CN110128550A - 一种新型的同时阻断免疫检查点pd-l1和tigit的复制型溶瘤腺病毒和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型的同时阻断免疫检查点PD‑L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒和应用。本发明的一种同时阻断免疫检查点PD‑L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白的两端分别为结合PD‑L1的PD1胞外区和结合TIGIT的PVR胞外区，PD1和PVR片段之间通过linker序列连接，可溶性融合蛋白的两端分别结合PD‑L1和TIGIT之后可以同时阻断免疫检查点PD‑L1和TIGIT。实验表明，本发明复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR能显著地阻断免疫检查点与活化抗肿瘤免疫作用，有显著的抗肿瘤活性，具有非常高的开发抗肿瘤药物的前景和价值。

Description

一种新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤 腺病毒和应用

技术领域

本发明涉及溶瘤病毒治疗和肿瘤免疫检查点阻断治疗领域，具体涉及一种新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒和应用。

背景技术

癌症是对人类生命健康危害最大的疾病之一，全世界每年都有大于8百万人死于癌症，而新增的癌症患者每年还在递增。目前所有的传统肿瘤治疗方法包括手术和放化疗等，都存在局限性，市场急需新的行之有效的治疗方法。

随着不断出现的令人振奋的临床研究结果，抗肿瘤免疫治疗给肿瘤患者带来了希望。然而肿瘤在发生发展过程中，不仅通过隐藏自己(缺乏被免疫细胞识别的抗原分子)逃避免疫攻击，还通过多种途径主动抑制抗肿瘤的免疫效应细胞，包括启动免疫检查点等诸多途径使免疫细胞失活，达到逃避免疫识别和免疫清除的目的。近年来发现的多个免疫检查点信号通路，就是肿瘤常用的逃避免疫攻击的机制。PD-1/PD-L1、PVR/TIGIT(T cellITIM domain)是两个关键的调控负性调控通路，显著抑制T细胞的活化并使得T细胞进入失能状态。至今已有多个阻断免疫检查点的抗体治疗已经被批准用于临床肿瘤治疗的药物。

肿瘤细胞可以通过自身或通过不同机制上调其它细胞高表达PD-L1，来激活抗肿瘤效应淋巴细胞上的负性调控分子PD-1从而劫持PD-1/PD-L1通路达到逃避免疫监视和免疫清除的目的。而阻断PD-1/PD-L1通路也被证实在部分病人中有效。

TIGIT(T cell immunoglobulin and immunoreceptortyrosinebasedinhibitory motif[ITIM]domain)是近年来发现的另外一个表达在淋巴细胞上的免疫检查点调控分子，参与对活化的T细胞及NK细胞的负性调控。TIGIT作为免疫检查点分子对T细胞的调控主要通过以下几种方式实现：(1)T细胞通过TIGIT分子与肿瘤或者APC细胞膜上的PVR(CD155)分子特异性结合，通过跨膜蛋白PVR转导调控信号，促进肿瘤细胞或者APC细胞高表达IL-10、TGF-beta1，下调IL-12的表达，参与免疫抑制；(2)T细胞上的TIGIT分子与自身细胞膜上的免疫共刺激分子CD226结合，阻断CD226分子形成同源二聚体，抑制CD226转导免疫共刺激信号，间接抑制免疫活化；(3)PVR作为免疫共刺激分子CD226的配体，与TIGIT的亲和性远远大于CD226，因此，TIGIT分子能够通过竞争性地结合PVR，来阻断PVR/CD226免疫共刺激通路，参与免疫抑制调控。

从近期的研究文献报告，单纯阻断效应淋巴细胞的PD-1或TIGIT通路，并不能有效地治疗肿瘤。因此，我们假设，多个免疫检查点通路的联合阻断，如同时阻断PD-1/PD-L1和TIGIT(从而恢复CD226的免疫共刺激通路)，是一个巧妙而且必要的抗肿瘤免疫治疗策略。

然而，阻断免疫检查点的抗肿瘤治疗也遇到了一些亟需解决的问题。首先，阻断免疫检查点的免疫治疗对肿瘤类型和肿瘤患者的普适性(有效率)有待提高。其次，临床研究发现，在一些肿瘤患者中，系统性阻断免疫检查点存在“脱靶”而“误伤”正常组织，如心肌炎等副作用。进一步的临床研究数据表明，肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)的多少、肿瘤局部的免疫活化状态等，是靶向免疫检查点治疗能否显效的重要预测指标。CD8+T细胞介导肿瘤清除过程中，I型干扰素(IFNα/β)通路的活化是靶向免疫检查点治疗的重要事件。因此，如何在肿瘤局部有效诱导I型干扰素介导的免疫活化、增强肿瘤微环境免疫细胞的浸润，可以使肿瘤对靶向免疫检查点的治疗更加敏感，这也许是解决免疫检查点治疗普适性(有效率)不高的有效手段之一。然而，如何解决免疫检查点治疗“脱靶”效应这一问题呢？

病毒作为外来侵入颗粒，能够有效激活机体的天然免疫和适应性免疫。随着重组溶瘤单疱疹病毒T-Vec在2015年底被FDA批准上市，溶瘤病毒介导的抗肿瘤免疫治疗受到越来越多的关注。我们设想，溶瘤病毒免疫疗法是不是可以使肿瘤对靶向免疫检查点的治疗更加敏感，从而解决免疫检查点治疗普适性(有效率)不高这一问题(免疫检查点治疗遇到的第1个问题)。

另外，利用溶瘤病毒在肿瘤细胞具有选择性复制的优势，使其在肿瘤微环境表达调控免疫检查点的相关分子，在肿瘤局部产生高效免疫激活，从而把免疫活化局限在肿瘤的局部微环境，避免阻断免疫检查点“脱靶”而造成的“误伤”(免疫检查点治疗遇到的第2个问题)。

