CN113817764A - 一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，公开了一种I群4型禽腺病毒Fiber‑2蛋白的制备及应用。所述制备方法包括：以FAdV‑4毒株DNA为模板，设计引物扩增出fiber2序列，测序正确后，将fiber2序列进行密码子优化，然后将其构建到pMal‑c2X载体上，得到重组质粒pMal‑c2X‑FAV4‑fiber2；最后转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，得到I群4型禽腺病毒Fiber‑2蛋白。本发明方法只需要在37℃诱导3h即可，时间短，操作简单，其表达的目的蛋白是有利于纯化的可溶性蛋白，只需要一步镍柱层析，便可获得大量目的蛋白，而且成本低，易放大。

Description

一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用。

背景技术

禽腺病毒(Fowl adenovirus，FAdV)属于禽腺病毒科禽腺病毒属成员，是呈二十面体对称的无囊膜线性双股DNA病毒，其基因组线性长度约43～45kb，病毒直径为70～100nm。腺病毒的核衣壳有3个主要结构蛋白：六邻体蛋白(Hexon)、纤突蛋白(Fiber)和五邻体蛋白(Penton)。禽腺病毒分为I、Ⅱ、Ⅲ三个亚群，I亚群包括鸡、火鸡、鸭和鹅常规腺病毒，Ⅱ亚群和Ⅲ亚群禽腺病毒分别以火鸡出血性肠炎病毒和产蛋下降综合征病毒为代表。根据限制性内切酶片段图谱和核酸序列等分子生物学标准又将I群禽腺病毒分为A-E五个种，每个种内的病毒根据血清交叉中和试验结果进一步分为12个血清型(1～7、8a、8b、9～11)。

不同血清型对禽类的致病作用存在差异，FAdV-1与肌胃糜烂(Gizzarderosion，GE)有关，FAdV-2、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-11，感染鸡能引起包涵体肝炎(Inclusionbodyhepatitis，IBH)，而FAdV-4是肝炎-心包积液(hepatitis-hydropericardium syndrome，HHS)的主要病原体。研究表明，FAdV可在健康禽体内复制，症状非常轻微或不表现感染症状，但与免疫抑制病(鸡传染性贫血、鸡传染性法氏囊病)混合感染时可成为条件性病原，从而影响禽类宿主的健康。

已经证明HHS是由FAdV-4单独引起的。由FAdV-4引起的HHS是一种异常侵袭性的临床疾病，病程发展迅速，高死亡率是其主要临床表现。感染FAdV-4的鸡群可出现不同程度的临床症状，包括昏睡，食欲不振，羽毛杂乱，排黄绿色稀粪，体重减少导致饲料转换率下降，但有的没有特征性症状，突然发病死亡，剖检可见肝脏变黄、出血肿胀、偶有坏死灶，最明显的病变为心包腔中有淡黄色清亮的积液，还可观察到肾脏肿大、出血苍白等病变。由FAdV-4引起的HHS给家禽养殖业尤其肉禽的养殖造成很大的经济损失，此时的科研工作主要集中在调查流行株的血清型，疫病的防控特别是疫苗的研发等方面。

在FAdV-4疫苗防控方面，许多研究人员使用甲醛灭活病禽的肝组织匀浆制备的甲醛灭活疫苗可成功预防该病。但此类疫苗也存在一些缺陷，比如禽肝组织匀浆液可能引发其他细菌和病毒的感染，灭活不完全也可导致HHS和其他病原体的进一步传播。有研究发现自巴基斯坦首次爆发HHS以来，之后的大多数疫情其实发生在接种疫苗后，说明该疫苗的安全性以及有效性还需进一步研究，因此建议使用鸡胚或者细胞培养病毒代替不健康的肝脏匀浆。而鸡胚繁殖病毒含量低，原代肝细胞肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入鸡胚成纤维细胞(CEF)，不利于实验操作，且灭活苗存在灭活不彻底的隐患。所以亟需研究新的、安全性更好的抗原及其制备的疫苗。

亚单位疫苗一直是疫苗研究的热点，其优势在于能够避免灭活苗和弱毒疫苗毒力返强等问题。FAdV-4的两条Fiber蛋白(Fiber 1和Fiber 2)，分别由两条不同的Fiber基因编码，且两条Fiber蛋白的长度差异显著，重组Fiber 2蛋白比Fiber 1蛋白活性更好，对FAdV-4的保护作用更强。鉴于此，Fiber 2蛋白被认为是FAdV-4的一种重要的保护性抗原蛋白，在新型重组蛋白亚单位疫苗研究方面具有潜在的开发应用价值。

