041 ]Em contraste, os primatas infectados por determinadas cepas de vírus da imunodeficiência símia (SIV), um lentivírus intimamente relacionado com o HIV, raramente progridem para SIDA ou fazem de forma imprevisível. Esta observação

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 25/64

14/36 aliada à descoberta de um fragmento supostamente TF hr imunossupressor em HIV1 Tat imunossupressora sugeriu que alguns primatas pudessem ter um fragmento de TF diferente (ou não) no terminal amino de SIV Tat. Tat a partir de certos mangabeys sooty infectados por SIV com um curso atenuado de imunodeficiência têm em seu amino terminus um fragmento de TARA TF em vez de hr TF. TARA associado com a família rho de ativadores GTPase que têm sido implicados em determinadas ativações oncogênicas.

[0042]Ensaios em animais com derivados da proteína Tat recombinantemente produzidos, em três diferentes modelos murinos amplamente aceitos de câncer de mama; 4T1, SM1 e TS/A proveram suporte de que estes derivados de Tat são ativos em suprimir crescimento do câncer de mama primário em camundongos. Além disso, o derivado mais ativo, Nani-P2, significativamente inibiu o desenvolvimento de metástases pulmonares 4T1 espontâneas e aumentou a sobrevida em comparação com camundongos de controle. Significativamente, o aumento dos níveis de produção de IFN-γ acompanhada de tratamento dos cânceres de mama murinos com derivativos Tat. Em estudos de câncer de mama quando 4T1 foi semeado por 14 dias antes do início do tratamento, os derivados de Tat foram igualmente tão eficazes como quando administrados no momento da implantação do tumor quando avaliados pelo crescimento do tumor primário, sobrevida e redução da carga de pulmão metastático quando em comparação com controles tratados com PBS.

[0043]Derivados de Tat sintéticos são imunoestimulantes para APCs, têm atividade substancial contra cânceres primários, bem como cânceres estabelecidos em três modelos de carcinoma mamário de murino amplamente utilizados. Em particular, um dos derivados, Nani-P2, produziu um impacto dependente de dose e de via sobre o crescimento do tumor primário, a formação de metástase pulmonar e sobrevivência no agressivo, Her2 (-) modelo de câncer de mama 4T1. Não é de

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 26/64

15/36 surpreender que a metástase pulmonar diminuída se correlacione com melhora da sobrevida, porque metástase pulmonar é a principal causa de mortalidade em câncer de mama avançado. Importante, camundongos portadores de tumores de mama estabelecido 4T1 tratados por via intravenosa com proteína Nani-P2 tiveram inibição de crescimento muito significativa do tumor e benefícios de sobrevida que se estendeu, pelo menos, por 36 dias após a administração passada. Em casos limitados, remissões totais foram, aparentemente, observadas que foram mais frequentes com os tumores de mama menos agressivos (SM1) e/ou um de alguma maneira mais imunogênicos (TS/A). Retardar a administração de implante de tumor pós Nani-P2 teve pouco efeito negativo sobre a supressão do crescimento tumoral 4T1, na medida em que a terapia (SC), iniciada no dia 0 após a injeção das células tumorais encolheu a carga tumoral em média 53%, enquanto a terapia SC iniciada no dia 13, quando o crescimento do tumor já era em média cerca de 5 mm de diâmetro, diminuiu a carga tumoral em média 52% em seu efeito máximo. Em conjunto, estas observações indicam que Nani-P2 pode impactar favoravelmente em câncer de mama humano avançados e Her2 (-) em seres humanos.

[0044]Além disso, os derivados de Tat divulgados neste documento compreendem sequências totalmente humanas. A taquifilaxia gradual contra os derivados de Tat é vista em camundongos administrados com mais de três doses (dados não mostrados), que pode ser substancialmente devido ao hospedeiro desenvolvendo uma resposta inibitória de anticorpos anti-derivativos. Como este tipo de resposta imunológica em seres humanos poderia bloquear a ativação de DC, assim, drasticamente cerceando a replicação do HIV, que, aparentemente, não pode facilmente se construir em seres humanos tornando muito menos provável que um grau semelhante de taquifilaxia, pelo menos, como devido a um mecanismo baseado em anticorpos, será operativo na terapêutica humana.

[0045]0s estudos aqui relatados utilizaram um protocolo de

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 27/64

16/36 aproximadamente três ou quatro doses semanais de derivados de Tat receberam ou IV ou SC, com a administração IV provando ser mais eficaz para aumentar a sobrevida e para reduzir metástases. Nenhuma toxicidade foi observada em mais de 250 camundongos que receberam essas composições. A sensibilidade do câncer de mama para os derivados de Tat contrasta favoravelmente quando comparada com a curva de resposta de dose de Herceptin ®, onde 4-8 gm / kg é a terapia padrão. Estima-se que os derivados de Tat serão até 100 vezes mais bioativos em humanos do que em camundongos, o que significa que doses ainda mais baixas associadas com um risco ainda menor de toxicidade poderíam provavelmente ser bem sucedidas.

[0046]Aqui estabelecido é que os derivativos Tat ativam o braço INF-γ da resposta imune de células T anti-câncer (FIG. 5). Níveis basais de INF-γ secretado por esplenócitos de camundongos tratados com Nani-P2 são 8 vezes maior que os de camundongos de controle tratados com PBS. Secreção de IFN-γ em resposta ao tratamento de derivado de Tat in vivo pode ser adicionalmente aumentada (até 53x) in vitro por agonistas imunes inatos GM-CSF e IL-4, enquanto esplenócitos a partir de camundongos de controle permanecem suprimidos mesmo depois de tentativas de co-estimular com altas doses de GM-CSF e/ou IL4.

