CN105732780A - 一种枯草颖肽素及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种枯草颖肽素及其应用。本发明提供的枯草颖肽素，该结构含有两个二硫键，第22位连接有单糖或二糖结构，以及多肽上多个位点可替换为其他的脂肪族氨基酸中的一种。该枯草颖肽素具有较好的抗乙肝生物学活性、较好的免疫促进作用等优点，与常用的抗HBV药物相比，该枯草颖肽素具有毒性小、效果明显的特点。本发明提供的枯草颖肽素在治疗病毒性肝炎、保肝护肝具有非常好的效果；具有非常好的调节免疫的功能；还可以应用于食品、饮料和保健品中，能很好的增强人体体质，提高人体免疫机能；还可以作为佐剂在病毒灭活疫苗、基因重组疫苗、多糖结合疫苗中应用，很好的增强了各疫苗的免疫作用。

Description

一种枯草颖肽素及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种枯草颖肽素及其应用。

背景技术

乙型肝炎是危害人类健康的主要传染性疾病之一，全世界乙型肝炎患者或乙型肝炎病毒携带者超过4亿人，每年由HBV引发肝脏相关疾病导致死亡的人数达到一百万(KennedyandAlexopoulos，2010；Lavanchy，2004)。我国属于中度流行区，约1.2～1.3亿人为慢性乙肝病毒感染，占全世界慢性乙肝病毒感染者1/3，全国每年死于乙肝相关肝病约30万例。因此，乙型肝炎病毒是威胁我国乃至世界人民的重大疾病。

目前，临床上常用的抗乙肝病毒的药物主要有聚乙二醇化干扰素(Peg-IFN-α)、干扰素(IFN-α)、拉米夫定(LAM)、阿德福韦酯(ADV)、恩替卡韦(ETV)、拉米夫定(3TC)、替比夫定(LDT)等(YuenandLai,2011；Kimetal,2011)等。干扰素类在给药方式、治疗效果、医疗费用等方面有其自身的局限性。核苷酸类药物在抗乙肝病毒的治疗中发挥了关键作用，不足之处是长期应用易出现耐药性及停药后反弹等现象。因此，疗效显著、治愈率高、不反弹且毒副作用少等是人们对未来抗乙肝病毒药物的期望，开发性能优良的抗乙肝药物仍然任重道远。

国内外大量研究表明，抗菌肽是所有生物的免疫防御系统在受到外界病原体侵染时都会产生的一类生物非特异性免疫应答产物，它不仅具有阳离子性、分子量小、抗菌谱广、热稳定性好，且不易形成耐药性和药物残留等特点，而且还具有免疫调节活性。

近年来，通过佐剂来增强疫苗的免疫原性已经成为疫苗开发的一个关键领域。目前，美国食品和药物管理局批准用于人体疫苗的佐剂只有不溶性铝盐类。但是，铝佐剂对细胞免疫反应的作用弱，并且对大多数包括亚单位疫苗和黏膜疫苗在内的新型疫苗的单一佐剂效应均不理想。乳剂类佐剂包括水包油和油包水类乳剂，如弗氏不完全佐剂(FIA)，蒙特耐得(Montanide)，佐剂65(Adjuvant65)和利波夫(Lipovant)等。乳剂常见的副作用有注射部位的炎症反应、肉芽肿、溃疡等，对于人类常规的预防性疫苗来说毒性太大，只能用于科学研究或癌症患者。脂质体既可以诱导体液免疫也可以诱导细胞免疫，但是其稳定性低、成本高，不适宜大批量生产，并且在注射部位可能引起疼痛。皂苷(QS-21)能针对HIV-P和其他病原体诱导强烈的细胞反应，但是毒性较大，不适用于大多数人群。因此，开发适合新型疫苗的高效低毒佐剂成为众多疫苗研发人员的追求。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种枯草颖肽素，所述的枯草颖肽素具有较好的抗乙肝生物学活性、较好的免疫促进作用等优点，与常用的抗HBV药物相比，该枯草颖肽素具有毒性小、效果明显的特点。

本发明的第二目的在于提供一种所述的枯草颖肽素的应用，该枯草颖肽素应用范围广，并具有很好的效果。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种枯草颖肽素，其特征在于，具有所示的结构；

其中，N为半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺中的任一种；R为单糖结构或二糖结构；

第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸为Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种。

本发明提供的枯草颖肽素，为37个氨基酸组成的多肽，该结构含有两个二硫键，分别为第7位和36位上的半胱氨酸形成的二硫键，第14位和29位上的半胱氨酸形成的二硫键；第22位为半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺中的任一种；22位连接有基团R，R为单糖结构或二糖结构；第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸为Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种。

优选地，R为葡糖糖、半乳糖、乳糖中的任一种。

对枯草颖肽素的结构进行举例说明，其中，第三位为甘氨酸，第22位为半胱氨酸，R为葡萄糖的结构如图1所示；第三位为丙氨酸，第22位为半胱氨酸，R为葡萄糖的结构如图2所示；第三位为甘氨酸，第22位为苏氨酸，R为葡萄糖的结构如图3所示；第三位为甘氨酸，第22位为天冬酰胺，R为葡萄糖的结构如图4所示；第三位为甘氨酸，第22位为半胱氨酸，R为乳糖的结构如图5所示。

本发明提供的枯草颖肽素样品体内外药效学初步评价，发现实验样品枯草颖肽素具有较好的抗乙肝生物学活性。具体表现在以下几个方面：

1、抗菌肽枯草颖肽素具有体外抗野生HBV活性的作用，对HBVDNA的复制具有抑制作用。

2、抗菌肽枯草颖肽素具有体内抗DHBV活性的作用，对血清中DHBVDNA均有抑制作用，随着用药时间的延长，各药物组的抑制率也逐渐增大，且停药后，总体“反弹”现象不明显。

