CN105734023A - 一种重组新城疫病毒在制备抗肝癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组新城疫病毒在制备抗肝癌药物中的应用。本发明提供了一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/NP?PIL2、pBL?N质粒、pBL?P质粒和pBL?L质粒共转染离体哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；所述重组质粒pBrClone30/NP?PIL2中包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。本发明结果对治疗肿瘤具有重要意义。

Description

一种重组新城疫病毒在制备抗肝癌药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种重组新城疫病毒在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是危害人类健康的重大疾病之一，目前全球每年大约有1100多万人罹患癌症，并有800多万人死于癌症。
据2012年全球癌症统计(Globe cancer stactics)报告显示：全世界2012年肝癌新发肝癌74.8万人，在所有癌症发病率中位列第六位，位于肺癌，乳腺癌，结直肠癌，胃癌，前列腺癌之后：当年死亡69.5万人，位于肺癌，胃癌之后，居第三位。2012年全国肿瘤统计显示肝癌新发2012年中国男性肝癌发病率为293318人，女性肝癌发病率为101452人，男女共有394770人发病，占到全球新发肝癌患者的52.7％，名副其实的全球第一。而且中国的肝癌患者仍然在增长，在2015年，中国男性肝癌发病率为326698，女性肝癌发病率为111017，两者相加437715人。
长期以来，人们治疗癌症的方法主要以传统的手术切除和放化疗为主，这些手段可以在一定程度上控制肿瘤的发展，但是对于晚期肿瘤扩散患者的疗效有限，并且这些手段同时对人体的正常细胞产生严重的创伤。
因此，急需一种新的治疗肝癌的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组新城疫病毒在制备抗肝癌药物中的应用。
本发明提供了一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染离体哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；
所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2中包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。
所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2中依次包括如下元件：所述新城疫病毒的NP基因、所述IL2基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
所述IL2基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第4642-5103位核苷酸所示。所示新城疫病毒的NP基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第2852-4321位核苷酸所示。所述新城疫病毒的P基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第5139-6326位核苷酸所示。所述新城疫病毒的M基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第6542-7636位核苷酸所示。所述新城疫病毒的F基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第7796-9457位核苷酸所示。所述新城疫病毒的HN基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第9664-11397位核苷酸所示。所述新城疫病毒的L基因具体可如序列表的序列3中自5’末端第11633-18247位核苷酸所示。
所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2中，所述IL2基因的存在形式具体为序列表的序列1自5’末端第9至507位核苷酸所示的DNA分子。
所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2可为具有序列表的序列3自5’末端第2786-18325位核苷酸所示的DNA分子的质粒。所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2具体可为序列表的序列3所示的质粒。
所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。
所述重组新城疫病毒的制备方法具体如下：
(1)将所述重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒ppBrClone30/IL2@NP-P、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h；
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液(其中含有所述重组新城疫病毒)。
所述重组新城疫病毒的制备方法具体如下：
(1)将所述重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μg pBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h；