发明内容

本发明的目的是提供一种更有效打破肿瘤免疫逃逸的新型溶瘤腺病毒，能够新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒和应用。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：本发明的一种同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白，所述的可溶性融合蛋白的两端分别为结合PD-L1的PD1胞外区和结合TIGIT的PVR胞外区，PD1和PVR之间通过linker序列连接，可溶性融合蛋白的两端分别结合PD-L1和TIGIT之后可以同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT；可溶性融合蛋白的PVR端结合CD226之后，可以激活免疫共刺激通路，活化抗肿瘤免疫。

进一步地，所述的可溶性融合蛋白为sPD1PVR，sPD1PVR的蛋白序列如序列表SEQID NO:1所示。

本发明所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。

本发明所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。

本发明所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、肝腹水癌、黑色素瘤或乳腺癌。

本发明的一种新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒，所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性融合蛋白，所述可溶性融合蛋白的两端分别为结合PD-L1的PD1胞外区和结合TIGIT的PVR胞外区，PD1和PVR之间通过linker序列连接，可溶性融合蛋白的两端分别结合PD-L1和TIGIT之后可以同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT；可溶性融合蛋白的PVR端结合CD226之后，可以激活免疫共刺激通路，活化抗肿瘤免疫。

进一步地，所述可溶性融合蛋白为sPD1PVR，sPD1PVR的蛋白序列如序列表SEQ IDNO:1所示。

本发明所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒，所述的复制型溶瘤腺病毒能够溶瘤。

本发明所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。

本发明所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。

本发明所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步地，所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或乳腺癌。

本发明一种新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒的构建方法，通过质粒构建、病毒拯救与病毒扩增三个步骤来实现。

有益效果：本发明复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR具有显著的活化抗肿瘤免疫作用，诱导IFN-γ的高表达，显著抑制肿瘤生长、延长生存期，具有极显著的抗肿瘤作用，是绝佳的用来制备抗肿瘤药物的原材料，也具有预料不到的效果。

与现有技术相比，本发明具有如下优点:

(1)Ad5sPD1PVR所表达的可溶性融合蛋白sPD1PVR的PD1端能与肿瘤细胞上的PD-L1结合，从而阻止了肿瘤或APC细胞上PD-L1与免疫细胞表达的PD1结合，阻断免疫检查点PD-1/PD-L1介导的负性调控，起到活化增强抗肿瘤免疫的作用。

(2)Ad5sPD1PVR所表达的可溶性融合蛋白sPD1PVR的PVR端与T细胞上的负性免疫调控分子TIGIT结合，抑制TIGIT作为免疫检查点所介导的多个方面的免疫抑制作用；阻断其负性调控肿瘤细胞转移及促进肿瘤细胞分泌抑制性细胞因子IL-10、TGF-beta1等的作用；阻断其竞争性抑制共刺激通路CD226的作用等。而且sPD1PVR的PVR端、加上因TIGIT被sPD1PVR封闭而空出来的肿瘤及APC细胞上的PVR，可以与CD226结合，直接激活免疫共刺激通路，起到活化抗肿瘤免疫的作用。因此，可溶性融合蛋白sPD1PVR具有协同活化免疫的作用，可以有效克服单独阻断PD-1/PD-L1或者TIGIT所面临的问题。

(3)复制型的Ad5sPD1PVR能够诱导肿瘤局部I型干扰素介导的免疫活化，及诱导淋巴细胞趋化因子的产生，从而增强肿瘤免疫浸润。两方面共同作用，使得sPD1PVR阻断免疫检查点PD-1/PD-L1和TIGIT的抗肿瘤免疫作用进一步放大，有望解决对肿瘤治疗人群普适性(有效率)不高的问题(免疫检查点治疗遇到的第1个问题)。

(4)另外，Ad5sPD1PVR可以通过对HCC细胞直接的“溶瘤”作用，诱导产生免疫原性细胞死亡(ICD)，从而趋化、活化免疫细胞、表达“新”抗原，激活适应性的抗肿瘤免疫应答。

(5)最后，Ad5sPD1PVR作为溶瘤病毒在HCC细胞内选择性复制，并表达可溶性融合蛋白，使得肿瘤微环境中的sPD1PVR浓度大大升高，并发挥肿瘤“靶向”效应，从而避免系统性免疫检查点阻断所带来的“脱靶”损伤(免疫检查点治疗遇到的第2个问题)。

(6)本发明的新型的可以阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，能够刺激IFN-γ高表达。动物模型显示，新型的可以阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR具有很强的抗肿瘤的作用，可以用来制备抗肿瘤药物。

(7)新型的阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR的设计和构建方法，成功获得了一株新型的可以阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR，该病毒可以在肿瘤细胞内和肿瘤部位特异性复制，并且能够高表达可溶性融合蛋白sPD1PVR，可溶性融合蛋白sPD1PVR能够分泌到细胞外，在细胞外发挥阻断PD-L1和TIGIT介导免疫检查点，激活CD226免疫共刺激通路，进而起到活化免疫的生物学和免疫学功能。进一步的本发明的新型的可以阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，能够刺激IFN-γ高表达。动物模型显示，新型的可以阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR具有很强的抗肿瘤的作用，可以用来制备抗肿瘤药物。

