CN109234242B - 一种包含casp8凋亡蛋白的病毒样颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒及其制备方法和应用，属于基因工程蛋白质技术领域。该包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒是由pSVCMV‑Gag‑CASP8质粒、包装质粒pCMV‑Δ8.2和VSV‑G质粒共转染到细胞后包装释放、纯化浓缩获得；所述pSVCMV‑Gag‑CASP8质粒是由全长CASP8蛋白融合到HIV‑1Gag(Pr55)的C‑末端构建而成。本发明的制备方法制备过程简便，易纯化，结构均一，经本方法制得的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒具有很强的诱导肿瘤细胞死亡，并能够有效抑制肿瘤细胞生长的治疗效果。

Description

一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程蛋白质技术领域，具体涉及一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒及其制备方法和应用。
背景技术
乳腺癌是全世界最常见的癌症，是女性癌症相关死亡的第五大常见原因。在过去的二十年中，除了细胞毒性化疗外，乳腺癌的药物治疗已经演变为一种更有针对性的方法，极大地改善了患者的预后。然而，转移性乳腺癌（MBC）仍然无法治愈，估计5年总生存率仅为23%。乳腺癌治疗的一个重要而出人意料的发现是耐药性癌细胞的出现。因此，为了进一步改善乳腺癌患者的临床结果和存活率，仍然需要开发新的潜在治疗策略。
细胞凋亡是一种自然发生的过程，通过该过程细胞被导向程序性细胞死亡，这是一个允许多细胞生物维持组织完整性和功能并消除受损或不需要的细胞的关键机制。细胞凋亡失调是癌症发展和进展中的关键过程，即癌细胞避免凋亡并继续增殖的能力是癌症发展的基本步骤之一。一些致癌突变破坏细胞凋亡，导致肿瘤的发生、发展或转移；另一方面，几种肿瘤抑制基因的沉默可能导致肿瘤形成和进展的风险增加。细胞凋亡是通过两种主要的信号传导机制触发的：“内在”和“外在”途径，在两种途径中，信号传导导致Cys（半胱氨酸）蛋白酶家族激活或半胱天冬酶激活CASP8-11种人类半胱氨酸蛋白酶中的一种，是细胞凋亡过程的中心，与所有其他半胱氨酸蛋白酶一样，CASP8作为无活性的单链多肽链酶原胱天蛋白酶合成，并通过蛋白水解切割活化，多聚体复合体（Fas相关的死亡结构域（FADD））或其他半胱天冬酶的反式切割，然后活化的CASP8激活下游的半胱天冬酶3和7，使细胞凋亡，因此，CASP8是一种有效的促凋亡分子。一些研究表明，由于启动子甲基化，乳腺癌细胞（MCF-7，MB231，SKBR3和HCC1937）中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase 8（CASP8）和maspin表达降低。因此，细胞凋亡是癌症遗传学和癌症治疗之间的生物学联系，并且控制凋亡的基因和蛋白质可能是潜在的药物靶标。 CASP8在导致细胞凋亡的酶促级联的繁殖中起着至关重要的作用：研究表明腺病毒介导的基因（Adv-casp-8）转移强烈诱导了U251人胶质瘤细胞的凋亡并抑制了U251异种移植物的体内生长。这项研究还表明，通过Adv-CASP 8载体引入CASP8 CASP8ye同样能增强细胞凋亡并抑制人胃癌细胞的腹膜播散。因此，CASP8显示出抗乳腺癌的潜力。
病毒样颗粒（Virus-like particle, VLP）是病毒复制过程中自然产生或通过基因工程表达病毒结构蛋白并自行组装出的不含病毒核酸的颗粒样物质，除核酸外其结构与来源病毒基本一致，VLP与完整感染性病毒具有相似的大小和构象，并具有与病毒最接近的抗原结构和免疫学特性，能有效刺激机体产生体液免疫和细胞免疫应答。病毒样颗粒具有众多优点：1.不具有感染性及核酸整合致病性，相对灭活减毒疫苗其安全性得到了保障；2.VLPs保持了病毒蛋白空间结构，可通过和病毒感染相似的途径将抗原呈递给免疫细胞，有效诱导机体免疫系统产生免疫保护应答；3.VLPs易规模化生产，可满足临床应用需要。此外，VLPs也可以用作传递外源基因和小分子的有效载体。即使在没有其他病毒蛋白的情况下表达，HIV结构蛋白Gag（组特异性抗原）也可以有效形成VLP。因此，病毒样颗粒的出现为研发更为安全有效的疫苗提供了一个新的契机。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒及其制备方法和应用，该方法制备过程简便，易纯化，结构均一，经本方法制得的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒具有良好的治疗效果，能够很好地诱导细胞死亡，有效抑制肿瘤生长。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒，该病毒样颗粒由pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G（水泡性口膜炎病毒包膜G糖蛋白）质粒共转染到细胞后包装释放、纯化浓缩获得；所述pSVCMV-Gag-CASP8质粒是由全长CASP8蛋白融合到HIV-1 Pr55的C-末端构建而成。
作为本发明优选的实施方式，所述病毒样颗粒的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.1所示。
作为本发明优选的实施方式，所述病毒样颗粒的碱基序列如序列表中SEQ IDNO.2所示。
本发明还提供了如上所述的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法，所述病毒样颗粒是由pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G质粒共转染到细胞后包装释放、纯化浓缩获得的；其中，所述pSVCMV-Gag-CASP8质粒是由全长CASP8蛋白融合到HIV-1 Pr55的C-末端构建而成。
