CN107488234B

CN107488234B - 禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原、亚单位疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN107488234B
Application number: CN201710910231.XA
Authority: CN
Inventors: 刘云涛; 郑朝朝; 何平有; 孙颖; 吴亚婷; 郁宏伟; 鲍恩东; 朱秀同; 杨保收
Original assignee: Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Ringpu Baoding Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2037-09-29
Also published as: CN107488234A

Abstract

本发明公开了一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原、亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明的一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，所述融合抗原包括禽腺病毒Hexon蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白。所述融合抗原具有如下氨基酸序列：（1）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或（2）与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95%至100%编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。本发明制得的亚单位疫苗的保护性抗原是融合抗原，融合抗原的生产采用基因工程发酵的方式制备，具有成本低、抗原纯度高、免疫原性好以及安全性高优点。

Description

禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原、亚单位疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原、亚单位疫苗及其制备方法。

背景技术

禽腺病毒(FAV)呈世界性分布，血清型众多，该病毒引起的肉鸡心包积水综合症就是由禽腺病毒-C血清4型腺病毒感染引起，全国各地对于该病均有报道，且呈现发病率不断上升趋势，严重危害我国养禽业健康发展，Hexon蛋白是禽腺病毒的主要结构蛋白，该蛋白具有免疫原性。

鸡传染性法氏囊病是雏鸡的一种急性接触性传染病，常呈地方流行，给养禽业带来较大经济损失，VP2蛋白是鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)的主要结构蛋白与保护抗原。

近年流行病学调查显示，鸡传染性法氏囊病的发生增加了禽腺病毒发病机率，造成致死率升高，凸显出鸡传染性法氏囊病与禽腺病毒协同防控的重要性。目前关于两种蛋白的基因工程疫苗有以下缺点：(1)仅有VP2基因工程疫苗商品化生产，而Hexon基因工程疫苗尚处于基础研究阶段。(2)单独表达两种蛋白，混合后制备二联疫苗，生产效率低，重复劳动。(3)病毒亚单位疫苗生产过程中两种蛋白直接串联融合表达，破坏蛋白原有的三级构象，造成抗原性与亲水性差异。(4)当前并无有关禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合蛋白的抗原性研究，也没有对Hexon与鸡VP2融合蛋白进行免疫保护作用和疫苗研究。

因此，有必要开发一种传染性法氏囊VP2蛋白与禽腺病毒Hexon蛋白融合表达的方法，用于制备抗原性良好、生产成本低的鸡传染性法氏囊病与禽腺病毒二联基因工程亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种抗原性良好的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原、基因工程亚单位疫苗及其制备方法。

为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，所述融合抗原包括禽腺病毒Hexon蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2蛋白。

进一步地，所述融合抗原具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在95％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

本发明的一种核酸分子，其编码所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原。

进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

本发明的一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗，由禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原与免疫佐剂混合乳化而成。

本发明所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原的制备方法，包括以下步骤：

(1)PCR扩增禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2融合蛋白的基因片段；

(2)将步骤(1)中的特异性核苷酸片段克隆到表达载体，制备获得重组质粒pET-28a-Hexon-VP2，将其转化宿主菌，获得重组菌株；

(3)禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合蛋白在大肠杆菌表达系统中表达；

(4)收集菌体，超声裂解后收集沉淀，并纯化得到禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原。

进一步地，在步骤(1)中，采用SOE-PCR方法，获得鸡传染性法氏囊病病毒VP2与禽腺病毒Hexon特异性核苷酸片段，其在两基因间插入了特异性连接肽片段，特异性连接肽片段氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

在步骤(2)中，大肠杆菌为Rosseta；

在步骤(3)中，诱导用IPTG浓度为1mM。

进一步地，在步骤(1)中，禽腺病毒Hexon基因与鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆：

