CN104357408A - 一种重组新城疫病毒及其应用 - Google Patents

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CN104357408A CN201410604238.5A CN201410604238A CN104357408A CN 104357408 A CN104357408 A CN 104357408A CN 201410604238 A CN201410604238 A CN 201410604238A CN 104357408 A CN104357408 A CN 104357408A
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李德山
安莹
陈睿
刘源
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Abstract

本发明公开了一种重组新城疫病毒及其应用。本发明提供的重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-P53、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述pBrClone30-P53为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19045位核苷酸所示的DNA分子的质粒。本发明还保护一种产品，包括所述的重组新城疫病毒；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)促使肿瘤细胞周期停滞；(d)治疗肿瘤。本发明对于肿瘤治疗具有重大价值。

Description

一种重组新城疫病毒及其应用
技术领域
本发明涉及一种重组新城疫病毒及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，目前全球每年大约有1100多万人罹患癌症，并有800多万人死于癌症。
长期以来，人们治疗癌症的方法主要以传统的手术切除和放疗\化疗为主，这些手段可以在一定程度上控制肿瘤的发展，但是对于晚期肿瘤扩散患者的疗效有限，并且这些手段同时对人体的正常细胞产生严重的创伤。
因此，急需一种新的治疗恶性肿瘤的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组新城疫病毒及其应用。
本发明提供的重组新城疫病毒(命名为rClone30-P53病毒)，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-P53、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述pBrClone30-P53为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19045位核苷酸所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5’末端第2703-19045位核苷酸所示的DNA分子即为rClone30-P53病毒的基因组DNA。所述重组质粒pBrClone30-P53具体可为序列表的序列3所示的质粒。所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
rClone30-P53病毒的制备方法具体如下：
(1)将所述重组质粒pBrClone30-P53、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-P53、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h；
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有pBrClone30-P53病毒)。
rClone30-P53病毒的制备方法具体如下：
(1)将所述重组质粒pBrClone30-P53、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-P53、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h；
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(5)将步骤(2)得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤(4)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30-P53病毒液。
本发明还保护一种重组新城疫病毒(命名为rClone30-P53病毒)，其基因组DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-19045位核苷酸所示。
本发明还保护以上任一所述的重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)促使肿瘤细胞周期停滞；(d)治疗肿瘤。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞或人神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为HepG-2细胞或U251细胞。所述(d)中，所述肿瘤为肝癌。所述(d)中，所述肿瘤为H22细胞引起的肿瘤。
本发明还保护一种产品，包括以上一所述的重组新城疫病毒；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)促使肿瘤细胞周期停滞；(d)治疗肿瘤。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞或人神经胶质细胞瘤细胞。所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为HepG-2细胞或U251细胞。所述(d)中，所述肿瘤为肝癌。所述(d)中，所述肿瘤为H22细胞引起的肿瘤。
新城疫病毒(Newacstle disease virus，NDV)为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属副粘病毒科副粘病毒亚科的禽副粘病毒属，能够特异地杀伤人肿瘤细胞，而对人正常细胞无明显影响。NDV作为病毒载体可以通过本身的复制扩增带动所携带的基因的表达水平，也可以直接影响肿瘤宿主细胞的凋亡及坏死，从而抑制肿瘤细胞的生长。