专利CN 110128508 A公开了一种禽腺病毒fiber蛋白亚单位疫苗。是使用禽腺病毒新型的抗原fiber蛋白，对序列进行优化后采用pET28a载体构建重组质粒，使fiber蛋白在大肠杆菌中获得可溶性的表达，表达产物制备亚单位疫苗。专利CN 112608932 A公开了一种大肠杆菌中高效表达禽腺病毒Fiber-2蛋白的方法。分别以PET-21a-GX-1-fiber2质粒和PXMJ19-C1786T-hexon(T7)质粒为模板，通过设计的引物进行扩增，得到Fiber-2目的片段和PXMJ19-C1786T-T7载体片段；然后进行同源重组，得到重组质粒PXMJ19-T7-his-fiber2；最后转化至ShuffleT7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达。专利CN 112538104A公开了构建促融质粒优化禽腺病毒Fiber-2蛋白表达及纯化的方法。通过特定模板扩增Fiber-2目的片段和PET-32a-T7-TrxA载体片段，然后进行同源重组得到重组质粒PET-32a-T7-TrxA-Fiber2转化至Shuffle T7-B感受态细胞进行Fiber-2蛋白的表达，提高Fiber-2蛋白的可溶性。上述现有技术均是采用特定的目的片段与不同的载体进行重组，然后转化至感受态细胞进行表达，以获得制备亚单位疫苗的蛋白产物。但上述方法构建的重组质粒普遍存在构建方法复杂，诱导时间较长，可溶性表达量不足或是温度等条件比较复杂的问题。

发明内容

针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白在制备禽腺病毒亚单位疫苗中的应用。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，包括如下制备步骤：

(1)以FAdV-4毒株DNA为模板，fiber2-F和fiber2-R为引物，PCR扩增出fiber2序列；

fiber2-F：5’-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3’(SEQ ID NO：1)；

fiber2-R：5’-GCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA-3’(SEQ ID NO：2)；

所述fiber2序列为SEQ ID NO：3；

(2)将步骤(1)扩增出的fiber2序列N段插入BamHⅠ酶切位点，在C端终止密码子之前插入6×His标签以及HindⅢ酶切位点，然后进行密码子优化并合成序列，得到经过密码子优化的fiber2序列；所述经过密码子优化的fiber2序列为SEQ ID NO：4；

(3)将步骤(2)经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2；

(4)将步骤(3)所得重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，得到I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白。

进一步地，步骤(1)中所述PCR扩增体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸54s，共34个循环；72℃延伸10min。

进一步地，步骤(3)中所述将经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上的步骤为：

将经过密码子优化的fiber2片段与空载体pMal-c2X用BamHⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切结束后，进行1％核酸凝胶电泳纯化，将目的条带切胶后进行胶回收，得到回收的目的片段fiber2和回收的空载体，然后将回收的目的片段fiber2和回收的空载体在T4连接酶条件下进行连接反应，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2。

进一步优选地，所述双酶切的反应时间为4h，反应温度为37℃，反应体系如下：

进一步优选地，所述连接反应的反应时间为12h，反应温度为16℃，反应体系如下：

进一步地，步骤(4)中所述转化大肠杆菌BL21的步骤为：

1)取重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2加入E.coli BL21感受态细胞中，冰浴30min；

2)42℃热激90s；冰浴2min；

3)在超净台内加入900μL SOC培养基，置于37℃摇床中220rpm摇1h；

4)取菌液涂布在氨苄抗性LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆加入氨苄抗性LB培养基中摇至OD值为0.8后，菌液和50％甘油1:1混合均匀得到甘油菌悬液，后于-80℃保存备用。

进一步地，步骤(4)中所述诱导表达包括小量诱导表达和大量诱导表达，所述小量诱导表达步骤如下：

1)菌株活化：用接种环挑取甘油菌悬液于氨苄抗性平板上划线，37℃培养过夜；

2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至1mL氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm培养至OD600值为0.6～0.8；

3)二次接种：将活化好的菌悬液按1:100的比例接种到10mL新的氨苄抗性LB培养基中，37℃，220rpm培养；

4)诱导：当菌液OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG，使终浓度为0.1mM，置于37℃摇床中诱导3h；

