CN103360498A

CN103360498A - 一种抗鸡传染性法氏囊病的重组蛋白亚单位疫苗

Info

Publication number: CN103360498A
Application number: CN2013103238021A
Authority: CN
Inventors: 刘爵; 柳舒航; 韦莉; 王菁; 朱珊珊; 张春燕; 阎旭; 全荣
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2013-07-30
Filing date: 2013-07-30
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-30
Also published as: CN103360498B

Abstract

本发明提供了一种抗鸡传染性法氏囊病（IBD）的亚单位疫苗，该疫苗是具有较高免疫原性的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）和传染性法氏囊病病毒（VP2）的融合蛋白。上述flagellin+VP2融合蛋白，是利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统，构建含有flagellin+VP2基因的重组杆状病毒来表达的。通过上述系统获得重组杆状病毒的周期短，且表达的flagellin+VP2融合蛋白具有较高的免疫保护力。

Description

一种抗鸡传染性法氏囊病的重组蛋白亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及一种改造后的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）+传染性法氏囊病病毒VP2融合蛋白为抗原的亚单位疫苗。

背景技术

鸡传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，该病仅使鸡感染致病死亡，生产性能下降，而且还会引起严重免疫抑制，从而导致免疫抑制和免疫缺陷，同时造成其他疫苗的免疫失败，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。

IBDV出现的初期是以经典毒株（cIBDV）为主要流行株，当时发病率高而死亡率不高，后来，相继出现了抗原变异株（vIBDV）和超强毒株（vvIBDV），尤其是超强毒株，可引起50%～100%的死亡率，对养鸡业的危害更大，使该病的防治面临新的困境。

目前，对该病的主要防治手段是采用疫苗免疫动物，包括灭活疫苗和活毒疫苗。这种措施能很好的控制该病的发生，但是对于一些地方出现的变异株和超强毒株，因为它们能突破母源抗体的保护和弱毒活苗的免疫保护，疫苗免疫的效果并不理想，而且它们存在一定的隐患，如病毒返毒和灭活不彻底会带来一定的危害。所以开发新型疫苗成为必然，研究更为有效的佐剂以增强疫苗的免疫效果具有重要意义。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的一个目的是提供一种高免疫原性的抗鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗，所述的高免疫原性的亚单位疫苗保护性抗原是flagellin+VP2融合蛋白。

本发明的另一个目的是提供上述flagellin+VP2融合蛋白的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供了一种融合蛋白，其为传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与消除毒力的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。该融合蛋白的氨基酸序列见SEQIDNO.2所示，编码上述flagellin+VP2融合蛋白的基因，其核苷酸序列见SEQIDNO.1。

编码此融合蛋白的基因通过将VP2抗原基因串联到鞭毛基因蛋白基因的3’端获得。

本发明还进一步提供所述flagellin+VP2融合蛋白的制备方法，其包括以下步骤：

人工合成编码所述融合蛋白的基因，连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBacHA-flagellin+VP2，转化E.coliDH10Bac感受态细胞，然后利用其含有细菌Tn7转座系统，将该基因转座至杆状病毒穿梭载体bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin+VP2，将其转染昆虫Sf9细胞，获得重组杆状病毒，并以昆虫Sf9细胞为寄主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。

本发明提供的flagellin+VP2融合蛋白中的鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白（flagellin）作为TLR5的识别受体，可诱导产生天然免疫应答。已有多个研究表明，鞭毛蛋白不仅是产生天然免疫应答的诱导剂，而且有助于诱导获得性免疫应答。本发明提供的融合蛋白中的VP2是IBDV的主要结构蛋白之一，占病毒总蛋白的51%。且VP2具有血清型特异性、含有能诱导中和抗体的构象依赖性抗原决定簇，是IBDV的保护性抗原，其诱导的中和抗体能保护宿主不受IBDV的感染。可见，本发明提供的融合蛋白，鞭毛蛋白作为佐剂增强了VP2蛋白的免疫应答，具有更好的保护作用。

