CN101361969B

CN101361969B - 一种治疗性乙肝疫苗及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN101361969B
Application number: CN2008100260751A
Authority: CN
Inventors: 张宜俊; 邱向南; 夏书奇; 曾振飞; 叶倩君; 赵峰; 段详; 王艳; 王翠玲; 吴思纹; 于源; 李平; 黄观凤; 熊伟宏; 王增松
Original assignee: KAITAI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd GUANGZHOU
Current assignee: Guangzhou Yinliangqiang Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2008-01-29
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2028-01-29
Also published as: CN101361969A

Abstract

本发明公开了一种治疗性乙肝疫苗及其制备方法和用途，其技术方案的关键是筛选了源自HBV包膜蛋白、核心抗原和多聚酶(polymerase)多个CTL和HTL多肽表位，形成多重抗原肽系统(MAP)，并以重组人的白细胞介素12(rhIL-12)为佐剂，以提高其免疫原性和应答水平，可为临床上慢性乙型肝炎的治疗提供一种治疗性的生物制剂。

Description

一种治疗性乙肝疫苗及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种生物制剂，更具体地说，它涉及用于慢性乙型肝炎的一种治疗性乙肝疫苗，本发明还涉及该疫苗的制备方法和用途。

背景技术

慢性乙型肝炎是我国常见的传染病之一，我国属乙型肝炎病毒(HBV)高流行区，HBV感染是一个严重的公共卫生问题，但在慢性乙型肝炎治疗方面一直未取得突破性进展。

直至目前，临床上对慢性乙型肝炎的治疗仍面临着不少的困惑，虽然治疗的总体目标是明确的，即最大限度的长期抑制或消除HBV，减轻肝细胞炎症坏死及纤维化，延缓和阻止疾病的进展等。但在实施过程中还存在着许多困难和争议。HBV的持续存在和复制是导致病情进行性发展的主要原因，因此抗病毒治疗是关键手段，尽管核苷(酸)类似物有了长足的发展，但由于HBV的耐药变异、HBV DNA可能与宿主基因的整合以及环状共价闭合DNA(cccDNA)难以清除等因素，以致抗病毒治疗存在着不彻底性。因此免疫干预的作用应当引起我们的关注，虽然目前还缺乏特异性的免疫干预制剂，但归根结底调动和诱导机体自身的免疫调节机制，是有效治疗慢性乙型肝炎的重要途径。

大量试验研究及临床观察表明，HBV特异性细胞免疫应答在慢性乙型肝炎病变的发生、发展、转归和清除HBV起着至关重要的作用。在急性HBV感染过程中，多克隆多特异性的细胞免疫应答，使HBV的复制迅速被抑制以致完全清除(Sobau Y，et al.JHepatology，2002)，患者痊愈。而慢性HBV感染者，针对HBV的特异性细胞免疫应答低下，甚至呈现对HBV的免疫耐受状态。增强和促进HBV特异性的CD8⁺毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4⁺辅助性T淋巴细胞(HTL)的活化，以非靶细胞损伤为主的清除HBV机制是机体清除HBV的十分重要的方式。活化的CD8⁺CTL一方面分泌IFN-γ、TNF-α等细胞因子，通过抑制前基因组RNA(pgRNA)和缩短细胞核内cccDNA半衰期，抑制以致清除HBV，另外也可通过溶细胞的机制清除HBV。但只有当CD8⁺CTL应答非溶细胞损伤机制不能有效抑制HBV复制时，才启动凋亡和溶细胞的机制，其途径包括穿孔素颗粒酶系统、Fas/Fas配体系统、TNF/TNF受体系统和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。

研究表明，慢性乙肝患者外周血存在着高水平的HBV颗粒和HBV蛋白，而且是抑制患者细胞免疫应答低下或耐受的主要原因之一(Schlaak JF，et al.J Hepatol，1999；Chen M，etal.J Virol，2005)。慢性乙型肝炎患者免疫应答功能低下或免疫耐受主要表现为树突状细胞(DCs)包括mDC和pDC数量下降、功能损伤，HTL的功能缺陷、CD8⁺CTL的数量减少和功能下降以及CD4⁺CD25⁺调节性T细胞(Treg细胞)抑制效应细胞和肝细胞外环境的改变。此外，共抑制分子PDL-1/PD-1信号途径也参与了HBV慢性感染过程中CTL的损伤(Leibsun PJ.Curv Opin Immunol，2004)。还有人指出慢性乙肝患者天然免疫应答也有所减弱，天然免疫在HBV的清除过程中起着重要作用，特别在感染的初期，pDC可先产生IFN-αβ，NK和NKT细胞通过Toll样受体途径被活化即可产生IFN-γ，80％复制高峰期的HBV可被NK、NKT细胞通过分泌细胞因子和细胞毒作用抑制和清除。

综上所述，慢性乙型肝炎治疗除使用抗HBV药物外，免疫干预治疗是必不可少的重要途径，而后者的主要选择就是以基于细胞因子的免疫治疗(cytokine-basedimmunotherapy)或治疗性疫苗(therapeutic vaccines)(Depla E，et al.J Virol，2007)。

本申请的发明人通过长期的实验研究，设计以多个HBV特异性CTL和HTL多肽表位为抗原肽，以重组人的白介素-12(rhIL-12)作为佐剂的慢性乙型肝炎治疗性疫苗，rhIL-12既可作为佐剂增加多肽表位的抗原性和免疫应答效应，而且rhIL-12是免疫网络中占有十分重要地位的核心细胞因子，具有多重功能，不但是连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，而且是细胞免疫应答的关键调节者(Decchio MD，et al.Clin Cancer Res，2007)。研究证明NKT细胞表达丰富的IL-12R复合物，是rhIL-12免疫调节作用的首要目标，而NK细胞无论活化与否均存在IL-12R，因此二者被rhIL-12激活后均可产生以IFN-γ为主的细胞因子，通过非溶细胞和溶细胞机制抑制HBV的复制。更重要的是rhIL-12调节Th1/Th2应答(Rossol S，et al.J Clin Invest，1997)，使其向Th1倾斜。rhIL-12还是诱生CTL免疫应答最佳的细胞因子。rhIL-12作为第三信号在初始CD8⁺细胞活化增殖中起重要作用。因此，HBV多肽表位诱导HTL和CTL的活化作用，能被rhIL-12所明显放大。因此在多肽表位的刺激下HTL和CTL活化后，其细胞表面表达高亲和力的IL-12R，与rhIL-12结合后进一步促使其转变为效应性T细胞，通过分泌以IFN-γ为主的细胞因子和细胞毒作用，抑制和清除HBV。