3、样品枯草颖肽素对免疫性和化学性肝损伤均具有保护作用。

本发明还应用动物免疫模型对枯草颖肽素样品进行了免疫学初步评价，发现枯草颖肽素具有较好的免疫促进作用。具体表现在以下几个方面：

1、作为粘膜佐剂使用，促进流感病毒、乙肝病毒等病毒疫苗的粘膜免疫效果。

2、作为注射用佐剂使用，促进流感病毒、重组乙肝病毒等病毒类疫苗的注射免疫效果。

3、作为注射用佐剂使用，促进肺炎结合疫苗、b型流感嗜血杆菌等多糖结合疫苗的注射免疫效果。

进一步地，第37位精氨酸后还包括一个甘氨酸。其中的一种结构如图6所示。

本发明还提供了枯草颖肽素在作为制备治疗病毒性肝炎、保肝护肝药物的应用。

本发明还提供了枯草颖肽素在作为制备治疗免疫调节药物的应用。

优选地，所述枯草颖肽素的纯度大于等于98％。比如枯草颖肽素的纯度可以为98％、98.5％、99％、99.5％、99.8％、99.9％等等。该纯度的枯草颖肽素含有的杂质少，药效好。

优选地，所述枯草颖肽素在药物中的含量为0.01～98％。

进一步地，所述病毒性肝炎为乙肝或丙肝。

本发明还提供了枯草颖肽素在食品、饮料和保健品中的应用。即枯草颖肽素可以添加到面粉中做成各种糕点或面食，或是制成其他的食品；也可以添加各种饮品中制成各种饮料；也可以通过添加一些辅料单独制成保健品，也可以与其他具有保健作用的材料混合一起制成保健品。食用添加有枯草颖肽素的食品、饮料和保健品，能很好的增强人体体质，提高人体免疫机能。

本发明还提供了枯草颖肽素作为佐剂在病毒灭活疫苗、基因重组疫苗、多糖结合疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明提供了多种特定结构形式的枯草颖肽素；

(2)本发明提供的枯草颖肽素在治疗病毒性肝炎、保肝护肝具有非常好的效果；

(3)本发明提供的枯草颖肽素具有非常好的调节免疫的功能；

(4)本发明提供的枯草颖肽素还可以应用于食品、饮料和保健品中，能很好的增强人体体质，提高人体免疫机能；

(5)本发明提供的枯草颖肽素还可以作为佐剂在病毒灭活疫苗、基因重组疫苗、多糖结合疫苗中应用，很好的增强了各疫苗的免疫作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为一种枯草颖肽素的结构图；

图2为另一种枯草颖肽素的结构图；

图3为另一种枯草颖肽素的结构图；

图4为另一种枯草颖肽素的结构图；

图5为另一种枯草颖肽素的结构图；

图6为另一种枯草颖肽素的结构图；

图7为本发明实施例1制得的枯草颖肽素纯品HPLC色谱图；

图8为本发明实施例1制得的枯草颖肽素纯品质谱图；

图9为本发明实施例3肝脏病理学显微镜观察图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售获得的常规产品。

实施例1

样品枯草颖肽素的纯化实验及纯度检测

1.1发酵液的制备

菌种为枯草芽孢杆菌B.subtilisCVCC20076，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；将接种于固体培养基上，培养至菌苔铺满培养基表面为第1代；刮取菌苔接种至液体培养基中，摇床振荡培养至菌液为第2代；将其接种至种子罐，搅拌培养至生产用种子为第3代，将生产用种子接种至培养罐，搅拌培养收获发酵液200L。

1.2纯化步骤及结果

离心并过滤：将发酵液在4℃下置于离心机上离心，10000r/min离心15min，获得上清液，弃除沉淀。

阴离子交换层析：将上清液用0.45μm陶瓷滤芯过滤以去除芽孢，得到滤液；然后滤液经20mmol/LTris-HCl，pH9.0缓冲液平衡好的阴离子层析柱(16×300mm)层析，收集穿透峰，得到样品溶液。

疏水层析：疏水层析柱(16×300mm)用20mmol/LTris-HCl、1mol/L(NH₄)₂SO₄，pH8.0的缓冲液平衡。样品溶液中先加硫酸铵至浓度为1mol/L，上样后先用平衡缓冲液洗脱未吸附蛋白，洗至基线后，再分别用含0.9、0.6、0.3、0.1、0mol/L的(NH₄)₂SO₄的20mmol/LTris-HCl，pH8.0的缓冲液梯度洗脱，流速为2ml/min。收集活性部分，超滤浓缩。

阳离子交换层析：阳离子交换柱(16×300mm)用20mmol/LTris-HCl，pH7.6的缓冲液平衡。上样后先用平衡缓冲液洗脱未吸附蛋白，洗至基线后再用不同NaCl浓度的20mmol/LTris-HCl，pH7.6缓冲液梯度洗脱，流速3ml/min，收集活性部分，得到收获液。

超滤、除菌、冻干并进行纯度检测：将收获液用1KD膜包超滤，使用10倍注射用水换液，之后用0.2μm孔径的除菌滤膜进行除菌过滤并进行冻干处理，得到枯草颖肽素纯化纯品。

将纯化纯品经LC-MS检测，具体实验条件如下所示，层析柱：AgilentEclipsePlusC18RRHD1.8μm，2.1*150mm；柱温：60℃，检测波长215nm，流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.085％甲酸+20％水+80％乙腈。得到枯草颖肽素的HPLC色谱图和枯草颖肽素的质谱图，分别如图7和图8所示。

从图7可以看出，枯草颖肽素的纯化纯品经LC-MS检测达到99％以上。图8得到的图谱鉴定得到枯草颖肽素的结构如图1所示。

实施例2

样品枯草颖肽素体外抗野生HBV活性实验

2.1试剂及仪器设备

2.1.1试剂

无支原体无内毒素胎牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培养基，购自北京索莱宝生物医药科技有限公司；G418和胰蛋白酶为Gibco公司产品；SYBRGreenI染料和引物为宝生物工程(大连)有限公司产品；二甲基亚砜(DMSO)为天津市富宇精细化工有限公司产品；四甲基偶氮唑盐(MTT)为Sigma(美国)公司生产；HBsAg和HBeAg抗原诊断试剂盒为上海科华生物工程股份有限公司产品。