[0047]Enquanto os derivados de Tat divulgados são agentes contrassupressores com eficácia “autônoma” em ambos os carcinoma de mama de murino avançado e inicial, estas observações, além disso suportam a perspectiva de que os derivados de Tat podem criar sinergias com outros terapêuticos anti-câncer contrassupressores atualmente em desenvolvimento clínico que podem ter um efeito restrito em face da carga tumoral avançada e imunossupressão grave que o acompanham.

[0048]Um modelo de câncer de mama mais imunogênico (SM1) e/ou um tumor de mama com um epítopo imunodominante (TS/A) têm uma taxa de regressão

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 28/64

17/36 relativamente alta após terapia com derivados de Tat, enquanto o modelo 4T1 nãoimunogênico é mais refratário. Isto é consistente com um modelo que a imunossupressão é um fator dominante na progressão do câncer de mama, e de fato pode ser positivo para o câncer de mama invasivo. Este modelo é suportado pela observação de que 4T1 expressa vários antígenos de câncer de mama comum, incluindo lactadherina e proteína de ligação de andrógenos, em níveis elevados em relação à resposta imune que é, aparentemente, contrassupressão induzida por derivado de Tat ausente aparentemente totalmente suprimido. Em conjunto, estas observações levantam a possibilidade de que os derivativos Tat, quando administrados a mulheres em risco saudáveis, juntamente com um ou vários antígenos comuns de câncer de mama humano, poderíam vir a ser desenvolvidos em uma vacina anti-câncer de mama profilática.

[0049]Em modalidades adicionais, divulgado neste documento é o uso de variantes conservadoramente modificadas de derivados de Tat. As variantes aqui descritas mantêm a atividade biológica da molécula fonte ou principal.

[0050]Como usado aqui o termo variantes conservadoramente modificadas refere-se a peptídeos variantes que têm a mesma atividade ou biológica similar dos peptídeos originais. Por exemplo, mudanças de aminoácidos conservadores podem ser feitas, que apesar de alterarem a sequência primária da proteína ou peptídeo, não alteram a sua função. Substituições de aminoácidos conservadores normalmente incluem substituições dentro dos seguintes grupos: glicina e alanina, valina, isoleucina e leucina, ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina, serina e treonina, lisina e arginina, fenilalanina e tirosina.

[0051]Modificações (que normalmente não alteram sequência primária) incluem derivatização química in vivo ou in vitro de polipeptídeos, por exemplo, acetilação, ou carboxilação. Também estão incluídas as modificações da glicosilação, por exemplo, aquelas feitas modificando os padrões de glicosilação de

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 29/64

18/36 um polipeptídeo durante sua síntese e processamento ou em etapas de processamento adicional, por exemplo, expondo o polipeptídeo às enzimas que afetam a glicosilação, por exemplo, as enzimas de glicosilação ou deglicosilação de mamíferos. Também englobadas são as sequências que têm resíduos de aminoácidos fosforilados, por exemplo, fosfatase, fosfoserina, ou fosfotreonina.

[0052]Também estão incluídos os polipeptídeos que foram modificados usando técnicas comuns da biologia molecular, de modo a melhorar a sua resistência à degradação proteolítica ou para otimizar as propriedades de solubilidade. Tais análogos de polipeptídeos incluem aqueles contendo resíduos diferentes dos L-aminoácidos que ocorrem naturalmente, por exemplo, Daminoácidos ou aminoácidos sintéticos de ocorrência não-natural. Os peptídeos divulgados neste documento não estão limitados a produtos de qualquer um dos processos específicos exemplares aqui listados.

[0053]Além de polipeptídeos de comprimento substancialmente completo, a presente divulgação também provê fragmentos biologicamente ativos dos polipeptídeos.

[0054]Como usado aqui, sequências de aminoácidos que são substancialmente a mesma normalmente compartilham mais de 95% de identidade de aminoácidos. Reconhece-se, no entanto, que as proteínas (e DNA ou mRNA que codificam tais proteínas) contendo menos do que o nível acima descrito de homologia que surge como variantes de divisão ou que foram alteradas por substituições de aminoácidos conservadores (ou substituição de códons degenerados) estão previstas para estarem no escopo da presente divulgação. Como facilmente reconhecido por aqueles versados na técnica, várias formas foram concebidas para alinhar sequências para comparação, por exemplo, matriz de pontuação 62 Blosum, como descrito por Henikoff e Henikoff em Proc. Natl. Acad Sei. 89:10915 EUA (1992). Algoritmos convenientemente utilizados para esse efeito

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 30/64

19/36 são amplamente disponíveis (ver, por exemplo, Needleman e Wunsch em J. Mol. Bio. 48:443 (1970).

[0055]Portanto, divulgadas neste documento são sequências de aminoácidos 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% idênticas aos derivados de Tat divulgados em SEQ ID NOs. 1-4.

[0056]0s seguintes sistemas de expressão são adequados para uso em expressar os derivados de Tat divulgados: sistemas de expressão de células de mamíferos, tal como, mas não limitado a, sistemas de expressão de células de insetos, tal como, mas não limitado a, sistema de expressão de Bac-to-Bac, sistema de expressão de baculovírus e sistemas de expressão DES e sistemas de expressão E. coli, incluindo mas não limitado a, sistemas de expressão pET, pSUMO e GST. Em outra modalidade, os derivados de Tat são expressos com um tag 6-his útil para o isolamento do polipeptídeo. Sistemas de purificação de tag 6-His são conhecidos por pessoas versadas na técnica.

[0057]Quantidade terapeuticamente eficaz se destina a qualificar a quantidade necessária para alcançar um efeito terapêutico.

