CN104357409A - 表达鸡il2重组新城疫病毒及其在疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡新城疫病毒毒株及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。本发明提供的鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL2为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3自5ˊ末端2703-18414位核苷酸即为rClone30-chIL2病毒的基因组DNA。本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂chIL2，可以有效提高免疫效果，提高免疫保护率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。

Description

表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及一种表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。 

背景技术

新城疫病毒（Newcastle Disease Virus，NDV）是危害养禽界的烈性传染病之一，已被国际兽疫局（The Office International des Epizooties, OIE）列定为A类传染疾病。如今，虽然没有发生世界性的大流行，但局部地区的疫情时有发生，给养禽界带来巨大经济损失，我国每年用于防治新城疫病（Newcastle Disease，ND）的疫苗达到上亿元。目前，灭活疫苗和弱毒疫苗在ND免疫预防中最为常用。 

白细胞介素2(Interleukin 2，IL2)主要是由T淋巴细胞或T淋巴细胞系产生的一类重要的淋巴因子，在抗肿瘤、抗毒素、免疫调节及感染性疾病的治疗中具有重要作用。 

对哺乳动物的IL2在B、T细胞的增殖和分化，增强NK细胞、单核细胞杀伤活性等功能中发挥着重要的作用，甚至可对神经系统发挥免疫调节作用。鸡的IL2作为第一个克隆的非哺乳动物的IL2，又与哺乳动物的IL2分子有明显的不同。 

除了T细胞外，IL2对免疫系统的其它细胞都有直接或间接的影响。在间接的方面，IL2分别刺激IFNα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和B细胞生长因子(即调节巨噬细胞及B细胞活性的细胞因子)的产生，所以rChL2的产生为我们研究禽免疫学提供了一个有用的工具，同样也可作为一种潜在疫苗增强剂。 

发明内容

本发明的目的是提供一种表达鸡IL2重组新城疫病毒及其在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。 

本发明提供的鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-chIL2病毒），其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL2为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。序列表的序列3即为rClone30-chIL2病毒的基因组DNA。 

所述重组质粒rClone30-chIL2具体可为序列表的序列3所示的质粒。 

所述哺乳动物细胞具体可为BHK-21细胞。 

rClone30-chIL2病毒的制备方法具体如下： 

（1）将所述重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×106个细胞转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL2、0.5μg pBL-N质粒、0.25μgpBL-P 质粒和0.1μgpBL-L质粒），置于5% CO2、37℃环境中静置培养72h；

（2）取步骤（1）得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（3）取步骤（2）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（4）取步骤（3）得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液；

（5）将步骤（2）得到的鸡胚尿囊液、步骤（3）得到的鸡胚尿囊液和步骤（4）得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液，即为rClone30-chIL2病毒液。

本发明还保护一种鸡新城疫病毒毒株（命名为rClone30-chIL2病毒），其基因组DNA如序列表的序列3所示。 

本发明还保护以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。 

本发明还保护一种鸡新城疫病疫苗，包括以上任一所述的鸡新城疫病毒毒株。 

本发明提供一种新的鸡新城疫病毒毒株，命名为rClone30-chIL2，因此简称毒株rClone30-chIL2。毒株rClone30-chIL2是将chIL2多肽的编码基因插入到鸡新城疫病毒毒株Clone30（简称毒株Clone30，弱毒株，为现有的新城疫病活疫苗）的基因组的F基因和HN基因之间得到的重组病毒株。毒株rClone30-chIL2免疫鸡群后，7 d后攻毒，重组病毒具有较好的保护效果，为进一步提高NDV重组新城疫疫苗的早期免疫效果提供了新思路。 

本发明构建的重组新城疫病毒可视为基因工程改造后的弱毒疫苗株，可制备为任何常规制剂，如冻干粉针制剂、液体疫苗制剂等。 

本发明通过在现有新城疫活疫苗基因组中引入分子佐剂chIL2，能够在疫苗免疫早期刺激鸡体内产生NDV抗体并增强体液免疫水平，提高免疫保护效率。本发明对于新城疫病的防治具有重大价值。 

附图说明

图1为重组质粒pBrClone30-chIL2的元件示意图。 

图2为混合液的HA和HI效价结果。 

图3为PCR鉴定电泳图。 

图4为实施例2的结果。 

图5为实施例3的结果。 

图6为实施例4的结果。 

图7为实施例5的结果； 

图8为实施例6的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 

提及“pBrClone30质粒”的文献：“Enhancement of anti-tumor activity of Newcastle disease virus by the synergistic effect of cytosine deaminase”,Zheng LV,Asian Pac J Cancer Ptev.。 

提及“pBL-N质粒”、“pBL-P质粒”和“pBL-L质粒”的文献：Genetically engineered Newcastle disease virus expressing interleukin 2 is a potential drug candidate for cancer immunotherapy,Fuliang Bai,Immunology letters.。 

pBrClone30质粒中具有新城疫病毒的NP基因、P基因、M基因、F基因、HN基因和L基因，其中SacⅡ和MluI酶切识别位点位于F基因和HN基因之间。将pBrClone30质粒、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养(pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒起辅助作用，pBrClone30质粒提供病毒的全基因组)，得到毒株Clone30。 

提及“NDV强毒BJ株”的文献：“鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定及其遗传变异分析”，校海霞，河北农业大学硕士学位论文。 

BHK-21细胞：ATCC编号为CRL-13001。 

DF-1细胞：ATCC编号为CRL-12203。 

SPF级白色来航鸡：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。 

chIL2多肽的全称为鸡白细胞介素2，如序列表的序列2所示，其编码基因的开放阅读框如序列表的序列1自5’末端第15至446位核苷酸所示。 

完全DMEM培养基即为含有5%胎牛血清的DMEM培养基。 

鸡血红细胞凝集（HA）试验的具体方法如下：(1)在血凝板第一排的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)在第1孔中加入25μL待测病毒液，混匀后吸25μL到第2孔，如此倍比稀释直到第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞；(4)震荡后室温静置20-30min，观察结果。 

鸡血红细胞凝集抑制（HI）试验的具体方法如下：(1)在血凝板的1-12孔各加入25μL生理盐水；(2)第1孔加入待检血清25μL，混匀后吸25μL至第2孔，倍比稀释直至第10孔，第10孔混匀后弃除25μL；(3)在1-12孔中各加入25μL实施例1制备的rClone30病毒液（4个血凝单位），室温静置30min；(4)在1-12孔中各加入25μL 1%鸡血红细胞；(5)震荡后室温静置30-40min，观察结果。 

  

实施例1、rClone30-chIL2病毒液的制备

一、重组质粒的合成

1、合成序列表的序列1所示的chIL2基因序列。

合成序列表的序列1中，自5ˊ末端第1至6位核苷酸为限制性内切酶SacⅡ的识别序列，第9-14位核苷酸为Kozac序列，第15至446位核苷酸为chIL2多肽的编码基因，第447至452位核苷酸为限制性内切酶MluI的识别序列。 

2、用限制性内切酶SacII和MluI双酶切步骤1得到的双链DNA分子，回收酶切产物。 

3、用限制性内切酶SacII和MluI双酶切pBrClone30质粒，回收约16000bp的载体骨架。 

4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pBrClone30- chIL2。重组质粒pBrClone30- chIL2的核苷酸序列如序列表的序列3所示。重组质粒pBrClone30-chIL2的元件示意图见图1。 

二、重组病毒的制备 

1、将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染BHK-21细胞（每1×10⁶个细胞约转染1μg重组质粒pBrClone30-chIL2、0.5μg pBL-N质粒、0.25μg pBL-P质粒和0.1μgpBL-L质粒），置于5% CO2、37℃环境中静置培养72h。

2、取步骤1得到的转染细胞，反复冻融3次，离心收取细胞上清液，然后接种于9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液（该鸡胚尿囊液的HA效价为4096，HI效价为256）。 

3、取步骤2得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液（该鸡胚尿囊液的HA效价为2048，HI效价为1024）。 

