CN111840537A

CN111840537A - 增强型血清禽腺病毒4型亚单位疫苗的制备及其应用

Info

Publication number: CN111840537A
Application number: CN201910348862.6A
Authority: CN
Inventors: 刘琴; 季国荣; 王蓬勃; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2019-04-28
Filing date: 2019-04-28
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-04-28
Also published as: CN111840537B

Abstract

本发明涉及增强型血清禽腺病毒4型亚单位疫苗的制备及其应用。本发明中，利用杆状病毒表达系统表达禽腺病毒4型纤突蛋白(Fiber‑2)、利用大肠杆菌表达系统构建表达两种细胞因子：白介素2(IL‑2)和干扰素γ(IFN‑γ)，并且将三者混合应用。利用本发明的方法制备疫苗，成本低廉，所获得的疫苗免疫效果良好，能够有效预防禽腺病毒4型的感染。

Description

增强型血清禽腺病毒4型亚单位疫苗的制备及其应用

技术领域

本发明属于免疫学以及疫苗学领域，更具体地，本发明涉及增强型血清禽腺病毒4型亚单位疫苗的制备及其应用。

背景技术

禽腺病毒(fowl adenovirus，FAdVs)可分为3个群：I群、II群和III群。I群又有12个血清型，按照基因型分成A、B、C、D、E 5个分支。其中在中国包涵体肝炎(Inclusion BodyHepatitis，IBH)和心包积液综合征(Hepatitis–hydropericardium Syndrome，HHS)是鸡群主要的两种疾病，它们均由I群腺病毒引起，其中IBH是由FAdV-8b型和FAdV-11型引起，HHS是由FAdV-4型引起。

禽腺病毒在结构上呈无囊膜的球形结构，病毒粒子以晶格状排列存在于感染的细胞核内，颗粒内包含一个36kb的线性双链DNA，与核蛋白形成髓芯。衣壳呈12面体对称，由直径8～10nm的壳粒组成，包含240个非顶点壳粒，称为六邻体，12个顶点壳粒作为五邻体基底。六邻体上的表位是诊断不同血清型的标准，是病毒对免疫选择压力最敏感的部位。每个五邻体基底上结合着2根长9～77.5nm的纤维突起，纤突有血清特异性，并含有负责体外血细胞凝集的种属特异性抗原决定位点。

禽腺病毒引起的疾病正在中国从北到南爆发疫情，给中国禽类养殖行业造成了巨大打击。除了中国，其它的国家也时有发生。

然而，传统灭活减毒疫苗存在灭活病毒质量参差不齐、佐剂搭配不合适、减毒方法不适宜、昂贵的人工成本等问题。因此，本领域亟待进一步地开发效果理想、成本低廉的防治禽腺病毒，以有效地改变这一现状。

发明内容

本发明的目的在于提供增强型血清禽腺病毒4型亚单位疫苗的制备及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：

(1)重组表达纤突蛋白Fiber-2、白介素2和干扰素γ；

(2)将(1)的纤突蛋白Fiber-2、白介素2和干扰素γ三种蛋白混合，获得免疫组合物。

在本发明的另一方面，提供一种提高纤突蛋白Fiber-2的免疫原活性的方法，其特征在于，所述方法包括：将白介素2、干扰素γ与纤突蛋白Fiber-2混合，从而提高纤突蛋白Fiber-2的免疫原活性。

在一个优选例中，所述的纤突蛋白Fiber-2通过昆虫杆状病毒表达系统表达，所述的白介素2和干扰素γ利用大肠杆菌表达系统表达(较佳地，包括表达包涵体，变性、复性)。

在另一优选例中，在三种蛋白混合后，还包括将它们与药学上或免疫学上可接受的载体混合，获得免疫组合物。

在另一优选例中，混合时，按照重量比，纤突蛋白Fiber-2:白介素2:干扰素γ为(8～20):(0.8～1.2):(0.8～1.2)；较佳地为(9～15):(0.9～1.1):(0.9～1.1)。