附图说明

下面将结合附图进一步说明，附图中：

图1为本发明的表达可溶性融合蛋白sPD1PVR的重组溶瘤腺病毒的构建(A)重组溶瘤腺病毒Ad5con、Ad5sPD1PVR的基因结构原理图。(B-C)使用MOI＝20的Ad5con、Ad5sPD1PVR分别感染H22细胞，48h后收集被感染细胞的上清，使用MOI＝10的Ad5con、Ad5sPD1PVR分别感染B16/F10细胞，通过western blot的方法检测可溶性融合蛋白sPD1PVR的表达与分泌。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图2为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR的复制能力(A-F)分别用Ad5con和Ad5sPD1PVR感染以下细胞：肝癌细胞株Hepa1-6(MOI＝5)、H22(MOI＝20)、LM3(MOI＝2)，黑色素瘤细胞株B16/F10(MOI＝10)、乳腺癌细胞株4T1(MOI＝10)和肺癌细胞株LLC1(MOI＝10)，在12，24，36，48，60，72h收取细胞，提取病毒基因组DNA，通过Q-PCR检测Ad5的拷贝数。用MTT检测细胞活率。数据代表三次独立性重复实验数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图3为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR的溶瘤能力(A-F)分别用Ad5con和Ad5sPD1PVR感染以下细胞：肝癌细胞株Hepa1-6(MOI＝5)、H22(MOI＝20)、LM3(MOI＝2)，黑色素瘤细胞株B16/F10(MOI＝10)、乳腺癌细胞株4T1(MOI＝10)和肺癌细胞株LLC1(MOI＝10)，在12，24，36，48，60，72h收取细胞，用MTT检测细胞活率。数据代表三次独立性重复实验数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图4为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR在肝癌腹水瘤H22中活化免疫作用(A)在H22腹水瘤小鼠模型中评估Ad5sPD1PVR的免疫活化作用，实验方案图如图所示。C57BL/6腹腔接种H22细胞5×10⁶cells/只，待腹水出现后，随机分组，每组10只，分别在第8、12天抽取腹水后腹腔注射5×10⁸pfu Ad5con或Ad5sPD1PVR，第16天取腹水细胞，用ELISpot检测活化免疫细胞水平。(B)H22腹水瘤模型ELISpot检测结果。(C)H22腹水瘤模型ELISpot实验结果统计。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图5为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR在实体肿瘤黑色素瘤B16/F10中活化免疫作用(A)通过黑色素瘤B16/F10皮下瘤模型评估Ad5sPD1PVR的免疫活化作用，实验方案图如图所示。C57BL/6右侧皮下接种B16/F10细胞2×10⁶cells/只，出现肿瘤后，瘤内注射5×10⁸pfu AD5con或Ad5sPD1PVR，在第13天时，处死小鼠，分离肿瘤制成单细胞悬液，ELISpot检测免疫活化。(B)B16/F10实体瘤模型ELISpot检测结果。(C)B16/F10实体瘤模型ELISpot实验结果统计。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图6为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR的体内抗肿瘤作用(B16F10黑色素实体肿瘤模型)(A)B16/F10实体瘤体内实验方案图，选取6-8周龄C57/BL6雄性小鼠，皮下接种B16/F10细胞2×10⁶cells/只，待第8天小鼠长出皮下瘤，随机分组，每组10只，分别在第8、9、10、11天皮下多位点注射Ad5con和Ad5sPD1PVR 5×10⁸pfu/只，监测小鼠肿瘤生长。(B)B16/F10肿瘤模型小鼠肿瘤生长曲线。(C)B16/F10肿瘤模型小鼠体重。(D)B16/F10肿瘤模型小鼠生存。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图7为本发明的Ad5sPD1PVR病毒抗肿瘤的效果(4T1乳腺癌实体肿瘤模型)(A)4T1实体瘤体内实验方案图，选取6-8周龄BALB/c雌性小鼠，皮下接种4T1细胞5×10⁴cells/只，待第8天小鼠长出皮下瘤，随机分组，每组10只，分别在第8、9、10、11天皮下多位点注射Ad5con和Ad5sPD1PVR 5×10⁸pfu/只，监测小鼠肿瘤生长。(B)4T1肿瘤模型小鼠肿瘤生长曲线。(C)4T1肿瘤模型小鼠体重。(D)4T1肿瘤模型小鼠生存。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图8为本发明的Ad5sPD1PVR病毒抗肿瘤的效果(H22肝癌腹水肿瘤模型)(A)H22腹水瘤体内实验方案图，选取6-8周龄C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射H22细胞5×10⁶cells/只，第8天分组，每组10只，第8、12、16分别腹腔注射Ad5con、Ad5sPD1PVR 5×10⁸pfu/只，监测小鼠生存，直至小鼠死亡。(B)H22腹水瘤模型小鼠生存曲线。(C)H22腹水瘤模型三次独立性重复实验。(D)H22腹水瘤模型小鼠生存比例。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图9为本发明的Ad5sPD1PVR病毒在肿瘤局部的复制和融合蛋白的表达(A)H22腹水瘤模型实验方案图，选取6-8周龄C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射H22细胞5×10⁶cells/只，待第8天小鼠全部长出腹水，随机分组，分别在第8、12、16天先抽取腹水后腹腔注射Ad5con、Ad5sPD1PVR 5×10⁸pfu/只，在第16天抽取腹水，流式检测淋巴细胞。(B)H22腹水瘤模型小鼠生存曲线。(C)第12天Ad5病毒拷贝数。(D)第16天Ad5病毒拷贝数。(E)第12天腹水中IFN-γ水平。(F)第16天腹水中IFN-γ水平。(G)第12天腹水中可溶性PD1表达量。(H)第16天腹水中可溶性PD1表达量。(I)第12天腹水中可溶性PVR表达量。(J)第16天腹水中可溶性PVR表达量。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图10为本发明的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR的体内抗肿瘤机制(A)H22腹水瘤实验方案图。选取6-8周龄C57BL/6雄性小鼠，腹腔注射H22细胞5×10⁶cells/只，待第8天小鼠长出腹水，随机分组，每组10只，分别在第8、12、16天腹腔注射5×108pfu/只，且在第8、12、16天腹腔注射400μg/只anti-CD8a和anti-NK1.1抗体分别清除小鼠体内CD8+T细胞和NK细胞，监测小鼠生存。(B)H22腹水瘤抗体清除实验小鼠生存曲线。(C)第16天小鼠外周血CD8+T细胞和NK细胞的流式图。(D)第12天小鼠腹水中病毒拷贝数。(E)第16天小鼠腹水中病毒拷贝数。(F)第12天小鼠腹水中PD1的表达水平。(G)第16天小鼠腹水中PD1的表达水平。(H)第12天小鼠腹水中PVR的表达水平。(I)第16天小鼠腹水中PVR的表达水平。(J)第12天小鼠腹水中IFN-γ的表达水平。(K)第16天小鼠腹水中IFN-γ的表达水平。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图11为本发明的可溶性融合蛋白sPD1PVR的抗肿瘤效果(Hepa1-6肝癌实体瘤模型)(A)在Hepa1-6肝癌实体瘤模型中评估可溶性融合蛋白sPD1PVR的抗肿瘤效果，实验方案如图所示。C57BL/6左侧和右侧皮下接种5×10⁶B16/F10，待肿瘤形成后，腹腔注射可溶性融合蛋白sPD1PVR 5mg/kg/周，实时监测肿瘤大小、小鼠生存时间及体重。(B)Hepa1-6肝癌实体瘤模型小鼠肿瘤生长曲线。(C)Hepa1-6肝癌实体瘤模型小鼠体重。数据代表三次独立性重复实验。数据表示为Mean±SD,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

