CN101618211A

CN101618211A - 一种乙肝多肽疫苗及其应用

Info

Publication number: CN101618211A
Application number: CN200810029216A
Authority: CN
Inventors: 郭妍; 曹春来; 肖拥军
Original assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: ZHUHAI LIANBANG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2008-07-03
Filing date: 2008-07-03
Publication date: 2010-01-06

Abstract

本发明公开了一种新型乙肝多肽疫苗及其应用。一种乙肝多肽疫苗，含有多肽，所述多肽能刺激引起CTL反应，并且所述多肽序列中含有1个突变的氨基酸残基，突变位于肽段的N末端或C末端。所述疫苗含有一种多肽或者一种以上多肽。所述乙肝多肽疫苗应用于制备治疗乙肝病毒慢性感染持续状态及相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物，可有效避免由天然病毒多肽序列引起的免疫耐受。

Description

一种乙肝多肽疫苗及其应用

【技术领域】

本发明涉及多肽疫苗领域，具体地说是一种具有治疗性作用的乙型肝炎多肽疫苗，本发明还涉及该疫苗作为治疗乙肝的药物制剂的应用。

【背景技术】

乙型肝炎病毒是一种具有很强传染性的病毒，全球目前约有3亿5千万人口感染乙型肝炎病毒，每年大约有1百万感染者死于乙型肝炎及由乙型肝炎诱发的肝硬化，肝坏死和肝癌。乙型肝炎可以分为急性及慢性两种，95％左右急性乙肝患者可以通过治疗而痊愈；5％左右转变成慢性乙型肝炎。绝大多数的慢性乙肝患者成为终生病毒携带者。

中国是世界上罹患慢性乙肝最严重的国家。全国乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带率平均10％(表面抗原携带者约1亿人)。全国人群乙型肝炎感染率高达60％(约有6亿多人已被乙肝病毒感染过)。若不及时有效地清除乙型肝炎病毒(HBV)，约25％的乙肝病毒携带者会发展为肝硬化，5-10％的患者会演变成肝癌。目前人们对乙型病毒性肝炎主要采取预防手段，即接种乙型肝炎疫苗进行预防。预防疫苗主要用于从未感染过的机体，因此天然结构的病毒蛋白可直接作为疫苗抗原。但是已经开发出应用的乙型肝炎病毒疫苗，虽然能对HBV感染起到良好的预防作用，但对感染HBV的机体，却难以发挥治疗和清除病毒的作用。主要原因在于机体对乙肝病毒产生了特异性免疫耐受，免疫系统不能有效地清除病毒。世界范围内对乙肝特别是无症状病毒携带者和慢性乙肝患者，一直没有疗效确实及根治的方法，现有的干扰素等药物不仅价格昂贵，而且效率低，容易复发。

近年来，随着体外大量培养病毒技术、同位素标记技术和对病毒及亚结构分析和纯化方法的发展，人们对病毒结构的认识日趋丰富。与此同时，将病毒分解成各有效生物活性成分的方法也已出现。人们发现一些含类脂病毒(如流感病毒、麻疹病毒和水泡性口炎病毒等)的表面成分或其蛋白的一部分肽段，在免疫动物后会产生一定的保护性免疫。同时，蛋白质分析方法及免疫学都有了长足的发展，这些新方法使我们可以迅速而又准确地确定病原体中可诱导免疫应答的蛋白质及其片段，并产生了一种新疫苗-多肽表位疫苗。多肽表位疫苗就是在具有抗原性的蛋白中选取单一表位或者多个表位进行组合，搭配，因而可以在较小的分子中展现完整蛋白的免疫原性。合成多肽生产费用低且便于纯化，又不含诸如微生物培养物或其他病毒或白蛋白的残留物等生物成分。另一优点是多肽合成的重复性好，每批产品均可通过N端测序和氨基酸分析来控制。所以其结构简单，易于生产而且高效、高特异性的特点使之成为当今疫苗研发的热点。