2.1.2仪器设备

168-1000XC酶标仪，BIORAD(美国)公司产品；Lightcycle1.5荧光定量PCR仪，Roche(德国)公司产品；IL-161HTCO₂培养箱，施都凯仪器设备(上海)有限公司产品；XD-30倒置显微镜，舜宇光学科技(浙江)集团有限公司。

2.2待测化合物和阳性对照药准备

待测样品枯草颖肽素为依照实施例1纯化得到的枯草颖肽素纯化纯品(纯度：99.5％)，枯草颖肽素溶解于无血清RPMI-1640培养基中，制成浓度为10mM的贮存液，0.22μm过滤除菌，分装后于-20℃保存；每次试验用的工作液现用现配，工作液4℃保存。

体外阳性对照药为拉米夫定(3TC)，购于葛兰素史克制药(苏州)有限公司，溶解于无血清RPMI-1640培养基中，制成浓度为10mM的贮存液，0.22μm过滤除菌，-20℃保存；每次试验用的工作液现用现配，工作液4℃保存。

2.3细胞株

HepG2.2.15细胞株，为HBV转染的肝癌细胞株，由本实验室保存和自行传代培养；该细胞株也可从公司购买。

HepG2.2.1细胞的培养：RPMI1640培养液中加入10％胎牛血清、200μg/mlG418，37℃、5％CO₂培养箱中静置培养，每2天换1次液，每3～5天传代一次，取对数生长期细胞进行试验。

2.4细胞毒性检测

HepG2.2.15细胞以2×10⁴个/ml浓度接种于96孔培养板，每孔100μl，设4个重复孔，置CO₂培养箱(37℃，5.0％CO₂)中培养24h，加入含不同浓度药物的培养基，并设不含药物的细胞作为对照孔(正常对照组)；试验组采用样品枯草颖肽素；拉米夫定(3TC)为阳性对照药物。连续培养9d后，应用MTT比色法检测枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞的毒性。酶标仪(检测波长490nm，波长630nm)读取各孔OD值，计算枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞的半数毒性浓度CC50(50％Cytotoxicconcentration)。

试验组CC50为648.75μM，拉米夫定(3TC)阳性对照组CC50为30.03μM；枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞的毒性作用与药物浓度成正相关；从数据可以看出阳性对照化合物拉米夫定(3TC)毒性明显大于枯草颖肽素，也说明了枯草颖肽素具有非常低的细胞毒性，细胞毒性大概是拉米夫定(3TC)的二十分之一。

2.5细胞上清液中HBsAg和HBeAg的检测

HepG2.2.15细胞以2×10⁴个/ml浓度接种于24孔培养板，每孔1ml，置CO₂培养箱(37℃,5.0％CO₂)中培养24h，加入含不同浓度药物的培养基，并设不含药物的细胞对照孔(正常对照组)；试验组采用枯草颖肽素；拉米夫定(3TC)为阳性对照药物。于第3天、第6天、第9天收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒检测说明书操作，酶标仪(检测波长450nm，参考波长630nm)读取各孔OD值，计算枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg的抗原表达抑制率。结果如表1和表2所示。

表1枯草颖肽素对HBsAg分泌的影响

注：和对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

表2枯草颖肽素对HBeAg分泌的影响

注：和对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

表1和表2结果表明，在无毒浓度下，枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞上清液中HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用随浓度的增加和用药天数的延长呈正相关，与正常对照组比较，具有显著的抑制作用。与阳性对照拉米夫定(3TC)相比，高剂量组(10μM)对乙肝病毒抗原抑制作用强于阳性对照拉米夫定(3TC)(0.01μM)；1μM剂量下抑制作用相当于或稍弱于拉米夫定(3TC)。

2.6细胞上清液中HBVDNA的检测

HepG2.2.15细胞以2×10⁴个/ml浓度接种于24孔培养板,每孔1ml，置CO₂培养箱(37℃,5.0％CO₂)中培养24h，加入含不同浓度药物的培养基，并设不含药物的细胞对照孔(正常对照组)；试验组采用枯草颖肽素；拉米夫定(3TC)为阳性对照药物。收集用药后第3天、第6天、第9天细胞培养上清液，用ViralDNA提取试剂盒提取细胞上清液中的HBVDNA；然后采用荧光定量聚合酶链式反应(fluorsescencequantitativepolymerasechainreaction，FQ-PCR)方法检测细胞上清液中HBVDNA的含量，并计算枯草颖肽素对上清液中HBVDNA的抑制率：

抑制率(％)＝(1-实验组HBVDNA含量/正常对照组HBVDNA含量)×100％。结果如表3所示。

表3枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞上清液中HBVDNA的抑制作用

表3结果表明，与正常对照组相比，不同浓度的枯草颖肽素作用HepG2.2.15细胞，第3、6和9天细胞上清中HBVDNA水平均显著降低。枯草颖肽素对HBVDNA复制的抑制作用与药物剂量和时间呈正相关。枯草颖肽素浓度为抑制作用时，第9天细胞上清中HBVDNA抑制率为70.29％，阳性对照拉米夫定(3TC)(0.01μM)的抑制率为75.27％，抑制效果无显著性差异。通过数据分析，样品第9天细胞外对HBV的半抑制浓度(IC50)为0.39μM，治疗指数SI为1663。

