CN105176937B - 一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用。本发明提供的重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/DR5‑TRAIL、pBL‑N质粒、pBL‑P质粒和pBL‑L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述重组质粒pBrClone30/DR5‑TRAIL为具有序列表的序列3自5’末端第2703‑19872位核苷酸所示的DNA分子的质粒。本发明还保护所述重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)治疗肿瘤。本发明为改善TRAIL抵抗以提高抗肿瘤效果提供了全新的方法，对于肿瘤治疗具有重大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，目前全球每年大约有1100多万人罹患癌症，并有800多万人死于癌症。
长期以来，人们治疗癌症的方法主要以传统的手术切除和放化疗为主，这些手段可以在一定程度上控制肿瘤的发展，但是对于晚期肿瘤扩散患者的疗效有限，并且这些手段同时对人体的正常细胞产生严重的创伤。
因此，急需一种新的治疗恶性肿瘤的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组新城疫病毒及其在制备抗癌药物中的应用。
本发明提供的重组新城疫病毒(命名为rClone30/DR5-TRAIL病毒)，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19872位核苷酸所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-19872位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30/DR5-TRAIL病毒的基因组DNA。所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL具体可为序列表的序列3所示的质粒。所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
rClone30/DR5-TRAIL病毒的制备方法具体如下：
(1)将所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒ppBrClone30/DR5-TRAIL、0.5μgpBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h；
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有rClone30/DR5-TRAIL病毒)。
rClone30/DR5-TRAIL病毒的制备方法具体如下：
(1)将所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h；
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(5)将步骤(2)得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤(4)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30/DR5-TRAIL病毒液。
本发明还保护一种重组新城疫病毒(命名为rClone30/DR5-TRAIL病毒)，其基因组对应的DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-19872位核苷酸所示。
本发明还保护以上任一所述的重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)治疗肿瘤。所述(a)和/或所述(b)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞或人神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)中，所述肿瘤细胞为HepG2细胞或U251细胞。所述(c)中，所述肿瘤为肝癌或神经胶质细胞瘤。所述(c)中，所述肿瘤为H22细胞引起的肿瘤。
本发明还保护一种产品，包括以上一所述的重组新城疫病毒；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)治疗肿瘤。所述(a)和/或所述(b)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞或人神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)中，所述肿瘤细胞为HepG2细胞或U251细胞。所述(c)中，所述肿瘤为肝癌或神经胶质细胞瘤。所述(c)中，所述肿瘤为H22细胞引起的肿瘤。
新城疫病毒(Newacstle disease virus，NDV)为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属副粘病毒科副粘病毒亚科的禽副粘病毒属，能够特异地杀伤人肿瘤细胞，而对人正常细胞无明显影响。NDV作为病毒载体可以通过本身的复制扩增带动所携带的基因的表达水平，也可以直接影响肿瘤宿主细胞的凋亡及坏死，从而抑制肿瘤细胞的生长。
本发明利用反向遗传操作技术将DR5基因区段和TRAIL基因区段同时插入新城疫病毒基因组F基因和HN基因之间(DR5基因区段为人DR5基因全长基因，其表达后定位于肿瘤细胞表面；TRAIL基因区段为人TRAIL基因的胞外区，分泌表达到细胞外)，得到了重组病毒rClone30/DR5-TRAIL。新城疫病毒本身能较小幅度上调肿瘤细胞表面DR5的表达量，插入的外源基因DR5能大幅度上调DR5的表达，从而可以提高肿瘤细胞对TRAIL的敏感性。外源基因TRAIL在新城疫病毒基因组上的联合表达减少了TRAIL的再次用药，减轻了多种药物同时注射所造成的痛苦，表达的TRAIL与DR5结合后，进一步诱导肿瘤细胞凋亡。本发明为改善TRAIL抵抗以提高抗肿瘤效果提供了全新的方法，对于肿瘤治疗具有重大的应用价值。
附图说明
图1为重组病毒感染肿瘤细胞后DR5蛋白的表达。
图2为重组病毒感染肿瘤细胞后TRAIL蛋白的表达。
图3为DR5基因的相对表达量。
图4为TRAIL基因的相对表达量。
图5为caspase3基因、caspase7基因和caspase8基因的相对表达量。
图6为重组病毒对HepG2细胞的抑制率。
图7为重组病毒对U251细胞的抑制率。
图8为感染剂量为1MOI时重组病毒对肿瘤细胞的杀伤效果。
图9为感染剂量为10MOI时重组病毒对肿瘤细胞的杀伤效果。