多肽疫苗是目前研究领域内较受重视的研究方向之一。尤其是病毒多肽疫苗的研究取得了许多进展，结果令人鼓舞。1999年美国NIH公布了两种HIV-1病毒多肽疫苗，对人体进行的I期临床试验结果，证实两种多肽能刺激机体产生特异性抗体和特异性细胞免疫，并有较好的安全性。我国清华大学也证实HIV-I膜蛋白内一段多肽有很强的免疫原性。丙肝病毒多肽疫苗也显示有良好的发展前景，国外学者从丙肝病毒(HCV)外膜蛋白E2内筛选出一般多肽，它可刺激机体产生保护性抗体。其它病毒的多肽疫苗及抗肿瘤、避孕多肽疫苗的研究也取得了较大进展。

美国Scripps研究所的FV Chisari申请了四项美国专利，主要内容是关于在HBV抗原上所确定的分别来源于核心抗原、表面抗原、多聚酶和X抗原的CTL表位。目前国内文献所报道的以激活免疫系统为基础的乙肝多肽疫苗大都集中于选用HBV病毒的蛋白的天然序列。当前，对HBV慢性持续感染状态尚无根治的方法。如何打破机体慢性感染所形成的免疫耐受状态，治愈乙肝是抗HBV治疗研究的重要课题。

【发明内容】

本发明的目的就是为了克服目前乙肝疫苗的缺点，提供一种具有强细胞免疫原性可以作为治疗用的、不易产生HBV感染免疫耐受、使用安全的疫苗；同时，本发明还提供一种制备简单、易于构建、稳定性好的乙肝疫苗的制备方法，本发明还涉及这种乙肝疫苗作为治疗乙肝的药物制剂的应用。

抗原表位是抗原诱生特异性免疫应答的最小的结构和功能单位，包括B细胞抗原表位、T辅助细胞表位和杀伤性T细胞表位。由于不同类型免疫应答的下调、缺乏及紊乱是许多疾病的病因，因此以抗原表位为基础的疫苗设计日益受到重视。在表位水平上对抗原性的认识已促成这样一种趋势：基于抗原分子的免疫干预手段已不再停留于病原体或天然抗原整体分子水平而开始向表位水平过度。以表位为基础的疫苗包括多肽疫苗和以表位为基础的基因疫苗等。HBV慢性感染的机制之一是机体不能诱生有效的特异性免疫应答，尤其是病毒特异性的CTL应答。研究证实在HBV慢性感染中，特异性CTL的数量和活性明显下降，不足以清除肝细胞内感染的病毒。由于机体的免疫机制清除感染的肝炎病毒主要依赖于特异性的细胞免疫，而慢性感染者缺乏或下调了病毒特异性的细胞免疫，因此，如何增强特异性细胞免疫，特别是诱生HBV特异性CTL应答是治疗性疫苗设计的主要策略。

本发明正是以多肽疫苗的方式入手，已知HBV基因中的表面蛋白抗原在HBV与肝细胞相应受体的粘附中起重要作用，而且在自然感染状态下，可能与病毒清除密切相关，因此本发明选取表面蛋白的CTL抗原决定簇。

HBV疫苗免疫比自然感染诱导的免疫应答范围窄，从而产生一种可能性，即HBsAg中单个氨基酸置换可使这种HBV变异株能在疫苗免疫个体内复制，但不能在自然免疫个体内复制。Wilson等假设，对于预防HBV疫苗逃逸突变株的传播“需要含有能诱导抗常见HBV突变株中和抗体的特异性表位的疫苗”。合成多肽的方法符合这些要求，在单个剂量中可以包括不同序列，也可对疫苗进行改变以加入新出现的变异序列。因此，本发明主要选取了能防止免疫逃逸和免疫耐受的天然病毒表位的变异序列，且表位的筛选来自亚裔人种的病毒的主要亚型。

