CN107488235A - 一种新的增强型抗原联合多肽诱导肝癌特异性ctl细胞的制备及应用 - Google Patents

一种新的增强型抗原联合多肽诱导肝癌特异性ctl细胞的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种新的增强型GPC3‑AFP‑NY‑ESO‑1联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备及应用。本发明选择从GPC3、AFP、NY‑ESO‑1中筛选出的新的肝癌细胞表面抗原多肽进行顺序片段连接。将新筛选出的GPC3、AFP、NY‑ESO‑1多肽顺序连接为CTL抗原表位肽SEQ ID NO:4。本发明建立了一种针对肝癌细胞进行高效特异性肿瘤杀伤的新方法和手段，得到的肝癌特异性杀伤CTL细胞克服了针对肿瘤杀伤效率低下，培养时间过长等关键问题，能够特异性增强肝癌免疫治疗的效果，具有肿瘤治疗应用前景。

Description

一种新的增强型抗原联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制 备及应用
技术领域：
本发明属于免疫细胞制备领域，具体涉及一种新的增强型 GPC3-AFP-NY-ESO-1联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备方法及应用。
背景技术：
我国是全球原发性肝细胞癌(Primary Hepatocellular Carcinoma)高发国家，全球每年新发肝癌约100万人，我国占55％。 2015年我国癌症登记网统计显示，在60岁之前的男性人群中，肝癌的死亡占比最高。。近年来，尽管在治疗上已经有了一些突破，例如外科手术、介入治疗以及移植，但是肝癌的快速进展、转移性等仍然是需要克服的关键问题。肿瘤免疫治疗目前已成为治疗和消除肿瘤的重要手段和方法，其也将成为今后治疗肿瘤的重要方向。体内的免疫系统主要包括固有免疫和适应性免疫系统，固有免疫和适应性免疫发挥作用的方式和手段各有不同，它们都在抵抗肿瘤的侵袭中发挥不可或缺的作用。在肿瘤治疗过程中，现在过继免疫细胞治疗已经被广泛采纳，过继免疫细胞治疗主要通过体外诱导与活化机体固有的生物调节系统来刺激具有细胞毒性和杀伤能力的细胞和细胞因子产生，增强机体杀伤肿瘤的特异性细胞的分化能力，在细胞水平上杀伤肿瘤细胞，同时有效地抑制肿瘤细胞的复发和转移，并提高肿瘤患者的自体免疫功能。
现在临床上应用较多是针对肿瘤靶点的特异性抗体，抗体在体内的半衰期较短，需要间隔重复给药，治疗成本昂贵并且存在较多的副反应。免疫细胞治疗的方法克服了传统治疗的缺点，随着在细胞水平和分子水平上对肿瘤免疫的认识发展深入，负载肿瘤抗原的树突状细胞(Dendritic Cells,DC)来致敏自体淋巴细胞，从而获得针对肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL) 的方法，已经成为了免疫治疗的重要手段和方法。通过这种方法获得的特异性CTL，可以在体外或者体内大量扩增，并且具有免疫记忆性，特异性识别肿瘤表面抗原，杀伤肿瘤细胞。CTL需要特异性肿瘤抗原以及抗原呈递细胞(Antigen-presenting cell,APC)提供的共刺激信号共同激活，针对肿瘤相关特异性抗原的筛选成为了近些年研究的重点，如何筛选出免疫原性强、特异性高的肿瘤相关抗原(Tumor-associated antigen,TAA)肿瘤特异性抗原(Tumor specific antigen,TSA)成为了肿瘤治疗研究工作者需要解决的重要问题。针对TAA或TSA的多肽免疫治疗性疫苗，安全、易于制备保存、特异性高，能有效地杀伤肿瘤细胞，成为了现在应用较为广泛的治疗方法。
细胞毒性T淋巴细胞的激活需要APC发挥呈递抗原的作用，APC 可以将肿瘤相关抗原降解为多肽并且形成多肽-MHC复合物后呈递给 T细胞受体(T Cell Receptor,TCR)进行识别，从而激活细胞毒性 T淋巴细胞，产生细胞毒性反应。多肽疫苗是用高剂量及广谱的肿瘤抗原多肽给予APC，使其和MHC分子相结合，能有效并且广谱地呈递给细胞毒性T细胞。由于肿瘤抗原多肽受到MHC分子的限制性、多肽疫苗的免疫原性较弱等特性，且我国HLA-A2人群比例较高，在肝癌患者中比例更高，因此我们采用新的增强型HLA-A2类多肽抗原结合强抗原提呈功能DC，可以有效地提高免疫原性，诱导功能更强、种类更多的杀伤性细胞毒性T淋巴细胞。
发明内容
本发明提供了一种新的增强型GPC3-AFP-NY-ESO-1联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备方法及应用。
