CN107312736B

CN107312736B - 融合表达ibdv vp2蛋白和沙门菌属外膜蛋白rck的重组乳酸菌菌株及其用途

Info

Publication number: CN107312736B
Application number: CN201710339025.8A
Authority: CN
Inventors: 崔红玉; 李凯; 祁小乐; 高立; 高玉龙; 王笑梅
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-05-15
Filing date: 2017-05-15
Publication date: 2021-09-17
Anticipated expiration: 2037-05-15
Also published as: CN107312736A

Abstract

本发明公开了一种融合表达IBDV VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株及其用途，本发明所述的重组乳酸菌菌株，含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白以及沙门菌属外膜蛋白RCK融合蛋白的基因序列，其能够高效融合表达VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK，且表达的融合蛋白VP2‑RCK以可溶性形式存在于乳酸菌的细胞质中。将本发明的重组乳酸菌菌株直接作为疫苗免疫鸡，实验结果表明：该重组菌株疫苗能有效诱导机体产生特异性的免疫应答，使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的，本发明的提出为鸡传染性法氏囊病的防治提供了一种新的技术手段。

Description

融合表达IBDV VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株及其用途

技术领域

本发明涉及一种重组乳酸菌菌株及其构建方法和用途，尤其涉及一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株及其构建方法和用途，本发明属于医学或兽医学技术领域。

背景技术

鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的能够引起鸡体免疫抑制的重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。传统疫苗在防治该病的历史中起到非常重要的作用，随着该病近年来呈现的新的变化-血清型变异株，超强毒株的出现，使得对该病的防治越来越棘手，传统疫苗的研制速度已经有些难于跟上该病的变化。快速的开发新型有效的能防治变异和超强毒株的新型疫苗的要求尤为迫切。重组乳酸菌活载体基因工程疫苗是完全食品级安全的、无任何生物安全隐患的新型活载体疫苗。不仅保留病毒抗原性，更不存在散毒的危险。该疫苗的开发和应用将为防治当前流行的鸡传染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可为防治禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类在代谢性能、生理特征及形态上不完全相同的革兰氏阳性菌的统称，其总的特征是发酵碳水化合物时主要代谢产物是乳酸，G+，多数为不形成芽孢的对动物或植物具有益生特性的一类细菌。早期被人们用于食品发酵并取得了巨大的成功。随着对于益生乳酸菌的生理特性和分子遗传特性基础研究的深入，研究者们逐渐认识到乳酸菌作为递送异源抗原的活载体用于各种疾病的预防与治疗具有巨大的应用前景。特别是利用乳酸菌活载体疫苗不仅可以诱导机体产生系统性免疫应答，而且可以同时诱导机体的黏膜免疫应答。

伴随着分子生物学和基因工程技术的发展，出现了对于鸡传染性法氏囊病的一些新型的疫苗研究，其中主要有DNA疫苗、重组亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗。其中活载体疫苗是指将致病微生物的主要抗原蛋白基因片段插入到表达载体中，然后将重组载体转到原核微生物或者细胞鸡真核微生物而得到的产物；或者是剔除致病微生非复制必须的毒力基因得到的基因缺失疫苗。目前主要是利用一些病毒载体(如：马立克病毒(MDV)、鸡痘病毒(FPV)、新城疫病毒(NDV)及禽腺病毒(ALV))表达IBDV的主要抗原蛋白VP2构建病毒活载体疫苗，其中Tsukamoto等利用HVT作为载体构建的rHVTpec-VP2重组活载体疫苗，在免疫鸡后，分别取得了致死剂量vvIBDV的攻毒保护率100％；随后Bublot团队和Le Gros团队分别开发的rHVT-VP2活载体疫苗在1日龄免疫接种雏鸡后，也取得了良好的免疫效果。目前利用乳酸菌构建重组乳酸菌IBDV-VP2活载体疫苗的研究预期取得了初步的进展，但是效果并不是非常理想，还需要进一步的探索和研究。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK融合蛋白的基因序列的重组乳酸菌菌株，该重组乳酸菌菌株可以作为疫苗直接使用。

本发明的目的之二是提供由上述重组乳酸菌菌株表达产生的由鸡传染性法氏囊病病毒VP2以及沙门菌属外膜蛋白RCK组成的融合蛋白。

本发明的目的之三是提供由所述的重组乳酸菌菌株以及由该菌株表达得到的融合蛋白在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株，其特征在于：含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白以及沙门菌属外膜蛋白RCK融合蛋白的基因序列。

在本发明中，优选的，所述的经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白以及沙门菌属外膜蛋白RCK融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的具体实施中，所述的重组乳酸菌菌株命名为r-L.lactis-RCK-VP2，分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号是：CGMCC NO.13739，保藏时间为2017年3月8日。