另外，多表位的联合使用将有可能诱导出多重免疫效果，进一步地避免病毒的逃逸。但是过多的表位一起使用将造成表位间的互相竞争与抑制作用，不利于有效的CTL的诱生。因此，本发明选用了两种多肽表位，既可产生双价的免疫原性，同时又避免了过多的表位间的竞争抑制作用。

本发明的构建疫苗采用Fmoc多肽合成法，合成药学上可以接受两条多肽主体；本发明还可以加入佐剂，如聚肌胞，阳离子脂质体，白细胞介素IL-12，GM-CSF，γ-干扰素等，也可以不加佐剂。所述的药物组合物可以通过常规的免疫途径应用于人类，从而引发免疫应答。所述应用途径包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、静脉注射和鼻粘膜滴注等。

本发明的疫苗可以有效地诱导HBV特异性杀伤性T细胞的产生，因此可作为慢性乙型肝炎治疗性多肽疫苗，用于打破HBV感染的免疫耐受，对慢性乙型肝炎进行治疗。通过本发明后续的实施例表明，用本发明构建的多肽疫苗免疫HLA-A2转基因小鼠产生了小鼠T细胞，能特异性地识别并清除带有HBV多肽以及被乙肝表面蛋白标记的靶细胞。本发明的实施例还表明HBV核酸疫苗能特异性诱导IFN-γ的分泌。

以下将结合附图和实施例详细说明本发明，应当说明的是，实施例是对本发明的技术方案的进一步说明，但并不表明本发明仅限于这些实施例。

【附图说明】

图1多肽体外活性检测结果

图2是本发明乙肝多肽疫苗免疫时间及方式图；

图3是HBV-S2A和HBV-S5A诱导HLA-A2转基因小鼠的特异性的CTL扩增的ELSPOT实验的直方图：

图4-5是HBV天然多肽刺激UV-B52免疫后的小鼠的脾细胞导致HBV特异性的CTL扩增分析：图4是针对S2和S5的特异性的CTL扩增的直方图，图5是针对S2和S5的Tetramer实验和ELISPOT实验结果图。

图6-8HBV-S2A和HBV-S5A特异性的CTL特异性地识别HBV天然多肽的试验结果图：图6为特异性的CTL扩增的tetramer实验结果图，图7是针对S2A的51铬释放实验结果图，图8为针对S5A的51铬释放实验的结果图。

【具体实施方式】

实施例1T细胞抗原决定簇的筛选和改造：

本发明是基于表位的疫苗设计(英文译名为：EPITOPE-BASED VACCINEDESIGN，EBVD)。首先筛选靶抗原，通过高分辨率的免疫识别研究获得表位图谱。以多种杀伤性T细胞实验进行功能筛选，选取具有较强免疫原性的杀伤性T细胞的表位。

再对其进行氨基酸的修饰与改造与修饰，采用计算机辅助疫苗设计”(Computers Aid Vaccine Design，CAVD)技术对改造和修饰进行分析。采用不同的分析软件，如NetMHC3.0，HLA peptide binding predictions，MHCPred，MHC form等软件，分析的主要方面有多肽的与MHC I类分子的结合能力，结合能量以及浓度。