2.7细胞内HBVDNA的检测

HepG2.2.15细胞以2×10⁴个/ml浓度接种于24孔培养板,每孔1ml，置CO₂培养箱(37℃,5.0％CO₂)中培养24h，加入含不同浓度药物的培养基，并设不含药物的细胞对照孔(正常对照组)；试验组采用枯草颖肽素；拉米夫定(3TC)为阳性对照药物。用药后第3天、第6天、第9天将培养板内细胞加胰蛋白酶消化，离心，PBS缓冲液洗涤两次，收集的细胞，每1×10⁶细胞中加入含蛋白酶K的裂解液1ml，37℃孵育60min，裂解产物用ViralDNA提取试剂盒提取细胞中的HBVDNA；然后用FQ-PCR法检测细胞中HBVDNA的含量，并计算枯草颖肽素对细胞中HBVDNA的抑制率：

抑制率(％)＝(1-实验组HBVDNA含量/正常对照组HBVDNA含量)×100％。结果如表4所示。

表4枯草颖肽素对HepG2.2.15细胞上清液中内HBVDNA的抑制作用

表4结果表明，与正常对照组相比，枯草颖肽素在无毒浓度下对HepG2.2.15细胞内HBVDNA具有显著的抑制作用，且随着药物浓度和作用时间的增加，其抑制作用逐渐增强，呈现出明显的量效和时效反应关系。枯草颖肽素浓度为10μM时，第9天细胞中HBVDNA抑制率为67.34％，阳性对照拉米夫定(3TC)(0.01μM)的抑制率为58.99％，略弱于枯草颖肽素。通过数据分析，样品第9天细胞内对HBV的IC50为0.59μM，治疗指数SI为1100。

实施例3

样品枯草颖肽素体内抗DHBV活性研究

3.1实验药物

待测样品枯草颖肽素为依照实施例1纯化得到的枯草颖肽素纯化纯品(纯度：99.5％)；拉米夫定(3TC)购于葛兰素史克制药(苏州)有限公司。

3.2实验动物

1日龄河南省樱桃谷鸭，雌雄不拘，体重50±5g。

3.3樱桃谷鸭感染DHBV动物模型的建立

1-3日龄樱桃谷鸭100只，通过普通PCR方法筛选出先天DHBV阴性，选择体况良好基本一致的鸭供实验用。

3日龄体况良好的阴性鸭90只经胫静脉注射DHBV阳性鸭血清0.2ml(Srivastavetal.,2010)。感染后7天经胫静脉采血，分离血清，PCR方法筛选DHBV阳性鸭进入实验。

3.4动物的分组与给药

取DHBV阳性鸭80只，随机分为5组，每组16只。分别为：模型组(按给药容量灌服生理盐水)、阳性对照组又称3TC组(灌服拉米夫定(3TC)20mg/kg/d)；枯草颖肽素组分别为高剂量组(灌服20mg/kg/d)、中剂量组(灌服4mg/kg/d)、低剂量组(灌服0.8mg/kg/d)。

另有16只DHBV阴性鸭作为阴性对照组，按给药容量灌服生理盐水。

以上各组均在相同饲养条件下饲养，试验所有给药组按照各组剂量每天同一时间于饲喂前根据体重经口腔灌服给药，共给药15天。

3.5血清和肝脏DHBV-DNA的变化

用药第10天(T10)，用药第15天(T15)和停药后第3天(P3)，以无菌操作方法从颈静脉采血，并杀鸭取肝组织，每次每组各采4只；分离血清，将血清和肝组织置于-70℃待检。用已建立的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测DHBV方法检测各样品DHBVDNA含量。

根据公式计算每组鸭用药后不同时间(T10、T15、P3)血清和肝脏中DHBVDNA的抑制率，拷贝数，比较各组鸭血清DHBVDNA的动态变化。同时检测样品在用药各个时期ALT和AST的变化。结果如表4和表5所示。

表4枯草颖肽素对鸭血清HBVDNA拷贝数的影响

和对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

采用FQ-PCR方法检测各个时间段每组鸭血清中DHBVDNA含量，表4结果显示：模型组鸭血清中DHBVDNA含量水平较高，各用药组和模型组相比DHBVDNA含量均有下降，其中3TC组与枯草颖肽素高剂量组鸭DHBVDNA水平显著降低。

各实验组用药后不同时间(T10、T15、P3)对血清中DHBVDNA均有抑制作用，随着用药时间的延长，各药物组的抑制率也逐渐增大，但停药后3TC对DHBV的抑制率有所降低，即出现轻度的“反弹”现象，但枯草颖肽素总体“反弹”现象不明显。各用药组均在T15时达到最大抑制效率，且随着剂量增大抑制效率也增大，这说明具有明显的剂量依赖关系，高剂量组对病毒的抑制随用药时间上升稍缓慢。3TC组对DHBV的抑制率与枯草颖肽素高剂量组基本一致。

表5枯草颖肽素对鸭肝脏HBVDNA拷贝数的影响

和对照组相比，*P<0.05，**P<0.01

采用FQ-PCR方法检测各个时间段每组鸭肝脏中DHBVDNA含量，表5结果显示：各实验组鸭肝脏中DHBVDNA含量均缓慢上升，模型组鸭肝脏中的DHBVDNA水平较高，各用药组与模型组相比DHBVDNA含量均有下降，其中3TC组与枯草颖肽素高剂量组鸭血清DHBVDNA水平显著降低。

各实验组用药后不同时间(T10、T15、P5)对肝脏中DHBVDNA均有显著的抑制作用，随着用药时间的延长，各药物组的抑制率也逐渐增大，但停药后枯草颖肽素和3TC对DHBV的抑制率有所降低，即出现“反弹”现象。各用药组均在T15时达到最大抑制效率，且随着剂量增大抑制效率也增大，这说明枯草颖肽素具有明显的剂量依赖关系。3TC组对DHBV的抑制率与枯草颖肽素高剂量组基本一致。