[0058]0s derivativos Tat divulgados são polipeptídeos imuno-estimulantes que são úteis em muitos tipos de cânceres. Em uma modalidade, os derivados de Tat são úteis no tratamento de um tipo de câncer, incluindo mas não limitado a, câncer de mama, melanoma, câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer pancreático, mieloma, câncer colorretal, câncer renal, linfoma e câncer de cólon.

[0059]Em uma outra modalidade, o câncer é o câncer de mama. Em ainda outra modalidade, o câncer é o câncer de ovário.

[0060]A presente divulgação é também direcionada a composições farmacêuticas compreendendo os polipeptídeos derivados de Tat acima descritos. Dosagens e concentrações do fármaco desejado das composições farmacêuticas divulgadas podem variar dependendo do uso específico previsto. A determinação da

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 31/64

20/36 dose adequada ou da via de administração está bem dentro da habilidade de um médico comum. Experiências com animais fornecem orientação confiável para a determinação de doses eficazes para terapia humana. Escala de interespécies de doses eficazes pode ser realizada seguindo os princípios estabelecidos por Mardenti, J. e Chappell, W. The use of interspecies scaling in toxicokinetics Em Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al, Eds., Pergamon Press, New Iorque 1989, pp 42-96. Em uma modalidade, a doença está presente. Em outra modalidade, a vida de uma célula ou um indivíduo é prolongada devido aos métodos aqui descritos.

[0061 ]Os Polipeptídeos de derivados de Tat acima descritos podem ser formulados sem a experimentação indevida para a administração a um mamífero, incluindo seres humanos, conforme apropriado para a aplicação particular. Além disso, as doses adequadas das composições podem ser determinadas sem a experimentação indevida usando o padrão de protocolos resposta a dose.

[0062]Assim, as composições projetadas para administração oral, nasal, lingual, sublingual, bucal, intrabucal, endovenosa, subcutânea, intramuscular e pulmonar podem ser feitas sem a experimentação indevida por meio bem conhecido na área, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo farmaceuticamente aceitável. Para efeitos de administração terapêutica, as composições farmacêuticas podem ser incorporadas com excipientes e usadas na forma de comprimidos, troches, cápsulas, elixires, suspensões, soluções, xaropes, etc. Um veículo farmaceuticamente aceitável significa qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão. Exemplos de veículos adequados são bem conhecidos na área e podem incluir, mas não estão limitados a qualquer um dos veículos farmacêuticos padrão tais soluções salinas tamponadas de fosfato, solução salina tamponada de fosfato contendo Polysorb 80, água, emulsões tais como emulsão óleo / água, e vários tipos de agentes umectantes. Outros veículos também podem incluir soluções estéreis,

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 32/64

21/36 comprimidos, comprimidos revestidos e cápsulas. Normalmente esses veículos contêm excipientes tais como amido, açúcar, leite, certos tipos de argila, gelatina, ácido esteárico ou seus sais, estearato de magnésio ou de cálcio, talco, gorduras vegetais ou óleos, gomas, glicóis, ou outros excipientes conhecidos. Composições compreendendo esses veículos são formuladas por métodos convencionais conhecidos.

[0063]As composições de polipeptídeo de derivados de Tat podem ser facilmente administradas por via parenteral, tal como por exemplo, por via intravenosa, intramuscular, intratecal ou subcutânea. A administração parenteral pode ser realizada através da incorporação dos compostos em uma solução ou suspensão. Tais soluções ou suspensões também podem incluir diluentes estéreis, tais como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos. Formulações parenterais também podem incluir agentes antibacterianos, tais como, por exemplo, álcool benzílico ou metil parabenos, antioxidantes, tais como, por exemplo, ácido ascórbico ou bissulfito de sódio e agentes quelantes tais como EDTA. Tampões, tais como acetatos, citratos e fosfatos e agentes para o ajuste de tonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose também podem ser adicionados. A preparação parenteral pode ser fechada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou de plástico.

[0064]A administração transdérmica inclui absorção percutânea da composição através da pele. Formulações transdérmicas incluem adesivos, dispositivos de iontoforese, pomadas, cremes, géis, pomadas e afins.

[0065]A composição pode incluir vários materiais que modificam a forma física de uma unidade de dosagem sólida ou líquida. Por exemplo, a composição pode incluir materiais que formam uma concha de revestimento em torno dos ingredientes ativos. Os materiais que formam a concha de revestimento são

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 33/64

22/36 normalmente inertes, e podem ser selecionados a partir, por exemplo, açúcar, gomalaca, e outros agentes de revestimento entéricos. Alternativamente, os ingredientes ativos podem ser envoltos em uma cápsula de gelatina ou cachet.

[0066]As composições de polipeptídeo dos derivados de Tat da presente divulgação podem ser administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, de acordo com um regime de dosagem apropriado. Como entendido por um versado na técnica, a quantidade exata necessária pode variar de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie do sujeito, idade e estado geral, a gravidade da infecção, o agente especial e o modo de administração. Em algumas modalidades, cerca de 0,001 mg / kg a cerca de 50 mg / kg, da composição com base no peso corporal do indivíduo é administrado, uma ou mais vezes por dia, para obter o efeito terapêutico desejado. Em outras modalidades, cerca de 1 mg / kg a cerca de 25 mg / kg, da composição com base no peso corporal do indivíduo é administrado, uma ou mais vezes por dia, para obter o efeito terapêutico desejado.

[0067]A dosagem diária total das composições será determinada pelo médico assistente no âmbito do julgamento médico. O nível de dose específica terapeuticamente eficaz para um determinado doente ou indivíduo dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a doença a ser tratada e a gravidade da doença, a atividade específica do composto empregado, a composição específica empregada, a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente ou indivíduo, o tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do composto específico empregado, a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou coincidentes com o composto específico utilizado, e outros fatores bem conhecidos na área médica.

