CN103952443A - 以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗。本发明是先将hTERT复合基因eTERTFcGB插入pShuttle-CMV穿梭载体中CMV启动子的下游，得到携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体AdEasy-1/F11p共转化细菌后得到的重组腺病毒载体。该重组腺病毒载体能够抑制移植瘤的生长，可应用于恶性肿瘤生物免疫治疗的免疫增效。

Description

以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种腺病毒疫苗，特别是涉及一种以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗。

背景技术

转移和复发是临床上大多数恶性肿瘤患者死亡的主要因素。研究表明，90％以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。而传统治疗方案，无论是手术治疗还是放射治疗和化学治疗，都难以保证将晚期或转移的恶性肿瘤细胞彻底消灭。肿瘤的免疫治疗是当前国际上研究的热点领域，随着对抗肿瘤免疫机制和恶性肿瘤生物学特性的深入研究，特别是多种肿瘤相关抗原的发现，针对恶性肿瘤生物治疗的动物试验及临床试验研究在近年广泛开展起来。肿瘤免疫治疗能够激活机体免疫系统，重建正常的免疫预警功能，具有特异性强，毒副作用低，相对安全，可产生免疫记忆等优点，对于肿瘤的治疗及防止肿瘤复发、转移意义重大。

hTERT是肿瘤生物治疗的理想靶抗原

人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是端粒酶复合物的核心成分，其表达状态是细胞调控端粒酶活性的重要环节。hTERT是最早发现，也是目前研究较多的广谱肿瘤相关抗原(TAA)。现已证实在85％以上的人类恶性肿瘤细胞中均存在hTERT的再激活，并且在肿瘤的发生发展过程中发挥关键作用。另外有证据表明在肿瘤干细胞中hTERT的活性增加，其持续表达被认为是肿瘤干细胞保持永久自我更新能力的关键因素之一。hTERT的广泛而持续地表达使其成为肿瘤治疗的理想靶点。

近十年来的诸多实验中，研究人员以hTERT为靶点对前列腺癌、肺癌、骨髓瘤、黑色素瘤等恶性肿瘤进行抗肿瘤免疫治疗。结果证实，在各组实验中都可以检测到hTERT特异性的CTL反应有效地杀伤恶性肿瘤细胞，另外，尽管在造血干细胞、活化的淋巴细胞、生殖细胞以及某些上皮细胞中有少量的hTERT表达，但大量的动物实验及临床试验均未发现特异性CTL细胞对这些组织的损害。

Ad5Fllp新型腺病毒载体具有DC靶向性

腺病毒载体具有感染效率高、高表达目的基因、能感染增殖及静止两类细胞、不与宿主细胞基因组DNA整合等特点。然而，多数商品化的腺病毒载体都来自于5型或2型腺病毒(Ad5和Ad2)，这些病毒载体对血液来源细胞(包括DCs)的感染效率低下。

军事医学科学院鲁茁壮等人以AdEasy系统为基础，用人工合成人B组llP型腺病毒的部分fiber基因，替换AdEasy骨架质粒中的人5型腺病毒的fiber基因，得到新的腺病毒骨架质粒命名AdEasy-1/F11p。结果显示这种改建后的重组腺病毒能更好地靶向结合血液来源细胞，其转染血液来源细胞的能力明显提高，显示出很好的应用前景(Zhuo-Zhuang Lu,Fang Ni,Ze-Bin Hu,Lan Wang,Hua Wang,Qun-Wei Zhang,et al.Efficient gene transfer into hematopoietic cells by aretargeting adenoviral vector system with a chimeric fiber of adenovirusserotype5and11p.[J].Experimental Hematology34(2006)1170–1181.)。

发明内容

为在广谱性抗肿瘤的同时提高抗肿瘤特异性，打破肿瘤免疫耐受技术难题和实现免疫增效，本发明提供了一种以hTERT为靶点构建的可同时表达抗原片段和多种免疫刺激分子和免疫佐剂的肿瘤治疗性腺病毒疫苗。

本发明所提供的肿瘤治疗性腺病毒疫苗，是先将hTERT复合基因sig-eTERT-IgGFc-GPI-IRES-GM/CSF-B7.1(简称eTERTFcGB)插入pShuttle-CMV穿梭载体中巨细胞病毒(CMV)启动子的下游，得到携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组穿梭载体命名为pShuttle-CMV-eTERTFcGB，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体AdEasy-1/F11p共转化BJ5183细菌后得到的携带有hTERT复合基因eTERTFcGB的重组腺病毒载体，命名为AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB。

在所述重组穿梭载体中，所述hTERT复合基因eTERTFcGB由人Igк链前导信号肽(sig)序列(GenBank号：KF688150)、eTERTFc融合抗原基因、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成。其中：eTERTFc融合抗原基因由人Igк链前导信号肽(sig)序列(GenBank号：KF688150)、人hTERT基因1609-2628位碱基的基因片段(GenBank号：NM_198253)、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定肽基因(GenBank号：XM676434)组成，eTERTFc融合抗原基因核苷酸序列如序列表中序列1所示，其中，自5’端第1-69位碱基为人Igк链前导信号肽(sig)序列基因片段，自5’端第70-1089位碱基为人hTERT基因1609-2628位碱基的基因片段，自5’端第1096-2362位碱基为人IgG Fc段基因(第1090-1095位碱基为EcoRⅠ限制性内切酶位点)，自5’端第2363-2473(此处修改)位碱基为糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定肽基因。eTERTFc融合抗原基因与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连得到hTERT复合基因eTERTFcGB，所述hTERT复合基因eTERTFcGB的核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中，自5’端第1-2473位碱基同序列1，自5’端第2474-2503位碱基为多个限制性内切酶串联序列，其中包括XbaI、NotI、PvuI、PsiI，自5’端第2504-3132位碱基为IRES序列，自5’端第3133-3564位碱基为GM/CSF基因，自5’端第3565-3588位碱基为大小为24bp的linker，自5’端第3589-4377位碱基为B7.1基因。

所述重组穿梭载体pShuttle-CMV-eTERTFcGB的核苷酸序列如序列表中序列3所示。

所述重组腺病毒载体AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种共表达eTERTFc融合抗原、GM/CSF及B7.1的重组腺病毒。

本发明所提供的共表达eTERTFc融合抗原、GM/CSF及B7.1的重组腺病毒，是将上述携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组腺病毒载体AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB转染包装细胞—人胚肾293细胞(HEK293)得到的。

重组腺病毒载体AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB可通过脂质体介导法转染人胚肾293细胞。

具体来讲，转染重组腺病毒载体AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB得到的的重组腺病毒命名为Ad5F11p-eTERTFcGB。

基于hTERT在超过85％的恶性肿瘤中广泛表达，是目前研究最多的广谱肿瘤相关抗原。本发明将hTERT的主要HLA-A2类T细胞抗原表位集中区域eTERT(1609bp-2628bp，538aa-875aa)与人IgG Fc段融合，并通过GPI锚定于细胞表面，同时在IRES序列的下游共表达人GM-CSF和B7.1共刺激分子，构建了上游可以表达eTERT抗原和人IgG Fc段、下游表达GM-CSF和B7.1的hTERT复合基因eTERTFcGB。通过与人IgG Fc段融合，增进抗原的内源化递呈；GM-CSF和B7.1有助于诱导DC活化和免疫共刺激，eTERTFcGB中加入人IgG Fc段、GM-CSF和B7.1等免疫增效元件，可以有效打破机体免疫耐受，发挥协同抗肿瘤作用。前期预实验证实该复合抗原能够有效打破肿瘤免疫耐受，激发有效的体液免疫和细胞免疫应答。本发明还将eTERTFcGB转换到AdEasy-1/F11p改良腺病毒载体中，经严格的质量控制获得体内试验级别的Ad5F11p-eTERTFcGB重组腺病毒产品。通过C57BL/6小鼠皮下荷瘤模型和肺部肿瘤转移模型治疗实验及体外杀伤实验对Ad5F11p-eTERTFcGB重组腺病毒抑瘤效果进行评价，结果所构建的新型抗肿瘤腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB与其它对照组相比在小鼠体内可以诱导产生更强的特异性细胞免疫反应和体液免疫反应，能够抑制移植瘤的生长，为恶性肿瘤生物免疫治疗的免疫增效的研究提供了一些有益的借鉴。本发明是一种能够有效防治肿瘤术后复发和转移的新型抗肿瘤生物治疗剂，通过多种机制协同发挥作用，打破免疫耐受，在安全性、优效性方面具备很大竞争力，有望大幅降低肿瘤术后复发和转移，逐步将当前尚处于发展阶段的恶性肿瘤生物免疫治疗技术推进到广谱性、特异性、标准化、高效化新阶段，具有广阔的临床应用前景和市场前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为pVAX1-eTERTFcGB质粒Nhe I、Pme I双酶切产物(eTERTFcGB复合基因片段)的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为经补平、纯化的eTERTFcGB复合基因片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图3为pShuttle-CMV环状质粒经限制性平端内切酶EcoR V酶切后成线性化质粒的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图4为重组穿梭载体pShuttle-CMV-eTERTFcGB的菌落PCR鉴定结果

图5为重组穿梭载体pShuttle-CMV-eTERTFcGB的物理图谱

图6为重组腺病毒质粒AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图7为重组腺病毒质粒AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的物理图谱

图8为经Pac I酶切线性化后的重组腺病毒质粒AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图9为光镜下转染AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB后293细胞的形态变化

图10为转染AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的293细胞上eTERTFc融合抗原及B7.1的表达水平的流式细胞术检测结果

图11为转染AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的293细胞上eTERTFc融合抗原及B7.1的表达水平的荧光显微镜检测结果

图12A为表示转染AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的293细胞上清中GM/CSF浓度与OD值之间存在显著的线性关系的标准曲线

图12B为转染后不同天数收获的细胞上清中GM/CSF的浓度

图13为光镜下观察不同洗脱峰感染293细胞后的状态

图14为Q Sepharose XL纯化Ad5F11p-eTERTFcGB的洗脱记录图(腺病毒特异性洗脱峰出现在0.45M NaCl浓度的洗脱缓冲液，流速为1mL/min)

图15为Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒基因组DNA的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图16为融合抗原片段eTERTFcGB上游hTERT抗原序列扩增的PCR检测结果和复制完全型腺病毒(RCA)检测结果(不应检测到野生型腺病毒特征基因E1区)

图17为经纯化的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒纯度的SDS-PAGE检测结果(分离胶(10％)，浓缩胶(5％))

图18为PCR扩增的hTERT1609-2628位碱基的基因的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图19为pMD-18T-hTERT的Mfe I、BglⅡ双酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图20为pET42a的Mfe I、BglⅡ双酶切产物的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图21为pET42a-hTERT重组表达质粒的PCR鉴定结果

图22A为GST-hTERT融合蛋白诱导中IPTG浓度的确定

图22B为GST-hTERT融合蛋白诱导中最适诱导温度的确定

图22C为GST-hTERT融合蛋白诱导中最适诱导时间的确定

图23为诱导表达的GST-hTERT融合蛋白及纯化产物的SDS-PAGE检测结果(浓缩胶(5％)，分离胶(10％))

图24为诱导表达及纯化的GST-hTERT融合蛋白的Weatern blot鉴定结果

图25为OD_450nm随抗体浓度变化的曲线

图26为pIRES-hyg3载体的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果

图27为重组真核表达质粒pIRES-hyg3-Luc的物理图谱

图28为重组真核表达质粒pIRES-neo-hTERT的物理图谱

图29为B16-hTERT/Luc单单克隆细胞株hTERT/Luc蛋白表达水平的Western Blot检测结果

图30为B16-hTERT/Luc单克隆细胞株中hTERT/Luc蛋白表达水平的流式细胞术检测结果

图31为B16-hTERT/Luc单克隆细胞株hTERT/Luc蛋白表达情况的共聚焦激光显微镜检测结果(40×)

图32为C57BL/6小鼠尾静脉注射B16-hTERT/Luc细胞(1×10⁶/只)后，应用小动物活体成像检测仪观察荧光素酶报告基因标记的肿瘤在体内的生长情况

图33为免疫方案

图34为各组免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤时间

图35为各组小鼠皮下肿瘤生长曲线

图36为皮下接种肿瘤30天后肿瘤体积统计结果

图37为末次免疫后两周各组小鼠肺部肿瘤生长情况

图38为末次免疫后两周各组肺部肿瘤结节数统计结果

图39为皮下移植瘤攻击后各组小鼠的存活时间

图40为各组免疫小鼠血清中hTERT抗原特异性抗体OD450nm值

图41为末次免疫后2周组免疫小鼠血清中IL-2浓度

图42为末次免疫后2周组免疫小鼠血清中IFN-γ浓度

图43A为特异分泌IFN-γ脾细胞的ELISPOT法检测结果

图43B为特异分泌IFN-γ脾细胞的ELISPOT斑点计数结果(个/10⁶)

