CN102405057A - 用免疫刺激性Hiv Tat衍生物多肽治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了通过施用经修饰的人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式活化因子(Tat)多肽来治疗癌症的方法，所述经修饰的Tat多肽具有与未经修饰的Tat多肽相比提高的免疫刺激性质。

Description

用免疫刺激性Hiv Tat衍生物多肽治疗癌症
与相关申请的交叉引用
本申请基于35USC§119(e)要求2009年3月23日提交的美国临时专利申请号61/162,605，2010年2月19日提交的美国临时专利申请号61/306,278，和2010年3月3日提交的美国临时专利申请号61/310,221的权益。这些申请中每一份的全部内容通过引用被并入本文。 
发明领域
本发明涉及基于免疫的癌症治疗剂领域。 
背景
人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式活化因子(Tat)是长度为86到110个氨基酸的可变RNA结合肽，其被编码于HIV基因组的两个分开的外显子上。Tat在所有人慢病毒之间是高度保守的，并且是病毒复制所必需的。慢病毒Tat与TAR(反式活化相应的)RNA区结合时，转录(病毒RNA到DNA随后到信使RNA的转化)水平显著提高。已经证实Tat提高病毒RNA转录，已经提出Tat可在T4细胞和巨噬细胞中引起细胞凋亡(编程性细胞死亡)(针对HIV感染的机体免疫监督系统的关键部分)，并且可能刺激α干扰素的过量生产(α-干扰素是一种公认的免疫抑制性细胞因子)。 
HIV感染过程早期的细胞外Tat存在可降低患者的免疫应答，给予病毒超过宿主的优点。另外，T4细胞的直接破坏和α-干扰素生产的诱导能够帮助解释在获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者中观察到的强烈细胞免疫应答的缺失，以及说明初始时深刻的免疫抑制。 
然而，从HIV-感染的长期无进展者(LTNP)中分离的Tat蛋白质与AIDS患者中存在的C-Tat不同。在LTNP中发现的Tat蛋白质能够反式活 化病毒RNA，然而，LTNP Tat(在下文中称作IS-Tat，表示免疫刺激性Tat)不在T4细胞或巨噬细胞中诱导细胞凋亡，并且不是免疫抑制性的。另外，用分离自LTNP的HIV离体感染的T4细胞(此类细胞系被称作TatTcL)能够导致IS-Tat蛋白质的过表达，通常达到其它病毒蛋白质的虚拟排斥(virtual exclusion)，所述其它病毒蛋白质是强有力地促进生长的，而不是原-细胞凋亡的(pro-apoptotic)。从这些Tat TcL中克隆的Tat基因揭示了位于氨基端和第二外显子第一部分内的两个Tat区中的序列变异。这些令人惊讶的发现能够帮助解释为何被HIV感染的LTNP T4细胞不会以在发展成AIDS的被HIV感染的个体中所观察的惊人速率相继死亡。 
另外，慢病毒中发现了下述Tat变体，所述变体感染猴物种，但是不导致免疫缺陷和流行性感染的发生。这些变体Tat蛋白质指导单核细胞分化成刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的树状突细胞(DC)。这些猿猴Tat变体和并非免疫抑制性的其它Tat变体已被称作减毒的或免疫刺激性的Tat(IS-Tat)。 
基于使用长期CD4+Tat T细胞系的观察、临床观察和动物实验，减毒的Tat(更特定地IS-Tat，或者已被化学或物理改变的Tat蛋白质)可作为免疫刺激剂作用，激活T4细胞，诱导它们的增殖。该原理可帮助解释在LTNP中观察到的稳定T4水平。另外，与其它活性疫苗(例如但不限于其他病毒、细菌、立克次氏体和癌细胞的疫苗)联合施用时，减毒的Tat可用作佐剂。 
癌症和慢性感染是对基于免疫的治疗应答的常见人疾病的最突出的例子。尽管感染是要通过免疫来控制的首要疾病，但是临床人试验确定免疫应答，尤其是免疫系统的CTL臂的免疫应答，能够使一些人黑色素瘤和肾癌消退。这些观察结果被下述发现扩展：一类特别的抗原呈递细胞(APC)DC尤其有效地引起针对癌症和其它疾病的CTL活性。靶向和活化DC的技术已经导致针对由人乳头状瘤病毒(HPV)感染引起的人脊椎前恶性肿瘤(cervical pre-malignancies)和人肺癌的一些早期成功。与目前针对癌症使用的化学治疗药物相反，激发针对癌症的CTL应答的药剂由于免疫应答的巨大特异性而伴随着极少的副作用。 
开发治疗癌症的免疫治疗药物的努力被下述方面的技术困难阻碍：靶向和活化DC，从而将所需的进入信号递送并维持至CTL。诱导CTL应答的抗原靶向作用在下述范围内是一种挑战：天然加工需要抗原进入细胞的细胞质，从而结合免疫系统的主要组织相容性复合物(MHC)I类抗原，这是CTL活化的必要条件，因为活化CTL上T细胞受体的配体是抗原和MHC I类的复合物。在几乎所有情况下，蛋白质抗原，甚至在它们与DC辅助活化因子偶联时，排他地进入替代性的MHC II类抗原呈递途径，所述途径排除CTL刺激。这可以部分通过基于肽的技术来克服，因为肽结合已经位于DC表面上的MHC I类。然而，该技术是非特异性的，并且大部分肽是较差的DC活化因子，这限制了它们作为人癌症治疗的功效。 
已知一组有限的生物学蛋白质刺激CTL应答。人免疫缺陷病毒1(HIV-1)转录反式活化因子(Tat)的变体和衍生物能够刺激该CTL应答。目前已知直接引发CTL应答的其它生物制品以热休克蛋白(HSP)为基础，或者以某些细菌的外壳蛋白为基础。在与HPV感染相关的某些生殖器新生物的治疗中，热休克蛋白显示有限的功效。 
乳腺癌是全世界女性中癌症相关死亡的主因之一。全世界每年约发生一百万新的乳腺癌病例，导致死亡370,000人。每年在美国诊断出大于200,000的浸润性乳腺癌病例，约45,000人的死亡归因于该疾病，使得乳腺癌成为美国女性癌症死亡率的第二主因，以及总癌症死亡的第五主因。在乳腺癌发病率的稳定降低后，从广泛的浸润性(第4阶段)疾病诊断时起的平均乳腺癌存活在过去二十年间没有改变过。从1988年起，第4阶段乳腺癌的五年存活率保持在约20％，表明更新药剂的存活优点已经完成了它们对于末期阶段疾病的历程。 
在过去四十年间，在辅助设置(adjuvant setting)中对乳腺癌的治疗经历了显著的改进。除了更好的肿瘤切除术、放射疗法、标准化学疗法和激素代替疗法以外，出现了具有不同溶瘤细胞机制的新种类疗法，例如Taxol
Figure BPA00001443222300031
和Herceptin
Figure BPA00001443222300032
。Herceptin是这些药剂中的最后一个，在2003年被引进。从2007年起其未在患者中显著扩展。另外，Herceptin
Figure BPA00001443222300034