根据软件分析的结合能力数值，结合能量的大小以及IC50的浓度值，筛选获得十七个乙肝表面抗原HBsAg杀伤性T细胞抗原决定簇表位的类似物：

1)HBV-S1A：YLQAGFFLL

2)HBV-S2A：VLQAGFFLV

3)HBV-S3A：YLDSWWTSL

4)HBV-S4A：ILLLCLIFV

5)HBV-S5A：FLLTRILTV

6)HBV-S6A：FIIFLFILV

7)HBV-S7A：FLFILLLCV

8)HBV-S8A：LLLCLIFLV

9)HBV-S9A：YLLLCLIFL

10)HBV-S10A：YLLCLIFLL

11)HBV-S11A：YLLDYQGML

12)HBV-S12A：YMLPVCPLL

13)HBV-S13A：YLSLLVPFV

14)HBV-S14A：YMWYWGPSL

15)HBV-S15A：YLSPFLPLL

16)HBV-S16A：MMWYWGPSV

17)HBV-S17A：VLLDYQGMV

实施例2HBV-S5A多肽的合成工艺

本实施例的构建多肽疫苗采用Fmoc合成方法，根据多肽序列羧基端选择不同的多肽树脂，如羧基端为颉氨酸，选择Fmoc Val-Wang-Resin(购于吉尔生化)，如羧基端为亮氨酸，选择Fmoc Leu-Wang-Resin(购于吉尔生化)进行合成。合成步骤如下：

9种带侧链保护基的Fmoc-氨基酸原料-固相合成-脱侧链保护基-HPLC纯化-冷冻干燥

1.氨基酸

2.固相合成的过程

采用HBTU/HOBt法活化氨基酸，按照序列连接到氨基树脂上，共进行8步合成。

以10mmole规模为例，称取树脂20克(树脂装载率为0.5mmole/g)，倒入多肽合成仪反应器内，按照目标多肽的氨基酸序列从C-端向N-端称取40mmole相应的带保护基氨基酸，并排列在合成仪中。在室温条件下，按照电脑程序分别自动进行完成8步合成反应。

合成结束后，得到带侧链保护基的多肽树脂。取出多肽树脂，放入真空干燥器中干燥2小时后称重。

3.脱保护基及沉淀：

将带保护基的目标多肽树脂置入带塞的三角烧瓶中，加入裂解试剂如下表：

恒温在25℃条件下，搅拌反应2小时；过滤、收集滤液，树脂用少量三氟乙酸洗涤，过滤合并入收集液。在搅拌下，滴加3000mL冰乙醚(-10℃)，得到白色沉淀，过滤，用少量冰乙醚洗涤粗品，并将粗品放入真空干燥器中干燥过夜。

4.HPLC纯化

通过HPLC反相纯化制备得到目标多肽纯品三氟乙酸盐溶液(纯度＞95％)。

①色谱柱：

50mm*250mm Kromasil RP-18 10μm 100A制备色谱柱

②流动相：

A：0.1％三氟乙酸水溶液

B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液

③上样溶液：

将多肽粗品(纯度约40～50％)用：0.1％三氟乙酸水溶液配成浓度为8.0mg/ml(按粗品计算)的溶液，并通过0.22μm滤膜过滤。

④洗脱条件：

采用线性梯度洗脱，流速为120ml/min，紫外280nm检测，洗脱梯度如下表：

⑤样品收集：

在20-35分钟期间，按照60ml/瓶分布收集洗脱主峰，并对各个样品液进行分析检测。合并所有纯度大于98％的样品液。

(4)换盐

将纯化好的样品液通过HPLC反相换盐制备得到多肽粗品纯品乙酸盐溶液(纯度＞98％)。

①色谱柱：

50mm*250mm Kromasil RP-18 10μm 100A制备色谱柱

②流动相：

A：0.5％乙酸水溶液

B：0.5％乙酸乙腈溶液

③上样溶液：

向多肽纯溶液加入等体积超纯水。

④洗脱条件：

⑤样品收集：

收集所有洗脱主峰溶液。

⑥除去乙腈：

将多肽溶液倒入圆底烧瓶，25℃，-0.099Mpa条件下旋转蒸发，除去所有乙腈，剩余液体通过0.22μm滤膜过滤，留待冷冻干燥。

5.冷冻干燥

将目标多肽醋酸水溶液倒入真空冷冻干燥机样品盘内，按照电脑程序进行冻干。

实施例3多肽活性的活性检测实验

采集HLA-A2的正常人的血液，Fioll-Hypaque法离心分离PBMC，用RPMI160完全培养基(含10％胎牛血清)调节细胞浓度为1×10⁶/ml，体外培养24h，待其恢复原生长状态后进行后续处理。