具体地，本发明所述的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法包括以下步骤：
步骤一：质粒构建：
将全长CASP8蛋白接入融合到HIV-1 Pr55的C-末端，构建pSVCMV-Gag-CASP8融合蛋白质粒，并在HIV-1 Pr55 Gag与CASP8之间插入HIV-1蛋白酶切割位点RPGNF/LQS；
步骤二：包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备：
将步骤一得到的pSVCMV-Gag-CASP8 质粒，以及包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G质粒共转染到293T细胞或HEK293细胞（人胚胎肾293细胞），于培养基培养5 h后加入caspase 8抑制剂Z-VAD-FMK，转染48h后取含有VLP的培养上清，离心纯化后重悬，低温保存。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤一具体如下：
1) 用二次PCR方法: 扩增HIVGag和CASP8基因序列并连接成一个融合基因序列，同时在融合基因序列的两端插入酶切位点ApaI/xba I;
2）利用ApaI/xba I 酶切位点将Gag-CASP8融合基因序列放入pCMV真核细胞表达质粒。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤二具体如下：
1)铺盘：2×106 293T细胞或者HEK293细胞铺到10×10 cm2培养皿；
2)转染：24h后将4μg的pSVCMV-Gag-CASP8质粒，4μg的包装质粒pCMV-Δ8.2及2μg的 VSV-G质粒共转染到 293T细胞；
3)转染293T细胞或者HEK293细胞5h后加入20μM 的caspase 8 抑制剂Z-VAD-FMK；
4)转染48h后收集上清，在4°C下以3000r/min的转速离心15min，去除细胞碎片；
5)取上清，在4°C 下以35000r/min的转速超速离心2h；
6)被离心下来的病毒样颗粒重悬于少量培养液，分装保存于-80°C 下；
7)HIV p24 ELISA 检测病毒样颗粒浓度。
本发明还提供了如上所述的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了如上所述的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明通过构建能够在HIV蛋白酶存在下形成携带活化CASP8的VLPs的Gag-CASP8融合蛋白质粒、再将pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G（水泡性口膜炎病毒包膜G糖蛋白）质粒共转染到细胞后包装释放、浓缩纯化获得Gag-CASP8-VLP，制备过程简便，易纯化，结构均一，，试验结果证明本发明制得的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒能够有效地进入乳腺癌细胞中并诱导细胞凋亡。在4T1小鼠乳腺癌模型的肿瘤组织中注射Gag-CASP8-VLP可以有效地抑制肿瘤生长，由此证明本发明所制得的HIV病毒样颗粒具有良好的抑制效果，对治疗肿瘤药物的研发具有广阔的应用前景；另外，可通过修饰本发明的病毒样颗粒使其携带不同靶标，以针对各种肿瘤特异性表面受体或抗原，从而杀死或抑制其他不同类型肿瘤细胞。
附图说明
图1为本发明的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的构建体系；
图2为本发明所制得的Gag-CASP8-VLP诱导293T细胞凋亡的坐标图；
图3为Gag-p24 ELISA方法定量检测VLP水平的坐标图；
图4为Western印迹方法检测细胞及病毒样颗粒中CASP8蛋白表达水平及活化程度的结果图；
图5为不同剂量下的Gag-VLPs和Gag-CASP8-VLPs诱导4T1细胞凋亡的结果图；
图6为Gag-VLPs和Gag-CASP8-VLPs诱导4T1细胞凋亡的台盼蓝染色法评估分析坐标图；
图7为Gag-VLPs和Gag-CASP8-VLP处理稳定表达分泌Gluc的4T1细胞的结果对比图；
图8为Gag-VLPs和Gag-CASP8-VLP处理4T1细胞AO/EB染色下的荧光显微镜观察结果对比图；
图9为采用免疫组织化学染色法检测病毒样颗粒处理后MCF-7细胞中的CASP8蛋白的结果对比图；
图10为细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法测定细胞增长的结果图；
图11为Gag-CASP8-VLP抑制小鼠乳腺癌细胞生长实验的流程图；
图12为小鼠首次注射Gag-CASP8-VLP后肿瘤切片的免疫荧光分析结构图；
图13为注射Gag-VLPs、Gag-CASP8-VLP及PBS的小鼠的肿瘤体积变化坐标图；
图14为各组小鼠于第22天解剖的肿瘤的照片对比图；
图15为各组小鼠于第22天解剖的肿瘤的体重对比坐标图；
图16为Gag-CASP8-VLP早期施用对小鼠乳腺癌细胞抑制实验的流程图；
图17为各组小鼠于第30天解剖的肿瘤的照片对比图；
图18为各组小鼠于第30天解剖的肿瘤的体积对比坐标图；
图19为各组小鼠于第30天解剖的肿瘤的体重对比坐标图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒，该病毒样颗粒由pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G（水泡性口膜炎病毒包膜G糖蛋白）质粒共转染到细胞后包装释放、浓缩纯化获得；所述pSVCMV-Gag-CASP8质粒是由全长CASP8蛋白融合到HIV-1 Pr55的C-末端构建而成。所述病毒样颗粒的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。所述病毒样颗粒的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
