JP2021109844A - 癌治療用キット - Google Patents

Abstract

【課題】癌を治療する新たな技術を提供する。【解決手段】Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドを含むワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む、癌治療用キット。【選択図】なし

Description

本発明は、癌治療用キットに関する。

Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）は、受容体型チロシンキナーゼの一種であり、リガンドであるＶＥＧＦの作用発現に関与することが知られている。

これまでに、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するペプチドワクチンが開発されてきた（例えば、特許文献１、２を参照。）。また、これらのペプチドワクチンを癌の治療に応用する研究が行われている。例えば、非特許文献１、２には、マウスグリオーマ細胞ＧＬ２６１細胞株を移植したグリオーマモデルに、グリオーマ腫瘍抗原ペプチドとＶＥＧＦＲペプチドを抗ＰＤ−１抗体と併用して効果が見られたことが記載されている。

特許第４９３１１５４号公報 特許第３９７１７６９号公報

森本 佑紀奈 他，マウスグリオーマモデルを用いた腫瘍抗原／ＶＥＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒワクチンと抗ＰＤ−１抗体併用療法の有効性の検討，第７７回日本脳神経外科学会総会抄録，２０１８年 森本 佑紀奈 他，悪性神経膠腫に対するＶＥＧＦＲ２ ワクチンと抗ＰＤ−１ 抗体併用療法の有効性の検討，第３６回日本脳腫瘍学会学術集会抄録，２０１８年

本発明は、癌を治療する新たな技術を提供することを目的とする。上記非特許文献１、２に記載されているのは２種のペプチドを用いるものであるのに対し、本発明は、より簡便に、様々な腫瘍に効果のあるペプチドワクチンを提供するものである。

本発明は以下の態様を含む。
［１］ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドを含むワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む、癌治療用キット。
［２］前記ワクチン組成物がアジュバントを含む、［１］に記載の癌治療用キット。
［３］前記アジュバントがｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、［２］に記載の癌治療用キット。
［４］前記癌が脳腫瘍である、［１］〜［３］のいずれかに記載の癌治療用キット。

本発明は、悪性度の高いグリオーマモデルを用いて、ＶＥＧＦＲペプチドワクチンのみと抗ＰＤ−１抗体とを併用することにより、更なる顕著な腫瘍縮小、生存期間延長効果を示すことを明らかにしたものであり、本発明によれば、癌を治療する新たな技術を提供することができる。

実験例１及び２の実験スケジュールを示す図である。 実験例１におけるインビボイメージング解析の結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例１における各群のマウスの腫瘍組織切片の代表的な明視野顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例１における各群のマウスの腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。 実験例１における各群のマウスの生存曲線を示すグラフである。 実験例２におけるインビボイメージング解析の結果を示す写真である。 実験例２における各群のマウスの生存曲線を示すグラフである。

［癌治療用キット］
１実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドを含むワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む、癌治療用キットを提供する。実施例において後述するように、発明者らは、本実施形態の癌治療用キットを用いることにより、癌を効果的に治療することができることを明らかにした。

本明細書において、癌の治療効果が奏されるとは、例えば、腫瘍体積の増大が抑制されることであってもよく、腫瘍体積が減少させることであってもよい。あるいは、生存期間が延長することであってもよい。

（ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド）
ＶＥＧＦＲには、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３の３種類に加えて、可溶性ＶＥＧＦＲ（ｓｏｌｕｂｌｅ ＶＥＧＦＲ）として、ｓＶＥＧＦＲ−１、ｓＶＥＧＦＲ−２、ｓＶＥＧＦＲ−３が知られている。これらのうち、ＶＥＧＦＲ−１及びＶＥＧＦＲ−２は、血管内皮細胞に発現し、血管新生において中心的な役割を担っていることが知られている。

ヒトＶＥＧＦＲ−１は、ＦＬＴ１遺伝子にコードされ、１３３８アミノ酸からなる細胞膜タンパク質である。ヒトＶＥＧＦＲ−１タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００２０１０．２等である。ヒトＶＥＧＦＲ−１は、新生血管の増殖に不可欠な血管内皮細胞増殖因子受容体であり、固形腫瘍の腫瘍新生血管内皮細胞で高発現している。

また、ヒトＶＥＧＦＲ−２は、ＫＤＲ遺伝子にコードされ、１３５６アミノ酸からなる細胞膜タンパクである。ヒトＶＥＧＦＲ−２タンパク質のＮＣＢＩアクセッション番号は、ＮＰ＿００２２４４．１等である。ヒトＶＥＧＦＲ−２は、固形腫瘍の腫瘍新生血管内皮細胞で高発現しており、血管内皮細胞の増殖と遊走に関与している。

ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドとしては、ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド等を好適に用いることができる。このようなペプチドとしては、既知のものを用いてもよい。既知のペプチドには、臨床試験によりヒトに投与した場合の安全性が確認されたものが存在する。このようなペプチドは、臨床試験を一部省略することが可能であるため臨床応用しやすい。

ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドの長さは、約４０アミノ酸未満であってもよく、約２０アミノ酸未満であってもよく、約１５アミノ酸未満であってもよい。例えば、ペプチドの長さは８〜１１アミノ酸であってもよく、９アミノ酸であってもよく、１０アミノ酸であってもよい。

ペプチドは、既知の方法により調製することができる。例えば、ペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製してもよいし、化学合成により調製してもよい。また、ペプチドは、ＣＴＬを誘導する活性を有している限り、各種の修飾を有していてもよい。具体的には、例えば、ペプチドに、糖鎖、脂肪酸、ポリアルキレングリコール鎖等が結合されていてもよい。あるいは、ペプチドにＤ体のアミノ酸が含まれていてもよい。あるいは、ペプチドの側鎖が、酸化、リン酸化等の修飾を受けていてもよい。あるいは、ペプチドが、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、塩酸塩等の塩を形成していてもよい。

ところで、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は組織適合性抗原とも呼ばれる膜タンパク質であり、免疫機構において重要な役割を担っている。ＨＬＡには多数の型が存在することが知られている。ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドが効果的に機能するためには、ペプチドが患者のＨＬＡ型と同じ型のＨＬＡに結合性を有する必要がある。

なかでも、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７等のＨＬＡ型を有するヒトは、特に日本人において比較的頻度が高い。したがって、本実施形態の癌治療用キットを日本人に適用する場合には、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドとして、これらのＨＬＡに対する結合性（拘束性）を有するものを用いることが好ましい。

ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加が挙げられる。

ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号２〜４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

ここで、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ−１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号２〜４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリン又はロイシンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加が挙げられる。

ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

ここで、配列番号５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号５〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加が挙げられる。

ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号１１〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。

ここで、配列番号１１〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ−２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号１１〜１６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。

ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリン又はロイシンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１〜２個のアミノ酸の付加が挙げられる。

例えば、配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンに置換したアミノ酸配列（配列番号１６）からなるペプチドは好適な例である。例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによる刺激に誘導されるＣＴＬは、変異前のペプチド（配列番号１２）を認識し、傷害することができることが確認されている。

本実施形態の癌治療用キットにおいて、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドとしては、１種を単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。特に、配列番号１〜１６にアミノ酸配列を示すペプチドは、ＨＬＡ−Ａ＊２４：０２結合性又はＨＬＡ−Ａ＊０２：０１結合性であり、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ−Ａ＊０２：０７への結合性も予想されることから、多くの日本人患者において効果的に機能することができる。

（ワクチン組成物）
本実施形態の癌治療用キットにおいて、ワクチン組成物は、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドと、薬学的に許容される担体とを含む。

ワクチン組成物は、薬学的に許容される担体と混合して、一般的な製薬手法により製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態に製剤化して経口的に投与してもよく、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態に製剤化して非経口的に投与してもよい。皮膚外用剤としては、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。

薬学的に許容される担体としては、アジュバント、注射用溶剤、賦形剤、粘着剤等が挙げられる。アジュバントとしては、ワクチン製剤のアジュバントとして一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、Ｔｏｌｌ様レセプター３（ＴＬＲ３）アゴニストであり、合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｐｏｌｙｉｎｏｓｉｎｉｃ−ｐｏｌｙｃｙｔｉｄｙｌｉｃ ａｃｉｄ、ＣＡＳ番号：２４９３９−０３−５）、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー等の沈降性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン、不完全型フロイントアジュバント、完全型フロイントアジュバント等の油性アジュバント等が挙げられるがこれらに限定されない。ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）はナトリウム塩等の塩であってもよい。

注射用溶剤としては、注射剤に一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられるがこれらに限定されない。注射用溶剤は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。

賦形剤としては、一般的な製剤に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、デンプン、結晶性セルロース等が挙げられるがこれらに限定されない。

粘着剤としては、一般的な貼付剤等に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等が挙げられるがこれらに限定されない。

ワクチン組成物の患者への投与は、例えば、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射等により行うことができ、全身投与であってもよく、目的となる腫瘍の近傍に局所投与してもよい。