(2)取步骤(1)得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(3)取步骤(2)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(4)取步骤(3)得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；
(5)将步骤(2)得到的鸡胚尿囊液、步骤(3)得到的鸡胚尿囊液和步骤(4)得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为重组新城疫病毒病毒液。
本发明还保护一种重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。
所述重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA依次包括如下元件：所述新城疫病毒的NP基因、所述IL2基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
所述的重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA中，所述IL2基因的存在形式具体为序列表的序列1自5’末端第9至507位核苷酸所示的DNA分子。
所述的重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA如序列表的序列3自5’末端第2786-18325位核苷酸所示。
本发明还保护一种重组质粒，依次包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。
所述重组质粒依次包括如下元件：所述新城疫病毒的NP基因、所述IL2基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
所述重组质粒中，所述IL2基因的存在形式具体为序列表的序列1自5’末端第9至507位核苷酸所示的DNA分子。
所述重组质粒可为具有序列表的序列3自5’末端第2786-18325位核苷酸所示的DNA分子的质粒。所述重组质粒具体可为序列表的序列3所示的质粒。
本发明还保护以上任一所述的重组新城疫病毒或重组质粒在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)表达IL2；(b)治疗肿瘤；(c)抑制肿瘤细胞增殖。所述(c)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。所述(b)中，所述肿瘤为肝癌。
本发明还保护一种产品，包括以上任一所述的重组新城疫病毒或重组质粒；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)表达IL2；(b)治疗肿瘤；(c)抑制肿瘤细胞增殖。所述(c)中，所述肿瘤细胞为肝癌细胞。所述(b)中，所述肿瘤为肝癌。
所述IL2可为人所述IL2。所述IL2具体可为序列表的序列1自5’末端第24至485位核苷酸编码的蛋白质。
新城疫病毒(Newacstle disease virTs，NDV)为不分节段的单股负链RNA病毒，隶属副粘病毒科副粘病毒亚科的禽副粘病毒属。本发明的发明人经过大量试验发现，在新城疫病毒的NP基因和P基因之间插入外源基因(人IL-2基因)的表达量在肝癌细胞、乳腺癌细胞、神经胶质瘤细胞和宫颈癌细胞中表达量均显著高于其他位点，而且，病毒的繁殖周期没有影响，这一结果为新城疫病毒作为载体插入外源基因治疗肿瘤具有重要意义。
附图说明
图1为实施例3中重组新城疫病毒增殖稳定性的结果。
图2为实施例4中流式细胞仪检测重组病毒感染肿瘤细胞后EGFP荧光强度的结果。
图3为待测细胞为A549细胞时，EGFP基因的相对表达水平。
图4为待测细胞为Hela细胞时，EGFP基因的相对表达水平。
图5为待测细胞为U251细胞时，EGFP基因的相对表达水平。
图6为待测细胞为HepG2细胞时，EGFP基因的相对表达水平。
图7为待测细胞为A549细胞时，IL2基因的相对表达水平。
图8为待测细胞为Hela细胞时，IL2基因的相对表达水平。
图9为待测细胞为U251细胞时，IL2基因的相对表达水平。
图10为待测细胞为HepG2细胞时，IL2基因的相对表达水平。
图11为试验第0天至14天，尿囊液组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图12为试验第0天至14天，rClone30组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图13为试验第0天至14天，rClone30/IL2@NP-P组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图14为试验第0天至14天，rClone30/IL2@P-M组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图15为试验第0天至14天，rClone30/IL2@M-F组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
图16为试验第0天至14天，rClone30/IL2@F-HN组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中所用的PBS缓冲液，如无特殊说明，均为pH7.2、0.1M的PBS缓冲液。
BHK-21细胞：ATCC,ATCC编号为CRL-13001。HepG2细胞(人肝癌细胞)：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,产品目录号为TCHT 72。U251细胞(人神经胶质细胞瘤细胞)：中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，产品目录号为TCHT 58。胰酶：Sigma，产品目录号为8049-47-6。H22细胞(小鼠肝癌细胞)：ATCC公司，产品目录号为58426。DF-1细胞：上海复祥生物科技有限公司。A549细胞：上海复祥生物科技有限公司。Hela细胞：上海复祥生物科技有限公司。C57bl/6小鼠：长春亿斯实验动物。