图44为乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠脾细胞的CTL杀伤活性的各实验孔的设计

图45为脾细胞CTL杀伤活性LDH法测定结果

图46为CD4+T与CD8+T细胞比例的流式细胞仪检测结果

图47为NK细胞比例的流式细胞仪检测结果

图48为肿瘤中浸润CD8+T淋巴细胞的免疫荧光检测结果

图49为肿瘤组织病理切片观察(HE染色)结果

图50为睾丸组织病理切片观察(HE染色)结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/体积(W/V)百分比浓度或体积/体积(V/V)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物均由英骏生物技术公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1、获得共表达eTERTFc融合抗原、GM/CSF及B7.1的重组腺病毒

一、构建肿瘤治疗性腺病毒载体Ad5F11p-eTERTFcGB

1、构建重组穿梭载体pShuttle-CMV-eTERTFcGB

在所述重组穿梭载体中，所述hTERT复合基因eTERTFcGB由eTERTFc融合抗原基因、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成；

所述eTERTFc融合抗原基因由人hTERT基因1609-2628位碱基的基因片段(GenBank号：NM_198253)、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定肽基因(GenBank号：XM676434)组成，eTERTFc融合抗原基因核苷酸序列如序列表中序列1所示。

所述eTERTFc融合抗原基因与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连，所述hTERT复合基因eTERTFcGB的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

1.1、构建携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组质粒pVAX1-eTERTFcGB

具体构建方法详见硕士论文：肖毅，hTERT广谱抗肿瘤基因疫苗实验研究，2010，硕士。

1.2、构建携带CMV启动子的重组载体pShuttle-CMV

pShuttle-CMV为STRATAGENE公司商品(Catalog#240007)。

1.3、pVAX1-eTERTFcGB、pShuttle-CMV质粒转化大肠杆菌E.coli DH5α

将pVAX1-eTERTFcGB、pShuttle-CMV质粒分别转化入大肠杆菌E.coli DH5α，具体操作步骤如下：

⑴从-80℃冰箱取2支E.coli DH5α感受态细胞，置于冰水浴中，然后分别将上述质粒各2μL用移液器加入，轻柔混匀；

⑵冰水浴30min，立即将感受态细胞转移到42℃水浴锅中热休克60s；

⑶热休克过程结束后，将感受态细胞重新放置在冰水浴中静置1-2min；

⑷吸取转化后的感受态分别均匀涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板培养基上，37℃培养箱中培养12小时；

⑸第二天，挑取单克隆菌落，分别接种于含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡培养12h。

1.4、pVAX1-eTERTFcGB、pShuttle-CMV质粒的小量提取

参照北京三博远志生物公司质粒小量提取试剂盒抽提pVAX1-eTERTFcGB、pShuttle-CMV质粒，具体操作步骤如下：

⑴收集培养12h的菌液1mL于EP管中，12000rpm室温下离心1min，尽量倒掉上清；

⑵在菌体沉淀中，加入250μL溶液Ⅰ，充分将使菌体悬浮混匀；

⑶加入250μL溶液Ⅱ，轻柔颠倒混匀；

⑷加入350μL溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀7-8次，放置室温下5分钟，12000rpm离心10min；

⑸把上清液转移到离心吸附柱，12000rpm离心1min；

⑹倒掉废液，在吸附柱中加入漂洗液W1500μL，12000rpm离心1min；

⑺倒掉废液，加入漂洗液W2700μL，12000rpm离心1min；

⑻重复步骤⑺后，12000rpm空离2min，以便尽量出去残留的漂洗液；

⑼将吸附柱移入一个干净的EP管中，在吸附柱中央加入50μL的灭菌水，静置5min后12000rpm离心1min，收集洗脱液，凝胶电泳分析后，-20℃保存。

1.5、获得eTERTFcGB片段

利用酶切、补平、纯化的方法从pVAX1-eTERTFcGB质粒中获得复合基因片段eTERTFcGB，具体操作方式如下：

⑴首先利用限制性内切酶Nhe I、Pme I双切pVAX1-eTERTFcGB质粒，37℃水浴4h，酶切体系见表1；

⑵酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1(M:DNA Marker(markerⅢ)；1：Nhe I、Pme I双酶切pVAX1-eTERTFcGB质粒)所示，经酶切获得了大小约4400bp的DNA片段，与预期结果相符，在紫外灯下将该约4400bp的目的基因片段小心切下，置入EP管中，加入600μL溶胶液，37℃水浴溶胶；

⑶完全溶解胶块后，将混合液全部移入离心吸附柱，12000rpm离心1min；

⑷重复步骤⑶后弃废液，12000rpm空离2min，以便尽量出去残留的漂洗液；

⑸将吸附柱移入一个干净的EP管中，在吸附柱中央加入50μL的灭菌水，静置5min后12000rpm离心1min，收集洗脱液；

⑹接下来用Klenow酶补平双切后的粘性末端，补平体系见表2；

⑺根据步骤⑹中补平产物的体积，按照1:3的比例加入片段纯化结合液BD；

⑻将混合液体转移至离心柱的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去废液；

⑼加入550μl漂洗液，12000rpm离心1min；

⑽重复步骤⑼后弃废液，12000rpm空离2min，以便尽量出去残留的漂洗液；

⑾将吸附柱移入一个干净的EP管中，在吸附柱中央加入50μL的灭菌水，静置5min后12000rpm离心1min，收集洗脱液，对经补平、纯化的目的基因片段进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2(M:DNA Marker(markerⅢ)；2：补平后回收的eTERTFcGB复合基因片段)所示，获得了大小约4400bp的DNA片段，与预期结果相符，表明获得了eTERTFcGB复合基因片段，-20℃保存。

表1pVAX1-eTERTFcGB Nhe I、Pme I双酶切体系

表2eTERTFcGB纯化片段的粘末端补平体系

1.6、eTERTFcGB复合基因片段与pShuttle-CMV载体的连接

将pShuttle-CMV载体用限制性平端内切酶EcoR V酶切后(酶切体系见表3)，环状质粒被单酶切成线性化，线性化质粒的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3(M:DNAMarker(markerⅢ)；1：EcoR V酶切pShuttle-CMV载体)所示，经酶切获得了大小约7500bp的DNA片段，与预期结果相符。按照步骤1.5中⑺-⑾所示方法回收该线性化的载体片段，即可得到平末端的pShuttle-CMV载体片段。接着，将载体片段与步骤1.5中得到的eTERTFcGB复合基因片段进行连接，连接体系见表4，16℃连接反应4h得到连接产物。

表3pShuttle-CMV EcoR V单酶切体系

表4eTERTFcGB复合基因片段与pShuttle-CMV载体的连接体系

1.7、连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α

用1.6得到的连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α得到含有pShuttle-CMV-eTERTFcGB的单克隆菌落。具体操作同步骤1.3。

1.8、重组穿梭质粒pShuttle-CMV-eTERTFcGB的菌落PCR鉴定

挑取10个步骤1.7后得到的单克隆菌落，转入5mL含50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基，置于37℃摇床中振荡培养12h。其中4h左右时吸取1μL菌液作为模板行菌落PCR鉴定，由于是平端连接，故可能存在片段与载体上下游颠倒连接的可能。为了确定正反向，挑选融合抗原片段eTERTFcGB下游与pShuttle-CMV载体相连接的一段序列扩增，如果是正向连接即可扩增出300bp大小的片段，若是反向连接，则不可能扩增出正确片段。鉴定引物如下：

上游：eTERTFcGB-F2：5’-GATCCTGAAACTGAGCTCTATGCTGTTAGC-3’；

下游：SHUTTLE-R：5’-GTGGTATGGCTGATTATGATCAG-3’。

PCR鉴定体系见表5，PCR扩增条件为：95℃预变性5min；循环参数(95℃变性40s，55℃退火40s、72℃延伸40s)，共20个循环；72℃继续延伸5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图4(M:DNAMarker(marker D2000)；1-8：菌落PCR鉴定结果)所示，选择鉴定结果呈阳性的菌液送北京三博远志生物公司进行基因测序进一步鉴定。

表5pShuttle-CMV-eTERTFcGB的菌落PCR鉴定体系

测序结果重组穿梭质粒的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中：994-5370碱基序列同序列2，第1-993及5371-11882位碱基为pShuttle-CMV载体序列。表明获得了插入序列和位置正确携带eTERTFcGB复合基因的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-eTERTFcGB，其物理图谱如图5所示。

2、构建重组腺病毒质粒AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB

2.1、重组穿梭质粒pShuttle-CMV-eTERTFcGB的单酶切和去磷酸化

将得到的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-eTERTFcGB用Pme I进行单酶切，37℃水浴4h。酶切后取5μL酶切产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照，检测结果表明获得了12000bp的单酶切产物，确定已经酶切完全后采用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)直接进行去磷酸化处理1h，然后进行1％琼脂糖凝胶电泳，回收并纯化12000bp的目的片段。

2.2、AdEasy-1/F11p与pShuttle-CMV-eTERTFcGB共转化

将基于AdEasy腺病毒系统改造获得的改良腺病毒载体AdEasy-1/F11p(构建方法参见文献：Lu ZZ,Ni F,Hu ZB,et al.Efficient gene transfer into hematopoieticcells by a retargeting adenoviral vector system with a chimeric fiber ofadenovirus serotype5and11p.[J].Exp Hematol.2006；34(9):1171-82)与步骤1线性化的穿梭质粒pShuttle-CMV-eTERTFcGB应用830方波电穿孔系统电转化BJ5183细菌(购自上海杰美基因医药科技有限公司)，在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒，命名为AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB。具体操作步骤如下：

⑴将电穿孔杯置于冰水浴中，加入10μL BJ5183感受态细胞。

⑵分别轻柔加入AdEasy-1/F11p1μg和线性化的pShuttle-CMV-eTERTFcGB5μg，轻柔混匀后,放置15min。

⑶按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，BTX仪器则为电压：1800V，脉冲时间：166us，脉冲次数：12次，脉冲间隔：500ms。

⑷迅速用1mL LB液体培养基重悬转化物，转入10mL离心管中，37℃振荡培养60分钟。

⑸将转化产物均匀涂布于含50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板培养基上，37℃培养箱中培养16h。

⑹挑出20个最好的单克隆菌落，转入5mL含有50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，置于37℃摇床中振荡培养12h。

⑺碱裂解法小量制备质粒(具体步骤参见步骤1、1.4)，取5μL进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，验证重组质粒的大小(鉴定正确的质粒大小约为38000kb左右)。

⑻将步骤⑺中初步鉴定正确大小质粒，进行Pac I单酶切，37℃水浴1h，具体体系见表6，酶切后取5μL酶切产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，以未酶切的质粒作为对照，结果经Pac I单酶切可获得33000bp左右的病毒基因组片段和4500bp的DNA片段，与预期结果相符。

表6AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB Pac I单酶切体系

2.3大量提取与纯化AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB重组质粒

参照天根生化科技(北京)有限公司“无内毒素质粒大提试剂盒”说明书大量取鉴定正确的Ad5F11p-eTERTFcGB重组质粒，具体操作方法如下：

⑴将Ad5F11p-eTERTFcGB重组质粒分别转化入E.coli DH5α感受态，50μg/mL卡那霉素抗性的LB固体平板培养基上培养，挑取单克隆菌体移入50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中振荡培养约12h；

⑵取300mL过夜培养的菌液加入500mL离心瓶，8000rpm离心3min收集细菌，尽量去除培养基上清；

⑶向离心瓶中的菌体沉淀的加入15mL P1溶液(预先加入RnaseA)，使用10mL移液器吹打，彻底悬浮细菌沉淀；

⑷向离心瓶中加入15mL溶液P2，温和的上下翻转10次，室温放置5min；

⑸向离心瓶中加入15mL溶液P4，温和的上下翻转10次，此时应出现白色絮状沉淀，放置于室温下10min，8000rpm离心20min，将上清倒入过滤器CS中，推动推柄过滤，将滤液收集在2个干净的50mL离心管中；

⑹柱平衡步骤：向吸附柱CP5中加入3mL平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CP5重新放回收集管中；

⑺向滤液中加入0.3倍体积异丙醇，混匀后转移到活化好的吸附柱CP5中；

⑻室温8000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CP5重新放回收集管中；

⑼向吸附柱CP5中加入10mL漂洗液PW，8000rpm离心2min，弃去废液，重复该步骤1次；

⑽向吸附柱CP5中加入5mL无水乙醇，室温8000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CP5重新放回收集管，室温8000rpm离心5min，去除吸附柱中残留的漂洗液；

⑾将吸附柱CP5置于另一个干净的50mL离心管中，向吸附膜的中间部位滴加1mL预热的灭菌蒸馏水，室温放置15min，8000rpm离心5min，将洗脱液移入干净的2mL离心管，-20℃保存备用；