本发明对于肿瘤治疗具有重大价值。
附图说明
图1为实施例2中的Western blot检测结果。
图2为实施例3中P53基因的相对表达量。
图3为实施例3中p21基因的相对表达量。
图4为实施例3中HDM基因的相对表达量。
图5为实施例4中重组病毒对HepG-2细胞的抑制率。
图6为实施例4中重组病毒对U251细胞的抑制率。
图7为实施例4中重组病毒对HepG-2细胞的杀伤效果。
图8为实施例4中重组病毒对U251细胞的杀伤效果。
图9为实施例5中重组病毒对肿瘤的治疗作用。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
P53蛋白如序列表的序列2所示，其编码基因(P53基因，又称p53基因)如序列表的序列1自5’末端7至1188位核苷酸所示。
BHK-21细胞：ATCC,ATCC编号为CRL-13001。DF-1细胞：ATCC,ATCC编号为CRL-12203。HepG2细胞(人肝癌细胞)：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,产品目录号为TCHu 72。U251细胞(人神经胶质细胞瘤细胞)：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为TCHu 58。胰酶：Sigma，产品目录号为8049-47-6。H22细胞(小鼠肝癌细胞)：ATCC公司，产品目录号为58426。ICR小鼠：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司)。
实施例中的PBS缓冲液，如无特殊说明均为pH7.4、0.01M的PBS缓冲液。
提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tumor activity ofNewcastle disease virus by the synergistic effect of cytosinedeaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.；哈尔滨博翱医药技术开发有限公司。
提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineeredNewcastle disease virus expressing interleukin 2is a potential drug candidatefor cancer immunotherapy,Ful iang Bai,Immunology letters.；哈尔滨博翱医药技术开发有限公司。
pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中F基因和HN基因之间具有HpaI和MluI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。
鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入50μL生理盐水；(2)在第1孔中加入50μL待测病毒液，混匀后吸50μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除50μL；(3)在1-12孔中各加入50μL 1％鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液(4个血凝单位)，室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1％鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
实施例1、rClone30-P53病毒液的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
序列表的序列1中，自5’末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶HpaⅠ的识别序列，第7至1188位核苷酸为P53基因，第1189至1194位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。
2、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶HpaI和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约16000bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30-P53。重组质粒pBrClone30-P53的核苷酸序列如序列表的序列3所示(序列表的序列3中，自5’末端第2703-19045位核苷酸为rClone30-P53病毒的基因组)。
二、重组病毒的制备
1、将重组质粒pBrClone30-P53、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30-P53、0.5μgpBL-N质粒、0.25μgpBL-P质粒和0.1μgpBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h。
2、取步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为211，HI效价为27)。
3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为210，HI效价为29)。
4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(该鸡胚尿囊液的HA效价为29，HI效价为28)。
5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液(该混合液的HA效价为210，HI效价为28)。
将步骤5得到的混合液命名为rClone30-P53病毒液。
三、对照病毒的制备
用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-P53进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
实施例2、检测rClone30-P53病毒液是否表达P53蛋白
