CN110946986B - 一种寡肽在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有IAVPGEVA氨基酸序列的寡肽在制备治疗非酒精性脂肪肝病药物中的应用，实验结果表明其能显著降低由FFA诱导的肝细胞脂质累积。本发明还通过建立非酒精性脂肪肝病小鼠模型证明，该寡肽有效地减少肝脏中脂肪堆积，减轻伴随的脂肪性肝炎症，并且可以优化血液中的各项指标，可用于防治非酒精性脂肪肝等相关肝病，具有良好的临床应用前景。

Description

一种寡肽在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用

技术领域

本发明涉及肽的用途，具体涉及一种寡肽在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明确因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗以及代谢综合征密切相关的疾病,包括单纯性脂肪肝(NAFL)及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化、肝硬化以及肝癌。全球每100个成年人中就有20～30位脂肪肝患者，在肥胖症患者中，这一比例高达60％～90％，随着人们生活水平的提高，脂肪肝已成为中国多发性疾病，中国沿海地区患病率达到15％。2016年12月2日国家发布了《非酒精性脂肪性肝病临床路径(2016年版)》，旨在重视和提高临床路径诊治方案及实施效果，进一步增强对非酒精性脂肪性肝病的认识和管理意识，全面提高国民的健康水平。非酒精性脂肪肝是一种慢性疾病，脂肪肝除了会影响肝脏自身的功能外，还会招来免疫系统的攻击，引发肝炎，造成肝脏纤维化，最终发展为不可治愈的肝硬化。非酒精性肝病早期通过干预，肝脏仍能恢复正常，一旦进展到肝硬化，将会有1-4％的患者进展为肝癌。

NAFLD的发生是由环境、遗传、饮食和代谢等因素相互作用的结果，其组织病理学改变可能是由于多种机制所致。肝脏脂质代谢的障碍，包括脂肪的合成和分解失去平衡或者脂质的运输发生障碍，导致脂肪在肝细胞中过度堆积形成脂肪肝，其中，进入肝脏脂肪酸的增加和肝脏脂质从头合成是最主要原因。胰岛素抵抗是 NAFLD/NASH发生发展的重要机制，而代谢氧化应激、自噬、炎症等促使过度荷载脂肪的肝细胞发生损伤和死亡。NAFLD早期表现为肝脏甘油三酯(Triglyceride，TG) 的堆积，该过程是可以逆转的，应尽早进行干预。因而药物靶向降低肝细胞内TG，对治疗脂肪性肝病，尤其预防和治疗NAFLD的进一步进程有着重要的临床意义。目前临床应用的主要是胰岛素增敏剂、降脂药、抗氧化剂和肝细胞保护剂等四类药物。但上述药物的作用靶点与非酒精性脂肪肝的发病机理并不完全一致，故治疗效果不理想，如现有的降糖药物二甲双胍和他汀类降脂药物在NAFLD的治疗中疗效并不显著，且他汀类降脂药物还存在较大副作用。迄今为止，尚没有用于治疗非酒精性脂肪性肝病的药物上市。因此，寻找治疗NAFLD的有效药物是该领域的研究热点。

肽主要通过蛋白水解降解和肾过滤来清除，水解的产物为氨基酸，因此一般不考虑肽类药物的代谢产物是否有毒性。小分子肽易于合成改造和优化组合，能很快确定其药用价值，因而在临床应用上具有非常重要的开发价值。11S球蛋白是大豆储藏蛋白质的主要成分之一，IAVPGEVA是11S球蛋白水解后得到的八肽。它能竞争性抑制胆固醇合成限速酶HMGCoA还原酶(HMGCoAR)活性，并能调节体外培养肝细胞葡萄糖和胆固醇代谢。但尚未见其用于防治非酒精性脂肪肝病的报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于公开一种寡肽在防治非酒精性脂肪肝病的药物中的应用，该寡肽能够有效地减少肝脏中脂肪堆积，减轻伴随的脂肪性肝炎症，并且可以优化血液中的各项指标，防治非酒精性脂肪肝。