[0068]As composições divulgadas também podem ser empregadas em terapias de combinação. Ou seja, as composições presentemente divulgadas podem ser administradas concomitantemente com, antes ou após, uma ou mais outras

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 34/64

23/36 composições desejadas, terapêuticas, tratamentos ou procedimentos médicos. A combinação particular de terapias administradas será determinada pelo médico assistente e levará em consideração a compatibilidade dos tratamentos e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será apreciado que os agentes terapeuticamente ativos utilizados em combinação podem ser administrados em conjunto em uma única composição, o tratamento ou procedimento, ou, alternativamente, podem ser administrados separadamente.

[0069]Em uma outra modalidade, repetitiva ou frequente, a administração dos derivados de Tat divulgados é contemplada que poderia correr na frente de taquifilaxia, bem como reverter a maré imunossupressora estabelecida durante a progressão do câncer de mama. Dosagem frequente é um procedimento utilizado, por exemplo, na terapia de alergia que podem suportar a tolerância imunológica a um agente. Uma vez que o derivado de Tat pode ser usado para recuperar a imunorreatividade para um tumor de mama, então outros imunoterapêuticos que perderam benefício devido à doença avançada poderíam recuperar eficácia. Em um segundo protocolo, os esquemas quimioterápicos são usados que poderíam liberar uma chuva de antígenos tumorais em alternância com imunoterapia de derivados de Tat. Cânceres de mama humano em estágio avançado são multirresistentes a fármacos, radioterapia poderia ser uma alternativa prática nos testes em humanos.

[0070]0 número de doses repetidas dos derivados de Tat pode ser estabelecido pelo profissional médico com base na resposta do paciente às doses. Em uma modalidade, o derivado de Tat é administrado uma vez a cada três dias, em 3 doses em um período de 10 dias. Este esquema de administração é então repetido para uma pluralidade de ciclos. A presente divulgação prevê uma variedade de esquemas de administração diferentes onde o derivado de Tat é administrado várias vezes dentro de um período de tempo selecionado e, em seguida, o esquema de administração é repetido para uma pluralidade de ciclos. Em outra modalidade, a

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 35/64

24/36 administração do derivado de Tat pode ser alternada com a administração de um ou mais agentes imunomoduladores ou imunossupressores, anti-câncer. Em uma modalidade, o agente imunossupressor é a ciclofosfamida.

EXEMPLO 1

Projeto e produção de derivados de Tat [0071]Três derivados de Tat exemplares são divulgados neste documento, cada um dos quais substitui o fragmento hr TF de uma maneira diferente. As porções das sequências sublinhadas representam as sequências entre os prolinas.

[0072]Nani-P1 (MPM1; SEQ ID NO: 2) - MEPVDANLEAWKHAGSQPR KTACTTCYCKKCCFHCQVCFTRKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQT HQASLSKQPASQSRGDPTGPTESKKKVERETETDPFD

Nani-P2 (ASH4; SEQ ID NO: 3) - MDPKGEEDQDVSHQDLIKQYRKP RTACNNCYCKKCCFHCYACFLRKGLGITYHAFRTRRKKIASADRIPVP QQSISIRGRDSQTTQESQKKVEEQAKANLRISRKNLGDETRGPVGAGN.

Nani-P3 (TMPD5; SEQ ID NO: 4) - METPLKEQENSLESCREHSS SISEVDVPTPVSCLRKGGRCWNRCIGNTRQIGSCGVPFLKCCKRKPF TRKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQTHQASLSKQPASQSRGDPTG PTESKKKVERETETDPFD [0073]Proteínas de ligação SH3 contêm uma série de prolinas internas necessárias para a função TF. Nani-P1 removeu as prolinas internas, que são cada uma substituídas como alanina, tornando o sítio de ligação SH3 inativo. Essa alteração enfraquece toda a proteína Tat como um TF, porque agora é produzida predominantemente como uma proteína intracitoplasmática, ao contrário dos outros derivados de Tat.

[0074]Nani-P2 tem um terminus amino Tat derivatizado a partir de uma variante do macaco verde Africano SIV com baixa patogenicidade no hospedeiro. Apenas a prolina flanqueando carboxila é conservada nesta sequência.

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 36/64

25/36 [0075]Em Nani-P3, uma sequência de homologia TARA rica em serina substitui a sequência de ligação SH3 como um peptídeo TF amino flanqueado por prolinas. A Tat foi originalmente sequenciada a partir de uma variante de baixa patogenicidade SIV em macacos e macacos mangabey sooty.

EXEMPLO 2

Atividade in vitro de derivados de Tat [0076]Monócitos humanos foram cultivados por 24-28 horas com um derivado de Tat (Nani-P2), uma sequência imunoestimulante (ISS) de um receptor toll-like (TLR) (fig. 1) ou lipopolissacarídeo (LPS) (FIG. 2) e as células foram então lavadas e manchadas com fluorescente etiquetado com CD86. O derivado de Tat estimulou maior expressão de CD86 do que qualquer ISS (TLR) ou LPS.

EXEMPLO 3

Avaliação de derivados de Tat em modelos de camundongo de câncer da mama

Materiais e métodos [0077]Animais. Camundongos BALB/c fêmeas de 6-8 semanas de idade foram adquiridos do Laboratório Jackson (Bar Harbor, NE). Camundongos foram aclimatados por pelo menos uma semana antes do uso. Camundongos foram mantidos em condições livres de patógenos no Centro de Manutenção de Animais da Columbia University of Medicai Center e todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Gare e Use Comitee da Columbia University of Medicai Center.