在另一优选例中，所述的纤突蛋白Fiber-2是来自禽腺病毒4型的蛋白；较佳地是来自禽腺病毒4型的KR5毒株；更佳地其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的白介素2是鸡白介素2；较佳地其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的干扰素γ是鸡干扰素γ；较佳地其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫的疫苗组合物，其中包括：纤突蛋白Fiber-2、白介素2与干扰素γ；并且，按照重量比，纤突蛋白Fiber-2:白介素2:干扰素γ为(8～20):(0.8～1.2):(0.8～1.2)；较佳地为(9～15):(0.9～1.1):(0.9～1.1)。

在一个优选例中，所述的纤突蛋白Fiber-2是来自禽腺病毒4型的蛋白；较佳地是来自禽腺病毒4型的KR5毒株；更佳地其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还包括：药学上或免疫学上可接受的载体(如乳化剂)。

在本发明的另一方面，提供一种用于免疫的药盒，其中包括所述的疫苗组合物。

在另一优选例中，所述的药盒还包括：适用说明书，说明所述疫苗组合物的用法或用量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、重组杆状病毒质粒Bacmid-Fiber-2菌落PCR鉴定。

图2、Western Blot检测重组杆状病毒表达产物。

其中，1、2、3号泳道分别为对照组细胞所分离的培养基上清、裂解液上清和裂解液沉淀，4、5、6号泳道分别为实验组细胞所分离的培养基上清、裂解液上清和裂解液沉淀。

图3、双向琼脂扩散检测Fiber-2重组蛋白效价。

图4、酶联免疫吸附法(ELISA)评估体内抗体水平结果。

具体实施方式

本发明提供了一种制备禽腺病毒亚单位疫苗的方法以及由该方法制备获得的疫苗组合物。本发明的方法利用杆状病毒表达系统表达禽腺病毒4型纤突蛋白(Fiber-2)、利用大肠杆菌表达系统构建表达两种细胞因子：白介素2(IL-2)和干扰素γ(IFN-γ)，并且将三者混合应用。利用本发明的方法制备疫苗，成本低廉。并且，本发明所提供的疫苗，免疫效果良好，能够有效预防禽腺病毒4型的感染。

为了获得效果良好的疫苗，本发明人选择了Fiber-2作为免疫原，但是其在重组表达方面却难度不小。在前期工作中，本发明人通过原核表达系统进行Fiber-2的重组表达，但这种表达始终无法使之具备应有的生物活性，这可能是重组表达后的蛋白无法正确折叠引起的。因此，通过多种表达体系的转换，本发明人最终以杆状病毒表达系统实现了较为理想的表达，获得了活性相对理想的蛋白。但是，这一表达方法确实较为昂贵的，且在免疫时所需的蛋白使用量也较高，这更增加了生产成本。在此基础上，本发明人进行了进一步的优化，最终获得了本发明点技术方案，也即将Fiber-2、IL-2和IFN-γ联合运用的方法。

本发明中，选用Fiber-2蛋白，其是病毒侵染过程中具有重要作用的蛋白；以及选用细胞因子IL-2和IFN-γ。其中，所述的Fiber-2蛋白可以是具有SEQ ID NO:1所示序列的蛋白；所述的IL-2可以是具有SEQ ID NO:2所示序列的蛋白；所述的IFN-γ可以是具有SEQID NO:3所示序列的蛋白。

本发明中，还包括具有与Fiber-2蛋白、IL-2、IFN-γ相同功能、它们的序列变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(例如为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，进行1个氨基酸的取代。任何与所述的Fiber-2蛋白、IL-2、IFN-γ同源性高(比如与SEQ ID NO:1、2或3所示蛋白序列的同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且保留相同功能/活性的蛋白也包括在本发明内。来源于本发明所列举的物种以外其它物种的与SEQ ID NO:1、2或3所示蛋白序列的同源性较高、功能相同的蛋白也包括在本发明中。

本发明还涉及编码本发明Fiber-2蛋白、IL-2、IFN-γ的多核苷酸序列。所述的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。术语“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞。