技术方案：具有IAVPGEVA氨基酸序列的寡肽在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。本发明将具有IAVPGEVA氨基酸序列的寡肽缩写为SGP8。

所述寡肽添加一种或多种药学上可接受的辅料制成制剂。

所述寡肽通过合成或由大豆储藏蛋白质水解分离得到。

所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。

所述制剂为注射剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。

所述制剂的给药方式包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、口服给药。

有益效果：本发明通过体内外实验证明，SGP8对肝细胞的脂肪变性有很好的干预作用，可用于制备防治非酒精性脂肪肝病的药物。具体来说，本发明通过游离脂肪酸(Freefatty acids，FFA)诱导肝细胞模拟非酒精性脂肪肝的脂质累积，通过共孵育SGP8，考察其对肝细胞脂质累积的治疗作用。实验结果表明，SGP8能显著降低由FFA诱导引起的肝细胞中脂质累积。本发明还通过建立非酒精性脂肪肝病小鼠模型证明，SGP8能有效地减少肝脏中脂肪堆积，减轻伴随的脂肪性肝炎症，并且可以优化血液中的各项指标，可用于防治非酒精性脂肪肝等相关肝病。

附图说明

图1为SGP8纯度及分子量鉴定；

图2为各组小鼠肝脏组织外观、HE染色和油红O染色结果；

图3为各组小鼠血清中ALT(左)和LDL(右)的含量(与对照组组比，^*p＜0.05；^***p＜0.001与造模组相比^#p＜0.05；^##p＜0.01；n＝3)；

图4为各组小鼠肝脏中TC(左)/TG(右)的含量(与对照组组比，^**p＜0.01；与造模组相比^#p＜0.05；^##p＜0.01；n＝6)；

图5为各组小鼠肝脏中MDA(左)和SOD(右)的水平(与对照组组比，^**p＜0.01；与造模组相比^###p＜0.001；n＝6)；

图6为Western-bloting检测小鼠各组肝组织中PPARγ、CD36、IL6和TNFα蛋白表达量， WB实验图谱及各蛋白表达量统计分析结果(与对照组组比，^**p＜0.01；^***p＜0.001与造模组相比^#p＜0.05；^##p＜0.01；^###p＜0.001；n＝3)；

图7为不同浓度SGP8对HepG2细胞存活率的影响(与正常组相比，^**p＜0.01；n＝5)；

图8为SGP8对HepG2细胞脂堆积的影响，400倍光镜照片、油红O溶出照片以及OD500光吸收值(与对照组组比，^***p＜0.001；n＝5)；

图9为SGP8对HepG2细胞TG(左)/TC(右)的影响(与对照组组比，^***p＜0.001；与造模组相比^##p＜0.01；^###p＜0.001；n＝3)。

具体实施方式

实施例1：SGP8的合成及纯度

所述SGP8由上海生物工程有限公司合成，纯度为99％(图1)，质谱鉴定分子量为754.5Da(图2)。

实施例2：SGP8对非酒精性脂肪肝小鼠肝脏脂代谢的影响

参考王兰在《非酒精性脂肪性肝病机制及标志物的蛋白质组学研究》、Nagasawa T等在《Effects of bezafibrate,PPAR pan-agonist,and GW501516,PPARδagonist,ondevelopment of steatohepatitis in mice fed a methionine-and choline-deficientdiet》以及 Arizuka N等在《The effect ofβ-caryophyllene on nonalcoholicsteatohepatitis》中的研究，用MCD饲料诱导建立小鼠非酒精性脂肪肝模型，实验选用清洁级C57BL-6小鼠(由扬州大学比较医学中心提供，动物生产许可证号:SCXK(苏)2008-0005)适应性饲养1周后，随机分为6组，分别是正常组，模型组，SGP8低剂量尾静脉注射组(1mg/Kg)，SGP8 高剂量尾静脉注射组(5mg/Kg)，SGP8灌胃组(6.25mg/Kg)，阳性组(苯扎贝特，Bez)。