的功效仅限于20％患有乳腺癌的女性，这些女性最显著地过表达Her2/neu癌基因。因此 需要新的、更闭塞的药剂来抗争和预防乳腺癌。 
在为了改进许多癌症管理的研究下，免疫疗法是一种定向的机制，其能够控制肿瘤生长并预防转移，同时避免与标准疗法相关的许多副作用。在乳腺癌是过多地影响育龄年轻女性的疾病这一情况下，后一考虑尤其重要。早期乳腺癌免疫疗法研究着重于通过施用针对乳腺癌抗原的疫苗或单克隆抗体使天然免疫应答靶向抵抗癌细胞的方式。虽然这一途径由于乳腺癌是肿瘤特异性蛋白质(例如哺乳抗原乳腺球蛋白A和乳黏着蛋白及其它)的丰富来源而很好理解，但是其证实在很大程度上是不成功的，因为与溶细胞性T细胞活化相反，抗体显示在大部分设置下控制实体瘤生长的功用有限。 
下一代乳腺癌免疫疗法着重于增强患者现有的抗乳腺癌免疫应答的方式，以免疫抑制也限制肿瘤靶向策略功效的理论为基础。一种此类免疫疗法是针对CTLA4的单克隆抗体，所述CTLA4是涉及抑制的溶细胞性T细胞上的受体。尽管证实了抵抗黑色素瘤和卵巢癌的一些承诺，但是抗-CTLA4已经证实在乳腺癌动物模型(包括本文报道的研究中使用的乳腺癌动物模型)中作为独立药剂是无效的。在癌症中评价的第二类免疫刺激剂——toll样受体(TLR)激动剂通过起始新的触发信号从源自单核细胞的树突状细胞进入免疫系统而发挥作用。这些药剂迄今为止已经证实在大部分实体癌症(包括乳腺癌)中功用有限，部分是因为它们迅速诱导伴随着T细胞活化的免疫抑制。 
人免疫缺陷病毒感染引发递增的免疫抑制，所述免疫抑制在缺乏治疗时通常发展成AIDS，之后导致受感染的个体死亡。因为免疫抑制涉及多种实体癌症进展(包括乳腺癌)模型，所以下述事实并不令人惊讶：受HIV感染的人处于对多种恶性肿瘤、特别是非-Hodgkin淋巴瘤(NHL)、Kaposi肉瘤(KS)和浸润性宫颈癌的提高的风险下，所述恶性肿瘤是受HIV感染个人中定义AIDS的癌症。与之矛盾的是，至少三类已报道在患有进行性HIV疾病的女性中对浸润性乳腺癌具有降低的风险。与法国的一般人群相比时，受HIV感染的女性具有递减的乳腺癌相对风险(RR)的统计学显著性模式。在坦桑尼亚的AIDS流行后，第二组发现在男性以及 女性中乳腺癌发病率的统计学显著性降低。第三，分析了8500例进行性HIV疾病的美国财团(US consortium)报道了统计学显著的降低的乳腺癌发生风险(p＜0.05)，所述风险在实现病毒复制控制时恢复至基线。 
发明内容
本文公开了用作癌症免疫治疗剂的人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式活化因子(Tat)蛋白质的衍生物。 
在一个实施方案中，提供了包含人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式活化因子(Tat)蛋白质的经修饰的氨基酸序列的药物组合物，其中所述经修饰的氨基酸序列与选自下组的氨基酸序列具有大于85％的序列同源性，所述组由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成。在另一实施方案中，组合物包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。 
在一个实施方案中，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的Tat衍生物多肽；和在受试者中导致癌症生长的停止或癌症的消退。 
在另一个实施方案中，提供了降低肿瘤负担的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的Tat衍生物；和在受试者中导致癌症的消退。 
在另一实施方案中，Tat衍生物多肽以多次剂量被施用。 
在又一实施方案中，施用步骤包括重复性施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中施用多次剂量的Tat衍生物多肽，之后是休息时间段，并且其中所述循环被重复多次。在另一实施方案中，施用步骤包括重复性施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中施用多次剂量的Tat衍生物多肽，之后在确定的时间段中施用一次或多次剂量的治疗剂，并且其中所述循环被重复多次。 
在另一实施方案中，治疗剂是环磷酰胺。 
在又一实施方案中，癌症是乳腺癌。在另一实施方案中，癌症是卵巢癌。 
在另一实施方案中，Tat衍生物多肽与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至 少85％同源。 
附图概述
图1描述了用Tat衍生物对人单核细胞的刺激。 
图2描述了用Tat衍生物刺激人单核细胞的剂量应答曲线。 
图3描述了Tat衍生物对体外4T1肿瘤生长的疗效。在注射肿瘤细胞后第0、7、14和21天用Nani-P1或Nani-P2(400ng，皮下[SC])(图3A)或Nani-P3(400ng或2μg，SC)(图3B)处理注射了1x104 4T1肿瘤细胞的BALB/c小鼠。对照组用PBS处理。数据表示平均肿瘤体积；误差棒±SE。每组含有10只小鼠。从第15天起，对照组和用Nani-P1或Nani-P2处理的组之间的差异显著(p＜0.05**)。从第22天开始，对照和Nani-P1或Nani-P2之间的差异高度显著(p＜0.01**)。Nani-P3(任一剂量)和对照之间无差异。 
图4描述了经纯化的Nani-P2对体内4T1乳腺肿瘤生长影响的剂量应答曲线。对每组十只BALB/c小鼠的四组植入1x104 4T1细胞。三组被分别给予每只小鼠0.4ng、4ng和40ng的递增剂量，21天众在左侧肋腹给予四次。第四组对照组在左侧肋腹注射PBS。数据表示平均肿瘤体积。对照组和0.4ng剂量之间的差异是显著的(p＜0.5*)，对照组和4ng或40ngNani-P2处理组之间的差异是高度显著的(p＜0.1**，p＜0.01**)。 
图5描述了用Nani-P2处理带有4T1乳腺肿瘤的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。第0天在乳垫(mammary pad)中对小鼠SC注射1x104 4T1细胞。第0天用SC施用的四次剂量的Nani-P2(40ng)开始处理。第42天，处理组具有超过对照的统计学显著更好的存活(**)(图5A)。在一组中，治疗被展示至第13天，此时一系列三次剂量的Nani-P2(40ng)被每周静脉内(IV)施用、SC施用进引流淋巴结中或瘤内(IT)施用(图5B)。第47天IV Nani-P2的存活益处(survival benefit)是高度统计学显著的(**)，同时SC Nani-P2的存活益处也是统计学显著的(*)。 