[0078]Linhagens celulares. Células 4T1, uma linhagem celular resistente a 6tioguanina derivada de um carcinoma mamário espontâneo de BALB/c foi obtida de ATCC; TS/A, uma linhagem celular de adenocarcinoma de murino foi fornecida pela Dr. Sandra Demaria (Demaria S. et al Clin Câncer. Res 11 :728-34, de 2005);. e SM1, o carcinoma mamário derivado de BALB/C foi gentilmente fornecido pelo Dr.

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 37/64

26/36

James Allison, da Universidade da Califórnia, Berkeley. Todas as linhagens celulares tumorais foram cultivadas em DMEM, suplementado com 2 mM de Lglutamina, 10 mM de HEPES, 150 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 10% de FCS inativado pelo calor (Invitrogen), 50 μΜ de 2-mercaptoetanol (Sigma), e 50 mg/L de gentamicina (Lanza).

[0079]Desafio de tumor e tratamento. BALB/c foram injetados (SC), com 1x104 de células 4T1, 1x10⁵ de TS/A ou 2 x10⁵ de SM1, respectivamente, no bloco mamário esquerdo no dia 0. Imunoterapia foi realizada injetando diretamente um derivado de Tat no flanco direito nos dias 0, 7, 12 e 17 após o estabelecimento de tumores. O grupo de controle recebeu injeção de PBS. Em alguns experimentos, quando todos os camundongos tiveram um tumor mensurável estabelecido (3-5 mm de diâmetro até 14 dias após a injeção do tumor), os animais foram divididos aleatoriamente em vários grupos de tratamento como indicado. Carga tumoral (volume tumoral) foi medida e registrada três vezes por semana. Animais foram sacrificados quando os tumores atingiram um volume de 15 mm de diâmetro e os tumores foram colhidos e pesados.

[0080]Detecção de metástases pulmonares. Pulmões foram examinados para metástases de 4T1, como descrito anteriormente (Pulaski B. et al. Câncer Res. 60:2710-2715, 2000). Tumores primários 4T1 que foram estabelecidos por 2-3 semanas em camundongos BALB/c metástase para os pulmões em uma grande maioria dos animais. Resumidamente, os camundongos foram sacrificados de acordo com as diretrizes IACUC estabelecidas no início dos ensaios, os pulmões removidos, e nódulos tumorais na superfície dos pulmões foram enumerados a olho nu por dois investigadores independentes, cegos aos protocolos de tratamento.

[0081]Análise ELISA de produção de IFN-γ por células do baço imunes. Secreção de esplenócitos de IFN-γ foi avaliada por um kit ELISA OptEIA™ (BD Biosciences). Resumidamente, as células do baço (1x10⁵/poço) de camundongos

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 38/64

27/36 portadores de tumor 4T1 foram cultivadas com ou sem 5x10³/poço de mitomicina C (50 pg / ml) tratadas com células 4T1 (usadas para fornecer antígenos tumorais) em DMEM em uma relação 20:01 Ε: T (efeito:tumor) com IL-2 (50ng/mL) e GM-CSF (1 OOng/ml) em placas de 96 poços. Sobrenadantes foram coletados após 72 horas e mantidos congelados a -80^sC até análise sem perda de atividade. IFN-γ foi medido em sobrenadantes livres de células de poços duplicados por ELISA de acordo com as instruções do fabricante. Produção de IFN-γ específico de tumor foi calculada subtraindo-se os valores de fundo medidos em sobrenadantes de células do baço cultivadas com meio sozinhas e valores de densidade óptica (DO) foram convertidos em quantidades de pg / ml de IFN-γ usando uma curva padrão de IFN-γ recombinante. índice de estimulação (SI) foi calculado como a proporção de IFN-γ em culturas estimuladas versus controle.

[0082]Análise estatística. Dados foram analisados estatisticamente utilizando teste t de Student (Graph Pad Prism versão 5; GraphPad). Dados de experimentos de sobrevivência de animais foram analisados estatisticamente utilizando teste logrank (Graph Prism Pad versão 5).

Resultados [0083]0 efeito terapêutico da administração sistêmica de composições de derivados de Tat sintéticos em modelos murinos de câncer de mama foi investigado. Para comparar a proteção relativa conferida por um pequeno painel de derivados de diferentes contra o crescimento primário de tumor de mama, camundongos BALB/c do sexo feminino foram injetados com 1x10⁴ de células de tumor de mama 4T1 SC no bloco mamário, e em seguida tratados com 400 ng de derivados de Tat parcialmente purificados nos dias 0, 7, 14 e 21 (injeção SC em PBS) nos nodos linfáticos axilares.

[0084]Dois dos derivados, Nani-P1 e Nani-P2, reduziram significativamente a carga tumoral, quando comparados aos camundongos do grupo de controle que

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 39/64

28/36 receberam injeções de PBS sozinhas, com esta primeira diferença que se manifestou em 15 dias após a implantação do tumor (FIG. 3A, dia 15 p <0,05). Por outro lado um terceiro derivado, Nani P3, produzido e parcialmente purificado com o mesmo protocolo como os outros, foi menos eficaz em suprimir o crescimento do tumor primário 4T1 mesmo em doses cinco vezes mais altas (2 mg, FIG. 3B) ou para estender sobrevivência (não mostrada). Estes resultados efetivamente descartaram que os contaminantes em preparação contribuíram para a eficácia anti-tumor, especialmente na medida em que os ensaios subsequentes foram realizados com materiais altamente purificados (> 95% puro) em doses muito menores. A eficácia da Nani-P2 foi significativamente mais sustentável do que o Nani-P1, de modo que no dia 21 (a dosagem final), a diferença de carga tumoral primária entre tumores tratados com Nani-P1 e Nani-P2 se tornou 18 mm³ e foi altamente estatisticamente significativa (p <0,01). Este efeito persistiu durante todo o restante deste estudo, apesar de nenhuma terapia adicional.