⑿收获的Ad5F11p-eTERTFcGB重组质粒进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图6(M:DNA Marker(marker D15000)；1-6：1-6号菌液提取质粒结果)所示，结果1号质粒获得了大于40000bp的DNA，与预期结果相符，再对1-6号菌提取的质粒进行Pac I酶切鉴定，结果1号菌提取的质粒经Pac I单酶切可获得33000bp左右的病毒基因组片段和4500bpDNA片段，与预期结果相符。将1号菌质粒送英骏生物技术公司进行测序鉴定，测序结果重组腺病毒质粒的核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中，自5’端第1-7917位碱基同序列3中第1-7917位碱基，自5’端第33671-37616位碱基序列同序列3中第7937-11882位碱基，第7918-33670位碱基为AdEasy-1/F11p载体序列。表明获得了插入序列及位置均正确携带eTERTFcGB复合基因片段的重组腺病毒质粒，命名为AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB，其物理图谱如图7所示。

二、制备Ad5F11p-eTERTFcGB重组腺病毒颗粒

1、AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB质粒线性化

将步骤一中获得的Ad5F11p-eTERTFcGB质粒经Pac I酶切，酶切结果如图8(M：DNA Marker(1KB)；1：AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB；2：Pac I酶切AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB)所示，经Pac I单酶切可获得33000bp的病毒基因组片段和4500bpDNA片段，与预期结果相符。AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB充分线性化后，利用乙醇沉淀法回收DNA，紫外分光光度计法测定DNA含量和纯度，具体操作步骤如下：

⑴将Pac I酶切体系混合为1管，加入1/10体积的3M醋酸钠溶液；

⑵加入2倍体积的无水乙醇，上下轻柔颠倒混匀后，置入-20℃冰箱放置2h；

⑶取出后12000rpm离心15min，小心去除液体，可见白色DNA沉淀沉于管底；

⑷向管中加入500μL70％乙醇，洗涤沉淀2次；

⑸将沉淀晾干后，加入50μL预热的灭菌蒸馏水，置入50℃水浴中1h,溶解DNA沉淀；

⑹紫外分光光度计法测定DNA浓度，结果DNA含量为1μg/μL，按4μg/管分装，-80℃冰箱保存待用。

2、制备Ad5F11p-eTERTFcGB原代腺病毒

⑴收集对数生长期的293细胞，以5×10⁵细胞/孔接种于六孔培养板，5％CO₂、饱和湿度、37℃条件下培养24h；

⑵转染时，首先制备转染复合物：A液：用240μL的Opti-MEM稀释4μg线性化质粒AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB；B液：用240μL的Opti-MEM稀释10μL的Lipofectamine^TM2000，室温下孵育5min；

⑶将B液轻轻滴加入A液，轻柔混匀，室温下孵育30min后，转染复合物轻柔加入到293细胞中，轻轻摇动混匀，放入5％CO₂、饱和湿度、37℃条件下培养；

⑷转染6h后，更换含有10％新生牛血清的MEM/EBSS培养基继续培养；

⑸于5％CO₂、饱和湿度、37℃条件下继续培养14天左右，期间每2-3天半量更换培养液；

⑹光镜下观察转染AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB后293细胞形态变化如图9所示，AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB质粒转染293细胞后，7天左右可见局部细胞发生变圆、透亮、呈泡状，继续换液培养可见细胞脱落形成一空斑，空斑边缘细胞呈不规则收缩，而空斑以外区域细胞生长良好。到14天左右时，六孔板中的大部分细胞变圆、透亮、漂浮在培养基中，即大量出现明显细胞病变(cytopathic effect，CPE)时，轻轻吹打细胞，将细胞和培养上清收集于10mL离心管中，-80℃和37℃之间反复冻融三次，8000rpm离心20min去除细胞碎片和杂质，将上清分装到Ep管中，得到的原代腺病毒上清冻存在-80℃冰箱备用，将该腺病毒命名为Ad5F11p-eTERTFcGB。

三、Ad5F11p-eTERTFcGB真核表达能力检测

1、流式细胞仪及荧光显微镜检测eTERTFc融合抗原和B7.1表达水平

将步骤二构建的以hTERT为靶点的新型肿瘤治疗性疫苗—Ad5F11p-eTERTFcGB，其中的hTERT复合基因eTERTFcGB中，eTERTFc融合抗原及IRES序列下游的B7.1都在细胞膜上表达，应用流式细胞术，使用PE标记的山羊抗人IgG Fc、FITC标记的兔抗人B7.1抗体可以检测eTERTFc融合抗原和B7.1在真核细胞水平的表达情况，具体操作步骤如下：

⑴收集转染14天后细胞，用5mL4℃预冷PBS重悬洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，去上清；

⑵分别加入由PBS按1:200稀释的PE标记的山羊抗人IgG Fc抗体(购自eBioscience)和FITC标记兔抗人B7.1抗体(购自eBioscience)100μL，混匀，避光冰浴30min；

⑶4℃预冷PBS500μL洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，去上清；

⑷加入1％多聚甲醛500μL固定后，进行流式细胞术检测。

流式细胞术检测eTERTFc融合抗原及B7.1的表达水平的检测结果如图10(A：PE标记抗人IgG Fc；B：FITC标记抗人B7.1)所示，荧光显微镜检测eTERTFc融合抗原及B7.1的表达(40×)的表达水平的检测结果如图11(A：PE标记抗人IgG Fc；B：FITC标记抗人B7.1)，应用流式细胞仪和荧光显微镜检测发现，在Ad5F11p-eTERTFcGB原代腺病毒感染的293细胞中，hTERT复合基因中eTERTFc融合抗原及IRES序列下游的B7.1都能细胞膜上很好地表达，其表达效率分别达到了25.4％和30.7％。

2、ELISA法检测培养上清中GM/CSF的表达水平

将步骤二构建的以hTERT为靶点的新型肿瘤治疗性疫苗—Ad5F11p-eTERTFcGB，其中的hTERT复合基因eTERTFcGB中，GM/CSF会以分泌的形式分散到细胞培养上清中，用达科为公司的人GM/CSF ELISA检测试剂盒检测培养上清中GM/CSF的表达水平，具体操作步骤如下：

⑴分别留取步骤二中转染后1、5、9、13天的细胞培养上清各200μL，-20℃冰箱保存待检测；

⑵100μL/孔加入稀释后的Cytokine standard至标准品孔，100μl/孔加入样品至样品孔，100μL/孔加Dilution buffer R入空白对照孔，盖上封板膜，室温孵育2h；

⑶扣去孔内液体，300μL/孔加入washing buffer，停留1min后弃去孔内液体，重复4次，每一次在滤纸上扣干；

⑷50μL/孔加入稀释后的Biotinylated antibody，混匀后盖上封板膜，室温孵育1h；

⑸扣去孔内液体，300μL/孔加入washing buffer，停留1min后弃去孔内液体，重复4次，每一次在滤纸上扣干；

⑹100μL/孔加入Streptavidin-HRP，盖上封板膜，室温孵育30min；

⑺扣去孔内液体，300μL/孔加入washing buffer，停留1min后弃去孔内液体，重复4次，每一次在滤纸上扣干；

⑻100μL/孔加入TMB，室温避光温育30min，100μL/孔加入Stop solution终止反应；

⑼终止后10分钟内，用检测波长450nm读值。

根据检测结果绘制标准曲线(如图12中的图A所示)，得到曲线方程：y＝0.004x+0.059(R²＝0.996)，R²>0.9，说明GM/CSF浓度与OD值之间存在显著的线性关系，计算转染后不同天数收获的细胞上清中GM/CSF的浓度(如图12中的图B所示)，结果证实Ad5F11p-eTERTFcGB原代腺病毒感染293细胞后，GM/CSF能够以分泌的形式表达于细胞培养上清中。

实施例2、以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗的扩增纯化及滴度测定

近年来，重组腺病毒载体越来越多地用于基因治疗领域，为了满足临床前动物试验和临床人体试验的需要，必须通过有效的并且可以灵活放大的工艺来生产和纯化大量的重组腺病毒产品。传统方法是氯化艳密度梯度超速离心法，可生产小量临床级腺病毒产品，但随着基因治疗时代的到来，需要大量的腺病毒产品。GE公司基于离子交换介质的开发的“Q Sepharose XL virus licensed”，能够提供快速，可按比例放大的腺病毒进行纯化的方法。本实施例的目的是对重组腺病毒的扩增和纯化工艺进行实验研究，为将来建立腺病毒生产工艺提供实验依据。

本部分实验主要包括以下几个方面：首先利用293细胞逐级扩增前期获得的以hTERT为靶点的新型肿瘤治疗性疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB原代腺病毒；接着，利用GE公司基于离子交换介质的开发的“Q Sepharose XL virus licensed”腺病毒纯化介质，纯化获得可用于动物实验水平的重组腺病毒产品，并对重组腺病毒的纯度、活性、安全性等进行检测，为下一步以hTERT为靶点的新型肿瘤治疗性疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB的抑瘤活性的评价奠定基础。具体实验方案及实验结果如下：

一、Ad5F11p-eTERTFcGB原代腺病毒的逐级扩增

实施例1收获的Ad5F11p-eTERTFcGB原代重组腺病毒可以直接感染293细胞，并在293细胞中继续完成病毒的包装与扩增，这样，我们通过腺病毒在293细胞中的逐级扩增，可收获大量的腺病毒粗产品，具体操作方法如下：

⑴Ad5F11p-eTERTFcGB原代腺病毒直接感染六孔板中的293细胞，48h后可见明显细胞病变反应，收获第一代腺病毒；

⑵逐级扩大感染293细胞到第4代腺病毒；

⑶大量扩增：将HEK293细胞接种于175cm²细胞培养瓶中，待细胞生长至密度约80％-90％状态时，加入适量病毒液，5％CO₂、饱和湿度、37℃条件下培养；48h后当细胞出现完全CPE时，收集细胞；

⑷将细胞重悬于PBS溶液中，于-80℃/37℃间反复冻融三次，4℃、8000rpm离心20min，收集病毒上清，冻存于-80℃；

⑸累计20-30瓶时用0.45μm滤膜过滤，准备进行病毒纯化。

二、阴离子交换层析分离纯化Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒

应用GE公司基于离子交换介质的开发的“Q Sepharose XL virus licensed”，能够提供快速、有效地对腺病毒粗产品进行纯化，并且建立的纯化体系可按比例放大进行规模化生产临床级别的腺病毒产品。

1、确定Ad5F11p-eTERTFcGB的特异性洗脱浓度

将处理过的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒粗产品结合到Q Sepharose XL阴离子交换层析柱后，需要以浓度为0-1M NaCL梯度浓度的洗脱缓冲液依次洗脱，同时收集不同洗脱峰的液体，感染293细胞48后观察细胞病变，以确定Ad5F11p-eTERTFcGB的特异性洗脱浓度，具体操作方法如下：

⑴将步骤一收获的腺病毒粗产品经0.45μm滤膜过滤后，按1：1000的比例加入Cryonase^TMCold-active Nuclease核酸酶，4℃处理样品30min；

⑵用平衡缓冲液(20mM Tris-HCL缓冲液pH8.0)平衡4-6个柱床体积，流速为2mL/min；

⑶将处理过的含Ad5F11p-eTERTFcGB的细胞裂解液10-20ml上样，流速为1mL/min；

⑷经平衡缓冲液(20mM Tris-HCL缓冲液pH8.0)洗4-6个柱床体积，洗掉未结合的成份；

⑸用平衡缓冲液(20mM Tris-HCL缓冲液pH8.0)与洗脱缓冲液(20mM Tris-HCL，1M NaCl缓冲液pH8.0)按照不同比例混合成梯度(使用0-1M NaCL梯度浓度的洗脱缓冲液依次洗脱)洗脱60min；

⑹收集不同的峰值取样进行分析，确定Ad5F11p-eTERTFcGB的洗脱范围。光镜下观察不同洗脱峰液体感染293细胞后的状态如图13所示，最后确定Ad5F11p-eTERTFcGB的特异性洗脱峰出现在0.45M NaCl，20mM Tris-HCL缓冲液pH8.0。

2、Q Sepharose XL纯化Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒

将处理过的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒粗产品结合到Q Sepharose XL阴离子交换层析柱后，首先以0.35M NaCl浓度的洗脱缓冲液，流速为2mL/min洗4-6个柱床体积，洗掉杂蛋白，接着换0.45M NaCl浓度的洗脱缓冲液，流速为1mL/min进行洗脱，收集Ad5F11p-eTERTFcGB洗脱峰样品，Q Sepharose XL纯化Ad5F11p-eTERTFcGB洗脱记录图如图14所示，使用病毒保存缓冲液(5％蔗糖，150mM NaCl，2mM MgCl₂，20mM Tris-HCL缓冲液pH8.0)透析后除去盐分，100kD超滤离心管浓缩样品，-80℃保存待用。