发明内容

本发明要解决的技术问题的关键所在是筛选源自HBV核心抗原(HBcAg)、HBV包膜蛋白抗原(HBsAg)和多聚酶的CTL、HTL优势表位多肽中加入佐剂rhIL-12，形成一种新型治疗性乙肝疫苗。

本发明的要解决的另一技术问题是提供一种上述治疗性乙肝疫苗的制备方法。

本发明的前一技术方案是这样的：一种治疗性乙肝疫苗，其特征在于该疫苗是由人体有效剂量的表位多肽、重组人白介素-12和药用辅料共同组成的冻干制剂，其中表位多肽和重组人白介素-12重量之比为200～20000∶1，其中的表位多肽由CTL表位多肽和HTL表位多肽组成。

上述一种治疗性乙肝疫苗中，所述的表位多肽中CTL表位多肽和HTL表位多肽的重量比约为2∶1；所述的CTL表位多肽、HTL表位多肽、重组人白介素-12的重量范围为 200μg～6mg∶100μg～3mg∶1μg～10μg；所述的药用辅料为甘露醇或蔗糖或白蛋白或右旋糖酐或聚维酮40或NaCl或水解明胶或乳糖或山梨醇中的至少一种。

上述一种治疗性乙肝疫苗中，所述的CTL表位多肽为乙型肝炎病毒来源的CTL表位多肽中的一条或多条，包括HBV包膜蛋白抗原中第183～191氨基酸序列FLLTRILTI或236～245氨基酸序列RWMCLRRFII或249～258氨基酸序列ILLLCLIFLL或313～321氨基酸序列IPIPSSWAF或332～342氨基酸序列RFSWLSLLVPF或335～343氨基酸序列WLSLLVPFV或359～369氨基酸序列WMMWYWGPSLY或它们的变异序列、HBV核心抗原中第18～27氨基酸序列FLPSDFFPSV或19～27氨基酸序列LPSDFFPSV或88～96氨基酸序列YVNVNMGLK或101～110氨基酸序列LWFHISCLTF或117～125氨基酸序列EYLVSFGVW或137～147氨基酸序列LTFGRETVLEY或141～151氨基酸序列STLPETTVVRR或419～428氨基酸序列DLLDTASALY或它们的变异序列和HBV多聚酶抗原中第47～55氨基酸序列NVSIPWTHK或149～159氨基酸序列HTLWKAGILYK或166～173氨基酸序列ASFCGSPY或354～363氨基酸序列TPARVTGGVF或388～397氨基酸序列LVVDFSQFSR或392～401氨基酸序列SWPKFAVPNL或415～424氨基酸序列LSLDVSAAFY或429～437氨基酸序列HPAAMPHLL或455～463氨基酸序列GLSRYVARL或530～539氨基酸序列FPHCLAFSYM或531～539氨基酸序列SAICSVVRR或538～546氨基酸序列YMDDVVLGV或562～570氨基酸序列FLLSLGIHL或640～650氨基酸序列YPALMPLYACI或665～674氨基酸序列QAFTFSPTYK或745～753氨基酸序列KYTSFPWLL或它们的变异序列。优选FLPSDFFPSV或YVNVNMGLK或STLPETTVVRR或TPARVTGGVF或HTLWKAGILYK或IPIPSSWAF或RWMCLRRFII或YMDDVVLGV。

上述一种治疗性乙肝疫苗中，所述的HTL表位多肽为乙型肝炎病毒来源的HTL表位多肽和padre序列AKFVAAWTLKAAA中的一条或多条，乙型肝炎病毒来源的HTL表位多肽包括HBV包膜蛋白抗原中第180～194氨基酸序列AGFFLLTRILTIPQS或339～353氨基酸序列LVPFVQWFVGLSPTV或它们的变异序列、HBV核心抗原中第50～69氨基酸序列PHHTALRQAILCWGELMTLA或120～139氨基酸序列VSFGVWIRTPPAYRPPNAPI或它们的变异序列和HBV多聚酶抗原中第96～110氨基酸序列VGPLTVNEKRRLKLI或145～159氨基酸序列RHYLHTLWKAGILYK或385～399氨基酸序列ESRLVVDFSQFSRGN或412～426氨基酸序列LQSLTNLLSSNLSWL或420～434氨基酸序列SSNLSWLSLDVSAAF或501～515氨基酸序列LHLYSHPIILGFRKI或523～537氨基酸序列PFLLAQFTSAICSVV或618～632氨基酸序列KQCFRKLPVNRPIDW664～678氨基酸序列KQAFTFSPTYKAFLC或694～708氨基酸序列LCQVFADATPTGWGL或767～781氨基酸序列AANWILRGTSFVYVP或774～788氨基酸序列GTSFVYVPSALNPAD或它们的变异序列；优选HTL表位多肽为AGFFLLTRILTIPQS或LHLYSHPIILGFRKI或AKFVAAWTLKAAA或RHYLHTLWKAGILYK。

本发明的后一目的是这样实现的：一种治疗性乙肝疫苗的制备方法，包括以下步骤：(1)用Fmoc固相肽合成法合成所需表位多肽；(2)在100级以下车间，量取各抗原表位肽、rhIL-12，加入药用辅料，用注射用水溶解，溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于适当容量玻璃容器瓶中，冷冻干燥，扎盖，包装即得成品。