4、取步骤3得到的鸡胚尿囊液，接种于新的9-11日龄SPF鸡胚尿囊腔，置于37℃环境中培养72h，收集鸡胚尿囊液（该鸡胚尿囊液的HA效价为1024，HI效价为512）。 

5、将步骤2得到的鸡胚尿囊液、步骤3得到的鸡胚尿囊液和步骤4得到的鸡胚尿囊液混合，得到混合液（该混合液的HA效价为2048，HI效价为512，见图2）。 

    6、取步骤5得到的混合液，提取总RNA并反转录为cDNA，采用F1和R1组成的引物对进行PCR鉴定(F1：5ˊ-CCGCGGACGCCACCATGATGTGCAAAGTACTGATCTTTG-3ˊ；R1：5ˊ-ACGCGTTTATTTTTGCAGATATCTCACAAAG-3ˊ)，结果见图3。PCR扩增片段大小约为432bp，与预期相符。 

结果表明，成功制备了具备感染性的表达chIL2多肽的NDV病毒，将步骤5得到的混合液命名为rClone30-chIL2病毒液。 

三、对照病毒的制备 

用pBrClone30质粒代替重组质粒pBrClone30-chIL2进行步骤二的1至5，得到的混合液命名为rClone30病毒液。

  

实施例2、检测病毒液中chIL2的表达量

1、以0.1 MOI重组新城疫病毒rClone30-chIL2感染HepG2细胞。感染72 h后，收获细胞上清，以含有10% FBS的DMEM培养基作为调零对照，Mock对照组为不加任何试剂或者病毒的DF-1细胞。

2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL2病毒液，其它同步骤1。 

3、利用重组NDV rClone30-chIL2 感染的DF-1细胞上清为抗原，采用双抗夹心方法，并按照试剂盒说明书进行ELISA检测。 

结果见图4。结果表明，rClone30-chIL2感染细胞后，chIL2的蛋白表达量明显高于rClone30，差异极显著 (p<0.01)。 

  

实施例3、rClone30-chIL2病毒与rClone30病毒在宿主细胞中的动力生长曲线

1、将对数生长期的DF-1细胞接种于六孔板，以0.1MOI的剂量将实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培养基稀稀释）接种于细胞单层，采用含1μg/mL胰蛋白酶的完全DMEM培养基，置于5% CO₂、37℃环境中静置培养96h，每隔24h取上清液并测定TCID₅₀。

2、用实施例1制备的rClone30病毒液代替rClone30-chIL2病毒液，其它同步骤1。 

结果见图5。rClone30-chIL2病毒与rClone30病毒保持着一致的繁殖滴度。结果表明，chIL2的编码基因的插入并不影响rClone30病毒的增殖能力。 

  

实施例4、rClone30-chIL2病毒或rClone30病毒免疫鸡后的HI抗体效价

参照农业部标准，青年鸡的抗体效价≥5log2时判为合格。特别是在30日龄前后抗体水平低于此标准，如果在此期间有强毒侵入，就有可能暴发新城疫。如果鸡群能在此期间达到此标准，将不受新城疫病毒的威胁。

取30日龄的SPF级白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）： 

第一组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：每只通过滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。

分别于免疫后7d、14 d、21d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。 

结果见图6。免疫后7d,第一组血清的HI效价为4.5log2，第二组的效价为2.8log2，经统计学分析呈差异显著 (p<0.05)，且这两组均与对照组呈差异极显著 (p<0.01)；在免疫14 d和21 d后，rClone30-chIL2组HI抗体平均效价均达到5log2以上，略高于rClone30组，但差异不显著 (p>0.05)，而这两组组HI抗体效价仍与对照组呈差异极显著 (p<0.01)。 

  

实施例5 重组病毒rClone30-chIL2或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价（母源抗体高的情况）

在养鸡生产中，一个鸡群的母源抗体水平往往参差不齐，其中一些母源抗体水平较低的雏鸡在其幼龄阶段易感染野毒和带毒，当其它雏鸡母源抗体水平下降时，它们亦依次受感染，使野毒在鸡群中的传播连绵不断，遗留很大的潜在威胁。据有关文献报道，蛋鸡出雏后在不同日龄测定其新城疫母源抗体水平，结果显示：1日龄母源抗体为6.6log2;7日龄时抗体水平下降为4.7log2；到10日龄时抗体水平降到4log2以下，如果以抗体效价4log2为临界保护值，1日龄雏鸡母源抗体保护率为95%，7日龄母源抗体保护率为80%，到10日龄时母源抗体保护率只有50%。

取1日龄的含母源抗体的白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）： 

第一组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL生理盐水。

分别于免疫后0d、6d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。 

结果见图7。免疫后7d,第一组血清的HI效价为6.5log2高于5log2，第二组的效价为4.75log2，即在母源抗体高的情况下rClone30-chIL2病毒液将可以实现早期有效保护效果，使鸡免受新城疫病毒的威胁，而rClone30病毒液的保护效果明显低于rClone30-chIL2病毒液。 

  

实施例6 重组病毒rClone30-chIL2或rClone30免疫含母源抗体的鸡后的HI抗体效价（母源抗体低的情况）

在养鸡生产中，一个鸡群的母源抗体水平往往参差不齐，其中一些母源抗体水平较低的雏鸡在其幼龄阶段易感染野毒和带毒，当其它雏鸡母源抗体水平下降时，它们亦依次受感染，使野毒在鸡群中的传播连绵不断，遗留很大的潜在威胁。据有关文献报道，蛋鸡出雏后在不同日龄测定其新城疫母源抗体水平，结果显示：1日龄母源抗体为6.6log2;7日龄时抗体水平下降为4.7log2；到10日龄时抗体水平降到4log2以下，如果以抗体效价4log2为临界保护值，1日龄雏鸡母源抗体保护率为95%，7日龄母源抗体保护率为80%，到10日龄时母源抗体保护率只有50%。

取1日龄的含母源抗体的白色来航鸡，随机分为3组，每组10只。分别处理如下（均为单次免疫）： 

第一组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：组内每只鸡采用滴鼻点眼的方式免疫200μL生理盐水。

分别于免疫后0d、6d翅静脉采血分离血清，检测HI效价。 

结果见图8。免疫后7d,第一组血清的HI效价为5.9log2，第二组的效价为6.3log2，即在母源抗体低的情况下，rClone30-chIL2病毒液早期有效保护效果更好，使鸡免受新城疫病毒的威胁。 

  

实施例7、攻毒试验

将30日龄SPF级白色来航鸡随机分为3组，每组30只。分别处理如下（均为单次免疫）：

第一组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30-chIL2病毒液（rClone30-chIL2病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第二组：实验第1天，每只通过滴鼻电眼方式免疫200μL实施例1制备的rClone30病毒液（rClone30病毒液用完全DMEM培养基稀释，用于免疫的病毒液的浓度为10⁵TCID₅₀/0.1ml）；

第三组：实验第1天，每只通过滴鼻点眼方式免疫200μL 0.9%生理盐水。

实验第8天，采用NDV强毒BJ株进行攻毒（每只鸡采用10⁴ ELD₅₀的剂量经肌肉注射途径攻毒，攻毒体积为0.1ml），实验第18天，统计各组的发病与死亡情况。结果见表1。 

表1 各组的发病与死亡情况统计（三次试验的平均值） 

疫苗组	攻毒剂量	发病数量/死亡数量/总数量	保护率
				第一组	104ELD50	0/0/30	100%
第二组	104ELD50	16/6/30	47%
				第三组	104ELD50	30/30/30	0%

发病表征如下（满足①-④中的一项以上即判断为发病）：①上呼吸道分泌大量黏液，自口鼻流出，有时挂于嘴端，常摇头想甩掉；呼吸困难，呼吸时喉部发出“咯咯”的喘鸣声或尖叫声；②由于呼吸困难，血液中氧气不足，二氧化碳增多，使肉髯变为青紫色，临死前及死后尤为明显；③下痢，粪便呈绿色、黄白色，有时混有少量血液；④部分鸡嗉囊蓄积大量酸臭液体，倒提鸡时，液体急速自口中流出，提壶倒水一般。