根据禽腺病毒Hexon蛋白保守的基座区P1、P2序列设计引物对1(F1、R1)，另外根据鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因高变区序列设计引物对2(F2、R2)；并且在R1与F2引物序列中加入特异性连接肽序列G₂SAG₂SA，制得禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合基因；

引物F1具有SEQID NO.3的核苷酸序列；

引物R1具有SEQID NO.4的核苷酸序列；

引物F2具有SEQID NO.5的核苷酸序列；

引物R2具有SEQID NO.6的核苷酸序列。

本发明的一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗的制备方法，禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，与免疫佐剂混合乳化，制备禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗。

本发明所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗在鸡传染性法氏囊病和禽腺病毒的感染疾病的免疫预防中的应用。

有益效果：本发明制得的亚单位疫苗的保护性抗原是融合抗原，本发明中融合抗原的生产采用基因工程发酵的方式制备，具有成本低、抗原纯度高、免疫原性好以及安全性高优点。

与现有的技术相比较，本发明具有以下优势：

(1)本发明中首次将禽腺病毒Hexon蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白串联融合表达，减少实际生产中的重复性工作，增加劳动效率。

(2)本发明中在禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2之间加入了特异性连接肽，辅助禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合表达，优化融合蛋白分子的折叠。

(3)本发明中制备的禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗可以诱导家禽产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受鸡传染性法氏囊病和禽腺病毒的感染。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明：

本发明的一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，所述融合抗原包括禽腺病毒Hexon蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2蛋白。

进一步地，所述融合抗原具有如下氨基酸序列：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

本发明的一种核酸分子，其编码禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原。

进一步地，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

(1)PCR扩增禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2融合蛋白的基因片段；采用SOE-PCR方法，获得鸡传染性法氏囊病病毒VP2与禽腺病毒Hexon特异性核苷酸片段，其在两基因间插入了特异性连接肽片段，特异性连接肽片段氨基酸序列为SEQ IDNO.2；

禽腺病毒Hexon基因与鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆：

引物F1具有SEQID NO.3的核苷酸序列；

引物R1具有SEQID NO.4的核苷酸序列；

引物F2具有SEQID NO.5的核苷酸序列；

引物R2具有SEQID NO.6的核苷酸序列。

(2)将步骤(1)中的特异性核苷酸片段克隆到表达载体，制备获得重组质粒pET-28a-Hexon-VP2，将其转化宿主菌，获得重组菌株；大肠杆菌为Rosseta；

(3)禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合蛋白在大肠杆菌表达系统中表达；诱导用IPTG浓度为1mM。

实施例1

本实施例描述了本发明提供的禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合基因核苷酸片段的制备方法。以SOE-PCR法进行基因扩增，通过在引物序列中加入连接肽序列方式，将连接肽添加至禽腺病毒Hexon蛋白与鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白之间。包括以下步骤：

(1)鸡传染性法氏囊病病毒与禽腺病毒基因组的提取

分别取鸡传染性法氏囊病病毒与禽腺病毒病毒液200ul，按照TaKaRa公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取鸡传染性法氏囊病病毒与禽腺病毒基因组RNA/DNA。

(2)禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合基因的克隆

分别根据Genbank登录的禽腺病毒Hexon基因序列，选择在该蛋白保守的基座区P1、P2设计引物对1(F1、R1)，另外根据登录的鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因序列，选择在该基因高变区设计引物对2(F2、R2)。并且在引物F1中加入了EcoRⅠ限制性内切酶识别位点，引物R2加入XhoⅠ限制性内切酶识别位点，并且在R1与F2引物序列中加入特异性连接肽序列(G₂SAG₂SA)，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

引物序列如下：

SEQ ID NO.3：

引物对1：F15’-CCGGAATTCGCAACATGAGCGTGCTT-3’

SEQ ID NO.4：

R15’-GGCGGAACCACCGGCGGAACCACCACGACCGTCTGCCTG-3’