本发明的还提供上述治疗性乙肝疫苗在慢性乙肝感染治疗中的应用，以及它在乙肝病毒相关肿瘤的预防和治疗中的应用。

以下从二个组分的具体研制过程和使用进行详细说明。

在应用抗原分子进行免疫干预方面，基本上已放弃病原体或天然抗原整体分子，虽然其抗原性强，但由于其中含有不适当、抑制性甚至病理性表位可以导致免疫损伤甚至免疫颠覆，因此选择的途径多遵循由病原体、蛋白质分子逐步过度到表位多肽。其优点是诱导的免疫应答有针对性，特异性强，但免疫原性依次下降，以致单纯应用表位多肽常常达不到满意的符合治疗要求的免疫应答。本申请的发明采用(1)表位多肽的合理组合与搭配；(2)以细胞因子rhIL-12为佐剂；(3)广谱高效的表位，HTL PADRE作为CTL表位的重要协同成分，它不仅可以和很多DR分子相结合，还可以与某些MHC II类分子相结合，该表位在诱导特异性CTL免疫应答方面比天然的HTL表位高1000倍以上，因此能够克服单纯应用多肽表位具有的抗原性较低的缺陷。

研究所用的多肽表位采用固相合成技术，高效液相色谱(HPLC)纯化，十分注意不同多肽表位氨基酸组成分析，质谱、氨基酸序列测定对其结构确定的重要意义，特别关注其生物特性尤其是其免疫原性的观察和研究，因为与其他化学药物相比，合成多肽稳定性较差，易降解、氧化，体内半衰期短。在注意这些基本方面的前提下，我们遵循以下原则筛选HBV特异性的CTL和HTL表位。

(1)尽可能选择较多的多肽表位形成MAP，以保证能诱导较全面的多特异性的CTL和HTL效应(Depla E，et al.J virol，2007)。

(2)选择来自HBV蛋白不同部分HBcAg、HBsAg和多聚酶(Polymerase)的多种CTL和HTL表位，以提高应答能力和调节作用。

(3)选择CTL和HTL表位时，应考虑到限制这些表位的HLA类型，特别是HLA超型的选择，尽量增加这些多肽表位的不同HLA类型的覆盖范围，以提高其潜在的识别率；

(4)充分注意提高免疫原性的通用的HTL表位，即泛化的DR辅助性T细胞表位(PanDR-helper T cell epitopes，PADRE)，以提高对多肽疫苗的应答水平(Alexander J等，1994)，避免对HBV感染个体的免疫损伤。应当指出，CD4⁺T细胞的活化可分泌IL-2、IL-12等细胞因子，是CTL发育、诱导成熟扩增及有效维持的必要条件(Rige JP，et al.Nature，1998)。

(5)多选择来自多聚酶的多肽表位有助于克服HBV抗原引起的免疫损伤，因为这种抗原的含量远较体内其他HBV抗原含量为少(Mizukoshi E，et al.J Immunol，2004)。

(6)选择相对保守度高的多肽表位序列，选用这种在病毒基因稳定存在的序列制成的疫苗，不但可以最大限度的抵抗现有的HBV，而且还可以避免病毒变异导致免疫逃逸；

(7)选择与HLA有高度或中度亲和力的表位(与HLA I类分子高度亲和的表位IC₅₀ 高于或等于50nM，与HLAII类分子高度亲和的表位IC₅₀高于或等于100nM，中度亲和的IC₅₀在100～1000nM)(Alessandro等，1999)。

采用下列方法筛选和优化HBV多肽表位组合：

(1)应用ELISA法检测和比较候选的HBV多肽组合、rhIL-12，和多肽组合与rhIL-12对人PBMC产生IFN-γ的影响；

(2)应用Elispot方法筛选和观察HBV多肽组合、rhIL-12，和多肽组合与rhIL-12对人PBMCs IFN-γ+细胞频率的影响；

(3)应用流式细胞术，观察HBV多肽组合与rhIL-12对人PBMC产生IFN-γ的细胞来源，主要观察IFN-γ⁺的CD8⁺CTL、CD4⁺Th1和NK细胞的分布情况。

候选的HBV多肽总计47个，其中来自HBcAg10个，来自HBsAg 9个，来自多聚酶28个。

通过上述3种方法的筛选，我们选择FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、IPIPSSWAF、RWMCLRRFII、YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAWTLKAAA和RHYLHTLWKAGILYK这12个多肽表位，把它们作为MAP(mutiple antigen peptide system)的成员，形成优化的组合与搭配。

本发明的发明人经过5年多的研究，成功地构建了高表达rhIL-12的CHO细胞株，从静止培养过渡到连续培养，形成了中试规模，用改进的纯化方法，所得rhIL-12纯度达到98％。经质谱MALD-TOF分子量检测与理论相符合，其质谱肽图N-端氨基酸序列与理论完全符合，SDS-PAGE电泳、免疫印迹结果与标准带一致。应用Elispot试验，外周血PBMC刺激试验和多色流式细胞仪进行了多项药效学试验，结果与文献报告一致(参考中国专利公开号CN101033254A)。

HBV多肽组合对人PBMC产生IFN-γ的影响结果表明，单独应用HBV多肽组合对PBMC产生IFN-γ只有轻度增加，单独应用rhIL-12也只诱导PBMC产生IFN-γ轻度增加，HBV多肽组合与rhIL-12联合应用则明显促进PBMC产生IFN-γ。Balb/c小鼠体内试验结果也证明，应用多肽组合和rhIL-12联合免疫，每天一次，连续5天，在免疫后2周，HBV 多肽组合和rhIL-12联合应用组脾脏淋巴细胞产生IFN-γ水平明显较单用HBV多肽或rhIL-12明显提高。流式细胞仪检测表明，IFN-γ的增量来源以HTL和CTL为主，其次为NK细胞。上述试验结果表明，以HBV多肽表位组合为抗原，以rhIL-12为佐剂的新型乙肝疫苗可以强烈诱导以HTL和CTL为主的免疫应答，显示了良好的应用前景。