提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tTmor activity ofNewcastle disease virTs by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。
提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineeredNewcastle disease virTs expressing interleTkin 2 is a potential drTgcandidate for cancer immTnotherapy,FTliang Bai,ImmTnology letters.。
pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中NP基因和P基因之间具有AscI和SfiI酶切识别位点。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。
鸡血红细胞凝集(HA)试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入50μL生理盐水；(2)在第1孔中加入50μL待测病毒液，混匀后吸50μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第11孔混匀后弃除50μL；(3)在1-12孔中各加入50μL 1％鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。
鸡血红细胞凝集抑制(HI)试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第11孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液(4个血凝单位)，室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1％鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。
实施例1、rClone30/IL2@NP-P病毒液的制备
一、重组质粒的构建
1、合成序列表的序列1所示的双链DNA分子。
序列表的序列1中，自5’末端第1至8位核苷酸为限制性核酸内切酶AscⅠ的识别序列，第18至第23位核苷酸为Kozak序列，第24至485位核苷酸为IL2基因区段(全长IL2基因)，第486至第496位核苷酸位Gene end序列，第497位核苷酸为基因间隔序列(IG)，第498至507位核苷酸为Gene start序列，第508至520位核苷酸为限制性内切酶Sfi I的识别序列。
2、用限制性内切酶AscⅠ和Sfi I双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶AscⅠ和Sfi I双酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P。经测序，重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P为序列表的序列3所示的环形质粒。序列表的序列3中，自5’末端第4642-5103位核苷酸为所述IL2基因区段。序列表的序列3中，自5’末端第2786-18325位核苷酸为rClone30/IL2@NP-P病毒的基因组。
序列表的序列3中，自5’末端第2852-4321位核苷酸为NP基因、第5139-6326位核苷酸为P基因、第6542-7636位核苷酸为M基因、第7796-9457位核苷酸为F基因、第9664-11397位核苷酸为HN基因、第11633-18247位核苷酸为L基因。
5、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
序列表的序列2中，自5’末端第1至8位核苷酸为限制性核酸内切酶AscⅠ的识别序列，第18至第23位核苷酸为Kozak序列，第24至743位核苷酸为EGFP基因区段(全长EGFP基因)，第744至第754位核苷酸为Gene end序列，第755位核苷酸为基因间隔序列(IG)，第756至765位核苷酸为Gene start序列，第766至778位核苷酸为限制性内切酶Sfi I的识别序列。
6、用限制性内切酶AscⅠ和Sfi I双酶切步骤5得到的双链DNA分子，回收酶切产物。
7、用限制性内切酶AscⅠ和Sfi I双酶切pBrClone30质粒，回收约18kb的载体骨架。
8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30/EGFP@NP-P。
9、分别构建重组质粒pBrClone30/IL2@P-M、重组质粒pBrClone30/IL2@M-F、重组质粒pBrClone30/IL2@F-HN、重组质粒pBrClone30/EGFP@P-M、重组质粒pBrClone30/EGFP@M-F、重组质粒pBrClone30/EGFP@F-HN。
重组质粒pBrClone30/IL2@P-M的构建方法如下：(1)将pBrClone30质粒中序列表的序列3自5’末端第6425-6497位核苷酸取代为序列表的序列4所示的核苷酸，得到中间质粒；(2)将序列表的序列1自5’末端第9至507位核苷酸所示的DNA分子插入步骤(1)得到的中间质粒的HpaI和MluI酶切位点之间，得到重组质粒pBrClone30/IL2@P-M。
重组质粒pBrClone30/EGFP@P-M的构建方法如下：(1)将pBrClone30质粒中序列表的序列3自5’末端第6425-6497位核苷酸取代为序列表的序列4所示的核苷酸，得到中间质粒；(2)将序列表的序列2自5’末端第9至765位核苷酸所示的DNA分子插入步骤(1)得到的中间质粒的HpaI和MluI酶切位点之间，得到重组质粒pBrClone30/EGFP@P-M。