本发明中，编码目标蛋白(Fiber-2蛋白、IL-2、IFN-γ)的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

作为本发明的特别优选方式，表达Fiber-2蛋白的表达体系为杆状病毒表达系统；更佳地为Bac-to-Bac杆状病毒表达系统。所述的宿主细胞例如sf9昆虫细胞，HighFive昆虫细胞；优选地为sf9昆虫细胞。

在本发明的具体实施方式中，合成Fiber-2编码序列后，将该目的片段连接至穿梭质粒pFastBac^TM1上，使穿梭质粒与杆状病毒质粒Bacmid发生转座，将目的基因交换至杆状病毒质粒上。将携带有目的基因的杆状病毒质粒转染进入贪草地夜蛾卵巢细胞(Sf9)，得到有侵染能力的病毒，使其侵染Sf9细胞进行重组Fiber-2蛋白的表达。

作为本发明的特别优选方式，表达IL-2和IFN-γ的表达体系为大肠杆菌表达系统。尽管IL-2、IFN-γ以包涵体的形式被表达，但是通过变性以及复性的操作后，本发明人发现，它们仍然能够与Fiber-2蛋白联用运用并发挥良好的生物活性，而并非如Fiber-2蛋白一样地发生活性的不稳定或活性丧失。这一表达系统表达量足够且价格低廉。

在本发明的具体实施方式中，合成鸡白介素2(chIL-2)与鸡干扰素γ(chIFN-γ)的编码序列，将该目的片段连接至大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，培养表达获得包涵体蛋白，复性后得到正确折叠的有生物活性的重组蛋白。

如上表达的三种蛋白，进行混合后，获得本发明疫苗组合物。所述的疫苗组合物包含：有效量的Fiber-2、IL-2和IFNγ。较佳地，所述的疫苗组合物中还包括：药学上或免疫学上可接受的载体。

如本文所用，“药学上或免疫学上可接受的”的成分是适用于禽类而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上或免疫学上可接受的载体”指用于免疫治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

作为本发明的优选方式，所述的疫苗组合物中，还包括兽用白油作为佐剂，将其与硬脂酸铝混合后加入司本-80制作油相，与Fiber-2、IL-2和IFNγ混合乳化制成疫苗。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的Fiber-2、IL-2和IFNγ施用于对象。其中，该Fiber-2的安全有效量一般约每只动物大于1ug，较佳地大于5ug，如5～50ug，更具体如10、15、20、25、30、40ug。该IL-2和/或IFNγ的安全有效量一般约大于0.2ug，较佳地大于0.4ug，如0.5～5ug，更具体如0.8、1、1.5、2、2.5、3、4ug。当然，具体剂量还应考虑给药途径、禽类健康状况、年龄等因素，这些都是本领域技术人员的技能范围之内的。

此外，本发明的疫苗组合物，也可被制备成单位剂型或单位剂量制剂，每个单位剂量可以根据上段的安全有效量、与安全有效量相匹配。例如，所述疫苗中重组抗原Fiber-2的含量为8～20μg/剂，IL-2和IFNγ的含量各为1～2μg/剂。

本发明还提供了一种药盒，所述的药盒中含有本发明所述的疫苗组合物。较佳地，所述的药盒中还可包含说明所述的疫苗组合物的使用方法的使用说明书，以指导本领域人员的应用。

相对于现有技术，本发明的有益效果体现在：相较于传统灭活疫苗，亚单位疫苗体积较小，去除了病毒颗粒中会引起不良反应的成分，避免全病原体生产疫苗的生物安全风险，且利于提高疫苗中主要有效成分的浓度、纯度。加之本发明中Fiber-2、IL-2和IFNγ三者联用，以更低剂量的抗原蛋白，使疫苗发挥更强的免疫效力。本发明的技术方案，对于高效防治鸡群心包积水综合征具有积极意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、重组杆状病毒的构建

本发明人的前期研究中，为了降低重组表达成本，试图将Fiber-2进行原核表达，利用大肠杆菌。但是，表达获得的蛋白无法准确折叠。经过表达系统的选择，确定采用重组杆状病毒表达系统。本实施例中，提供这一表达方法。