本发明提供了一种新的诱导肝癌特异性CTL细胞的增强型的联合抗原多肽，根据GPC3、AFP、NY-ESO-1的肝癌特异性表达及功能差异，经过氨基酸序列评分及功能实验，筛选出新的未公开的三种与 HLA-A*0201阳性肝癌细胞匹配并且可以发挥特异性刺激效果的肝癌细胞表面抗原肽序列，并制作成联合多肽抗肝癌疫苗，这种新的联合多肽疫苗相比于传统肝癌疫苗具有明显的优势，其可克服肿瘤细胞表面抗原表达的多样性，不均一性等难点。本发明还提供了一种诱导新的增强型肝癌特异性CTL细胞的制备方法及其在肝癌治疗中的应用。
本发明选择从GPC3、AFP、NY-ESO-1中筛选出的新的肝癌细胞表面抗原多肽进行顺序片段连接。将新筛选出的GPC3、AFP、NY-ESO-1 (其氨基酸序列分别是：SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3) 多肽顺序连接为CTL抗原表位肽SEQ ID NO:4。采用上述方式制备的新的多肽具有诱导针对肝癌抗原表位的杀伤及免疫增强作用，这种对肝癌细胞表面联合的新多价疫苗比使用传统抗原肽刺激具有更强的杀伤肿瘤作用。
本发明通过以下技术方案得以实现：
一种新的增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其氨基酸序列是新筛选出的GPC3、AFP、NY-ESO-1多肽序列的组合。
所述多肽组成中GPC3多肽氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示，AFP 多肽氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示，NY-ESO-1多肽氨基酸序列是 SEQ ID NO：3所示。
进一步的，所述增强型肝癌细胞特异性联合多肽，氨基酸序列是 SEQ ID NO：4所示。
进一步的，本发明提供了所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽在制备肝癌细胞特异性CTL诱导剂组合物中的用途。
本发明同时提供了所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽制备具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞的方法，所述方法包含如下步骤：
1)分离HLA-A*0201阳性肝癌患者的外周血单个核细胞PBMC，收集贴壁细胞，经rhGM-CSF与rhIL-4诱导培养，获得非成熟树突状细胞；
2)使用rhIL-2、rhIL-33和rhTNF-α继续诱导培养步骤1) 中获得的非成熟树突状细胞，获得成熟树突状细胞；
3)向步骤2)中获得的成熟树突状细胞中加入SEQ ID NO：4 多肽，继续培养培养，获得致敏性的成熟树突状细胞；
4)将步骤3)获得的致敏性的成熟树突状细胞与原始分离的非贴壁T淋巴细胞在CTL专用培养基中共同培养，得到具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞。
优选的，步骤4)中使用的CTL培养基含有浓度为100-500IU/ml的 rhIL-2，2.5-15ng/ml的rhIL-7，2.5-15ng/ml的rhIL-15， 2.5-15ng/ml的rhIL-21，2.5-15ng/ml的rhIL-23，0.5-5μg/ml的抗CD3抗体；更优选为使用的CTL培养基含有浓度为300-500IU/ml 的rhIL-2，5-15ng/ml的rhIL-7，5-15ng/ml的rhIL-15，5-15ng/ml 的rhIL-21，5-15ng/ml的rhIL-23，1-3μg/ml的抗CD3抗体；再优选含有浓度为300-400IU/ml的rhIL-2，10-15ng/ml的rhIL-7， 10-15ng/ml的rhIL-15，10-15ng/ml的rhIL-21，10-15ng/ml的 rhIL-23，1-2μg/ml的抗CD3抗体；最优选为含有浓度为300IU/ml 的rhIL-2，10ng/ml的rhIL-7，10ng/ml的rhIL-15，10ng/ml的rhIL-21， 10ng/ml的rhIL-23，1μg/ml的抗CD3抗体。
本发明同时提供了上述制备获得的具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞在制备肝癌治疗药物中的用途。
本发明的实施方式中，提供了联合抗原肽诱导肝癌抗原特异性的 CTL，所述联合抗原肽是在肝癌细胞特异性表达的抗原多肽联合聚合物。本发明所述组合的增强型CTL抗原肽是在肝癌特异性表达的 GPC3、AFP、NY-ESO-1多肽顺序连接聚合物。