具体实施方式

通过以下实施例进一步详细说明本发明，但应注意本发明的范围并不受这些实施例的任何限制。

实施例1

新型复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR的构建、制备、抗肿瘤免疫活化评估和抗肿瘤作用评价

1.实验材料和方法

1.1实验材料和仪器

1.1.1实验细胞系

人胚肾细胞株293T、人肝癌细胞株LM3、小鼠黑色素瘤细胞株B16/F10、小鼠肝癌细胞株Hepa1-6、小鼠肝癌细胞株H22、小鼠乳腺癌细胞株4T1、小鼠肺癌细胞株LLC1，均使用含10％胎牛血清，100U/I青霉素和1mg/ml链霉素的高糖DMEM培养基培养于37℃、5％CO₂的培养箱中。

1.2实验仪器

生物安全柜( III advance，Class II Biological SafetyCabinet，The Baker Company)，二氧化碳培养箱(FORMA SERIES II WATER JACKETCO₂incubator，Thermo)，低温离心机(HERAEUS MEGAFUGE 1.0R，Thermo)，垂直电泳槽(BIO-RAD)，电泳仪(BIO-RAD)，半干转-转膜仪(BIO-RAD)，免疫印迹曝光系统(Alpha Innotech)，PCR仪(PCR Thermal Cycler Dice，TaKaRa)，实时定量PCR仪及分析软件(ABI384，SequenceDetection Software，Version 1.3.1)，酶标仪(VERSA max microplate reader)，整套移液器(eppendorf和RAININ)，细胞计数仪(Countstar Automated cell counter，Inno-Alliance Biotech Inc.，Wilmington，USA)，流式细胞仪(FACSCalibur，Becton，Dickinsonand Company，USA)，FlowJosoftware(Version 7.6.5，Tree Star Inc，Ashland，Oregon)，微孔板振荡器(QiLinBeiEr)，核酸纯度浓度检测仪(Biophotometer plus，eppendorf)，数显恒温水浴锅(国华电器)。

1.1.3主要实验试剂及耗材

引物均由金斯瑞公司合成。肿瘤细胞培养所需的DMEM高糖培养基，双抗，血清均购自Invitrogen(上海)公司。定量RT-PCR试剂Faststart Universal SYBR Green Master(Roche，04913914001)。Western Blot所需试剂耗材：蛋白酶抑制剂(Roche，11873580001)，细胞裂解液(碧云天：P0013)，PVDF膜(Roche，03010040001)，WB Immobilon ECL发光液(Millipore，WBKLS0500)，一抗稀释液(碧云天，P0023A)，HRP标记的二抗(Multisciences，GAR007and GAM007，1:5000稀释)，其余所需试剂均为国产分析纯，购自南京大学化学化工学院。台盼蓝(碧云天，C0011)，Opti-MEM购自Invitrogen(上海)公司。Western Blot抗体:anti-His(金斯瑞，MB001，1:5000稀释)。

1.2实验方法

1.2.1 Ad5 sPD1PVR病毒构建

1.2.1.1可溶性蛋白sPD1PVR的基因克隆以及携载sPD1PVR基因的腺病毒穿梭质粒的构建

小鼠PD1和PVR都属于膜蛋白，其结构依次是:N端信号肽-胞外区-跨膜区-胞内区C端。PD1与PVR分别与PD-L1和TIGIT结合的功能单位是胞外区，sPD1-PVR将PD1和PVR的胞外区进行融合，中间使用连接肽GGGSGGGSGGGS连接，保留PD1的N端信号肽区域(见图1)；

可溶性蛋白sPD1PVR的基因克隆：分别设计合成引物PD1-F、PD1-R、PVR-F、PVR-R，使用PD1-F和PD1-R引物，以小鼠脾脏cDNA为模板扩增得到片段EXO-PD1；使用PVR-F和PVR-R引物，以小鼠肝癌细胞Hep1-6的cDNA为模板扩增得到片段EXO-PVR；体外合成Linker DNA；引物PD1-R与PVR-F分别有16bp左右与linker序列5’和3’完全一致。使用PCR技术以PD1-F和PVR-R为引物，将EXO-PD1、linker、EXO-PVR片段按设计拼接，完成sPD1PVR基因克隆。sPD1PVR、EXO-PD1、EXO-PVR、Linker和信号肽(CD33)的蛋白序列如序列表SEQ ID NO:1-5所示；sPD1PVR、EXO-PD1、EXO-PVR、Linker和信号肽(CD33)的DNA序列如序列表SEQ ID NO:6-10所示。基因模板构建相关引物如表1所示：

表1

携载可溶性蛋白基因的腺病毒穿梭质粒Ad5-pShuttle-sPD1PVR载体的构建：使用Infusion技术将sPD1PVR片段与Ad5-pShuttle(pZD55)连接。具体步骤：首先使用限制性内切酶BglII对AD5-pShuttle(pZD55)线性化，纯化后片段按照sPD1PVR：Ad5-pShuttle的2:1比例使用Infusion试剂盒(clontech lab.Inc.)进行连接，后经转化扩增验证获得携载sPD1PVR基因的腺病毒穿梭质粒Ad5-pShuttle-sPD1PVR。