また、投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法等により適宜調整することができ、通常成人（体重６０ｋｇ）においては、１回あたり、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇの有効成分（ペプチド）を投与する量が挙げられる。

ペプチドワクチン又はペプチドワクチン組成物の患者への投与回数は、１回であってもよいが、効率的にＣＴＬを誘導するためには複数回投与することが好ましい。複数回投与する場合の投与間隔は、例えば数日から数か月であってもよい。

（免疫チェックポイント阻害剤）
本実施形態の癌治療用キットにおいて、免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体等が挙げられる。抗ＰＤ−１抗体としては、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ等が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、例えば、イピリムマブ等が挙げられる。抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ等が挙げられる。

本実施形態の癌治療用キットにおいて、免疫チェックポイント阻害剤は、抗体等の有効成分と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物として製剤化されていることが好ましい。

免疫チェックポイント阻害剤は、薬学的に許容される担体と混合して、一般的な製薬手法により製剤化することができる。例えば、点滴剤、注射剤、皮膚外用剤等の形態に製剤化して非経口的に投与してもよい。皮膚外用剤としては、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。

薬学的に許容される担体としては、点滴用溶剤、注射用溶剤、粘着剤等が挙げられる。点滴用溶剤、注射用溶剤としては、点滴剤、注射剤に一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられるがこれらに限定されない。点滴用溶剤、注射用溶剤は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。

粘着剤としては、一般的な貼付剤等に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等が挙げられるがこれらに限定されない。

免疫チェックポイント阻害剤の患者への投与は、例えば、点滴静脈注射、静脈注射、皮内投与、皮下投与等により行うことができ、全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。

また、投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法等により適宜調整することができ、通常成人（体重６０ｋｇ）においては、１回あたり、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ〜１０ｍｇの有効成分（ペプチド）を投与する量が挙げられる。

免疫チェックポイント阻害剤の患者への投与回数は、１回であってもよく、複数回であってもよい。複数回投与する場合の投与間隔は、例えば数日から数か月であってもよい。

本実施形態の癌治療用キットを患者に適用する場合、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドを含むワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤とを、同時に投与してもよいし、別々に投与してもよい。

（対象疾患）
本実施形態の癌治療用キットによる治療が有効な癌としては、脳腫瘍、神経線維腫症２型（ＮＦ２）患者に発生する腫瘍、その他の悪性腫瘍等が挙げられる。

脳腫瘍としては、神経膠腫、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、上衣腫、血管芽腫、血管周皮腫、転移性脳腫瘍、髄芽腫、悪性リンパ腫等が挙げられる。

ＮＦ２患者に発生する腫瘍としては、神経鞘腫、髄膜腫、上衣腫、神経膠腫等が挙げられる。神経鞘腫としては、脳神経、脊髄神経、末梢神経に発生する神経鞘腫が挙げられ、より具体的には、前庭神経鞘腫、三叉神経鞘腫等が挙げられる。また、髄膜腫、上衣腫、神経膠腫としては、頭蓋内に生じる腫瘍や脊髄に生じる腫瘍が挙げられる。

その他の悪性腫瘍としては、白血病、乳癌、子宮癌、卵巣癌、食道癌、胃癌、大腸癌、肝癌、膵癌、頭頚部癌、腎癌、肺癌、骨肉腫、前立腺癌、膀胱癌、皮膚癌等の癌が挙げられる。

［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドを含むワクチン組成物の有効量と、免疫チェックポイント阻害剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌の治療方法を提供する。

１実施形態において、本発明は、癌の治療のためのキットを提供し、当該キットは、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、及び、免疫チェックポイント阻害剤を含む。

１実施形態において、本発明は、癌治療用キットを製造するための、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、及び、免疫チェックポイント阻害剤の使用を提供する。

これらの各実施形態において、ＶＥＧＦＲ発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、ワクチン組成物、免疫チェックポイント阻害剤、癌については上述したものと同様である。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（マウスグリオーマモデルを用いた検討）
マウスグリオーマ細胞株であるＧＬ２６１細胞に、フォルティシモ・ルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現するレンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ−ＥＦ−ｆｆＬｕｃ）を感染させた。続いて、セルソーターを用いたクローニングにより、ｆｆＬｕｃを安定に高発現する細胞株（ＧＬ２６１ ｆｆＬｕｃ）を樹立した。