在本发明的实施方法中，联合抗原肽的组合的方式具体为所述的肝癌细胞抗原GPC3、AFP和NY-ESO-1三条新多肽顺序连接，其中所述GPC3多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示，所述AFP多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2所示，所述NY-ESO-1多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3所示。连接的方式为顺序片段连接法。本发明所述联合多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示:
SEQ ID NO:4
N-VLLGLFSTI-FIYEIARRH-ITQCFLPVF-C
SEQ ID NO:1
N-VLLGLFSTI-C
SEQ ID NO:2
N-FIYEIARRH-C
SEQ ID NO:3
N-ITQCFLPVF-C
本发明制备得到的新的联合多肽诱导的肝癌特异性CTL细胞，具有很大程度增强的抗肝癌细胞的杀伤效果，其分泌杀伤性细胞因子 IFN-γ能力较传统抗原多肽增强很多，其针对肝癌细胞的特异性增强，抑制肝癌细胞增殖分化的能力及对其杀伤能力都优于传统抗原肽疫苗。
本发明的创新及重要意义体现在：建立了一种针对肝癌细胞进行高效特异性肿瘤杀伤的新方法和手段。本发明得到的肝癌特异性杀伤 CTL细胞克服了针对肿瘤杀伤效率低下，培养时间过长等关键问题，能够特异性增强肝癌免疫治疗的效果，具有肿瘤治疗应用前景。
附图说明
图1新的增强型联合肝癌特异性多肽序列
图2具有致敏性的成熟树突状细胞和联合抗原肽诱导肝癌特异性CTL淋巴细胞的制备
图3表位诱导的肝癌特异性CTL效应细胞IFN-γ分泌能力
图4表位诱导的特异性CTL效应细胞对肝癌细胞系HepG2的体外杀伤能力
图5表位诱导的特异性CTL效应细胞对肝癌细胞系Huh7的体外杀伤能力
图6：表位诱导的特异性CTL效应细胞在动物体内杀伤肝癌细胞实验
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。下述实施例中的实验方法，未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件如《ATCC细胞培养手册》中所述条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则按照说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明实施例中所用的试剂：
AIM V细胞培养基，ThermoFisher公司
Lymphoprep分离液(即用型)，Axis-Shield公司
CD3单克隆抗体、rhIL-2、rhIL-7、rhIL-15、rhIL-21、rhIL-23、 rhIL-33、rhIL-4、rhGM-CSF、rhTNF-α，Peprotech公司
实施例1合成肝癌特异性联合多肽
HLA分子一般结合特定长度和亲和力的多肽，在特定位置的氨基酸残基决定了多肽被TCR识别的亲和力。我们通过SYFPEITHI与BIMAS 的数据库，进行了GPC3、AFP、NY-ESO-1多肽与MHC-I类分子结合能力的预测，并进行比对以及评分筛选。我们得到了新的具有HLA分子高亲和力的GPC3、AFP、NY-ESO-1的序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3。查阅大量相关文献专利报道，以上序列未在相关研究中公开发表。
将筛选获得的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4及经典抗原肽组(序列已报道)SEQ ID NO:5所示氨基酸序列，委托北京赛百盛基因技术有限公司采用TETRASTM Peptide Synther进行合成，并采用高效液相色谱法进行纯化和纯度分析，质谱法进行鉴定和分子量测定。结果显示，合成多肽纯度高于95％，分子量与理论值相符。所得多肽为GMP级。具体合成步骤：1.固相多肽合成用Fmoc 方法，碱性溶剂去除氨基保护基团；2.激活剂激活氨基酸羧基端，将激活的单体与游离氨基在交联剂作用下进行交联反应，反复循环直至肽链合成完毕。
实施例2外周血单个核细胞(PBMC)提取
(1)清晨分离HLA-A*0201阳性肝癌患者20ml抗凝静脉血。在50ml离心管中加入15ml Lymphoprep分离液。
(2)抗凝静脉血中缓慢加入等体积0.9％无菌生理盐水轻柔颠倒三次，充分混匀。
(3)使用2ml无菌滴管将稀释后的血液缓缓加入淋巴细胞分离液表层，全部移入后切勿晃动或颠倒。
(4)离心管配平，以水平离心机(水平转头)1700rpm，ace/brake: 0/0，室温离心30min。
