CN103751778B

CN103751778B - 3′-脱氧腺苷在制备广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用

Info

Publication number: CN103751778B
Application number: CN201410040650.9A
Authority: CN
Inventors: 朱乃硕; 杨艳; 刘蕊; 白豆; 蕫越
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2014-01-28
Filing date: 2014-01-28
Publication date: 2016-09-28
Anticipated expiration: 2034-01-28
Also published as: CN103751778A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种免疫佐剂及其制备方法。所提供的是一种天然免疫增效分子3′‑脱氧腺苷，或3′‑脱氧腺苷与MHC表位肽组成的混合物或共价偶联物对疫苗及抗原的增效作用。本发明的免疫佐剂可有效提高各种疫苗（抗原）如：狂犬疫苗、乙肝疫苗、结核疫苗和各种抗原等的免疫效果，显著提高动物体内保护性抗体滴度和效应免疫细胞的数量及功能，同时显著加速抗体和效应细胞产生的时间。本发明免疫佐剂的制备方法易于实施，可用于开发高效快速增效型疫苗，在医学领域具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效应和经济效益。

Description

3 ´ - 脱氧腺苷在制备广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种3´-脱氧腺苷及其组合物在制备广谱疫苗（或抗原）增效的免疫佐剂中的应用。

背景技术

疫苗是控制许多烈性传染病的有效手段，目前使用的疫苗大多是相关病原体的减毒株，然而许多病原体减毒株的开发较困难，另外一些病原体如流感病毒等，减毒株的效果并不明显且存在病毒产生回复突变的危险。新研制出的重组核酸疫苗、合成多肽疫苗、虽然纯度高、特异性强，但分子小，免疫原性弱，难以诱导机体产生有效的免疫应答，需用佐剂以使得它们能够在机体内产生足以抵抗感染的抗体或者细胞免疫反应。

天然免疫系统对病原体的反应速度较快，通常在感染后的几分钟到几小时之内就能够识别病原体，而典型的获得性免疫反应需要在几天甚至数周后才被激发出来。研究发现天然免疫反应能够介导获得性免疫反应的发生，因而可通过天然免疫过程增强疫苗抗原性。机体的天然免疫系统主要通过模式识别受体（PRRs）对外来的微生物侵染进行识别，将PRRs的配体作为疫苗佐剂是佐剂研究领域的一个重要趋势。3´-脱氧腺苷是从真菌中分离得到的鸟嘌呤核苷酸类似物，能够特异性激活TLR7，产生显著的Th1类免疫反应。本发明将其单独、与MHC表位抗原以一定比例混合或者直接偶联作为一种高效快速反应型疫苗佐剂应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种3´-脱氧腺苷在制备用于广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用。

本发明所述的化合物3´-脱氧腺苷，其结构式为：

该化合物3´-脱氧腺苷在制备广谱疫苗（或抗原）增效的免疫佐剂中的应用，具体是3´-脱氧腺苷单独，或其组合物即3´-脱氧腺苷与MHC表位脂肽制成的混合物或3´-脱氧腺苷与MHC表位脂肽共价键偶联物，作为用于广谱疫苗（或抗原）增效的免疫佐剂。

本发明中，所述MHC表位肽制备方法为：

将能与MHC-I分子结合的9~11氨基酸，通过连接肽，同能与MHC-II分子结合的10~18氨基酸相偶联，得到线性肽或分支肽，即MHC表位肽。

本发明中，所述的3´-脱氧腺苷在制备用于广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用，其特征在于所述3´-脱氧腺苷为小分子化合物，来源为中药提取物。

本发明中，所述组合物中，3´-脱氧腺苷与MHC表位肽的质量比为：100:1到1:100。

本发明中，所述广谱疫苗（或抗原）可以为蛋白质疫苗（或蛋白质）、多肽疫苗、核酸疫苗或灭活疫苗等。

本发明中，所述灭活疫苗是将病原体经公知的方法灭活后作为疫苗的抗原物质。

本发明中，所述免疫佐剂可通过注射、喷射、口服、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明中，所述3´-脱氧腺苷与MHC表位肽制成的混合物，其制备方法如下：

将5~500微克、浓度为20毫克/毫升的3´-脱氧腺苷的DMSO溶液，连同5~500微克MHC表位肽，加入到生理盐水中混合；调整生理盐水的容量，使混合物的最终浓度为1~200微克/毫升。