本发明是将VP2基因串联到鞭毛蛋白基因的3’端，通过真核表达系统中Bac-to-Bac杆状病毒表达系统将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白与传染性法氏囊病病毒VP2蛋白进行融合表达，表达融合蛋白的周期短，其表达产物具有与天然产物相似的理化和生物学特性，能对蛋白质进行正确的翻译后加工修饰，表达稳定，而且表达产量高，且该融合蛋白具有良好的免疫原性，对鸡进行超强毒攻击后有较好的免疫保护力。本发明的鞭毛蛋白是经过改造后的鞭毛蛋白，其中去掉了鞭毛蛋白毒力的部分，消除了鞭毛蛋白毒力的影响，因此通过本发明提供的表达系统能获得没有毒副作用的且具有免疫学活性的表达产物，对鸡传染性法氏囊病新型疫苗的开发具有重要的意义。

附图说明

图1是flagellin+VP2基因扩增的电泳图，其中1～2：flagellin+VP2蛋白的目的条带，M：MarkerDL2000。

图2是flagellin+VP2基因克隆到pFastBac-HA载体得到的重组质粒PCR鉴定图，其中M：DNAMarkerDL2000，1～6：重组质粒pFastBac-HA-flagellin+VP2扩增产物。

图3是flagellin+VP2基因克隆到pFastBac-HA载体得到的重组质粒pFastBac-HA-flagellin+VP2的酶切鉴定图，其中M：DNAMarkerDL2000，1～4：阳性重组质粒pFastBac-HA-flagellin+VP2的酶切片段。

图4是pFastBac-HA-flagellin+VP2转化到DH10Bac感受态细胞后，提取质粒PCR鉴定图，其中M：DNAMarkerDL2000，1～4：Bacmid-flagellin+VP2扩增产物。

图5是重组Bacmid-flagellin+VP2用M13引物的PCR产物图，其中M：DNAMarkerDL10000，1～4：Bacmid和pFastBac-HA-flagellin+VP2发生转座。

图6是重组杆状病毒感染Sf9细胞后培养结果图，其中（1）：Bacmid-VP2重组病毒感染Sf9细胞72h，（2）：Bacmid-flagellin+VP2重组病毒感染Sf9细胞72h，（3）：Bacmid病毒感染Sf9细胞72h，（4）：Sf9细胞生长72h。

图7是重组杆状病毒间接免疫荧光鉴定结果图，其中（1）：Bacmid-VP2重组病毒感染Sf9细胞72h，（2）：Bacmid-flagellin+VP2重组病毒感染Sf9细胞72h，（3）：Bacmid病毒感染Sf9细胞72h，（4）：Sf9细胞生长72h。

图8是表达VP2和flagellin+VP2重组蛋白的WesternBlotting检测图，其中，（1）：Bacmid-flagellin+VP2转染Sf9细胞裂解上清，（2）：flagellin+VP2纯化融合蛋白产物，（3）：Bacmid-VP2转染Sf9细胞裂解清，（4）：VP2纯化融合蛋白产物，（5）：Bacmid转染Sf9细胞裂解上清，（6）：Sf9细胞裂解上清。

图9是免疫组和对照组鸡攻毒后，法氏囊病理观察图，其中，（1）：空白对照，（2）：空白对照攻击鸡，（3）：空白对照攻击病死鸡法氏囊，（4）：免疫组攻击后法氏囊。

图10是免疫后每周各组血清抗体水平，（1）：一免一周后血清水平，（2）：一免二周后血清水平，（3）一免三周后血清水平，（4）：二免一周后血清水平，（5）：二免二周后血清水平。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明的进一步说明，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。

实施例1传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白在昆虫Sf9细胞中的融合表达

1.1构建重组载体

1.1.1flagellin+VP2基因的PCR扩增

人工合成的flagellin+VP2基因(SEQIDNo.1)，flagellin+VP2-F、flagellin+VP2-R为引物，分别是：

上游引物：5’-GGAATTCTATGGCACAAGTAATCAACAC-3’