(5)吸出最上层部分多余的血浆。用2ml无菌吸管轻轻吸出淋巴细胞层，移入新的50ml离心管中，将所有管中的淋巴细胞层吸入同一个50ml离心管中。加入0.9％无菌生理盐水至50ml，充分混匀。
(6)离心管配平，以水平离心机(水平转头)1700rpm， ace/brake:9/9离心，室温离心10min。
(7)取出试管，完全弃去液体。
(8)从37℃培养箱中取出孵育的AIM V培养基，取2ml将细胞沉淀充分混匀，注意轻柔操作，避免产生气泡。随后加入其余培养基，混匀细胞。
(9)将混匀的细胞悬液移入75cm2细胞培养瓶，轻轻晃动混匀，放置于37℃培养箱中培养。
实施例3抗原提呈细胞的制备
(1)将密度梯度离心法得到的PBMC以AIM V培养基重悬，加入细胞培养皿中，37℃，5％CO2培养。
(2)3小时候将培养皿取出，轻轻晃动，吸出悬浮细胞。
(3)向培养皿中加入含500IU/ml的rhIL-4、500IU/ml的 rhGM-CSF的AIM V培养基。
(4)分别在培养后第3天、第5天半量换液，加入新鲜含 500IU/ml的rhIL-4、500IU/ml的rhGM-CSFAIM V培养基。
(5)培养第6天加入终浓度为10ng/ml的rhTNF-α、300IU/ml 的rhIL-2、10ng/ml的rhIL-33的培养基。
(6)第7天收获成熟树突状细胞。
(7)离心收取成熟树突状细胞，以AIM V培养基重悬，加入终浓度10μg/ml氨基酸序列为SEQ ID NO:4的联合抗原多肽或对照抗原肽组培养6小时。
(8)离心去除游离的多肽，收获具有致敏性的成熟树突状细胞。
实施例4联合多肽诱导的增强型肝癌特异性CTL效应细胞的制备
(1)HLA-A*0201肝癌患者外周血经实施例2方法分离得到非贴壁悬浮细胞，重悬于AIM V培养基中，调节细胞浓度至1×106个/ml，此悬液中富含T淋巴细胞。
(2)将实施例3制备的具有致敏性的成熟树突状细胞与T淋巴细胞按照DC：T细胞＝1:10的比例混合后，在AIM V培养基中加入终浓度 300IU/ml的rhIL-2，10ng/ml的rhIL-7，10ng/ml的rhIL-15， 10ng/ml的rhIL-21，10ng/ml的rhIL-23，1μg/ml的CD3抗体继续培养10天，每3天半量换液，10天后收集细胞即得联合抗原表位诱导的特异性CTL效应细胞。
实施例5联合抗原表位诱导的肝癌特异性CTL效应细胞IFN-γ分泌能力检测实验
使用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,Q-PCR) 检测细胞中IFN-γ分泌能力。
所述IFN-γPCR引物序列如下：
Forward：5’-TCTGTGTGGATTGGTGGCTCTA-3’
Reverse：5’-CCTCGAACTTGGCGATGCT-3’
Q-PCR反应在BIO-RAD IQ5型号定量PCR仪上进行，反应体系为：
cDNA 2μL
primer1(10μΜ)0.2μL
primer2(10μΜ)0.2μL
SYBR Green Realtime PCR Master 10μL
ddH2O 7.6μL
总体系20μL
基因表达量计算采用优化的2-ΔΔCT方法，以GAPDH基因作为内参，每个样品每次实验设置3个技术重复，每个处理设置4个生物学重复。
实验分组为：PBS对照组；AFP抗原组；GPC3抗原组；NY-ESO-1 抗原组；联合抗原肽组；经典抗原肽组。
GPC3抗原组：SEQ ID NO:1序列肽段，终浓度10μg/mL；
AFP抗原组：SEQ ID NO:2序列肽段，终浓度10μg/mL；
NY-ESO-1抗原组：SEQ ID NO:3序列肽段，终浓度10μg/mL；
经典抗原肽组(序列已报道)：SEQ ID NO:5序列肽段，终浓度 10μg/mL；
联合抗原肽组：SEQ ID NO:4序列肽段，终浓度10μg/mL。
图3的结果表明，联合抗原肽组诱导肝癌特异性CTL淋巴细胞 IFN-γ分泌能力最强，相对传统抗原肽及经典已报道抗原肽组诱导分泌IFN-γ能力至少提高两到三倍。
实施例6加强型联合抗原多肽诱导的肝癌特异性CTL对肝癌细胞杀伤能力实验
效应细胞：实施例4获得的CTL
靶细胞1：人肝母细胞瘤细胞系HepG2
靶细胞2：人高分化肝癌系Huh7
检测特异性CTL对肿瘤细胞杀伤能力实验使用乳酸脱氢酶 (LacticDehydrogenase,LDH)释放法。具体操作方法如下:
(1)调整靶细胞浓度至1×105个/ml；
(2)将靶细胞按照100μl/孔转移至96孔板中，每组设定三个复孔。
(3)设置靶细胞自然释放孔(阴性对照)。不加效应细胞只加 100μl培养液。
(4)设置最大释放孔(阳性对照)。不加效应细胞只加100μl 10％ NP40。
(5)在每个实验孔中加入效应细胞100μl，效应细胞：靶细胞＝0:1；1:1；3:1；10:1；30:1；50:1。