将分离的得到的HLA-A2人PBMC制成单细胞悬液，以2×10⁵/ml浓度悬浮于RPMI1640培养液(含10％胎牛血清、10ng/ml抗原、30U/ml rhIL-2)中，分配于24孔细胞培养板内，持续培养1周后，以1000r/min离心10min，去上清，用前述培养液重悬，用各种表位肽刺激，每周刺激1次，共两次，末次刺激24h后，离心收集细胞，用前述培养液调节细胞至1×10⁶/ml，用作效应细胞。

采用T2细胞作为靶细胞，生长状态良好的T2细胞，用前2h加入相应的多肽(1μg/ml)预包被，用⁵¹Cr标记后，按照效靶比(E/T)50∶1与效应细胞共培养4h，培养结束后取上清检测γ计数值，如图1所示。

实施例4HBV-S2A和HBV-S5A诱导HLA-A2转基因小鼠的CTL活性

为了评价HBV-S2A和HBV-S5A诱导的CTL应答的效力，用UV-B52(指HBV-S2A多肽与HBV-S5A多肽)对HLA-A2转基因小鼠进行免疫。取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分别溶于1ml PBS，给药前与等体积的1mg/ml的聚肌胞(Sigma，#Cat.P1530)混合后用1ml的注射器经皮下注射给药。两组动物分别在第1，4，15，和18天以多肽佐剂(对照)或25μl UV-B52-S2A和25μlUV-B52-S5A以摩尔比1∶1的比例联合进行免疫，免疫时间及剂量见图2。每只小鼠注射的总剂量(4次)为100μg。

在最后一次给药后两周，以双盲法收集脾细胞。将每只动物的脾脏收集至一个含有5mlRPMI培养基的15ml的离心管中，并在管子上标记转基因小鼠的编号。样品保存于冰上，并于收集的当天进行分析。将脾脏碾磨并制成单细胞悬液。用密度梯度离心法(Lympholyte Mammal，Cedarlane Labs)分离单核细胞，并在细胞培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至1x10⁷细胞/ml。

将每只小鼠的脾细胞收集后分为四组，在预包被了具有高亲和性的单克隆抗体的ELISPOT的板中，每孔置来自免疫组或对照组的脾细胞1x10⁶个，并加入10μg/ml的HBV-S2A，HBV-S5A，对照多肽或者不加多肽共同进行孵育。在37℃，5％CO₂ and 100％湿度的培养箱中培养24小时后，溶解细胞并洗脱。细胞因子在释放的区域被捕获并由一个结合了生物素的抗细胞因子抗体标记。经显色后形成一个黑点。用ELISPOT计数器计算斑点的数量，即活化的T细胞的数量。经显色，在AID国际平板计数器上，用3.2.3版IFN-γ斑点计数软件分析每只被免疫动物针对每种抗原的γ-IFN斑点。

与对照组相比，在用HBV多肽类似物免疫的小鼠脾脏T细胞中，检测到了高水平的多肽特异性的CTL活性。ELISPOT分析表明，HLA-A2转基因小鼠对HBV-S2A和HBV-S5A产生了较强的免疫应答，10只小鼠的脾细胞均可诱导IFN-γ的产生(见图3)。而在注射多肽载体的动物(对照组)中，未产生显著的应答(见图3)。

实施例5HBV天然多肽刺激UV-B52免疫后的小鼠的脾细胞导致HBV特异性的CTL扩增

为了评价HBV-S2A和HBV-S5A诱导的CTL的数量的扩增能力，用UV-B52对HLA-A2转基因小鼠进行免疫。取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分别溶于1ml PBS，给药前与等体积的1mg/ml的聚肌胞(Sigma，#Cat.P1530)混合后用1ml的注射器经皮下注射给药。两组动物分别在第1，4，15，和18天以多肽佐剂(对照)或25μl UV-B52-S2A和25μl UV-B52-S5A以摩尔比1∶1的比例联合进行免疫，免疫时间及剂量见图2。每只小鼠注射的总剂量(4次)为100μg。