3.6肝脏病理学检查

用药第15天(T15)，将实验动物处死，取小块肝组织固定于10％甲醛溶液，作常规HE染色病理检查。方法如下：

把固定的组织切成3～5mm厚的组织块，将修正后的组织块经自来水冲洗后，再用蒸馏水浸泡1h；

组织块脱水兼透明：75％乙醇×1h、85％乙醇×1h、95％乙醇×1.5h、无水乙醇Ⅰ×15min、无水乙醇Ⅱ×15min、二甲苯Ⅰ×15min、二甲苯Ⅱ×15min、石蜡Ⅰ×10min、石蜡Ⅱ×25min；

包埋：将浸蜡的组织块放入包埋框中包埋，放置冰上迅速冷却，4℃冰箱过夜；

切片与粘片：将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片进行水捞法粘片，放入50℃烘箱过夜；

进行HE染色。HE染色的过程：

(1)二甲苯Ⅰ：30min；

(2)二甲苯Ⅱ：5min；

(3)无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各3min；

(4)水洗：5min；

(5)苏木精：4min；

(6)水洗1min；

(7)盐酸酒精分化：7s；

(8)蓝化：25min；

(9)75％乙醇、85％乙醇、90％乙醇各3min；

(10)伊红染色：30s；

(11)95％乙醇：30s；

(12)无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5min；

(13)晾干，树胶封片。

将制作好的各组织病理切片进行显微镜观察并分析其病理变化，选择病变典型的部分拍照，光学显微镜(×400)，结果如图9所示，其中A为阴性对照组；B为模型组；C为灌服枯草颖肽素0.8mg/kg/d；D为灌服枯草颖肽素4mg/kg/d；E为灌服枯草颖肽素20mg/kg/d；F为灌服拉米夫定(3TC)20mg/kg/d。

从图9观察肝组织病理切片可以看出，造模后，用药前(T0)肝组织染色可见肝细胞点、灶状坏死，部分肝脏细胞肿胀、脂肪变性；用药15天后，模型组肝组织可见严重气球样变性、多灶性坏死、部分肝细胞纤维化；3TC组和枯草颖肽素各剂量组炎症均有不同程度减轻，高剂量组相对更为明显。

实施例4

样品枯草颖肽素对免疫性和化学性肝损伤保护实验

4.1样品枯草颖肽素对刀豆蛋白A所致小鼠免疫性肝损伤的保护作用

4.1.1材料：

待测样品枯草颖肽素为依照实施例1纯化得到的枯草颖肽素纯化纯品(纯度：99.5％)；雄性小鼠60只，体重(20±2g)；刀豆蛋白A(ConA)、联苯双酯滴丸，ALT，AST检测试剂盒等试剂盒。

4.1.2方法：

小鼠适应性饲养一周，室温22±2℃，相对湿度50-60％，12小时循环光照。

小鼠随机分组，每组10只，灌胃给药。

正常对照组：生理盐水，灌胃给药；

模型对照组：同正常对照组；

联苯双酯组：150mg/kg/d；

用药组：枯草颖肽素，分为高剂量、中剂量、低剂量。

除正常对照组外，其余各组小鼠于实验首日尾静脉注射ConA20mg/kg，首日上午，下午和次日下午各灌胃给药一次，末次给药后4小时，模型组和各给药组小鼠尾静脉注射ConA20mg/kg，12小时后摘眼球取血，离心分离血清，并断头处死小鼠，分别取肝组织。一部分10％甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。

4.1.3检测指标及结果

(1)检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性，肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等指标。血液放置1小时后分离血清进行试剂盒检测；数据使用±s表示，数据采用单因素方差分析(one-wayANOVA法检验)，组间用LSD法两两比较，检验水准α＝0.05。结果如表6和表7所示。

表6枯草颖肽素对conA诱导的免疫性肝损伤小鼠血清ALT、AST的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，^#P<0.05,^##P<0.01

表6结果所示，模型组小鼠血清的ALT和AST水平与正常组相比，差异显著(P<0.01)，表明造模成功。抗菌肽高、中剂量组与模型组比较显著降低(P<0.01)，但枯草颖肽素低剂量组疗效不明显。联苯双脂组与抗菌肽高、中剂量组水平基本一致(P<0.05或P<0.01)。

表7枯草颖肽素对conA诱导的免疫性肝损伤小鼠细胞NO、MDA和SOD的影响

注：与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，^#P<0.05,^##P<0.01

表7结果显示，模型组小鼠肝脏中SOD的活性显著低于正常组，MDA活性显著高于正常组，NO的含量显著高于正常组(P<0.01)，不同剂量的枯草颖肽素对细胞的抗氧化作用呈一定的量效关系，并且还可以不同程度降低NO的含量。

(2)肝组织病理学观察：处死小鼠，取肝脏，观察其大体变化，并取甲醛固定的肝组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察病理变化。

用光学显微镜(×400)观察肝组织病理切片，正常对照组小鼠肝组织结构完整，肝细胞结构正常，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐有序，大小一致，由中央静脉向小叶周边呈放射状排列，细胞核大而圆，分界清晰未见病理性变化；ConA模型组肝体积明显增大，细胞呈现大量气泡样坏死，胞浆透明呈气球样，肝小叶结构严重破换，模糊不清，汇管区大量炎细胞浸润，中央静脉及肝窦明显淤血；联苯双酯组小鼠肝脏细胞出现明显的坏死细胞与正常细胞的分界线，肝小叶结构较完整，肝细胞肿胀，并有嗜酸性变，未见空泡变形，汇管区有轻度的炎细胞浸润；抗菌肽枯草颖肽素低剂量组肝小叶较完整，汇管区炎性反应呈中毒变化；抗菌肽枯草颖肽素中剂量组肝小叶结构较完整，肝细胞有少量嗜酸性变，肝细胞病变程度与阳性对照组相似；抗菌肽枯草颖肽素高剂量组肝小叶结构完整，出现明显的坏死细胞与正常细胞的分界线，未见肝细胞体积明显增大，与联苯双酯药物效果相同。