1、目的基因的获得

Fiber-2的构建与表达是基于昆虫杆状病毒表达系统，将编码Fiber-2的目的序列(基因序列按昆虫细胞表达系统优化)克隆于pFastBac^TM1穿梭质粒上，并使其C端带有6个His-tag，命名为pFastBac1-Fiber-2。

Fiber-2蛋白的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:1)：

2、重组杆状病毒构建

将重组穿梭质粒pFastBac1-Fiber-2转入大肠杆菌DH10Bac感受态中，挑选阳性克隆进行菌落PCR验证。

M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT(SEQ ID NO:4)

M13-R：CAGGAAACAGCTATGAC(SEQ ID NO:5)

菌落PCR反应体系为(10μl)：菌液1μl，M13上下游引物各1μl，Taq酶5μl，ddH₂O 2μl。PCR反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；56℃，30s；72℃，2min；72℃，7min；25个循环。

1％琼脂糖凝胶电泳结果如图1，显示1500bp处有明显条带，将该阳性菌保种，质粒命名为Bacmid-Fiber-2。

3、重组杆状病毒转染Sf9细胞

上述阳性菌培养后，纯化回收重组质粒。将提纯的重组杆状病毒质粒使用脂质体转染的方式转入Sf9细胞，具体操作方法参考Invitrogen的Cellfectin

II转染试剂说明书，获得P1代重组杆状病毒。

P1代病毒已具有侵染细胞能力，将其接种Sf9昆虫细胞，27℃培养3天后，收获P2代杆状病毒，以此类推，得到滴度合适的P3代病毒用于之后的重组目的蛋白表达。

实施例2、重组Fiber-2蛋白的制备

1、重组蛋白Fiber-2的表达测试

将上述制备P3代病毒的孔板进行如下处理：吸取1ml对照组与实验组孔板培养基上清，4℃，10000g离心15min，再取离心上清制样；在对照组与实验组底部细胞中加入2ml1％TritonX-100，对细胞进行裂解，裂解充分后，将裂解液4℃，10000g离心15min，离心上清取样，沉淀用2ml PBS悬起后取样，将上述样品Western blot检测。

结果如图2，表明目的蛋白不会分泌至培养基上清中，细胞破碎后目的蛋白绝大部分以可溶形式位于细胞裂解上清中。

2、重组Fiber-2蛋白的大量表达与溶解

将上述有侵染能力的重组杆状病毒以MOI＝1接种大量Sf9细胞，27℃培养96h后，离心(4℃，5000g，15min)收集沉淀，即获得大量重组Fiber-2蛋白。

用破胞缓冲液(20mmol/L磷酸盐缓冲液、150mmol/L NaCl、20mmol/L咪唑、1mmol/LMgCl₂、1mmol/L PMSF、PH＝7.4)将上述沉淀以固液比1:10悬起，高压匀浆破碎(800bar，3min，2cycles)后，离心(4℃，10000g，20min)收集破碎上清。

3、重组Fiber-2蛋白的活性检测

使用方法为双向琼脂扩散法，是测定抗原效价的生物学定量方法之一。是在含有电解质的半固体琼脂或琼脂糖板上，将待测可溶性抗原与标准血清加入至板上预先打好的小孔中，使其在琼脂板上均匀扩散，在一定位置相遇，形成肉眼可见的沉淀线。根据待测抗原的稀释倍数及沉淀线的位置即可粗略判断该抗原的效价。

将待测抗原按照以下比例稀释：1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256，加入至对应琼脂孔中，中心孔加入标准阳性血清。正置3min后，倒置于湿盒，放入37℃培养箱中，48-96h后观察结果。

不同批次的样品，经上述方法测定，结果均有128倍以上的效价，如图3。该结果说明，所述的重组蛋白可与禽腺病毒4型标准品中的特异性抗体发生反应，具有良好的特异性和反应原性。