下游引物：5’-CCCAAGCTTTGCTCCTGCAATCTTCAGG-3’。

通过对PCR反应条件和试剂优化后建立20μl的反应体系，见表1：

表1

模板	0.2μl
		PrimeSTAR	0.2μl
5×PrimeSTARBuffer	4μl
		dNTPMixture	2μl
flagellin+VP2-F（10pmol）	1μl
		flagellin+VP2-R（10pmol）	1μl
灭菌蒸馏水	11.6μl

混匀瞬时离心，置于PCR仪上扩增。反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。

取5μlPCR产物加入适量LoadingBuffer进行1%的琼脂糖凝胶电泳，用标准分子量作对照，确定产物的大小，结果见图1。

1.1.2PCR产物的回收与纯化

核酸电泳结束后，用洁净刀片在紫外灯下切出含目的片段DNA的凝胶。用DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因条带，操作参考DNA回收试剂盒。

1.1.3回收DNA片段及捐赠载体pFastBac-HA（购于Invitrogen公司）双酶切

将回收的flagellin+VP2基因片段和pFastBac-HA载体均用EcoRI和HindIII进行双酶切，37℃水浴3h，反应体系20μl。反应体系见表2：

表2

EcoRI	1ul	EcoRI	1μl
				HindIII	1ul	HindIII	1μl
BSA	0.2ul	BSA	0.2μl
				flagellin+VP2基因片段	2ul	pFastBac-HA	2μl
Buffer2	2ul	Buffer2	2μl
				ddH₂O	13.8ul	ddH₂O	13.8μl

载体末端的去磷酸化处理：

其中载体在酶切3h后，加入1μl磷酸酶抑制剂和2μl磷酸酶抑制剂缓冲液，37℃再作用1h后，65℃灭活5min，使载体去磷酸化。

1.1.4纯化酶切的DNA产物及捐赠载体

用PCR纯化试剂盒纯化酶切后的flagellin+VP2基因片段和pFastBac-HA载体，具体操作参考试剂盒使用说明。

1.1.5目的片段与捐赠载体连接

用T4DNA连接酶将flagellin+VP2酶切片段与pFastBac-HA酶切载体连接。反应体系为10μl，22℃连接过夜，连接体系见表3：

表3

10×LigaseBuffer	1μl
		flagellin+VP2酶切片段	7.5μl
pFastBac-HA	0.5μl
		T4DNAligase	1μl

1.1.6连接产物的转化

（1）从-80℃冰箱中取出感受态细胞E.coliDH5α置于冰上融化。

（2）取连接产物10μl，加入到感受态细胞中，边加边混匀，冰浴30min。

（3）将离心管放入42℃水浴90s，禁止振荡，快速转入冰浴2～3min。

（4）加入890μlLB培养基（无抗生素），37℃摇床培养45min～1h。

（5）4000g离心1min，弃去上清，留100μlLB培养基重悬细菌，做涂板用。

（6）将上述混悬液均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上，倒置平板37℃培养过夜。

1.1.7阳性克隆的菌液PCR鉴定

从转化后的平板上随机挑取5～10个单菌落，分别接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃250rpm振荡培养2～3h后，取1μl作为模板进行PCR鉴定。反应体系见表4：

表4

模板	1μl
		PrimeSTAR	0.2μl
5×PrimeSTARBuffer	4μl
		dNTPMixture	2μl
flagellin+VP2-F（10pmol）	1μl
		flagellin+VP2-R（10pmol）	1μl
灭菌蒸馏水	10.8μl

混匀瞬时离心，置于PCR仪上扩增。反应条件：95℃预变性15min；94℃变性30s，58℃火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。

取5μlPCR产物加入适量LoadingBuffer进行1%的琼脂糖凝胶电泳，用标准分子量作对照，确定产物的大小，结果见图2。

1.1.8重组供体质粒的提取

将菌液PCR鉴定为阳性的单菌落1:100转接到5mlLB培养基（含Amp）中，37℃250rpm振荡培养过夜。使用小提质粒试剂盒提取质粒，具体操作参见试剂盒使用说明。