三、Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒的PCR鉴定

提取病毒基因组DNA后，利用PCR技术对hTERT复合基因中的抗原基因部分进行检测；另外，通过检测野生5型腺病毒E1区的存在与否，可鉴定复制完全型腺病毒(RCA)，评价腺病毒产品的安全性。

1、提取重组腺病毒的基因组DNA

按照北京三博远志生物公司的病毒基因组DNA提取试剂盒进行小量提取病毒基因组DNA，具体操作方法如下：

⑴取750ul上清液(病毒)移至一个新的EP管中，加入等体积预冷的溶液P，反复颠倒数次室温放置30min，12,000rpm离心5min，尽可能弃上清；

⑵向病毒颗粒沉淀中加入200μL缓冲液SL，立即振荡混匀；

⑶加入20μL蛋白酶K(20mg/mL)溶液，混匀，58℃放置1小时；

⑷加入220μL结合液SB，立刻上下快速颠倒充分混匀，58℃放置10分钟；

⑸冷却后加入220μL无水乙醇，颠倒混匀充分；

⑹将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；

⑺加入700μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；

⑻加入500μL漂洗液PW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；

⑼再将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液；

⑽取出吸附柱，放入一个干净的1.5mL离心管中，在吸附膜的中间部位加50μL的灭菌水，50℃温浴10分钟，12,000rpm离心1分钟，所得基因组DNA放置在-20℃保存。

Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒基因组DNA的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图15(M：DNA Marker(DL15000)；1：阴性对照；2：腺病毒基因组DNA)所示，结果获得了33000bp的病毒基因组DNA，与预期结果相符。

2、融合抗原片段eTERTFcGB上游hTERT抗原序列扩增的PCR检测

以步骤1提取的腺病毒基因组DNA作为模板进行PCR鉴定，选取融合抗原片段eTERTFcGB上游hTERT抗原序列扩增，引物如下：

上游：eTERT-F：5’-CGTGAGGAGATCCTG-3’

下游：eTERT-R：5’-TCAGTGAGGTGTCACCAAC-3’

PCR鉴定体系如表7所示，PCR扩增条件：95℃预变性5min；循环参数(95℃变性45s，55℃退火45s、72℃延伸60s)，共20个循环；72℃继续延伸5min。

表7融合抗原片段eTERTFcGB上游hTERT抗原序列扩增的PCR检测体系

PCR鉴定结果如图16(M：DNA Marker(DL15000)；1：Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒基因组DNA；2：eTERT抗原基因片段)所示，结果扩增出大小约1100bp的eTERT抗原基因片段，证实纯化得到的Ad5F11p-eTERTFcGB重组腺病毒中包含hTERT复合基因，

3、复制完全型腺病毒(RCA)检测

PCR法不应检测到野生型腺病毒特征基因E1区，合成PCR引物，以步骤1提取的腺病毒基因组DNA作为模板进行检测，引物如下：

上游：El-F：5’-TGACGACGAGGATGAAGA-3’

下游：El-R：5’-GGAGTCACAGCTATCCGTAC-3’

PCR鉴定体系参见表7，PCR扩增条件：95℃预变性5min；循环参数(95℃变性30s，55℃退火30s、72℃延伸30s)，共20个循环；72℃继续延伸5min。

PCR鉴定结果如图16(M：DNA Marker(DL15000)；1：Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒基因组DNA；3：野生5型腺病毒E1区)所示，扩增野生5型腺病毒E1区结果为阴性，证实腺病毒未整合293基因组中的E1区，证明获得的腺病毒产品无复制完全型腺病毒(RCA)，全部为安全的复制缺陷型腺病毒。

四、病毒活性检定

主要包括三项检测内容：病毒颗粒数、病毒感染滴度、比活性：

1、病毒颗粒数测定

取25μL腺病毒加入5μL10％SDS，放置5min后加入95μL PBS混合均匀，等待15min后采用紫外分光法测定A260nm和A280nm。以25μL PBS液替换腺病毒产品，处理后作为空白对照。根据1.0A260nm＝1.1x10¹²VP，计算腺病毒颗粒数。

2、病毒感染滴度测定

⑴取l0μL纯化的腺病毒加入990μL MEM/EBSS培养基(10²倍稀释)，混匀后取100μL稀释于900μL MEM/EBSS培养基中(10³倍稀释)，依次类推进行倍比稀释，直至10⁶倍稀释；

⑵将293细胞提前一天接种于6孔培养板，接种量为1×10⁶细胞/孔；

⑶24h后细胞长至约90％汇合时，吸出培养液，分别加入10²-10⁶倍比稀的病毒液，培养1-2h。

⑷快速CPE分析：将10²-10⁶倍比稀释的病毒液从各孔中吸出，每孔加入2mL含10％新生牛血清的MEM/EBSS培养基。

⑸48h后观察CPE，选出发生100％CPE的稀释倍数，根据下述公式计算病毒的感染滴度：

公式：感染滴度(PFU/mL)＝(2×10⁶细胞/孔)×稀释倍数×10/病毒液体积。

3、A260/A280比值测定

经Q Sepharose XL阴离子交换层析法获得的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒产品测定其A260nm和A280nm，快速CPE法分析病毒感染滴度，计算获得病毒颗粒数、病毒感染滴度、比活性。

结果如表8所示，纯化获得的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒产品A260nm/A280nm＝1.33比值介于1.25-1.35之间，病毒颗粒数大于1.0x10¹¹VP/mL，感染滴度大于5x10⁹PFU/mL，比活性大于3.3％，符合国家关于生物制品的相关规定。

表8病毒颗粒数、病毒感染滴度、比活性检测结果

5、SDS-PAGE测定Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒纯度

⑴取方法2.2获得的腺病毒产品，加入1/4体积的5×蛋白处理Buffer，混匀后沸水中加热5-10min；

⑵电泳：制备分离胶(10％)，浓缩胶(5％)，每个样品加入20ul，同时加入预染的Marker。150V恒压下电泳；

⑶预染Marker特定条带到达胶的底部时停止电泳；

⑷考马斯亮蓝染色凝胶后，脱色液脱色后进行分析。

纯化获得的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒产品经蛋白处理后，进行(分离胶(10％)，浓缩胶(5％))SDS-PAGE检测，结果如图17(A：未纯化前样品；B：纯化后样品)所示，结果显示经Q Sepharose XL阴离子交换层析法获得的Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒产品未见其它杂蛋白带，具有较高的纯度。

实施例3、端粒酶逆转录酶hTERT抗原片段的原核表达、纯化及抗原活性检测

目前以hTERT为靶点的广谱肿瘤免疫治疗性疫苗的临床前研究，多采用小鼠或转基因小鼠荷瘤模型进行评价，为进一步探讨hTERT在恶性肿瘤免疫治疗中的效果及其相关机制，经纯化得到了hTERT蛋白(1609-2628位碱基的)并对其免疫原性进行了相关的检测，为下一步肿瘤治疗性腺病毒疫苗的Ad5F11p-eTERTFcGB抑瘤相关免疫学机制的研究奠定了基础。

首先，应用PCR的方法扩增hTERT1609-2628位碱基的序列，将其构建到原核表达载体pET-42a中并在大肠杆菌E.coli.Rossata(DE3)中诱导表达，优化hTERT蛋白的表达条件，最终确定IPTG的浓度、诱导温度、诱导时间的最佳条件，实现GST-hTERT融合蛋白在大肠杆菌中高效表达、纯化。对纯化后的蛋白进行Western blot检测，接着，用纯化后hTERT蛋白包板进行ELISA检测，证实其免疫原性。具体实验方法及实验结果如下：

一、构建hTERT原核表达载体

1、去除mPSCA序列中的信号肽序列的引物设计

根据GenBank中hTERT序列信息(序列号：NM_198253)，确定hTERT1609-2628位碱基的序列，设计PCR扩增引物如下：

上游引物42aTERT-F：5’-GCAATTGGTCGTGAGGAGATCCTG-3’

下游引物42aTERT-R：5’-GAGATCTTCAGTGAGGTGTCACCAAC-3’

其中，hTERT1609-2628位碱基的序列上游引入Mfe I酶切位点，序列下游引入BglⅡ酶切位点。引物由英骏生物技术有限责任公司合成、纯化。用灭菌蒸馏水配制成10μmol/L的使用液，分装后-20℃保存备用。

2、PCR扩增hTERT基因片段

以含有hTERT全长基因的pMD-18T-hTERT质粒(构建方法参见硕士毕业论文：肖毅，hTERT广谱抗肿瘤基因疫苗实验研究，2010，硕士)为模板，在引物42aTERT-F和42aTERT-R的引导下PCR扩增hTERT1609-2628位碱基的基因片段，反应体系如表9所示，PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃45s、58℃45s、72℃60s(进行20个循环)；最后72℃延伸5min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图18(M:DNA Marker(DL2000)；1:hTERT1609-2628位碱基的PCR扩增产物)所示，可见扩增出大小约为1100bp的片段，与预期大小一致。

表9hTERT1609-2628位碱基的基因的PCR扩增体系

3、hTERT1609-2628位碱基的基因的纯化

参见实施例1。

4、过渡载体pMD-18T-hTERT的构建及测序

将回收纯化的hTERT1609-2628位碱基的基因片段与载体pMD-18T(购自TAKARA公司)连接，将连接产物转化入大肠杆菌E.coli.DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，送英骏生物技术有限责任公司测序，测序结果表明1号菌液与GenBank中hTERT基因(序列号：NM_198253)相同，将测序正确的菌液提质粒，将该质粒命名为pMD-18T-hTERT。

5、构建pET42a-hTERT重组表达载体

5.1pMD-18T-hTERT和pET42a的酶切及纯化回收

将重组质粒pMD-18T-hTERT和载体pET42a(购自NOVAGEN公司)分别用Mfe I、BglⅡ双酶切，双酶切体系如表10所示，37℃水浴过夜12小时，将酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分离后，进行切胶纯化回收，pMD-18T-hTERT的双酶切产物及其纯化片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图19(M1：DNA Marker(markerⅢ)；1：pMD-18T-hTERT质粒；2：pMD-18T-hTERT质粒经Mfe I酶切线性化；3：pMD-18T-hTERT双酶切；4：pMD-18T-hTERT双酶切后纯化片段；M2：DNA Marker(DL2000))所示，pET42a的双酶切产物及其纯化片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图20(M：DNAMarker(markerⅢ)；1：pET42a双酶切后纯化片段)所示，结果pMD-18T-hTERT经双酶切获得了1100bp的DNA片段，pET42a经双酶切获得了5900bp的DNA片段，与预期结果相符。

表10pMD-18T-hTERT、pET42a的Mfe I、BglⅡ双酶切体系

5.2pET42a-hTERT重组质粒的连接、转化

将纯化回收的hTERT1609-2628位碱基的基因片段和pET42a载体片段进行连接，将连接产物转化E.coli.DH5α感受态菌，用含50μg/mL卡那霉素的抗性LB平板筛选阳性克隆。以阳性单克隆菌落为模版，在引物42aTERT-F和42aTERT-R的引导下进行PCR鉴定，鉴定结果如图21(M：DNA Marker(DL2000)；1：菌液PCR鉴定；2：质粒PCR鉴定；3:阴性对照)所示，结果经扩增获得了1100bp的DNA片段，与预期结果相符，对PCR鉴定正确的菌种提取质粒，送英骏生物公司测序，将测序正确的携带hTERT1609-2628位碱基的基因片段的重组表达载体命名为pET42a-hTERT，-20℃保存备用。

6、hTERT1609-2628位碱基的的原核表达及纯化

6.1GST-hTERT融合蛋白的诱导表达条件的优化

通过实验筛选出GST-hTERT融合蛋白表达的IPTG的诱导浓度、诱导的温度及时间。

6.1.1GST-hTERT融合蛋白诱导中IPTG浓度的确定

以IPTG0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L，在37℃、100rpm振荡诱导4h，检测GST-hTERT蛋白的表达情况，具体方法包括以下步骤：

⑴按照1：100的比例，将步骤5中保存的菌液分别接种到4管含有5mL50μg/mL卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD600≈0.4时，留取一管作为未诱导前的对照，向另外3管中加入IPTG，使其终浓度分别为：0.25mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L，37℃、100rpm振荡诱导4h；

⑵取诱导的菌液各1mL，12000rpm离心1min收集菌液，0.5mL的PBS重悬，超声破碎菌体使菌液变澄清。4℃下12000rpm离心1min，收集上清用1×Loading buffer处理后，进行分离胶(10％)，浓缩胶(5％)SDS-PAGE电泳检测；