图10为尿囊液组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图11为rClone30组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图12为rClone30/IL2组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图13为rClone30/DR5组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图14为rClone30/TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图15为rClone30/DR5-TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图16为各试验组肿瘤平均体积。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。鼠抗人DR5单克隆抗体：sigma，货号SAB 4700538。FITC标记的兔抗鼠：santa cruze，货号SC-358946。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.2、0.1M的PBS缓冲液。
BHK-21细胞：ATCC,ATCC编号为CRL-13001。HepG2细胞(人肝癌细胞)：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,产品目录号为TCHu 72。U251细胞(人神经胶质细胞瘤细胞)：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为TCHu 58。胰酶：Sigma，产品目录号为8049-47-6。H22细胞(小鼠肝癌细胞)：ATCC公司，产品目录号为58426。ICR小鼠：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。
提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tumor activity ofNewcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.；哈尔滨博翱医药技术开发有限公司。
提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineeredNewcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drugcandidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters.；哈尔滨博翱医药技术开发有限公司。
pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有HpaI和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。
鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入50μL生理盐水；(2)在第1孔中加入50μL待测病毒液，混匀后吸50μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第11孔混匀后弃除50μL；(3)在1-12孔中各加入50μL 1％鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第11孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液(4个血凝单位)，室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1％鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
实施例1、rClone30/DR5-TRAIL病毒液的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
序列表的序列1中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性核酸内切酶Hpa Ⅰ的识别序列，第7至第12位核苷酸为Kozak序列，第13至1248位核苷酸为DR5基因区段(全长DR5基因)，第1249至1254位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。
2、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/DR5。
5、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
序列表的序列2中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性核酸内切酶MluI的识别序列，第7至第17位核苷酸位Gene end序列，第18位核苷酸为基因间隔序列(IG)，第19至29位核苷酸为Gene start序列，第30至35位核苷酸为Kozak序列，第36至659位核苷酸为TRAIL基因区段(TRAIL基因的胞外区)，第667至672位核苷酸为限制性核酸内切酶MluI的识别序列。
6、用限制性内切酶MluI单酶切步骤5得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
7、用限制性内切酶MluI单酶切重组质粒pBrClone30/DR5，回收约19kb的载体骨架。
8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL。经测序，重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL的核苷酸序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3中，自5’末端第2703-19872位核苷酸为rClone30/DR5-TRAIL病毒的基因组)。
9、用限制性内切酶MluI单酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨架。
10、将步骤6的酶切产物和步骤9的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/TRAIL。
11、合成序列表的序列4所示的双链DNA分子。
序列表的序列4中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性核酸内切酶Hpa Ⅰ的识别序列，第7至第12位核苷酸为Kozak序列，第13至474位核苷酸为IL2基因区段，第475至480位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。
12、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤11得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
13、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨架。
14、将步骤12的酶切产物和步骤13的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/IL2。
二、重组病毒的制备
1、将重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、0.5μg pBL-N质粒、0.25μgpBL-P质粒和0.1μgpBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h。
