CN101775375A - 制备含eb病毒潜伏膜蛋白1,2基因的重组腺相关病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

制备含EB病毒潜伏膜蛋白1，2基因的重组腺相关病毒及其应用，本发明它携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白1，2的DNA序列，如CCTCC NO：V200907所述。其中所说的重组腺相关病毒的病毒滴度不小于1×10¹¹/ml viral particles。所说的重组腺相关病毒可在体内诱导EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。制备本发明方法包括：1)将编码LMP1，LMP2和HSP70蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺相关病毒载体质粒中，得到携带LMP1，LMP2和HSP70之DNA编码序列的重组腺相关病毒载体质粒。2)用步骤1的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒共转染适当的包装细胞，得到所需的重组腺相关病毒。

Description

制备含EB病毒潜伏膜蛋白1，2基因的重组腺相关病毒及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。具体地说是一种含EB病毒潜伏膜蛋白1，2和热休克蛋白70基因的重组腺相关病毒制备方法，以及该重组腺相关病毒在预防和治疗EB病毒相关肿瘤的疫苗中的应用。

背景技术

鼻咽癌为上皮源性恶性肿瘤。传统的鼻咽癌治疗是以放射治疗为主，以诱导化疗为辅。这种传统的治疗模式在过去几十年里，发挥了很大的作用，挽救了许多患者的生命。但是，晚期鼻咽癌占NPC总病例的70％，其5年生存率一直未见提高，治疗失败的主要原因是局部未控、复发和远处转移。如何进一步提高鼻咽癌的治疗效果，特别提高晚期及耐药病人的生存率，是摆在我们面前的一个急待解决的问题。

近年来，大量实验资料证明EB病毒与鼻咽癌密切相关。EB病毒膜蛋白LMP1和LMP2是在鼻咽癌中仅有的可诱发特异性免疫反应的靶抗原，可作为治疗性疫苗的靶点。

Khanna R通过构建重组痘病毒，体内和体外实验中观察到LMP1特异的CTL反应，动物实验中该疫苗能使肿瘤消退。Duraiswamy等用LMP1多表位聚合的疫苗可在体内和体外实验中观察到LMP1特异的CTL反应，动物实验中该疫苗能使肿瘤消退。以痘病毒或腺病毒载体的疫苗能够刺激免疫系统，但是这也同时带来病毒感染的风险，特别是对于免疫缺陷的病人。

国内曾毅等发明了一个携带EB病毒潜伏膜蛋白2的DNA编码序列的复制缺陷型重组腺病毒，并提出了3项申请。含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的重组腺病毒疫苗，公开号：CN1548532；含重组质粒和复制缺陷型重组腺病毒的联合免疫制剂，公开号：CN1927405；含EB病毒潜伏膜蛋白2基因的Ad5F35-LMP2重组腺病毒疫苗，公开号：CN1907493，但该项研究也是基于腺病毒载体系统，然而腺病毒有致病性，应用于免疫力低下的肿瘤患者会带来感染风险。

为避免感染风险，就必须选取一个安全、高效的适合治疗的基因表达载体。重组腺相关病毒(又名：依赖性腺联病毒)是目前基因治疗载体系统研究的热点之一，同时也是最安全的一种载体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组腺相关病毒，它携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白1，2的DNA序列。

本发明的另一个目的是提供生产如上限定的重组腺相关病毒的方法，本发明的再一个目的是提供如上限定的重组腺相关病毒作为EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗的应用。

本发明的病毒携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白1，2的DNA序列，已如2009年4月16日送中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCCNO：V200907，分类命名：依赖性腺联病毒2型病毒rAAV-LMP2/1-hsp所述。

本发明含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其中所说的重组腺相关病毒的病毒滴度不小于1×10¹¹/ml viral particles。

本发明含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其中所说的重组腺相关病毒可在体内诱导EB病毒特异性细胞毒性淋巴细胞反应。

制备本发明含EB病毒潜伏膜蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，该方法包括：

1)将编码LMP1，LMP2和HSP70蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺相关病毒载体质粒中，得到携带LMP1，LMP2和HSP70之DNA编码序列的重组腺相关病毒载体质粒。

2)用步骤1的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒共转染适当的包装细胞，得到所需的重组腺相关病毒。

根据本发明方法的一个实施方案，其中所说的腺相关病毒载体质粒是质粒pAAV(D+)。

根据本发明方法的一个实施方案，其中所说的腺相关病毒辅助质粒是质粒pHelper和pXX2。

根据本发明方法的一个实施方案，其中所说的腺相关病毒包装细胞是293细胞。

根据本发明方法的一个实施方案，其中所说的疫苗的靶抗原是EB病毒的潜伏膜蛋白1和2.