图6描述了TS/A和SM1乳腺癌模型中Nani-P2的抗肿瘤活性。对小鼠SC植入1x105TS/A乳腺癌细胞(图6A)，并用递增剂量的SC Nani-P2 (0.4、4和40ng)处理。即使在最低剂量时，主要的抗癌差异也是高度显著的(p＜0.01**)，同时40ng剂量也是高度显著的(p＜0.01***)。图6B描述了SC植入2x105 SM1乳腺癌细胞并在第0、7、14和21天用Nani-P2(40ng)SC处理的小鼠。对照和用Nani-P2处理的SM1动物之间的原发性肿瘤生长差异是高度统计学显著的(p＜0.01***)。 
图7描述了来自带有4T1乳腺肿瘤的小鼠脾细胞的INF-γ生产。对Balb/c小鼠SC注射1x104 4T1细胞。对照动物每周接受PBS注射，而Nani-P2处理包括每周一次的SC注射(40ng)，从第0天开始持续4周。第33天当对照小鼠处于末期时，将小鼠处死，收获脾并作为单细胞悬浮液冷冻，直至测定时。将经脾细胞(2x105)和1x104丝裂霉素C-处理(50μg/ml，30分钟)的4T1刺激剂细胞(S)涂布在96孔平板中。刺激72小时后，收集上清液，使用商业IFN-γELISA试剂盒测定IFN-γ浓度。在体外培养物的所有条件下，来自经Nani-P2-处理的小鼠的脾细胞培养物中IFN-γ生产显著(p＜0.05*)更高。1：无再刺激；2：IL-4(50ng/ml)/GM-CSF(100mg/ml)；3：刺激剂细胞/IL-4/GM-CSF；4：仅刺激剂细胞。体外激动剂IL-4和GM-CSF(2和3)的添加诱导了高度显著的IFN-γ生产提高(p＜0.01**)。 
图8描述了Nani-P2处理使确立的4T1乳腺肿瘤消退并抑制肺转移。在图8A中，第0天对两组10BALB/c小鼠在乳垫中注射1x1044T1细胞。一组用Nani-P2(40ng)每周给药，从第14天开始持续三周。第二组用PBS处理并用作对照。第22天时肿瘤负担高度显著，并且在试验的持续时间中始终保持如此(p＜0.01**)。肿瘤直径达到15mm时处死小鼠，此时计数肺转移灶(图8B)。数据表示由对处理流程不知情的两个观察者定量的总肺转移灶(p＜0.01**)。图8C描述存活。 
图9描述了BALB/c小鼠中的4T1肿瘤生长和肺转移。对两组10BALB/c小鼠皮下(SC)植入1×104 4T1细胞，或用40ng Nani-P2或PBSIV注射小鼠。在处理的第28天，杀死小鼠，取出肺和肿瘤，并用眼计数肿瘤结节。展示了代表10只小鼠的肿瘤和肺的图片。可以在肺表面上观察到发白的肿瘤损伤。三次实验得到相似的结果。 
图10描述了Nani-P2处理诱导的确立的4T1乳腺肿瘤的消退。10只小鼠中的一只经历了完全消退并且保持无疾病超过50天，此时研究结束。第0天在乳垫中对两组10BALB/c小鼠注射1x104 4T1细胞。一组每周IV进行每只小鼠Nani-P2(40ng)的给药，从第14天开始持续3周，另一组用PBS处理并且用作对照。对照和Nani-P2-处理组之间原发性肿瘤生长的差异是高度显著的(p＜0.01**)。 
图11描述了用重复的剂量的Nani-P2和环磷酰胺治疗后的肿瘤生长。 
图12描述了重复的剂量的Nani-P2和环磷酰胺的存活益处，这是与每周环磷酰胺的存活益处相比而言的。 
发明详述
设计了在乳腺癌动物模型中有高度活性的一系列人工人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式活化因子(Tat)肽衍生物。所述分子在本文中被称作Tat衍生物或“精确免疫刺激剂”(PINS)，并且包括下述Tat分子：所述分子缺失了有助于HIV介导的免疫抑制的元件。这些衍生物之一——Nani-P2引起确立的转移性乳腺癌疾病的消退。在本文中报道的剂量下，高度纯化(＞95％纯)的衍生物的皮下或静脉内施用不伴随显著的毒性。 
尽管具有相对丰富的肿瘤特异性抗原，但是乳腺癌已被证实是一种困难的免疫疗法靶标。已积累了多个下述证据：乳腺癌和其它癌症对免疫疗法的不应状态可能源自与确立的癌症相关的免疫抑制。至少三种独立的流行病学研究显示，患有HIV感染甚至获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的女性被矛盾地保护免于发生乳腺癌，甚至在免疫缺陷显著的晚期疾病中也是如此。 
基于分子分析，Tat蛋白(SEQ ID NO：1)编码四种不同的相联系的肽活性。本文公开的内容描述了以增强多肽的免疫治疗潜能的方式，至少在第一个肽或氨基肽上衍生自规范的HIV-1Tat结构的多肽组合物。Tat的氨基端部分包括来自核转录因子(TF)的短肽区，其侧翼典型地是脯氨酸残基。该区域至少部分决定了Tat多肽对免疫系统细胞、尤其是先天免疫细胞例如树状突细胞(DC)和巨噬细胞(抗原呈递细胞或APC)如何具有 刺激性或抑制性。因此，预测对TF区的修饰能够使多肽在癌症和其它慢性疾病的治疗中更有活性。 
HIV-1Tat蛋白质(SEQ ID NO：1)MEPVDPRLEPWKHPGSQPKTACTTCYCKKCCFHCQVCFTKKALGISYGRKKRRQRRRAPEDSQTHQVSPPKQPAPQFRGDPTGPKESKKKVERETETHPVD 
计算机分析发现，HIV-1Tat编码与另一TF蛋白质hairless(hr)中存在的序列相同的短SH3结合结构域，所述hairless(hr)先前显示在小鼠中具有免疫抑制性质。带有hr突变的小鼠发生免疫失调，目前最常被称作“TH1到TH2的移位”，这是被HIV感染的个体发展成为AIDS的必要条件。进一步的分析确定，源自hr基因的SH3结合序列是从HIV-1分离的Tat的几乎不变的特征，以及HIV-2的非常一致的特征。被HIV-1或HIV-2感染的个体只有在极少的情况下才不发展成AIDS。 
相反，被与HIV密切相关的一种慢病毒——猴免疫缺陷病毒(SIV)的某些毒株感染的灵长动物很少发展成AIDS或者，或者出乎意料地发展成AIDS。该观察结果与免疫抑制性HIV-1Tat中推定为免疫抑制性的hrTF片段的发现结合，表明一些灵长动物会在SIV Tat的氨基端具有不同的(或不具有)TF片段。来自某些具有衰减的免疫缺陷过程的被SIV感染的乌黑白眉猴的Tat在其氨基端具有来自TF TARA而不是TF hr的片段。TARA与涉及某些癌基因活化的GTPase活化因子rho家族相关。 
在三种不同的被广泛接受的小鼠乳腺癌模型：4T1、SM1和TS/A中用重组生产的Tat蛋白质衍生物进行的动物试验提供了下述支持：这些Tat衍生物在小鼠中抑制原发性乳腺癌生长是有活性的。另外，最有活性的衍生物Nani-P2显著地抑制了自发性4T1肺转移的发生，并且与对照小鼠相比提高了存活。显著地，用Tat衍生物治疗小鼠乳腺癌伴随着提高的IFN-γ生产水平。在研究中，通过原发性肿瘤生长、存活和与PBS处理的对照相比时转移性肺负担的降低来评价时，在开始治疗之前十四天播种4T1乳腺癌时，Tat衍生物与在肿瘤植入时给予的情况同等有效。 