[0085]0 efeito inibitório do crescimento de tumor de mama de Nani-P2 altamente purificado sobre tumores 4T1 foi dependente de dose, com efeitos significativos aparentes após a administração SC de apenas 0,4 ng do composto (FIG. 4). Aumento da dose de Nani-P2, administrada por via subcutânea no flanco axilar de drenagem, por incrementos logarítmicos de 0,4 ng a 40 ng por dose progressivamente inibiu o crescimento do tumor de mama 4T1. A inibição do crescimento 4T1 mais robusta com doses elevadas de Nani-P2 entre 0,4 ng a 40 ng foi estatisticamente significativa (p <0,01), enquanto o aumento da dose de 400 ng e até 2 mg não resultou em nenhuma eficácia anti-tumor (dados não mostrados). Importante, nenhuma toxicidade foi observada após a administração IV ou SC de 40 ng de Nani-P2 em vários estudos clínicos utilizando esquemas de dosagem múltipla. A dose de 40ng de Nani-P2 foi selecionada para um estudo mais aprofundado.

[0086]Para determinar se tratamento com Nani-P2 pode prolongar a

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 40/64

29/36 sobrevivência, além de encolher os tumores primários em camundongos, os protocolos de tratamento utilizando vários esquemas de dosagem e rotas (SC, IV ou TI) de administração de 40ng de Nani-P2 foram realizados. Cortes de dez camundongos por grupo foram seguidos por tempo de sobrevivência, como avaliado pela utilização do método de limite de produto Kaplan-Meier. Como pelo regulamento das Instalações de Animais de Columbia University Medicai Center, cada camundongo foi sacrificado com um diâmetro médio do tumor de aproximadamente 15 mm, ou antes, se o camundongo se tornou moribundo, fazendo um desses dois resultados o elemento definidor da fatalidade.

[0087]No primeiro ensaio avaliação de Nani-P2, tratamento SC foi iniciado simultaneamente para implante do tumor. O tempo médio de sobrevida para o camundongo de controle (tratado com PBS) foi de 30 dias e 100% de fatalidade ocorreu pelo dia 36. Com administração de Nani-P2 (4 doses ao longo de 14 dias), 35% dos camundongos tratados ainda estavam vivos no dia 48 (p <0,001, FIG. 6A) ponto em que todos os camundongos foram sacrificados devido à carga tumoral primária.

[0088]Em um segundo teste de sobrevivência, os tumores foram autorizados a estabelecer-se por 14 dias para melhor avaliar a eficácia na doença metastática, depois disso três ciclos de terapia com Nani-P2 foram administrados semanalmente por uma das várias vias (SC, IV ou TI) para comparar a eficácia relativa para cada via de administração (Fig. 5B). Semelhante ao estudo anterior, a sobrevida mediana de camundongos de controle (tratados com PBS SC) foi de 32 dias, com letalidade de 100% até o dia 36. Sobrevivência foi prorrogada pela administração IV de NaniP2 (p <0,005, FIG. 5B) com a sobrevida de 60% no dia 47, em comparação com a sobrevivência de 20% dos camundongos tratados SC no dia 47 (p <0,05). Administração intratumoral do composto foi ligeiramente inferior à administração SC.

[0089]0 modelo de tumor mamário murino 4T1 foi escolhido para o estudo

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 41/64

30/36 porque é um tumor agressivo e rapidamente invasivo, é rotineiramente metastático em 14 dias pós-implante em que é difícil de tratar. Para saber se a eficácia de NaniP2 poderia se estender a outros modelos de tumor de mama murino, mais dois tumores mamários, TS/A e SM1 foram estudados (FIG. 6). Tumores de mama primários TS/A foram aproximadamente tão agressivo quanto 4T1, atingindo um volume de tumor de 15 mm em 30 dias (FIG. 6A). No entanto, os tumores TS/A foram consideravelmente mais sensíveis ao tratamento com Nani-P2, com uma supressão de aproximadamente 50% de crescimento após o tratamento com 0,4 ng de Nani-P2, e uma taxa de remissão total de 40% em 30 dias.

[0090]0 modelo de carcinoma mamário SM1 (FIG. 6B) é inicialmente menos agressivo como um tumor primário, e as mortes parecem ser através de outros mecanismos de doença metastática. No dia 30 de tratamento, os tumores SM1 atingiram um volume médio de aproximadamente 33% menos do que qualquer TS/A ou 4T1. Isso indica uma grande sensibilidade do tumor SM1 a imunoterapia com Nani-P2, em comparação com 4T1, tal que o crescimento do tumor foi suprimido em 100% dos animais por 16 dias, e 40% dos animais permaneceram em remissão até 28 dias após o implante e totalmente uma semana após o término do regime.

[0091]Para determinar se linfócitos T citotóxicos desempenham um papel na rejeição de tumores induzidos por terapia com Nani-P2, um ensaio ELISA de IFN-γ (FIG. 7) foi realizado para comparar células do baço de camundongos portadores de tumor 4T1 tratados sem (controle) ou com Nani-P2 (FIG. 7). Baços foram removidos sob condições estéreis e preparados como descrito em outro lugar (duPre'S. et al. Exp. Mol.. Path 85:174-188, 2008). Resumidamente, baços foram homogeneizados e esplenócitos, como uma rica fonte de células T citolíticas sistêmicas e APCs, foram co-cultivados com células estimuladoras 4T1 tratadas com mitomicina C para induzir respostas imunes de recall. Poços de controle foram cultivados com meio sozinho.