如上所述的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法包括如下步骤：
步骤一：质粒构建：
仅用HIV-1结构蛋白Pr55Gag就可以形成类似HIV-1的VLPs。因此，如图1所示，将全长CASP8蛋白接入融合到HIV-1 Pr55的C-末端，构建pSVCMV-Gag-CASP8融合蛋白质粒，并在HIV-1 Pr55 Gag (P1)与CASP8之间插入HIV-1蛋白酶切割位点RPGNF/LQS，通过由HIV-1蛋白酶介导的特异切割可以让VLP中携带具有活性的CASP8蛋白；
步骤一具体如下：
1) 用二次PCR方法: 扩增HIVGag和CASP8基因序列并连接成一个融合基因序列，同时在融合基因序列的两端插入酶切位点ApaI/xba I;
2）利用ApaI/xba I 酶切位点将Gag-CASP8融合基因序列放入pCMV真核细胞表达质粒。
步骤二：包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备：
将步骤一得到的pSVCMV-Gag-CASP8 质粒，以及包装质粒pCMV-Δ8.2和水泡性口膜炎病毒包膜G糖蛋白（VSV-G）质粒共转染到293T细胞或HEK293细胞，于培养基培养5 h后加入caspase 8 抑制剂Z-VAD-FMK，转染48h后取含有VLP的培养上清，离心纯化后重悬，低温保存。其中，其中包装质粒pCMV-Δ8.2可提供Gag结构蛋白及足够量的HIV-1蛋白酶用于切割Pr55Gag前体并释放CASP8；VSV-G质粒用于增强Gag-CASP8-VLPs进入细胞的能力。步骤二的具体操作如下：
1)铺盘：2×106 293T细胞或者HEK293细胞铺到10×10 cm2培养皿；
2)转染：24h后将4μg的pSVCMV-Gag-CASP8质粒，4μg的包装质粒pCMV-Δ8.2及2μg的 VSV-G质粒共转染到 293T细胞；
3)转染293T细胞5h后加入20μM 的caspase 8 抑制剂Z-VAD-FMK；
4)转染48h后收集上清，在4°C下以3000r/min的转速离心15min，去除细胞碎片；
5)取上清，在4°C 下以35000r/min的转速超速离心2h；
6)被离心下来的病毒样颗粒重悬于少量培养液，分装保存于-80°C 下；
7)HIV p24 ELISA 检测病毒样颗粒浓度。
为了介导在Gag-CASP8-VLp有效地进入癌细胞，本发明采用VSV-G假型化Gag-CASP8-VLPs。与一般的慢病毒载体系统相反，Gag-CASP8-VLPs不含有任何病毒基因组材料。因此，这消除了病毒基因组整合到宿主染色体中的潜在风险。如果在动物模型中证明抗癌效率和安全性，则表明可以将该抗癌剂用于体内。
效果验证：
一、Gag-CASP8对293T细胞的诱导凋亡作用
1、Gag-CASP8的表达能够诱导293T细胞的凋亡
为了测试Gag-CASP8的表达是否可以诱导293T细胞（VLP产生细胞）的凋亡，在上述转染293T细胞时设立了对照组，该组细胞在转染293T细胞5h后加入含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase8抑制剂Z-VAD-FMK（苄氧羰基-缬氨酰-丙氨酰-天冬氨酰-[O-甲基]-氟甲基酮）；不添加抑制剂Z-VAD-FMK为试验组。转染18h后，在显微镜下观察细胞活力并通过台盼蓝排除法评估细胞存活情况，结果见图2。
如图2所示，Gag-CASP8的表达能够很好地诱导293T细胞的凋亡，在包装质粒pCMV-Δ8.2的存在下，Gag-CASP8诱导细胞死亡的效果更明显；另外，试验组中在转染24h后并且在不存在Z-VAD-FMK的情况下，观察到大量细胞死亡，存活细胞部分仅约35%和20%。然而对照组中，在抑制剂Z-VAD-FMK存在下，共转染细胞的存活率达到约70~85%。
2、VLP水平的定量检测
通过Gag-p24 ELISA方法分别对对照组和试验组的转染细胞培养物的上清液进行VLP水平的定量检测，结果如图3所示。
图3表明：与图2观察一致，由于大量的细胞死亡，不含Z-VAD-FMK抑制剂的试验组的Gag-CASP8-VLP的生产水平非常低；对照组中，通过使用Z-VAD-FMK抑制剂抑制细胞凋亡，可以大大提高Gag-CASP8-VLP的产量。
3、Western印迹方法测定293T细胞和纯化后的Gag-CASP8 VLP中CASP8蛋白表达水平
通过Western印迹方法测定293T细胞和纯化后的Gag-CASP8 VLP中CASP8蛋白表达水平，结果如图4所示。
由图4可知，尽管只有低水平的Gag-CASP8融合蛋白，但在293T细胞和VLP中观察到大量的活化的CASP8，包括CASP8p41/37和p18；由此可见，Caspase8抑制剂Z-VAD-FMK不会干扰CASP8的表达和切割。此外，VLPs中的HIV Gag前体也被有效地切割而达到成熟，因为在转染的293T细胞中及VLP中均检测到丰富的裂解衣壳蛋白。
由以上实验可知，VLP中的大多数CASP8蛋白处于其活性形式（p41 / 37，p18）并且诱导细胞凋亡。先前的研究表明，除了Fas-1刺激之外，CASP8的激活还可以通过各种不同的机制发生。在某些生理条件下，CASP8前体蛋白的大量表达也可能导致自我寡聚化和随后在不存在任何外部凋亡信号的情况下自我切割和活化。在Gag-CASP8融合蛋白转染的293T细胞中，Gag-CASP8融合蛋白的过表达有可能导致CASP8活化，其诱导CASP8-VLP产生细胞（293T）的凋亡，这降低了CASP8-VLP的生产水平。因此，向产生CASP8-VLP的293T细胞中添加了胱天蛋白酶抑制剂Z-VAD-FMK，并显示其存在可显着抑制Gag-CASP8转染的293T细胞中的凋亡并显着增加CASP8-VLP的产生。