根据本发明方法的一个实施方案，其中所说的重组腺相关病毒可在体内诱导抗EB病毒潜伏膜蛋白1和2特异性抗体生成反应和特异性细胞毒性淋巴细胞反应。

本发明用于基因治疗具有显著的优点：(1)抗原性，毒性很小，不致病，安全性好；(2)基因组小而易于操作。大部分基因可被替代而保留感染能力；(3)感染谱广，可感染分裂期和非分裂期细胞；(4)利用包装细胞，在体外可制备高滴度病毒；放射线照射可以使病毒从潜隐感染进入复制状态，为基因治疗联合放射治疗创造了条件。(5)可以有效地转导脑、骨骼肌、肝脏等许多类型的细胞。

同时，我们利用热休克蛋白HSP70与LMP1和LMP2构建融合基因白。结核分枝杆菌HSP70不仅能诱导特异性Th1型细胞反应，还直接参与和促进抗原的提呈与识别，激活自然杀伤细胞，诱导巨噬细胞分泌IL1α、IL1β、肿瘤坏死因子和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等多种细胞因子，发挥类似免疫佐剂的功能，能够增强针对LMP1和LMP2表位的特异性细胞免疫反应。

附图说明

图1rAAV-LMP2/1-HSP重组腺相关病毒载体质粒的结构示意图

图2被免疫BABL/c小鼠血清中LMP2抗体的检测

rAAV-LMP2/1-HSP免疫小鼠的可诱导特异性的体液免疫。

图3rAAV LMP2/1CTL-HSP疫苗诱导的CTL反应

图3aSP2/0-LMP2细胞；

图3b SP2/0细胞；

图3cSP2/0细胞+LMP2peptide_131-139，

图3dSP2/0细胞+非特异性肽。

结果显示，rAAV-LMP2/1-HSP免疫后的小鼠对SP2/0-LMP2细胞有明显的CTL效应

图4重组腺相关病毒疫苗的预防性作用(A)五天监测一次肿瘤直径，计算肿瘤体积；(B)5周后杀死小鼠，肿瘤称重。结果显示，rAAV-LMP2/1-HSP免疫小鼠的肿瘤生长明显抑制。

图5重组腺相关病毒疫苗的治疗性作用：rAAV-LMP2/1-HSP免疫小鼠的生存时间明显延长。

具体实施方式

以下实例用来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：rAAV-LMP2/1-HSP重组腺相关病毒的构建

1.pAAV-LMP2/1-HSP重组腺相关病毒载体质粒的构建

(1)大肠杆菌感受态细胞的制备

取出-80℃保存的E.Coli DH5α菌种，用接种环挑取少量菌液在LB琼脂板上划线，37℃倒置培养过夜；次日挑取单个DH5α菌落，接种于3ml LB培养基(不含抗生素)中，置37℃摇床280rpm振摇过夜；次日取上述菌液0.5ml接种于50ml LB培养基中，37℃摇床280～300rpm振摇至菌液OD值A₆₀₀达到0.4～0.6时取出；4℃5,000rpm离心10min，弃上清，用20ml预冷CaCl₂(0.1mol/L)重悬细菌，冰浴30min后4℃5,000rpm离心10min，同样弃上清，再用2ml预冷CaCl₂(0.1mol/L)重悬细菌；按每管100μl分装后继续冰浴1h以上或置4℃过夜后即可使用。如要长期保存，可加入30％甘油，置于-80℃冰箱保存。