[0092]Concentrações de IFN-γ, um substituto padrão para a ativação de

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 42/64

31/36

CTL, foram quantificadas por ELISA comercial (BD Biosciences). Produção de INF-γ foi significativamente (p <0,01 **) maior em culturas de células do baço retiradas de camundongos BALB/c tratados com Nani-P2 em todas as condições de ensaio. Atividade de IFN-γ em tratados com Nani-P2, mas não nos animais de controle pode ser melhorada com a adição de IL-4 e GM-CSF (p <0,05) sob condições mostradas para promover a diferenciação do DC, e poderíam ser ainda mais ampliadas se os estimuladores de tumor fossem adicionados de volta no início da cultura (índice de estimulação = 53 vs controle, 3S + IL4 + GM-CSF), demonstrando a potência de Nani P2 em sinergia com outros agonistas CTL.

[0093]Para investigar a eficácia de Nani-P2 contra o câncer de mama metastático e estabelecido, as células 4T1 foram injetadas SC na glândula mamária abdominal de camundongos e tratamento foi atrasado até o momento em que os tumores tinham metástase para os pulmões e em média 3,5 milímetros de tamanho (FIG. 8A, dia 13), correspondente a 2,4 centímetros ou tumor de mama humano no estágio T2. Camundongos foram seguidos por crescimento de tumor (Fig. 8a) e metástases pulmonares (Fig. 8B). À necropsia, animais que receberam tratamento com Nani-P2 mostraram uma redução drástica no número de metástases pulmonares visíveis quando comparados com controles (FIG. 9). O número médio de nódulos tumorais grosseiramente visíveis nos pulmões de camundongos tratados IV com Nani-P2 tinha sete anos, comparado com o grupo de controle com PBS, que teve uma média de 35,3 (p <0,01 **). Isto corresponde a uma aparência menos agressiva do tumor primário, bem como metástases de pulmão que foram em média muito menores em tamanho (Fig. 8B).

[0094]Eficácia de Nani-P2 na definição de câncer de mama 4T1 agressivo, pré-estabelecidos é clara e significativamente comprovada comparando a carga tumoral primária em animais tratados por via intravenosa (40 ng IV de Nani-P2) contra os animais de controle (tratados com PBS) (no dia 18 p <0,01 **, FIG. 10).

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 43/64

32/36

Este benefício estatisticamente significativo na supressão do tumor primário (FIG. 10) permaneceu durante toda a duração do ensaio faltando 50 dias (p <0,01 **), embora apenas três doses semanais de PINS foram administradas entre os dias 14 e 28. Além disso 7/10 camundongos demonstraram regressão de tumor com o tratamento inicial de tumor no dia 14. Isso se traduziu em um benefício muito grande para a sobrevivência estatisticamente significativa (p <0,005 **, e ver Fig. 5B). Notavelmente 1/10 animais foram submetidos a uma remissão completa e permaneceram livres da doença em 50 dias altura em que o estudo foi interrompido, suportando a inferência de que este animal foi tornado aparentemente livre de tumor.

EXEMPLO 4

Terapia de dosagem repetida de derivados de Tat e ciclofosfamida [0095]Quatro grupos de 10 camundongos BALB/c foram implantados com 1x10⁴ de células 4T1 SC no bloco de gordura mamário. O tratamento foi iniciado quando diâmetros do tumor chegaram a 4-5 mm, no dia 10. Camundongos de controle foram injetados com PBS IV em intervalos de três dias, enquanto alternando camundongos com tratamento recebendo três doses do fármaco a cada 3 dias na rotação de 10 ciclos por dia. Carga tumoral (tamanho do tumor mm³) foi calculada usando uma fórmula padrão. CY: (ciclofosfamida sozinha) camundongos foram injetados semanalmente IP com 80 mg / kg por camundongo iniciando no dia 10. Cy/Nani-P2: (primeiro ciclofosfamida seguida por Nani-P2) camundongos foram injetados IP primeiro com ciclofosfamida (80 mg / kg) em intervalos de 3 dias para três doses a partir de dia 10 e depois injetados IV com Nani-P2 (40 ng) em intervalos de três dias por três doses em rotação. O ciclo de três doses de CY, seguido de 3 doses de Nani-P2 foi repetido até o dia 50. Nani-P2/CY: (primeiro Nani-P2 seguido por ciclofosfamida): Camundongos foram injetados IV primeiro com Nani-P2 (40 ng) em intervalos de 3 dias para 3 doses, começando no dia 10 e, em seguida, injetados

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 44/64

33/36

i.p. com ciclofosfamida em intervalos de 3 dias em rotação. O ciclo de três doses de Nani-P2, seguido de 3 doses de CY foi repetido até o dia 50.

[0096]A carga tumoral diminuiu no grupo Nani-P2/CY comparado ao grupo CY é altamente significativo (fig. 11, p = 0,003077).

[0097]0 benefício de sobrevivência de tratamento com bolus Nani-P2 alternando com ciclofosfamida versus ciclofosfamida semanal é altamente significativo (FIG. 12, p = 0,0001). O coorte Nani-P2 tem 3/10 camundongos em remissão total e 9/10 camundongos em remissão parcial no dia 50 (não mostrado), enquanto os 10/10 camundongos tratados com ciclofosfamida foram mortos pelo dia 42.