二、Gag-CASP8-VLP对癌细胞的诱导凋亡作用
1、VSV-G-假型化的Gag-CASP8-VLP对乳腺癌细胞的诱导凋亡作用
以VSV-G假型化Gag-VLPs作为对照组（a），以5ng、10ng、20ng p24剂量的Gag-CASP8-VLP作为三组试验组（b,c,d），分别处理小鼠乳房肿瘤细胞系4T1细胞24h，显微镜下观察细胞存活情况，结果如图5所示；同时通过台盼蓝染色法对各组的细胞存活情况进行评估分析，结果如图6所示。
由图5和图6可知，显微镜下观察到Gag-CASP8-VLP处理的细胞大量死亡并随着剂量的增加细胞死亡率逐渐增加。5ng、10ng、20ng p24剂量下的Gag-CASP8-VLP 三个试验组分别诱导约55%、71%和87%的细胞死亡。转染后48h或72h，所有Gag-CASP8-VLP处理的4T1细胞完全死亡。
上述观察结果可通过使用稳定表达分泌荧光素酶（Gluc）蛋白的4T1细胞进一步证实：采用Gag或Gag-CASP8-VLP（10ng p24）处理稳定表达分泌荧光素酶蛋白的4T1细胞，在不同的时间点测量培养基中的Gluc活性，结果见图7。
如图7所示，当未处理或采用Gag-VLP处理的对照组细胞随着培养时间的延长，4T1细胞培养物中的Gluc释放得越多，导致细胞培养液中Gluc活性水平逐渐增加；然而，在采用Gag-CASP8-VLP处理后，4T1细胞培养物中的Gluc活性随着时间的推移显着下降，由此表明Gag-CASP8-VLP确实阻止了4T1细胞的生长。
同时，还可以通过使用AO/EB染色来检测VLP处理的4T1细胞中的细胞凋亡：以不作任何处理的4T1细胞为对照组a，以等量（10ng p24）的Gag-VLP处理的4T1细胞为对照组b，以10ng p24的Gag-CASP8-VLP处理的4T1细胞作为实验组。处理10h后，对经处理的4T1细胞进行AO/EB染色并在荧光显微镜下观察，结果见图8。
如图8所示，在对照组a的细胞中未检测到显着的凋亡（图8中a），在对照组b的细胞中检测到少量黄绿色的凋亡细胞（图8中b），在Gag-CASP8-VLP处理的细胞中发现大量早期凋亡细胞，即黄绿色部分（图8中c）。随着处理时间的延长，显微镜下清楚可见晚期凋亡和坏死细胞，即橙红色核染色部分（图8中d）。
2、VSV-G-假型化的Gag-CASP8-VLP对人癌细胞的诱导凋亡作用
以不作任何处理的MCF-7细胞为对照组a，以等量（10ng p24）的Gag-VLP处理的MCF-7细胞为对照组b，以10ng p24的Gag-CASP8-VLP处理的MCF-7细胞作为实验组，处理2h后，采用免疫组织化学染色法检测MCF-7细胞中的CASP8蛋白，结果见图9。图9显示，与Gag-CASP8-VLP温育2h后，MCF-7细胞的细胞膜上发现显着的CASP8阳性信号，表明Gag-CASP8-VLP已经靶向MCF-7细胞。
处理24h后，通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定法测定各组MCF-7细胞的活力，结果见图10。图10显示，Gag-CASP8-VLP导致约76％的MCF-7细胞死亡，而Gag-VLP仅导致约12%的MCF-7细胞死亡。
综上所述，Gag-CASP8-VLP可有效进入并杀死乳腺癌细胞。
三、VSV-G-假型化的Gag-CASP8-VLP对4T1小鼠乳腺癌模型中肿瘤的抑制作用
实验过程如下：将多个6周龄雌性BALB/c的小鼠平均分为三组，在第0天将4T1细胞接种到每个小鼠的右侧乳房脂肪垫中，使其于第7天形成大约70mm3的瘤体，分别于第10、13和16天将Gag-CASP8、Gag-VLPs或PBS注射到肿瘤块内，注射量为100ul 或100ng p24的100ul Gag-CASP8 、100ng p24的Gag-VLP 、100ul 的PBS，于第 22 处死小鼠，如图11所示。
为了研究CASP8在体内递送的效率，每组2只小鼠在首次注射VLP后12h处死，采用抗CASP8抗体对肿瘤切片进行免疫荧光分析，结果见图12。如图12所示，在Gag-CASP8- VLPs的肿瘤组织切片中检测到较强的CASP8信号，而在Gag-VLP和PBS处理的细胞中只有非常弱的CASP8信号，由此可见通过注射Gag-CASP8-VLP可以有效地将外源性CASP8递送到肿瘤细胞中。
定期测量小鼠乳腺肿瘤体积，并于第22天处死所有小鼠，将乳腺肿瘤切开并称重。如图13所示，与PBS注射对照组相比，于第10、13和16天注射Gag-CASP8-VLP能够明显抑制肿瘤生长。如图14和15所示，Gag-CASP8-VLP处理的肿瘤的体积和重量仅为PBS治疗的肿瘤的体积和重量的30%，Gag-VLP和PBS处理之间未检测到显着差异。在观察期间，在Gag-CASP8-VLP-或Gag-VLP-处理的小鼠中没有观察到体重减轻、步态变化等副作用。
以上实验结果显示，本发明的Gag-CASP8-VLPs有效诱导肿瘤细胞死亡并抑制小鼠模型中的肿瘤形成，本发明提供了新的抗肿瘤策略的可行性的证据，Gag-CASP8-VLPs对治疗肿瘤药物的研发具有广阔的应用前景。
四、Gag-CASP8-VLP的早期施用对小鼠肿瘤细胞的抑制作用
如图16所示，将多个6周龄雌性BALB/c的小鼠平均分为四组，在第0天将4T1细胞接种到每个小鼠的右侧乳房脂肪垫中，将其中一组在接种4T1细胞后的第0天、3天和第6天注射Gag-CASP8，命名为Gag-CASP8-a组，另外一组小鼠于第3，6和12天注射等量的Gag-CASP8，命名为Gag-CASP8-a组；另外两组小鼠为对照组，分别于第3，6和12天注射等量的Gag-VLP和PBS。在第30处死所有小鼠，进行肿瘤生长评估以及组织学和组织形态学检查，结果见图17~图19。
图17~图19显示，在4T1细胞接种当天施用 Gag-CASP8-VLP可将肿瘤的体积和重量降低至对照组（Gag-VLP和PBS）中的5%，而在Gag-CASP8-b组中，肿瘤大小仅减少至对照组的35%，由此可证，Gag-CASP8-VLPs越早应用，所达到的效果就越显著。