重组质粒pBrClone30/IL2@M-F的构建方法如下：(1)将pBrClone30质粒中序列表的序列3自5’末端第7666-7795位核苷酸取代为序列表的序列5所示的核苷酸，得到中间质粒；(2)将序列表的序列1自5’末端第9至507位核苷酸所示的DNA分子插入步骤(1)得到的中间质粒的SacII和PmeI酶切位点之间，得到重组质粒pBrClone30/IL2@M-F。
重组质粒pBrClone30/EGFP@M-F的构建方法如下：(1)将pBrClone30质粒中序列表的序列3自5’末端第7666-7795位核苷酸取代为序列表的序列5所示的核苷酸，得到中间质粒；(2)将序列表的序列2自5’末端第9至765位核苷酸所示的DNA分子插入步骤(1)得到的中间质粒的SacII和PmeI酶切位点之间，得到重组质粒pBrClone30/EGFP@M-F。
重组质粒pBrClone30/IL2@F-HN的构建方法如下：(1)将pBrClone30质粒中序列表的序列3自5’末端第9491-9563位核苷酸取代为序列表的6所示的核苷酸，得到中间质粒；(2)将序列表的序列1自5’末端第9至507位核苷酸所示的DNA分子插入步骤(1)得到的中间质粒的SacII和MluI酶切位点之间，得到重组质粒pBrClone30/IL2@F-HN。
重组质粒pBrClone30/EGFP@F-HN的构建方法如下：(1)将pBrClone30质粒中序列表的序列3自5’末端第9491-9563位核苷酸取代为序列表的6所示的核苷酸，得到中间质粒；(2)将序列表的序列2自5’末端第9至765位核苷酸所示的DNA分子插入步骤(1)得到的中间质粒的SacII和MluI酶切位点之间，得到重组质粒pBrClone30/IL2@F-HN。
二、重组病毒的制备
1、将重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞(每1×106个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P、0.5μg pBL-N质粒、0.25μgpBL-P质粒和0.1μgpBL-L质粒)，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h。
2、取步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液。
5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液。该混合液的HA效价为211，HI效价为29。
将步骤5得到的混合液命名为rClone30/IL2@NP-P病毒液。
三、对照病毒的制备
用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。
用重组质粒pBrClone30/IL2@P-M代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/IL2@P-M病毒液。
用重组质粒pBrClone30/IL2@M-F代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/IL2@M-F病毒液。
用重组质粒pBrClone30/IL2@F-HN代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/IL2@F-HN病毒液。
用rClone30/EGFP@NP-P质粒代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/EGFP@NP-P病毒液。
用rClone30/EGFP@P-M质粒代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为pBrClone30/EGFP@P-M病毒液。
用rClone30/EGFP@M-F质粒代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/EGFP@M-F病毒液。
用rClone30/EGFP@F-HN质粒代替重组质粒pBrClone30/IL2@NP-P进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30/EGFP@F-HN病毒液。
实施例2、重组病毒的鸡胚稳定性检测
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/IL2@NP-P病毒液、rClone30/IL2@P-M病毒液、rClone30/IL2@M-F病毒液、rClone30/IL2@F-HN病毒液、rClone30/EGFP@NP-P病毒液、rClone30/EGFP@P-M病毒液、rClone30/EGFP@M-F病毒液或rClone30/EGFP@F-HN病毒液。
取100μL待测病毒液(第1代病毒液)，用灭菌后的PBS缓冲液稀释，然后经由尿囊腔接种至9-11日龄SPF鸡胚中，37℃培养72h。收集HA阳性的鸡胚尿囊液(第2代病毒液)然后经由尿囊腔接种至9-11日龄SPF鸡胚中，37℃培养72h。按照相同的方法进行连续传代。
取第1代、第3代、第5代、第8代和第10代鸡胚尿囊液各100μL并按Reed-MTench两氏法计算每毫升病毒液的TCID50。
进行三次重复试验，结果取平均值。
结果见表1。结果表明，rClone30/IL2@NP-P病毒液、rClone30/IL2@P-M病毒液、rClone30/IL2@M-F病毒液、rClone30/IL2@F-HN病毒液、rClone30/EGFP@NP-P病毒液、rClone30/EGFP@P-M病毒液、rClone30/EGFP@M-F病毒液、rClone30/EGFP@F-HN病毒液均具有增殖稳定性。
表1 各代鸡胚尿囊液的HA滴度和TCID50
实施例3、重组新城疫病毒增殖稳定性