已经证明rhIL-12可以活化NKT、NK细胞和γδT细胞，NKT和NK均存在rhIL-12受体(Lanzen N M，et al.Cell Immunol，2006)，相结合产生以IFN-γ为主的细胞因子，具有非溶细胞及溶细胞的免疫作用。而且NKT和NK活化的结果可使单核细胞直接分化为DC，导致人对DC的调节，包括上调CD40的表达，调整CD40和CD40L的相互作用，促进DC激活，提高DC对HBV多肽组合的功能，加速HBV特异性和CTL的活化，激发IFN-γ的分泌。特别应当指出，rhIL-12可以调节Th1/Th2应答，使其向Th1倾斜，协助HBV多肽，诱导Th1细胞发育和增殖，增强T细胞的功能，使其分泌IL-2，IL-3，IFN-γ，TNF-β和GM-CSF、rhIL-12和CD28⁺协同诱导静息型T细胞增生，rhIL-12与HBV多肽抗原共刺激，使特异性的CTL增殖并表现叠加或倍增效应，增加CTL释放IFN-γ、穿孔素、颗粒酶A及颗粒酶B，提高其非溶细胞和溶细胞清除HBV机制。还要指出rhIL-12作为第三信号对初始的CD8⁺T细胞的活化与增殖起诱导作用，特别是在HBV抗原水平较低时起诱导的作用是十分重要的。rhIL-12可活化IL-2Rα链(CD25)的表达能力，而且其诱导功能比TCR和/或rhIL-2的诱导功能更强，因此rhIL-12作为第三信号在一定程度上决定了初始T细胞能否进一步分化(Curtsinger J M，et al.J Exp Med，2003)。还应指出rhIL-12诱导B细胞产生多种生物效应(Ima A，et al.Haematological，2002)，在抗原特异性应答期内对多数同型抗体的生成产生增强效应，rhIL-12刺激NK细胞和T细胞活化生成IFN-γ，促使IgG1向IgG2转化，并对IgG1的生成产生抑制作用，而IgG2/IgG1＞1时，则有助于Th1的应答。因此rhIL-12在协助HBV多肽表位诱导放大免疫应答是十分重要的。综上所述，rhIL-12不仅能活化NKT、NK、T细胞以非溶细胞为主要方式抑制和清除HBV，而且还可以促进APC的功能，加速DC成熟，提高DC对HBV多肽组合的递呈效率，促进HBV特异性CTL和HTL的活化(Xiong SQ，et al.Int immunophar macol，2007)。

最新的研究表明，rhIL-12可以增强记忆性中央型T细胞的活化或应答；在中央型记忆性CD⁺细胞转化为CD4⁺效应性T细胞是必须的。效应性记忆性CD8T细胞在缺乏同源抗原下，rhIL-12可以促使其分泌IFN-γ。HBV特异性记忆性T细胞在HBV疫苗的应答中占有地位是十分重要的。rhIL-12这一作用再次说明HBV的特异性HTL和CTL表位产生应答效应，与rhIL-12的佐剂作用是十分重要的和不可缺少的。

多肽表位组合作为再次进入机体HBV相同抗原与记忆性T细胞(包括CD4⁺和CD8⁺T细胞)再次接触时，能迅速杀灭或清除被感染的细胞，同时分泌细胞因子来抑制HBV的复制并调节其他免疫细胞的功能。这一点是免疫网络对HBV多肽表位为抗原肽以rhIL-12 为佐剂的疫苗的重要作用机制之一。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

实施例1 多肽表位的制备

多肽的制备用Fmoc固相肽合成法，首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-树脂。将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、耦联，直到得到目的肽。最后将肽-支臂-树脂裂解。多肽纯化，用HPLC法，粗肽产品经C18高压柱分离纯化，用液相色谱仪跟踪收集所需流出液，样品峰合并后去盐、冻干，制得多肽精品。以下以HBcAg(18-27)的制备过程为例，叙述合成过程。

(1)HBcAg(18-27)合成

a)Fmoc-Val-Wang树脂的溶胀及脱Fmoc保护

称取Fmoc-Val-Wang树脂62.5克(150目，0.8mmol/g)，装入专用的反应器中，开启CS936生产型多肽合成仪总电源，打开工作站，调用事先编著的接肽程序。用700mlDMF浸泡，使树脂充分溶胀，氮气吹干。加入700ml20％PIP的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹虑去PIP，用DMF洗涤3次，氮气吹干。

b)Fmoc-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Ser(tBu)-OH57.5g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

加入400ml20％PIP的DMF溶液，25℃振摇30分钟。氮气吹干，用DMF洗涤6次，氮气吹干。

c)Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Pro-OH 50.6g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

d)Fmoc-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Phe-OH 58.1g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

e)Fmoc-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

f)Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Asp(OtBu)-OH 61.7g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

g)Fmoc-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Ser(tBu)-OH 57.5g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

h)Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

i)Fmoc-Leu-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

加入Fmoc-Leu-OH 53.1g，HOBt20.5g，DIC 50.6g，300mlDMF，将混合物25℃振摇1小时。氮气吹干，DMF洗涤3次，氮气吹干。

j)Fmoc-Phe-Leu-Pro-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Phe-Phe-Pro-Ser(tBu)-Val-树脂的制备

再用无水乙醇洗涤3次。抽干后，放入真空氮气吹干器中氮气吹干，得保护的HBcAg(18-27)树脂103g。

k)Phe-Leu-Pro-Ser-Asp-Phe-Phe-Pro-Ser-Val的制备

取103g保护的HbcAg(18-27)树脂转移到切肽瓶中，冷却，边搅拌边加入切肽试剂(TFA/HBr/TIS/EDT＝700ml/28ml/43ml/21ml)，25℃搅拌4小时。过滤，减压浓缩，滤液加无水乙醚沉淀，收集沉淀，用乙醚洗，P2O5干燥，获得切肽后的HbcAg(18-27)粗品，约45g。

(2)纯化

将45g HbcAg(18-27)粗品溶于20L纯化水中，过滤，滤液经C18柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac：乙腈(75-25)，流速为300ml/min。用HPLC跟踪收集所需要的流出液。样品峰合并后去盐，冻干，得成品12.5g(MW：1154)，总收率约22％。

其他抗原表位多肽的制备同上述工艺。

实施例2 多肽表位的质量控制

多肽表位的质量控制检测项目包括：外观、纯度和分子量。

多肽的外观：制备的抗原表位肽外观应为白色粉末状；多肽的色谱分析：采用RP-HPLC对多肽进行分析，色谱条件：Waters公司C18色谱柱(250×4.6mm，5μm，10nm)。流动相A(含0.1％三氟乙酸的乙腈)。流动相B(含0.1％三氟乙酸的水)。线性梯度洗脱：0.01到20.00min，B从35％到50％，流速：1.0ml/min。检测波长：220nm。进样量：10μl。柱温：室温。质量要求：纯度＞98％；多肽的质谱鉴定：用30％乙腈水溶液将样品溶解为0.05mg/ml的溶液。取0.5l点于样品板上，以0.5μl HCCA作为基质溶液进行质谱鉴定。质量要求：多肽分子量的检测结果与理论分子量一致。检测结果见表1。