结果表明：rClone30-chIL2组攻毒后10 d内所有鸡均得到100%保护，且无临床症状；rClone30组攻毒后有16只发病，保护率为47%；而对照组所有鸡在攻毒后第4 d全部死亡。rClone30-chIL2可以提高攻毒保护效率。 

序列表

 序列1、chIL2的核苷酸序列

1      CCGCGGACGC CACCATGATG TGCAAAGTAC TGATCTTTGG CTGTATTTCG GTAGCAATGC

61     TAATGACTAC AGCTTATGGA GCATCTCTAT CATCAGCAAA AAGGAAACCT CTTCAAACAT

121    TAATAAAGGA TTTAGAAATA TTGGAAAATA TCAAGAACAA GATTCATCTC GAGCTCTACA

181    CACCAACTGA GACCCAGGAG TGCACCCAGC AAACTCTGCA GTGTTACCTG GGAGAAGTGG

241    TTACTCTGAA GAAAGAAACT GAAGATGACA CTGAAATTAA AGAAGAATTT GTAACTGCTA

301    TTCAAAATAT CGAAAAGAAC CTCAAGAGTC TTACGGGTCT AAATCACACC GGAAGTGAAT

361    GCAAGATCTG TGAAGCTAAC AACAAGAAAA AATTTCCTGA TTTTCTCCAT GAACTGACCA

421    ACTTTGTGAG ATATCTGCAA AAATAAACGC GT  

                                          

序列2、chIL2的氨基酸序列

      1   MMCKVLIFGC ISVAMLMTTA YGASLSSAKR KPLQTLIKDL EILENIKNKI HLELYTPTET

61  QECTQQTLQC YLGEVVTLKK ETEDDTEIKE EFVTAIQNIE KNLKSLTGLN HTGSECKICE

121 ANNKKKFPDF LHELTNFVRY LQK

 