所述大量诱导表达步骤如下：

1)菌株活化：用接种环挑取甘油菌悬液于氨苄抗性平板上划线，37℃培养过夜；

2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至100mL氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm培养至OD600值为0.6～0.8；

3)放大培养：使用F2基础发酵培养基配制6L发酵培养基，并加入6mL消泡剂，以及终浓度为50ug/mL的氨苄，混合后压入高压灭菌过的发酵罐中，按照1:100的比例加入活化的菌液进行放大培养，培养发酵参数为：PH 7.15；DO 40％；转速200rpm；温度37℃；

4)诱导：菌液培养至OD600值为12～14时加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃诱导3h。

进一步地，步骤(4)经诱导表达的蛋白通过如下方法纯化：

诱导结束后，离心收集菌体沉淀，用非变性裂解液重悬菌体，经高压均质机破碎，离心收集上清液，柱层析纯化，得到I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白。

进一步地，所述I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的氨基酸序列(在序列C端插入了6×His标签)见SEQ ID NO：5。

上述方法制备得到的I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白在制备禽腺病毒亚单位疫苗中的应用。

进一步地，所述应用步骤如下：

1)水相准备：根据疫苗中Fiber-2蛋白含量，使用PBS或生理盐水将纯化后的蛋白稀释，即为水相；

2)油相准备：按照水相和油相1:1体积比准备弗氏佐剂，即为油相；

3)乳化：将水相加入到油相中，搅拌混匀后置于4℃保存备用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明是利用大肠杆菌实现原核可溶性表达，制备抗原蛋白的方法简单，只需要在37℃诱导3h即可，时间短，操作简单，其表达的目的蛋白是有利于纯化的可溶性蛋白，只需要一步镍柱层析，便可获得大量目的蛋白，而且成本低，易放大。

(2)利用本发明制备的I群4型禽腺病毒亚单位蛋白与佐剂制备疫苗，安全性高、不存在灭活不彻底的问题(如使用蛋白制备疫苗，不需要灭活)，制备的疫苗可用于预防I群4型禽腺病毒感染措施中。

(3)本发明提供的一种I群4型禽腺病毒亚单位疫苗，具体为长纤突蛋白fiber2全长，共479个氨基酸。其具有良好的免疫原性，能够保护鸡免受FAdV-4强毒株的攻击。

附图说明

图1为实施例中所得pMal-c2X-FAV4-fiber2的质粒图谱；

图2为实施例中小量诱导表达上清和沉淀的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果图；

图3为实施例中柱层析纯化洗脱液的SDS-PAGE考马斯亮蓝染色结果图；

图4为实施例中柱层析纯化洗脱液的WB鉴定结果图；

图5为实施例中免疫攻毒实验攻毒后脏器剖检图；图中A、B、C为攻毒对照组肝脏、心脏、肾脏；D、E、F为免疫组肝脏、心脏、肾脏。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

1、FAdV-4 fiber2表达载体的构建

从实验室分离的FAdV-4 GX-LC毒株中扩增出fiber2片段，测序正确后，将fiber2序列进行密码子优化，然后将其构建到pMal-c2X载体上，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2。此载体含有MBP标签，可促进目的蛋白的可溶性表达，表达的目的蛋白也带有MBP便签，目的蛋白分子量大小约为117KDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

1.1目的片段的扩增

(1)引物设计及合成

上游引物(fiber2-F)：5’-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物(fiber2-R)：5’-GCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA-3’(SEQ ID NO：2)。

(2)加样体系50μL，如下表1所示：

表1

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸54s，共34个循环；72℃延伸10min。扩增结束后PCR产物利用1％琼脂糖进行凝胶电泳，后将目的片段切割下来按照胶回收试剂盒说明书进行胶回收。

1.2回收产物的测序、密码子优化及载体构建

将扩增出的fiber2序列连接到T载体上进行测序，连接反应体系如下表2所示：

表2

置于恒温干浴锅中16℃过夜连接，之后将连接产物转化至DH5α感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液PCR鉴定。为保证DNA测序结果的准确性，每株随机选择5个阳性克隆送至上海生工生物公司进行DNA双向测序。测序结果如SEQ ID NO：3所示。经测序发现扩增出的fiber2片段与国内分离株HN19(GenBank登录号：MT635844.1)、JSXZ(GenBank登录号：KU569296.1)、AHWH(GenBank登录号：MN606302.1)核苷酸同源性为100％，说明分离到的毒株为国内流行株，未发生变异，具有一定代表性。将扩增出的fiber2序列N段插入BamHⅠ酶切位点，在C端终止密码子之前插入6×His标签以及HindⅢ酶切位点，然后进行密码子优化并合成序列(委托金斯瑞生物科技股份有限公司完成)，得到经过密码子优化的fiber2序列；所述经过密码子优化的fiber2序列为SEQ ID NO：4。由于不同物种的种属之间，对同义密码子的使用频率是不同的，利用密码子优化可以使外源基因的同义密码子使用频率与表达宿主相匹配，从而使外源基因的表达水平显著提高。然后将经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上，具体构建方法如下：