引物对2：

SEQ ID NO.5：

F25’-GGTGGTTCCGCCGGTGGTTCCGCCCATCTACCTTATTAGGCTTTCG-3’

SEQ ID NO.6：

R25’-GGGAGCTCGTGTAGTTCATGGCTCCTG-3’。

采用SOE-PCR技术，分别经过3次PCR扩增，构建Hexon与VP2融合基因，构建过程如下：

第1次扩增，以步骤1中提取的禽腺病毒基因组为模板，以F1、R1为上下游引物，以TaKaRa公司高保真酶Premix TaqTM(LA TaqTMVersion 2.0plus dye)进行扩增，反应程序为95℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃90s，35个循环，72℃10min，克隆获得Hexon基因片段。

第2次扩增，以步骤1中提取的鸡传染性法氏囊病病毒基因组为模板，以F2、R2为上下游引物，以TaKaRa公司One Step RNA PCR Kit(AMV)进行扩增，反应程序为50℃30min，95℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环，72℃10min，克隆获得VP2基因片段，以获得的Hexon基因片段与VP2基因片段为模板。

第3次扩增，以F1与R2为上下游引物，以TaKaRa公司高保真酶Premix Taq^TM(LATaq^TMVersion 2.0plus dye)进行扩增，反应程序为95℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃120s，35个循环，72℃10min，克隆获得Hexon与VP2特异性核苷酸片段，即融合基因片段，进行序列测定，其核苷酸序列为SEQ ID NO.7，对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

实施例2

本实施例中描述了重组质粒pET-28a-Hexon-VP2和重组菌株的构建。

利用限制性内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切实施例1所述的Hexon与VP2融合基因片段和表达载体pET-28a，分别回收纯化酶切产物，将融合基因片段连接至pET-28a载体中，获得重组质粒pET-28a-Hexon-VP2。

将重组载体转化到DH5α感受态细胞，挑取单个菌落培养，提取重组质粒pET-28a-Hexon-VP2进行测序分析，将鉴定正确的重组质粒pET-28a-Hexon-VP2转化至大肠杆菌Rosseta感受态细胞，挑取单个菌落培养，提取重组质粒进行EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切鉴定分析，得到重组菌株。

实施例3

本实施例描述了禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合蛋白的表达与纯化

挑取实施例2中鉴定正确的重组菌株，加入到含有50ug/ml卡那霉素LB培养基，37℃振荡培养16h，按照1％转接至2L含有50ug/ml卡那霉素LB培养基，37℃振荡培养4h，菌液OD600值在0.6，加入诱导剂IPTG至工作浓度为1mM，继续培养6h，3000rpm离心收获，弃上清后，加入预冷的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.5～9.0),2mM EDTA，100mM NaCl,0.5％Triton X-100,1mg/ml溶菌酶)200ml重悬菌体，冰浴20min后超声，超声条件为超6s、停6s，总计20min，振幅为39％，功率为700W。超声后溶液，4℃条件12000rpm离心10min，分离上清与沉淀，将沉淀(包涵体)用包涵体洗液进行洗涤纯化，操作步骤如下：

(1)将包涵体用包涵体洗液Ⅰ(50mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100(V/V)，4M脲素。)重悬，置于4℃1-2h。

(2)12000rpm离心10min，用包涵体洗液Ⅱ(50M Tris-HCl(pH8.0)，2mM EDTA，100mM NaCl，3％Triton X-100)重悬，置于4℃1-2h。

(3)12000rpm离心10min，用包涵体洗液Ⅲ(50mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM EDTA，100mM NaCl，0.5％Triton X-100，2M盐酸胍)重悬，置于4℃1-2h。

(4)12000rpm离心10min，加入8M尿素重悬沉淀，室温放置30min，12000rpm离心10min，去上清置于透析袋中，置于0.1MPBS溶液中，4℃过夜透析，使蛋白复性。