1.1.9重组供体质粒的双酶切鉴定

将重组供体质粒用EcoRI和HindIII进行双酶切。反应体系见表5：

表5

EcoRI	1μl
		HindIII	1μl
BSA	0.2μl
		重组质粒	2μl
Buffer2	2μl
		ddH₂O	13.8μl

37℃水浴3h后，进行琼脂糖电泳观察，结果见图3。

1.1.10重组供体质粒测序及序列分析

将PCR、酶切鉴定均为阳性的pFastBac-HA-flagellin+VP2克隆，过夜培养，提取重组质粒DNA送Invitrogen公司测序。用DNAStar软件分析插入目的序列与参考序列的核苷酸和氨基酸同源性及碱基顺序正确性。将测序正确的菌株冻存于-80℃保存。

将测序正确的重组质粒命名为pFastBac-HA-flagellin+VP2。

1.2蓝白斑筛选

1.2.1制备大肠杆菌DH10Bac感受态细胞

（1）将大肠杆菌DH10Bac在含有卡那霉素和四环素的LB平板上划线，37℃过夜培养。

（2）挑单个菌落于5ml含有卡那霉素和四环素的LB培养基中，37℃250rpm振荡过夜培养。

（3）取500μl菌液转接于50ml含有卡那霉素和四环素的LB培养基中，37℃振荡培养。

（4）取菌液测OD600值，达到0.3～0.5最佳。

（5）在冰上冷却菌液30min左右，保证彻底冷却。

（6）将菌液配平，4℃5000rpm离心10min。

（7）将上清弃掉，用1/2原摇菌培养基的体积（即25ml）的0.1M预冷的CaCl₂轻轻重悬菌体。

（8）在冰上放置40min，4℃1500rpm离心5min

（9）将上清弃掉，用1ml预冷的0.1MCaCl₂和1ml50%的甘油重悬菌体，使甘油终浓度为25%。

（10）将大肠杆菌DH10Bac感受态细胞分装成100～200μl每管，放-80℃保存备用。

1.2.2重组供体质粒pFastBac-HA-flagellin+VP2的转化

（1）从-80℃冰箱中取出感受态细胞DH10Bac置于冰上融化。

（2）取重组质粒pFastBac-HA-flagellin+VP21ng（5μl），加入感受态细胞中，边加边混匀。

（3）在冰上放置30min。

（4）将离心管放入42℃水浴45s，禁止振荡，快速转入冰浴2～3min。

（5）加入890μlSOC培养基，37℃250rpm摇床振荡培养4h。

（6）将DH10Bac转化菌体用SOC培养基倍比稀释，做10^-1、10^-2、10^-3三个梯度。

（7）每个梯度各取100μl混悬液均匀涂布于含50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素、100μg/mlBluo-gal和40μg/mlIPTG的LB琼脂平板上。

（8）37℃培养48h，挑取白色单菌落进行鉴定。

1.2.3重组质粒Bacmid-flagellin+VP2的PCR鉴定

从转化后的平板上挑取白色单菌落于10ml含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素、10μg/ml四环素的LB培养基中，37℃250rpm振荡培养过夜，用于重组质粒Bacmid-flagellin+VP2的提取。用flagellin+VP2特异性引物和M13引物进行PCR鉴定，flagellin+VP2特异性引物参见1.1.1，M13上下游引物分别为：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3’和5’-AGCGGATAACAATTTCACAGG-3’，结果见图4、5。方法同1.1.8。其中，用M13引物进行扩增是由于Bacmid分子量大，不具有单一酶切位点，用酶切鉴定有困难，为进一步验证Bacmid中的外源基因的正确性，用M13引物进行PCR反应来确证扩增片断的大小。反应程序为：94℃变性15min；94℃1min，55℃1min，72℃5min，共35个循环，然后72℃延伸10min。