进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组乳酸菌菌株的方法，包括以下步骤：

(1)获得优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白RCK的基因序列，所述的优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，优化后的编码沙门菌属外膜蛋白RCK的基因序列如SEQ ID NO.5所示，将二者进行连接，得到编码VP2和RCK融合蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为OptiVP2-OptiRCK；

(2)针对该融合基因OptiVP2-OptiRCK设计1对带有乳酸菌载体两侧重复序列的特异性引物，以OptiVP2-OptiRCK基因为模板，进行PCR扩增，得到的扩增产物与线性化的乳酸菌载体进行多片段的同源重组，构建得到重组质粒；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入到乳酸菌感受态中，涂板，培养，挑取单克隆菌株进行鉴定，得到融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株。

其中，优选的，所述的特异性引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列为：

上游引物：5’CACCATGGCTAATTTACAAGAGCTAATTAATTAGG 3’

下游引物：5’TGGGGTACCTGCTCCAGCAATTTTCAATGGACTATT3’

其中，优选的，所述的乳酸菌载体为pNZ8149。

再进一步的，本发明还提出了一种鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的融合蛋白，其特是由本发明所述的重组乳酸菌菌株经过诱导表达后得到，优选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

编码所述的融合蛋白的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

更进一步的，本发明还提出了所述的重组乳酸菌菌株、所述的融合蛋白及其编码序列在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的用途，其中，优选的，所述的药物为疫苗，更优选的，所述的药物为口服疫苗或注射疫苗；其中，优选的，所述的鸡传染性法氏囊病毒为鸡传染性法氏囊病毒超强毒(vvIBDV)。

攻毒实验结果表明，当受到鸡传染性法氏囊病毒超强毒株HLJ0504攻击时，注射免疫r-L.lactis-RCK-VP2实验组攻毒保护率可达到100％，口服r-L.lactis-RCK-VP2免疫实验组攻毒保护率可达到80％；说明本发明得到的重组乳酸乳球菌r-L.lactis-RCK-VP2经注射和口服免疫后均不能诱导机体产生特异性的免疫应答，注射免疫或口服免疫r-L.lactis-VP2实验组以及空菌对照实验组攻毒保护率均为0。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明将优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白以及沙门菌属外膜蛋白RCK进行融合表达，结果显示RCK和VP2蛋白的融合蛋白，显著提高了VP2蛋白对于上皮细胞的黏附能力，而单独表达的VP2蛋白和空菌裂解蛋白与上皮细胞的黏附作用很少。说明RCK蛋白肽可以显著提高VP2蛋白对上皮细胞的黏附能力，从而可以显著提高抗原递呈能力；

2、将本发明重组乳酸菌制成疫苗，免疫鸡实验结果表明：本发明重组乳酸菌口服免疫或注射免疫均可以有效诱导机体产生特异性的免疫应答，产生特异性中和抗体，注射免疫使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，对法氏囊组织有完全保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。

3、在生产工艺上，本发明的重组乳酸菌菌株可以通过发酵培养大量获得，比起用SPF鸡法氏囊或细胞培养物制备的传统IBD疫苗，乳酸菌的培养简单、方便，所需培养基成本低，此外，本发明的重组乳酸菌可直接作为疫苗经口服或皮下注射途径使用，无需裂解或纯化，适合大规模生产。

附图说明

图1为融合基因的PCR扩增结果；

图2为重组质粒的酶切鉴定(NcoI和AvaII双酶切)结果；

图3为重组质粒p8149-OptiVP2-RCK图谱；

图4为重组乳酸菌的PCR鉴定检测结果；

图5A为乳酸菌融合表达的RCK-VP2重组蛋白的Western blot检测结果；

图5B为IBDV-VP2重组蛋白的稳定性检测结果；

图5C、5D为重组乳酸菌的冷冻电镜切片，未显示蛋白颗粒样物质，表明融合表达的IBDV-VP2重组蛋白为可溶性表达于溶质中；

图6为重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2黏附上皮细胞的验证实验结果；

图7为重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2内化上皮细胞的庆大霉素验证实验结果；

图8为r-L.lactis-RCK-VP2免疫组攻毒观察10日后可见囊指数大于0.7，全部保护；

图9为各实验组攻毒保护存活率曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1重组乳酸菌的构建及鉴定

1、重组乳酸菌载体的构建

将编码鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2蛋白与沙门菌属外膜蛋白RCK的基因分别按照乳酸菌密码子偏嗜表进行优化，优化后的基因命名分别为OptiVP2以及OptiRCK，优化后的鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2基因序列OptiVP2如SEQ ID NO：3所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，优化后的鸡沙门菌属外膜蛋白RCK的基因序列OptiRCK如SEQ ID NO：5所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。将优化后的OptiVP2以及OptiRCK基因序列进行连接，得到编码VP2-RCK融合蛋白的核苷酸序列OptiVP2-OptiRCK，其序列如SEQ ID NO：1所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