1.2.1.2 Ad5sPD1PVR病毒构建(质粒构建、病毒拯救与扩增)

A.Ad5sPD1全长质粒构建：将构建好的穿梭载体Ad5-pShuttle-sPD1PVR用PmeI线性化后转入感受态pAdEasy-BJ5183中，使用含50ug/ml卡那霉素LB平板的进行筛选，挑取阳性克隆培养鉴定，鉴定正确的克隆质粒重新转化DH5a感受态进行二次筛选鉴定，鉴定正确后进行质粒大提获得AD5sPD1PVR全长质粒。

B.Ad5sPD1PVR病毒拯救：Ad5sPD1PVR全长质粒使用PacI线性化，纯化后6孔板中1μg/well转染293T细胞，5％CO₂、37℃培养，2天后将细胞消化后转入10cm平皿，2-3天换液，至80％细胞出现病变，使用10ml培养基将细胞吹下收集至15ml离心管，反复冻融2次，3000rpm/min离心15min，收集病毒上清-80℃保存做为毒种。

C.病毒扩增：取病毒种液50μl加入60％293T细胞10cm平皿中，5％CO₂ 37℃培养，细胞密度至90％以上，按照1传3比例传代，直至80％细胞出现病变，大约有10个平皿细胞，按上述方法收病毒，使用氯化铯密度梯度离心纯化病毒；使用TCID50方法进行滴度测定。

1.2.1.3 Ad5sPD1PVR病毒功能评价

A.sPD1PVR的表达和分泌功能：Ad5sPD1PVR病毒感染肿瘤细胞72小时后，收细胞和上清，使用Western Blot检测sPD1PVR的表达和分泌功能。

B.病毒复制能力：Ad5sPD1PVR和Ad5con病毒相同MOI感染肿瘤细胞，72小时后收细胞，反复冻融离心后得到等量病毒悬液，使用293T细胞进行病毒滴度测定；分析病毒复制能力变化。

C.溶瘤功能：分别使用Ad5sPD1PVR和Ad5con病毒按照MOI 1到100病毒量感染肿瘤细胞，48小时后使用MTT检测细胞活性，评价Ad5sPD1PVR的杀瘤作用。

1.2.1体内研究Ad5sPD1PVR抗肿瘤机制

A.选用6-8周龄C57BL/6小鼠在右侧腋窝建立皮下瘤模型，每只小鼠一侧接种B16/F10细胞5×10⁵个细胞，4-6天后测量肿瘤大小至200mm³，将小鼠随机分成3组，分别是：无处理组、对照Ad5病毒治疗组、Ad5sPD1PVR病毒治疗组；a.按照分组使用相应病毒瘤内注射，每只注射病毒量5×10⁸pfu，跟踪测量肿瘤体积，体重，至肿瘤体积大于2500mm³判定小鼠死亡，记录小鼠生存期。b.按照分组瘤内注射病毒，每只注射病毒量5×10⁸pfu，注射两次，ELISpot检测免疫活化。

B.选用6-8周龄C57BL/6小鼠在腹腔建立腹水瘤模型，每只小鼠腹腔接种H22细胞5×10⁶个细胞，第7-8天左右看到小鼠有腹水，将小鼠随机分成3组，分别是：无处理组、对照Ad5病毒治疗组、Ad5sPD1PVR病毒治疗组；a.按照分组使用相应病毒腹腔注射，每只注射病毒量5×10⁸pfu，跟踪体重，直至小鼠死亡，记录小鼠生存期。b.按照分组腹腔注射病毒，每只注射病毒量5×10⁸pfu，注射两次，ELISpot检测免疫活化。

1.2.2 Ad5sPD1PVR病毒的滴度测定

1)293T细胞种于96孔板，每孔约1×10⁴个细胞，待细胞贴壁后进行滴度测定。

2)病毒梯度的稀释：准备EP管，每个EP管加入1170μl含胎牛血清的DMEM；往第一个EP管中加入130μl病毒溶液，混匀，标记为10^-1；从第一个EP管中吸取130μl于第二个EP管中，混匀，标记为10^-2；依次类推，直至稀释到所需梯度为止。

3)每孔加入100μl相应梯ff度的病毒稀释液，每个梯度重复10个孔，37℃培养过夜。

4)5天后，将96孔板放于显微镜下观察GFP，记下每个梯度有GFP的孔数，用于病毒滴度的计算。

病毒滴度TCID₅₀的计算公式：

Log10(TCID₅₀)＝L+d(s-0.5)+log10(1/v)

L＝Log10最高稀释度(如最高稀释度为10倍稀释，L＝1)

V＝最初每孔细胞培养液的体积(ml/well)

d＝Log10稀释度(如为10倍稀释，d＝1)

s＝各个梯度GFP比率之和。

1.2.3实时定量PCR

实时定量PCR的10μl体系组成：2.6μl PCR water，上下游引物各0.2μl，2μl的模板和5μl的SYBR Green荧光染料。样品混合后，于ABI 384PCR仪上进行扩增。

1.2.4细胞总蛋白的提取及浓度测定

1)以六孔板为例，去掉细胞培养上清，用PBS洗涤2遍，去掉PBS，每孔加入200μl的胰酶，消化吹打细胞，并将细胞收入至EP管中，2500rpm离心5min。

2)去掉上清，加入PBS重悬细胞，2500rpm离心5min。

3)去掉PBS，每孔根据细胞量加入相应的含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，涡旋60s，置于冰上10min，重复操作三次。4℃，12000g离心10min。收集上清于另一干净的EP管中。

4)蛋白浓度的测定：根据BCA蛋白浓度测定盒说明书进行检测。取2μl蛋白样品于96孔板中，加入18μl的PBS稀释样品，最后在加入200μl的测定工作液(工作液由试剂A:试剂B＝50:1)，放置于60℃的烘箱中，30min后，用酶标仪在562nm测定吸光度，根据标准曲线，计算出蛋白样品的浓度。

5)每管加入1/4蛋白裂解液体积的5×loading buffer，混匀后，100℃金属浴5min，冷却后，-20℃保存备用。

1.2.5 Western blot实验

1)配胶和电泳：按照不同要求配制不同浓度的SDS-PAGE分离胶和浓缩胶根据蛋白定量的计算结果，每个样品上样量调为20μg。电泳条件：浓缩胶80V 30min，分离胶120V，约60min，前提是将条带分开且不会跑出去。