2、取步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液。该混合液的HA效价为211，HI效价为29。
将步骤5得到的混合液命名为rClone30/DR5-TRAIL病毒液。
三、对照病毒的制备
用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
用重组质粒pBrClone30/DR5代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/DR5病毒液。
用重组质粒pBrClone30/TRAIL代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/TRAIL病毒液。
用重组质粒pBrClone30/IL2代替重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/IL2病毒液。
实施例2、重组病毒的鸡胚稳定性检测
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液或rClone30/TRAIL病毒液。
取100μL待测病毒液，用灭菌后的PBS缓冲液稀释，然后经由尿囊腔接种至9-11日龄SPF鸡胚中，37℃孵化72h。收集鸡胚尿囊液，取HA阳性尿囊液接种9-11日龄SPF鸡胚并进行连续传代。
取第1代、第3代、第5代、第8代和第10代鸡胚尿囊液各100μL并按Reed-Muench两氏法计算每毫升病毒液的TCID50。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见表1。结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液和rClone30/TRAIL病毒液均具有增殖稳定性。
表1各代鸡胚尿囊液的HA滴度和TCID50
实施例3、检测重组病毒感染肿瘤细胞后DR5蛋白的表达
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。
1、取对数生长期的HepG2细胞，以1MOI的剂量感染待测病毒液，37℃静置孵育48h。
2、完成步骤1后，取细胞，1700r/min离心5min，收集细胞沉淀，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次。
3、用PBS缓冲液重悬步骤2得到的细胞沉淀，加入鼠抗人DR5单克隆抗体(一抗)并冰上孵育40min，然后1700r/min离心5min，收集沉淀，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次。
4、用PBS缓冲液重悬步骤3得到的沉淀，加入FITC标记的兔抗鼠(二抗)并冰上避光孵育40min，然后1700r/min离心5min，收集沉淀。
5、用PBS缓冲液重悬步骤4得到的沉淀，利用流式细胞仪进行检测。
结果见图1。图1中，A为HepG2空细胞荧光强度检测结果，B为感染rClone30病毒液的HepG2细胞的荧光强度检测结果，C为感染rClone30/TRAIL病毒液的HepG2细胞的荧光强度检测结果，D为感染rClone30/DR5病毒液的HepG2细胞的荧光强度检测结果，E为感染rClone30/DR5-TRAIL病毒液的HepG2细胞的荧光强度检测结果。结果表明：与HepG2空细胞相比，感染rClone30病毒液、rClone30/TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液都能显著上调HepG2细胞表面DR5蛋白的表达水平；与感染rClone30病毒液相比，感染rClone30/DR5病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液能显著上调HepG2蛋白表面DR5蛋白的表达水平。
实施例4、检测重组病毒感染肿瘤细胞后TRAIL蛋白的表达
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。
1、取对数生长期的HepG2细胞，以1MOI的剂量感染待测病毒液，37℃静置孵育48h。
2、完成步骤1后，取细胞培养上清，采用Human TRAIL/TNFSF10 Quantikine ELISAkit(DTRL00；R&D公司)检测细胞培养上清中TRAIL蛋白的水平。
结果见图2。图2中，A为HepG2空细胞的检测结果，B为感染rClone30病毒液的HepG2细胞的检测结果；C：感染rClone30/DR5病毒液的HepG2细胞的检测结果；D：感染rClone30/TRAIL病毒液的HepG2细胞的检测结果；E：感染rClone30/DR5-TRAIL病毒液的HepG2细胞的检测结果。结果表明，与HepG2空细胞、感染rClone30病毒液和感染rClone30/DR5病毒液相比，感染rClone30/TRAIL病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液能极显著的上调TRAIL蛋白的表达水平。
实施例5、检测凋亡相关基因mRNA表达变化。
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。
1、取对数生长期的HepG2细胞，以1MOI的剂量感染待测病毒液，37℃静置孵育48h。
2、完成步骤1后，取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测DR5基因、TRAIL基因、caspase3基因、caspase7基因和caspase8基因(caspase3、caspase7和caspase8均为凋亡相关因子)的相对表达情况，以β-actin基因为内参基因。
用于检测DR5基因的引物对如下：
上游引物：5’-AGATTCTCCTGAGATGTGCCGGA-3’；
下游引物：5’-ACCACCTGAGCAGATGCCTTTCAGG-3’。
用于检测TRAIL基因的引物对如下：
上游引物：5’-TCAGAGAGTAGCAGCTCACATA-3’；
下游引物：5’-GTTCACCATTCCTCAAGTGCAA-3’。
用于检测caspase3基因的引物对如下：
上游引物：5’-TCATAAAAGCACTGGAATGACATC-3’；
下游引物：5’-TTCTGAATGTTTCCCTGAGGTT-3’。
用于检测caspase7基因的引物对如下：
上游引物：5’-TCTATGTGCCCCGTCAGTA-3’；
下游引物：5’-ACATCCATACCTGTCGCTTT-3’。
用于检测caspase8基因的引物对如下：
上游引物：5’-CATTTGCATATTTAGCCGCCAAG-3’；
下游引物：5’-TTAAGAGTCCCAGGAATTCAGCAAC-3’。
用于检测β-actin基因的引物对如下：
上游引物：5’-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3’；
下游引物：5’-ACCCTCATAGATGGGCACA-3’。