1)将优化合成后的fiber2片段与空载体pMal-c2X用BamHⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶进行双酶切。酶切的反应时间为4h，反应温度为37℃。反应体系如下：

2)酶切结束后，进行1％核酸凝胶电泳纯化，于UV下降目的条带切胶后转到2mL的EP管中，按照试剂盒说明书进行胶回收。

3)将回收的目的片段fiber2和回收的空载体按照1:5的浓度进行连接。连接酶为T4 DNA Ligase，反应时间为12h，反应温度为16℃，反应体系如下：

4)将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，经PCR鉴定为阳性，送测序公司测序，测序正确后命名为pMal-c2X-FAV4-fiber2。其质粒图谱如图1所示。

2、FAdV-4fiber2蛋白表达

2.1转化大肠杆菌BL21，具体步骤如下：

(1)吸取10ng质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2轻柔地加入100μL E.coli BL21感受态细胞中，冰浴30min；

(2)42℃热激90s；冰浴2min；

(3)在超净台内加入900μL SOC培养基，至于37℃摇床中220rpm摇1h；

(4)吸取100μL菌液涂布在氨苄抗性LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆加入氨苄抗性LB培养基中摇至OD值为0.8后，菌液和50％甘油1:1混合均匀后于-80℃保存备用。

2.2小量诱导表达

(1)甘油菌保藏管菌株活化：用接种环挑取甘油菌悬液与氨苄抗性平板上划线，37℃培养过夜。

(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至1mL氨苄抗性培养基中，37℃220rpm/min培养至OD600值为0.6～0,8；

(3)二次接种：将活化好的菌悬液按1:100的比例接种到10mL新的氨苄抗性LB培养基中，37℃，220r/min培养，多设一组后续不加诱导剂作为对照；

(4)诱导：当菌液OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG，使终浓度为0.1mM，置于37℃摇床中诱导3h；

(5)破碎：诱导结束后，离心收集菌体沉淀，按每克细菌沉淀湿重加入3mLPBS的比例加入PBS进行重悬菌体后将菌液置于冰上利用超声波细胞破碎仪进行菌体破碎，电压为220V，超声2s，停4s，持续超声直至菌液变成流水状；

(6)将超声后液体离心分离上清和沉淀，沉淀再利用等量PBS重悬，上清和沉淀各取20uL，加入5×上样缓冲液后100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳，后用考马斯亮蓝染色液进行染色，如图2，M为蛋白Marker，1是未诱导上清，2是未诱导沉淀，3是诱导后上清，4是诱导后沉淀，由图可看出制备的fiber 2几乎都在上清中，为可溶性表达。

2.3大量诱导表达

(1)甘油菌保藏管菌株活化：用接种环挑取甘油菌悬液与氨苄抗性平板上划线，37℃培养过夜；

(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至100mL氨苄抗性培养基中，37℃220rpm/min培养至OD600值为0.6～0,8；

(3)放大培养：使用F2基础发酵培养基配制6L发酵培养基，并加入6mL消泡剂，以及终浓度为50ug/mL的氨苄，混合后压入高压灭菌过的发酵罐中，按照1:100的比例加入活化的菌液进行放大培养，培养发酵参数为：PH:7.15；DO:40％；转速：200rpm/min；温度37℃；

(4)诱导：菌液培养至OD600值为12～14时加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃诱导3h；

(5)发酵补料：待发酵培养至OD600值为17～19时，按5％的速度连续补加补料培养基，补料培养基为C源流加培养基；

(6)菌体收集：发酵结束后，收集发酵液分装到1L离心管瓶中，在8000r/min离心30min，收集菌体沉淀。

上述过程使用的F2基础培养基和C源流加培养基均为四川百诺吉科技有限公司的产品；消泡剂(Antifoam 204)为SIGMA公司的产品。

2.4蛋白纯化

小量纯化可用碧云天BeyoGold^TM His-tag Purification Resin(耐还原螯合型)试剂盒进行纯化，大量纯化则使用的是BIO-RAD中高压层析系统。