⑶染色并脱色后分析SDS-PAGE电泳结果，选择最佳的IPTG诱导浓度。

结果如图22A(M：蛋白预染Marker；1：未诱导菌对照；2：IPTG1.0mmol/L全菌；3：IPTG1.0mmol/L上清；4：IPTG0.25mmol/L全菌；5：IPTG0.25mmol/L上清；6：IPTG0.5mmol/L全菌；7：IPTG0.5mmol/L上清)所示，可见其它诱导条件相同时，IPTG浓度为0.5mmol/L、1.0mmol/L时诱导的蛋白表达浓度均较高，并且GST-hTERT蛋白(约65kD)主要以可溶的形式表达在上清中，所以确定在下一步的实验中选择IPTG终浓度为0.5mmol/L。

6.1.2GST-hTERT融合蛋白诱导最适温度的确定

以IPTG0.5mmol/L，在24℃、27℃、30℃、33℃、37℃、100rpm振荡诱导4h，检测GST-hTERT蛋白的表达情况，具体方法包括以下步骤：

⑴根据步骤6.1.1的实验结果，选择IPTG浓度为0.5mmol/L进行后续实验，菌液诱导前的步骤同前。

⑵加入IPTG使终浓度为0.5mmol/L后，分别选择24℃、27℃、30℃、33℃、37℃五个温度进行诱导表达，100rpm振荡培养6h。

⑶收集菌液，离心后PBS重悬，超声破碎菌体使菌液变澄清。

⑹4℃下12000rpm离心1min，收集上清用0.5mL PBS重悬；1×Loading buffer处理后进行分离胶(10％)，浓缩胶(5％)SDS-PAGE电泳检测。

结果如图22B(M：蛋白预染Marker；1：未诱导菌对照；2-6：不同温度诱导下上清中的GST-hTERT表达，温度依次为：24℃、27℃、30℃、33℃、37℃)所示，结果显示，24℃、27℃、30℃下诱导均可以达到GST-hTERT蛋白在细菌裂解上清中的高效表达，由于随温度的增加细菌中的蛋白酶活性也增加，所以选择较低的24℃作为蛋白诱导的最佳温度进行以后的实验。

6.1.3GST-hTERT融合蛋白诱导最适时间的确定

以IPTG0.5mmol/L，在24℃、100rpm振荡分别诱导2h、4h、6h、8h，检测GST-hTERT蛋白的表达情况。检测结果如图22C(M:蛋白Marker1:未诱导全菌2：诱导6h全菌3：诱导2h上清4：诱导4h上清5：诱导6h上清6：诱导8h上清)所示，结果显示，在2h,4h,6h诱导时，GST-hTERT融合蛋白在上清中的表达逐渐增加，而8小时时GST-hTERT融合蛋白在上清中的表达量减少，考虑随时间的延长上清中表达的蛋白可能被细菌中的蛋白酶降解，所以选择表达量最高的6h作为GST-hTERT融合蛋白诱导最适时间。

最终确定诱导GST-hTERT的条件为：IPTG终浓度为0.5mmol/L，24℃诱导6h。

6.2重组质粒pET42a-hTERT转化大肠杆菌E.coli.Rossata(DE3)

将鉴定正确的重组质粒pET42a-hTERT转化E.coli.Rossata(DE3)感受态细胞，于含有50μg/mL卡那霉素抗性LB平板培养过夜12h。

6.3筛选GST-hTERT蛋白表达的阳性克隆菌

⑴挑取10个阳性单克隆菌落，接种于含有50μg/mL卡那霉素抗性的5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡4h，菌液PCR鉴定正确菌种，培养过夜。

⑵取过夜培养的菌液按照1：100的比例重新接种另外的含有50μg/mL卡那霉素抗性的5mL LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养至OD600≈0.4时向菌液中加入IPTG，使其终浓度为1mmol/L，37℃、100rpm继续振荡诱导4h。

⑶取诱导的菌液1mL，12000rpm离心1min收集菌体，用1×Loading buffer处理后行分离胶(10％)，浓缩胶(5％)SDS-PAGE电泳。

⑷将凝胶转入考马斯亮蓝染色液，室温下摇床缓慢摇动染色30min，放入干净的容器中，加入脱色液，摇动脱色12h，选择目的蛋白条带最深的菌液，保存菌种作为蛋白表达的诱导菌。

6.4GST-hTERT融合蛋白的表达及纯化

⑴取过夜培养的菌液2mL转接入200mL50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养至菌液OD600≈0.4时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，24℃、100rpm诱导6h。

⑵将菌液倒入离心管中，4℃、8000rpm离心3min收集菌菌体，用PBS洗涤菌体后，用20mL PBS重悬菌液置入冰浴中，超声裂解菌体至菌液清亮。

⑶4℃、12000rpm离心10min，收集上清用0.45μm滤膜过滤至新的离心管中。

⑷Glutathione Sepharose^TM4B凝胶预处理：吸取400μL凝胶，4℃、3000rpm离心2min，吸出凝胶上层的液体，用2倍体积冰PBS重悬，4℃、3000rpm离心2min，弃上清。

⑸用冰PBS重悬凝胶，并将其与过滤后的上清轻柔混匀，4℃下在混匀仪上混匀45min。

⑹4℃、3000rpm离心2min，轻柔去除上清，用冰PBS洗涤凝胶5次左右。

⑺加入10mmol/L还原性谷胱甘肽洗脱液400μL洗脱GST-hTERT蛋白，重复洗脱6-8次，用紫外分光光度计检测纯化出的目的蛋白的浓度，通过分离胶(10％)，浓缩胶(5％)SDS-PAGE检测洗脱GST-hTERT蛋白情况。

纯化后获得的融合蛋白GST-hTERT经分离胶(10％)，浓缩胶(5％)SDS-PAGE分析，结果如图23(M：蛋白预染Marker；1：未诱导菌对照；2：诱导后全菌；3：诱导后上清；4：纯化后的GST-hTERT蛋白)所示，可见一相对分子质量大小约为65kD的清晰的条带，与预期的蛋白大小相符。

7、Western Blot检测纯化的GST-hTERT蛋白

取纯化的目的蛋白20μL，加入1×Loading buffer沸煮10min，同时以未诱导的菌液及未纯化的菌液作为对照，具体步骤如下：

7.1电泳

a.制备浓缩胶(5％)，分离胶(10％)；

b.每个样品加入10μL，同时加入预染的Marker；

c.120V恒压下电泳；

d.预染Marker特定条带到达胶的底部时停止电泳。

7.2转移印迹

a.将滤纸、PVDF膜剪成与凝胶同样大小；

b.PVDF膜浸入甲醇45s，与滤纸一起浸入转移buffer中平衡20min；

c.将滤纸、凝胶、滤纸逐层铺平，避免产生气泡和皱褶；

d.恒流200mA，冰水浴下转移2h。

7.3抗体结合

a.转移后的PVDF膜置于5％脱脂奶粉中室温封闭2h；

b.PBST洗膜3次，10min/次，加一抗(名称山羊抗人TERT，购自Santa cruz公司)，4℃冰箱内反应过夜；

c.PBST洗膜3次，10min/次，加二抗(名称HRP标记的兔抗山羊IgG，购自北京中杉金桥技术有限公司)，37℃反应1h；

d.PBST洗膜3次，10min/次。

7.4化学发光

a.在暗室中红光的照明下，曝光盒内置一保鲜膜，PVDF膜有蛋白的一面朝上；

b.取发光试剂盒(购自北京中杉金桥技术有限公司)内500μL A液和B液按1：1混匀后滴加到PVDF膜上；

c.保鲜膜对折，将PVDF膜包在两层之间；

d.1min后在保鲜膜上放置胶片曝光，曝光约30s-10min；

e.将曝光后的胶片在显影液中显影5-10min，浸于定影液中定影约5-10min；

f.将定影后的胶片清水冲洗晾干，保存实验结果。

结果如图24(1：GST-hTERT融合蛋白；2：阳性对照(诱导后全菌)；3：阴性对照(未诱导全菌))所示，应用特异性的抗人TERT的抗体与GST-hTERT蛋白杂交可以检测到大小(65KD)与预期一致的特异性条带，可见纯化后的GST-hTERT融合蛋白能够与特异性抗体结合。

8、ELISA法检测hTERT的抗原活性

以纯化的GST-hTERT蛋白包被酶联板，用山羊抗人TERT抗体对包被的抗原进行检测，以山羊抗人IgG作为对照，具体步骤如下：

⑴包被酶联板：将纯化的GST-hTERT蛋白用包被缓冲液稀释至10μg/mL，混匀后每孔中加入100μL，4℃冰箱包被12小时；

⑵将包被液甩出，用PBST洗板4次，每次停留60s，最后一次在吸水纸扣干；

⑶每孔加入含5％BSA的封闭液100μL，37℃封闭1h，甩出封闭液，用PBST洗板4次；

⑷用PBS按照1：50、1：100、1:200、1：400、1：800、1：1600、1：3200梯度稀释山羊抗人TERT抗体(购自Santa cruz公司)，每孔100μL。以同型无关抗体山羊抗人IgG为阴性对照，37℃孵育抗体2h；

⑸将抗体液甩出，PBST洗板4次；

⑹用PBS按照1：5000比例稀释HRP标记的兔抗山羊IgG(购自北京中杉金桥技术有限公司)，每孔加入100μL，37℃孵育抗体1h；

⑺将稀释的二抗甩出，PBST洗板4次；

⑻加入TMB底物显色液100μL，避光37℃孵育30min；加入2M的H₂SO₄终止反应。酶标仪中，检测OD_450nm的吸光度值。

纯化获得的GST-hTERT蛋白包被酶标板，以不同倍数稀释的抗人TERT抗体进行ELISA检测，以抗人IgG作阴性对照，每稀释倍数做4个复孔，所有数据用表示，结果如表11所示。

表11hTERT抗原活性的ELISA法检测结果

以稀释倍数1：3200为1作为横坐标，以OD_450nm值为纵坐标，绘制曲线，如图25所示，线性回归方程为y＝0.032x+0.149相关系数R²＝0.982。由于R²＞0.9，可判定为y与x之间为高度线性相关。由图中可以看出，纯化后的GST-hTERT抗原具有较高的灵敏性及特异性。

实施例4、稳定表达hTERT/Luc的荷瘤小鼠模型的建立

本部分实验，在pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc质粒鉴定正确的基础上，利用阳离子脂质体法转染和抗生素筛选技术，建立了稳定表达人hTERT全长基因和荧光素酶报告基因(Luc)的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株，将稳定共表达hTERT和Luc的B16-hTERT/Luc细胞株通过皮下注射和尾静脉注射的方式接种C57BL/6小鼠，建立小鼠皮下荷瘤模型和肿瘤肺转移模型，通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤的生长，并观察小鼠的存活状况。为进一步研究新型抗肿瘤生物治疗剂Ad5F11p-eTERTFcGB的体内外抑瘤功能提供了稳定表达hTERT基因的靶细胞，为hTERT在肿瘤免疫治疗中的应用研究奠定了基础。

一、构建真核表达质粒pIRES-hyg3-Luc

根据pGL3-Luc及pIRES-hyg3真核表达质粒设计酶切位点。pIRES-hyg3载体采用BsrG I酶切后补平，然后采用Nhe I酶切产生一平一粘两个末端。pGL3-Luc采用HindⅢ酶切后补平，然后采用Xba I酶切获得一平一粘两个末端的Luc报告基因片段。由于Nhe I和Xba I是一对同尾酶，分别切胶回收载体和片段，经连接酶连接后转化入E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，氨苄培养皿筛选，挑取阳性克隆进行PCR鉴定及测序鉴定，分析后证实并命名为pIRES-hyg3-Luc。具体构建方法，包括以下步骤：

1、获得pGL3-Luc真核表达质粒

pGL3-Luc即pGL3-Basic质粒(带有Luc报告基因)，购自Promega公司。

2、获得pIRES-hyg3真核表达载体

pIRES-hyg3购自Clontech公司。

3、pIRES-hyg3载体的酶切和补平

根据pGL3-Luc及pIRES-hyg3真核表达载体设计酶切位点。pIRES-hyg3载体采用BsrG I酶切后补平，然后采用Nhe I酶切产生一平一粘两个末端。具体操作方式如下：

⑴首先利用限制性内切酶BsrG I酶切pIRES-hyg3质粒，37℃水浴4h，酶切体系见表12；

⑵酶切产物按照1：3的比例加入片段纯化结合液BD，将混合液体转移至离心柱的吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去废液；

⑶加入550μL漂洗液，12000rpm离心1min；

⑷重复步骤⑶后弃废液，12000rpm空离2min，以便尽量出去残留的漂洗液；

⑸将吸附柱移入一个干净的EP管中，在吸附柱中央加入50μL的灭菌水，静置5min后12000rpm离心1min，收集洗脱液。

⑹接下来用Klenow酶补酶切后的粘性末端，补平体系见表13；

⑺同上片段回收后，采用Nhe I再次酶切线性化后补平的pIRES-hyg3载体，最终获得一平一粘两个末端的pIRES-hyg3载体，pIRES-hyg3载体的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图26(M:DNA Marker(markerⅢ)；1:pIRES-hyg3质粒；2：pIRES-hyg3酶切后回收)所示，结果获得了5700bp的目的条带，与预期结果相符，-20℃保存。