序列3（自5ˊ末端第2703-18414位核苷酸为病毒rClone30-chIL2基因组）

1        CTGGCGTAAT AGCGAAGAGG CCCGCACCGA TCGCCCTTCC CAACAGTTGC GTAGCCTGAA

61       TGGCGAATGG GACGCGCCCT GTAGCGGCGC ATTAAGCGCG GCGGGTGTGG TGGTTACGCG

121      CAGCGTGACC GCTACACTTG CCAGCGCCCT AGCGCCCGCT CCTTTCGCTT TCTTCCCTTC

181      CTTTCTCGCC ACGTTCGCCG GCTTTCCCCG TCAAGCTCTA AATCGGGGGC TCCCTTTAGG

241      GTTCCGATTT AGTGCTTTAC GGCACCTCGA CCCCAAAAAA CTTGATTAGG GTGATGGTTC

301      ACGTAGTGGG CCATCGCCCT GATAGACGGT TTTTCGCCCT TTGACGTTGG AGTCCACGTT

361      CTTTAATAGT GGACTCTTGT TCCAAACTGG AACAACACTC AACCCTATCT CGGTCTATTC

421      TTTTGATTTA TAAGGGATTT TGCCGATTTC GGCCTATTGG TTAAAAAATG AGCTGATTTA

481      ACAAAAATTT AACGCGAATT TTAACAAAAT ATTAACGTTT ACAATTTCAG GTGGCACTTT

541      TCGGGGAAAT GTGCGCGGAA CCCCTATTTG TTTATTTTTC TAAATACATT CAAATATGTA

601      TCCGCTCATG AGACAATAAC CCTGATAAAT GCTTCAATAA TATTGAAAAA GGAAGAGTAT

661      GAGTATTCAA CATTTCCGTG TCGCCCTTAT TCCCTTTTTT GCGGCATTTT GCCTTCCTGT

721      TTTTGCTCAC CCAGAAACGC TGGTGAAAGT AAAAGATGCT GAAGATCAGT TGGGTGCACG

781      AGTGGGTTAC ATCGAACTGG ATCTCAACAG CGGTAAGATC CTTGAGAGTT TTCGCCCCGA

841      AGAACGTTTT CCAATGATGA GCACTTTTAA AGTTCTGCTA TGTGGCGCGG TATTATCCCG

901      TATTGACGCC GGGCAAGAGC AACTCGGTCG CCGCATACAC TATTCTCAGA ATGACTTGGT

961      TGAGTACTCA CCAGTCACAG AAAAGCATCT TACGGATGGC ATGACAGTAA GAGAATTATG

1021     CAGTGCTGCC ATAAGCATGA GTGATAACAC TGCGGCCAAC TTACTTCTGA CAACGATCGG

1081     AGGACCGAAG GAGCTAACCG CTTTTTTTCA CAACATGGGG GATCATGTAA CTCGCCTTGA

1141     TCGTTGGGAA CCGGAGCTGA ATGAAGCCAT ACCAAACGAC GAGCGTGACA CCACGATGCC

1201     TGTAGCAATG GCAACAACGT TGCGCAAACT ATTAACTGGC GAACTACTTA CTCTAGCTTC

1261     CCGGCAACAA TTAATAGACT GGATGGAGGC GGATAAAGTT GCAGGACCAC TTCTGCGCTC

1321     GGCCCTTCCG GCTGGCTGGT TTATTGCTGA TAAATCTGGA GCCGGTGAGC GTGGGTCTCG

1381     CGGTATCATT GCAGCACTGG GGCCAGATGG TAAGCCCTCC CGTATCGTAG TTATCTACAC

1441     GACGGGCAGT CAGGCAACTA TGGATGAACG AAATAGACAG ATCGCTGAGA TAGGTGCCTC

1501     ACTGATTAAG CATTGGTAAC TGTCAGACCA AGTTTACTCA TATATACTTT AGATTGATTT

1561     AAAACTTCAT TTTTAATTTA AAAGGATCTA GGTGAAGATC CTTTTTGATA ATCTCATGAC

1621     CAAAATCCCT TAACGTGAGT TTTCGTTCCA CTGAGCGTCA GACCCCGTAG AAAAGATCAA

1681     AGGATCTTCT TGAGATCCTT TTTTTCTGCG CGTAATCTGC TGCTTGCAAA CAAAAAAACC

1741     ACCGCTACCA GCGGTGGTTT GTTTGCCGGA TCAAGAGCTA CCAACTCTTT TTCCGAAGGT

1801     AACTGGCTTC AGCAGAGCGC AGATACCAAA TACTGTCCTT CTAGTGTAGC CGTAGTTAGG

1861     CCACCACTTC AAGAACTCTG TAGCACCGCC TACATACCTC GCTCTGCTAA TCCTGTTACC

1921     AGTGGCTGCT GCCAGTGGCG ATAAGTCGTG TCTTACCGGG TTGGACTCAA GACGATAGTT

1981     ACCGGATAAG GCGCAGCGGT CGGGCTGAAC GGGGGGTTCG TGCACACAGC CCAGCTTGGA

2041     GCGAACGACC TACACCGAAC TGAGATACCT ACAGCGTGAG CATTGAGAAA GCGCCACGCT

2101     TCCCGAAGGG AGAAAGGCGG ACAGGTATCC GGTAAGCGGC AGGGTCGGAA CAGGAGAGCG

2161     CACGAGGGAG CTTCCAGGGG GGAACGCCTG GTATCTTTAT AGTCCTGTCG GGTTTCGCCA

2221     CCTCTGACTT GAGCGTCGAT TTTTGTGATG CTCGTCAGGG GGGCCGAGCC TATGGAAAAA

2281     CGCCAGCAAC GCGGCCTTTT TACGGTTCCT GGCCTTTTGC TGGCCTTTTG CTCACATGTT

2341     CTTTCCTGCG TTATCCCCTG ATTCTGTGGA TAACCGTATT ACCGCCTTTG AGTGAGCTGA

2401     TACCGCTCGC CGCAGCCGAA CGACCGAGCG CAGCGAGTCA GTGAGCGAGG AAGCGGAAGA

2461     GCGCCCAATA CGCAAACCGC CTCTCCCCGC GCGTTGGCCG ATTCATTAAT GCAGCTGGCA

2521     CGACAGGTTT CCCGACTGGA AAGCGGGCAG TGAGCGCAAC GCAATTAATG TGAGTTACCT

2581     CACTCATTAG GCACCCCAGG CTTTACACTT TATGCTTCCG GCTCCTATGT TGTGTGGAAT

2641     TGTGAGCGGA TAACAATTTC ACACAGGAAA CAGCTATGAC CATGATTACG CCAAGCTCGG

2701     AAGCGGCCGC TAATACGACT CACTATAGGG ACCAAACAGA GAATCCGTAA GTTACGATAA

2761     AAGGCGAAGG AGCAATTGAA GTCGCACGGG TAGAAGGTGT GAATCTCGAG TGCGAGCCCG

2821     AAGCACAAAC TCGAGAAAGC CTTCTGCCAA CATGTCTTCC GTATTTGATG AGTACGAACA

2881     GCTCCTCGCG GCTCAGACTC GCCCCAATGG AGCTCATGGA GGGGGAGAAA AAGGGAGTAC

2941     CTTAAAAGTA GACGTCCCGG TATTCACTCT TAACAGTGAT GACCCAGAAG ATAGATGGAG

3001     CTTTGTGGTA TTCTGCCTCC GGATTGCTGT TAGCGAAGAT GCCAACAAAC CACTCAGGCA

3061     AGGTGCTCTC ATATCTCTTT TATGCTCCCA CTCACAGGTA ATGAGGAACC ATGTTGCCCT

3121     TGCAGGGAAA CAGAATGAAG CCACATTGGC CGTGCTTGAG ATTGATGGCT TTGCCAACGG

3181     CACGCCCCAG TTCAACAATA GGAGTGGAGT GTCTGAAGAG AGAGCACAGA GATTTGCGAT

3241     GATAGCAGGA TCTCTCCCTC GGGCATGCAG CAACGGAACC CCGTTCGTCA CAGCCGGGGC

3301     CGAAGATGAT GCACCAGAAG ACATCACCGA TACCCTGGAG AGGATCCTCT CTATCCAGGC

3361     TCAAGTATGG GTCACAGTAG CAAAAGCCAT GACTGCGTAT GAGACTGCAG ATGAGTCGGA

3421     AACAAGGCGA ATCAATAAGT ATATGCAGCA AGGCAGGGTC CAAAAGAAAT ACATCCTCTA

3481     CCCCGTATGC AGGAGCACAA TCCAACTCAC GATCAGACAG TCTCTTGCAG TCCGCATCTT

3541     TTTGGTTAGC GAGCTCAAGA GAGGCCGCAA CACGGCAGGT GGTACCTCTA CTTATTATAA

3601     CCTGGTAGGG GACGTAGACT CATACATCAG GAATACCGGG CTTACTGCAT TCTTCTTGAC

3661     ACTCAAGTAC GGAATCAACA CCAAGACATC AGCCCTTGCA CTTAGTAGCC TCTCAGGCGA

3721     CATCCAGAAG ATGAAGCAGC TCATGCGTTT GTATCGGATG AAAGGAGATA ATGCGCCGTA