(2)质粒的小量制备、酶切和电泳分析

为了小量制备携带LMP1、LPM2和HSP70基因的质粒pMD18T-LMP1、pMD18T-LMP2pMD18T-HSP70(均为本试验室克隆和构建)，首先按已知方法用质粒(1μl)转化如上的大肠杆菌细胞。取连接反应物10μl加入200μl感受态细菌中，轻轻旋转混匀，冰上放置30分钟；将Ep管放入42℃热水浴中，恰恰放置90秒，不要摇动。快速将Ep管转移到冰上，使细菌冷却2分钟；加入无抗生素的LB培养基600μl，轻轻吹打，置37℃摇床200转/分缓慢振摇45分钟，使细菌复苏；然后取100μl菌液均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素，1.5％琼脂的LB固体培养平板上，室温放置数分钟，待接种物吸收后，置于37℃培养箱倒置培养12～16小时，直至有菌落长出。

(3)碱裂解法快速小量制备质粒DNA

随机挑取单个菌落接种于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床280转/分振摇过夜至细菌生长至饱和状态；取1.5ml菌液转入EP管中，10,000rpm离心30秒，弃上清；加入100μl预冷的溶液I，剧烈振荡重悬细菌；加入200μl溶液II，上下颠倒数次混匀；加入150μl预冷的溶液III，颠倒数次混匀，冰上放置5分钟，12,000rpm离心10分钟；将上清转移至一新EP管中，加入2倍体积的无水乙醇混匀，室温静置数分钟，12,000rpm离心15分钟，弃上清，用70％的乙醇洗沉淀一次；空气干燥数分钟后，加入适量TE(10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，pH8.0)，置于-20℃冰箱保存备用。

(4)测序鉴定

将提取的重组质粒送上海生工公司测序鉴定。

(5)重组中间质粒的构建和酶切鉴定

分别用HindIII和ApaI双酶切消化带有CMV启动子的腺相关病毒载体质粒pAAV(D+)和带有LMP2片段的质粒pMD18T-LMP2，然后用玻璃奶回收pAAV(D+)的载体片段和pMD18T-LMP2的目的基因片段，按1∶5比例混合，加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4连接酶(反应体积10μl)，16℃连接过夜。然后，用所得到的连接反应混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

以碱裂解法提取如上得到的中间质粒pAAV(D+)-LMP2。

分别用ApaI和Bam HI双酶切消化中间质粒pAAV(D+)-LMP2和带有LMP1片段的质粒pMD18T-LMP1，然后用玻璃奶回收pAAV(D+)-LMP2的载体片段和pMD18T-LMP1的目的基因片段，按1∶5比例混合，加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4连接酶(反应体积10μl)，16℃连接过夜。然后，用所得到的连接反应混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

以碱裂解法提取如上得到的中间质粒pAAV(D+)-LMP2/1。

分别用BamHI和XbaI双酶切消化中间质粒pAAV(D+)-LMP2/1和带有HSP70片段的质粒pMD18T-HSP70，然后用玻璃奶回收pAAV(D+)-LMP2/1的载体片段和pMD18T-HSP70的目的基因片段，按1∶5比例混合，加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4连接酶(反应体积10μl)，16℃连接过夜。然后，用所得到的连接反应混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。

以碱裂解法提取如上得到的中间质粒pAAV(D+)-LMP2/1-HSP。(见图1)

2重组腺相关病毒的包装

(1)pXX₂、phelper、pAAV(D+)-LMP2/1-HSP和pAAV(D+)-GFP质粒的大提挑取酶切鉴定正确的阳性克隆单菌落，接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床280～300rpm振摇培养过夜；将此菌液加入含900ml TB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)的3L烧瓶中，37℃摇床280～300rpm振摇培养至饱和状态；采用质粒大量提取法大量制备所需质粒DNA。首先5,000rpm离心10min沉淀细菌，每升菌液加入30ml溶液I，剧烈振荡重悬细菌；接着每升菌液加入60ml溶液II，上下颠倒离心管数次混匀；每升菌液加入45ml溶液III，同样上下颠倒离心管数次混匀，置冰上10分钟，4℃14,000g离心15min；将上清液转入另一离心管中；加入0.6倍体积异丙醇，混匀，-20℃放置30min，4℃14,000g离心15min；用4ml TE重悬沉淀，加等体积预冷的5M氯化锂溶液冰上放置30分钟，4℃8,000g离心10min；将上清转移到另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇充分混匀，-20℃放置30分钟；4℃8,000g离心10min；弃上清，70％乙醇洗一次，晾干；加入2mlTE(PH8.0)，溶解沉淀；加入RNA酶，终浓度20μg/ml，37℃作用2小时以上。