合成的Tat衍生物对APC是免疫刺激性的，具有针对三种广泛使用的小鼠乳腺癌模型中原发性癌症以及确立的癌症的巨大活性。特别地，衍生 物之一——Nani-P2对侵略性的Her2(-)4T1乳腺癌模型中的原发性肿瘤生长、肺转移灶形成和存活产生剂量依赖型和途径依赖型的影响。下述事实并不令人惊讶：减少的肺转移与被改进的存活相关，因为肺转移是晚期乳腺癌死亡率的主要原因。重要的是，用Nani-P2蛋白质静脉内治疗的带有确立的4T1乳腺肿瘤的小鼠具有高度显著的肿瘤生长抑制和扩展至最后一次给药后至少36天的存活益处。在有限的情况下，明显观察到完全缓解，这在侵略性较小(SM1)和/或多少更加致免疫(TS/A)的乳腺肿瘤中更加频繁。在下述情况下肿瘤植入后延迟Nani-P2的施用对4T1肿瘤生长抑制几乎没有负面影响：肿瘤细胞注射后第0天开始的疗法(SC)将肿瘤负担平均缩小53％，而在第13天(此时肿瘤生长已经达到平均直径约5mm)开始的SC疗法的最大效果是将肿瘤负担平均降低52％。总而言之，这些观察结果表明Nani-P2能够在人中有利地影响晚期和Her2(-)人乳腺癌。 
另外，本文公开的Tat衍生物包含全人序列。在施用了大于三剂的小鼠中观察到针对Tat衍生物的逐步快速耐受(数据未显示)，这可主要归因于宿主发生了抑制性抗衍生物抗体应答。因为人的这类抗体应答能够阻断DC活化从而可观地减少HIV复制，所以其显然不能容易地在人中建立，使得至少归因于基于抗体的机制的类似程度的快速耐受更不可能在人疗法中运作。 
本文报道的研究使用通过IV或SC任一给予的每周约三剂或四剂Tat衍生物的流程，其中IV施用证实对于提高存活和降低转移最为有效。在给予了这些组合物的超过250只的小鼠中未观察到毒性。与4-8gm/kg为标准疗法的Herceptin的剂量应答曲线相比，乳腺癌对Tat衍生物的灵敏度有利地与之相反。估计Tat衍生物在人中具有多达小鼠中100倍的生物活性，表明与进一步更低的毒性风险相关的进一步更低的剂量可能证实是成功的。 
本文中确定了Tat衍生物活化抗癌T细胞免疫应答的INF-γ臂(图5)。由来自用Nani-P2处理的小鼠脾细胞分泌的INF-γ的基线水平是来自用PBS处理的对照小鼠的8倍高。可以通过先天的免疫激动剂GM-CSF和 IL-4体外额外地增强(高达53倍)应答体内Tat衍生物处理的INF-γ分泌，尽管来自对照小鼠的脾细胞甚至在尝试用高剂量的GM-CSF和/或IL4共同刺激后仍保持被抑制。 
尽管所公开的Tat衍生物在晚期和早期小鼠乳腺癌中均具有“独立”功效的反抑制剂，但是这些观察结果还支持了下述展望：Tat衍生物能够与目前处于临床开发中的其它反抑制性抗癌疗法协同作用，所述其它反抑制性抗癌剂疗法可能在面对晚期肿瘤负担和伴随的严重免疫抑制时具有有限的效果。 
一种更致免疫的乳腺癌模型(SM1)和/或具有免疫优势表位的一种乳腺肿瘤(TS/A)在Tat衍生物疗法后具有相对高的消退率，而“非致免疫”的4T1模型更加难治。这与下述模型相一致：免疫抑制是乳腺癌发展中的主要因素，事实上可有助于乳腺癌侵袭。该模型得到下述观察结果的支持：4T1以高水平表达若干常见的乳腺癌抗原，包括乳黏着蛋白和雌激素结合蛋白，在没有Tat衍生物诱导的反抑制时针对所述高水平表达的免疫应答显然被完全抑制。总而言之，这些观察结果提出下述可能性：Tat衍生物与一种或若干种常见的人乳腺癌抗原一起被施用给健康的有风险女性时，能够最终被发展成预防性的抗乳腺癌疫苗。 
在另外一些实施方案中，本文公开了Tat衍生物的经保守修饰的变体。本文所述的变体维持亲本分子或来源分子的生物活性。 
在本文中使用时，术语“经保守修饰的变体”是指与原始肽具有相同或相似生物活性的变体肽。例如，可以制造保守的氨基酸改变，所述改变尽管改变了蛋白质或肽的一级序列，但是不改变蛋白质或肽的功能。保守的氨基酸取代典型地包括以下组中的取代：甘氨酸和丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸；天冬氨酸和谷氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸和苏氨酸；赖氨酸和精氨酸；苯丙氨酸和酪氨酸。 
(通常不改变一级序列的)修饰包括多肽的体内或体外化学衍生化，例如乙酰化或羧基化。还包括在内的是糖基化修饰，例如如下进行：在多肽合成和加工或其它加工步骤中修饰多肽的糖基化模式；将多肽暴露于影响糖基化的酶，例如哺乳动物糖基化酶或去糖基化酶。还包括在内的是具 有磷酸化的氨基酸残基例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸的序列。 
本发明还包括已使用常规分子生物学技术修饰从而改进它们对蛋白水解降解的抗性或优化其溶解度性质的多肽。此类多肽的类似物包括含有除天然存在的L-氨基酸之外的残基(例如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸)的多肽。本文公开的多肽不限于本文所列的任何特定示例性方法的产物。 
除了基本全长的多肽以外，本公开还提供了多肽的生物活性片段。 
在本文中使用时，基本相同的氨基酸序列典型地共享大于95％的氨基酸同一性。然而，公认作为剪接变体出现的或者通过保守氨基酸取代(或简并密码子取代)被修饰的、含有小于上述同源性水平的蛋白质(和编码此类蛋白质的DNA或mRNA)被认为在本公开的范围内。如本领域技术人员容易公认的，已经设计出多种方式来比对序列进行比较，例如Henikoffand Henikoff在Proc.Natl.Acad Sci.USA 89：10915(1992)中描述的Blosum 62评分矩阵。为了该目的而便利使用的算法是可广泛获得的(见例如Needleman and Wunsch in J.Mol.Bio.48：443(1970))。 
因此，本文公开了与SEQ ID NOs.1-4中公开的Tat衍生物85％、90％、95％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。 
以下的表达体系适用于表达所公开的Tat衍生物：哺乳动物细胞表达体系，例如但不限于，昆虫细胞表达体系，例如但不限于，Bac-to-Bac表达体系，杆状病毒表达体系，和DES表达体系；和E.coli表达体系，包括但不限于pET、pSUMO和GST表达体系。在另一实施方案中，Tat衍生物与可用于分离多肽的6-His标签一起表达。6-His标签纯化系统是本领域常规技术人员已知的。 
“治疗有效量”旨在表示定量实现疗效所需要的量。 
本文公开的Tat衍生物是在多种类型癌症中有用的免疫刺激性多肽。在一个实施方案中，Tat衍生物可用于治疗一类癌症，包括但不限于乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、骨髓瘤、结肠直肠癌、直肠癌、淋巴瘤和结肠癌。 
在另一实施方案中，癌症是乳腺癌。在又一实施方案中，癌症是卵巢癌。 