表1多肽表位HBcAg(18-27)的质量检测结果

实施例3 多肽表位的筛选

目前，乙肝治疗性疫苗的设计倾向于覆盖大部分人群，只有这样才能对绝大多数人群有效，同时具有更好的商业价值。广泛的覆盖率可以通过选择与总体人群高表达的HLA超型具有高度亲和力的表位肽来获得。

HLA-I类分子能够与多个相互重叠又各自独立的肽结合，根据所结合的肽的特征，大多数HLA-I类分子可以被划归为几个主要的HLA I类超型。通过考察这些表位与全部或大多数特定超型的HLA分子结合的能力，来筛选制备有效的多表位疫苗所需的表位。选择人群覆盖率最广，并且有针对性的选择某些人群最常见的HLA超型有利于合理设计既对群体有效又强调个体化的治疗性疫苗。(Roberto Bertoni等，J.Clin.Invest.，1997，100：503-513；Alessandro Sette等，Immunogenetics，1999，49：800-807；Alessandro Sette 等，Curr.Opin.Immunol.，1998，10：478-482)。

最常见的HLA I类超型以及它们在人群中的分布如表2所示。如果不考虑种族特异性，HLA-A2、-A3、-B7各自在人群中的覆盖率是35～55％以上(John Sidney等，Immunol.Today，1996，17：261-266)，三种超型联合可覆盖80％以上人群(Alessandro Sette等，Immunogenetics，1999，50：201-212；US 6689363；US 7026443)。除了以上这三种超型，HLA-A24和HLA-A1表型的出现频率较高(Deborah V.Dawson等，Genetic Epidemiology，2001，20：87-106；Xue Fu-zhong等，Immunological J.，2005，21：136-141；Alessandro Sette等，Immunogenetics，1999，50：201-212；US 7026443；CA 02500955)。这五种表型联合在亚洲人群中的覆盖率至少可达90％以上(Deborah V.Dawson等，GeneticEpidemiology，2001，20：87-106)。

受HLA-DR限制的HTL表位之间已被证实存在着广泛的交叉反应(Brian Livingston等，J.Immunol.，2002，168：5499-5506)，如表3所示。因此选用与HLA-DR超家族中常见等位基因具有多重交叉反应的HTL表位，能够进一步提高疫苗在人群中的覆盖率。

表2HLAI类超型在人群中的覆盖率

表3 HLAII类在人群中的覆盖率

HLA-A2、-A3、-B7和-A24四个超型所限制的CTL表位及其亲和力如表4所示。HLA-DR限制的HTL表位及其与不同等位基因之间的亲和力如表5所示。

表4受HLA-A2、-A3、-B7、-A24和-A1限制的乙肝疫苗CTL表位

从HLA-A2、-A3、-B7和-A24各超家族中各选择若干个CTL表位用于疫苗的开发。考察这些CTL表位与等位基因亲和力的截取值是500nM。IC50≤500nM的CTL表位免疫原性和抗原性较高(Alessandro Sette等，J.Immunol，1994，153：5586-5592)。所有选定的的CTL表位都能全部与所属超型中常见等位基因结合，或者至少与所属超型中5个常见等位基因中的3个结合。从受HLA-DR限制的HTL表位中选择若干用于疫苗的开发，HTL表位与等位基因亲和力的截取值是1000nM。选定的HTL表位与常见的11个HLA-DR等位基因中的绝大多数具有高度亲和力(Alessandro Sette等，J.Immunol，1994，153：5586-5592；Erik Depla等，J.Virol.2007.10.17)。选择与HBV清除相关的等位基因所限制的CTL、HTL表位(Chloe L.Thio等，Hepatology，2000，89：229-240；Maureen P Martin等，Curr Opin Immunol，17：510-516)。

所有入选的表位在最常见的HBV菌株中都是高度保守的，以保证疫苗对所有常见的HBV有效，并且能有效防止因病毒基因突变导致的免疫逃逸(Erik Depla等，J.Virol.2007.10.17)。这些表位分别来自HBV的表面抗原、多聚酶和核心抗原，使疫苗产生的免疫反应针对HBV的多个病毒蛋白，模仿了病毒在体内自然清除的过程(CA 02500955；Erik Depla等，J.Virol.2007.10.17)。所选中的表位都同时被人和小鼠的免疫系统识别，产生免疫应答(K.A.Wall等，J.Immunol，1994，152：4526-4536；Roberto Bertoni等，J.ClinInvest 1997，100：503-513；A.Vitiello等，J.Clin Invest 1995，95：341-349；D.M.Mckinney等，J.Immunol Methods，2000，237：105-117；E.Keogh等，J.Immunol 2001，167：787-796；CA02500955)。

选用Pan-DR-epitope(PADRE)，保证最大范围的诱导Th细胞产生应答，并且显著提高应答水平(J.Alexander等，Immunity，1994，1：751)。

通过ELISA法、ELISPOT法和流式细胞术观察上述多肽表位促使人PBMC产生的IFN-γ的量、产生IFN-γ的细胞频率及IFN-γ⁺CTL、IFN-γ⁺HTL等分布情况，筛选出12个多肽表位：FLPSDFFPSV，YVNVNMGLK，STLPETTVVRR，TPARVTGGVF，HTLWKAGILYK，IPIPSSWAF，RWMCLRRFII，YMDDVVLGV，AGFFLLTRILTIPQS，LHLYSHPIILGFRKI，AKFVAAWTLKAAA，RHYLHTLWKAGILYK。

实施例4 表达rhIL-12细胞株的构建、培养和纯化

请参考我公司申请的专利：IL-12表达载体及该载体表达的真核细胞株及应用，申请号：200710028952.4；一种纯化重组人白细胞介素12的方法，申请号：200710026863.6、公开号CN101033254A，上述专利申请公开的内容，全部纳入本发明申请公开的范围。