(2)质粒的纯化

取1.5L菌液大提质粒置于50ml离心管中，加入10-15ml Merlin BidingBuffer，3-5ml Merlin Resin Slurry(用前剧烈震荡)；混合液置于摇床上摇动至少20分钟；将滤柱和聚乙烯管连接负压装置，将振荡混合后的混合液装入滤柱中，在负压下形成Resin沉积层；待沉积层抽吸干燥后，再用25ml Merlin-5洗2次，同样通过负压吸引装置将洗涤液吸弃；向滤柱中加入预热的TE1ml(70-80℃)后2500rpm离心5分钟洗脱质粒DNA；将洗脱的质粒DNA加入2倍体积的无水乙醇，1/20体积的醋酸钠溶液，-20℃放置30分钟，8,000g离心10min，70％乙醇洗涤一次，干燥后，无菌TE溶解；-20℃保存备用。

(3)细胞的复苏和传代

取液氮冻存的293细胞一管37℃快速融化，接种于培养瓶中，用含10％小牛血清DMEN培养基置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达90％以上聚集度时传代。吸出培养基，加入0.25％胰蛋白酶，室温下短暂消化，置于显微镜下观察至细胞皱缩、变圆时，立即吸弃胰蛋白酶，加入含培养基，反复吹打成细胞悬液后分瓶传代。

(4)rAAV-LMP2/1-HSP和rAAV-GFP病毒的包装

三质粒钙磷共转染法

在直径为15cm的细胞培养皿内将293细胞按1∶1-1∶3的比例传代；待细胞至75-80％融合时进行转染，转染前3小时换培养基，按以下方法配制钙磷混合液：

1)15cm培养皿中加入质粒总量为50微克，三种质粒摩尔比1∶1∶1，质量比例为

phelper                                     25微克

pXX2                                        6.25微克

pAAV(D+)-LMP2/1-HSP(或pAAV(D+)-GFP)         18.75微克

2)将质粒加入到0.25MCaCl₂溶液中，每盘需2ml CaCl₂

3)将配制的混合液置于漩涡震荡器上(转速800-1000rpm/min)，再向其中加入2×HEBS，每盘需2ml2×HEBS，震荡10-20秒，充分混匀后，每盘滴入4ml混合液。振摇混合液逐滴加入，以形成较小的钙磷颗粒。

过6-16小时后，换无血清DMEM培养基。

(5)病毒收集

转染后72小时吸弃培养基，离心800rpm×10分钟，弃上清，留沉淀；PBS10ml轻轻吹打盘子里的细胞，将盘子里的细胞清洗干净，转至离心管，800rpm×10分钟离心；弃上清，重复步骤2；用PBS重悬细胞沉淀，800rpm×10分钟离心，留取沉淀，尽可能除尽培养基；用10mMTris+15mMNaCl(PH8.0)或1×PBS溶液充分溶解细胞(1ml/15cm培养皿)可直接进入后面的冻融程序，也可将其存放于-80度；细胞反复冻融3-4次；离心1000rpm×10分钟，取上清-80度保存。

(6)病毒的纯化

病毒上清加入等体积冰冷的饱和硫酸铵(PH7.0)，冰上放置20分钟，15,000g离心10min。沉淀用氯化铯-PBS溶液(PH7.5)(密度1.38g/ml)溶解，加入0.5ml氯化铯-PBS缓冲液(密度1.5g/ml)，40,000rpm离心48小时，收集病毒带，如上所述再次离心48小时。最后，收集病毒带，用DMEM进行透析。