(6)37度5％CO2培养至相应时间。
(7)吸取培养液上清，检测LDH数值计算活性。杀伤活性 (％)＝[(实验组A值-总自然释放A值)/(最大释放组A值-总自然释放 A值)]×100％。
图4结果表明，表位诱导的特异性CTL效应细胞对肝癌细胞系HepG2的体外杀伤能力：靶细胞为人肝母细胞癌HepG2细胞系，效应细胞为表位诱导的特异性CTL，按照效应细胞:靶细胞不同比例即 0:1、1:1、3:1、10:1、30:1、50:1进行杀伤实验。于12小时收取细胞上清进行乳酸脱氢酶(LDH)检测。设置磷酸盐缓冲液(PBS)组、 GPC3多肽、AFP多肽、NY-ESO-1多肽、经典联合多肽组作为对照。结果显示，联合抗原肽组诱导CTL可以形成对靶细胞的特异性溶解，对HepG2的杀伤效果强于各对照组及经典抗原肽组，证明了联合抗原表位诱导CTL功能比使用传统抗原肽刺激更有效。
图5结果表明，肝癌特异性CTL效应细胞对肝癌细胞系Huh7的体外杀伤能力：靶细胞为人高分化肝细胞癌Huh7细胞系，效应细胞为肝癌诱导的特异性CTL，按照效应细胞:靶细胞不同比例即0:1、 1:1、3:1、10:1、30:1、50:1进行杀伤实验。于12小时收取细胞上清进行乳酸脱氢酶(LDH)检测。设置磷酸盐缓冲液(PBS)组、GPC3 多肽、AFP多肽、NY-ESO-1多肽、经典联合多肽组作为对照。结果显示，联合抗原表位诱导CTL可以形成对靶细胞的特异性溶解，对Huh7 的杀伤效果强于各对照组及经典抗原肽组，证明了联合抗原肽诱导 CTL功能比使用传统抗原肽刺激更有效。
实施例7.CTL细胞体内杀伤肝癌肿瘤细胞实验
选用GFP荧光标记的肝细胞癌细胞系HepG2-GFP作为肿瘤细胞，皮下种植于周龄为8周，体重在20～30g之间的免疫缺陷小鼠 NOD-SCID小鼠背部，待肿瘤长成后，按时间点尾静脉过继人CTL细胞，荧光成像观察肿瘤生长情况并测量肿瘤大小。
具体操作方法如下:
(1)联合多肽诱导的增强型肝癌特异性CTL效应细胞：实施例4 获得的大量扩增的CTL细胞，注射前以生理盐水悬浮备用；
(2)CTL细胞注射频率为从14天开始后每周1次，共4周，4次注射，阴性对照组为注射1％含白蛋白生理盐水组，阳性对照组为腹腔注射阿霉素2mg/kg，14天开始后注射到腹腔隔5天1次；
(3)注射CTL细胞剂量的确定：以60kg的成人为基准，CTL细胞在临床预期使用剂量为1×109～1×1010个细胞(约1.6×107～1.6 ×108个细胞/kg)。以NOD-SCID小鼠体重30g为基准，其临床预期剂量相当于5×105～5×106个细胞/只。我们以高剂量细胞为实验剂量，每只小鼠过继5×106个细胞；
(4)肿瘤的体积(mean tumor volume)：注射期间，每周3次使用测径器(calipers)测量肿瘤的长轴及短轴，并利用以下的计算公式，测量肿瘤的体积：V(mean tumor volume,mm3)＝AB2/2(A＝长轴长度,B＝短轴长度)。
实验分组每组3只NOD-SCID鼠。具体分组如下表所示。
由图6结果显示，NOD-SCID小鼠皮下种植HepG2-GFP肿瘤细胞 14天后，尾静脉过继联合多肽诱导的增强型肝癌特异性CTL效应细胞，过继时间点分别为第14、21、28、35天，此后每周荧光成像观察肿瘤大小，并测量肿瘤体积(图6A)。如图6B、6C结果显示，CTL 细胞过继给荷瘤小鼠后，小鼠肿瘤大小比起Control阴性对照组明显缩小，提示联合多肽诱导的增强型肝癌特异性CTL效应细胞在体内有明显的抗肝癌肿瘤细胞的作用。
所有本说明书中列出的出版物的内容都包含在本说明书中。此外，本领域技术人员可以理解，在不背离权利要求书中所述的技术范围和实质内容的情况下，对本发明进行多种不同的修饰和改变是可能的。本发明还包括上述这些修饰和更改。
序列表
<110> 闾军
北京基因启明生物科技有限公司
<120> 一种新的增强型抗原联合多肽诱导肝癌特异性CTL细胞的制备及应用
<150> 201610921968.7
<151> 2016-10-21
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(GPC3 amino acid)
<400> 1
Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (AFP amino acid)
<400> 2
Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列 (NY-ESO-1 amino acid)
<400> 3
Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe
1 5
<210> 4