实验动物饲养于中国药科大学实验动物中心，饲养条件为温度22±2℃，湿度为50％-60％，12h光照和黑夜循环。实验中小鼠自由饮食和饮水，除正常组每天给予正常的饲料外，其他各组每天给予MCD饲料喂养，每天下午14点-16点按时给药，避免外界环境的干扰。实验开始三周后处死小鼠，处死前禁食不禁水12h。处死时摘取眼球取血，处死后开腹，分离肝脏组织，同时取肝脏尾叶放入组织固定液中。

收集血清，测定小鼠血清中ALT和LDL的含量。称取肝组织，用无水乙醇提取肝组织中的TC和TG并进行测定。取组织固定液中的肝组织进行HE染色和油红O染色。称取肝组织，用PBS提取肝组织中的MDA和SOD并进行测定。最后，取放置在液氮中备用的组织，用全蛋白提取液提取肝组织中的蛋白，进行Western-bloting检测。

结果显示：对小鼠肝组织外观的观察(图2)可以发现，与造模组相比，SGP8尾静脉注射组肝组织的颜色更加红润富有光泽，边缘更加清晰没有褶皱。SGP8灌胃组与造模组相比，外观也有明显的改善。通过对比MCD造模组与正常组可以看出，造模组肝脏切片出现大量脂肪空泡，并且染色颜色变为深红色。同时可见出现炎性细胞浸润的现象，符合非酒精性脂肪肝的各项病理特征。对比SGP8低剂量尾静脉注射组与造模组可以发现，SGP8低剂量组肝脏切片并未出现大量的脂肪空泡，并且染色的颜色相对更趋近与正常组，同时也可以看到炎性细胞浸润的现象有所减轻。通过对比SGP8低剂量尾静脉注射组与高剂量尾静脉注射组可以看出，SGP8在改善非酒精性脂肪肝方面具有剂量依赖性的特点。通过对比SGP8灌胃组与造模组可以看出，SGP8灌胃也具有改善非酒精脂肪肝的作用，可以促使肝组织切片脂肪空泡减少，对肝组织HE染色的颜色和炎性细胞浸润等方面都有改善效果。通过对比造模组与正常组可以发现，造模组肝细胞中出现了大量的脂滴被油红O染成红色，可以确定形成非酒精性脂肪肝模型。SGP8低剂量尾静脉注射组与造模组进行比较可以看出，非酒精性脂肪肝小鼠尾静脉注射 1mg/Kg SGP8后，肝脏中脂滴的含量有明显的降低。通过对比SGP8高剂量尾静脉注射组与低剂量尾静脉注射组油红O染色，可以得出SGP8可以明显降低肝脏脂滴含量，并且呈现剂量依懒性(图2)。

通过图3可以看出，SGP8尾静脉注射组LDL的浓度较造模组有了显著的降低，并且SGP8尾静脉注射组能够明显的降低血清中ALT的含量，有效的预防肝损伤。通过对比SGP8灌胃组与尾静脉组也可以发现，SGP8经过灌胃的途径给药也有一定的效果。通过对图4的分析可以看出，造模组与对照组相比，肝脏中甘油三酯(TG)和胆固醇 (TC)的含量明显升高。通过对比SGP8尾静脉注射组与造模组可以得出，SGP8对于非酒精性脂肪肝小鼠肝脏TC和TG具有明显的降低作用。

MDA和SOD是常用的膜脂过氧化指标。如图5所示，通过对比造模组与SGP8尾静脉注射组可以看出，SGP8可以明显降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏MDA的含量，有效提高NASH小鼠肝脏中SOD的活力，具有防止肝脏氧化损伤的作用。

PPARγ、CD36、IL6、TNFα是小鼠肝脏炎症反应的重要蛋白质。如图6可以看出，非酒精性脂肪肝小鼠尾静脉注射SGP8后，PPARγ的表达量较造模组明显有所提高， CD36、IL6、TNFα的表达量较造模组都有所降低。并且SGP8灌胃组PPARγ的表达量也有所升高，CD36、IL6、TNFα的表达量都有所降低。