4.2样品枯草颖肽素对CCl4所致小鼠化学性肝损伤的保护作用

4.2.1材料：

枯草颖肽素；雄性小鼠60只，体重(20±2g)；四氯化碳、联苯双酯滴丸，ALT，AST检测试剂盒等试剂盒。

4.2.2方法：

小鼠适应性饲养一周，室温22±2℃，相对湿度50-60％，12小时循环光照。

小鼠随机分组，每组10只，灌胃给药。

正常对照组：0.5％羧甲基纤维素(CMC)，一天一次，连续一周，第七天腹腔注射10ml/kg橄榄油(溶媒)；

模型对照组：0.5％CMC，一天一次，连续一周；

联苯双酯组：150mg/kg/d联苯双酯，一天一次，连续一周；

用药组：枯草颖肽素，分为高剂量、中剂量、低剂量。

除正常对照组外，其余各组在第七天给药2小时后，腹腔注射10ml/kgCCl₄(0.1％)，禁食不禁水，24小时后，摘眼球取血，离心分离血清，断头处死取肝脏。-20℃保存待检。

4.2.3检测指标及结果

(1)检测小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性，肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)等指标。血液放置1小时后分离血清进行试剂盒检测。数据使用±s表示，数据采用单因素方差分析(one-wayANOVA法检验)，组间用LSD法两两比较，检验水准α＝0.05。结果如表8和表9所示。

表8抗菌肽对CCl₄损伤小鼠血清ALT、AST的影响(±s，n＝10)

注：*P<0.05，**P<0.01，与CCl₄模型组比较，经方差分析。

表8结果显示，与正常对照组比较，CCl₄模型组的ALT和AST水平显著升高(P<0.01)，提示CCl₄损伤肝细胞后，促进了肝细胞内肝功能相关酶的释放。阳性对照组和枯草颖肽素处理组ALT和AST水平与模型组相比，均明显降低，其中抗菌肽中的高剂量组ALT水平与阳性对照组相当(P>0.05)。结果提示枯草颖肽素能够显著改善CCl₄损伤正常肝细胞的肝功能相关酶的释放。

表9抗菌肽对CCL4损伤小鼠细胞NO、MDA和SOD的影响(±s,n＝10)

注：*P<0.05，**P<0.01，与CCL4模型组比较，经方差分析。

如表9结果所示，CCl₄损伤后模型组肝细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性明显降低，丙二醛(MDA)含量明显升高，提示CCl₄损伤引起了肝细胞抗氧化能力的下降。各枯草颖肽素组的MDA、SOD除最小剂量组的MDA与模型对照组无显著差异外(P>0.05)，其余剂量组都能显著提高CCl₄损伤后肝细胞中的SOD活力，降低CCl₄损伤后肝细胞中的MDA水平，并呈现一定剂量依赖关系(P<0.05)。结果提示抗菌肽枯草颖肽素能够显著提高CCl₄损伤正常肝细胞的抗氧化能力。

(2)肝组织病理学观察：处死小鼠，取肝脏，观察其大体变化，并取甲醛固定的肝组织，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察病理变化。

用光学显微镜(×400)观察肝组织病理切片，正常对照组小鼠肝组织结构完整，肝细胞结构正常，肝小叶结构清晰，肝细胞索排列整齐有序，大小一致，由中央静脉向小叶周边呈放射状排列，细胞核大而圆，分界清晰未见病理性变化；模型对照组肝体积明显增大，细胞呈现大量气泡样坏死，胞浆透明呈气球样，肝小叶结构严重破换，模糊不清，汇管区大量炎细胞浸润，中央静脉及肝窦明显淤血；联苯双酯组小鼠肝脏细胞出现明显的坏死细胞与正常细胞的分界线，肝小叶结构较完整，肝细胞肿胀，并有嗜酸性变，未见空泡变形，汇管区有轻度的炎细胞浸润；抗菌肽枯草颖肽素低剂量组肝小叶较完整，汇管区炎性反应呈中毒变化；抗菌肽枯草颖肽素中剂量组肝小叶结构较完整，肝细胞有少量嗜酸性变，肝细胞病变程度与阳性对照组相似；抗菌肽枯草颖肽素高剂量组肝小叶结构完整，出现明显的坏死细胞与正常细胞的分界线，未见肝细胞体积明显增大，与联苯双酯药物效果相同。

从上可以看出，枯草颖肽素具有很好的抗乙肝病毒效果，体外能明显降低HepG2.2.15的表面抗原与核心抗原的表达，动物实验表明其能够有效降低体内的谷丙转氨酶，并有效抑制HBV-DNA的复制，进而保护肝损伤。

上述可以推断，枯草颖肽素的免疫调节活性主要表现在以下两个方面：

1、抗菌肽枯草颖肽素具有明显的抑制HBVDNA的复制效应、抑制HBsAg和HBeAg的表达，有效抑制病毒复制、降低血清转氨酶水平及改善肝脏组织学状况，减轻病毒对宿主免疫系统的压力，帮助宿主打破耐受，重建抗HBV特异性免疫应答。

2、清除肝细胞内HBV主要依靠HBV特异的CD8+细胞毒性T细胞(CTL)来完成。CTL在HBV特异的CD4+T辅助细胞(Th)和有关细胞因子协助下，受HBV抗原刺激而增殖活化，清除HBV，抗菌肽枯草颖肽素可能具有诱导CD4和CD8细胞的产生，增强细胞免疫功能和T细胞的辅助功能。