综上所述，本发明通过构建HIV Gag-CASP8融合蛋白质粒、再将pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G质粒共转染到细胞后合成携带活化CASP8蛋白的慢病毒样颗粒（Gag-CASP8-VLPs）；通过用VSV-G糖蛋白假型化，Gag-CASP8-VLP可以有效进入乳腺癌细胞中，释放活化的CASP8到癌细胞中并通过诱导细胞凋亡而杀死细胞。通过以上实验证明，在肿瘤组织中注射本发明所述的Gag-CASP8-VLP可以显着抑制肿瘤生长，并且越早施用Gag-CASP8-VLP，对肿瘤的抑制效率越高。
本发明Gag-CASP8-VLP的细胞进入取决于存在于VLP上的VSV-G糖蛋白，可通过进一步优化VLP上的膜蛋白而增加Gag-CASP8-VLP的靶向性。许多在肿瘤细胞上特异性的受体或过表达的受体都可以作为Gag-CASP8-VLPs的靶向受体，例如人表皮生长因子受体2。应用纳米技术可将能与这类受体结合的化学分子或蛋白部分包装到 VLP的表面，使肿瘤特异性靶向分子与VLP表面连接从而引导Gag-CASP8-VLP特异性地进入肿瘤细胞，以实现特异性抗癌活性。因此，本发明的病毒样颗粒Gag-CASP8-VLP可应用于各种类型的肿瘤治疗。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 遵义医学院珠海校区
<120> 一种包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒及其制备方法和应用
<130> 20180903
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 947
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Lys Trp
1 5 10 15
Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Gln Tyr Lys Leu Lys
20 25 30
His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro
35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gln Ile Leu Gly Gln Leu
50 55 60
Gln Pro Ser Leu Gln Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn
65 70 75 80
Thr Ile Ala Val Leu Tyr Cys Val His Gln Arg Ile Asp Val Lys Asp
85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Ser Lys
100 105 110
Lys Lys Ala Gln Gln Ala Ala Ala Asp Thr Gly Asn Asn Ser Gln Val
115 120 125
Ser Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His
130 135 140
Gln Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu
145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser
165 170 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly
180 185 190
Gly His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu
195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala
210 215 220
Pro Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Ser Thr Leu Gln Glu Gln Ile Gly Trp Met Thr His Asn Pro Pro Ile
245 250 255
Pro Val Gly Glu Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys
260 265 270
Ile Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly
275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu
290 295 300
Arg Ala Glu Gln Ala Ser Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr
305 310 315 320
Leu Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly
340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser
355 360 365
Gln Val Thr Asn Pro Ala Thr Ile Met Ile Gln Lys Gly Asn Phe Arg
370 375 380
Asn Gln Arg Lys Thr Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His
385 390 395 400
Ile Ala Lys Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys
405 410 415