2)转膜：准备滤纸和PVDF膜，先用甲醇浸泡PVDF膜，再和滤纸一同浸泡在转膜缓冲液中备用。从玻璃板中小心将胶取下，浸泡在转膜缓冲液中，按照负极-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-正极的三明治顺序放置，赶走气泡，根据所需条带大小不同，恒流110mA转膜60-70min。

3)封闭：转膜结束后，立即取出PVDF膜，放入5％脱脂奶粉中室温封闭1h。

4)一抗孵育：4℃孵育一抗过夜。

5)二抗孵育：用washing buffer洗涤条带，每次10min，共三次；再用相应的HPR标记的二抗室温孵育1h。

6)曝光：用washing buffer洗涤条带，每次10min，共三次；用化学发光液在WB曝光仪上曝光，并获取条带图像。

1.2.6台盼兰计数

以六孔板为例，去除细胞上清，用PBS洗涤2遍，去掉PBS，每孔加入

200μl胰酶消化，轻轻吹打细胞并收集进入干净的EP管中，2500rpm，离心5min。去掉上清，加入PBS重悬细胞，2500rpm，离心5min。去掉PBS，根据细胞数量加入一定量的PBS重悬细胞，从中取出10μl细胞重悬液，加入10μl 0.2％台盼蓝溶液混合，取混合液20μl于细胞计数板中，用细胞计数仪计数。

1.2.7流式细胞仪检测细胞表面分子

1)取实体瘤细胞(腹水)10⁵cells，加PBS清洗一遍。

2)去掉PBS，每管加入100μl含相应量的流式抗体的PBS，重悬细胞，置于冰上30min，避光。期间拿出样品，轻轻吹打，防止其因沉淀而影响抗体结合效果。

3)30min后，每管加入1ml PBS混合细胞，2500rpm，离心5min。去掉上清，再加入PBS重悬细胞，2500rpm，离心5min。去掉PBS，每管加入300μl PBS重悬，避光。

将准备好的样品，用流式细胞仪检测。用FlowJo软件分析实验结果。

1.2.8 Mouse IFN-γELISpot检测

1)ELISpot板子在使用前每孔加入200μl含10％血清的培养基孵育30min以上，放入细胞培养箱中。

2)去掉培养基，每孔加入200μl含细胞的培养体系。细胞体系组成：100μl的肿瘤细胞和100μl的脾脏细胞。混合均匀之后，加入孔板中，放入细胞培养箱中。且在实验结束取出之前，不要随意挪动板子。12h后，取出板子检测。

3)去掉培养基，每孔加入200μl的PBS清洗，需要清洗五遍以上。

4)去掉PBS，每孔加入100μl含一抗的稀释液。一抗稀释液：含0.5％FBS的PBS；一抗稀释比例1:1000。室温放置2h。

5)去掉一抗稀释液，用PBS洗五遍以上；每孔加入100μl二抗稀释液。二抗稀释液：含0.5％FBS的PBS；二抗稀释比例1:1000。室温放置1h。

6)去掉二抗稀释液，用PBS洗五遍以上。每孔加入200μl显色剂显色。待有蓝色斑点出现，且又不显色过头的情况下，甩掉显色液，用自来水洗多遍。

7)将自来水甩掉，室温晾干。注意：不要在室温晾的过久，且晾干过程保持避光。最后用避光保存于封口袋中。扫描读板。

1.2.9肿瘤组织及脾细胞的mouse IFN-γ的ELISpot检测

1)肿瘤组织单细胞悬液制备及mouse IFN-γ的ELISpot检测：处死小鼠，取下一小块的肿瘤组织，用PBS清洗，再放入培养皿中，加入1ml的胶原酶溶液，用剪刀剪碎，将肿瘤组织浑浊液吸入干净的离心管中，再加入1ml胶原酶溶液，放入37℃培养箱2小时，使得肿瘤组织得以消化完全。期间，每隔15min要取出，用枪头吹打混匀。2h后，取出装有肿瘤组织浑浊液的离心管，确认肿瘤组织消化完全。将浑浊液离心，取沉淀即肿瘤组织细胞。用含血清的DMEM重悬，细胞计数，将细胞浓度调为2×10⁶个/ml，取100μl细胞混合液做鼠IFN-γ的ELISpot检测，方法同1.2.8。

2)脾单细胞悬液的制备及鼠IFN-γ的ELISpot检测：处死小鼠，取出脾脏，用PBS清洗，剪下一小块脾脏组织，放于70μl的细胞过滤网中，用5ml的注射器研磨，边研磨边加入适量的PBS冲洗。用Ficoll法去掉红细胞，离心重悬获得脾脏单细胞混合液，细胞计数，将细胞浓度调为2×10⁶个/ml，取100μl与肿瘤细胞混合做鼠IFN-γ的ELISpot检测，方法同1.2.8。

2.实验结果与结论

图1的结果显示我们已经成功构建可以新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒，图中对照组对应位置没有条带、是空白的，而Ad5sPD1PVR重组溶瘤腺病毒对应的条带深黑，证明Ad5sPD1PVR重组溶瘤腺病毒能够在肿瘤细胞表达并且分泌到细胞外，而且从蛋白大小判断，是我们拟表达的目标蛋白：可溶性融合蛋白sPD1PVR。

图2的结果显示我们所构建的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR在Hepa1-6、H22、LM3、4T1、B16/F10、LLC1肿瘤细胞内保留了与对照病毒相同的复制能力。

图3的结果显示我们所构建的重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR在Hepa1-6、H22、LM3、4T1、B16/F10、LLC1肿瘤细胞内保留了与对照病毒相同的溶瘤能力。

图4在H22肝癌腹水瘤中腹腔注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR，通过ELISpot实验结果看出肿瘤微环境中抗肿瘤免疫活性显著增强。