实施例5

下面对枯草颖肽素的剂型进行举例，但并不限于以下的剂型。

枯草颖肽素注射剂：枯草颖肽素20g，加辅料依次用注射用水溶解至100ml，pH4.5。

枯草颖肽素片剂：取枯草颖肽素20g，加入适当片剂辅料，按照片剂工艺制备成片剂。

枯草颖肽素胶囊剂：取枯草颖肽素20g，加入胶囊剂适当辅料，按照胶囊剂工艺制备成胶囊剂。

枯草颖肽素微乳剂：取枯草颖肽素20g，加入微乳剂适当辅料，按照微乳剂工艺制备成微乳剂。

枯草颖肽素缓冲剂：取枯草颖肽素20g，加入缓冲剂适当辅料，按照缓冲剂工艺制备成缓冲剂。

枯草颖肽素脂质体剂：取枯草颖肽素20g，加入脂质体剂适当辅料，按照脂质体剂工艺制备成脂质体剂。

枯草颖肽素喷雾剂：取枯草颖肽素20g，基质1.0g，表面活性剂0.6g，防腐剂0.2g，添加蒸馏水至100g，pH4.5。

枯草颖肽素凝胶剂：取枯草颖肽素20g，基质3g，表面活性剂0.1g，防腐剂20g，添加蒸馏水至100g，pH4.5。

其中，辅料的量根据枯草颖肽素在药物中的含量为0.01～98％进行添加，如枯草颖肽素在药物中的含量可以为0.01、2％、5％、10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％、98％等等。

实施例6

枯草颖肽素作为疫苗佐剂

6.1材料与方法

疫苗：重组乙型肝炎病毒疫苗；实验动物：清洁级Balb/c雌性小鼠，5-7周龄，体重18-22g；主要试剂：枯草颖肽素佐剂和氢氧化铝佐剂(浓度为1mg/ml)。

6.2动物分组及免疫检测

小鼠随机分为5组，每组10只，组1：无佐剂乙肝疫苗滴鼻组；组2：枯草颖肽素佐剂乙肝疫苗滴鼻组；组3：无佐剂乙肝疫苗腹腔注射组；组4：氢氧化铝佐剂乙肝疫苗腹腔注射组；组5：枯草颖肽素佐剂乙肝疫苗腹腔注射组，如表10所示。

表10试验分组与免疫

免疫剂量为15μg抗原，10μg抗菌肽佐剂或1mg/mlAl(OH)₃佐剂。分别于0天和14天腹腔注射免疫2次，21天采血，摘眼球取血清，用ELISA方法检测小鼠血清中的anti-HBs抗体效价；滴鼻组使用PBS洗阴道腔，检测IgA含量。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用t检验，数据以几何均值(GMT)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。

采用ELISA法定量检测免疫后小鼠血清中HBsAb的含量,结果显示与单纯乙肝疫苗免疫相比，乙肝疫苗联用枯草颖肽素可以显著提高小鼠血清中的anti-HBs抗体水平。但是效价低于氢氧化铝佐剂乙肝疫苗腹腔注射组。具体的检测结果见表11。

表11各组小鼠的anti-HBs抗体效价(GMT，n＝10)

注：1.与无佐剂乙肝疫苗腹腔注射组相比，进行t检验，*P<0.05，**P<0.01；

2.与无佐剂乙肝疫苗滴鼻组相比，进行t检验，*P<0.05，**P<0.01。

将枯草颖肽素和乙肝疫苗联合腹腔注射免疫Balb/c小鼠后，小鼠血清中HBs的IgG水平明显高于单独注射免疫乙肝疫苗组。使用黏膜免疫，枯草颖肽素的添加能够提高小鼠血清中HBs的IgG和灌洗液的IgA水平，明显高于单独黏膜免疫乙肝疫苗组。枯草颖肽素对乙肝疫苗的免疫佐剂作用将使之成为一种新型的疫苗佐剂，它的应用将可以提高乙肝疫苗接种人群的应答率，从而在乙肝的防治中发挥重要作用。

实施例7

枯草颖肽素作为流感疫苗佐剂

7.1材料与方法

H5N1全病毒疫苗和裂解病毒疫苗；清洁级雌性Balb/c小鼠，6-8周龄，18-22g。实验前将小鼠置于常温动物房中，以标准饲料饲养1周；枯草颖肽素佐剂和氢氧化铝佐剂(浓度为1mg/ml)。

7.2动物分组及免疫检测

将小鼠随机分为5组，每组10只，组1：无佐剂全病毒滴鼻疫苗组；组2：抗菌肽佐剂全病毒滴鼻疫苗组；组3：无佐剂全病毒腹腔注射组；组4：氢氧化铝佐剂全病毒腹腔注射组；组5：枯草颖肽素佐剂全病毒腹腔注射组，具体如表12所示。

表12试验分组与免疫

免疫剂量为15μg抗原，10μg枯草颖肽素佐剂或1mg/mlAl(OH)₃佐剂。分别于0天和14天滴鼻免疫或腹腔注射免疫2次，21天采血，收集血清，检测血凝抑制(HI)滴度(血清HI效价测定根据疾病控制中心基于实验室流感监测标准程序操作)，实验重复1次。

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用t检验，数据以几何均值(GMT)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。具体的检测结果见表13。

表13各组小鼠的anti-H5N1抗体效价(GMT，n＝10)

注：1.与无佐剂H5N1全病毒疫苗腹腔注射组相比，进行t检验，*P<0.05，**P<0.01；

2.与无佐剂H5N1全病毒疫苗滴鼻组相比，进行t检验，*P<0.05，**P<0.01。

检测结果显示枯草颖肽素在10微克剂量可以促进流感全病毒的粘膜免疫原性，与无佐剂全病毒滴鼻疫苗组有显著性差异，好于无佐剂全病毒腹腔注射组并有显著性差异，但是效价低于氢氧化铝佐剂全病毒腹腔注射组。

将枯草颖肽素和H5N1全病毒疫苗联合腹腔注射免疫Balb/c小鼠后，小鼠血清中HBs的IgG水平明显高于单独注射免疫H5N1全病毒疫苗组。使用黏膜免疫，枯草颖肽素的添加能够提高小鼠血清中HBs的IgG和灌洗液的IgA水平，明显高于单独黏膜免疫H5N1全病毒疫苗组。枯草颖肽素对流感疫苗的免疫佐剂作用将使之成为一种新型的疫苗佐剂，它的应用将可以提高流感疫苗接种人群的应答率，从而在流感疫苗的防治中发挥重要作用。