分别将实施例1制备的rClone30病毒液、rClone30/IL2@NP-P病毒液、rClone30/IL2@P-M病毒液、rClone30/IL2@M-F病毒液或rClone30/IL2@F-HN病毒液按0.1MOI感染六孔板内汇合度为80％-90％的单层DF-1细胞，置于5％CO2、37℃环境中静置培养72h。分别于培养24h、48h、72h和96h时取上清，采用Reed-Muench法计算每毫升重组病毒的TCID50。
结果见图1，rClone30病毒、rClone30/IL2@NP-P病毒、rClone30/IL2@P-M病毒、rClone30/IL2@M-F病毒或rClone30/IL2@F-HN病毒保持着一致的繁殖滴度。
实施例4、利用流式细胞仪检测重组病毒感染肿瘤细胞后EGFP荧光强度
待测病毒液为实施例1制备的rClone30/EGFP@NP-P病毒液、rClone30/EGFP@P-M病毒液、rClone30/EGFP@M-F病毒液或rClone30/EGFP@F-HN病毒液。
待测细胞为HepG2细胞、A549细胞、Hela细胞或U251细胞。
1、取对数生长期的待测细胞，以1MOI的剂量感染待测病毒液，37℃静置孵育48h。设置用等体积PBS缓冲液代替待测病毒液的空白对照。
2、完成步骤1后，1700r/min离心5min，收集细胞沉淀，用预冷的PBS缓冲液洗涤两次。
3、用PBS缓冲液重悬步骤2得到的沉淀，利用流式细胞仪进行检测。
结果见图2。结果表明：与各个空白对照相比，感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液、rClone30/EGFP@P-M病毒液、rClone30/EGFP@M-F病毒液或rClone30/EGFP@F-HN病毒液的各个待测细胞都能检测到荧光，其中感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液的各个待测细胞细胞的荧光强度最高。
实施例5、real-time PCR检测EGFP基因和IL2基因mRNA表达。
待测病毒液为实施例1制备的rClone30病毒液、rClone30/IL2@NP-P病毒液、rClone30/IL2@P-M病毒液、rClone30/IL2@M-F病毒液、rClone30/IL2@F-HN病毒液、rClone30/EGFP@NP-P病毒液、rClone30/EGFP@P-M病毒液、rClone30/EGFP@M-F病毒液或rClone30/EGFP@F-HN病毒液。
待测细胞为A549细胞、Hela细胞、U251细胞或HepG2细胞。
1、取对数生长期的待测细胞，以1MOI的剂量感染待测病毒液，37℃静置孵育48h。
2、完成步骤1后，取细胞，提取总RNA并反转录为cDNA。
3、以步骤2得到的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测IL2基因或EGFP基因的相对表达情况(以β-actin基因为内参基因)。
用于检测IL2基因的引物对如下：
上游引物：5’-ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTT-3’；
下游引物：5’-TCAAGTCAGTGTTGAGATGATGCTT-3’。
待测细胞为A549细胞时，EGFP基因的相对表达水平见图3。结果表明：EGFP基因的相对表达水平由高至低的顺序依次为感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@P-M病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@M-F病毒液的细胞和感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞，两两之间均具有显著差异，感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞中EGFP基因的相对表达水平极低。结果表明：感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液可有效表达EGPF基因。
待测细胞为Hela细胞时，EGFP基因的相对表达水平见图4。结果表明：EGFP基因的相对表达水平由高至低的顺序依次为感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@P-M病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@M-F病毒液的细胞和感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞，感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液的细胞与感染rClone30/EGFP@P-M病毒液的细胞之间具有显著差异，感染rClone30/EGFP@M-F病毒液的细胞与感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞之间具有显著差异，感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞中EGFP基因的相对表达水平极低。结果表明：感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液可有效表达EGPF基因。
待测细胞为U251细胞时，EGFP基因的相对表达水平见图5。结果表明：EGFP基因的相对表达水平由高至低的顺序依次为感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@P-M病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@M-F病毒液的细胞和感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞，两两之间均具有显著差异，感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞中EGFP基因的相对表达水平极低。结果表明：感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液可有效表达EGPF基因。