3781     CATGACATTA CTTGGTGATA GTGACCAGAT GAGCTTTGCG CCTGCCGAGT ATGCACAACT

3841     TTACTCCTTT GCCATGGGTA TGGCATCAGT CCTAGATAAA GGTACTGGGA AATACCAATT

3901     TGCCAGGGAC TTTATGAGCA CATCATTCTG GAGACTTGGA GTAGAGTACG CTCAGGCTCA

3961     GGGAAGTAGC ATTAACGAGG ATATGGCTGC CGAGCTAAAG CTAACCCCAG CAGCAAGGAG

4021     GGGCCTGGCA GCTGCTGCCC AACGGGTCTC CGAGGAGACC AGCAGCATAG ACATGCCTAC

4081     TCAACAAGTC GGAGTCCTCA CTGGGCTTAG CGAGGGGGGG TCCCAAGCTC TACAAGGCGG

4141     ATCGAATAGA TCGCAAGGGC AACCAGAAGC CGGGGATGGG GAGACCCAAT TCCTGGATCT

4201     GATGAGAGCG GTAGCAAATA GCATGAGGGA GGCGCCAAAC TCTGCACAGG GCACTCCCCA

4261     ATCGGGGCCT CCCCCAACTC CTGGGCCATC CCAAGATAAC GACACCGACT GGGGGTATTG

4321     ATGGACAAAA CCCAGCCTGC TTCCACAAAA ACATCCCAAT GCCCTCACCC GTAGTCGACC

4381     CCTCGATTTG CGGCTCTATA TGACCACACC CTCAAACAAA CATCCCCCTC TTTCCTCCCT

4441     CCCCCTGCTG TACAACTCCG CACGCCCTAG ATACCACAGG CACAATGCGG CTCACTAACA

4501     ATCAAAACAG AGCCGAGGGA ATTAGAAAAA AGTACGGGTA GAAGAGGGAT ATTCAGAGAT

4561     CAGGGCAAGT CTCCCGAGTC TCTGCTCTCT CCTCTACCTG ATAGACCAGG ACAAACATGG

4621     CCACCTTTAC AGATGCAGAG ATCGACGAGC TATTTGAGAC AAGTGGAACT GTCATTGACA

4681     ACATAATTAC AGCCCAGGGT AAACCAGCAG AGACTGTTGG AAGGAGTGCA ATCCCACAAG

4741     GCAAGACCAA GGTGCTGAGC GCAGCATGGG AGAAGCATGG GAGCATCCAG CCACCGGCCA

4801     GTCAAGACAA CCCCGATCGA CAGGACAGAT CTGACAAACA ACCATCCACA CCCGAGCAAA

4861     CGACCCCGCA TGACAGCCCG CCGGCCACAT CCGCCGACCA GCCCCCCACC CAGGCCACAG

4921     ACGAAGCCGT CGACACACAG CTCAGGACCG GAGCAAGCAA CTCTCTGCTG TTGATGCTTG

4981     ACAAGCTCAG CAATAAATCG TCCAATGCTA AAAAGGGCCC ATGGTCGAGC CCCCAAGAGG

5041     GGAATCACCA ACGTCCGACT CAACAGCAGG GGAGTCAACC CAGTCGCGGA AACAGTCAGG

5101     AAAGACCGCA GAACCAAGTC AAGGCCGCCC CTGGAAACCA GGGCACAGAC GTGAACACAG

5161     CATATCATGG ACAATGGGAG GAGTCACAAC TATCAGCTGG TGCAACCCCT CATGCTCTCC

5221     GATCAAGGCA GAGCCAAGAC AATACCCTTG TATCTGCGGA TCATGTCCAG CCACCTGTAG

5281     ACTTTGTGCA AGCGATGATG TCTATGATGG AGGCGATATC ACAGAGAGTA AGTAAGGTTG

5341     ACTATCAGCT AGATCTTGTC TTGAAACAGA CATCCTCCAT CCCTATGATG CGGTCCGAAA

5401     TCCAACAGCT GAAAACATCT GTTGCAGTCA TGGAAGCCAA CTTGGGAATG ATGAAGATTC

5461     TGGATCCCGG TTGTGCCAAC ATTTCATCTC TGAGTGATCT ACGGGCAGTT GCCCGATCTC

5521     ACCCGGTTTT AGTTTCAGGC CCTGGAGACC CCTCTCCCTA TGTGACACAA GGAGGCGAAA

5581     TGGCACTTAA TAAACTTTCG CAACCAGTGC CACATCCATC TGAATTGATT AAACCCGCCA

5641     CTGCATGCGG GCCTGATATA GGAGTGGAAA AGGACACTGT CCGTGCATTG ATCATGTCAC

5701     GCCCAATGCA CCCGAGTTCT TCAGCCAAGC TCCTAAGCAA GTTAGATGCA GCCGGGTCGA

5761     TCGAGGAAAT CAGGAAAATC AAGCGCCTTG CTCTAAATGG CTAATTACTA CTGCCACACG

5821     TAGCGGGTCC CTGTCCACTC GGCATCACAC GGAATCTGCA CCGAGTTCCC CCCCGCAGAC

5881     CCAAGGTCCA ACTCTCCAAG CGGCAATCCT CTCTCGCTTC CTCAGCCCCA CTGAATGATC

5941     GCGTAACCGT AATTAATCTA GCTACATTTA AGATTAAGAA AAAATACGGG TAGAATTGGA

6001     GTGCCCCAAT TGTGCCAAGA TGGACTCATC TAGGACAATT GGGCTGTACT TTGATTCTGC

6061     CCATTCTTCT AGCAACCTGT TAGCATTTCC GATCGTCCTA CAAGACACAG GAGATGGGAA

6121     GAAGCAAATC GCCCCGCAAT ATAGGATCCA GCGCCTTGAC TTGTGGACTG ATAGTAAGGA

6181     GGACTCAGTA TTCATCACCA CCTATGGATT CATCTTTCAA GTTGGGAATG AAGAAGCCAC

6241     TGTCGGCATG ATCGATGATA AACCCAAGCG CGAGTTACTT TCCGCTGCGA TGCTCTGCCT

6301     AGGAAGCGTC CCAAATACCG GAGACCTTAT TGAGCTGGCA AGGGCCTGTC TCACTATGAT

6361     AGTCACATGC AAGAAGAGTG CAACTAATAC TGAGAGAATG GTTTTCTCAG TAGTGCAGGC

6421     ACCCCAAGTG CTGCAAAGCT GTAGGGTTGT GGCAAACAAA TACTCATCAG TGAATGCAGT

6481     CAAGCACGTG AAAGCGCCAG AGAAGATTCC CGGGAGTGGA ACCCTAGAAT ACAAGGTGAA

6541     CTTTGTCTCC TTGACTGTGG TACCGAAGAA GGATGTCTAC AAGATCCCAG CTGCAGTATT

6601     GAAGGTTTCT GGCTCGAGTC TGTACAATCT TGCGCTCAAT GTCACTATTA ATGTGGAGGT

6661     AGACCCGAGG AGTCCTTTGG TTAAATCTCT GTCTAAGTCT GACAGCGGAT ACTATGCTAA

6721     CCTCTTCTTG CATATTGGAC TTATGACCAC CGTAGATAGG AAGGGGAAGA AAGTGACATT

6781     TGACAAGCTG GAAAAGAAAA TAAGGAGCCT TGATCTATCT GTCGGGCTCA GTGATGTGCT

6841     CGGGCCTTCC GTGTTGGTAA AAGCAAGAGG TGCACGGACT AAGCTTTTGG CACCTTTCTT

6901     CTCTAGCAGT GGGACAGCCT GCTATCCCAT AGCAAATGCT TCTCCTCAGG TGGCCAAGAT

6961     ACTCTGGAGT CAAACCGCGT GCCTGCGGAG CGTTAAAATC ATTATCCAAG CAGGTACCCA

7021     ACGCGCTGTC GCAGTGACCG CCGACCACGA GGTTACCTCT ACTAAGCTGG AGAAGGGGCA

7081     CACCCTTGCC AAATACAATC CTTTTAAGAA ATAAGCTGCG TCTCTGAGAT TGCGCTCCGC

7141     CCACTCACCC AGATCATCAT GACACAAAAA ACTAATCTGT CTTGATTATT TACAGTTAGT

7201     TTACCTGTCT ATCAAGTTAG AAAAAACACG GGTAGAAGAT TCTGGATCCC GGTTGGCGCC

7261     CTCCAGGTGC AAGATGGGCT CCAGACCTTC TACCAAGAAC CCAGCACCTA TGATGCTGAC

7321     TATCCGGGTT GCGCTGGTAC TGAGTTGCAT CTGTCCGGCA AACTCCATTG ATGGCAGGCC

7381     TCTTGCAGCT GCAGGAATTG TGGTTACAGG AGACAAAGCC GTCAACATAT ACACCTCATC

7441     CCAGACAGGA TCAATCATAG TTAAGCTCCT CCCGAATCTG CCCAAGGATA AGGAGGCATG

7501     TGCGAAAGCC CCCTTGGATG CATACAACAG GACATTGACC ACTTTGCTCA CCCCCCTTGG

7561     TGACTCTATC CGTAGGATAC AAGAGTCTGT GACTACATCT GGAGGGGGGA GACAGGGGCG