Gly Lys Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn
420 425 430
Phe Leu Gly Lys Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe
435 440 445
Leu Gln Ser Met Asp Phe Ser Arg Asn Leu Tyr Asp Ile Gly Glu Gln
450 455 460
Leu Asp Ser Glu Asp Leu Ala Ser Leu Lys Phe Leu Ser Leu Asp Tyr
465 470 475 480
Ile Pro Gln Arg Lys Gln Glu Pro Ile Lys Asp Ala Leu Met Leu Phe
485 490 495
Gln Arg Leu Gln Glu Lys Arg Met Leu Glu Glu Ser Asn Leu Ser Phe
500 505 510
Leu Lys Glu Leu Leu Phe Arg Ile Asn Arg Leu Asp Leu Leu Ile Thr
515 520 525
Tyr Leu Asn Thr Arg Lys Glu Glu Met Glu Arg Glu Leu Gln Thr Pro
530 535 540
Gly Arg Ala Gln Ile Ser Ala Tyr Arg Phe His Phe Cys Arg Met Ser
545 550 555 560
Trp Ala Glu Ala Asn Ser Gln Cys Gln Thr Gln Ser Val Pro Phe Trp
565 570 575
Arg Arg Val Asp His Leu Leu Ile Arg Val Met Leu Tyr Gln Ile Ser
580 585 590
Glu Glu Val Ser Arg Ser Glu Leu Arg Ser Phe Lys Phe Leu Leu Gln
595 600 605
Glu Glu Ile Ser Lys Cys Lys Leu Asp Asp Asp Met Asn Leu Leu Asp
610 615 620
Ile Phe Ile Glu Met Glu Lys Arg Val Ile Leu Gly Glu Gly Lys Leu
625 630 635 640
Asp Ile Leu Lys Arg Val Cys Ala Gln Ile Asn Lys Ser Leu Leu Lys
645 650 655
Ile Ile Asn Asp Tyr Glu Glu Phe Ser Lys Gly Glu Glu Leu Cys Gly
660 665 670
Val Met Thr Ile Ser Asp Ser Pro Arg Glu Gln Asp Ser Glu Ser Gln
675 680 685
Thr Leu Asp Lys Val Tyr Gln Met Lys Ser Lys Pro Arg Gly Tyr Cys
690 695 700
Leu Ile Ile Asn Asn His Asn Phe Ala Lys Ala Arg Glu Lys Val Pro
705 710 715 720
Lys Leu His Ser Ile Arg Asp Arg Asn Gly Thr His Leu Asp Ala Gly
725 730 735
Ala Leu Thr Thr Thr Phe Glu Glu Leu His Phe Glu Ile Lys Pro His
740 745 750
Asp Asp Cys Thr Val Glu Gln Ile Tyr Glu Ile Leu Lys Ile Tyr Gln
755 760 765
Leu Met Asp His Ser Asn Met Asp Cys Phe Ile Cys Cys Ile Leu Ser
770 775 780
His Gly Asp Lys Gly Ile Ile Tyr Gly Thr Asp Gly Gln Glu Ala Pro
785 790 795 800
Ile Tyr Glu Leu Thr Ser Gln Phe Thr Gly Leu Lys Cys Pro Ser Leu
805 810 815
Ala Gly Lys Pro Lys Val Phe Phe Ile Gln Ala Cys Gln Gly Asp Asn
820 825 830
Tyr Gln Lys Gly Ile Pro Val Glu Thr Asp Ser Glu Glu Gln Pro Tyr
835 840 845
Leu Glu Met Asp Leu Ser Ser Pro Gln Thr Arg Tyr Ile Pro Asp Glu
850 855 860
Ala Asp Phe Leu Leu Gly Met Ala Thr Val Asn Asn Cys Val Ser Tyr
865 870 875 880
Arg Asn Pro Ala Glu Gly Thr Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Cys Gln Ser
885 890 895
Leu Arg Glu Arg Cys Pro Arg Gly Asp Asp Ile Leu Thr Ile Leu Thr
900 905 910
Glu Val Asn Tyr Glu Val Ser Asn Lys Asp Asp Lys Lys Asn Met Gly
915 920 925
Lys Gln Met Pro Gln Pro Thr Phe Thr Leu Arg Lys Lys Leu Val Phe
930 935 940
Pro Ser Asp
945
<210> 2
<211> 2843