实施例5 运用ELISA方法检测多肽表位联合rhIL-12对诱导健康人PBMCs产生INF-γ时的协同效应

健康人10名，各取外周血20ml，肝素抗凝，使用上海华精公司生产的淋巴细胞分离液按常规分离单个核细胞，洗涤后用含10％胎牛血清(GIBCO公司生产)的RPMI-1640培养基(GIBCO公司生产)配成2×10⁶个/ml的悬液。在普通96孔微孔培养板小孔中，每孔取100ul细胞悬液入96孔培养板，再加100ulRPMI-1640(10％FCS，室温)稀释好的刺激物，并设不加刺激物的阴性对照孔和anti-CD3(eBioscience公司生产，批号E017230)阳性对照孔，同一刺激孔均设复孔，置37℃、5％CO₂的培养箱(美国SHELLAB牌CO2培养箱)中孵育48h后，在无菌条件收集细胞上清液，使用BD biosciences公司HumanIFN-γELISA set试剂盒测定INF-γ含量。结果见附表6。结果表明，多肽和IL-12联合运用，在诱导健康人PBMC产生INF-γ的过程中，有明显的协同效应，并呈明显的量效关系。

表6 10名健康人PBMC诱生INF-γ水平结果比较

注：本试验数据表明表位多肽(12条肽)与IL-12的用量比在187.5～192000∶1之间时，其联合运用对人外周血单个核细胞诱生INF-γ的能力都强于它们二者单独使用，有明显的量效关系和放大作用，有的甚至能放大25倍以上。

实施例6 Elispot法检测多肽表位联合rhIL-12对健康人PBMCs IFN-γ⁺细胞频率的影响

采用ELISPOT方法，试剂盒(Human IFNγELISPOT Kit)为U-CyTech biosciences公司产品，按说明操作。简要流程如下：取6名健康人外周血5ml，肝素抗凝，使用上海华精公司生产的淋巴细胞分离液按常规分离单个核细胞，洗涤后用含10％胎牛血清(GIBCO公司生产)的RPMI-1640培养基(GIBCO公司生产)配成2×106个/ml的悬液。在业经IFNγ单抗包被和阻断剂封闭的96孔微孔板小孔中，每孔取100ul细胞悬液入96孔ELISPOT透明板，再加100ulRPMI-1640(10％FCS，室温)稀释好的刺激物，并设不加刺激物的阴性对照孔，同一样品均设复孔，置37℃、5％CO2的培养箱(美国SHELLAB牌CO2培养箱)中孵育24h，经洗涤后，相继用生物素化抗IFN-γ多抗和酶标记的山羊抗生物素抗体作用，继用ActivatorI、II显色后经仪器阅读计数斑点。结果表明与单独使用多肽组合或者单独使用rhIL-12刺激，多肽组合联合rhIL-12能明显增高健康人外周血单核细胞(PBMCs)IFN-γ⁺细胞频率。结果见表7。

表7多肽组合联合rhIL-12诱导健康人PBMCs IFN-γ⁺细胞频率检测

注：本试验数据表明表位多肽(12条肽)与rmIL-12的用量比在2400～9600∶1之间时，其联合运用诱导人外周血单个核细胞生成INF-γ产生细胞的能力都强于它们二者单独使用，有明显的量效关系和放大作用，有的甚至10倍以上。

实施例7 多肽表位联合rmIL-12对小鼠体内IFN-γ产生的影响

1.实验材料

多肽表位，200μg/支；rmIL-12，(美国Peprotech公司)，10μg/支/1ml。实验动物用6-8周SPF级别BALB/c小鼠，雌雄各半，体重约20g(购自中山大学实验动物中心)。主要试剂和仪器有ELISA试剂盒(晶美公司)，全自动酶标仪(BIO-RAD公司)。

2.方法

(1)分组和给药方法：BALB/c小鼠随机分为空白对照组、多肽表位组、rmIL-12组、多肽表位+rmIL-12组。其中多肽表位+rmIL-12组按多肽剂量分为高中低三个小组。每组12只小鼠，皮下给药，注射部位为小鼠颈背部，隔周一次，共免疫5次。免疫前，第二次及第四次免疫后24h各采血一次，眼眶采血300ul，离心后取血清冷藏待检；连续免疫5次后两周处死小鼠，取脾脏，分离淋巴细胞，观察乙肝病毒抗原多肽联合rmIL-12制剂对BALB/c小鼠体内IFN-γ产生的影响，以判断多肽与IL-12在激发免疫应答时是否存在协同效应。实验分组及给药情况如下：

空白对照组：注射同量生理盐水(第一组)

多肽表位组：注射乙肝病毒多肽表位(每条多肽各180μg)/只/次

rmIL-12组：注射mIL-12(0.3μg)/只/次

多肽表位(高剂量)+rmIL-12组：多肽表位(每条多肽各180μg)+mIL-12(0.3μg)/只/次

多肽表位(中剂量)+rmIL-12组：多肽表位(每条多肽各60μg)+mIL-12(0.3μg)/只/次

多肽表位(低剂量)+rmIL-12组：多肽表位(每条多肽各20μg)+mIL-12(0.3μg)/只/次

(2)检测方法

a)多肽表位联合rmIL-12免疫小鼠体内诱导血清IFN-γ的产生

免疫前，第二次及第四次免疫后24h各采血一次，眼眶采血300ul，离心后取血清冷藏待检。实验结束时，各取100ul加入96孔培养板，各孔中分别加入含10％胎牛血清的1640培养基，实验孔中添加刺激物，以及空白培养液作为对照，每组设3个复孔，37℃，5％CO₂湿润条件下培养48h，之后取其上清，用ELISA方法检测PBMC培养上清液IFN-γ水平。实验结果进行统计学处理。

b)多肽表位联合rmIL-12免疫小鼠体内诱导T淋巴细胞IFN-γ的产生

连续5次免疫后两周处死小鼠，取脾脏，分离淋巴细胞，制成细胞悬液，加入1640培养基，调整细胞浓度为2.0×10⁶个/ml，加入培养板200μL/孔，实验孔中加入终浓度为10μg/ml 的各多肽表位，对照孔加等量生理盐水，一式三复孔，5％CO₂培养48h，ELISA法检测IFN-γ。检测严格按IFN-γ检测试剂盒使用说明书操作，用酶标仪读取各孔OD值，在标准曲线上核算出IFN-γ浓度值。实验结果进行统计学处理。