1.2.4重组质粒Bacmid-flagellin+VP2的大量抽提

使用质粒大提试剂盒大量抽提细胞转染用的高纯度质粒重组质粒Bacmid-flagellin+VP2和Bacmid阴性对照质粒，具体操作参照试剂盒使用说明。

1.3转染及感染昆虫细胞

1.3.1复苏Sf9昆虫细胞

活化Sf9昆虫细胞是从液态氮中取出冻存管，37℃水浴迅速融解，加入到无血清培养基中，800r/min离心10min，再用无血清培养基重悬，27℃在不透气细胞瓶中培养。在倒置显微镜下观察细胞生长状况，待细胞长成致密的单层并开始变圆时应立即传代。从培养瓶中吸出旧培养基，加入少量新鲜培养基。如果细胞贴壁生长可用手掌拍击培养瓶的侧壁使贴壁不太紧的细胞脱离瓶壁，或用吸管吸取足够量的培养基轻柔冲刷细胞单层，将细胞洗脱。计数后，取适量细胞悬液传至新培养瓶，并加入适量培养基，轻轻晃动使细胞分布均匀，27℃恒温培养。

1.3.2转染Sf9昆虫细胞

共转染按Cellfectin说明书进行如下操作：

（1）培养Sf9细胞，待细胞涨到对数生长期，密度大于95%状态时，用2ml无血清培养基将细胞铺到一个6孔板孔中，使其数量为8×10⁵个/孔，室温放置30min，使其贴壁。

（2）准备转染试剂：

a．将转染试剂CellfectinⅡ8μl稀释到100μl无血清培养基中。

b．将2μl（约1～2μg）重组质粒Bacmid-flagellin+VP2稀释到100μl无血清培养基中。

c．将稀释的转染试剂CellfectinⅡ和重组质粒Bacmid-flagellin+VP2混合（约210μl），并轻轻混匀，室温下放置15～30min。

（3）将210μl转染混合液逐滴加入到一个6孔板孔中，27℃培养3～5h。

（4）弃去含有转染混合液的培养基，加入新鲜无血清培养基。

（5）27℃培养72h，直到可以看到病变。

1.3.3收集并扩增重组杆状病毒

转染细胞培养72h，可见细胞出现病变，贴壁细胞全部变大，呈粗糙颗粒感，部分细胞脱落结果见图6。500g5min离心分别收集细胞与上清，上清即为重组杆状病毒。上清继续感染Sf9昆虫细胞2～3轮，可获得高滴度重组杆状病毒。4℃保存。

1.3.4IFA鉴定重组杆状病毒

用间接免疫荧光反应鉴定重组病毒，操作如下：

（1）将生长期Sf9昆虫细胞用无血清培养基铺到96孔板中，待细胞完全贴壁后，密度为90%。

（2）弃去培养基，接重组病毒，27℃孵育1h，每孔再加入100μl新鲜无血清培养基，72h后观察病变。

（3）弃去病毒培养液，PBST洗三遍后，用4%多聚甲醛室温固定细胞30min，每孔100μl。

（4）弃去固定液，PBST洗三遍后，用5%脱脂奶室温封闭2h，每孔100μl。

（5）弃去封闭液，PBST洗三遍后，用1%脱脂奶1:400稀释的小鼠腹水VP2单抗，4℃过夜孵育，每孔100μl。

（6）一抗回收利用，PBST洗三遍后，用1%脱脂奶1:50稀释的荧光标记抗体（兔抗鼠IgG-FITC），37℃避光孵育1h，每孔100μl。

（7）二抗回收利用，PBST洗四遍后，荧光显微镜下避光观察，结果见图7。

1.3.5表达重组目的蛋白的纯化

用亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白，操作如下：

（1）将Sf9昆虫细胞用无血清培养基铺到175×175mm细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁后，密度为90%。