(1)菌体裂解：用2L非变性裂解液重悬菌体，将高压均质机调至4℃，将菌液样品倒入高压均质机样品槽中，调节破碎压力在800-900bar之间，破碎2次，收集破碎后的样品；

(2)离心：将破碎后的样品分装到1L离心管瓶中，8000rpm，4℃，离心30min，收集上清液；

(3)平衡镍柱：用超纯水平衡2～3倍柱体积，排出30％的乙醇保存液，然后用裂解液平衡2～3倍柱体积，流速为1mL/min，压力控制在3psi；

(4)进样：控制流速为0.5mL/min，压力控制在3psi，将样品流入镍柱填料中；

(5)洗涤：调节流速为2mL/min，压力控制在3psi，用非变性洗涤液洗涤镍柱，直至γ(280nm)曲线趋于平缓；

(6)洗脱：调节流速为2mL/min，压力控制在3psi，用非变性洗脱液洗脱目的蛋白，待γ(280nm)曲线出峰时开始收集，曲线回落即将趋于平缓时结束(图3为洗脱液SDS-PAGE考马斯亮蓝染色图，图4为WB鉴定图片)。

上述所用液体配方如下：

非变性裂解液：50mMNaH₂PO₄，6.90gNaH₂PO₄·H₂O(MW 137.99g/mol)，300mM NaCl，17.54g NaCl(MW 58.44g/mol)，用氢氧化钠调节pH值至8.0。

非变性洗涤液：50mMNaH₂PO₄，6.90gNaH₂PO₄·H₂O(MW 137.99g/mol)，300mM NaCl，17.54g NaCl(MW 58.44g/mol)，2mM imidazole，0.136g imidazole(MW 68.08g/mol)，用氢氧化钠调节pH值至8.0。

非变性洗脱液：50mMNaH₂PO₄，6.90gNaH₂PO₄·H₂O(MW 137.99g/mol)，300mM NaCl，17.54g NaCl(MW 58.44g/mol)，50mM imidazole，3.40g imidazole(MW 68.08g/mol)，用氢氧化钠调节pH值至8.0。

2.5亚单位疫苗制备

(1)水相准备：根据疫苗中Fiber-2蛋白含量，使用PBS(或生理盐水)将纯化后的蛋白稀释适当浓度，即为水相；

(2)油相准备：按照水相和油相1:1体积比准备适量弗氏佐剂；

(3)乳化：将水相缓缓加入到油相中，7000rpm/min搅拌30s，停30s，重复3次，检验合格后置于4℃保存备用。

3、免疫攻毒实验：

为了验证Fiber2蛋白的免疫原性，使用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂制备了2批疫苗，每批疫苗中fiber2-MBP融合蛋白的浓度为250ug/mL(每只免疫0.2mL)。

取20只3日龄SPF鸡，随机分成2组，每组10只。组一3日龄免疫弗氏完全佐剂疫苗，2周后用弗氏不完全佐剂疫苗加强免疫一次，对照组则用PBS代替蛋白水相与佐剂混合后，等量注射。免疫后4周内，所有鸡都正常，未出现任何异常情况，说明疫苗安全性良好；初免4周后用200uL 10⁷TCID₅₀FAdV-4 GGC强毒株进行攻毒，连续观察14天，免疫组鸡正常，未出现异常情况，而对照组10只在攻毒6天内全部死亡。免疫组和对照组攻毒后脏器解剖图如图5所示，图中A、B、C为攻毒对照组肝脏、心脏、肾脏；D、E、F为免疫组肝脏、心脏、肾脏。结果表明该疫苗能保护鸡免受强毒攻击，具有良好的免疫原性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备及应用