本发明的免疫佐剂与相应疫苗（或抗原）一起使用，可增强机体对以下致病病原体的免疫应答能力：病毒、原核细胞、真核细胞。其中，病毒性病原体包括但不局限于狂犬病毒、乙肝病毒、呼吸道病毒、疮疹病毒。

附图说明

图1 免疫后增强小鼠血清中抗体产生变化情况（增强抗狂犬病毒抗体范例）。

图2免疫后小鼠血清中抗病毒细胞因子IFN-γ增加变化情况。

图3免疫后小鼠血清中T细胞活化因子IL-2变化情况。

图4 流式细胞法检测免疫后小鼠CD3⁺ CD8⁺T细胞分化情况。

图5体外CTL对携带病毒抗原靶细胞杀伤试验。

具体实施方式

一、3´-脱氧腺苷对狂犬病毒疫苗效果的影响评价。

1、ELISA法（酶联免疫吸附实验）检测小鼠免疫后体内抗狂犬病毒抗体以及相关细胞因子的浓度

将实验动物分为实验组和对照组。以BALB/c小鼠为例，其中实验组1腹腔注射0.25ml人用狂犬病疫苗（Vero细胞），实验组2腹腔注射50微克3´-脱氧腺苷(溶于10微升DMSO)和0.25ml人用狂犬病疫苗（Vero细胞），对照组注射相同剂量的生理盐水。各组小鼠均在第0天、第七天和第十四天各免疫一次，注射部位与剂量均相同。小鼠在免疫程序的第0（第一次注射前）、7（第二次注射前）、14、21天从小鼠尾静脉采血，37℃血液自然凝固1 h，3000 r/min，4℃，离心30 min，用微量加样器仔细吸取上清，-20℃保存；用ELISA法检测小鼠体内抗狂犬病毒抗体（RV-IgG）的滴度以及淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IL-4或IFN-γ的浓度，以反应机体细胞免疫的水平。

2、疫苗佐剂刺激T细胞分化情况的流式细胞实验

小鼠于末次免疫后7d断头处死，浸泡于75%的乙醇中约10min；取出小鼠脾脏，脾细胞分离后培养5d，收集细胞，用细胞染色缓冲液洗涤两次，调整细胞浓度为10⁷个/ml。每管加入100μl细胞悬液，并加入FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD4以及PE/Cy5 anti-mouse CD8a荧光抗体各2ul，冰上避光孵育30min。加入1.5ml细胞染色缓冲液以1500r/min，5min离心洗涤细胞2次，去除残留的荧光抗体。最后以0.5ml细胞染色缓冲液重悬细胞，转移至流式管中，上机检测药物刺激对CD3⁺CD4⁺/ CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的影响情况。

二、3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C制备的组合物对狂犬病毒疫苗效果的影响评价。

1、3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C组合物的制备

1.1 狂犬病毒MHC表位脂肽C的制备

应用生物信息学手段对狂犬病毒G蛋白与N蛋白的序列进行CTL表位以及Th表位预测，并利用免疫学实验方法筛选得到小鼠MHC-I表位：AYTIFNKTL序列，MHC-II表位WTSYGILIARKGDRI序列。用KK序列作为间隔序列， MHC-I表位通过赖氨酸接头与两个MHC-II表位偶联，并且两个MHC-II表位各与一个Pal基团链接。多肽固相合成方法合成。高效液相色谱、质谱仪鉴定。

狂犬病毒MHC表位肽C的结构式为：

；

1.2 3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C组合物的制备

将500微克的3´-脱氧腺苷（20微克/毫升溶于DMSO）与100微克狂犬病毒MHC表位脂肽C的生理盐水溶液混合。

2、ELISA法（酶联免疫吸附实验）检测小鼠免疫后体内抗狂犬病毒抗体以及相关细胞因子的浓度

将实验动物分为实验组和对照组。以BALB/c小鼠为例，其中实验组1腹腔注射0.25ml人用狂犬病疫苗（Vero细胞），实验组2腹腔注射50微克3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C组合物和0.25ml人用狂犬病疫苗（Vero细胞），对照组注射相同剂量的生理盐水。各组小鼠均在第0天、第七天和第十四天各免疫一次，注射部位与剂量均相同。小鼠在免疫程序的第0（第一次注射前）、7（第二次注射前）、14、21天从小鼠尾静脉采血，37℃血液自然凝固1 h，3000 r/min，4℃，离心30 min，用微量加样器仔细吸取上清，-20℃保存；用ELISA法检测小鼠体内抗狂犬病毒抗体（RV-IgG）的滴度以及淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、IL-4或IFN-γ的浓度，以反应机体细胞免疫的水平。SPSS软件分析实验组和对照组的差异。