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atgggtgcga gagcgtcggt attaagcggg ggagaattag ataaatggga aaaaattcgg 60
ttaaggccag ggggaaagaa acaatataaa ctaaaacata tagtatgggc aagcagggag 120
ctagaacgat tcgcagttaa tcctggcctt ttagagacat cagaaggctg tagacaaata 180
ctgggacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttagatc attatataat 240
acaatagcag tcctctattg tgtgcatcaa aggatagatg taaaagacac caaggaagcc 300
ttagataaga tagaggaaga gcaaaacaaa agtaagaaaa aggcacagca agcagcagct 360
gacacaggaa acaacagcca ggtcagccaa aattacccta tagtgcagaa cctccagggg 420
caaatggtac atcaggccat atcacctaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480
gagaaggctt tcagcccaga agtaataccc atgttttcag cattatcaga aggagccacc 540
ccacaagatt taaataccat gctaaacaca gtggggggac atcaagcagc catgcaaatg 600
ttaaaagaga ccatcaatga ggaagctgca gaatgggata gattgcatcc agtgcatgca 660
gggcctattg caccaggcca gatgagagaa ccaaggggaa gtgacatagc aggaactact 720
agtacccttc aggaacaaat aggatggatg acacataatc cacctatccc agtaggagaa 780
atctataaaa gatggataat cctgggatta aataaaatag taagaatgta tagccctacc 840
agcattctgg acataagaca aggaccaaag gaacccttta gagactatgt agaccgattc 900
tataaaactc taagagccga gcaagcttca caagaggtaa aaaattggat gacagaaacc 960
ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagactattt taaaagcact gggaccagga 1020
gcgacactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtgg ggggacccgg ccataaagca 1080
agagttttgg ctgaagcaat gagccaagta acaaatccag ctaccataat gatacagaaa 1140
ggcaatttta ggaaccaaag aaagactgtt aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200
atagccaaaa attgcagggc ccctaggaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aaaggaagga 1260
caccaaatga aagattgtac tgagagacag gctaattttt tagggaagat ctggccttcc 1320
cacaagggaa ggccagggaa ttttcttcag agcagaatgg acttcagcag aaatctttat 1380
gatattgggg aacaactgga cagtgaagat ctggcctccc tcaagttcct gagcctggac 1440
tacattccgc aaaggaagca agaacccatc aaggatgcct tgatgttatt ccagagactc 1500
caggaaaaga gaatgttgga ggaaagcaat ctgtccttcc tgaaggagct gctcttccga 1560
attaatagac tggatttgct gattacctac ctaaacacta gaaaggagga gatggaaagg 1620
gaacttcaga caccaggcag ggctcaaatt tctgcctaca ggttccactt ctgccgcatg 1680
agctgggctg aagcaaacag ccagtgccag acacagtctg tacctttctg gcggagggtc 1740
gatcatctat taataagggt catgctctat cagatttcag aagaagtgag cagatcagaa 1800
ttgaggtctt ttaagtttct tttgcaagag gaaatctcca aatgcaaact ggatgatgac 1860
atgaacctgc tggatatttt catagagatg gagaagaggg tcatcctggg agaaggaaag 1920
ttggacatcc tgaaaagagt ctgtgcccaa atcaacaaga gcctgctgaa gataatcaac 1980
gactatgaag aattcagcaa aggggaggag ttgtgtgggg taatgacaat ctcggactct 2040
ccaagagaac aggatagtga atcacagact ttggacaaag tttaccaaat gaaaagcaaa 2100