DR5基因的相对表达量见图3。结果表明：感染rClone30/DR5病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液使DR5基因的相对表达量增加，与感染rClone30病毒液和感染rClone30/TRAIL病毒液相比差异极显著。结果表明，插入新城疫病毒载体的外源基因DR5可以有效地在肿瘤细胞表达。
TRAIL基因的相对表达量见图4。结果表明：感染rClone30病毒液和感染rClone30/DR5病毒液后TRAIL基因几乎不表达；感染rClone30/TRAIL病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液使TRAIL基因的相对表达量增加，与感染rClone30病毒液和rClone30/DR5病毒液相比差异极显著。结果表明，插入新城疫病毒载体的外源基因TRAIL可以有效地在肿瘤细胞内表达。
caspase3基因、caspase7基因和caspase8基因的相对表达量见图5。结果表明，感染rClone30/DR5-TRAIL病毒液后可检测到caspase3、caspase7和caspase8基因的高表达，与感染rClone30病毒液、感染rClone30/DR5病毒液、感染rClone30/TRAIL病毒液相比差异极显著。
实施例6、重组病毒对肿瘤细胞的作用效果
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液或rClone30病毒液。肿瘤细胞为HepG2细胞和U251细胞。
一、MTT法检测rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤细胞的抑制作用
1、将对数生长期的肿瘤细胞进行胰酶消化，然后用含10％小牛血清的DMEM培养基制成2×104个细胞/mL的细胞悬液。
2、将步骤1得到的细胞悬液接种于96孔板(每孔200微升)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
3、完成步骤2后，取所述96孔板，感染待测病毒液(分别设置如下感染剂量：0.1MOI、1MOI或10MOI；每孔100μL病毒液；设置用等体积含5％小牛血清的DMEM培养基代替病毒液的对照组)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养1h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
4、完成步骤3后，取所述96孔板，每孔加入含10％小牛血清的DMEM培养基，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h、48h或72h。
5、完成步骤4后，取所述96孔板，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)并37℃孵育4h，吸弃培养上清，每孔加入150μL DMSO，震荡混匀10min，用酶标仪于测定490nm处的OD值，计算细胞生长的抑制率。
抑制率＝(对照处理孔的OD值-试验处理孔的OD值)/对照处理孔的OD值。
对HepG2细胞的抑制率见图6。图6中，A对应步骤3中感染不同MOI(分别为0.1MOI,1MOI，10MOI)待测病毒液在培养72h的结果，B对应感染同一MOI(即0.1MOI)待测病毒液在不同的培养时间(分别为24h,48h,72h)的结果，C对应感染同一MOI(即1MOI)待测病毒液在不同培养时间(分别为24h,48h,72h)的结果，D对应感染同一MOI(即10MOI)待测病毒液在不同培养时间(分别为24h,48h,72h)的结果。
对U251细胞的抑制率见图7。图7中，A对应步骤3中感染不同MOI(分别为0.1MOI,1MOI，10MOI)待测病毒液在培养72h的结果，B对应感染同一MOI(即0.1MOI)待测病毒液在不同的培养时间(分别为24h,48h,72h)的结果，C对应感染同一MOI(即1MOI)待测病毒液在不同培养时间(分别为24h,48h,72h)的结果，D对应感染同一MOI(即10MOI)待测病毒液在不同培养时间(分别为24h,48h,72h)的结果。
结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤细胞的抑制作用显著强于rClone30病毒、rClone30/DR5病毒和rClone30/TRAIL病毒，抑制率与病毒剂量呈明显的剂量依赖性关系，且抑制率与时间成正比。
二、Annexin V/PI法检测rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤细胞的杀伤效果
1、将对数生长期的HepG2细胞进行胰酶消化，然后用含10％小牛血清的DMEM培养基制成1×104个细胞/mL的细胞悬液。
2、将步骤1得到的细胞悬液接种于6孔板(每孔2ml)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
3、完成步骤2后，取所述6孔板，感染待测病毒液(分别设置如下感染剂量：1MOI或10MOI；设置用等体积含5％小牛血清的DMEM培养基代替病毒液的空白对照)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养1h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤。
4、完成步骤3后，取所述6孔板，每孔加入含10％小牛血清的DMEM培养基，置于5％CO2、37℃环境中静置培养48h。
5、完成步骤4后，取所述6孔板，收集细胞，用含0.25％(质量比)胰酶的DMEM培养基消化细胞，然后用PBS缓冲液洗涤两次，然后取(0.5-1)×106个细胞，用500μL BindingBuffer轻柔的悬浮细胞，加入10μL FITC标记的Annexin-V，再加入5μL PI，混匀，避光反应5-15min后用流式细胞术定量检测。
感染剂量为1MOI时的结果见图8。图8中，A为空白对照的检测结果，B为感染rClone30病毒液的HepG2细胞的检测结果，C为感染rClone30/DR5病毒液的HepG2细胞的检测结果，D为感染rClone30/TRAIL病毒液的HepG2细胞的检测结果，E为感染rClone30/DR5-TRAIL病毒液的HepG2细胞的检测结果。
感染剂量为10MOI时的结果见图9。图9中，A为空白对照的检测结果，B为感染rClone30病毒液的HepG2细胞的检测结果，C为感染rClone30/DR5病毒液的HepG2细胞的检测结果，D为感染rClone30/TRAIL病毒液的HepG2细胞的检测结果，E为感染rClone30/DR5-TRAIL病毒液的HepG2细胞的检测结果。
结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒、rClone30病毒、rClone30/DR5病毒和rClone30/TRAIL病毒均能诱导肿瘤细胞发生凋亡，且细胞凋亡的程度对病毒剂量呈现剂量依赖性，rClone30/DR5-TRAIL病毒的效果显著强于rClone30病毒、rClone30/DR5病毒和rClone30/TRAIL病毒。
实施例7、重组病毒对肿瘤的治疗作用及病毒安全性检测
一、rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤的治疗作用
1、建立H22肝癌动物模型
(1)取H22细胞，用PBS缓冲液悬浮，得到106个细胞/mL的细胞悬液。