<130> 2021-10-26

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

atgctccggg cccctaaaag aagacattc 29

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

gctgtccagc ggcctccctc ccgtaa 26

<210> 3

<211> 1440

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

atgctccggg cccctaaaag aagacattcc gaaaacggga agcccgagac cgaagcggga 60

ccttccccgg ctccaatcaa gcgcgccaaa cgcatggtga gagcatccca gcttgacctg 120

gtttatcctt tcgattacgt ggccgacccc gtcggagggc tcaacccgcc ttttttggga 180

ggctcaggac ccctagtgga ccagggcgga cagcttacgc tcaacgtcac cgatcccatc 240

atcatcaaga acagatcggt ggacttggcc cacgacccca gtctcgatgt caacgcccaa 300

ggtcaactgg cggtggccgt tgaccccgaa ggggccctgg acatcacccc cgatggactg 360

gacgtcaagg tcgacggagt gaccgtaatg gtcaacgatg actgggaact ggccgtaaaa 420

gtcgacccgt ccggcggatt ggattccacc gcgggtggac tgggggtcag cgtggacgac 480

accttgctcg tggatcaggg agaactgggc gtacacctca accaacaagg acccatcact 540

gccgatagca gtggtatcga cctcgagatc aatcctaaca tgttcacggt caacacctcg 600

accggaagcg gagtgctgga actcaaccta aaagcgcagg gaggcatcca agccgacagt 660

tcgggagtgg gcgtttccgt ggatgaaagc ctacagattg tcaacaacac tctggaagtg 720

aaaccggatc ccagcggacc gcttacggtc tccgccaatg gcctagggct gaagtacgac 780

actaataccc tagcggtgac cgcgggcgct ttaaccgtgg tcggaggggg gagcgtctcc 840

acacccatcg ctacttttgt ctcgggaagt cccagcctca acacctacaa tgccacgacc 900

gtcaattcca gcgcgaacgc cttctcttgc gcctactacc ttcaacagtg gaacatacag 960

gggctccttg ttacctccct ctacttgaaa ttggacagcg ccaccatggg gaatcgccct 1020

ggggacctca actccgccaa tgccaaatgg ttcacctttt gggtgtccgc ctatctccag 1080

caatgcaacc cctccgggat tcaagcggga acggtcagcc cctccaccgc caccctcacg 1140

gactttgaac ccatggccaa taggagcgtg accagcccat ggacgtactc ggccaatgga 1200

tactatgaac catccatcgg ggaattccaa gtgttcagcc cggtggtaac aggtgcctgg 1260

aacccgggaa acatagggat ccgcgtcctc cccgtgccgg tttcggcctc cggagagcga 1320

tacacccttc tatgctatag tctgcagtgc acgaacgcga gcatttttaa tccaaacaac 1380

agcggaacca tgatcgtggg acccgtgctc tacagctgtc cagcggcctc cctcccgtaa 1440

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<211> 1458

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

atgctgcgtg caccgaaacg tcgtcatagc gaaaacggta aaccggaaac cgaagcaggt 60

ccgagtccgg caccgattaa acgcgctaaa cgtatggttc gcgcatctca gctggatctg 120

gtttacccgt ttgattacgt tgccgatccg gttggcggtc tgaatccgcc gtttctgggc 180

ggttctggtc cgctggtaga tcaaggcggt caactgaccc tgaacgttac cgatccgatc 240

atcatcaaaa accgcagcgt tgatctggcg cacgatccga gtctggacgt taacgcacaa 300

ggtcaactgg cagttgctgt tgatccggaa ggcgcactgg atattacccc ggacggtctg 360

gacgtgaaag ttgacggcgt taccgttatg gtcaacgacg attgggaact ggcggttaaa 420

gttgatccgt ctggcggtct ggatagtacc gcaggcggtc tgggcgtttc tgttgacgat 480

accctgctgg ttgatcaagg cgaactgggc gttcatctga atcagcaggg tccgattacc 540

gcagatagca gcggcattga tctggaaatc aacccgaaca tgttcaccgt caacaccagt 600

accggttcag gcgttctgga actgaacctg aaagcgcaag gcggtattca agcagcaagt 660

agcggcgttg gggtttccgt tgacgaaagt ctgcagatcg tcaacaacac cctggaagtt 720

aaaccggacc cgtctggtcc gctgaccgta tctgcaaacg gtctgggcct gaaatacgat 780

accaataccc tggcagttac cgcaggcgca ctgacggttg ttgggggcgg ttccgttagt 840

accccgattg caacctttgt tagcggtagt ccgagcctga atacctataa cgcaaccacc 900