3.实验结果

(1)多肽表位联合rmIL-12免疫小鼠体内诱导血清IFN-γ的产生

免疫前，第二次及第四次免疫后24h各采血一次检测血清IFN-γ的产生。第二次免疫后24h，单独使用多肽诱导血清IFN-γ产生的量很少；(多肽使用高中剂量时)多肽表位联合rmIL-12比单用IL-12免疫小鼠血清IFN-γ的产生的量具有较为明显的协同效应。随着免疫次数与时间的增长，多肽表位联合rmIL-12同样显示较为明显的协同效应，但血清IFN-γ的产生有下降趋势。具体结果见表8。

表8多肽表位联合rmIL-12免疫小鼠体内诱导血清IFN-γ(pg/ml)的产生

(2)多肽表位联合rmIL-12免疫小鼠体内诱导T淋巴细胞IFN-γ的产生

小鼠免疫5次后两周，取脾脏T淋巴细胞检测IFN-γ的产生，同样单用多肽只诱导很少量IFN-γ细胞因子的产生，多肽表位联合rmIL-12比单用IL-12具有明显的协同效应。结果见表9。

表9多肽表位联合rmIL-12免疫小鼠体内诱导T淋巴细胞IFN-γ的产生

实施例8 运用流式细胞技术对多肽表位联合rhIL-12刺激健康人PBMCs产生IFN-γ⁺ 细胞的种类和频率分析

1.方法

(1)分离PBMCs：2名健康人，各抽取静脉血10ml，肝素抗凝80U/ml血，RMPI 1640基础培养液1∶2稀释混匀，以1∶1的比例将稀释的血液沿管壁缓缓叠加于Ficoll淋巴细胞分离液(密度：1.077±0.002)上分离PBMCs细胞，再用RMPI 1640基础培养液洗两次，用含10％灭活胎牛血清的RMPI 1640基础培养液配制细胞悬液，计数细胞，同时用台盼兰检测细胞活力，要求细胞活力＞95％以上，调整细胞浓度为2×10⁶/ml。

(2)激活：将浓度为2×10⁶/ml的细胞分别加入6管15ml细胞离心管中，每管1ml，具体如下：

a)细胞1000μl

b)细胞1000μl+IL-12(2ng/ml)

c).细胞1000μl+HBV-Ag多肽(各2μg/ml)

d)细胞1000μl+IL-12(2ng/ml)+HBV-Ag多肽(各2μg/ml)

e)细胞1000μl+cAg(2μg/ml)

f)细胞1000μl+IL-12(2ng/ml)+cAg(2μg/ml)

注意混匀，37℃，5％CO₂分别温育0h、24h。

(3)除0h外各方法温育的最后2h加蛋白转运抑制剂(BFA)10μg/ml，注意混匀。

(4)离心收集上清低温保存，用ELISA法检测培养上清中IFN-γ含量。细胞用PBS洗2次(1000转、5分钟)，注意用纸吸干后加固定液，每管各加4％PFA 2ml，注意混匀，室温8分钟。

(5)用PBS洗2次(2000转、10分钟)，注意用纸吸干，各加破膜剂(buffer 3)400μl，4℃过夜。

(6)染色：每管二个组合，每组100μl细胞。一组加入PE标记的CD3抗体、PreCP标记的CD4抗体、FITC标记的CD8抗体、APC标记的IFN-γ抗体；另一组加入FITC标记的CD3抗体、PE标记的CD56抗体、APC标记的IFN-γ抗体。每次均以PE标记的mouseIgG1、PreCP标记的mouseIgG1、FITC标记的mouseIgG1、APC标记的mouseIgG1作同型对照。每种抗体加入量均为2μl。4℃，避光30分钟。

(7)用洗液Perm/Wash^TM buffer(用蒸馏水10倍稀释成1×)洗2次。

(8)每管各加含0.1％BSA的PBS 300μl。

2.结果

实验结果表明多肽和IL-12的协同刺激增加IFN-γ产生的作用主要是通过促进NK、Th和CTL产生IFN-γ来达到的，说明联合的协同作用是通过激发非特异性免疫反应和多肽表位决定的特异性免疫反应共同作用来达到的。实验结果见表10及表11：

表10多肽表位联合rhIL-12体外刺激人PBMC流式细胞分析结果(健康人1)

^*IL-12浓度为2ng/ml；^**cAg浓度为2μg/ml；^***多肽表位浓度为每条肽2μg/ml。

表11多肽表位联合rhIL-12体外刺激人PBMC流式细胞分析结果(健康人2)

本发明根据上述实验结果，选择疫苗制剂中表位多肽和重组人白介素-12重量之比为200～20000∶1，根据本领域的相关经验，结合体内体外实验结果确定，CTL表位多肽、HTL表位多肽、重组人白介素-12三部分的人体拟定用量范围为200μg～6mg∶100μg～3mg∶1μg～10μg。

实施例9疫苗制备之一

取IL-122mg，取FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、IPIPSSWAF、RWMCLRRFII、YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAWTLKAAA和RHYLHTLWKAGILYK这些多肽每条多肽25mg，加1000ml注射用水，搅拌使溶解，再加入甘露醇40g，白蛋白1g，混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液无菌分装于灭菌西林瓶，每瓶1ml，冷冻干燥，压塞，压盖，即得本发明多肽疫苗。

实施例10疫苗制备之二

取IL-12 1mg，取FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、IPIPSSWAF、RWMCLRRFII、YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAWTLKAAA和RHYLHTLWKAGILYK这些多肽每条多肽100mg，加1000ml注射用水，搅拌使溶解，再加入甘露醇40g，白蛋白1g，混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液无菌分装于灭菌西林瓶，每瓶1ml，冷冻干燥，压塞，压盖，即得本发明多肽疫苗。

实施例11疫苗制备之三

取IL-125mg，取FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、IPIPSSWAF、RWMCLRRFII、YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAWTLKAAA和RHYLHTLWKAGILYK这些多肽每条多肽300mg，加1000ml注射用水，搅拌使溶解，再加入甘露醇40g，白蛋白2g，混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液无菌分装于灭菌西林瓶，每瓶1ml，冷冻干燥，压塞，压盖，即得本发明多肽疫苗。