表12pIRES-hyg3BsrG I/Nhe I酶切体系

表13pIRES-hyg3纯化片段的粘末端补平体系

4、Luc报告基因片段的获得

pGL3-Luc采用HindⅢ酶切后补平，然后采用Xba I酶切获得一平一粘两个末端的Luc报告基因片段(具体步骤参见步骤3)。Luc报告基因片段的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果如图27(M:DNA Marker(markerⅢ)；1:pGL3-Luc质粒；2：HindⅢ酶切后补平回收；3：Xba I酶切；4：回收Luc基因片段)所示，结果获得了1600bp的Luc报告基因片段，与预期结果相符。

5、Luc报告基因片段与pIRES-hyg3载体的连接

由于Nhe I和Xba I是一对同尾酶，分别切胶回收载体pIRES-hyg3和Luc报告基因片段，经连接酶连接后转化入E.coli.DH5α感受态大肠杆菌，用含100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板进行筛选，挑取阳性克隆提质粒进行测序鉴定，测序结果表明重组质粒中的Luc报告基因的核苷酸序列与GenBank中载体pGL3-3'UTR(序列号：JN542721.1)中Luc报告基因的序列相同，表明获得了插入位置及序列均正确的Luc报告基因的重组表达质粒，命名为pIRES-hyg3-Luc，其物理图谱如图27所示。

二、获得稳定表达hTERT/Luc的B16单克隆细胞株

1、构建pIRES-neo-hTERT真核表达质粒

请提供pIRES-neo-hTERT真核表达质粒的构建方法参见硕士毕业论文：肖毅，hTERT广谱抗肿瘤基因疫苗实验研究，2010，硕士)，其物理图谱如图28所示。

2、pIRES-hyg3-Luc转染质粒的提取

将鉴定正确的pIRES-hyg3-Luc菌液培养12h，按Plus Minipreps DNAPurification system(Promega公司)说明书提取转染质粒，操作步骤如下：

⑴12000rpm离心60s，将约6mL菌液收集到1.5mL离心管，尽量去除上清，加入300μL重悬液重悬沉淀；

⑵加入300μL裂解液，轻柔混匀溶液，至重悬液变澄清；

⑶加入300μL中和液，轻柔混匀溶液，12000rpm离心10min，立即吸取上清；

⑷将注射器去掉针头，插在纯化柱子上，加入1mL树脂，加入⑶步的离心上清，混匀后，将混合液清推过柱子；

⑷将2mL洗涤缓冲液加入注射器，用洗涤缓冲液轻推过柱子；

⑸取下纯化柱子插到新的1.5mL离心管上，12000rpm离心2min，去除多余洗涤缓冲液；

⑹取下纯化柱子插到新的1.5mL离心管，用50μL预热的无菌水溶解约5min，室温下12000rpm离心1min，收集洗脱液。用紫外分光度法测定质粒pIRES-hyg3-Luc浓度，分装，-20℃保存备用。

使用Lipofectamine2000将pIRES-neo-hTERT和pIRES-hyg3-Luc共转染B16细胞；37℃、5％CO₂饱和湿度培养，筛选培养基含有1000μg/mL G418和400μg/mL的潮霉素B。持续加压至细胞不再死亡即获得混合克隆。随后按照有限稀释法进行单克隆化操作。具体方法如下：

3、B16细胞转染方法

⑴准备细胞：转染前24h，将B16细胞传代培养于6孔板中，使用含10％新生牛血清的RPMI1640培养，次日细胞密度达到80％左右，进行转染。

⑵配制转染复合物：转染时，分别用250μL Opti-MEM稀释4μg的重组质粒(pIRES-neo-hTERT2μg，pIRES-hyg3-Luc2μg)和10μL的Lipofectamine^TM2000，室温放置5分钟，将两液体混合后，室温放置30分钟，使其形成DNA-脂质体复合物。

⑶转染细胞：先用Opti-MEM培养基洗涤6孔板中的细胞两次，温和滴加转染液到细胞中，37℃、5％CO₂饱和湿度培养。

⑷转染6小时后，更换含10％新生牛血清的RPMI1640培养基，继续培养。

4、B16细胞潮霉素B及G418敏感性筛选

由于每种细胞对潮霉素B及G418的敏感性不同，所以在加压筛选之前要确定潮霉素B及G418的筛选浓度。方法如下：

⑴B16细胞消化后，将细胞稀释至1000/mL，每孔加入100μL细胞悬液至24孔板。置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养4h；

⑵每孔中的潮霉素B/G418浓度分别为0、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100μg/mL，每组3个复孔；

⑶37℃、5％CO₂饱和湿度培养1周左右，寻找全部细胞死亡的浓度，以此为基准，确定筛选B16细胞的浓度。最终确定B16细胞的潮霉素B/G418的筛选浓度分别为400μg/mL和1000μg/mL。

5、稳定转染的细胞单克隆化操作

⑴加抗生素筛选过程中，每隔3d更换培养基，加压后1周后光镜下可见大量细胞死亡，持续筛选至细胞不再死亡，以团簇的形式生长即得到阳性细胞；

⑵加压筛选至阳性克隆细胞铺满6孔板，在培养瓶扩大培养，到阳性克隆细胞长满获得混合克隆；

⑶进行有限稀释法单克隆化操作：将混合克隆稀释为1000/mL，按100μL/孔有限稀释到96孔板中，培养过程中在显微镜下观察，确定只含有1个细胞的孔；

⑷10-15d后，将单克隆细胞团消化后逐级扩大培养，最终得到单克隆细胞株。

三、检测单克隆细胞株hTERT/Luc蛋白的表达水平

1、Western Blot检测单克隆细胞株hTERT/Luc蛋白的表达水平

1.1样品制备

a.待培养瓶中细胞生长的达到80-90％融合度时，用冷的PBS将细胞洗两遍；

b.0.25％的胰酶消化，1000rpm离心5min收集细胞；

c.向沉淀中加入400μL RAPI裂解液，冰上裂解细胞30min；

d.裂解产物于4℃、12000rpm离心10min；

e.吸取上清，加入1×Buffer，沸水中加热5min获得蛋白样品。

1.2电泳

见实施例3。

1.3转移印迹

见实施例3。

1.4抗体结合

见实施例3，一抗为山羊抗人TERT购自Santa cruz公司；山羊抗Luciferase购自Promega公司，二抗为HRP标记兔抗山羊IgG北京中杉金桥技术有限公司。

1.5化学发光

见实施例3。

结果如图29(1:B16(hTERT-/Luc-)；2：B16(hTERT+/Luc-)；3：B16-hTERT/Luc(hTERT+/Luc+))所示，可见1号单克隆细胞蛋白经特异性山羊抗人TERT或山羊抗Luciferase结合后，经HRP标记二抗孵育，均可在正确位置显示明确条带，证明1号单克隆细胞系可稳定表达hTERT及荧光素酶(Luciferase)基因。

2、流式细胞术检测hTERT/Luc在细胞内的表达水平

将已通过Western Blot验证的1号单克隆细胞株进行扩大培养，待细胞生长处于对数生长期时收获细胞，细胞固定打孔，进行特异性山羊抗人TERT或山羊抗Luciferase，FITC标记兔抗山羊IgG孵育后流式上机检测，方法如下：

⑴收集单克隆细胞，用5mL4℃预冷PBS重悬洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，去上清；

⑵加4℃预冷细胞固定打孔液500ul，4℃冰水浴，作用10min后，1000rpm离心5min，去上清；

⑶用5mL4℃预冷PBS重悬洗涤细胞2次，加入1:100稀释的一抗山羊抗人TERT购自Santa cruz公司；山羊抗Luciferase购自Promega公司100μL，混匀，冰水浴孵育30min；

⑷用5mL4℃预冷PBS重悬洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，去上清；

⑸加入1：100稀释的FITC标记兔抗山羊IgG抗体(购自北京中杉金桥技术有限公司)100μL，混匀，避光冰水浴孵育30min；

⑹用5mL4℃预冷PBS重悬洗涤细胞2次，1000rpm离心5min，去上清，加入1％多聚甲醛500μL固定后，进行流式细胞术检测。

检测结果如图30(A:B16-hTERT/Luc(anti-human TERT)；B：B16-hTERT/Luc(anti-Luciferase))所示，B16-hTERT/Luc单克隆细胞株流式检测结果显示：抗人TERT染色后荧光表达率为84％，抗Luciferase染色后荧光表达率为98％，说明B16-hTERT/Luc单克隆细胞株中hTERT及Luciferase报告基因均达到了很好的表达。

3、间接免疫荧光法检测hTERT/Luc在细胞内的表达情况

⑴将消毒的盖玻片置于6孔板中，收集B16单克隆细胞悬液，滴加到盖玻片上，过夜培养；

⑵弃去6孔板培养基，用冷PBS洗一遍，使用4％多聚甲醛浸泡30min，冷PBS洗3遍；

⑶Triton-X-100，4℃通透处理10min。冷PBS洗3遍；

⑷加入10％血清冷PBS封闭30min；

⑸加入按1:200稀释的一抗山羊抗人TERT购自Santa cruz公司；山羊抗Luciferase购自Promega公司)800μL，室温孵育2h后冷PBS洗三遍；

⑹加入按1:200稀释的FITC标记兔抗山羊IgG抗体(购自北京中杉金桥技术有限公司)800μL，避光孵育1h后PBS洗三遍；

⑺加一滴封片液在载玻片上，取出盖玻片，细胞面朝下盖好，共聚焦激光显微镜下观察并拍照。

共聚焦显微镜检测结果如图31(A:B16-hTERT/Luc(anti-human TERT)；B：B16-hTERT/Luc(anti-Luciferase))所示，经山羊抗人TERT和山羊抗Luciferase特异性抗体染色过的B16-hTERT/Luc单克隆细胞株细胞发现，视野里的全部细胞均有绿色的荧光表达，并且hTERT主要定位于细胞核，而荧光素酶(Luciferase)主要在胞浆内表达。

四、荷瘤小鼠模型的建立

1、皮下荷瘤小鼠模型的建立

雄性6-8周龄C57BL/6小鼠随机分为4组，每组共5只，背部皮下注射B16-hTERT/Luc细胞悬液，细胞数分别为5×10⁵/只、2×10⁵/只、1×10⁵/只、0.5×10⁵/只，于肿瘤细胞移植后隔天观察小鼠背部肿瘤生长情况，仔细记录成瘤时间，肿瘤生长曲线。肿瘤体积按下面公式计算：

肿瘤体积(mm³)＝0.5×垂直长径×(垂直短径)²

各组小鼠成瘤时间及成瘤率如表14所示，每只小鼠背部皮下接种1×10⁵到5×10⁵个B16-hTERT/Luc肿瘤细胞均可以100％成瘤，继续观察肿瘤生长情况发现1×10⁵组小鼠背部肿瘤生长速度均一，正常情况下约在接种肿瘤后的30天到40天内陆续死亡。故选择均一性较好的1×10⁵/只的接种量作为正式实验时的接种肿瘤细胞数。

表14各组小鼠成瘤时间及成瘤率

肿瘤细胞浓度	接种细胞数	成瘤天数	3mm×3mm天数	成瘤率
					5×106	5×105	5-7	8-9	100％
2×106	2×105	7-8	10-12	100％
					1×106	1×105	10-11	14-15	100％
0.5×106	0.5×105	10-14	13-19	80％

2、小鼠肿瘤肺转移模型的建立

雄性6-8周龄C57BL/6小鼠随机分为2组，每组共5只，尾静脉分别注射B16和B16-hTERT/Luc细胞悬液，细胞数为1×10⁶/只，于肿瘤细胞移植后的0天、7天、14天、21天、28天，腹腔注射荧光素酶底物D-Luciferin(150mg/kg)后，将小鼠置于麻醉箱麻醉，麻醉后的小鼠置于Xenogen小动物活体检测仪中成像检测表达荧光素酶报告基因的肿瘤在体内的生长。

C57BL/6小鼠尾静脉注射B16-hTERT/Luc细胞(1×10⁶/只)后，应用小动物活体成像检测仪观察荧光素酶报告基因标记的肿瘤在体内的生长情况。结果如图32所示，由图可以看出尾静脉注射B16-hTERT/Luc细胞后肿瘤细胞主要集中在肺脏(第0天)，随时间的延长，肺部肿瘤逐渐生长(7-28天)，表明成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型。