在最后一次给药后两周，以双盲法收集脾细胞。将每只动物的脾脏收集至一个含有5mlRPMI培养基的15ml的离心管中，并在管子上标记转基因小鼠的编号。样品保存于冰上，并于收集的当天进行分析。将脾脏碾磨并制成单细胞悬液。用密度梯度离心法(Lympholyte Mammal，Cedarlane Labs)分离单核细胞，并在细胞培养基中重悬细胞。调整细胞浓度至1x10⁷细胞/ml。将每只小鼠的脾细胞分成两份，每份1x10⁶个细胞，与鼠-抗鼠CD8a(Ly-2)单克隆抗体(BDBiosciences，553031)和HBV-S2A tetramer或者鼠-抗鼠CD8a(Ly-2)单克隆抗体(BD Biosciences，553031)和HBV-S5A tetramer共染色。用BD FACSCalibur流式细胞仪进行数据收集，并用cellquest软件进行淋巴细胞分类，计算在CD⁸⁺CTL亚群中tetramer⁺的细胞的百分比。用天然的S2多肽刺激UV-B25免疫后的小鼠脾细胞，6天后，检测培养物中CD8+HLA-A2/S2四聚体阳性细胞的数量。免疫小鼠新鲜脾细胞中，该细胞的检测频率为0.19％(见图4)。用天然S2刺激后，细胞数量显著增加，其频率为4.97％，扩增了25倍(见图5)，而S5组的试验结果也与此相似，且频率更高，扩增倍数为33倍。与之相比，对照组经S2或S5刺激后的小鼠脾细胞，频率未显著改变(见图3)。

实施例6HBV-S2A和HB V-S5A特异性的CTL特异性地识别HBV天然多肽的免疫原性分析

为了检测HBV-S2A和HBV-S5A诱导的T细胞能否特异性识别天然的HBV多肽，采用来自HBV-S2A和HBV-S5A免疫后的T细胞，用ELISPOT法检测多肽特异性的IFN-γ释放，并用51铬放射分析检测多肽诱导的特异性杀伤功能。

取HBV-S2A和HBV-S5A各2mg分别溶于1ml PBS，给药前与等体积的1mg/ml的聚肌胞(Sigma，#Cat.P1530)混合后用1ml的注射器经皮下注射给药。两组动物分别在第1，4，15，和18天以多肽佐剂(对照)或25μl UV-B52-S2A和25μl UV-B52-S5A以摩尔比1∶1的比例联合进行免疫，免疫时间及剂量见图2。每只小鼠注射的总剂量(4次)为100μg。

将每只小鼠的脾细胞收集后分为四组，在预包被了具有高亲和性的单克隆抗体的ELISPOT的板中，每孔置来自免疫组或对照组的脾细胞1x10⁶个，并加入10μg/ml的HBV-S2A，HBV-S5A，对照多肽或者不加多肽共同进行孵育。在37℃，5％ CO2 and 100％湿度的培养箱中培养24小时后，溶解细胞并洗脱。细胞因子在释放的区域被捕获并由一个结合了生物素的抗细胞因子抗体标记。经显色后形成一个黑点。用ELISPOT计数器计算斑点的数量，即活化的T细胞的数量。经显色，在AID国际平板计数器上，用3.2.3版IFN-γ斑点计数软件分析每只被免疫动物针对每种抗原的γ-IFN斑点。