（2）弃去培养基，以重组病毒适量感染细胞，27℃孵育1h，再加入新鲜无血清培养基，72h后见细胞已全部变大，呈粗糙颗粒状，但尚未破裂。

（3）500g5min离心分别收集细胞与上清，病毒液4℃保存，细胞用10ml非变性LysisBuffer重悬。

（4）在冰上放置30min，期间轻轻振荡2～3次。

（5）将细胞裂解液4℃14000g离心30min，上清转移到干净的离心管中。

（6）将纯化柱上下颠倒几次，重悬填充树脂。

（7）先折断纯化柱的底部，再打开盖子，使存储缓冲液受重力排出。

（8）将细胞裂解上清转移到纯化柱中，使其受重力滴下。

（9）用8ml非变性WashBuffer洗柱子2次。

（10）用2ml非变性ElutionBuffer洗脱目的蛋白，并收集洗脱液，每管为1ml。

以紫外分光光度计测定每管洗脱液的OD260、OD280，确定蛋白浓度。分装并-80℃保存。

1.3.6WesternBlot

（1）配制SDS-PAGE凝胶，见表6

表6

（2）取准备好的细胞样品，加入6×loadingbuffer，100℃变性10min上样，在12%的蛋白胶上电泳分离。

（3）将电泳后的SDS-PAGE凝胶进行转印，转移到NC膜上。

（4）转移结束后，将NC膜用TBST洗一遍，用5%脱脂奶室温封闭2h。

（5）弃去封闭液，用TBST洗一遍，加入用1%脱脂奶1:4000稀释的小鼠腹水VP2单抗，4℃孵育过夜。

（6）单抗回收利用，TBST洗三遍，每次5min，加入用1%脱脂奶1:8000稀释的HRP标记的兔抗鼠IgG二抗，室温孵育2h。

（7）二抗回收利用，TBST洗三遍，每次10min，用ECL显示试剂盒显示5min后，曝光观察，结果见图8。

实施例2传染性法氏囊病毒VP2蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白融合表达产物的免疫原性研究

2.1材料

实验动物：6周龄白来航鸡120只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，免疫蛋白：前期实验中通过亲和层析法利用His标签纯化的表达重组目的蛋白。

2.2方法

2.2.1SPF鸡免疫方案

实验鸡共分为13组，其中3组各10只，10组各9只，10只组分别为空白对照组、攻毒对照组和灭活苗免疫组，9只组又分为2大组，免疫表达的目的重组蛋白，分别为VP2蛋白免疫组和flagellin+VP2蛋白免疫组，将纯化的重组蛋白用PBS均稀释为5个浓度，即均免疫5个剂量，分别为5μg/只、10μg/只、20μg/只、50μg/只和100μg/只。免疫途径为肌肉注射，免疫分两次进行，首免后根据抗体检测结果，进行二免，免疫方法及剂量同首免（表7）。

表7

2.2.2实验鸡采血及血清分离

免疫前，随机抽取10只鸡，翅静脉采血，作为阴性对照。免疫后，每周对灭活苗免疫组、VP2蛋白免疫组和flagellin+VP2蛋白免疫组进行翅静脉采血，血液置37℃放置30min，4℃4000rpm/min离心10min，再小心吸出上层透明血清，将吸出的血清分装，置-20℃冻存，分离血清用于抗体检测和病毒中和试验。

2.2.3免疫鸡血清抗体的检测

ELISA试验程序如下：

（1）包板抗原：用预冷的包被液将纯化的重组蛋白抗原进行稀释，以100μl分别加入做好标记的酶联板孔中，每孔蛋白量为100ng，置于湿盒中，4℃过夜。

（2）洗板：弃去板孔内液体，用洗涤液洗涤3次，每次间隔3～5min，拍干。

（3）封闭：每孔加入100μl封闭液，37℃孵育2h。

（4）加入待检血清：用稀释液将待检血清作100倍稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h。同上，将鸡传染性法氏囊病毒阳性、阴性血清作100倍稀释作为对照，37℃孵育1h。

（5）重复步骤（2）。

（6）加入酶标二抗：用稀释液将辣根过氧化物酶山羊抗鸡IgG结合物作10000倍稀释，每孔加100μl，37℃孵育1h。

（7）重复步骤（2）。

（8）底物显色：每孔加入TMB底物显色溶液100μl，37℃避光孵育15min，观察显色情况。

（9）终止：每孔加入终止液50μl，用酶标仪测定OD450值。

2.2.4实验鸡攻毒

免疫5周后，除空白对照外，免疫鸡用鸡传染性法氏囊病毒超强毒株攻毒。将实验室保存的病变法氏囊组织用预冷的PBS以1:4体积研磨后，再用PBS1:15倍稀释，研磨和稀释过程中均保证双抗浓度为2%。免疫鸡的攻毒剂量为200μl/只，攻毒途径为滴鼻、点眼和口服。每天注意观察鸡的发病和死亡情况，并对病死鸡进行剖检观察，法氏囊组织分别称重，然后冻存和固定法氏囊组织。攻毒一周后，将剩余鸡全部称重后采血处死，观察法氏囊病变并称重后冻存和固定。