1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以10MOI的剂量感染实施例1制备的rClone30-P53病毒液，置于5％CO2、37℃环境中静置培养48h，然后取细胞并用pH7.4的PBS缓冲液洗涤两次，然后将细胞置于裂解缓冲液(溶剂为pH7.4、10mmol/L的Tris-HCl缓冲液；溶质及其浓度为：1mmol/L MgCl2、体积比为0.5％的NP-40、20μg/mLDnaseI)中4℃裂解30min，然后15000r/min离心10min，收集上清液并进行Westernblot检测，结果见图1的泳道2。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-P53病毒液，其它同步骤1，结果见图1的泳道1。
结果表明，rClone30-P53病毒能够稳定表达P53蛋白,而rClone30病毒不表达P53蛋白。
实施例3、检测rClone30-P53病毒液对各个相关基因表达量的影响
p21基因和HDM基因是HepG2细胞中的基因。P53蛋白能诱导p21蛋白,p21蛋白能抑制cdk2酶的活性,从而阻碍细胞进入DNA合成期,使细胞不能进行分裂。HDM蛋白与P53蛋白结合后，刺激多个特异性的泛素分子标记在P53蛋白的C-末端上，从而使P53能被胞浆中的蛋白水解酶识别并降解；P53蛋白在细胞内低浓度又可减少HDM基因转录，将HDM-P53负反馈环路关闭，使P53蛋白回到维持正常功能状态的水平。
1、将对数生长期的HepG2细胞进行胰酶消化，然后用含10％小牛血清的DMEM培养基制成1×104个细胞/mL的细胞悬液；将细胞悬液接种于六孔板(每孔2毫升)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h；然后感染实施例1制备的rClone30-P53病毒液(分别设置如下感染剂量：0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI、1MOI或10MOI)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h；然后收集细胞，提取总RNA并反转录为cDNA，通过实时荧光定量PCR检测P53基因、p21基因和HDM基因的相对表达量(以β-actin基因为内参基因)。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-P53病毒液，其它同步骤1。
用于检测P53基因的引物对如下：
上游引物：5’-TAACAGTTCCTGCATGGGCGGC-3’；
下游引物：5’-AGGACAGGCACAAACACGCACC-3’。
用于检测p21基因的引物对如下：
上游引物：5’-CTGGAGACTCTCAGGGTCGAAA-3’；
下游引物：5’-GATTAGGGCTTCCTCTTGGAGAA-3’。
用于检测HDM基因的引物对如下：
上游引物：5’-CCCTGGTTAGACCAAAGCCAT-3’；
下游引物：5’-GGCACGCCAAACAAATCTCC-3’。
P53基因的相对表达量见图2，rClone30-P53中存在P53基因的表达,而rClone30病毒中不存在P53基因的表达。p21基因的相对表达量见图3。HDM基因的相对表达量见图4。结果表明，rClone30-P53病毒的P53基因可以在肿瘤细胞内有效表达，并调节p21基因的表达量从而影响到肿瘤细胞的凋亡，并且也影响到凋亡相关基因HDM表达量的变化。
实施例4、rClone30-P53病毒对肿瘤细胞的作用效果
肿瘤细胞为HepG-2细胞或U251细胞。
一、MTT法检测rClone30-P53病毒对肿瘤细胞的抑制作用
1、将对数生长期的肿瘤细胞进行胰酶消化，然后用含10％小牛血清的DMEM培养基制成2×104个细胞/mL的细胞悬液；将细胞悬液接种于96孔板(每孔200微升)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤；然后感染实施例1制备的rClone30-P53病毒液(分别设置如下感染剂量：0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI、1MOI或10MOI；设置用等体积含10％小牛血清的DMEM培养基代替rClone30-P53病毒液的对照处理)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养1h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤；然后每孔加入含5％小牛血清的DMEM培养基，置于5％CO2、37℃环境中静置培养48h；然后每孔加入20μL MTT溶液并37℃孵育4h，吸弃培养上清，每孔加入150μL DMSO，震荡混匀10min，用酶联免疫仪测定OD值(测定波长为490nm)，计算细胞生长的抑制率。
抑制率＝(对照处理孔的OD值-试验处理孔的OD值)/对照处理孔的OD值。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-P53病毒液，其它同步骤1。
对HepG-2细胞的抑制率见图5。对U251细胞的抑制率见图6。结果表明，rClone30-P53病毒对肿瘤细胞的抑制作用强于rClone30病毒，且抑制率与病毒剂量呈明显的剂量依赖性关系。
二、Annexin V/PI法检测rClone30-P53病毒对肿瘤细胞的杀伤效果
Binding Buffer：Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒的组件。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司。
1、将对数生长期的肿瘤细胞进行胰酶消化，然后用含10％小牛血清的DMEM培养基制成1×104个细胞/mL的细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板(每孔2毫升)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤；然后感染实施例1制备的rClone30-P53病毒液(分别设置如下感染剂量：0.1MOI、1MOI或10MOI；设置用等体积DMEM培养基代替rClone30-P53病毒液的空白对照处理)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养1h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤；然后每孔加入含5％小牛血清的DMEM培养基，置于5％CO2、37℃环境中静置培养48h；收集细胞，用含0.25％(质量比)胰酶的DMEM培养基消化细胞，然后用PBS缓冲液洗涤2次，然后取(0.5-1)×106个细胞，用200μL Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μL FITC标记的Annexin-V，室温下混匀避光反应30min，最后加入5μL PI和300μL Binding Buffer，避光反应10min后用流式细胞仪定量检测。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-P53病毒液，其它同步骤1。