将5x10⁶个来自于对照组与免疫组的脾细胞与5x10⁶个经脂多糖刺激72小时后，伽玛照射和加载多肽的同源小鼠的脾细胞置24孔板中共同培养，48小时后，加入1ng/ml鼠重组IL-2。细胞培养6天后，从培养板中收集CTLs，计数后将CTL分成三组，三组浓度分别为1x10⁷/ml，3x10⁶/ml和1x10⁶/ml。每组三孔，每孔加100ul置96孔板中置37℃备用。用T2细胞(来自美国模式菌体收藏中心)做为靶细胞测定CTL的免疫原性。将3x10⁶T2细胞分成3组，一组不加多肽作为对照，另两组分别加入25μg HBV-S2A和HBV-S5A，每组加入100uCi的51Cr，37℃培养1个小时。标记和装载后，洗脱细胞三次，再次制成悬浮液，浓度为10⁵/ml。在上述含有CTL的U形板中，每孔加入100μl靶细胞。为了测定自发及最大释放量，每个靶位配制另外6个含有100μl靶细胞的孔。其中三孔加入100μl培养液，用于测定自发释放量；另三孔加入100μl2％SDS，用于测定最大释放量。37℃培养4小时后收集上清液，用γ计数器进行计数。按照以下方法对特异性裂解进行确定：％特异释放＝[(试验释放值-自发释放值)/(最大释放值-自发释放值)]x100％。按以下方法表达数据：X轴表示效应靶位比；y轴表示相应的特异性裂解百分比。将试验组小鼠脾细胞的结果与未免疫小鼠的脾细胞结果进行对比。

如图6-8所示，HBV-S2A特异性的CTL能有效地交叉识别天然的S2多肽和S5多肽，其中Tetramer实验显示针对S2A和S5A的特异性的CTL有明显的扩增(见图6)，51铬释放实验显示这些特异性的CTL能导致靶细胞的裂解(T2分别加入了天然的S2和S5)。而这些CTL对不含多肽的T2对照细胞无影响(见图7-8)。

序列表

<110>珠海联邦制药股份有限公司

<120>一种新型乙肝多肽疫苗及其应用

<160>17

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>1

Tyr Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu

1 5

<210>2

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>2

Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Val

1 5

<210>3

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>3

Tyr Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu

1 5

<210>4

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>4

Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Val

1 5

<210>5

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>5

Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Val

1 5

<210>6

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>6

Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Val

1 5

<210>7

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>7

Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Val

1 5

<210>8

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>8

Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Val

1 5

<210>9

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>9

Tyr Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu

1 5

<210>10

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>10

Tyr Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>11

Tyr Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu

1 5

<210>12

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>12

Tyr Met Leu Phe Val Cys Pro Leu Leu

1 5

<210>13

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>13

Tyr Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val

1 5

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<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>14

Tyr Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu

1 5

<210>15

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>15

Tyr Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu

1 5

<210>16

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>16

Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Val

1 5

<210>17

<211>9

<212>PRT

<213>乙型肝炎病毒

<400>17

Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Val

1 5

Claims

1、一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，含有多肽，多肽能刺激引起CTL反应，并且多肽序列中含有1个突变的氨基酸残基，突变位于肽段的N末端或C末端。

2、根据权利要求1所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述疫苗含有一种或者一种以上多肽。

3、根据权利要求1或2所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列中含有9个氨基酸。

4、根据权利要求3所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽选自如下序列：VLQAGFFLV、YLQAGFFLL、FLLTRILTV、YLDSWWTSL、FIIFLFILV、FLFILLLCV、ILLLCLIFV、YLLLCLIFL、LLLCLIFLV、YLLCLIFLL、VLLDYQGMV、YLLDYQGML、YMLPVCPLL、YLSLLVPFV、MMWYWGPSV、YMWYWGPSL、YLSPFLPLL。

5、根据权利要求4所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述多肽选自如下序列：VLQAGFFLV，FLLTRILTV。

6、根据权利要求1所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述CTL反应为乙肝病毒特异性的CTL反应。

7、根据权利要求1所述的一种乙肝多肽疫苗，其特征在于，所述疫苗是药学上可接受的任意一种剂型。

8、权利要求1-7中任意一项所述的乙肝多肽疫苗在制备治疗乙肝病毒慢性感染持续状态及相关的继发性肝硬化、肝癌等疾病的疫苗或药物的用途。

9、根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述乙肝病毒慢性持续感染状态为慢性乙肝肝炎或乙型肝炎。