将透析后的溶液，12000rpm离心10min，去上清，经0.22um滤膜过滤除菌后，得到禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，经BCA方法测定其蛋白浓度为1mg/mL，分装-20℃保存。

实施例4

本实施例描述了禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原的Westernblot鉴定

(1)配置SDS-PAGE凝胶，加入制备的样品，对照样品与预染蛋白Marker，电泳。

(2)电泳完成后，去除多余凝胶，剪取与凝胶合适大小的滤纸与硝酸纤维素膜(NC膜)，将滤纸、凝胶块、硝酸纤维素膜按照顺序叠放，转印条件为200mA，转膜40min。

(3)转膜完成后，将硝酸纤维素膜放入5％脱脂乳中，4℃过夜封闭。用PBST洗膜5次，每次5min。

(4)将硝酸纤维素膜分别加入1:1000稀释鸡抗鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白阳性血清与1：1500稀释鸡抗禽腺病毒Hexon蛋白阳性血清中，37℃作用1h，用PBST洗膜5次，每次5min。

(5)将硝酸纤维素膜加入1:5000HRP标记山羊抗鸡IgG中，37℃作用35min，用PBST洗膜5次，每次5min。

(6)将硝酸纤维素膜加入到DAB显色液中，避光显色，至出现特异性目的条带，以去离子水为终止液终止反应。结果表明禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原具有良好的抗原性。

实施例5

本实施例描述了禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗的制备。

(1)油相制备取注射用白油94份，硬脂酸铝2份，在油相制备罐中混合均匀并加热至80℃后，再加入司本-806份，充分混匀，高压灭菌，冷却后备用。

(2)水相将96份Hexon与VP2融合蛋白加入4份灭菌吐温-80，充分搅拌后使吐温-80完全溶解。

(3)乳化水相与油相乳化比例为1:3(v/v)，先将油相导入烧杯中，慢速搅拌，缓慢加入水相，加完后10000r/min剪切乳化5min，在终止乳化前按总量加入1％硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01％，充分搅拌混匀。

(4)分装无菌定量分装，加盖密封，获得禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗，置2～8℃保存。

实施例6

本实施例描述了禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗免疫效果检测，分别采用血清学方法和免疫攻毒法同时进行效力检验。具体操作如下：

取21日龄SPF鸡40只，分为2组，每组20只，第1组经皮下注射0.3ml禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗，第2组为健康对照，相同条件下饲养。

在免疫后14d、21d与28d采血，采用琼扩方法检测血清中鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白和禽腺病毒Hexon蛋白的抗体效价，免疫组的鸡传染性法氏囊病病毒VP2琼扩抗体效价应大于2³，禽腺病毒Hexon琼扩抗体效价应大于2¹。

免疫后28d分别进行攻毒保护试验，鸡传染性法氏囊病病毒强毒株BC6-85株接种免疫鸡和对照鸡各10只，攻毒剂量为100BID/只；逐日观察记录鸡临床症状，攻毒后96h扑杀，检查法氏囊病变，免疫鸡至少9只正常，对照鸡至少9只发病。

禽腺病毒Ⅳ型毒株接种免疫鸡和对照鸡各10只，攻毒剂量为10^6.0TCID₅₀/只；逐日观察记录鸡临床症状，攻毒后7d扑杀，免疫组至少7只存活，不出现特征性病变，对照组至少7只死亡或出现出现特征性病变。

血清学检验结果见表1，经计算，疫苗免疫后28d鸡传染性法氏囊病病毒IBDV琼扩抗体几何平均值为2^5.71，禽腺病毒FAV琼扩抗体几何平均值为2^3.36，对照组鸡抗体效价均为阴性；免疫攻毒检验结果见表2，鸡传染性法氏囊病病毒强毒株BC6-85攻毒后试验组保护率为9/10，禽腺病毒Ⅳ型毒株攻毒后试验组保护率为9/10，对照组鸡保护率均为0/10。免疫后试验鸡血清抗体(AGP)效价结果如表1所示，试验鸡攻毒结果如表2所示：