[0098]Salvo indicação em contrário, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, propriedades tais como peso molecular, condições de reação, e assim por diante usados na especificação e reivindicações devem ser entendidos como sendo modificados em todas as instâncias pelo termo cerca de. Assim, salvo indicação em contrário, os parâmetros numéricos estabelecidos na especificação e reivindicações associadas são aproximações que podem variar de acordo com as propriedades desejadas e pretendem ser obtidas pela presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado à luz do número de dígitos significativos relatados e aplicando técnicas de arredondamento comuns. Não obstante o que os intervalos numéricos e parâmetros estabelecendo o amplo escopo da invenção são aproximações, os valores numéricos estabelecidos nos exemplos específicos são relatados de forma tão precisa quanto possível. Qualquer valor numérico, no entanto, inerentemente contém alguns erros que decorrem do desvio-padrão encontrado em seus respectivos testes de medições.

[0099]0s termos o/a e um/uma e referências similares utilizados no

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 45/64

34/36 contexto da descrição da invenção (especialmente no contexto das reivindicações a seguir) devem ser interpretados como cobrindo tanto o singular quanto o plural, salvo indicação em contrário neste documento ou em clara contradição com o contexto. Recitação de intervalos de valores aqui é apenas destinada a servir como um método de taquigrafia para se referir individualmente a cada valor separado caindo dentro do intervalo. Salvo indicação em contrário neste documento, cada valor individual é incorporado na especificação como se fosse recitado individualmente aqui. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada salvo indicação em contrário neste documento ou de outra forma claramente contraditória pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, tal como) contidos neste documento destina-se apenas a iluminar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção de outra forma reivindicada. Nenhuma linguagem na especificação deve ser interpretada como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[00100]Agrupamentos de elementos alternativos ou modalidades da invenção divulgadas neste documento não devem ser interpretados como limitações. Cada membro do grupo pode ser referido e reivindicado individualmente ou em qualquer combinação com outros membros do grupo ou outros elementos encontrados aqui. Prevê-se que um ou mais membros de um grupo podem ser incluídos ou excluídos de um grupo por razões de conveniência e/ou patenteabilidade. Quando qualquer tal inclusão ou exclusão ocorre, a especificação é considerada como contendo o grupo como modificado cumprindo assim a descrição por escrito de todos os grupos Markush utilizados nas reivindicações anexas.

[00101]Certas modalidades da presente invenção são descritas neste documento, incluindo o melhor modo conhecido pelos inventores para a realização

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 46/64

35/36 da invenção. Naturalmente, as variações sobre essas modalidades descritas se tornarão evidentes para os vrsados na técnica ao ler a descrição acima. O inventor espera que versados na técnica empreguem tais variações conforme o caso, e os inventores pretendem que a invenção seja praticada de outra forma do que a especificamente descrita aqui. Assim, a presente invenção inclui todas as modificações e os equivalentes da matéria sujeita recitada nas reivindicações em anexo, conforme permitido pela lei aplicável. Além disso, qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis do mesmo é englobada pela invenção salvo indicação em contrário neste documento ou de outra forma claramente contradita pelo contexto.

[00102]Modalidades específicas divulgadas aqui podem ser adicionalmente limitadas nas reivindicações usando consistindo em ou consistindo essencialmente em linguagem. Quando utilizado nas reivindicações, quer como depositado ou acrescentado por emenda, o termo de transição que consiste em” exclui qualquer elemento, etapa, ou ingrediente não especificado nas reivindicações. O termo de transição “consistindo essencialmente em” limita o escopo de uma reivindicação aos materiais especificado ou etapas e aqueles que não afetam significativamente a característica básica e nova. Modalidades da invenção assim reivindicadas são inerente ou expressamente descritas e habilitadas neste documento.

[00103]Além disso, inúmeras referências têm sido feitas a patentes e publicações impressas por toda esta especificação. Cada uma das referências acima citadas e publicações impressas são individualmente aqui incorporadas por referência em sua totalidade.

[00104]Para finalizar, é preciso entender que as modalidades da invenção aqui divulgadas são ilustrativas dos princípios da presente invenção. Outras modificações que podem ser empregadas estão dentro do escopo da invenção. Assim, a título de exemplo, mas não de limitação, configurações alternativas da

Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 47/64

36/36 presente invenção podem ser utilizadas de acordo com os ensinamentos aqui. Assim, a presente invenção não se limita aquela que é exatamente como mostrada e descrita.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos modificada da proteína trans-ativadora de transcrição (Tat) do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), em que a dita sequência de aminoácidos modificada é selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4.
2. 2. Uso de um polipeptídeo derivado de Tat que compreende uma sequência de aminoácidos modificada da proteína Tat como definida na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo, pela cessação do crescimento do dito câncer ou regressão do dito câncer no indivíduo, ou para reduzir a carga tumoral em um indivíduo, causando a regressão do câncer no dito indivíduo.
3. 3. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo derivado de Tat é formulado para ser administrado em uma pluralidade de doses.
4. 4. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo derivado de Tat é formulado para ser administrado por um ciclo repetitivo, em que em cada ciclo uma pluralidade de doses do dito polipeptídeo derivado de Tat é formulada para ser administrada em um período de tempo definido seguido por um período de descanso, e em que o dito ciclo é repetido uma pluralidade de vezes.
5. 5. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo derivado de Tat é formulado para ser administrado por um ciclo repetitivo, em que em cada ciclo uma pluralidade de doses do dito polipeptídeo derivado de Tat é formulada para ser administrada em um período de tempo definido seguido pela formulação de uma ou de uma pluralidade de doses de um agente terapêutico para ser administrado em um período de tempo definido, e em que o dito

   Petição 870190082465, de 23/08/2019, pág. 49/64

   2/2 ciclo é repetido uma pluralidade de vezes.
6. 6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente terapêutico é ciclofosfamida.
7. 7. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito câncer é câncer de mama.
8. 8. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito câncer é câncer de ovário.
9. 9. Uso, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido polipeptídeo derivado de Tat apresenta a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:3.