本公开还涉及包含上述Tat衍生物多肽的药物组合物。所公开的药物组合物的剂量和期望地药物浓度可根据展望的具体用途而变化。适当剂量或施用途径的决定完全在常规医生的技术范围内。动物实验提供了测定用于人治疗的有效剂量测定的可靠指导。可以按照Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi et al，Eds.，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96中Mardenti，J.and Chappell，W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”制定的原则进行有效剂量的物种间缩放。在一个实施方案中，存在疾病。在另一实施方案中，细胞或个体的生命由于本文所述的方法而被延长。 
可以根据具体应用的需要配制上述Tat衍生物多肽，来施用给哺乳动物(包括人)，而不需要过多的实验。另外，可以使用标准剂量-应答流程确定组合物的适当剂量，而不需要过多地实验。 
因此，可以通过本领域公知的手段，例如使用惰性稀释剂或使用药物可接受的载体，来制造被设计为用于口、鼻、舌、舌下、颊、颊内、静脉内、皮下、肌内和肺施用的组合物，而不需要过多的实验。为了治疗性施用的目的，可以将药物组合物与赋形剂掺合在一起，并以片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、溶液、糖浆等等形式使用。“药物可接受的载体”表示任何标准的药物载体。合适的载体的例子是本领域公知的，并且可包括但不限于任何标准药物载体，如磷酸盐缓冲的盐水溶液，含有Polysorb 80的磷酸盐缓冲的盐水，水，乳液例如油/水乳液，和多种类型的湿润剂。其它载体可包括无菌溶液、片剂、有涂层的片剂和胶囊。典型地，此类载体含有赋形剂例如淀粉、奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石、植物脂肪或油脂、胶质、二醇或其它已知的赋形剂。包含此类载体的组合物通过公知的常规方法配制。 
Tat衍生物多肽组合物能够例如通过静脉内、肌内、椎管内或皮下注射而容易地肠胃外施用。肠胃外施用可以通过将化合物掺入溶液或悬浮液中来完成。此类溶液或悬浮液也可包括无菌稀释剂例如注射用水、盐水溶 液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂。肠胃外配制物也可包括抗菌剂例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，和螯合剂例如EDTA。也可以添加缓冲液例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调节张力的试剂例如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以被包封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量管中。 
经皮施用包括通过皮肤经皮吸收组合物。经皮配制物包括贴片、离子电渗装置、软膏剂、霜剂、凝胶、油膏剂等等。 
组合物可包括修饰固体或液体剂量单位的物理形式的多种材料。例如，组合物可包括在活性成分周围形成涂层壳的材料。形成涂层壳的材料典型地是惰性的，并且可以选自例如糖、紫胶和其它肠溶包衣试剂。或者，活性成分可以被包装在明教胶囊或扁胶囊中。 
本公开的Tat衍生物多肽组合物可以根据适当的给药方案，以治疗有效量被施用。如本领域技术人员所理解的，需要的精确量可在受试者之间变化，取决于受试者的物种、年龄和一般条件，感染的严重性，具体地药剂和施用的模式。在一些实施方案中，每天一次或多次，以受试者的体重为基础施用约0.001mg/kg到约50mg/kg的组合物，以获得想要的疗效。在其它实施方案中，每天一次或多次，以受试者的体重为基础施用约1mg/kg到约25mg/kg的组合物，以获得想要的疗效。 
组合物的总每日剂量应由主治医师在健全的医疗判断范围内决定。针对任何具体患者或受试者的特异性治疗有效剂量水平会取决于多种因素，包括被治疗的病症和病症的严重性；使用的特定化合物的活性；使用的特定组合物；患者或受试者的年龄、体重、一般健康、并别和饮食；施用时间、施用途径、和使用的特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与使用的特定化合物组合使用或同时使用的药物；和医学领域中公知的其它因素。 
本文公开的组合物也可以在组合疗法中使用。也就是说，本文公开的组合物可以在一种或多种其它想要的组合物、疗法、治疗或医学程序的同时、之前、或之后被施用。所施用的具体疗法组合应由主治医师决定，并且应当考虑多种治疗的相容性和想要实现的疗效。应当理解，组合使用的 治疗活性剂可以在单一组合物、治疗或程序中一起施用，或者可以单独施用。 
在另一实施方案中，考虑了所公开的Tat衍生物的重复性给药或频繁给药，这可在快速耐受之前进行，以及逆转在乳腺癌发展期间确立的免疫抑制性潮流。频繁给药时例如在变态反应疗法中使用的一种程序，其能够支持对药剂的免疫学耐受。一旦Tat衍生物能够被用于恢复对乳腺肿瘤的免疫反应性，则由于晚期疾病而丧失了益处的其它免疫疗法可能能够重获功效。在第二种方案中，使用化学治疗方案，所述方案能够与Tat衍生物免疫疗法交替地释放大量肿瘤抗原。因为晚期阶段的人乳腺癌是多药物抗性的，所以放射性疗法可以是人试验中实用的替代方案。 
Tat衍生物的重复给药次数可以由医学专业人士基于患者对剂量的应答而确立。在一个实施方案中，Tat衍生物每3天施用一次，在10天的时间段中施用3剂。然后将该施用流程重复多个循环。本公开展望了多种不同的施用流程，其中Tat衍生物在选择的时间框内被施用多次，然后将所述施用流程重复多个循环。在另一实施方案中，Tat衍生物的施用可以与一种或多种其它抗癌剂、免疫调节剂或免疫抑制剂的施用交替进行。在一个实施方案中，免疫抑制剂是环磷酰胺。 
实施例1 
Tat衍生物的设计和生产 
本文公开了三种示例性的Tat衍生物，其中每种都以不同的方式代替TF hr片段。序列中加有下划线的部分表示脯氨酸之间的序列。 
Nani-P1(MPM1；SEQ ID NO：2)-MEPVDANLEAWKHAGSQPR 
KTACTTCYCKKCCFHCQVCFTRKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQT 
HQASLSKQPASQSRGDPTGPTESKKKVERETETDPFD
Nani-P2(ASH4；SEQ ID NO：3)-MDPKGEEDQDVSHQDLIKQYRKP
RTACNNCYCKKCCFHCYACFLRKGLGITYHAFRTRRKKIASADRIPVP 
QQSISIRGRDSQTTQESQKKVEEQAKANLRISRKNLGDETRGPVGAG 
N. 