实施例2：rAAV-LMP2/1-HSP和rAAV-GFP病毒滴度的测定：

(1)探针标记

采用随机引物法标记试剂盒(Random Primer Labeling Kit，Promega)，将载体中的CMV启动子片段标记[α-³²p]dCTP作为探针：

溶解CMV于消毒TE中，浓度为25μg/mL，100℃煮沸2min立即置于冰上；

冰上依次加入下列反应物：

成分                         量             终浓度

5×标记缓冲液                10μl          1×

dNTPs混合物                  2μl           20μM/每种

CMV模板                        1μl            500ng/ml

BSA                            2μl            400μg/ml

[α-³²P]-dCTP(3000Ci/mmol)     5μl            333nM

Klenow酶                       1μl            100u/ml

灭菌水                         29μl

                                                   

总量                           50μl

将上述反应物轻轻混匀，室温孵育60min；

100℃煮沸2min后立即置于冰上；

加入EDTA至终浓度为20mM终止反应，直接用于杂交反应或-20℃保存备用。

(2)滴度测定

将含有病毒的293细胞反复冻融三次，8,000rpm离心(4℃，15min)收集上清，除去细胞碎片。

取40μl含有病毒的上清液按下列反应体系除去其中游离的DNA和RNA：

rAAV-CRP(rAAV-GFP)                    40μl

10×DNase缓冲液                       20μl

DNase I                               1μl

RNase                                 4μl

无血清DMEM培养基                      135μl

                                            

于37℃孵育3h

上述反应液200μl再按下列反应体系除去其中的DNase和RNase，及去除病毒的蛋白质外壳。

上述反应液                                200μl

2×蛋白酶K缓冲液                           200μl

蛋白酶K                                    10μl

                                               

于37℃孵育3h

加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提一次，12,000g×15min(4℃)回收水相，再用等体积的氯仿抽提一次，回收水相；取含有病毒DNA水相加入等体积的0.4M NaOH/10mM EDTA溶解变性；将含有已知分子数的对照质粒和步骤4的病毒DNA溶液分别于沸水加热5min后，冰上冷却2分钟，随后用0.4MNaOH/10mM EDTA各按一定的比例稀释；裁二张与抽滤加样器一样大小的滤纸，用6×SSC浸湿，然后平铺于加样器的夹层中；

将预裁减好的尼龙膜，用去离子水浸泡，再置于6×SSC中让其自然浸没，浸泡10min后，置于斑点杂交仪夹层中的双层滤纸上。将尼龙膜铺平后，将斑点杂交仪的顶层按要求安装好，并确保装置中不漏气；连接真空泵与抽滤加样器，每孔加400μl去离子水，真空抽干；将对照质粒和病毒DNA按稀释顺序分别点样，同时真空抽干。每孔再加400μl，0.4M NaOH/10mM EDTA，清洗一次并抽干；拆卸装置，将膜置于一张浸过变性液的滤纸上，放置10min，将膜转至一张滤纸上，晾干；将膜夹于2张滤纸之间，放在干烤箱中，80℃烤膜2小时；将膜正面朝外，置于杂交瓶中，加入预杂交液5ml，在杂交炉中42℃预杂交1小时；将CMV片段用随机引物法(Primer-It II Random Primer LabelingKit)按说明要求标记[α-³²P]dCTP作为探针。标记好的CMV探针于100℃变性10min，之后冰浴2min。加入预杂交液中杂交12～16小时；弃杂交液，用2×SSC/0.1％SDS和0.5×SSC/0.1％SDS于42℃条件下洗膜各3次，每次进行15min；0.1×SSC/0.1％SDS于56℃条件洗膜2次，每次30min；取出尼龙膜在室温下用2×SSC漂洗膜，并吸干多余的液体，用塑料薄膜包裹后于-80℃放射自显影2～3小时；根据样本病毒DNA和对照质粒的斑点强度，确定病毒的滴度。

实施例3：rAAV-LMP2/1-HSP的免疫活性分析

常规培养BALB/c骨髓瘤细胞(SP2/0细胞)。当细胞生长到对数中期时，以脂质体法(Lipofectamine 2000Reagent，Invitrogen)用携带LMP2基因序列的重组质粒pCDNA3.1-LMP2转染之。转染后，用含10％牛血清的RPMI 1640培养基37℃培养24小时，然后换成含600μg/ml G418的选择培养基继续培养。三周后得到有稳定抗性的阳性细胞。继续扩增培养后，将其用作靶细胞。4周龄BALB/c(H-2^d)雄性小鼠随机分为2组，每组6只，按每只动物5×10¹⁰病毒颗粒数经肌肉注射的途径分别用本大名的重组腺相关病毒和对照病毒，免疫动物。第4周加强免疫一次。第6周采血并分离血清进行抗体检测，然后处死动物分离脾细胞进行CTL活性分析。