待测细胞为HepG2细胞时，EGFP基因的相对表达水平见图6。结果表明：EGFP基因的相对表达水平由高至低的顺序依次为感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@P-M病毒液的细胞、感染rClone30/EGFP@M-F病毒液的细胞和感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞，两两之间均具有显著差异，感染rClone30/EGFP@F-HN病毒液的细胞中EGFP基因的相对表达水平极低。结果表明：感染rClone30/EGFP@NP-P病毒液可有效表达EGPF基因。
待测细胞为A549细胞时，IL2基因的相对表达水平见图7。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液的细胞中IL2基因的相对表达水平最高，其次是感染rClone30/IL2@P-M病毒液的细胞，两者之间具有显著差异。感染rClone30/IL2@M-F病毒液的细胞、感染rClone30/IL2@F-HN病毒液的细胞和感染rClone30病毒液的细胞中基本检测不到IL2基因的表达。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液可有效表达IL2基因。
待测细胞为Hela细胞时，IL2基因的相对表达水平见图8。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液的细胞中IL2基因的相对表达水平最高，其次是感染rClone30/IL2@P-M病毒液的细胞，两者之间具有显著差异。感染rClone30/IL2@M-F病毒液的细胞、感染rClone30/IL2@F-HN病毒液的细胞和感染rClone30病毒液的细胞中基本检测不到IL2基因的表达。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液可有效表达IL2基因。
待测细胞为U251细胞时，IL2基因的相对表达水平见图9。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液的细胞中IL2基因的相对表达水平最高，其次是感染rClone30/IL2@P-M病毒液的细胞，两者之间具有显著差异。感染rClone30/IL2@M-F病毒液的细胞、感染rClone30/IL2@F-HN病毒液的细胞和感染rClone30病毒液的细胞中基本检测不到IL2基因的表达。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液可有效表达IL2基因。
待测细胞为HepG2细胞时，IL2基因的相对表达水平见图10。结果表明：IL2基因的相对表达水平由高至低的顺序依次为感染rClone30/IL2@NP-P病毒液的细胞、感染rClone30/IL2@P-M病毒液的细胞、感染rClone30/IL2@M-F病毒液的细胞、感染rClone30/IL2@F-HN病毒液的细胞，两两之间具有显著差异，感染rClone30病毒液的细胞中基本检测不到IL2基因的表达。结果表明：感染rClone30/IL2@NP-P病毒液可有效表达IL2基因。
实施例6、重组病毒对肿瘤的治疗作用
一、rClone30/IL2@NP-P病毒对肝癌的治疗作用
1、建立H22肝癌动物模型
(1)取H22细胞，用PBS缓冲液悬浮，得到106个细胞/mL的细胞悬液。
(2)取6周龄C57bl/6小鼠，每只右侧腹股沟皮下注入剂量0.2mL步骤(1)制备的细胞悬液，正常饲养小鼠，10天后形成5-8mm直径的实体瘤的小鼠，即为模型小鼠。
2、rClone30/IL2@NP-P病毒对肿瘤的治疗作用
将模型小鼠随机分为六组，每组10只，分别处理如下：
rClone30/IL2@NP-P组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/IL2@NP-P病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30/IL2@P-M组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/IL2@P-M病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30/IL2@M-F组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/IL2@M-F病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30/IL2@F-HN组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30/IL2@F-HN病毒液(含107pfu病毒)；
rClone30组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL实施例1制备的rClone30病毒液(含107pfu病毒)；
尿囊液组：分别于试验第1天、第3天、第5天和第7天，各向每只模型小鼠的实体瘤内注射0.2mL鸡胚尿囊液。
每两天测量肿瘤体积，绘制肿瘤体积生长曲线。