表1

表2

如表1和表2所示，本发明的禽腺病毒Hexon和鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗免疫家禽后可以诱导产生高水平的特异性抗体，保护家禽免受鸡传染性法氏囊病和禽腺病毒的感染。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

序列表

<110> 瑞普（保定）生物药业有限公司

<120> 禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原、亚单位疫苗及其制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 400

<212> PRT

<213> 人工序列(融合抗原的氨基酸序列)

<400> 1

Asn Met Ser Val Leu Phe Asp Thr Ser Ile Asn Trp Pro Gly Asn Asp

1 5 10 15

Arg Leu Leu Ala Pro Asn Leu Phe Glu Ile Lys Arg Asn Val Gly Ile

20 25 30

Asp Ser Glu Gly Phe Thr Met Ser Gln Cys Asp Ile Thr Lys Asp Trp

35 40 45

Tyr Leu Ile Gln Met Ala Thr Asn Tyr Asn Tyr Val Phe Asn Gly Tyr

50 55 60

Arg Phe Trp Pro Asp Arg Gln Tyr Phe His Tyr Asp Phe Leu Arg Asn

65 70 75 80

Phe Asp Pro Met Thr Arg Gln Gly Pro Asn Phe Gln Asp Pro Thr Leu

85 90 95

Phe Asp Leu Thr Thr Tyr Glu Pro Ala Ser Pro Pro Gln Ala Gly Glu

100 105 110

Ala Leu Thr Gly Gln Asp Ala Val Arg Asn Asn Ser Gly Tyr Ile Ala

115 120 125

Pro Arg Ser Trp Pro Val Tyr Ser Ala Gln Gln Gly Glu Ser Trp Pro

130 135 140

Ala Asn Trp Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Thr Glu Ser Ile Pro Ser Thr

145 150 155 160

Gln Ile Val Asn Tyr Lys Lys Phe Leu Cys Asp Asn Tyr Leu Trp Thr

165 170 175

Val Pro Phe Ser Ser Asp Phe Met Tyr Met Gly Glu Leu Thr Asp Leu

180 185 190

Gly Gln Asn Pro Met Tyr Thr Asn Asn Ser His Ser Met Val Ile Asn

195 200 205

Phe Glu Leu Asp Pro Met Asp Glu Asn Thr Tyr Val Tyr Met Leu Tyr

210 215 220

Gly Val Phe Asp Met Val Arg Val Asn Gln Pro Glu Arg Asn Val Leu

225 230 235 240

Ala Met Ala Tyr Phe Arg Thr Pro Phe Ala Thr Gly Asn Ala Val Gly

245 250 255

Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala Ser Thr Ser Leu Gly Phe Asp Gly Thr

260 265 270

Ala Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asn Asn Gly Leu Thr Thr Gly

275 280 285

Thr Asp Asn Leu Leu Pro Phe Asn Leu Val Ile Pro Thr Asn Glu Ile

290 295 300

Thr Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser

305 310 315 320

Gly Gly Gln Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Arg Gly Ser Leu

325 330 335

Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val

340 345 350

Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val

355 360 365

Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys

370 375 380

Asn Leu Val Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr

385 390 395 400

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(链接肽序列)

<400> 2

Gly Gly Ser Ala Gly Gly Ser Ala

1 5

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(引物F1的核苷酸序列)

<400> 3

ccggaattcg caacatgagc gtgctt 26

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(引物R1的核苷酸序列)

<400> 4

ggcggaacca ccggcggaac caccacgacc gtctgcctg 39

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(引物F2的核苷酸序列)

<400> 5

ggtggttccg ccggtggttc cgcccatcta ccttattagg ctttcg 46

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(引物R2的核苷酸序列)

<400> 6

gggagctcgt gtagttcatg gctcctg 27

<210> 7

<211> 1202

<212> DNA

<213> 人工序列(融合抗原的核苷酸序列)