图5在B16/F10黑色素瘤实体肿瘤中瘤内注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR，通过ELISpot实验结果看出肿瘤微环境中抗肿瘤免疫活性显著增强。

图6显示，在黑色素瘤实体瘤小鼠模型中，注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR能够显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存时间；并且注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR和对照病毒Ad5组与模型组相比，小鼠体重未收到影响，证明重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR和对照病毒Ad5具有一定的安全性。

图7显示，在乳腺癌实体瘤小鼠模型中，注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR能够显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存时间；并且注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR和对照病毒Ad5组与模型组相比，小鼠体重未收到影响，证明重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR和对照病毒Ad5具有一定的安全性。

图8肝癌腹水瘤模型中，给与重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR治疗的小鼠，其生存时间显著延长，约有40％小鼠长期无瘤生存，治愈的小鼠能够完全排斥腹腔再次注射同种肿瘤细胞，说明能够产生长期免疫记忆。

图9肝癌腹水瘤模型中显示，注射重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR后，病毒在肿瘤局部能够复制、表达融合蛋白。

图10肝癌腹水肿瘤模型中，用抗体清除小鼠的CD8+T细胞或者小鼠的NK细胞后，清除小鼠CD8+T细胞的小鼠，重组溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR完全失去抗肿瘤作用，说明Ad5sPD1PVR是通过激活CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫。

图11显示，在肝癌实体瘤小鼠模型中，腹腔注射可溶性融合蛋白sPD1PVR，能够显著抑制肿瘤的生长，延长荷瘤小鼠生存时间；并且小鼠体重未收到影响，证明可溶性融合蛋白sPD1PVR具有一定的安全性。

由以上结果可知，本发明提供了一种可以新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒的设计和构建方法，成功获得了一株新型可以新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒，该病毒可以在肿瘤细胞内和肿瘤部位选择性复制、具有肿瘤靶向性，而且能够溶瘤，诱导免疫原性细胞死亡。与此同时，该病毒能够高表达可溶性融合蛋白sPD1PVR，该蛋白能够分泌到细胞外，在细胞外的肿瘤局部同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并且发挥活化免疫的生物学功能。本发明的可以阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒Ad5sPD1PVR具有很强的活化抗肿瘤免疫作用，能够显著刺激IFN-γ的高表达，显著抑制肿瘤生长、延长生存期，具有很强的抗肿瘤作用，可以用来制备抗肿瘤药物，是一个一石数鸟的绝佳设计和策略，具有预料不到的抗肿瘤效果。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 南京大学

<120> 一种新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒和应用

<130> 2019

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 481

<212> PRT

<213> mouse（Mus musculus）

<400> 1

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro

20 25 30

Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser

35 40 45

Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser

50 55 60

Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser

65 70 75 80

Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly

85 90 95

Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly

100 105 110

Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys

115 120 125

Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val

130 135 140

Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

145 150 155 160

Thr Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Ser Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu

180 185 190

Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu

195 200 205

Val Thr His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly

210 215 220

Ser Met Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser

225 230 235 240

Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn

245 250 255

Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr

260 265 270

Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile

275 280 285

Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys

290 295 300

Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr

305 310 315 320

Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly

325 330 335

Met Pro Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr

340 345 350

Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys

355 360 365

Asn Val Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu

370 375 380

Leu Thr Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser

385 390 395 400

Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr

405 410 415

Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr

420 425 430

Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu

435 440 445

Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn

450 455 460

Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val

465 470 475 480

Lys

<210> 2

<211> 146

<212> PRT

<213> mouse（Mus musculus）

<400> 2

Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala

1 5 10 15

Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe

20 25 30

Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro

35 40 45

Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln

50 55 60

Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr

85 90 95

Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu

100 105 110

Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro

115 120 125

Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr

130 135 140

Leu Val

145

<210> 3

<211> 303

<212> PRT

<213> mouse（Mus musculus）

<400> 3

Asp Val Val Val Gln Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp

1 5 10 15

Ser Val Thr Leu Pro Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr

20 25 30

His Val Ser Gln Leu Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met

35 40 45

Ala Val Phe His Gln Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg

50 55 60

Leu Glu Phe Val Ala Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser

65 70 75 80

Leu Arg Met Phe Gly Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys

85 90 95

Leu Phe Val Thr Phe Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu

100 105 110

Arg Val Leu Ala Lys Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln

115 120 125

Leu Thr Gly Glu Pro Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly

130 135 140

Arg Pro Pro Ala Gln Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro

145 150 155 160

Asn Thr Ser Gln Val Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr

165 170 175

Ser Leu Trp Ile Leu Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val

180 185 190

Thr Cys Lys Val Glu His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr

195 200 205

Val Asn Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr

210 215 220

Asp Asn Asn Trp Tyr Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp

225 230 235 240

Ala Arg Ser Asn Pro Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met

245 250 255

Gly Pro Leu Pro Pro Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile

260 265 270

Arg Pro Val Asp Lys Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr

275 280 285

Asn Ala Leu Gly Ala Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys

290 295 300

<210> 4

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Linker)