实施例3、白介素2和干扰素γ的表达与制备

1、目的基因的获得

鸡白介素2(chIL-2)与鸡干扰素γ(chIFN-γ)序列为南京金苏瑞合成，将编码chIL-2和chIFN-γ的目的序列(基因序列按大肠杆菌表达载体优化)分别克隆于pET28a(+)，分别获得重组质粒pET28a-chIL-2和pET28a-chIFN-γ，转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。

chIL-2的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:2)：

chIFN-γ的氨基酸序列如下(SEQ ID NO:3)：

2、重组chIL-2与chIFN-γ的表达

将阳性菌株以1％接种量接入含有卡那抗性的培养基中，37℃培养至OD＝0.6～0.8后，加入终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导，之后继续放入37℃摇床培养，5h后，离心(4℃，10000g，15min)收集菌体。使用破胞缓冲液将菌体以固液比1:10悬起，高压匀浆破碎(1000bar，3min，2cycles)后，离心(4℃，10000g，20min)收集破碎上清，并将破碎沉淀用等体积缓冲液悬起，上清沉淀分别取样进行SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝染色检测目标条带。

结果如图4，表明重组蛋白chIL-2与chIFN-γ均以包涵体的形式存在于细菌破碎沉淀中，无法直接纯化，需进行复性操作。

更换表达条件，将前述37℃摇床培养5h的条件替换为30℃摇床培养10h；或替换为16℃摇床培养20h，均得到一致结果。

3、重组chIL-2与chIFN-γ的复性

包涵体的复性通常包括以下步骤：破碎菌体、包涵体洗涤、包涵体溶解、包涵体复性。

复性操作及缓冲液配方如下：

破碎菌体：100ml菌液10000g离心15min后，加入25ml破菌Buffer(50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、0.5mmol/L EDTA、PH＝8)均匀悬起，高压匀浆破碎(1000bar，3min，2cycles)后，离心(10000g，4℃，15min)收集沉淀，得到重组包涵体蛋白。

包涵体洗涤：使用洗涤buffer(50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、0.5mmol/LEDTA、1％TritonX-100、2mol/L尿素、PH＝8)上述沉淀均匀吹打悬起，重复两次。

包涵体溶解：使用溶解buffer(chIL-2溶解Buffer：50mmol/L Tris-HCl、50mmol/LNaCl、0.5mmol/L EDTA、8mol/L尿素、5mmol/L DTT，PH＝8；chIFN-γ溶解Buffer：50mmol/LTris-HCl、50mmol/L NaCl、0.5mmol/L EDTA、0.45％十二烷基肌氨酸钠、5mmol/L DTT，PH＝8)将沉淀悬起，吹打均匀后将离心管置于4℃旋转孵育1-2h，使包涵体完全溶解。

包涵体复性(透析复性法)：chIL-2透析复性Buffer：50mmol/L Tris-HCl、50mmol/L NaCl、0.5mmol/L EDTA、5％甘油、0.5mol/L L-精氨酸、6～0mol/L浓度递减尿素(6、4、2、0mol/L尿素，前三梯度各透析10h，0mol/L透析18h)。chIFN-γ透析复性Buffer：50mmol/LTris-HCl、50mmol/L NaCl、0.5mmol/L EDTA、5％甘油、0.5mol/L L-精氨酸、0.4％～0％浓度递减十二烷基肌氨酸钠(0.35％、0.25％、0.15％、0％，前三梯度各透析10h，0mol/L透析18h)。

将包涵体溶解液加入至预先处理好的透析袋中，封口后放入复性缓冲液中，加入磁力搅拌转子后置于4℃冰箱中。并按上述梯度顺序更换缓冲液，将变性剂除去，随后更换L-精氨酸透析缓冲液，同样在缓冲液中降低L-精氨酸的浓度，以逐步除去透析袋中的L-精氨酸。

4、重组chIL-2与chIFN-γ的可溶性检测

透析完成后，将透析液置于离心管中，离心(10000g，15min，4℃)收集上清，取样进行SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝染色法检测。