続いて、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの脳（右線条体）にＧＬ２６１ ｆｆＬｕｃ細胞株１．５×１０^５個を定位的に移植し、マウスグリオーマモデルを作製した。続いて、作成したマウスグリオーマモデルを、コントロール群、ワクチン単独投与群、抗ＰＤ−１抗体単独投与群、併用群の４群に分けた。

コントロール群には、アジュバント、及び、抗ＰＤ−１抗体のアイソタイプ抗体を投与した。アジュバントとして、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、アイソタイプ抗体として、ラットＩｇＧ２ａ抗体（抗トリニトロフェノール抗体、クローン２Ａ３、バイオセル社）２００μｇを生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

ワクチン単独投与群には、ワクチン組成物、及び、抗ＰＤ−１抗体のアイソタイプ抗体を投与した。ワクチン組成物として、アミノ酸配列を配列番号１７に示すペプチド１００μｇ、及び、アジュバントとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、アイソタイプ抗体として、ラットＩｇＧ２ａ抗体（抗トリニトロフェノール抗体、クローン２Ａ３、バイオセル社）２００μｇを生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

抗ＰＤ−１抗体単独投与群には、アジュバント、及び、抗ＰＤ−１抗体を投与した。アジュバントとして、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、抗ＰＤ−１抗体として、抗ＰＤ−１抗体（カタログ番号「ＢＥ０１４６」、バイオセル社）を生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

併用群には、ワクチン組成物、及び、抗ＰＤ−１抗体を投与した。ワクチン組成物として、アミノ酸配列を配列番号１７に示すペプチド１００μｇ、及び、アジュバントとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、抗ＰＤ−１抗体として、抗ＰＤ−１抗体（カタログ番号「ＢＥ０１４６」、バイオセル社）を生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

図１は、実験スケジュールを示す図である。アジュバント又はワクチン組成物は、細胞移植から２日後、９日後、１６日後の３回、両側腋窩に投与した。また、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−１抗体のアイソタイプ抗体は、細胞移植から１２日後、１６日後、１９日後の３回、腹腔内投与した。また、細胞移植から２日後、９日後、１６日後、２３日後に、腫瘍のインビボイメージング解析を行った。図１中、黒丸は投与したことを示し、「ＩＶＩＳ」はインビボイメージング解析を行ったことを示す。

図２はインビボイメージング解析の結果を示す写真である。図２中、「ワクチン単独群」はワクチン単独投与群を示し、「抗ＰＤ−１抗体単独群」は抗ＰＤ−１抗体単独投与群を示す。その結果、併用群では、コントロール群、ワクチン単独投与群、抗ＰＤ−１抗体単独投与群と比較して、腫瘍の増大が顕著に抑制されたことが明らかとなった。また、併用治療群の中には、腫瘍が完全に消失したマウスが３匹認められた。

細胞移植から２１日後に、一部のマウスを安楽死させ、還流固定し断頭した後、腫瘍体積を測定した。図３（ａ）は、各群のマウスの腫瘍組織切片の代表的な明視野顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真である。図３（ａ）中、「ワクチン単独群」はワクチン単独投与群を示し、「抗ＰＤ−１抗体単独群」は抗ＰＤ−１抗体単独投与群を示し、「Ｖｅｎｕｓ」は蛍光顕微鏡でＶｅｎｕｓの蛍光を観察した結果を示す。ＧＬ２６１ ｆｆＬｕｃ細胞には、蛍光タンパク質であるＶｅｎｕｓが遺伝子導入されている。このため、蛍光顕微鏡を用いてＶｅｎｕｓの蛍光を検出することにより、腫瘍体積を定量的に解析することができる。

図３（ｂ）は、腫瘍体積の測定結果を示すグラフである。図３（ｂ）中、「ワクチン単独群」はワクチン単独投与群を示し、「抗ＰＤ−１抗体単独群」は抗ＰＤ−１抗体単独投与群を示す。その結果、コントロール群の腫瘍体積は、７３．３５±３７．３３ｍｍ^３であった。また、ワクチン単独投与群の腫瘍体積は、３５．６２±２６．２４ｍｍ^３であった。また、抗ＰＤ−１抗体単独投与群の腫瘍体積は、３８．３１±２０．８５ｍｍ^３であった。また、併用群の腫瘍体積は、１１．５５±２１．１３ｍｍ^３であった。スチューデントのｔ検定を行った結果、コントロール群と併用群との間で、有意差（ｐ＝０．０１９）が認められた。

図４は、各群のマウスの生存曲線を示すグラフである。図４中、「ワクチン単独群」はワクチン単独投与群を示し、「抗ＰＤ−１抗体単独群」は抗ＰＤ−１抗体単独投与群を示す。その結果、併用群では、コントロール群、ワクチン単独投与群、抗ＰＤ−１抗体単独投与群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた。