(2)取6周龄ICR小鼠，每只右侧腹股沟皮下注入剂量0.2mL步骤(1)制备的细胞悬液，正常饲养小鼠，10天后形成5-8mm直径的实体瘤的小鼠，即为模型小鼠。
2、rClone30/DR5-TRAIL病毒对肿瘤的治疗作用
将模型小鼠随机分为六组，每组10只，分别处理如下：
rClone30/DR5-TRAIL组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/DR5-TRAIL病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30/DR5组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/DR5病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30/TRAIL组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/TRAIL病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30/IL2组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/IL2病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30病毒液(含107pfu病毒)；
尿囊液组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL鸡胚尿囊液。
每两天测量肿瘤体积，绘制肿瘤体积生长曲线。
试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，尿囊液组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图10。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图11。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/IL2组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图12。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/DR5组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图13。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图14。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/DR5-TRAIL组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图15。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，各试验组肿瘤平均体积见图16。
结果表明，与PBS组相比，rClone30病毒液、rClone30/IL2病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液和rClone30/DR5-TRAIL病毒液对肿瘤有极显著的抑制效果，rClone30病毒液、rClone30/IL2病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液之间效果差异不显著，rClone30/DR5-TRAIL病毒液与Clone30病毒液、rClone30/IL2病毒液、rClone30/DR5病毒液、rClone30/TRAIL病毒液的效果有显著性差异。
二、rClone30/DR5-TRAIL病毒的安全性检测
1、急性毒性试验
取10只健康4-6周龄ICR小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射rClone30/DR5-TRAIL病毒液(含107pfu病毒)，注射之后观察48h。
小鼠均未出现如下任何不良反应：呼吸受到抑制、四肢步伐不平稳、瘫痪症状、惊厥、皮毛战栗、死亡。
2、亚急性毒性试验
取10只健康4-6周龄ICR小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射rClone30/DR5-TRAIL病毒液(含107pfu病毒)，注射之后观察4周。
小鼠进水、进食、毛色、体重等方面均正常，无任何不良反应，无死亡。
结果表明，rClone30/DR5-TRAIL病毒对小鼠的正常生长无不良影响，安全性可靠。
Claims (10)
1.一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19872位核苷酸所示的DNA分子的质粒。
2.如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述重组质粒pBrClone30/DR5-TRAIL为序列表的序列3所示的质粒。
3.如权利要求1或2所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
4.一种重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-19872位核苷酸所示。
5.权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒在制备药物中的应用；所述药物的功能为抑制肿瘤细胞增殖；所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。
6.权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒在制备药物中的应用；所述药物的功能为杀伤肿瘤细胞；所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。
7.权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒在制备药物中的应用；所述药物的功能为治疗肿瘤；所述肿瘤为肝癌或神经胶质细胞瘤。
8.一种药物，包括权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒；所述药物的功能为抑制肿瘤细胞增殖；所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。
9.一种药物，包括权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒；所述药物的功能为杀伤肿瘤细胞；所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。
10.一种药物，包括权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒；所述药物的功能为治疗肿瘤；所述肿瘤为肝癌或神经胶质细胞瘤。
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