结果显示，重组蛋白chIL-2或chIFN-γ以可溶状态存在于缓冲液中。

实施例4、疫苗制备

1、溶液制备

双向琼脂就扩散测定128倍效价的重组Fiber-2蛋白浓度约为0.7mg/ml，chIL-2与chIFN-γ透析后浓度约为0.6mg/ml，用PBS将上述蛋白稀释，并按实验要求将抗原、chIL-2与chIFN-γ预混于同一体系中。

2、油相制备

将兽用白油和硬脂酸铝以体积比95:1的比例混合均匀后加热至80℃，再加入5份(v/v)司本-80，调节温度达到120℃后，维持30min，冷却至室温备用。

3、水相制备

在PBS稀释后的重组蛋白中加入5％的吐温-80，慢慢搅拌使吐温-80完全溶解。

4、乳化(30ml体系)

将制备好的油相20ml加入至高速剪切机内，开机调节转子缓慢搅拌，然后缓慢加入10ml水相，调节转速至10000r/min，乳化5min。吸取20ml乳化液至离心管中，3000r/min离心15min，若管底析出的水相不超过1ml，则表明乳化成功。

实施例5、动物实验疫苗检验

1、Fiber-2单独免疫实验

选取40只1日龄SPF鸡，实验室养殖1周后随机分为4组，编号为1、2、3、4，每组10只。将制备的重组Fiber-2亚单位疫苗按照不同剂量颈皮下接种SPF鸡。

将上述免疫后的4周龄SPF鸡肌肉注射流行毒株，病毒含量≥10⁵TCID₅₀/ml，6每只注射0.3ml，攻毒后观察记录死亡及病变情况。实验结果如表1。

表1、Fiber-2亚单位疫苗单独免疫结果

*疫苗中重组蛋白的量。

该结果表明，疫苗中重组Fiber-2蛋白的量对免疫效果有着重要影响，50μg/剂会对鸡群抵御I群禽腺病毒有100％效果。

2、Fiber-2与chIL-2以及chIFN-γ联合免疫

(1)免疫与攻毒

选取50只1日龄SPF鸡，实验室养殖1周后随机分为5组，编号为A、B、C、D、E，每组10只。将重组Fiber-2与chIL-2以及chIFN-γ制备的亚单位疫苗按照不同剂量颈皮下接种SPF鸡。

将上述免疫后的4周龄SPF鸡肌肉注射分离毒株，病毒含量≥10⁵TCID₅₀/ml，每只注射0.3ml，攻毒后观察记录死亡及病变情况。

免疫与攻毒的剂量整理如表2。

表2、联合免疫方案

(2)血样的抽取与血清分离

攻毒前1天和攻毒后第4周对各组鸡分别采血并分离血清。

采血前1天晚上将笼中所有饲料移出，保证第2天早晨采血时鸡群处于空腹状态，取静脉血分离血清。

将采集好的血样加入至无菌试管中，室温倾斜放置2-4h后，血液便会凝固，血清在上层析出，将血块用无菌针挑出后即可得到血清样品，编号标记后储存备用。采血的组别为B组与E组，即单独Fiber-2制备的亚单位疫苗以及添加chIL-2与chIFN-γ制备的亚单位疫苗，随机挑选6只，攻毒前1天血样编号为B1、B2…B5、B6；E1、E2…E5、E6。攻毒后第4周血样编号为b1、b2…b5、b6；e1、e2…e5、e6。

(3)双向琼脂扩散及酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗体水平

准备四块琼脂糖板，用移液器将B1-B6、E1-E6、b1-b6、e1-e6四组血样按顺序点样20μl至梅花孔边缘孔内在中间孔加入流行毒株培养混液，室温放置5min后将其倒置于37℃湿盒中孵育48～96h，观察出现沉淀线平板的数量。结果如表3和表4。