实施例8

抗菌肽作为b型流感嗜血杆菌结合疫苗的注射剂型增强剂

8.1材料与方法

疫苗：b型流感嗜血杆菌结合疫苗；实验动物：清洁级Balb/c雌性小鼠，5-7周龄，体重18-22g；枯草颖肽素佐剂和氢氧化铝佐剂(浓度为1mg/ml)。

8.2动物分组及免疫检测

小鼠随机分为3组，每组10只，组1：无佐剂Hib结合疫苗腹腔注射组；组2：氢氧化铝佐剂Hib结合疫苗腹腔注射组；组3：枯草颖肽素佐剂Hib结合疫苗腹腔注射组。免疫剂量为15μg抗原，10μg抗菌肽佐剂或1mg/mlAl(OH)₃佐剂。具体见表14。

表14试验分组与免疫

分别于0天和14天腹腔注射免疫2次，21天采血，收集血清，用ELISA方法检测小鼠血清中的anti-PRP抗体效价。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用t检验，数据以几何均值(GMT)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。结果如表15所示。

表15各组小鼠的anti-PRP抗体效价(GMT，n＝10)

注：与无佐剂Hib结合疫苗腹腔注射组相比，进行t检验，*P<0.05，**P<0.01。

采用ELISA法定量检测免疫后小鼠血清中Hib荚膜多糖IgG抗体的含量,表15结果显示与无佐剂及氢氧化铝佐剂Hib结合疫苗组相比，加入枯草颖肽素佐剂可以显著提高小鼠血清中的Hib荚膜多糖IgG抗体水平。枯草颖肽素佐剂对Hib结合疫苗注射剂型具有免疫增强作用，显著增强血清抗体水平，其免疫增强效果强于氢氧化铝佐剂。枯草颖肽素可作为一种新型的HIB结合疫苗注射剂型的免疫佐剂。

实施例9

抗菌肽作为6B型肺炎结合疫苗注射剂型的免疫增强作用

9.1材料与方法

疫苗：6B型肺炎链球菌多糖结合疫苗；实验动物：清洁级SD雌性大鼠，5-7周龄，体重150-250g；枯草颖肽素佐剂和磷酸铝佐剂(浓度为1mg/ml)。

9.2动物分组及免疫检测

小鼠随机分为3组，每组10只，组1：无佐剂6B型肺炎结合疫苗腹腔注射组；组2：磷酸铝佐剂6B型肺炎结合疫苗腹腔注射组；组3：枯草颖肽素佐剂6B型肺炎结合疫苗腹腔注射组。免疫剂量为:15μg抗原，10μg抗菌肽佐剂或1mg/ml磷酸铝佐剂。具体如表16所示。

表16试验分组与免疫

分别于0天和7天腹腔注射免疫2次，21天采血，收集血清，用ELISA方法检测小鼠血清中的抗肺炎球菌荚膜多糖IgG抗体效价。采用SPSS19.0软件进行统计学分析，采用t检验，数据以几何均值(GMT)表示，P<0.05为差异具有统计学意义。结果如表17所示。

表17各组小鼠的anti-6B荚膜多糖抗体效价(GMT，n＝10)

表17结果显示与单纯6B型肺炎结合疫苗免疫相比，6B型肺炎结合疫苗联用枯草颖肽素可以显著提高小鼠血清中的抗肺炎球菌荚膜多糖IgG抗体水平。但是效价低于氢氧化铝佐剂6B型肺炎结合疫苗腹腔注射组。枯草颖肽素对抗6B型肺炎球菌多糖抗体应答具有显著的免疫增强作用，加入枯草颖肽素能使抗6B型肺炎球菌多糖抗体几何滴度显著升高。可以认为枯草颖肽素对6B型肺炎球菌结合疫苗具有良好的佐剂作用。

此外，本申请人还将实施例1中得到的枯草颖肽素结构进行了改进，采用Fmoc固相合成法合成了如图1-6所示的结构以及将图1中的葡萄糖替换为半乳糖，同时进行了如实施例2-9的验证，结果同实施例1中得到的枯草颖肽素的效果一致。

另外，采用Fmoc固相合成法还合成了如下结构：将图1中的第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸替代为Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种得到的枯草颖肽素结构，同时进行了如实施例2-9的验证，结果同实施例1中得到的枯草颖肽素的效果一致。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种枯草颖肽素，其特征在于，具有

所示的结构；

其中，N为半胱氨酸、丝氨酸、天冬酰胺中的任一种；R为单糖结构或二糖结构；

第1，2，3，5，8，9，10，12，15，17，18，20，21，23，25，26，27，28位的氨基酸为Gly，Ala，Ile，Leu，Val五种脂肪族氨基酸中的任一种。

2.根据权利要求1所述的枯草颖肽素，其特征在于，R为葡糖糖、半乳糖、乳糖中的任一种。

3.根据权利要求1所述的枯草颖肽素，其特征在于，第37位精氨酸后还包括一个甘氨酸。

4.权利要求1-3任一项所述的枯草颖肽素在作为制备治疗病毒性肝炎、保肝护肝药物的应用。

5.权利要求1-3任一项所述的枯草颖肽素在作为制备治疗免疫调节药物的应用。

6.根据权利要求4-5任一项所述的应用，其特征在于，所述枯草颖肽素的纯度大于等于98％。

7.根据权利要求4-5任一项所述的应用，其特征在于，所述枯草颖肽素在药物中的含量为0.01～98％。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述病毒性肝炎为乙肝或丙肝。

9.权利要求1-3任一项所述的枯草颖肽素在食品、饮料和保健品中的应用。

10.权利要求1-3任一项所述的枯草颖肽素作为佐剂在病毒灭活疫苗、基因重组疫苗、多糖结合疫苗中的应用。