7621     CCTTATAGGC GCCATTATTG GCGGTGTGGC TCTTGGGGTT GCAACTGCCG CACAAATAAC

7681     AGCGGCCGCA GCTCTGATAC AAGCCAAACA AAATGCTGCC AACATCCTCC GACTTAAAGA

7741     GAGCATTGCC GCAACCAATG AGGCTGTGCA TGAGGTCACT GACGGATTAT CGCAACTAGC

7801     AGTGGCAGTT GGGAAGATGC AGCAGTTTGT TAATGACCAA TTTAATAAAA CAGCTCAGGA

7861     ATTAGACTGC ATCAAAATTG CACAGCAAGT TGGTGTAGAG CTCAACCTGT ACCTAACCGA

7921     ATTGACTACA GTATTCGGAC CACAAATCAC TTCACCTGCT TTAAACAAGC TGACTATTCA

7981     GGCACTTTAC AATCTAGCTG GTGGAAATAT GGATTACTTA TTGACTAAGT TAGGTGTAGG

8041     GAACAATCAA CTCAGCTCAT TAATCGGTAG CGGCTTAATC ACCGGTAACC CTATTCTATA

8101     CGACTCACAG ACTCAACTCT TGGGTATACA GGTAACTCTA CCTTCAGTCG GGAACCTAAA

8161     TAATATGCGT GCCACCTACT TGGAAACCTT ATCCGTAAGC ACAACCAGGG GATTTGCCTC

8221     GGCACTTGTC CCAAAAGTGG TGACACAGGT CGGTTCTGTG ATAGAAGAAC TTGACACCTC

8281     ATACTGTATA GAAACTGACT TAGATTTATA TTGTACAAGA ATAGTAACGT TCCCTATGTC

8341     CCCTGGTATT TATTCCTGCT TGAGCGGCAA TACGTCGGCC TGTATGTACT CAAAGACCGA

8401     AGGCGCACTT ACTACACCAT ACATGACTAT CAAAGGTTCA GTCATCGCCA ACTGCAAGAT

8461     GACAACATGT AGATGTGTAA ACCCCCCGGG TATCATATCG CAAAACTATG GAGAAGCCGT

8521     GTCTCTAATA GATAAACAAT CATGCAATGT TTTATCCTTA GGCGGGATAA CTTTAAGGCT

8581     CAGTGGGGAA TTCGATGTAA CTTATCAGAA GAATATCTCA ATACAAGATT CTCAAGTAAT

8641     AATAACAGGC AATCTTGATA TCTCAACTGA GCTTGGGAAT GTCAACAACT CGATCAGTAA

8701     TGCTTTGAAT AAGTTAGAGG AAAGCAACAG AAAACTAGAC AAAGTCAATG TCAAACTGAC

8761     TAGCACATCT GCTCTCATTA CCTATATCGT TTTGACTATC ATATCTCTTG TTTTTGGTAT

8821     ACTTAGCCTG ATTCTAGCAT GCTACCTAAT GTACAAGCAA AAGGCGCAAC AAAAGACCTT

8881     ATTATGGCTT GGGAATAATA CTCTAGATCA GATGAGAGCC ACTACAAAAA TGTGAACACA

8941     GATGAGGAAC GAAGGTTTCC CTAATAGTAA TTTGTGTGAA AGTTCTGGTA GTCTGTCAGT

9001     TAAGAAAAAA TACGGGTAGA AGGTTAACCG GCCCGCGGAC GCCACCATGA TGTGCAAAGT

9061     ACTGATCTTT GGCTGTATTT CGGTAGCAAT GCTAATGACT ACAGCTTATG GAGCATCTCT

9121     ATCATCAGCA AAAAGGAAAC CTCTTCAAAC ATTAATAAAG GATTTAGAAA TATTGGAAAA

9181     TATCAAGAAC AAGATTCATC TCGAGCTCTA CACACCAACT GAGACCCAGG AGTGCACCCA

9241     GCAAACTCTG CAGTGTTACC TGGGAGAAGT GGTTACTCTG AAGAAAGAAA CTGAAGATGA

9301     CACTGAAATT AAAGAAGAAT TTGTAACTGC TATTCAAAAT ATCGAAAAGA ACCTCAAGAG

9361     TCTTACGGGT CTAAATCACA CCGGAAGTGA ATGCAAGATC TGTGAAGCTA ACAACAAGAA

9421     AAAATTTCCT GATTTTCTCC ATGAACTGAC CAACTTTGTG AGATATCTGC AAAAATAAAC

9481     GCGTGGCCTG AGAGGCCTTC AGAGAGTTAA GAAAAAACTA CCGGTTGTAG ATGACCAAAG

9541     GACGATATAC GGGTAGAACG GTAAGAGAGG CCGCCCCTCA ATTGCGAGCC AGGCTTCACA

9601     ACCTCCGTTC TACCGCTTCA CCGACAACAG TCCTCAATCA TGGACCGCGC CGTTAGCCAA

9661     GTTGCGTTAG AGAATGATGA AAGAGAGGCA AAAAATACAT GGCGCTTGAT ATTCCGGATT

9721     GCAATCTTAT TCTTAACAGT AGTGACCTTG GCTATATCTG TAGCCTCCCT TTTATATAGC

9781     ATGGGGGCTA GCACACCTAG CGATCTTGTA GGCATACCGA CTAGGATTTC CAGGGCAGAA

9841     GAAAAGATTA CATCTACACT TGGTTCCAAT CAAGATGTAG TAGATAGGAT ATATAAGCAA

9901     GTGGCCCTTG AGTCTCCGTT GGCATTGTTA AATACTGAGA CCACAATTAT GAACGCAATA

9961     ACATCTCTCT CTTATCAGAT TAATGGAGCT GCAAACAACA GTGGGTGGGG GGCACCTATC

10021    CATGACCCAG ATTATATAGG GGGGATAGGC AAAGAACTCA TTGTAGATGA TGCTAGTGAT

10081    GTCACATCAT TCTATCCCTC TGCATTTCAA GAACATCTGA ATTTTATCCC GGCGCCTACT

10141    ACAGGATCAG GTTGCACTCG AATACCCTCA TTTGACATGA GTGCTACCCA TTACTGCTAC

10201    ACCCATAATG TAATATTGTC TGGATGCAGA GATCACTCAC ATTCATATCA GTATTTAGCA

10261    CTTGGTGTGC TCCGGACATC TGCAACAGGG AGGGTATTCT TTTCTACTCT GCGTTCCATC

10321    AACCTGGACG ACACCCAAAA TCGGAAGTCT TGCAGTGTGA GTGCAACTCC CCTGGGTTGT

10381    GATATGCTGT GCTCGAAAGT CACGGAGACA GAGGAAGAAG ATTATAACTC AGCTGTCCCT

10441    ACGCGGATGG TACATGGGAG GTTAGGGTTC GACGGCCAGT ACCACGAAAA GGACCTAGAT

10501    GTCACAACAT TATTCGGGGA CTGGGTGGCC AACTACCCAG GAGTAGGGGG TGGATCTTTT

10561    ATTGACAGCC GCGTATGGTT CTCAGTCTAC GGAGGGTTAA AACCCAATTC ACCCAGTGAC

10621    ACTGTACAGG AAGGGAAATA TGTGATATAC AAGCGATACA ATGACACATG CCCAGATGAG

10681    CAAGACTACC AGATTCGAAT GGCCAAGTCT TCGTATAAGC CTGGACGGTT TGGTGGGAAA

10741    CGCATACAGC AGGCTATCTT ATCTATCAAG GTGTCAACAT CCTTAGGCGA AGACCCGGTA

10801    CTGACTGTAC CGCCCAACAC AGTCACACTC ATGGGGGCCG AAGGCAGAAT TCTCACAGTA

10861    GGGACATCTC ATTTCTTGTA TCAACGAGGG TCATCATACT TCTCTCCCGC GTTATTATAT

10921    CCTATGACAG TCAGCAACAA AACAGCCACT CTTCATAGTC CTTATACATT CAATGCCTTC

10981    ACTCGGCCAG GTAGTATCCC TTGCCAGGCT TCAGCAAGAT GCCCCAACTC GTGTGTTACT

11041    GGAGTCTATA CAGATCCATA TCCCCTAATC TTCTATAGAA ACCACACCTT GCGAGGGGTA

11101    TTCGGGACAA TGCTTGATGG TGTACAAGCA AGACTTAACC CTGCGTCTGC AGTATTCGAT

11161    AGCACATCCC GCAGTCGCAT TACTCGAGTG AGTTCAAGCA GTACCAAAGC AGCATACACA

11221    ACATCAACTT GTTTTAAAGT GGTCAAGACT AATAAGACCT ATTGTCTCAG CATTGCTGAA

11281    ATATCTAATA CTCTCTTCGG AGAATTCAGA ATCGTCCCGT TACTAGTTGA GATCCTCAAA

11341    GATGACGGGG TTAGAGAAGC CAGGTCTGGC TAGTTGAGTC AATTATAAAG GAGTTGGAAA

11401    GATGGCATTG TATCACCTAT CTTCTGCGAC ATCAAGAATC AAACCGAATG CCGGCGCGTG