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列 (GPC3-AFP-NY-ESO-1 amino acid)
<400> 4
Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile Phe Ile Tyr Glu Ile Ala Arg
1 5 10 15
Arg His Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe
20 25
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列 (GPC3-AFP-NY-ESO-1 amino acid)
<400> 5
Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Phe Met Asn Lys Phe Ile Tyr
1 5 10 15
Glu Ile Ser Ile Leu Met Trp Ile Thr Gln Val
20 25

Claims (10)

1.一种增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，其氨基酸序列是GPC3、AFP、NY-ESO-1多肽序列的组合。
2.根据权利要求1所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，该多肽组成中GPC3多肽氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示，AFP多肽氨基酸序列是SEQ ID NO：2所示，NY-ESO-1多肽氨基酸序列是SEQ ID NO：3所示。
3.根据权利要求1或2所述的的增强型肝癌细胞特异性联合多肽，其特征在于，氨基酸序列是SEQ ID NO：4所示。
4.权利要求1-3中任一所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽在制备肝癌细胞特异性CTL诱导剂组合物中的用途。
5.根据权利要求1-3中任一所述的增强型肝癌细胞特异性联合多肽制备具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
1)分离HLA-A*0201阳性肝癌患者的外周血单个核细胞PBMC，收集贴壁细胞，经rhGM-CSF与rhIL-4诱导培养，获得非成熟树突状细胞；
2)使用rhIL-2、rhIL-33和rhTNF-α继续诱导培养步骤1)中获得的树突状细胞，获得成熟树突状细胞；
3)向步骤2)中获得的成熟树突状细胞中加入SEQ ID NO：4多肽，继续培养，获得致敏性的成熟树突状细胞；
4)将步骤3)获得的致敏性的成熟树突状细胞与原始分离的非贴壁T淋巴细胞在CTL培养基中共同培养，得到具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)中使用的CTL培养基含有浓度为100-500IU/ml的rhIL-2，2.5-15ng/ml的rhIL-7，2.5-15ng/ml的rhIL-15，2.5-15ng/ml的rhIL-21，2.5-15ng/ml的rhIL-23，0.5-5μg/ml的抗CD3抗体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)中使用的CTL培养基含有浓度为300-500IU/ml的rhIL-2，5-15ng/ml的rhIL-7，5-15ng/ml的rhIL-15，5-15ng/ml的rhIL-21，5-15ng/ml的rhIL-23，1-3μg/ml的抗CD3抗体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤4)中使用的CTL培养基含有浓度为300-400IU/ml的rhIL-2，10-15ng/ml的rhIL-7，10-15ng/ml的rhIL-15，10-15ng/ml的rhIL-21，10-15ng/ml的rhIL-23，1-2μg/ml的抗CD3抗体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤4)中使用的CTL培养基含有浓度为300IU/ml的rhIL-2，10ng/ml的rhIL-7，10ng/ml的rhIL-15，10ng/ml的rhIL-21，10ng/ml的rhIL-23，1μg/ml的抗CD3抗体。
10.根据权利要求5-9中任一所述的方法制备获得的具有抗肝癌特异性CTL淋巴细胞在制备肝癌治疗药物中的用途。
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