cctcggggat actgtctgat catcaacaat cacaattttg caaaagcacg ggagaaagtg 2160
cccaaacttc acagcattag ggacaggaat ggaacacact tggatgcagg ggctttgacc 2220
acgacctttg aagagcttca ttttgagatc aagccccacg atgactgcac agtagagcaa 2280
atctatgaga ttttgaaaat ctaccaactc atggaccaca gtaacatgga ctgcttcatc 2340
tgctgtatcc tctcccatgg agacaagggc atcatctatg gcactgatgg acaggaggcc 2400
cccatctatg agctgacatc tcagttcact ggtttgaagt gcccttccct tgctggaaaa 2460
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gagactgatt cagaggagca accctattta gaaatggatt tatcatcacc tcaaacgaga 2580
tatatcccgg atgaggctga ctttctgctg gggatggcca ctgtgaataa ctgtgtttcc 2640
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cgatgtcctc gaggcgatga tattctcacc atcctgactg aagtgaacta tgaagtaagc 2760
aacaaggatg acaagaaaaa catggggaaa cagatgcctc agcctacttt cacactaaga 2820
aaaaaacttg tcttcccttc tga 2843

Claims (7)

1.一种用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒由pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G质粒共转染到细胞后包装释放、纯化浓缩获得；所述pSVCMV-Gag-CASP8质粒是由全长CASP8蛋白融合到HIV-1 Pr55的C-末端构建而成；所述病毒样颗粒的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒的碱基序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述病毒样颗粒由pSVCMV-Gag-CASP8质粒、包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G质粒共转染到细胞后包装释放、纯化浓缩获得；其中，所述pSVCMV-Gag-CASP8质粒是由全长CASP8蛋白融合到HIV-1 Pr55的C-末端构建而成。
4.根据权利要求3所述的用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：质粒构建：
将全长CASP8蛋白接入融合到HIV-1 Pr55的C-末端，构建pSVCMV-Gag-CASP8融合蛋白质粒，并在HIV-1 Pr55 Gag与CASP8之间插入HIV-1蛋白酶切割位点RPGNF/LQS；
步骤二：包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备：
将步骤一得到的pSVCMV-Gag-CASP8 质粒，以及包装质粒pCMV-Δ8.2和VSV-G质粒共转染到293T细胞或HEK293细胞，于培养基培养5 h后加入caspase 8 抑制剂Z-VAD-FMK，转染48h后取含有病毒样颗粒的培养上清，离心纯化后重悬，低温保存。
5.根据权利要求4所述的用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤一具体如下：
1) 用二次PCR方法: 扩增HIVGag和CASP8基因序列并连接成一个融合基因序列，同时在融合基因序列的两端插入酶切位点ApaI/xba I;
2）利用ApaI/xba I 酶切位点将Gag-CASP8融合基因序列放入pCMV真核细胞表达质粒。
6.根据权利要求4所述的用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤二具体如下：
1) 铺盘：2×106 293T细胞或HEK293细胞铺到10×10 cm2培养皿；
2) 转染：24h后将4μg的pSVCMV-Gag-CASP8质粒，4μg的包装质粒pCMV-Δ8.2及2μg的VSV-G质粒共转染到 293T或HEK293细胞；
3) 转染293T或HEK293细胞5h后加入20μM 的caspase 8 抑制剂Z-VAD-FMK；
4) 转染48h后收集上清，在4°C下以3000r/min的转速离心15min，去除细胞碎片；
5) 取上清，在4°C 下以35000r/min的转速超速离心2h；
6) 被离心下来的病毒样颗粒重悬于少量培养液或磷酸盐缓冲盐水，分装保存于-80°C下；
7) HIV p24 ELISA 检测病毒样颗粒浓度。
7.如权利要求1所述的用于抑制乳腺癌细胞的包含CASP8凋亡蛋白的病毒样颗粒在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
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病毒样颗粒的常用表达系统和应用进展;郭慧敏等;《中国动物传染病学报》;20170430;第25卷(第4期);第82-86页 *

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