(1)rAAV-LMP2/1-HSP诱发的小鼠LMP2特异性抗体生成

使用LMP2抗原肽PYLFWLAAI包板，以常规间接酶联免疫法检测被免疫小鼠血清内抗LMP2特异性抗体的滴度。rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫小鼠后，可诱导特异性的体液免疫反应。

(见图2)

(2)rAAV-LMP2/1-HSP诱发的小鼠LMP2特异性CTL反应

使用被免疫小鼠的脾淋巴细胞作为效应细胞，并使用SP2/0-LMP2细胞作为靶细胞，以乳酸脱氢酶法检测接种了本发明的重组腺相关病毒之小鼠的LMP2特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)活性(％杀伤率)。结果显示，rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫后的小鼠对SP2/0-LMP2细胞有明显的CTL效应(见图3)

实施例4：肿瘤攻击实验

(1)疫苗的预防作用

4周龄BALB/c雄性小鼠随机分为3组，每组12只。按每只动物5×10¹⁰病毒颗粒数的剂量经肌肉注射的途径分别用本发明的重组腺相关病毒rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP和生理盐水免疫动物。免疫后3周，每组分别接种SP2/0-LMP2细胞或SP2/0野生型细胞(10⁶cells/mouse)，各6只。接种后动态检测30天，游标卡尺测量肿瘤直径(见图4A)。第30天，处死动物，称量肿瘤重量，结果显示，rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫小鼠的肿瘤生长明显抑制。(见图4B)

(2)疫苗的治疗作用

4周龄BALB/c雄性小鼠随机分为2组，每组10只，接种SP2/0-LMP2细胞(10⁶cells/mouse)。接种10天后，按每只动物5×10¹⁰病毒颗粒数的剂量经肌肉注射的途径分别用本发明的重组腺相关病毒rAAV-LMP2/1-hsp、rAAV GFP免疫动物，每种病毒各10只。接种后动态检测32天，可见rAAV LMP2/1CTL-HSP免疫小鼠的生存时间明显延长。(见图5)

<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120>制备含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组相关病毒及其应用

<160>1

<170>PatentIn Version 3.5

<210>1

<211>3570

<212>DNA

<213>EB病毒(Human herpesvirus 4)结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(13)...(1038)

<223>EB病毒潜伏期膜蛋白2基因部分编码序列

<220>

<221>mat_peptide

<222>(1045)...(1674)

<223>EB病毒潜伏期膜蛋白1基因部分编码序列

<220>

<221>mat_peptide

<222>(1684)...(3564)