［実験例２］
（マウスグリオーマ幹細胞モデルを用いた検討）
より悪性度が高いマウスグリオーマ幹細胞モデルを用いて実験例１と同様の検討を行った。マウスグリオーマ幹細胞モデルは、最も治療困難なモデルである。

まず、マウスグリオーマ幹細胞株であるＴＳＧ細胞に、フォルティシモ・ルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）を発現するレンチウイルスベクター（ＣＳＩＩ−ＥＦ−ｆｆＬｕｃ）を感染させた。続いて、セルソーターを用いたクローニングにより、ｆｆＬｕｃを安定に高発現する細胞株（ＴＳＧ ｆｆＬｕｃ）を樹立した。

続いて、６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの脳（右線条体）にＴＳＧ ｆｆＬｕｃ細胞株１．５×１０^５個を定位的に移植し、マウスグリオーマ幹細胞モデルを作製した。続いて、作成したマウスグリオーマ幹細胞モデルを、コントロール群、ワクチン単独投与群、抗ＰＤ−１抗体単独投与群、併用群の４群に分けた。

コントロール群には、実験例１と同様にして、アジュバント、及び、抗ＰＤ−１抗体のアイソタイプ抗体を投与した。アジュバントとして、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、アイソタイプ抗体として、ラットＩｇＧ２ａ抗体（抗トリニトロフェノール抗体、クローン２Ａ３、バイオセル社）２００μｇを生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

ワクチン単独投与群には、実験例１と同様にして、ワクチン組成物、及び、抗ＰＤ−１抗体のアイソタイプ抗体を投与した。ワクチン組成物として、アミノ酸配列を配列番号１７に示すペプチド１００μｇ、及び、アジュバントとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、アイソタイプ抗体として、ラットＩｇＧ２ａ抗体（抗トリニトロフェノール抗体、クローン２Ａ３、バイオセル社）２００μｇを生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

抗ＰＤ−１抗体単独投与群には、実験例１と同様にして、アジュバント、及び、抗ＰＤ−１抗体を投与した。アジュバントとして、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、抗ＰＤ−１抗体として、抗ＰＤ−１抗体（カタログ番号「ＢＥ０１４６」、バイオセル社）を生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

併用群には、実験例１と同様にして、ワクチン組成物、及び、抗ＰＤ−１抗体を投与した。ワクチン組成物として、アミノ酸配列を配列番号１７に示すペプチド１００μｇ、及び、アジュバントとしてｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（カタログ番号「Ｐ１５３０」、シグマ社）１００μｇを生理食塩水に混合し１００μＬとしたものを使用した。また、抗ＰＤ−１抗体として、抗ＰＤ−１抗体（カタログ番号「ＢＥ０１４６」、バイオセル社）を生理食塩水で希釈し２００μＬとしたものを使用した。

実験スケジュールは、実験例１と同様であり、図１に示す通りであった。アジュバント又はワクチン組成物は、細胞移植から２日後、９日後、１６日後の３回、両側腋窩に投与した。また、抗ＰＤ−１抗体又は抗ＰＤ−１抗体のアイソタイプ抗体は、細胞移植から１２日後、１６日後、１９日後の３回、腹腔内投与した。また、細胞移植から２日後、９日後、１６日後、２３日後、３０日後に、腫瘍のインビボイメージング解析を行った。

図５はインビボイメージング解析の結果を示す写真である。その結果、実験例１のマウスグリオーマモデルと同様に、マウスグリオーマ幹細胞モデルにおいても、併用群では、コントロール群、ワクチン単独投与群、抗ＰＤ−１抗体単独投与群と比較して、腫瘍の増大が顕著に抑制されたことが明らかとなった。また、併用治療群の中には、腫瘍が完全に消失したマウスが２匹認められた。

図６は、各群のマウスの生存曲線を示すグラフである。その結果、併用群では、コントロール群、ワクチン単独投与群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた。

本発明によれば、癌を治療する新たな技術を提供することができる。

Claims (4)

1. Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導するペプチドを含むワクチン組成物と、免疫チェックポイント阻害剤とを含む、癌治療用キット。
2. 前記ワクチン組成物がアジュバントを含む、請求項１に記載の癌治療用キット。
3. 前記アジュバントがｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）である、請求項２に記載の癌治療用キット。
4. 前記癌が脳腫瘍である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の癌治療用キット。

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