为了实现人hTERT和Luc基因在小鼠黑色素瘤B16细胞中的高效表达，本实施例中我们利用pIRES-neo和pIRES-hyg3载体中neo以及hyg基因作为抗性标记物，通过G418和潮霉素B的筛选。在本实施例中，经脂质体介导的稳定转染及抗生素加压筛选获得了能够稳定共表达hTERT和Luc基因的B16单克隆细胞株，将该细胞株通过尾静脉注射的方式接种雄性C57BL/6小鼠，成功建立了小鼠肿瘤肺转移模型，并通过活体成像技术实时监测小鼠肺部肿瘤生长情况。该检测方式与传统的解剖学检测相比，具有以下优点：1、数据准确、客观，易于量化后进行统计学分析；2、可以对实验对象进行长时间的无创性跟踪分析，符合动物福利的要求；3、避免分阶段处死动物获得实验数据，降低了实验成本。

综上所述，我们运用基因工程方法成功构建了稳定表达hTERT和Luc基因的小鼠黑色素瘤B16单克隆细胞株,利用该细胞株建立了小鼠肿瘤肺转移模型，并通过活体成像技术检测小鼠肺部肿瘤生长。为进一步研究以hTERT为靶抗原构建的抗肿瘤免疫治疗功能实验提供了良好的细胞模型与动物模型。

实施例5、以hTERT为靶点的肿瘤治疗性腺病毒疫苗抑瘤功能研究

在本实施例中，我们将前期构建的以hTERT为靶点的新型肿瘤治疗性疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB通过肌肉内注射的的方式免疫C57BL/6小鼠，通过对免疫后相关免疫学指标及小鼠肿瘤形态学的检测，评价Ad5F11p-eTERTFcGB治疗性疫苗在小鼠体内抑制皮下肿瘤及肺部转移肿瘤的效果并探讨其发挥作用可能的免疫学机制。

一、肿瘤生长形态学观察

1、实验动物分组

实验设计方案：完全随机化分组设计；随机化方法：按照体重从小到大进行编号，完全随机化分组；实验分组：雄性6-8周龄的C57BL/6小鼠随机分为3组，每组15只，5只进行生存期观察、5只进行肿瘤生长形态学观察及免疫学检测，5只为肺转移模型；A组Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒组；B组为Ad5F11p空载体对照组；C组为生理盐水组。

2、C57BL/6小鼠的免疫策略

免疫策略如图33所示，C57BL/6小鼠在进行皮下接种B16-hTERT/Luc肿瘤细胞前两周进行初次免疫，免疫方法采用股四头肌肌肉注射的方式，Ad5F11p及Ad5F11p-eTERTFcGB的免疫剂量均为1×10⁸PFU病毒/只；第二次免疫的当天，每只小鼠右侧背部皮下接种1×10⁵B16-hTERT/Luc肿瘤细胞；第三次免疫在接种肿瘤后的两周进行。

3、肿瘤攻击方案

3.1皮下荷瘤模型

在第二次免疫当天进行移植瘤攻击。收获对数生长期B16-hTERT/Luc细胞，制备单细胞悬液，温PBS洗两次，调整细胞浓度至1×10⁶个/mL，在小鼠右侧背部皮下接种100μL细胞悬液即1×10⁵个细胞/只。

3.2肿瘤肺转移模型

在第二次免疫当天进行移植瘤攻击。收获对数生长期的B16-hTERT/Luc细胞，制备单细胞悬液，温PBS洗两次，调整细胞浓度至1×10⁷个/mL，小鼠尾静脉注射接种100μL细胞悬液即1×10⁶个细胞/只。

4、肿瘤生长形态学观察

观察小鼠背部肿瘤的生长情况。肉眼观察到且刚触及黑色肿瘤结节时，记录各组小鼠的成瘤时间；接着每天测量记录肿瘤的垂直长径及垂直短径，计算肿瘤体积，计算公式如下：

肿瘤体积(mm³)＝0.5×长径×(短径)²；

抑瘤率＝(对照组平均肿瘤体积-治疗组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积；

绘制小鼠皮下移植瘤的生长曲线；记录各组荷瘤小鼠的生存时间。

小鼠肺部转移模型评价：末次免疫后两周，断颈处死小鼠，手术解剖小鼠肺脏，计数小鼠肺部黑色的转移结节，进行数据统计，分析。

4.1免疫小鼠移植瘤形成时间

于第二次免疫的当天，对各组C57BL/6小鼠进行B16-hTERT/Luc皮下接种，肉眼观察到且刚触及黑色肿瘤结节时，记录各组小鼠的成瘤时间。

结果如表15和图34所示，发现Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组的成瘤时间明显晚于空白对照及空载体对照组。

表15各组免疫小鼠皮下移植瘤的成瘤时间

注：^*与对照组比成瘤时间显著性差异(P<0.05)。

4.2皮下肿瘤生长曲线

皮下接种肿瘤细胞后每天测量肿瘤的垂直长径及垂直短径，计算每组小鼠肿瘤的体积，绘制其肿瘤生长曲线。对每次测量的结果进行统计学分析。

各组小鼠皮下肿瘤生长曲线如图35所示，结果生理盐水对照组与Ad5F11p对照组小鼠肿瘤体积不存在显著性差异(P>0.05)；Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组与其它两组之间均存在显著性差异(P<0.05)。

4.3Ad5F11p-eTERTFcGB对皮下移植瘤生长抑制

以皮下接种B16-hTERT/Luc肿瘤细胞后，对皮下肿瘤结节的生长进行观测、记录、分析，以接种肿瘤后30天的肿瘤生长情况计算抑瘤率。

皮下接种肿瘤30天后肿瘤体积统计结果如表16和图36所示，单独的Ad5F11p空载体组与生理盐水组小鼠的肿瘤体积不存在统计学差异(P>0.05)；Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组与Ad5F11p空载体组以及生理盐水组之间均存在统计学差异(P＜0.05)。

根据公式计算各组疫苗对肿瘤的抑制率，计算公式如下：肿瘤抑制率(％)＝(对照组平均肿瘤体积-实验组平均肿瘤体积)/对照组平均肿瘤体积。抑瘤率统计结果如表16所示，接种肿瘤后30天，与生理盐水对照组相比，疫苗组的平均肿瘤体积最小，具有较高的肿瘤抑制率达83％。

表16肿瘤的体积以及肿瘤抑制率

注：*与对照组比肿瘤体积显著性差异(P<0.05)。

4.4Ad5F11p-eTERTFcGB对肺部转移肿瘤的生长抑制

通过尾静脉接种B16-hTERT/Luc肿瘤细胞后，末次免疫后两周，断颈处死小鼠，手术解剖小鼠肺脏，计数小鼠肺部黑色的转移结节，进行数据统计、分析。

末次免疫后两周各组小鼠肺部肿瘤生长情况如图37所示，末次免疫后两周各组肺部肿瘤结节数统计结果如图38所示，结果显示，单独的Ad5F11p空载体组与生理盐水组小鼠的肺脏可见明显黑色肿瘤结节生长，计数肿瘤结节的个数，发现两组数据不存在统计学差异(P>0.05)；Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组小鼠肺脏形态正常，均未见肿瘤结节生长，可以认为在本次实验中Ad5F11p-eTERTFcGB对肺部转移肿瘤的抑制率达到100％。

4.5皮下接种肿瘤小鼠的存活情况

皮下接种B16-hTERT/Luc肿瘤细胞后，各组小鼠的存活情况如图39所示，可以看出，Ad5F11p空载体组与生理盐水组小鼠从接种肿瘤后30天左右开始陆续死亡，平均存活天数分别为36.8±5.5和35.8±4.3天，不存在统计学差异(P>0.05)；

Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组小鼠的生存期明显延长，出现第一只小鼠死亡的时间为接种肿瘤后第42天，并且在接种肿瘤后的60天时，仍旧有两只小鼠保持存活。

二、Ad5F11p-eTERTFcGB诱导抑瘤效应机制研究

通过检测免疫后各组小鼠体内免疫学指标，对本发明DNA疫苗发挥作用可能的机制进行初步的研究。

1、ELISA法检测免疫后小鼠血清中hTERT特异性抗体

每次免疫后的第二天，行小鼠眼眶取血200μL，分离获得血清，-80℃保存备用。应用原核表达纯化的hTERT蛋白包被ELISA板，将小鼠血清检测小鼠血清1：400稀释后，ELISA法检测hTERT抗原特异性的抗体。具体方法如下：

⑴包被酶联板：将纯化的GST-hTERT蛋白用包被缓冲液稀释至10μg/mL，混匀后每孔中加入100μL，4℃冰箱包被12小时；

⑵将包被液甩出，用PBST洗板4次，每次停留60s，最后一次在吸水纸扣干；

⑶每孔加入含5％BSA的封闭液100μL，37℃封闭1h，甩出封闭液，用PBST洗板4次；

⑷用PBS按照1：400稀释小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育抗体2h；

⑸将抗体液甩出，PBST洗板4次；

⑹用PBS按照1：5000比例稀释HRP标记的山羊抗小鼠IgG，每孔加入100μL，37℃孵育抗体1h；

⑺将稀释的二抗甩出，PBST洗板4次；

⑻加入TMB底物显色液100μL，避光37℃孵育30min；加入2M的H₂SO₄终止反应。酶标仪中，检测OD_450nm的吸光度值。

结果如图40所示，显示：第一次免疫后，Ad5F11p-eTERTFcGB、Ad5F11p空载体组与生理盐水组三组小鼠血清hTERT抗原特异性的抗体ELISA检测OD450nm读数并无统计学差异(P>0.05)，从第二次免疫后开始，Ad5F11p-eTERTFcGB组小鼠血清hTERT抗原特异性的抗体ELISA检测OD_450nm读数逐步升高，明显高于Ad5F11p空载体组与生理盐水组(P<0.05)，说明通过Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗的接种免疫，实验组小鼠体内产生了较高浓度的hTERT抗原特异性的抗体。

2、ELISA法检测血清中TH1类细胞因子水平

TH1类细胞因子包括IL-2、IFN-γ、TNF-α等，主要介导细胞免疫反应，在抗肿瘤免疫应答中起着重要的免疫调节作用。末次免疫后两周，对各组小鼠眼球取血分离血清后，ELISA检测小鼠血清中TH1类细胞因子包括IL-2、IFN-γ的含量。按欣博盛生物公司小鼠IL-2/IFN-γ检测试剂盒说明书进行操作，操作步骤如下：

⑴从密封袋中取出板条，加入不同浓度稀释好的标准品(100μL/孔)，并加入待测小鼠血清，按100μL/孔加入到板条中，37℃孵育90min；

⑵配制洗涤工作液，洗板5次，每次1min；

⑶加入生物素化的抗体工作液100μL/孔，37℃孵育60min；

⑷洗板5次，每次1min；

⑸加酶结合物工作液100μL/孔，37℃避光孵育30min；

⑹洗板5次，每次1min；

⑺加入TMB显色底物100μL/孔，37℃避光孵育15min；

⑻加入终止液100μL/孔，测量OD₄₅₀值。

末次免疫后两周，眼球取血后分离血清，检测IL-2的浓度。结果如图41所示，Ad5F11p空载体组与生理盐水组分别为157.6pg/mL和173.4pg/mL，两组间无统计学差异(P>0.05)；Ad5F11p-eTERTFcGB组浓度为598.2pg/mL，与Ad5F11p空载体组与生理盐水组之间均存在统计学差异(P<0.05)。

末次免疫后2周，检测清中IFN-γ的浓度。结果如图42所示，Ad5F11p空载体组与生理盐水组分别为267.4pg/mL和201.1pg/mL，两组间无统计学差异(P>0.05)；Ad5F11p-eTERTFcGB组浓度为1249.1pg/mL，与Ad5F11p空载体组与生理盐水组之间均存在统计学差异(P<0.05)。

3、ELISPOT法检测特异分泌IFN-γ的脾细胞

将hTERT抗原加入到实验孔作为刺激物对分离的小鼠的脾淋巴细胞进行刺激，分泌TH1类细胞因子IFN-γ并被包被在板上的IFN-γ抗体捕获，通过酶联显色变成斑点，而对hTERT没有反应的细胞则不会受到刺激释放细胞因子。