<400> 4

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> human（Homo sapiens）

<400> 5

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

Met

<210> 6

<211> 1443

<212> DNA

<213> mouse（Mus musculus）

<400> 6

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggctat gttagactcc 60

ccagacaggc cctggaaccc ccccaccttc tccccagccc tgctcgtggt gaccgaaggg 120

gacaacgcca ccttcacctg cagcttctcc aacacatcgg agagcttcgt gctaaactgg 180

taccgcatga gccccagcaa ccagacggac aagctggccg ccttccccga ggaccgcagc 240

cagcccggcc aggactgccg cttccgtgtc acacaactgc ccaacgggcg tgacttccac 300

atgagcgtgg tcagggcccg gcgcaatgac agcggcacct acctctgtgg ggccatctcc 360

ctggccccca aggcgcagat caaagagagc ctgcgggcag agctcagggt gacagagaga 420

agggcagaag tgcccacagc ccaccccagc ccctcaccca ggccagccgg ccagttccaa 480

accctggtgg gtggaggcgg ttcaggcgga ggtggctctg gcggtggcgg atcggacgtc 540

gtcgtgcagg cgcccaccca ggtgcccggc ttcttgggcg actccgtgac gctgccctgc 600

tacctacagg tgcccaacat ggaggtgacg catgtgtcac agctgacttg ggcgcggcat 660

ggtgaatctg gcagcatggc cgtcttccac caaacgcagg gccccagcta ttcggagtcc 720

aaacggctgg aattcgtggc agccagactg ggcgcggagc tgcggaatgc ctcgctgagg 780

atgttcgggt tgcgcgtaga ggatgaaggc aactacacct gcctgttcgt cacgttcccg 840

cagggcagca ggagcgtgga tatctggctc cgagtgcttg ccaagcccca gaacacagct 900

gaggttcaga aggtccagct cactggagag ccagtgccca tggcccgctg cgtctccaca 960

gggggtcgcc cgccagccca aatcacctgg cactcagacc tgggcgggat gcccaatacg 1020

agccaggtgc cagggttcct gtctggcaca gtcactgtca ccagcctctg gatattggtg 1080

ccctcaagcc aggtggacgg caagaatgtg acctgcaagg tggagcacga gagctttgag 1140

aagcctcagc tgctgactgt gaacctcacc gtgtactacc ccccagaggt atccatctct 1200

ggctatgata acaactggta ccttggccag aatgaggcca ccctgacctg cgatgctcgc 1260

agcaacccag agcccacagg ctataattgg agcacgacca tgggtcccct gccacccttt 1320

gctgtggccc agggcgccca gctcctgatc cgtcctgtgg acaaaccaat caacacaact 1380

ttaatctgca acgtcaccaa tgccctagga gctcgccagg cagaactgac cgtccaggtc 1440

aaa 1443

<210> 7

<211> 438

<212> DNA

<213> mouse（Mus musculus）

<400> 7

ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct ccccagccct gctcgtggtg 60

accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca acacatcgga gagcttcgtg 120

ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca agctggccgc cttccccgag 180

gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc ttccgtgtca cacaactgcc caacgggcgt 240

gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca gcggcaccta cctctgtggg 300

gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc tgcgggcaga gctcagggtg 360

acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc cctcacccag gccagccggc 420

cagttccaaa ccctggtg 438

<210> 8

<211> 909

<212> DNA

<213> mouse（Mus musculus）

<400> 8

gacgtcgtcg tgcaggcgcc cacccaggtg cccggcttct tgggcgactc cgtgacgctg 60

ccctgctacc tacaggtgcc caacatggag gtgacgcatg tgtcacagct gacttgggcg 120

cggcatggtg aatctggcag catggccgtc ttccaccaaa cgcagggccc cagctattcg 180

gagtccaaac ggctggaatt cgtggcagcc agactgggcg cggagctgcg gaatgcctcg 240

ctgaggatgt tcgggttgcg cgtagaggat gaaggcaact acacctgcct gttcgtcacg 300

ttcccgcagg gcagcaggag cgtggatatc tggctccgag tgcttgccaa gccccagaac 360

acagctgagg ttcagaaggt ccagctcact ggagagccag tgcccatggc ccgctgcgtc 420

tccacagggg gtcgcccgcc agcccaaatc acctggcact cagacctggg cgggatgccc 480

aatacgagcc aggtgccagg gttcctgtct ggcacagtca ctgtcaccag cctctggata 540

ttggtgccct caagccaggt ggacggcaag aatgtgacct gcaaggtgga gcacgagagc 600

tttgagaagc ctcagctgct gactgtgaac ctcaccgtgt actacccccc agaggtatcc 660

atctctggct atgataacaa ctggtacctt ggccagaatg aggccaccct gacctgcgat 720

gctcgcagca acccagagcc cacaggctat aattggagca cgaccatggg tcccctgcca 780

ccctttgctg tggcccaggg cgcccagctc ctgatccgtc ctgtggacaa accaatcaac 840

acaactttaa tctgcaacgt caccaatgcc ctaggagctc gccaggcaga actgaccgtc 900

caggtcaaa 909

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Linker)

<400> 9

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcg 45

<210> 10

<211> 51

<212> DNA

<213> human（Homo sapiens）

<400> 10

atgccgctgc tgctactgct gcccctgctg tgggcagggg ccctggctat g 51

Claims (12)

1.一种同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白的两端分别为结合PD-L1的PD1胞外区和结合TIGIT的PVR胞外区，PD1和PVR片段之间通过linker序列连接，可溶性融合蛋白的两端分别结合PD-L1和TIGIT之后可以同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT；可溶性融合蛋白的PVR端结合CD226之后，可以激活免疫共刺激通路，活化抗肿瘤免疫。

2.如权利要求1所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白，其特征在于：所述的可溶性融合蛋白为sPD1PVR，sPD1PVR的蛋白序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

3.权利要求1或2所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。

4.权利要求1或2所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。

5.权利要求1或2所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

6.如权利要求5所述的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT并激活免疫共刺激通路的可溶性融合蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、肝腹水癌、黑色素瘤或乳腺癌。

7.一种新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内复制，并且表达和分泌可溶性融合蛋白，所述可溶性融合蛋白的两端分别为结合PD-L1的PD1胞外区和结合TIGIT的PVR胞外区，PD1和PVR之间通过linker序列连接，可溶性融合蛋白的两端分别结合PD-L1和TIGIT之后可以同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT；可溶性融合蛋白的PVR端结合CD226之后，可以激活免疫共刺激通路，活化抗肿瘤免疫。

8.如权利要求7所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒，其特征在于：所述可溶性融合蛋白为sPD1PVR，sPD1PVR的蛋白序列如序列表SEQ ID NO:1所示。

9.权利要求7或8所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备活化抗肿瘤免疫药物中的应用。

10.权利要求7或8所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备刺激IFN-γ表达药物中的应用。

11.权利要求7或8所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用。

12.如权利要求11所述的新型的同时阻断免疫检查点PD-L1和TIGIT的复制型溶瘤腺病毒在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述的肿瘤为肝癌、腹水癌、黑色素瘤或乳腺癌。