gttaatagca gcgcgaacgc atttagctgc gcgtattacc tgcagcagtg gaacattcag 960

ggtctgctgg ttaccagtct gtacctgaaa ctggactctg caaccatggg taatcgtccg 1020

ggcgatctga attctgcaaa cgcgaaatgg ttcacctttt gggtaagcgc ctatctgcag 1080

cagtgtaatc cgtctggcat tcaagcaggt accgttagtc cgagtaccgc aaccctgacc 1140

gattttgaac cgatggcgaa ccgtagcgtt accagtccgt ggacctattc tgcaaacggt 1200

tactacgaac cgagcattgg cgaattccag gtttttagtc cggttgttac cggcgcttgg 1260

aacccgggta acattggtat tcgcgttctg ccggttccgg tttctgcatc tggcgaacgt 1320

tataccctgc tgtgttactc cctgcaatgc accaacgcaa gcatcttcaa cccgaacaac 1380

tctggtacca tgatcgttgg tccggttctg tatagttgtc cggcagcaag tctgccgcat 1440

catcatcatc accactaa 1458

<210> 5

<211> 485

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 5

Met Leu Arg Ala Pro Lys Arg Arg His Ser Glu Asn Gly Lys Pro Glu

1 5 10 15

Thr Glu Ala Gly Pro Ser Pro Ala Pro Ile Lys Arg Ala Lys Arg Met

20 25 30

Val Arg Ala Ser Gln Leu Asp Leu Val Tyr Pro Phe Asp Tyr Val Ala

35 40 45

Asp Pro Val Gly Gly Leu Asn Pro Pro Phe Leu Gly Gly Ser Gly Pro

50 55 60

Leu Val Asp Gln Gly Gly Gln Leu Thr Leu Asn Val Thr Asp Pro Ile

65 70 75 80

Ile Ile Lys Asn Arg Ser Val Asp Leu Ala His Asp Pro Ser Leu Asp

85 90 95

Val Asn Ala Gln Gly Gln Leu Ala Val Ala Val Asp Pro Glu Gly Ala

100 105 110

Leu Asp Ile Thr Pro Asp Gly Leu Asp Val Lys Val Asp Gly Val Thr

115 120 125

Val Met Val Asn Asp Asp Trp Glu Leu Ala Val Lys Val Asp Pro Ser

130 135 140

Gly Gly Leu Asp Ser Thr Ala Gly Gly Leu Gly Val Ser Val Asp Asp

145 150 155 160

Thr Leu Leu Val Asp Gln Gly Glu Leu Gly Val His Leu Asn Gln Gln

165 170 175

Gly Pro Ile Thr Ala Asp Ser Ser Gly Ile Asp Leu Glu Ile Asn Pro

180 185 190

Asn Met Phe Thr Val Asn Thr Ser Thr Gly Ser Gly Val Leu Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Lys Ala Gln Gly Gly Ile Gln Ala Ala Ser Ser Gly Val Gly

210 215 220

Val Ser Val Asp Glu Ser Leu Gln Ile Val Asn Asn Thr Leu Glu Val

225 230 235 240

Lys Pro Asp Pro Ser Gly Pro Leu Thr Val Ser Ala Asn Gly Leu Gly

245 250 255

Leu Lys Tyr Asp Thr Asn Thr Leu Ala Val Thr Ala Gly Ala Leu Thr

260 265 270

Val Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Thr Pro Ile Ala Thr Phe Val Ser

275 280 285

Gly Ser Pro Ser Leu Asn Thr Tyr Asn Ala Thr Thr Val Asn Ser Ser

290 295 300

Ala Asn Ala Phe Ser Cys Ala Tyr Tyr Leu Gln Gln Trp Asn Ile Gln

305 310 315 320

Gly Leu Leu Val Thr Ser Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Ala Thr Met

325 330 335

Gly Asn Arg Pro Gly Asp Leu Asn Ser Ala Asn Ala Lys Trp Phe Thr

340 345 350

Phe Trp Val Ser Ala Tyr Leu Gln Gln Cys Asn Pro Ser Gly Ile Gln

355 360 365

Ala Gly Thr Val Ser Pro Ser Thr Ala Thr Leu Thr Asp Phe Glu Pro

370 375 380

Met Ala Asn Arg Ser Val Thr Ser Pro Trp Thr Tyr Ser Ala Asn Gly

385 390 395 400

Tyr Tyr Glu Pro Ser Ile Gly Glu Phe Gln Val Phe Ser Pro Val Val

405 410 415

Thr Gly Ala Trp Asn Pro Gly Asn Ile Gly Ile Arg Val Leu Pro Val

420 425 430

Pro Val Ser Ala Ser Gly Glu Arg Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ser Leu

435 440 445

Gln Cys Thr Asn Ala Ser Ile Phe Asn Pro Asn Asn Ser Gly Thr Met

450 455 460

Ile Val Gly Pro Val Leu Tyr Ser Cys Pro Ala Ala Ser Leu Pro His

465 470 475 480

His His His His His

485

Claims (10)