实施例12疫苗制备之四

取IL-12 10mg，取FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、 HTLWKAGILYK、IPIPSSWAF、RWMCLRRFII、YMDDVVLGV、AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、AKFVAAWTLKAAA和RHYLHTLWKAGILYK这些多肽每条多肽750mg，加1000ml注射用水，搅拌使溶解，再加入甘露醇40g，白蛋白4g，混匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，滤液无菌分装于灭菌西林瓶，每瓶1ml，冷冻干燥，压塞，压盖，即得本发明多肽疫苗。

[0174] 核苷酸或氨基酸序列表

<110>广州市恺泰生物科技有限公司

<120>一种治疗性乙肝疫苗及其制备方法和用途

<140>200810026075.1

<141>2008-01-29

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(183)...(191)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>1

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile

1 5

<210>2

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(236)...(245)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>2

Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile

1 5 10

<210>3

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(249)...(258)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>3

Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu

1 5 10

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(313)...(321)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>4

Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe

1 5

<210>5

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(332)...(342)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>5

Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe

1 5 10

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(335)...(343)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>6

Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val

1 5

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(359)...(369)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>7

Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr

1 5 10

<210>8

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(180)...(194)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>8

Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser

1 5 10

<210>9

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(339)...(353)

<223>乙肝病毒包膜抗原

<400>9

Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val

1 5 10

<210>10

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(18)...(27)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>10

Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5 10

<210>11

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(19)...(27)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>11

Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val

1 5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(88)...(96)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>12

Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys

1 5

<210>13

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(101)...(110)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>13

Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe

1 5 10

<210>14

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(117)...(125)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>14

Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp

1 5

<210>15

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(137)...(147)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>15

Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr

1 5 10

<210>16

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(141)...(151)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>16

Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg

1 5 10

<210>17

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(419)...(428)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>17

Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser Ala Leu Tyr

1 5 10

<210>18

<211>20

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(50)...(69)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>18

Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile

1 5 10

Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala

15 20

<210>19

<211>20

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(120)...(139)

<223>乙肝病毒核心抗原

<400>19

Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro

1 5 10

Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile

15 20

<210>20

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(47)...(55)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>20

Asn Val Ser Ile Pro Trp Thr His Lys

1 5

<210>21

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(149)...(159)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>21

His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys

1 5 10

<210>22

<211>8

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(166)...(173)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>22

Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr

1 5

<210>23

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(354)...(363)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>23

Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe

1 5 10

<210>24

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(388)...(397)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>24

Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg

1 5 10

<210>25

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(392)...(401)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>25

Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu

1 5 10

<210>26

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(415)...(424)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>26

Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr

1 5 10

<210>27

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(429)...(437)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>27

His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu

1 5

<210>28

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(455)...(463)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>28

Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu

1 5

<210>29

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(530)...(539)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>29

Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met

1 5 10

<210>30

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(531)...(539)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>30

Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg

1 5

<210>31

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(538)...(546)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>31

Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Val

1 5

<210>32

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(562)...(570)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>32

Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu

1 5

<210>33

<211>11

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(640)...(650)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>33

Tyr Pro Ala Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile

1 5 10

<210>34

<211>10

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(665)...(674)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>34

Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Tyr Tyr Lys

1 5 10

<210>35

<211>9

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(745)...(753)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>35

Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu

1 5

<210>36

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(96)...(110)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>36

Val Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile

1 5 10

<210>37

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(145)...(159)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>37

Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys

1 5 10

<210>38

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(385)...(399)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>38

Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn

1 5 10

<210>39

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(412)...(426)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>39

Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu

1 5 10

<210>40

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(420)...(434)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>40

Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe

1 5 10

<210>41

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(501)...(515)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>41

Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile

1 5 10

<210>42

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(523)...(537)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>42

Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val

1 5 10

<210>43

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(618)...(632)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>43

Lys Gln Cys Phe Arg Lys Leu Pro Val Asn Arg Pro Ile Asp Trp

1 5 10

<210>44

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(664)...(678)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>44

Lys Gln Ala Phe Thr Phe Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys

1 5 10

<210>45

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(694)...(708)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>45

Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu

1 5 10

<210>46

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(767)...(781)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>46

Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro

1 5 10

<210>47

<211>15

<212>PRT

<213>乙肝病毒(hepatitis B virus)

<220>

<221>CHAIN

<222>(774)...(788)

<223>乙肝病毒多聚酶蛋白

<400>47

Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp

1 5 10

<210>48

<211>13

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>VARIANT

<223>padre序列

<400>48

Ala Lys Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala

1 5 10

Claims

1.一种用于制备治疗性乙肝疫苗的组合物，其特征在于该组合物是由人体有效剂量的表位多肽、重组人白介素-12和药用辅料共同组成的冻干制剂，其中表位多肽和重组人白介素-12重量之比为200～20000∶1，其中的表位多肽由来自乙肝病毒蛋白抗原的CTL表位多肽FLPSDFFPSV、YVNVNMGLK、STLPETTVVRR、TPARVTGGVF、HTLWKAGILYK、IPIPSSWAF、RWMCLRRFII、YMDDVVLGV和HTL表位多肽AGFFLLTRILTIPQS、LHLYSHPIILGFRKI、RHYLHTLWKAGILYK以及通用HTL表位多肽padre序列AKFVAAWTLKAAA组成。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的表位多肽中CTL表位多肽∶HTL表位多肽以及通用HTL表位多肽padre序列的重量比为2∶1。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于所述的CTL表位多肽、HTL表位多肽以及通用HTL表位多肽padre序列、重组人白介素-12的重量范围为200μg～6mg∶100μg～3mg∶1μg～10μg。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于所述的药用辅料为甘露醇、蔗糖、白蛋白、右旋糖酐、聚维酮40、NaCl、水解明胶、乳糖或山梨醇中的至少一种。

5.权利要求1所述一种用于制备治疗性乙肝疫苗组合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)用Fmoc固相肽合成法合成所需表位多肽；(2)在100级以下车间，量取各抗原表位肽和rhIL-12，加入药用辅料，用注射用水溶解，溶液经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装于适当容量玻璃容器瓶中，冷冻干燥，扎盖，包装即得成品。

6.权利要求1所述的组合物在制备慢性乙肝感染以及预防和治疗乙肝病毒相关肿瘤的治疗性乙肝疫苗中的应用。