试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，尿囊液组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图11。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图12。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/IL2@NP-P组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图13。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/IL2@P-M组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图14。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/IL2@M-F组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图15。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，rClone30/IL2@F-HN组10只小鼠的肿瘤体积生长曲线见图16。试验第0天(第0天指的是注射病毒液前)至试验第14天，各试验组肿瘤平均体积见表2。
表2 肿瘤体积(mm3，该组的平均值)
PBS rClone30 rClone30/IL2@NP-P rClone30/IL2@P-M rClone30/IL2@M-F rClone30/IL2@F-HN
第0天 133.3428 140.1347 127.034 135.846 128.0338 129.8548
第2天 182.2284 243.5569 150.9174 155.5264 178.9095 164.5728
第4天 409.0822 342.4714 153.077 175.7106 214.2573 180.7738
第6天 521.6181 382.0421 118.624 189.5933 202.361 158.732
第8天 673.1526 428.0976 78.37673 197.4358 261.215 193.7865
第10天 909.9323 429.6397 56.06194 221.7638 225.9455 184.8647
第12天 1386.022 439.1864 49.75799 201.9216 235.6793 164.4554
第14天 1788.106 359.0703 30.15612 186.9016 213.722 176.0648
结果表明，与尿囊液组相比，rClone30病毒液、rClone30/IL2@NP-P病毒液、rClone30/IL2@P-M病毒液、rClone30/IL2@M-F病毒液和rClone30/IL2@F-HN病毒液对肿瘤均有抑制效果，其中rClone30/IL2@NP-P病毒液和rClone30/IL2@P-M病毒液之间效果差异不显著，rClone30/IL2@NP-P病毒液与尿囊液组有显著性差异。
二、rClone30/IL2@NP-P病毒的安全性检测
1、急性毒性试验
取10只健康4-6周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射rClone30/IL2@NP-P病毒液(含107pfu病毒)，注射之后观察48h。
小鼠均未出现如下任何不良反应：呼吸受到抑制、四肢步伐不平稳、瘫痪症状、惊厥、皮毛战栗、死亡。
2、亚急性毒性试验
取10只健康4-6周龄C57BL/6小鼠，雌雄各半，每只小鼠腹腔内注射rClone30/IL2@NP-P病毒液(含107pfu病毒)，注射之后观察4周。
小鼠进水、进食、毛色、体重等方面均正常，无任何不良反应，无死亡。
结果表明，rClone30/IL2@NP-P病毒对小鼠的正常生长无不良影响，安全性可靠。

Claims (10)

1.一种重组新城疫病毒，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述重组新城疫病毒；
所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2中包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2中依次包括如下元件：所述新城疫病毒的NP基因、所述IL2基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
3.如权利要求2所述的重组新城疫病毒，其特征在于：所述重组质粒pBrClone30/NP-P@IL2为具有序列表的序列3自5’末端第2786-18325位核苷酸所示的DNA分子的质粒。
4.一种重组新城疫病毒，其基因组对应的DNA包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。
5.如权利要求4所述的重组新城疫病毒，其特征在于：其基因组对应的DNA依次包括如下元件：所述新城疫病毒的NP基因、所述IL2基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
6.如权利要求5所述的重组新城疫病毒，其特征在于：其基因组对应的DNA如序列表的序列3自5’末端第2786-18325位核苷酸所示。
7.一种重组质粒，依次包括如下元件：IL2基因、新城疫病毒的NP基因、新城疫病毒的P基因、新城疫病毒的M基因、新城疫病毒的F基因、新城疫病毒的HN基因和新城疫病毒的L基因；所述IL2基因位于所述新城疫病毒的NP基因和所述新城疫病毒的P基因之间。
8.如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于：依次包括如下元件：所述新城疫病毒的NP基因、所述IL2基因、所述新城疫病毒的P基因、所述新城疫病毒的M基因、所述新城疫病毒的F基因、所述新城疫病毒的HN基因和所述新城疫病毒的L基因。
9.权利要求1至6中任一所述的重组新城疫病毒，或，权利要求7或8所述的重组质粒，在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)表达IL2；(b)治疗肿瘤；(c)抑制肿瘤细胞增殖。
10.一种产品，包括权利要求1至6中任一所述的重组新城疫病毒或权利要求7或8所述的重组质粒；所述产品的功能为如下(a)和/或(b)和/或(c)：(a)表达IL2；(b)治疗肿瘤；(c)抑制肿瘤细胞增殖。
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