1.一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：

(1)以FAdV-4毒株DNA为模板，fiber2-F和fiber2-R为引物，PCR扩增出fiber2序列；

fiber2-F：5’-ATGCTCCGGGCCCCTAAAAGAAGACATTC-3’；

fiber2-R：5’-GCTGTCCAGCGGCCTCCCTCCCGTAA-3’；

所述fiber2序列为SEQ ID NO：3；

(2)将步骤(1)扩增出的fiber2序列N段插入BamHⅠ酶切位点，在C端终止密码子之前插入6×His标签以及HindⅢ酶切位点，然后进行密码子优化并合成序列，得到经过密码子优化的fiber2序列；所述经过密码子优化的fiber2序列为SEQ ID NO：4；

(3)将步骤(2)经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2；

(4)将步骤(3)所得重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2转化大肠杆菌BL21进行诱导表达，得到I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PCR扩增体系如下：

PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸54s，共34个循环；72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述将经过密码子优化的fiber2序列构建到pMal-c2X载体上的步骤为：

将经过密码子优化的fiber2片段与空载体pMal-c2X用BamHⅠ和HindⅢ两种限制性核酸内切酶进行双酶切，酶切结束后，进行1％核酸凝胶电泳纯化，将目的条带切胶后进行胶回收，得到回收的目的片段fiber2和回收的空载体，然后将回收的目的片段fiber2和回收的空载体在T4连接酶条件下进行连接反应，得到重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2。

4.根据权利要求3所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，所述双酶切的反应时间为4h，反应温度为37℃，反应体系如下：

所述连接反应的反应时间为12h，反应温度为16℃，反应体系如下：

5.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述转化大肠杆菌BL21的步骤为：

1)取重组质粒pMal-c2X-FAV4-fiber2加入E.coli BL21感受态细胞中，冰浴30min；

2)42℃热激90s；冰浴2min；

3)在超净台内加入900μL SOC培养基，置于37℃摇床中220rpm摇1h；

4)取菌液涂布在氨苄抗性LB平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆加入氨苄抗性LB培养基中摇至OD值为0.8后，菌液和50％甘油1:1混合均匀得到甘油菌悬液，后于-80℃保存备用。

6.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述诱导表达包括小量诱导表达和大量诱导表达，所述小量诱导表达步骤如下：

1)菌株活化：用接种环挑取甘油菌悬液于氨苄抗性平板上划线，37℃培养过夜；

2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至1mL氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm培养至OD600值为0.6～0.8；

3)二次接种：将活化好的菌悬液按1:100的比例接种到10mL新的氨苄抗性LB培养基中，37℃，220rpm培养；

4)诱导：当菌液OD600达到0.6～0.8时，加入IPTG，使终浓度为0.1mM，置于37℃摇床中诱导3h；

所述大量诱导表达步骤如下：

1)菌株活化：用接种环挑取甘油菌悬液于氨苄抗性平板上划线，37℃培养过夜；

2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至100mL氨苄抗性培养基中，37℃，220rpm培养至OD600值为0.6～0.8；

3)放大培养：使用F2基础发酵培养基配制6L发酵培养基，并加入6mL消泡剂，以及终浓度为50ug/mL的氨苄，混合后压入高压灭菌过的发酵罐中，按照1:100的比例加入活化的菌液进行放大培养，培养发酵参数为：PH 7.15；DO 40％；转速200rpm；温度37℃；

4)诱导：菌液培养至OD600值为12～14时加入终浓度为0.1mM的IPTG，37℃诱导3h。

7.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(4)经诱导表达的蛋白通过如下方法纯化：

诱导结束后，离心收集菌体沉淀，用非变性裂解液重悬菌体，经高压均质机破碎，离心收集上清液，柱层析纯化，得到I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白。

8.根据权利要求1所述的一种I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的制备方法，其特征在于，所述I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：5。

9.权利要求1～8任一项方法制备得到的I群4型禽腺病毒Fiber-2蛋白在制备禽腺病毒亚单位疫苗中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，具体应用步骤如下：

1)水相准备：根据疫苗中Fiber-2蛋白含量，使用PBS或生理盐水将纯化后的蛋白稀释，即为水相；

2)油相准备：按照水相和油相1:1体积比准备弗氏佐剂，即为油相；

3)乳化：将水相加入到油相中，搅拌混匀后置于4℃保存备用。

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