<400> 7

aacatgagcg tgcttttcga cacgtccatc aactggccgg gcaacgaccg gctgctggcc 60

cccaacctgt tcgaaatcaa gcgcaacgtc ggtatcgact cagagggctt caccatgtcc 120

cagtgcgaca tcaccaagga ctggtatttg attcagatgg ccaccaacta caattacgtg 180

ttcaacgggt atcggttctg gcccgaccgt cagtacttcc actacgactt tttgagaaat 240

ttcgatccca tgacccgtca gggtcccaac ttccaggacc ctactctctt cgatctcacg 300

acttacgagc ctgcttcgcc gccacaggca ggagaagccc tcaccggtca ggacgcggtg 360

cgtaacaact cgggctacat cgcgccgcgc agctggcccg tgtacagcgc gcagcaggga 420

gagtcctggc ccgccaattg gccgtacccg ctcatcggca ccgagtccat tccgtccacg 480

caaatcgtca actacaagaa atttctgtgc gacaactacc tgtggaccgt gcctttcagc 540

tccgatttca tgtacatggg cgaactgacg gacctgggtc agaatccgat gtacaccaac 600

aactcgcaca gcatggtgat caacttcgag ttggacccca tggacgagaa cacgtacgtc 660

tacatgctct acggcgtgtt cgacatggtc cgggtgaacc aacccgaacg caacgtgctg 720

gcgatggcct acttccgtac gcctttcgcc acaggcaacg ctgtgccccc cacgcgtccc 780

cccacgcgtt ctacctcatt aggctttgat gggacagcgg taatcaccag ggctgtggcc 840

gcaaacaatg ggctgacgac cggcaccgac aaccttttgc cattcaatct tgtgattcca 900

acaaacgaga taacccagcc aatcacatcc atcaaactgg agatagtgac ctccaaaagt 960

ggtggtcagg caggggatca gatgtcatgg tccgcaagag ggagcctagc agtgacgatc 1020

catggtggca actatccagg ggccctccgt cccgtcacgc tagtggccta cgaaagagtg 1080

gcaacaggat ccgtcgttac ggtcgctggg gtgagcaact tcgagctgat cccaaatcct 1140

gaactagcaa agaacctggt tacagaatac ggccgatttg acccaggagc catgaactac 1200

ac 1202

Claims

1.一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，其特征在于：所述融合抗原由禽腺病毒Hexon蛋白和鸡传染性法氏囊病病毒抗原VP2蛋白组成，其具有如下氨基酸序列：

由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的融合抗原。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。

4.一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗，其特征在于：由权利要求1中禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原与免疫佐剂混合乳化而成。

5.权利要求1所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)PCR扩增权利要求1所述融合蛋白的基因片段；

6.根据权利要求5所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，采用SOE-PCR方法，获得鸡传染性法氏囊病病毒VP2与禽腺病毒Hexon特异性核苷酸片段，其在两基因间插入了特异性连接肽片段，特异性连接肽片段氨基酸序列为SEQ ID NO.2；

在步骤(2)中，宿主菌为大肠杆菌Rosseta；

在步骤(3)中，诱导用IPTG，浓度为1mM。

7.根据权利要求5所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，禽腺病毒Hexon基因与鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的克隆：

引物F1具有SEQ ID NO.3的核苷酸序列；

引物R1具有SEQ ID NO.4的核苷酸序列；

引物F2具有SEQ ID NO.5的核苷酸序列；

引物R2具有SEQ ID NO.6的核苷酸序列。

8.一种禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：权利要求1中禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2融合抗原，与免疫佐剂混合乳化，制备禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗。

9.权利要求4所述的禽腺病毒Hexon与鸡传染性法氏囊病病毒VP2亚单位疫苗在制备免疫预防鸡传染性法氏囊病和禽腺病毒的感染疾病的产品中的应用。