Nani-P3(TMPD5；SEQ ID NO：4)-METPLKEQENSLESCREHSS
SISEVDVPTPVSCLRKGGRCWNRCIGNTRQIGSCGVPFLKCCKRKPF
TRKGLGISYGRKKRRQRRRAPQDSQTHQASLSKQPASQSRGDPTGP 
TESKKKVERETETDPFD 
SH3结合蛋白含有TF功能所需的一系列内部脯氨酸。Nani-P1去除了内部脯氨酸，每个内部脯氨酸被丙氨酸取代，使得SH3-结合位点失活。所述改变使得作为TF的整个Tat蛋白质残缺，因为此时其主要作为胞浆内蛋白质被生产，与其它Tat衍生物不同。 
Nani-P2具有来自非洲绿猴变体SIV的衍生化的Tat氨基端，所述SIV在宿主中具有低致病性。在所述序列中只有侧翼为羧基的脯氨酸是保守的。 
在Nani-P3中，富含丝氨酸的TARA同源序列代替SH3结合序列，作为侧翼是脯氨酸的氨基TF肽。Tat最初由短尾猴(macaques)和乌黑白眉猴(sooty mangabey monkeys)中低致病性变体SIV测序而来。 
实施例2 
Tat衍生物的体外活性 
将人单核细胞与Tat衍生物(Nani-P2)、toll样受体(TLR)的免疫刺激性序列(ISS)(图1)或脂多糖(LPS)(图2)一起培养24-28小时，然后洗涤细胞并用荧光标记的CD86染色。Tat衍生物刺激了比ISS(TLR)或LPS任一更高的CD86表达。 
实施例3 
在乳腺癌的小鼠模型中评价Tat衍生物 
材料和方法 
动物。6到8周龄的雌性BALB/c小鼠购自Jackson Laboratory(Bar Harbor，NE)。使用前使小鼠适应至少1周。在Animal Maintenance Facility of the Columbia University of Medical Center将小鼠保持在无病原体的条件下，并且所有实验由Institutional Animal Care and Use Committee of  Columbia University of Medical Center批准。 
细胞系。源自BALB/c自发性乳腺癌的6-硫鸟嘌呤抗性细胞系——4T1细胞得自ATCC；小鼠腺癌细胞系TS/A由Dr.Sandra Demaria(Demaria S.et al.Clin Cancer Res.11：728-34，2005)提供；源自BALB/C的乳腺癌SM 1由Dr.James Allison，University of California，Berkeley友好提供。所有肿瘤细胞系在补充了2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES、150单位/ml青霉素/链霉素、10％热失活的FCS(Invitrogen)、50μM 2-巯基乙醇(Sigma)和50mg/L庆大霉素(Lanza)的DMEM中培养。 
肿瘤攻击和治疗。第0天在左乳垫中分别用1x104 4T1、1x105TS/A或2x105SM1细胞(SC)注射BALB/c。通过在确立肿瘤后第0、7、12和17天将Tat衍生物直接注射进右肋腹中，进行免疫治疗。对照组接受PBS注射。在一些实验中，当所有小鼠具有确立的可测量的肿瘤(肿瘤注射后14天直径3-5mm)时，将动物随机指定至所示的多个处理组中。每周三次测量并记录肿瘤负担(肿瘤体积)。当肿瘤达到直径15mm的体积时处死动物，收获肿瘤并称重。 
检测肺转移。如先前所述检查肺的4T1转移(Pulaski B.et al.Cancer Res.60：2710-2715，2000)。在非常大多数的动物中，BALB/c小鼠中已确立2-3周的原发性4T1肿瘤转移至肺。简言之，在试验开始时根据确立的IACUC指南处死小鼠，取出肺，由对处理流程不知情的两个独立的研究者用肉眼列举肺表面上的肿瘤结节。 
免疫脾细胞的IFN-γ生产的ELISA分析。通过OptEIATM ELISA试剂盒(BD Biosciences)评价IFN-γ的脾细胞分泌。简言之，在96孔板中，20∶1的E∶T(效应物∶肿瘤)比例在含IL-2(50ng/mL)和GM-CSF(100ng/ml)的DMEM中，使用或不使用5x103/孔经丝裂霉素C(50μg/ml)-处理的4T1细胞(用于提供肿瘤抗原)地培养来自4T1带肿瘤小鼠的脾细胞(1x105/孔)。72小时后收集上清液并在-80℃下保持冷冻直至分析，而不丧失活性。根据制造商的说明，通过ELISA在一式两份孔中无细胞的上清液中测量IFN-γ。如下计算肿瘤特异性IFN-γ生产：减去在单独使用培养基培养的脾细胞上清液中测量的背景值，并使用重组的IFN-γ标准曲线将光密度 (OD)数值转化成以pg/ml为单位的IFN-γ量。刺激指数(SI)被计算为被刺激的培养物与对照培养物相比的IFN-γ比例。 
统计学分析。使用Student′s t-检验(Graph Pad Prism第5版；GraphPad)对数据进行统计学分析。使用log-rank检验(Graph Pad Prism第5版)对来自动物存活实验的数据进行统计学分析。 
结果
研究了乳腺癌小鼠模型中合成的、源自Tat的组合物的全身性施用的疗效。为了比较一小组不同衍生物针对原发性乳腺肿瘤生长所赋予的相对保护，将1x104 4T1乳腺肿瘤细胞SC注射进雌性BALB/c小鼠的乳垫中，然后在第0、7、14和21天用400ng部分纯化的Tat衍生物处(PBS中SC注射)进腋下引流淋巴结中。 
与单独接受PBS注射的对照小鼠相比时，衍生物中的两种(Nani-P1和Nani-P2)显著地减小了肿瘤负担，所述差异在肿瘤植入后第15天首次开始明显(图3A，第15天p＜0.05)。相比之下，用与其它衍生物相同的流程生产并部分纯化的第三种衍生物Nani-P3甚至在五倍高的剂量(2μg，图3B)下在抑制4T1原发性肿瘤生长或者延长存活(未显示)方面都更不有效。这些结果有效地排除了制剂中的污染物有助于抗肿瘤功效，尤其是在随后的试验用低得多的剂量下高度纯化(＞95％纯)的材料进行时。Nani-P2的功效比Nani-P1显著更持久，因而在第21天(最后一次给药)时，经Nani-P2和Nani-P1处理的肿瘤之间原发性肿瘤负担的差异变为18mm3，并且是高度统计学显著性的(p＜0.01)。尽管不再有其它疗法，但是该效应持续该试验的整个剩余部分。 
高度纯化的Nani-P2对4T1肿瘤的乳腺肿瘤生长抑制效应是剂量依赖型的，SC施用低至0.4ng化合物之后观察到显著的效应(图4)。将在引流腋窝侧翼(draining axillary flank)SC施用的Nani-P2剂量通过对数增量从0.4ng每剂递增至40ng每剂逐渐地抑制了4T1乳腺肿瘤生长。0.4ng到40ng之间更高剂量Nani-P2下更强有力的4T1生长抑制是统计学显著性的(p＜0.01)，而将剂量递增至400ng甚至2μg不导致进一步的抗肿瘤功 效(数据未显示)。重要的是，在使用多次给药方案的多次试验中SC或IV施用40ng Nani-P2后，未观察到毒性。选择40ng Nani-P2的剂量用于进一步研究。 