2.3结果

2.3.1鸡攻毒后的发病情况

将免疫组和攻毒对照组鸡攻毒后，3～4d，有部分鸡萎蔫和死亡，剖检可见法氏囊发生病变，有的充血肿大，呈紫葡萄样；有的囊软，黏膜有出血。一周后，将剩余鸡全部处死，观察法氏囊，灭活苗免疫组、flagellin+VP2融合蛋白20μg免疫组和空白对照组无显著差异，其余组法氏囊萎缩，或囊黄色化胶冻样，质硬，内有淡黄色干酪样物。免疫组与攻击对照鸡法氏囊组织学观察，结果见图9。

2.3.2血清抗体效价的ELISA检测结果

一免后两周，VP2蛋白免疫组、flagellin+VP2蛋白免疫组和灭活苗免疫组均未能检测到显著的特异性血清抗体；第三周，各免疫组抗体水平均有所提高，其中灭活苗免疫组的抗体效价与空白对照组之间呈现显著性差异（p<0.05），二免后一周，除灭活苗组外，各免疫组的抗体水平均继续上升，抗体效价与空白对照组之间呈现显著性差异（p<0.05）；二免后两周，灭活苗免疫组抗体水平稳定，其余组抗体效价升高；而且flagellin+VP2蛋白免疫组抗体水平一直比VP2蛋白免疫组高，不过灭活苗免疫组抗体水平在二免后基本上没有变化；此外各免疫组不同剂量的免疫并不是剂量越大抗体水平越高，结果见图10。

2.3.3各免疫组的保护效果

攻毒后一周，将剩余鸡全部称重后采血处死，观察法氏囊组织病变并称重，计算法氏囊重和体重之比，看攻毒后各组与空白对照组平均囊/体比（BF/BW）有无显著性差异。与空白对照组相比，灭活苗免疫组BF/BW和flagellin+VP2（20μg）均无显著性差异，且无肉眼可见病变（p>0.05）；其余各组除病死鸡外，法氏囊均有严重萎缩，有的出现肉眼可见病变（p<0.05）；flagellin+VP2蛋白与VP2蛋白免疫组相比，不同剂量的免疫BF/BW都较高，说明flagellin+VP2蛋白比VP2蛋白免疫后的保护效果好，但并不是免疫剂量越高，保护效果越好，从flagellin+VP2蛋白免疫组看，20μg免疫剂量对法氏囊的保护效果最好（表8）。

表8

BF/BW:囊重÷体重×1000。

abcd:各组与空白对照组之间的统计学差异。

攻击保护率（%）；是指免疫鸡攻击强毒后无法氏囊病特征性病变鸡数占免疫攻击鸡数的百分比。

Claims

1.一种融合蛋白，其为传染性法氏囊病病毒VP2蛋白与鼠伤寒沙门菌鞭毛蛋白的融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。

3.编码权利要求1所述融合蛋白的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。

5.一种抗鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗，其特征在于，其保护性抗原是权利要求1所述的融合蛋白。

6.制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：人工合成编码权利要求1所述蛋白的基因，连接到pFastBac-HA质粒，得到重组载体pFastBacHA-flagellin+VP2，转化E.coliDH10Bac感受态细胞，然后利用其含有细菌Tn7转座系统，将该基因转座至杆状病毒穿梭载体bacmid中，得到重组质粒Bacmid-flagellin+VP2，将其转染昆虫Sf9细胞，获得重组杆状病毒，并以昆虫Sf9细胞为寄主细胞培养病毒，采用Ni-NAT亲和层析法纯化带有His标签的目的蛋白。