<223>结核分支杆菌热休克蛋白70基因部分编码序列

<400>1

aagcttgcca ccatgaatcc agtatgcctg cctgtaattg ttgcgcccta cctcttttgg         60

ctggcggcta ttgccgcctc gtgtttcacg gcctcagtta gtaccgttgt gaccgccacc        120

ggcttggccc tctcacttct actcttggca gcagtggcca gctcatatgc cgctgcacaa        180

aggaaactgc tgacaccggt gacagtgctt actgcggttg tcactttctt tgcaatttgc        240

ctaacatgga ggattgagga cccacctttt aattctcttc tgtttgcatt gctggccgca        300

gctggcggac tacaaggcat ttacgttctg gtgatgcttg tgctcctgat actagcgtac        360

agaaggagat ggcgccgttt gactgtttgt ggcggcatca tgtttttggc atgtgtactt        420

gtcctcatcg tcgacgctgt tttgcagctg agtcccctcc ttggagctgt aactgtggtt        480

tccatgacgc tgctgctact ggctttcgtc ctctggctct cttcgccagg gggcctaggt        540

actcttggtg cagccctttt aacattggca gcagctctgg cactgctagc gtcactgatt        600

ttgggcacac ttaacttgac tacaatgttc cttctcatgc tcctatggac acttgtggtt        660

ctcctgattt gctcttcgtg ctcttcatgt ccactgagca agatccttct ggcacgactg        720

ttcctatatg ctctcgcact cttgttgcta gcctccgcgc taatcgctgg tggcagtatt        780

ttgcaaacaa acttcaagag tttaagcagc actgaattta tacccaattt gttctgcatg        840

ttattactga ttgtcgctgg catactcttc attcttgcta tcctgaccga atggggcagt        900

ggaaatagaa catacggtcc agtttttatg tgcctcggtg gcctgctcac catggtagcc        960

ggcgctgtgt ggctgacggt gatgtctaac acgcttttgt ctgcctggat tcttacagca       1020

ggattcctga ttttcctcgg gcccgccctc cttgtcctct attcctttgc tctcatgctt       1080

ataattataa ttttgatcat ctttatcttc agaagagacc ttctctgtcc acttggagcc       1140

ctttgtctac tcctactgat gagtaagtat tacacccttt gccccactcc ccctttccct       1200

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ggcgacttgg tgccaccatc tggcagcttt tggccttctt cctagccttc ttcctagacc       1500

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gtgaaagacg ttctgctgct tgatgttacc ccgctgagcc tgggtatcga gaccaagggc    2820

ggggtgatga ccaggctcat cgagcgcaac accacgatcc ccaccaagcg gtcggagtct    2880

ttcaccaccg ccgacgacaa ccaaccgtcg gtgcagatcc aggtctatca gggggagcgt    2940

gagatcgccg cgcacaacaa gttgctcggg tccttcgagc tgaccggcat cccgccggcg    3000

ccgcggggga ttccgcagat cgaggtcact ttcgacatcg acgccaacgg cattgtgcac    3060

gtcaccgcca aggacaaggg caccggcaag gagaacacga tccgaatcca ggaaggctcg    3120

ggcctgtcca aggaagacat tgaccgcatg atcaaggacg ccgaagcgca cgccgaggag    3180

gatcgcaagc gtcgcgagga ggccgatgtt cgtaatcaag ccgagacatt ggtctaccag    3240

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acgctgaaca aggttgatgc cgcggtggcg gaagcgaagg cggcacttgg cggatcggat    3360

atttcggcca tcaagtcggc gatggagaag ctgggccagg agtcgcaggc tctggggcaa    3420

gcgatctacg aagcagctca ggctgcgtca caggccactg gcgctgccca ccccggcggc    3480

gagccgggcg gtgcccaccc cggctcggct gatgacgttg tggacgcgga ggtggtcgac    3540

gacggccggg aggccaagtg ataatctaga                                     3570

Claims (8)

1.含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，特征在于：该病毒携带有编码EB病毒潜伏膜蛋白1和2的DNA序列如CCTCC NO：V200907所述。

2.根据权利要求1所述的含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其特征在于：所说的重组腺相关病毒可在体内诱导EB病毒潜伏膜蛋白1和2特异性抗体生成反应和细胞毒性淋巴细胞反应。

3.制备如权利要求1限定的含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒的方法，该方法包括：

1)将编码LMP1和LMP2蛋白质的DNA序列克隆到适当的腺相关病毒载体质粒中，得到携带LMP1和LMP2的DNA编码序列的重组腺相关病毒质粒；

2)用步骤1的重组腺相关病毒载体质粒和辅助质粒共转染适当的包装细胞，得到所需的重组腺相关病毒。

4.根据权利要求3制备含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒的方法，其特征在于：所说的腺相关病毒载体质粒是质粒pAAV(D+)。

5.根据权利要求3制备含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒的方法，其特征在于：所说的腺相关病毒辅助质粒是质粒pHelper和pXX2。

6.根据权利要求3制备含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒的方法，其特征在于：所说的腺相关病毒包装细胞是293细胞。

7.如权利要求1限定的含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其特征在于：作为EB病毒相关肿瘤的治疗性疫苗的应用。

8.根据权利要求7所述的含EB病毒潜伏蛋白1，2基因的重组腺相关病毒，其特征在于：其中所说的疫苗的靶抗原是EB病毒的潜伏膜蛋白1和2。

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