为了测定Nani-P2处理在小鼠中是否能够除了缩小原发性肿瘤之外还延长存活，进行了使用多种给药方案和途径(SC、IV或IT)施用40ngNani-P2的处理流程。针对每组十只小鼠的小组监督存活长度，所述存活长度使用Kaplan-Meier产物限制方法来评价。按照Columbia University Medical Center Animal Facility规程，在约15mm平均肿瘤直径下使每只小鼠安乐死，或者在小鼠濒死时可以更早，使得这两种输出之一成为死亡率的定义标准。 
在评价Nani-P2的第一个试验中，与肿瘤植入同时开始SC处理。对照(经PBS处理的)小鼠的中位存活时间是30天，100％的死亡率发生于第36天。通过Nani-P2施用(14天中4剂)，35％经处理的小鼠在第48天仍然存活(p＜0.001，图6A)，此时所有小鼠由于原发性肿瘤负担而被处死。 
在第二个存活试验中，允许肿瘤确立十四天，以更好地评价在转移性疾病中的功效，之后通过若干途径(SC、IV或IT)之一每周施用三个循环的Nani-P2疗法，以比较每种给药途径的相对功效(图5B)。与先前的试验相似，对照(SC经PBS处理)的中位存活是32天，第36天100％死亡。IV施用Nani-P2延长了存活(p＜0.005，图5B)，在第47天有60％存活，与之相比，经SC处理的小鼠在第47天有20％存活(p＜0.05)。化合物的瘤内施用略次于SC施用。 
选择4T1小鼠乳腺肿瘤模型进行研究，因为这是一种侵略性和迅速浸润的肿瘤；其通常在植入后第十四天转移，此时已难以治疗。为了学习Nani-P2的效能如何扩展至其它小鼠乳腺肿瘤模型，研究了两种额外的乳腺肿瘤TS/A和SM1(图6)。TS/A原发性乳腺肿瘤大致与4T1同样具有侵略性，在第30天达到15mm的肿瘤体积(图6A)。然而，TS/A肿瘤可观地更加应答Nani-P2处理，用0.4ng Nani-P2处理后具有约50％的生长抑制，第30天总计40％消退。 
SM1乳腺癌模型(图6B)最初作为原发性肿瘤侵略性较低，并且显示死亡穿插在除转移疾病之外的机制中。在处理的第30天，SM1肿瘤达到比TS/A或4T1任一小约33％的平均体积。这表示与4T1相比，SM1肿瘤对Nani-P2免疫疗法具有提高的灵敏度，从而在16天中100％的动物中肿瘤生长被抑制，甚至在植入后28天和终止给药方案后整整一周，40％的动物仍保持减轻。 
为了测定细胞毒性T淋巴细胞在Nani-P2疗法诱导的肿瘤排斥中是否起作用，进行了IFN-γELISA测定(图7)，以比较不用(对照)或用Nani-P2处理的4T1带肿瘤小鼠任一的脾细胞(图7)。在无菌条件下取出脾，并如别处(duPre′S.et al.Exp.Mol.Path.85：174-188，2008)所述制备。简言之，将脾匀浆，将作为全身溶细胞性T细胞和APC的丰富来源的脾细胞与经丝裂霉素C处理的4T1刺激剂细胞共同培养，以诱导记忆性免疫应答。单独用培养基培养对照孔。 
通过商业ELISA(BD Biosciences)定量CTL活化的标准代用品——IFN-γ浓度。在测定的所有条件下，来自经Nani-P2-处理的BALB/c小鼠的脾细胞培养物中IFN-γ生产显著(p＜0.01**)更高。与对照动物不同，经Nani-P2-处理的动物中的IFN-γ活性可以在显示促进DC分化的条件下通过添加IL-4和GM-CSF来增强(p＜0.05)，，如果在开始培养时添加回肿瘤刺激剂(次级指数＝53比对照，3S+IL4+GM-CSF)则甚至可以被进一步增加，证实Nani-P2在与其它CTL激动剂的协同作用中的潜能。 
为了进一步研究Nani-P2激动剂抵抗确立和转移性乳腺癌的功效，在小鼠的腹部乳垫中SC注射4T1细胞，并且延迟治疗直至肿瘤转移至肺并且大小平均为3.5mm(图8A，第13天)，对应于2.4cm或T2阶段人乳腺肿瘤。监测小鼠的肿瘤生长(图8A)、肺转移(图8B)和存活(图8C)。在尸检时，与对照相比，接受Nani-P2的动物显示可视的肺转移灶数量的客观降低(图9)。用Nani-P2IV处理的小鼠肺中显著可视的肿瘤结节的平均数量为7，与之相比，PBS对照组具有35.3的平均值(p＜0.01**)。这对应于原发性肿瘤侵略性较低的外观，以及大小平均小得多的肺转移灶(图8B)。 
通过比较静脉内处理的动物(40ng IV Nani-P2)和对照(经PBS处理的)动物的原发性肿瘤负担，清楚并显著地证实了预先确立的、侵略性4T1乳腺癌设置中的Nani-P2功效(第18天p＜0.01**，图10)。在原发性肿瘤抑制中的该统计学显著的益处(图10)在持续了50天的试验的整个持续时间内保持(p＜0.01**)，即使在第14天和28天之间仅有三次每周PINS给药。另外，有7/10的小鼠在第14天开始治疗肿瘤时证实有肿瘤消退。这被翻译成对存活的非常高统计学显著的益处(p＜0.005**，见图5B)。可观的是，1/10的动物经历了完全消退，并且在研究终结的第50天时保持无疾病，支持了已经显然使动物无肿瘤的推论。 
实施例4 
Tat衍生物和环磷酰胺的重复给药疗法 
将1x104 4T1细胞SC植入四组10BALB/c小鼠的乳腺脂肪垫中。第10天肿瘤直径达到4-5mm时开始治疗。以3天的间隔对对照小鼠IV注射PBS，而交替治疗小鼠在轮转的10天循环中每3天接受3剂药物。使用标准式计算肿瘤负担(肿瘤大小mm3)。CY：(单独环磷酰胺)从第10天开始，每只小鼠每周用80mg/kg IP注射小鼠。Cy/Nani-P2：(首先环磷酰胺，之后Nani-P2)从第10天开始，首先以3天的间隔用环磷酰胺(80mg/kg)对小鼠IP注射三剂，然后以3天的间隔用Nani-P2(40ng)IV注射3剂，轮转进行。重复3剂CY之后3剂Nani-P2的循环，直至第50天。Nani-P2/CY：(首先Nani-P2，之后环磷酰胺)：从第10天开始首先以3天的间隔用Nani-P2(40ng)对小鼠IV注射3剂，然后以3天的间隔用环磷酰胺腹腔内注射，轮转进行。重复3剂Nani-P2之后3剂CY的循环，直至第50天。 
Nani-P2/CY组中与CY组相比降低的肿瘤负担是具有非常高度统计学显著性的(图11，p＝0.003077)。 
与环磷酰胺交替的Nani-P2大丸剂治疗相比每周环磷酰胺的的存活益处是高度统计学显著的(图12，p＝0.0001)。第50天时Nani-P2小组有3/10的小鼠完全缓解，9/10的小鼠部分缓解(未显示)，而第42天时 10/10用环磷酰胺治疗的小鼠死亡。 
除非另有说明，用于说明书和权利要求书中的表达成分数量、如分子量的性质、反应条件的所有数字等应理解为在所有情况下由术语“约”修饰。因此，除非指出反例，说明书和附加的权利要求书中公开的数量参数是近似值，其可根据本发明想要获得的所需性质而变化。至少，并不企图限制将等同原则应用于权利要求书的范围，每个数量参数至少应按照经报导的有效数字的位数并通过应用常规约数技术解释。不反对公开本发明广大范围的数量范围和参数为约数，而特定实施例中公开的数量值则是尽可能精确地报导的。然而，任何数量值固有地包含某些误差，这是由它们各自检测测量中发现的标准差必然地导致的。 