3、疫苗佐剂刺激T细胞分化情况的流式细胞实验

小鼠于末次免疫后7d断头处死，浸泡于75%的乙醇中约10min；取出小鼠脾脏，脾细胞分离后培养5d，收集细胞，用细胞染色缓冲液洗涤两次，调整细胞浓度为10⁷个/ml。每管加入100μl细胞悬液，并加入FITC anti-mouse CD3、PE anti-mouse CD4以及PE/Cy5 anti-mouse CD8a荧光抗体各2ul，冰上避光孵育30min。加入1.5ml细胞染色缓冲液以1500r/min，5min离心洗涤细胞2次，去除残留的荧光抗体。最后以0.5ml细胞染色缓冲液重悬细胞，转移至流式管中，上机检测3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C组合物刺激对CD3⁺CD4⁺/ CD3⁺CD8⁺T细胞亚群的影响情况。SPSS软件分析实验组和对照组的差异。

4、疫苗佐剂细胞杀伤试验

小鼠于末次免疫后7d断头处死，浸泡于75%的乙醇中约10min；取出小鼠脾脏，加入IL-2、Con A和多肽C，置于培养箱中培养3d，作为效应细胞；SP2/0细胞用3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C组合物体外刺激1d，作为靶细胞，调整效应细胞浓度至4×10⁶/ml，靶细胞为10⁶/ml,按效靶比为40:1将两种细胞加入96孔培养板培养；另外设置效应细胞与靶细胞的对照孔，每组加入IL-2、Con A和3´-脱氧腺苷与狂犬病毒MHC表位脂肽C组合物共培养；三组细胞培养24h后，加入CCK-8继续培养4h，测定各孔450nm处的吸光度值，计算杀伤率。SPSS软件分析实验组和对照组的差异。

三、结果

图1~3显示，3´-脱氧腺苷（5）或3´-脱氧腺苷加狂犬病毒MHC抗原（多肽C）、与疫苗组相比均可7天就显著提高抗狂犬病毒抗体的滴度，达到甚至超过疫苗组14天的水平，同时快速刺激淋巴细胞分泌细胞因子IL-2、与IFN-γ，可确认3´-脱氧腺苷或3´-脱氧腺苷加MHC抗原（多肽C）可以快速激发机体的体液免疫应答。图4、5显示，3´-脱氧腺苷（5）或3´-脱氧腺苷加狂犬病毒MHC抗原（多肽C）均能诱导T细胞分化，并挺高细胞杀伤，进一步验证3´-脱氧腺苷或3´-脱氧腺苷加MHC抗原具有成为疫苗佐剂的可能性。

具体应用

本发明提供的疫苗佐剂经动物实验证明可直接提高机体对病毒的细胞免疫及体液免疫应答水平，明显提高淋巴细胞增殖能力，以及诱导细胞分泌抗病毒感染的相关细胞因子，能够有效地提高蛋白疫苗，核酸疫苗和灭活疫苗激发机体完全免疫反应的能力，增强机体T细胞的免疫效果，延长保护期，克服原有疫苗的种种不足；本发明免疫佐剂的制备方法简单无需复杂的设备和操作步骤，易于实施，在生命科学和医学领域具有极佳的应用前景，并将产生巨大的社会效应和经济效益。

Claims

1.一种3´-脱氧腺苷在制备广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用，其特征在于由3´-脱氧腺苷与MHC表位脂肽制成的混合物或3´-脱氧腺苷与MHC表位脂肽共价键偶联物，作为用于广谱疫苗增效的免疫佐剂，所述MHC表位脂肽结构式为：

。

2.如权利要求1所述的3´-脱氧腺苷在制备广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用，其特征在于所述组合物中，3´-脱氧腺苷与MHC表位脂肽的的质量比为：100:1到1:100。

3.如权利要求1所述的3´-脱氧腺苷在制备广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用，其特征在于所述3´-脱氧腺苷与MHC表位脂肽制成的混合物，其制备方法如下：

将5~500微克、浓度为20毫克/毫升的3´-脱氧腺苷的DMSO溶液，连同5~500微克MHC表位脂肽，加入到生理盐水中混合；调整生理盐水的容量，使混合物的最终浓度为1~200微克/毫升。

4.如权利要求1所述的3´-脱氧腺苷在制备广谱疫苗增效的免疫佐剂中的应用，其特征在于所述广谱疫苗为蛋白质疫苗、多肽疫苗、核酸疫苗或灭活疫苗。