实施例3：SGP8对脂肪变性HepG2细胞脂质积累的影响

1、SGP8对脂肪变性肝细胞的干预

培养HepG2细胞接种于96孔板，在含有10％新生牛血清的DMEM高糖培养基中37℃5％CO2继续培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，换成不含有血清的DMEM 高糖培养基，饥饿处理8h。饥饿处理完成后，用移液器小心吸弃培养液，换成含有不同浓度SGP8(0μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM、1000μM)和苯扎贝特(100 μM)的培养基孵育24h。孵育完成后，每孔加10μL MTT溶液，在37℃5％CO₂条件下继续培养4h，小心弃去孔内培养基，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)震荡摇匀10min，在波长570nm测各孔吸光度并计算细胞存活率。

结果显示：当用不同浓度的SGP8对HepG2细胞刺激24h后，SGP8浓度达到1000 μM时，细胞存活率相对于对照组(SGP8浓度为0μM)有显著性的减低。SGP8浓度在 500μM以下时对细胞存活率的影响，没有显著性差异。同时当用阳性药苯扎贝特100μM 刺激24h后，对细胞存活率检测显示也没有显著性差异(图7)。因此可以得出结论，当用不同浓度的SGP8孵育HepG2细胞时，可以选用小于等于500μM的浓度，这个范围内的浓度对细胞存活率的影响与阳性药苯扎贝特100μM对细胞存活率产生的影响相似。

培养肝癌细胞HepG2，接种于24孔板,在含有10％新生牛血清的DMEM高糖培养基中37℃5％CO₂培养24h，之后用移液器小心的弃去培养基，换成不含有血清的DMEM 高糖培养基，饥饿处理8h。饥饿处理完成后，用移液器小心吸弃培养液，按照组别(正常组、造模组、SGP8 100μM组、SGP8 200μM组、SGP8 500μM组、Bez 100μM)加入培养基孵育24h。孵育完成后，每孔用PBS清洗两遍，然后将油红O储液以3：2(油红O:H₂O)的比例稀释。将稀释好的油红O每孔200μL加入24孔板中，在37℃的环境中染色30min。染色完成后，每孔加入200μL60％的异丙醇漂洗2min。在荧光显微镜下拍取照片。然后每孔加入200μL的100％的异丙醇将油红O析出。拍照后，将析出的油红O吸入96孔板每孔100μL，在酶标仪OD₅₀₀测定吸光度值定量得出结果。

结果显示：HepG2细胞1mM FFA造模24h的同时给予不同浓度的SGP8刺激，油红O染色结果8所示。随着SGP8浓度的不断增加脂堆积的情况呈下降趋势。当SGP8 给药浓度达到500μM时，效果与100μM苯扎贝特相当。油红O溶出的结果与显微镜下拍照的结果相似，SGP8给药浓度达到500μM时，与造模组相比OD₅₀₀的吸收值明显下降。并且溶出的颜色肉眼观察也明显变浅。同样与阳性药组的对比也可以得出与显微镜拍照相同的结果，即给药浓度达到500μM时，SGP8的降低脂堆积效果与与100μM 苯扎贝特相当。

同样的培养方法测定SGP8对HepG2细胞TG(左)和TC(右)的影响。结果如图9所示。通过对比造模组与正常组可以得出结论，1mM FFA造模24h，可以使HepG2 细胞内TG和TC的含量有显著的提高。然后通过对比SGP8给药组与造模组可以得出结论，SGP8可以有效的降低脂肪变性肝细胞中TG和TC的含量，起到降低脂质积累的效果。

Claims (6)

1.一种氨基酸序列为IAVPGEVA的寡肽在制备防治非酒精性脂肪肝病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物添加一种或多种药学上可接受的辅料制成制剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述寡肽通过合成或由大豆储藏蛋白质水解分离得到。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述药学上可接受的辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂或稳定剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述制剂为注射剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述制剂的给药方式包括皮下注射、肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、口服给药。

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