除非在本文另有说明或同上下文明显抵触，描述本发明的上下文中(特别是在以下的权利要求书上下文中)使用的术语“一个”(″a″，″an″)和“这个”(″the″)和类似的指代被解释为包括单数和复数。对本文数值范围的叙述仅意图用作为引用落入该范围的每个单独的值的速记方法(shorthand method)。除非本文另有说明，每个单独的值都被并入说明书，就像其被单独地并入本文一样。除非在本文另有说明或与上下文明显抵触，本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文所提供的任何和所有实例或举例文字(例如“例如”)的使用仅意欲用来更好地阐述本发明，而非对本发明通过其它方式要求保护的范围设定限制。申请文件中的文字不应被理解为表示任何不要求保护的元素对本发明的实践而言是必需的。 
本文公开的备选元素或实施方案的分组不应解释为限制。各组成员可被单独提到或要求保护，或与本文发现的组的其它成员或其它元素任意组合。应当理解，由于便利和/或专利的原因，一组的一个或多个成员可以被包括进一组中或从该组删除。当任何这类包括或删除发生时，本申请文件在本文中被认为含有经改写的组，以满足对附加的权利要求书中所用的所有马库什组的书面描述。 
本文描述了根据本发明的某些实施方案，包括本发明的发明人已知的实现本发明的最佳模式。当然，本领域常规技术人员阅读上述描述后会明 白这些实施方案的变更。本发明人预期熟练的技术人员能适当地采用这类变更，且本发明者意欲使得本发明以与本文特定描述不同的方式应用。因此，至少可适用的法律允许，本发明包括附加的权利要求书中所述的主体内容的所有修饰和等价物。另外，除非本文另有说明或与上下文明显抵触，在其所有可能变化中，上述元件的任何组合由本发明所包括。 
本文公开的特定实施方案可在使用语言“由……组成”或“基本由……组成”的权利要求中被进一步限制。在无论是被提交的或是通过修改而添加的权利要求中使用时，过渡术语“由……组成”将权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分排除在外。过渡术语“基本由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤和不实质性影响基本特征和新颖特征的材料或步骤。藉此要求保护的本发明的实施方案被固有地或清楚地描述并且能够实施。 
另外，在本申请文件中，引用了大量专利和印刷出版物作为参考文献。上述各参考文献和印刷出版物通过引用其整体并入本文。 
最后，应理解本文公开的本发明的实施方案仅用于阐述本发明的原则。其它可使用的修饰也在本发明的范围内。因此，通过示例而非限制的方式，可根据本文的教导利用本发明的备选形式。因此，本发明并非被限制为如精确地所示和所述的。 
Figure IPA00001443221800011
Figure IPA00001443221800021
Figure IPA00001443221800031
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Figure IPA00001443221800051

Claims (18)

1.药物组合物，其包含人免疫缺陷病毒(HIV)转录反式活化因子(Tat)蛋白质的经修饰的氨基酸序列，其中所述经修饰的氨基酸序列与选自由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成的组的氨基酸序列具有大于85％的序列同源性。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
3.用于治疗癌症的方法，所述方法包括：
对需要其的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的Tat衍生物多肽；和
在所述受试者中导致所述癌症生长的停止或所述癌症的消退。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽以多次剂量被施用。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述施用步骤包括重复性的施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中施用多次剂量的所述Tat衍生物多肽，之后是休息时间段，并且其中所述循环被重复多次。
6.根据权利要求3所述的方法，其中所述施用步骤包括重复性的施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中施用多次剂量的所述Tat衍生物多肽，之后在确定的时间段中施用一次或多次剂量的治疗剂，并且其中所述循环被重复多次。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述治疗剂是环磷酰胺。
8.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
9.根据权利要求3所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
10.根据权利要求3所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽与SEQ IDNO：3的氨基酸序列至少85％同源。
11.降低肿瘤负担的方法，所述方法包括：
向需要其的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的Tat衍生物；和
在所述受试者中导致所述癌症的消退。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽以多次剂量被施用。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述施用步骤包括重复性的施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中施用多次剂量的所述Tat衍生物多肽，之后是休息时间段，并且其中所述循环被重复多次。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述施用步骤包括重复性的施用循环，其中每个循环包括在确定的时间段中施用多次剂量的所述Tat衍生物多肽，之后在确定的时间段中施用一次或多次剂量的治疗剂，并且其中所述循环被重复多次。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述治疗剂是环磷酰胺。
16.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症是乳腺癌。
17.根据权利要求11所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述Tat衍生物多肽与SEQ IDNO：3的氨基酸序列至少85％同源。
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