11461    CTCGAATTCC ATGTTGCCAG TTGACCACAA TCAGCCAGTG CTCATGCGAT CAGATTAAGC

11521    CTTGTCAATA GTCTCTTGAT TAAGAAAAAA TGTAAGTGGC AATGAGATAC AAGGCAAAAC

11581    AGCTCATGGT AAATAATACG GGTAGGACAT GGCGAGCTCC GGTCCTGAAA GGGCAGAGCA

11641    TCAGATTATC CTACCAGAGT CACACCTGTC TTCACCATTG GTCAAGCACA AACTACTCTA

11701    TTACTGGAAA TTAACTGGGC TACCGCTTCC TGATGAATGT GACTTCGACC ACCTCATTCT

11761    CAGCCGACAA TGGAAAAAAA TACTTGAATC GGCCTCTCCT GATACTGAGA GAATGATAAA

11821    ACTCGGAAGG GCAGTACACC AAACTCTTAA CCACAATTCC AGAATAACCG GAGTGCTCCA

11881    CCCCAGGTGT TTAGAAGAAC TGGCTAATAT TGAGGTCCCA GATTCAACCA ACAAATTTCG

11941    GAAGATTGAG AAGAAGATCC AAATTCACAA CACGAGATAT GGAGAACTGT TCACAAGGCT

12001    GTGTACGCAT ATAGAGAAGA AACTGCTGGG GTCATCTTGG TCTAACAATG TCCCCCGGTC

12061    AGAGGAGTTC AGCAGCATTC GTACGGATCC GGCATTCTGG TTTCACTCAA AATGGTCCAC

12121    AGCCAAGTTT GCATGGCTCC ATATAAAACA GATCCAGAGG CATCTGATGG TGGCAGCTAG

12181    GACAAGGTCT GCGGCCAACA AATTGGTGAT GCTAACCCAT AAGGTAGGCC AAGTCTTTGT

12241    CACTCCTGAA CTTGTCGTTG TGACGCATAC GAATGAGAAC AAGTTCACAT GTCTTACCCA

12301    GGAACTTGTA TTGATGTATG CAGATATGAT GGAGGGCAGA GATATGGTCA ACATAATATC

12361    AACCACGGCG GTGCATCTCA GAAGCTTATC AGAGAAAATT GATGACATTT TGCGGTTAAT

12421    AGACGCTCTG GCAAAAGACT TGGGTAATCA AGTCTACGAT GTTGTATCAC TAATGGAGGG

12481    ATTTGCATAC GGAGCTGTCC AGCTACTCGA GCCGTCAGGT ACATTTGCAG GAGATTTCTT

12541    CGCATTCAAC CTGCAGGAGC TTAAAGACAT TCTAATTGGC CTCCTCCCCA ATGATATAGC

12601    AGAATCCGTG ACTCATGCAA TCGCTACTGT ATTCTCTGGT TTAGAACAGA ATCAAGCAGC

12661    TGAGATGTTG TGTCTGTTGC GTCTGTGGGG TCACCCACTG CTTGAGTCCC GTATTGCAGC

12721    AAAGGCAGTC AGGAGCCAAA TGTGCGCACC GAAAATGGTA GACTTTGATA TGATCCTTCA

12781    GGTACTGTCT TTCTTCAAGG GAACAATCAT CAACGGGTAC AGAAAGAAGA ATGCAGGTGT

12841    GTGGCCGCGA GTCAAAGTGG ATACAATATA TGGGAAGGTC ATTGGGCAAC TACATGCAGA

12901    TTCAGCAGAG ATTTCACACG ATATCATGTT GAGAGAGTAT AAGAGTTTAT CTGCACTTGA

12961    ATTTGAGCCA TGTATAGAAT ATGACCCTGT CACCAACCTG AGCATGTTCC TAAAAGACAA

13021    GGCAATCGCA CACCCCAACG ATAATTGGCT TGCCTCGTTT AGGCGGAACC TTCTCTCCGA

13081    AGACCAGAAG AAACATGTAA AAGAAGCAAC TTCGACTAAT CGCCTCTTGA TAGAGTTTTT

13141    AGAGTCAAAT GATTTTGATC CATATAAAGA GATGGAATAT CTGACGACCC TTGAGTACCT

13201    TAGAGATGAC AATGTGGCAG TATCATACTC GCTCAAGGAG AAGGAAGTGA AAGTTAATGG

13261    ACGGATCTTC GCTAAGCTGA CAAAGAAGTT AAGGAACTGT CAGGTGATGG CGGAAGGGAT

13321    CCTAGCCGAT CAGATTGCAC CTTTCTTTCA GGGAAATGGA GTCATTCAGG ATAGCATATC

13381    CTTGACCAAG AGTATGCTAG CGATGAGTCA ACTGTCTTTT AACAGCAATA AGAAACGTAT

13441    CACTGACTGT AAAGAAAGAG TATCTTCAAA CCGCAATCAT GATCCGAAAA GCAAGAACCG

13501    TCGGAGAGTT GCAACCTTCA TAACAACTGA CCTGCAAAAG TACTGTCTTA ATTGGAGATA

13561    TCAGACAATC AAATTGTTCG CTCATGCCAT CAATCAGTTG ATGGGCCTAC CTCACTTCTT

13621    CGAATGGATT CACCTAAGAC TGATGGACAC TACGATGTTC GTAGGAGACC CTTTCAATCC

13681    TCCAAGTGAC CCTACTGACT GTGACCTCTC AAGAGTCCCT AATGATGACA TATATATTGT

13741    CAGTGCCAGA GGGGGTATCG AAGGATTATG CCAGAAGCTA TGGACAATGA TCTCAATTGC

13801    TGCAATCCAA CTTGCTGCAG CTAGATCGCA TTGTCGTGTT GCCTGTATGG TACAGGGTGA

13861    TAATCAAGTA ATAGCAGTAA CGAGAGAGGT AAGATCAGAC GACTCTCCGG AGATGGTGTT

13921    GACACAGTTG CATCAAGCCA GTGATAATTT CTTCAAGGAA TTAATTCATG TCAATCATTT

13981    GATTGGCCAT AATTTGAAGG ATCGTGAAAC CATCAGGTCA GACACATTCT TCATATACAG

14041    CAAACGAATC TTCAAAGATG GAGCAATCCT CAGTCAAGTC CTCAAAAATT CATCTAAATT

14101    AGTGCTAGTG TCAGGTGATC TCAGTGAAAA CACCGTAATG TCCTGTGCCA ACATTGCCTC

14161    TACTGTAGCA CGGCTATGCG AGAACGGGCT TCCCAAAGAC TTCTGTTACT ATTTAAACTA

14221    TATAATGAGT TGTGTGCAGA CATACTTTGA CTCTGAGTTC TCCATCACCA ACAATTCGCA

14281    CCCCGATCTT AATCAGTCGT GGATTGAGGA CATCTCTTTT GTGCACTCAT ATGTTCTGAC

14341    TCCTGCCCAA TTAGGGGGAC TGAGTAACCT TCAATACTCA AGGCTCTACA CTAGAAATAT

14401    CGGTGACCCG GGGACTACTG CTTTTGCAGA GATCAAGCGA CTAGAAGCAG TGGGATTACT

14461    GAGTCCTAAC ATTATGACTA ATATCTTAAC TAGGCCGCCT GGGAATGGAG ATTGGGCCAG

14521    TCTGTGCAAC GACCCATACT CTTTCAATTT TGAGACTGTT GCAAGCCCAA ATATTGTTCT

14581    TAAGAAACAT ACGCAAAGAG TCCTATTTGA AACTTGTTCA AATCCCTTAT TGTCTGGAGT

14641    GCACACAGAG GATAATGAGG CAGAAGAGAA GGCATTGGCT GAATTCTTGC TTAATCAAGA

14701    GGTGATTCAT CCCCGCGTTG CGCATGCCAT CATGGAGGCA AGCTCTGTAG GTAGGAGAAA

14761    GCAAATTCAA GGGCTTGTTG ACACAACAAA CACCGTAATT AAGATTGCGC TTACTAGGAG

14821    GCCATTAGGC ATCAAGAGGC TGATGCGGAT AGTCAATTAT TCTAGCATGC ATGCAATGCT

14881    GTTTAGAGAC GATGTTTTTT CCTCCAGTAG ATCCAACCAC CCCTTAGTCT CTTCTAATAT

14941    GTGTTCTCTG ACACTGGCAG ACTATGCACG GAATAGAAGC TGGTCACCTT TGACGGGAGG

15001    CAGGAAAATA CTGGGTGTAT CTAATCCTGA TACGATAGAA CTCGTAGAGG GTGAGATTCT

15061    TAGTGTAAGC GGAGGGTGTA CAAGATGTGA CAGCGGAGAT GAACAATTTA CTTGGTTCCA

15121    TCTTCCAAGC AATATAGAAT TGACCGATGA CACCAGCAAG AATCCTCCGA TGAGGGTACC

15181    ATATCTCGGG TCAAAGACAC AGGAGAGGAG AGCTGCCTCA CTTGCAAAAA TAGCTCATAT

15241    GTCGCCACAT GTAAAGGCTG CCCTAAGGGC ATCATCCGTG TTGATCTGGG CTTATGGGGA