3.1分离小鼠脾细胞

⑴在末次免疫2周后，断颈处死小鼠，75％乙醇中浸泡5min后转入超净台内操作；

⑵无菌条件下取出脾脏，剪碎脾脏后放入200目细胞筛中，用研磨棒尽量将脾研磨均匀；

⑶用无血清的RPMI1640培养基将细胞筛中的淋巴细胞冲到无菌培养皿中；

⑷离心管中加入3ml小鼠淋巴细胞分离液，将脾细胞悬液缓慢滴加在分离液上方，室温下2000rpm离心30min；

⑸离心后吸取中层白膜，加入RPMI1640培养基洗淋巴细胞2次；进行计数后可进行下游实验。

3.2ELISPOT检测

⑴接种细胞前一天IFN-γ抗体包被ELISPOT板：

a.准备ELISPOT板条，每孔加入50μL35％的酒精，1min后弃去，用无菌水洗涤5次，拍干；

b.用灭菌的PBS稀释包被抗体，IFN-γ抗体(AN18，购自Mabtech公司)至15μg/mL；

c.加入100μl稀释好抗体到各个实验孔，4℃包被过夜12小时；

⑵接种细胞，加入刺激物并培养；

a.按方法2.6.2.1去小鼠脾脏，收获计数好的脾细胞悬液待用；

b.取出4℃包被过夜的板条，拍去板内多余的液体，无菌PBS洗涤5次，吸水纸上拍干，每孔加入200μL RPMI1640的完全培养基，室温下孵育30min，将包被板活化；

c.弃去液体，加入脾细胞悬液，实验组加入细胞数为4×10⁵个/孔+hTERT蛋白1μg。

d.阳性对照孔加入细胞数为1×10⁵个/孔+10μL PMA。阴性对照加入细胞数为1×10⁵个/孔；

e.加样完成后，将ELISPOT板放入37℃、CO₂培养箱饱和湿度培养24-48h。

⑶ELISPOT板斑点显色：

a.弃去板内细胞，用PBS洗板5次；

b.用0.5％血清的PBS将生物素标记抗体R4-6A2稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，室温孵育2h；

c.用PBS洗板5次，用0.5％血清的PBS将ALP标记亲和素抗体按1：1000稀释，每孔100μL，室温孵育1h；

d.PBS洗板5次，避光每孔加入底物BCIP100μL，孵育15min直至斑点显色；

e.用清水冲洗各个反应孔，终止后晾干，避光干燥保存；

f.ELISPOT板置于Biosys Bioreader读板机内，记录斑点的各种参数，分析。

检测结果如图43A(A：阳性对照；B：阴性对照；C-D：实验组；1-2：生理盐水对照组；3-4：Ad5F11p对照组；5-6：Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组)和43B所示，Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组免疫小鼠的脾细胞中均能检测到hTERT特异性淋巴细胞的分泌IFN-γ，每1×10⁶个脾淋巴细胞产生的阳性斑点数为581±62个；而生理盐水对照组与Ad5F11p对照组分别为40±11和45±15，两者之间不存在显著性差异(p>0.05)。

4、小鼠脾细胞CTL杀伤实验

末次免疫后2周，断颈处死免疫小鼠，无菌获取免疫小鼠脾细胞，加入hTERT蛋白作为刺激物，含10％胎牛血清RPMI1640培养基中加入鼠IL-2(20IU/mL)，培养5天作为效应细胞，以B16-hTERT/Luc细胞作为靶细胞。效靶比(E/T)设定为40:1、20:1和10:1，Promega公司Non-Radioactive Cytotoxicity Assay测定各组的OD490nm吸收值，根据公式计算各组的CTL杀伤效果。

4.1效应细胞的制备

无菌获取免疫小鼠脾细胞悬液，加入了表达纯化的hTERT作为刺激物，10％胎牛血清的RPMI1640中加入鼠IL-2(20IU/mL)培养4-5d，收获脾淋巴细胞计数后作为效应细胞。

4.2靶细胞的制备

B16-hTERT/Luc制备成细胞悬液，计数后作为靶细胞。

4.3乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测免疫小鼠的CTL杀伤活性

操作按照Promega公司Non-Radioactive Cytotoxicity Assay说明书进行，具体步骤如下：

a.LDH法检测时各实验孔的设计如图44所示，实验孔中每孔加入50μLB16-hTERT/Luc细胞悬液共0.5×10⁴个靶细胞/孔；

b.根据40:1、20:1、10:1的效靶比加入效应细胞，每组设4个复孔。同时设立靶细胞自发释放孔、靶细胞最大释放孔、培养基空白对照孔、总体积校正对照孔及效应细胞自发释放孔；

c.培养板于室温250g离心4min，然后置于37℃、5％CO₂、饱和湿度下孵育4h；

d.结束前45min，于靶细胞最大释放孔及体积校正孔中加入裂解液10μL；

e.结束后，室温250g离心4min，吸取每孔上清50μL加入到酶标板上对应孔中，加入各50μL底物液，室温避光反应30min后，再加入50μL终止液。测量波长为490nm的OD值。

实验结果如表17和图45所示，Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组脾细胞在效靶比为40:1、20:1和10:1时对B16-hTERT/Luc细胞特异性的杀伤效率分别为61.4％、45.8％和35.3％，都要明显强于Ad5F11p空载体组与生理盐水组，结果证实经过腺病毒疫苗Ad5F11p-eTERTFcGB免疫的小鼠体内产生了更强的hTERT抗原特异性细胞免疫反应。

表17不同效靶比免疫小鼠脾细胞杀伤活性

5、外周血淋巴细胞亚群及肿瘤浸润淋巴细胞检测

5.1外周血淋巴细胞亚群检测

针对小鼠T淋巴细胞表面的CD4和CD8分子不同表型，及NK细胞表面的NK1.1标志，分别利用E标记Anti-Mouse NK1.1和FITC标记的Anti-Mouse CD4，PE标记的Anti-MouseCD8a抗体对分离的脾细胞进行染色，通过流式细胞术检测小鼠脾脏中的免疫细胞亚群。具体方法如下：

⑴取小鼠脾脏，制备脾脏单细胞悬液，离心后弃去上清，用2mL PBS重悬细胞后分成两管；

⑵室温下1500rpm离心5min，收集细胞并用PE标记Anti-Mouse NK1.1和FITC标记的Anti-Mouse CD4、PE标记的Anti-Mouse CD8a抗体，4℃孵育1h；

⑶5mL PBS洗细胞两次后用500μL PBS重悬细胞，进行流式细胞术检测。

CD4+T与CD8+T细胞比例的流式细胞仪检测结果如图46(A:生理盐水对照组；B:Ad5F11p对照组；C:Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组)所示，可以发现，与Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组相比，生理盐水组及Ad5F11p组小鼠的脾淋巴细胞中CD4+T所占的比例明显下降，表面经肿瘤冲击后，对照组的小鼠CD4+T亚群降低明显，出现CD4+T与CD8+T比例倒置，机体处于免疫抑制状态；Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗免疫过的小鼠，CD4+T与CD8+T比例分别为13.93％和17.47％，机体的免疫状态未受到明显抑制。

NK细胞比例的流式细胞仪检测结果如图47(A:生理盐水对照组；B:Ad5F11p对照组；C:Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组)所示，可以发现，与Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组中NK细胞占7.03％，明显高于生理盐水组及Ad5F11p组小鼠的3.61％和3.85％，NK细胞在抗肿瘤免疫方面是一类重要的免疫细胞亚群。NK细胞利用细胞毒活性直接杀伤靶细胞，利用抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用，分泌Th-1型细胞因子，通过与DC细胞的交联促进效应T细胞介导的抗肿瘤免疫应答。

5.2免疫荧光检测肿瘤中浸润CD8+T淋巴细胞

肿瘤组织中常有多种免疫细胞浸润，包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞等。其中CD8+T细胞为最主要的抗肿瘤效应细胞。取末次免疫后两周的小鼠，断颈处死后，解剖小鼠取材肿瘤，经固定、脱水、包埋、制备石蜡切片，利用间接免疫荧光技术检测小鼠肺转移灶石蜡切片中CD8+T细胞和NK细胞的浸润情况。具体方法如下：

⑴石蜡切片置于烘箱内连续烤30min至3h；

⑵石蜡切片脱腊直至水化：二甲苯15min×3次、100％乙醇10min×2次、95％乙醇5min、90％乙醇5min、80％乙醇5min、70％乙醇5min、ddH₂O2min、PBS2min×2次；

⑶热修复：热修复盒中倒入80mL0.01M pH＝6.0枸缘酸钠缓冲液。放入切片，微波热修复法95℃-98℃间10min/高火3min，停1min，换中火5min，停1min，再次中火3min，后自然冷却到室温；

⑷PBS洗3次，每次约5min；

⑸滴加信号增强剂，室温反应30min；

⑹PBS洗3次，每次约5min；

⑺滴加山羊抗小鼠CD8-α抗体(1:50，购自Santa Cruz公司)用于检测肿瘤侵润的CD8+T细胞，4℃、12小时)；

⑻第二天，室温下放置30min后，PBS洗3次，每次约10min；

⑼滴加Alexa Fluor488绿光标记的兔抗山羊IgG(1:600)，37℃、30min，PBS洗3次，每次约10min；

⑽滴加DAPI对细胞核进行染色，室温下孵育30min，PBS洗3次，每次10min；

⑾吸去多余水分，封片，共聚焦显微镜下进行观察，分析和照相。

肿瘤浸润CD8+T细胞间接免疫荧光检测结果如图48(A：生理盐水对照组；B：Ad5F11p对照组；C：Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组)所示，在对照组中几乎检测不到CD8+T细胞，而在Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组中则检测到CD8+T细胞。本实验结果说明，Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒组CD8+T局部肿瘤中的浸润增加，利于CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中发挥作用。

6、HE染色检测小鼠肿瘤组织及睾丸组织

选择末次免疫后两周小鼠，小鼠脱颈处死后，手术摘取肿瘤组织及有hTERT少量表达的睾丸组织，利用苏木素-伊红(HE)染色法对免疫小鼠组织石蜡切片进行染色，观察比较肿瘤组织形态及睾丸组织中是否存在炎症细胞浸润和自身组织损害。

肿瘤组织病理切片观察(HE染色)结果如图49(A:生理盐水对照组；B:Ad5F11p对照组；C:Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组)所示，发现生理盐水组及Ad5F11p组小鼠肿瘤组织器官的病理切片显示围绕血管核心生长的肿瘤结节，未见明显组织坏死及淋巴细胞浸润；Ad5F11p-eTERTFcGB腺病毒疫苗组中肿瘤组织成片状坏死，可见明显炎症反应及可疑淋巴细胞浸润。

睾丸组织病理切片观察(HE染色)结果如图50(A:生理盐水对照组；B:Ad5F11p对照组；C:Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗组)所示，发现各组小鼠睾丸组织不存在差别，未见明显组织破坏及局部免疫细胞聚集。说明疫苗在体内没有引起自身免疫性的疾病，Ad5F11p-eTERTFcGB疫苗在小鼠体内应用是安全的。

Claims (9)

1.一种以hTERT为靶点构建的肿瘤治疗性腺病毒载体，是先将hTERT复合基因sig-eTERT-IgGFc-GPI-IRES-GM/CSF-B7.1(简称eTERTFcGB)插入pShuttle-CMV穿梭载体中巨细胞病毒(CMV)启动子的下游，得到携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组穿梭载体，再将该重组穿梭载体与病毒骨架载体AdEasy-1/F11p共转化细菌后得到的携带有hTERT复合基因eTERTFcGB的重组腺病毒载体。

2.根据权利要求1所述的以hTERT为靶点构建的肿瘤治疗性腺病毒载体，其特征在于：在所述重组穿梭载体中，所述hTERT复合基因eTERTFcGB由eTERTFc融合抗原基因、GM/CSF基因(GenBank号：NM-000758)和B7.1基因(GenBank号：NM-005191)组成；

所述eTERTFc融合抗原基因由人hTERT基因1609-2628位碱基的基因片段(GenBank号：NM_198253)、人IgG Fc段基因(GenBank号：Z17370)和糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定肽基因(GenBank号：XM676434)组成，eTERTFc融合抗原基因核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述eTERTFc融合抗原基因与GM/CSF基因和B7.1基因通过IRES序列相连，所述hTERT复合基因eTERTFcGB的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

3.根据权利要求1或2所述的以hTERT为靶点构建的肿瘤治疗性腺病毒载体，其特征在于：所述携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组穿梭载体命名为pShuttle-CMV-eTERTFcGB，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。

4.根据权利要求1或2或3所述的以hTERT为靶点构建的肿瘤治疗性腺病毒载体，其特征在于：所述携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组腺病毒载体命名为AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

5.一种共表达eTERTFc融合抗原、GM/CSF及B7.1的重组腺病毒，是将权利要求1-4任一所述携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组腺病毒载体转染包装细胞—人胚肾293细胞(HEK293)得到的。

6.根据权利要求5所述的重组腺病毒，其特征在于：所述携带hTERT复合基因eTERTFcGB的重组腺病毒载体可通过脂质体介导法转染人胚肾293细胞。

7.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于：转染权利要求4所述重组腺病毒载体AdEasy-1/F11p-eTERTFcGB的重组腺病毒命名为Ad5F11p-eTERTFcGB。

8.权利要求1-4任一所述以hTERT为靶点构建的肿瘤治疗性腺病毒载体在制备肿瘤治疗性疫苗或肿瘤治疗性药物中的应用。

9.权利要求5-6任一所述共表达eTERTFc融合抗原、GM/CSF及B7.1的重组腺病毒在制备肿瘤治疗性疫苗或肿瘤治疗性药物中的应用。