表3、琼脂扩散检测B组抗体水平

表4、琼脂扩散检测E组抗体水平

上述实验结果表明，添加chIL-2与chIFN-γ的疫苗较单纯Fiber-2抗原制备的疫苗更能刺激机体产生强烈的免疫反应，且抗体水平持续时间较长。

酶联免疫吸附法使用Biochek公司的FAdV-I ELISA试剂盒检测目标血清抗体水平，其中含I群禽腺病毒预包被板、洗涤液、稀释液以及羊抗鸡IgG-HRP二抗等，具体步骤按试剂盒操作说明。将B1、B3、B6与E1、E3、E6组血样进行检测，比较两种疫苗免疫3周后鸡体内抗体水平。

结果如图4所示，E组抗体水平显著高于B组。

(4)存活数及发病数统计

攻毒后第4周，进行鸡群发病数与死亡数的统计，观察各组鸡的粮、水进食情况，精神状态以及全身和局部反应，染病鸡群前期无明显病变现象，发病末期会出现食欲下降、精神沉郁、萎靡不振、躯干呈蜷曲状等现象。依据此类现象判断是否发病。结果如表5。

表5、联合免疫结果

上述实验结果表明，本发明制备的禽腺病毒灭活疫苗能够抵御流行病毒分离株的攻击，具有较好的免疫效果。

上述实验结果还表明，chIFN-γ与Fiber-2联用的效果显著优于chIL-2与Fiber-2联用的效果。但是，同时添加chIFN-γ与chIL-2后，可极大地减少表达难度大且制备成本高的Fiber-2抗原的剂量，使得每剂中Fiber-2抗原的使用量从50μg/剂极大地降低到10μg/剂，剂量极大地下降但依然使疫苗维持具有100％的保护效力。

成本上，单纯从培养基角度考虑，昆虫细胞培养基1L价格为200元，大肠杆菌LB培养基大约1L价格在10元以内，而且昆虫细胞表达系统制备一批样品需要6天，而大肠杆菌则只需5h便可收获，人力物力成本均较低。

并且，由于抗原毕竟是外源物质，外源物质剂量太高必然会存在副反应。三蛋白联用后，达到100％保护力所需施用于鸡的总外源蛋白总量也显著性降低。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 华东理工大学

<120> 增强型血清禽腺病毒4型亚单位疫苗的制备及其应用

<130> 192871

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> 禽腺病毒(avian adenovirus)

<400> 1

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Gln Pro Glu

1 5 10 15

Ser Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Gly Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Glu Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Ser Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr

260 265 270

Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser

275 280 285

Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Ile Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ser His Pro Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Val Gln

305 310 315 320

Gly Leu Leu Phe Thr Ser Leu Tyr Val Lys Leu Asp Ser Thr Thr Met

325 330 335

Gly Thr Arg Pro Gly Asp Asn Ser Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr

340 345 350

Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln

355 360 365

Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Ala Leu Ala Asp Phe Glu Pro

370 375 380

Met Ala Asn Arg Ser Val Ser Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Ala

385 390 395 400

Tyr Tyr Gln Pro Ser Ser Gly Glu Phe Gln Val Phe Thr Pro Val Val

405 410 415

Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val

420 425 430

Pro Val Thr Ala Ser Gly Asp Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu

435 440 445

Gln Cys Thr Asn Ser Ser Ile Phe Asn Pro Ala Asn Ser Gly Thr Met

450 455 460

Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Val Pro

465 470 475

<210> 2

<211> 143

<212> PRT

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<400> 2

Met Met Cys Lys Val Leu Ile Phe Gly Cys Ile Ser Val Ala Met Leu

1 5 10 15

Met Thr Thr Ala Tyr Gly Ala Ser Leu Ser Ser Ala Lys Arg Lys Pro

20 25 30

Leu Gln Thr Leu Ile Lys Asp Leu Glu Ile Leu Glu Asn Ile Lys Asn

35 40 45

Lys Ile His Leu Glu Leu Tyr Thr Pro Thr Glu Thr Gln Glu Cys Thr

50 55 60

Gln Gln Thr Leu Gln Cys Tyr Leu Gly Glu Val Val Thr Leu Lys Lys

65 70 75 80

Glu Thr Glu Asp Asp Thr Glu Ile Lys Glu Glu Phe Val Thr Ala Ile

85 90 95

Gln Asn Ile Glu Lys Asn Leu Lys Ser Leu Thr Gly Leu Asn His Thr

100 105 110

Gly Ser Glu Cys Lys Ile Cys Glu Ala Asn Asn Lys Lys Lys Phe Pro

115 120 125

Asp Phe Leu His Glu Leu Thr Asn Phe Val Arg Tyr Leu Gln Lys

130 135 140

<210> 3

<211> 164

<212> PRT

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<400> 3

Met Thr Cys Gln Thr Tyr Asn Leu Phe Val Leu Ser Val Ile Met Ile

1 5 10 15

Tyr Tyr Gly His Thr Ala Ser Ser Leu Asn Leu Val Gln Leu Gln Asp

20 25 30

Asp Ile Asp Lys Leu Lys Ala Asp Phe Asn Ser Ser His Ser Asp Val

35 40 45

Ala Asp Gly Gly Pro Ile Ile Val Glu Lys Leu Lys Asn Trp Thr Glu

50 55 60

Arg Asn Glu Lys Arg Ile Ile Leu Ser Gln Ile Val Ser Met Tyr Leu

65 70 75 80

Glu Met Leu Glu Asn Thr Asp Lys Ser Lys Pro His Ile Lys His Ile

85 90 95

Ser Glu Glu Leu Tyr Thr Leu Lys Asn Asn Leu Pro Asp Gly Val Lys

100 105 110

Lys Val Lys Asp Ile Met Asp Leu Ala Lys Leu Pro Met Asn Asp Leu

115 120 125

Arg Ile Gln Arg Lys Ala Ala Asn Glu Leu Phe Ser Ile Leu Gln Lys

130 135 140

Leu Val Asp Pro Pro Ser Phe Lys Arg Lys Arg Ser Gln Ser Gln Arg

145 150 155 160

Arg Cys Asn Cys

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

tgtaaaacga cggccagt 18

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

caggaaacag ctatgac 17

Claims

1.一种制备疫苗组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)重组表达纤突蛋白Fiber-2、白介素2和干扰素γ；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的纤突蛋白Fiber-2通过昆虫杆状病毒表达系统表达，所述的白介素2和干扰素γ利用大肠杆菌表达系统表达。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在三种蛋白混合后，还包括将它们与药学上或免疫学上可接受的载体混合，获得免疫组合物。

4.一种提高纤突蛋白Fiber-2的免疫原活性的方法，其特征在于，所述方法包括：将白介素2、干扰素γ与纤突蛋白Fiber-2混合，从而提高纤突蛋白Fiber-2的免疫原活性。

5.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，混合时，按照重量比，纤突蛋白Fiber-2:白介素2:干扰素γ为(8～20):(0.8～1.2):(0.8～1.2)；较佳地为(9～15):(0.9～1.1):(0.9～1.1)。

6.如权利要求1～4任一所述的方法，其特征在于，所述的纤突蛋白Fiber-2是来自禽腺病毒4型的蛋白；较佳地是来自禽腺病毒4型的KR5毒株；更佳地其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

所述的白介素2是鸡白介素2；较佳地其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或

所述的干扰素γ是鸡干扰素γ；较佳地其具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

7.一种用于免疫的疫苗组合物，其特征在于，其中包括：纤突蛋白Fiber-2、白介素2与干扰素γ；并且，按照重量比，纤突蛋白Fiber-2:白介素2:干扰素γ为(8～20):(0.8～1.2):(0.8～1.2)；较佳地为(9～15):(0.9～1.1):(0.9～1.1)。

8.如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的纤突蛋白Fiber-2是来自禽腺病毒4型的蛋白；较佳地是来自禽腺病毒4型的KR5毒株；更佳地其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或

9.如权利要求1所述的疫苗组合物，其特征在于，所述的疫苗组合物还包括：药学上或免疫学上可接受的载体。

10.一种用于免疫的药盒，其特征在于，其中包括权利要求7～9任一所述的疫苗组合物。