15301    TAATGAAGTA AATTGGACTG CTGCTCTTAC GATTGCAAAA TCTCGGTGTA ATGTAAACTT

15361    AGAGTATCTT CGGTTACTGT CCCCTTTACC CACGGCTGGG AATCTTCAAC ATAGACTAGA

15421    TGATGGTATA ACTCAGATGA CATTCACCCC TGCATCTCTC TACAGGGTGT CACCTTACAT

15481    TCACATATCC AATGATTCTC AAAGGCTGTT CACTGAAGAA GGAGTCAAAG AGGGGAATGT

15541    GGTTTACCAA CAGATCATGC TCTTGGGTTT ATCTCTAATC GAATCGATCT TTCCAATAAC

15601    AACAACCAGG ACATATGATG AGATCACACT GCACCTACAT AGTAAATTTA GTTGCTGTAT

15661    CAGAGAAGCA CCTGTTGCGG TTCCTTTCGA GCTACTTGGG GTGGTACCGG AACTGAGGAC

15721    AGTGACCTCA AATAAGTTTA TGTATGATCC TAGCCCTGTA TCGGAGGGAG ACTTTGCGAG

15781    ACTTGACTTA GCTACTTTCA AGAGTTATGA GCTTAATCTG GAGTCATATC CCACGATAGA

15841    GCTAATGAAC ATTCTTTCAA TATCCAGCGG GAAGTTGATT GGCCAGTCTG TGGTTTCTTA

15901    TGATGAAGAT ACCTCCATAA AGAATGACGC CATAATAGTG TATGACAATA CCCGAAATTG

15961    GATCAGTGAA GCTCAGAATT CAGATGTGGT CCGCCTATTT GAATATGCAG CACTTGAAGT

16021    GCTCCTCGAC TGTTCTTACC AACTCTATTA CCTGAGAGTA AGAGGCCTAG ACAATATTGT

16081    CTTATATATG GGTGATTTAT ACAAGAATAT GCCAGGAATT CTACTTTCCA ACATTGCAGC

16141    TACAATATCT CATCCCGTCA TTCATTCAAG GTTACATGCA GTGGGCCTGG TCAACCATGA

16201    CGGATCACAC CAACTTGCAG ATACGGATTT TATCGAAATG TCTGCAAAAC TATTAGTATC

16261    TTGCACCCGA CGTGTGATCT CCGGCTTATA TTCAGGAAAT AAGTATGATC TGCTGTTCCC

16321    ATCTGTCTTA GATGATAACC TGAATGAGAA GATGCTTCAG CTGATATCCC GGTTATGCTG

16381    TCTGTACACG GTACTCTTTG CTACAACAAG AGAAATCCCG AAAATAAGAG GCTTAACTGC

16441    AGAAGAGAAA TGTTCAATAC TCACTGAGTA TTTACTGTCG GATGCTGTGA AACCATTACT

16501    TAGTCCCGAT CAAGTGAGCT CTATCATGTC TCCTAACATA ATTACATTCC CAGCTAATCT

16561    GTACTACATG TCTCGGAAGA GCCTCAATTT GATCAGGGAA AGGGAGGACA GGGATACTAT

16621    CCTGGCGTTG TTGTTCCCCC AAGAGCCATT ATTAGAGTTC CCTTCTGTGC AAGATATTGG

16681    TGCTCGAGTG AAAGATCCAT TCACCCGACA ACCTGCGGCA TTTTTGCAAG AGTTAGATTT

16741    GAGTGCTCCA GCAAGGTATG ACGCATTCAC ACTTAGTCAG ATTCATCCTG AACTCACATC

16801    TCCAAATCCG GAGGAAGACT ACTTAGTACG ATACTTGTTC AGAGGGATAG GGACTGCATC

16861    TTCCTCTTGG TATAAGGCAT CTCATCTCCT TTCTGTACCC GAGGTAAGAT GTGCAAGACA

16921    CGGGAACTCC TTATACTTAG CTGAAGGGAG CGGAGCCATC ATGAGTCTTC TCGAACTGCA

16981    TGTACCACAT GAAACTATCT ATTACAATAC GCTCTTTTCA AATGAGATGA ACCCCCCGCA

17041    ACGACATTTC GGGCCGACCC CAACTCAGTT TTTGAATTCG GTTGTTTATA GGAATCTACA

17101    GGCGGAGGTA ACATGCAAAG ATGGATTTGT CCAAGAGTTC CGTCCATTAT GGAGAGAAAA

17161    TACAGAGGAA AGTGACCTGA CCTCAGATAA AGTAGTGGGG TATATTACAT CTGCAGTGCC

17221    CTACAGATCT GTATCATTGC TGCATTGTGA CATTGAAATT CCTCCAGGGT CCAATCAAAG

17281    CTTACTAGAT CAACTAGCTA TCAATTTATC TCTGATTGCC ATGCATTCTG TAAGGGAGGG

17341    CGGGGTAGTA ATCATCAAAG TGTTGTATGC AATGGGATAC TACTTTCATC TACTCATGAA

17401    CTTGTTTGCT CCGTGTTCCA CAAAAGGATA TATTCTCTCT AATGGTTATG CATGTCGAGG

17461    AGATATGGAG TGTTACCTGG TATTTGTCAT GGGTTACCTG GGCGGGCCTA CATTTGTACA

17521    TGAGGTGGTG AGGATGGCGA AAACTCTGGT GCAGCGGCAC GGTACGCTTT TGTCTAAATC

17581    AGATGAGATC ACACTGACCA GGTTATTCAC CTCACAGCGG CAGCGTGTGA CAGACATCCT

17641    ATCCAGTCCT TTACCAAGAT TAATAAAGTA CTTGAGGAAG AATATTGACA CTGCGCTGAT

17701    TGAAGCCGGG GGACAGCCCG TCCGTCCATT CTGTGCGGAG AGTCTGGTGA GCACGCTAGC

17761    GAACATAACT CAGATAACCC AGATCATCGC TAGTCACATT GACACAGTTA TCCGGTCTGT

17821    GATATATATG GAAGCTGAGG GTGATCTCGC TGACACAGTA TTTCTATTTA CCCCTTACAA

17881    TCTCTCTACT GACGGGAAAA AGAGGACATC ACTTAAACAG TGCACGAGAC AGATCCTAGA

17941    GGTTACAATA CTAGGTCTTA GAGTCGAAAA TCTCAATAAA ATAGGCGATA TAATCAGCCT

18001    AGTGCTTAAA GGCATGATCT CCATGGAGGA CCTTATCCCA CTAAGGACAT ACTTGAAGCA

18061    TAGTACCTGC CCTAAATATT TGAAGGCTGT CCTAGGTATT ACCAAACTCA AAGAAATGTT

18121    TACAGACACT TCTGTACTGT ACTTGACTCG TGCTCAACAA AAATTCTACA TGAAAACTAT

18181    AGGCAATGCA GTCAAAGGAT ATTACAGTAA CTGTGACTCT TAACGAAAAT CACATATTAA

18241    TAGGCTCCTT TTTTGGCCAA TTGTATTCTT GTTGATTTAA TCATATTATG TTAGAAAAAA

18301    GTTGAACCCT GACTCCTTAG GACTCGAATT CGAACTCAAA TAAATGTCTT AAAAAAAGGT

18361    TGCGCACAAT TATTCTTGAG TGTAGTCTCG TCATTCACCA AATCTTTGTT TGGTTTGGTG

18421    GCCGGCATGG TCCCAGCCTC CTCGCTGGCG CCGGCTGGGC AACATTCCGA GGGGACCGTC

18481    CCCTCGGTAA TGGCGAATGG GACGCGGCCG ATCCGGCTGC TAACAAAGCC CGAAAGGAAG

18541    CTGAGTTGGC TGCTGCCACC GCTGAGCAAT AACTAGCATA ACCCCTTGGG GCCTCTAAAC

18601    GGGTCTTGAG GGGTTTTTTG CTGAAAGGAG GAACTATATC CGGATCGGCC GATCCGGCTG

18661    CTAACAAAGC CCGAAAGGAA GCTGAGTTGG CTGCTGCCAC CGCTGAGCAA TAACTAGCAT

18721    AACCCCTTGG GGCCTCTAAA CGGGTCTTGA GGGGTTTTTT GCTGAAAGGA GGAACTATAT

18781    CCGGATGGCC GCCACCGGTG GGCCTTGCAG CACATCCCCC CTTCGCCAG

 

Claims (6)

1.一种鸡新城疫病毒毒株，其制备方法包括如下步骤：将重组质粒pBrClone30-chIL2、pBL-N质粒、pBL-P质粒和pBL-L质粒共转染哺乳动物细胞并培养，得到所述鸡新城疫病毒毒株；所述重组质粒pBrClone30-chIL2为具有序列表的序列1所示的DNA分子的质粒。

2.如权利要求1所述的鸡新城疫病毒毒株，其特征在于：所述重组质粒pBrClone30-chIL2为序列表的序列3所示的质粒。

3.如权利要求1或2所述的鸡新城疫病毒毒株，其特征在于：所述哺乳动物细胞为BHK-21细胞。

4.一种鸡新城疫病毒毒株，其基因组DNA如序列表的序列3自5末端第所示。

5.权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒毒株在制备鸡新城疫病疫苗中的应用。

6.一种鸡新城疫病疫苗，包括权利要求1至4中任一所述的鸡新城疫病毒毒株。