肿瘤细胞为HepG-2细胞时的结果见图7。
肿瘤细胞为U251细胞时的结果见图8。
结果表明，rClone30-P53病毒和rClone30病毒均能诱导肿瘤细胞发生凋亡，且细胞凋亡的程度对病毒剂量呈现剂量依赖性，rClone30-P53病毒的效果强于rClone30病毒。
三、PI单染法检测rClone30-P53病毒对肿瘤细胞细胞周期的影响
1、将对数生长期的肿瘤细胞进行胰酶消化，然后用含10％小牛血清的DMEM培养基制成1×104个细胞/mL的细胞悬液；将细胞悬液接种于6孔板(每孔2毫升)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养24h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤；然后感染实施例1制备的rClone30-P53病毒液(分别设置如下感染剂量：0.001MOI、0.01MOI、0.1MOI、1MOI或10MOI；设置用等体积DMEM培养基代替rClone30-P53病毒液的对照处理)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养2h，吸弃培养上清，用PBS缓冲液洗涤；然后每孔加入含5％小牛血清的DMEM培养基，置于5％CO2、37℃环境中静置培养36h；收集细胞，用含0.25％(质量比)胰酶的DMEM培养基消化细胞，然后用PBS缓冲液洗涤2次，然后取(0.5-1)×106个细胞，加入500μL 70％乙醇水溶液固定细胞24h，然后用PBS缓冲液洗涤2次，然后用500μL PBS缓冲液悬浮细胞并加入1μL PI染液，混匀避光反应30min，用流式细胞仪定量检测细胞生长周期。
2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-P53病毒液，其它同步骤1。
结果表明，与rClone30病毒相比，rClone30-P53病毒诱导细胞凋亡的效果更加显著，且具有促使肿瘤细胞周期停滞的效果。
实施例5、rClone30-P53病毒对肿瘤的治疗作用及病毒安全性检测
一、rClone30-P53病毒对肿瘤的治疗作用
1、建立H22肝癌动物模型
(1)取H22细胞，用PBS缓冲液制备得到106个细胞/mL的细胞悬液。
(2)取6周龄ICR小鼠，每只右侧腹股沟皮下注入剂量0.2mL步骤(1)制备的细胞悬液，正常饲养小鼠，10天后形成5-8mm直径的实体瘤的小鼠，即为模型小鼠。
2、rClone30-P53病毒对肿瘤的治疗作用
将模型小鼠随机分为三组，每组6只，分别处理如下：
rClone30-P53组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30-P53病毒液(含104pfu病毒)；
rClone30组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30病毒液(含104pfu病毒)；
PBS组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的瘤内注射0.2mL PBS缓冲液。
每天测量肿瘤体积，结果见图9(治疗前为试验第1天的前1天)。结果表明，与rClone30病毒相比，rClone30-P53病毒抑制肿瘤生长的效果更加显著。
二、rClone30-P53病毒的安全性检测
1、急性毒性试验
取10只健康4-6周龄ICR小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射实施例1制备的rClone30-P53病毒液(含104pfu病毒)，注射之后观察48h。
小鼠均未出现如下任何不良反应：呼吸受到抑制、四肢步伐不平稳、瘫痪症状、惊厥、皮毛战栗、死亡。
2、亚急性毒性试验
取10只健康4-6周龄ICR小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射实施例1制备的rClone30-P53病毒液(含104pfu病毒)，注射之后观察4周。
小鼠进水、进食、毛色、体重等方面均正常，无任何不良反应，无死亡。
结果表明，rClone30-P53病毒对小鼠的正常生长无不良影响，安全性可靠。

Claims (10)

1.一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-P53、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述pBrClone30-P53为具有序列表的序列3自5’末端第2703-19045位核苷酸所示的DNA分子的质粒。
2.如权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述重组质粒pBrClone30-P53为序列表的序列3所示的质粒。
3.如权利要求1或2所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述哺乳动物细胞为BHK-21细胞。
4.一种重组新城疫病毒，其基因组DNA如序列表的序列3自5’末端第2703-19045位核苷酸所示。
5.权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)促使肿瘤细胞周期停滞；(d)治疗肿瘤。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述(d)中，所述肿瘤为肝癌。
8.一种产品，包括权利要求1至4中任一所述的重组新城疫病毒；所述产品的功能为如下(a)、(b)、(c)或(d)：(a)抑制肿瘤细胞增殖；(b)杀伤肿瘤细胞；(c)促使肿瘤细胞周期停滞；(d)治疗肿瘤。
9.如权利要求8所述的产品，其特征在于：所述(a)和/或所述(b)和/或所述(c)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞或神经胶质细胞瘤细胞。
10.如权利要求8所述的产品，其特征在于：所述(d)中，所述肿瘤为肝癌。
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