针对得到的OptiVP2-OptiRCK基因(SEQ ID NO：1所示)设计1对带有pNZ8149载体两侧重复序列的特异性引物，将设计好的引物交给吉林库美生物有限公司合成。引物序列如下：

上游引物：5’CACCATGGCTAATTTACAAGAGCTAATTAATTAGG 3’(SEQ ID NO.7所示)

下游引物：5’TGGGGTACCTGCTCCAGCAATTTTCAATGGACTATT3’(SEQ ID NO.8所示)

扩增的片段大小为1536bp，扩增结果见图1。将pNZ8149酶切纯化回收的线性化载体按照One Step Cloning Kit的说明书要求与载体进行多片段的同源重组，构建重组质粒。

2、重组质粒的提取及鉴定

采用电转化的方式将重组质粒导入到乳酸菌NZ3900感受态中。具体的步骤为：取出一支乳酸菌株NZ3900感受态细胞置于冰上融化，然后将同源重组得到连接产物吸出10μL加入感受态细胞中，轻轻吹均匀，在冰上静置5-10min，加入0.2mm的电转杯中，按照条件(2000ν、25μF、200Ω)进行电转，电转完成后，迅速在电转杯中加入1mL的电转复苏液进行复苏，吹吸混匀后吸出加入提前准备好的EP管(高压灭菌并提前在冰上预冷)中，冰水浴5min，30℃孵育1h。取100μL在L-Elliker平板上涂板，将平板倒置，于30℃过夜培养。第二天挑取单克隆菌株进行鉴定，证明质粒构建正确。质粒的鉴定结果见图2，质粒图谱见图3。将所得到的重组质粒命名为p8149-OptiVP2-RCK。

3、重组乳酸菌的筛选和鉴定

挑取单克隆菌株培养，经过菌液PCR初步鉴定出1、2、5、7、9共五株疑似阳性克隆菌株，鉴定结果见图4；为进一步鉴定重组乳酸菌株的构建正确，通过测序，Blast序列比对，最终确定筛选出一株与预期设计的完全一致的阳性克隆，命名为r-L.lactis-RCK-VP2，分类命名为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCC NO.13739。

5、重组乳酸菌的诱导表达及稳定性鉴定

将所述的重组乳酸菌菌株r-L.lactis-RCK-VP2接种于Elliker-medium培养基中，加入0.5％乳糖，30℃，静止培养过夜，按照1：50传代培养，培养菌密度至OD₆₀₀为0.3-0.5时，加入nisin诱导培养，Nisin浓度为10ng/mL培养，静止诱导培养5至6小时后，分别得到重组菌株的培养上清、裂解上清和裂解沉淀；利用含有空载体菌株作为阴性对照，进行WesternBlot检测，结果显示重组乳酸乳球菌实现融合蛋白VP2-RCK(约57kD)的表达(如图5A所示)，并且是胞内可溶性表达(如图5C、5D所示)。

重组乳酸乳球菌r-L.Lactis-RCK-VP2经过诱导表达后，静置于室温环境中，对不同时间段的菌体进行处理后，经Western Blot检测结果(图5B)显示，在108h时仍可以检测到融合蛋白的存在，说明在室温环境一周左右的时间中融合蛋白可以稳定存在。

实施例2本发明重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2对上皮细胞的吸附和粘附特性检测，以及被上皮细胞内化的特性检测

1、重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2对上皮细胞的粘附性实验验证

(1)首先将人肠道上皮细胞系HT29在24孔板内用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液培养，当达到80％细胞融合度时，将部分细胞孔细胞消化并吹下，用细胞计数仪进行细胞计数，确保每孔细胞总数大约含有4-5×10⁵个细胞。

(2)分别将重组乳酸菌株r-L.lactis-RCK-VP2、仅表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组乳酸菌r-L.lactis-VP2(制备方法与r-L.lactis-RCK-VP2的制备相同，区别仅在于不含有RCK表达序列)和对照菌株Wt-L.Lactis进行诱导表达后，离心收集菌体，再用细胞培养液DMEM重悬细菌，测定OD值，根据事前监测OD值和平板菌落计数建立的OD值-菌数标准曲线，计算重组菌含量，吸取一定体积的菌液，离心收集菌体，再用细胞培养液DMEM重悬细菌，使感染复数MOI＝1:1000(multiplicity of infection)感染HT29细胞，温度为37℃，5％的CO2条件下共孵育1h。

(3)用不含任何抗生素和血清的细胞培养液DMEM洗涤细胞4-5次，弃上清，以清除未能和HT29细胞结合的菌体。

(6)用冰冷的灭菌超纯水(含0.2％triton-X 100)重悬并裂解HT29细胞，将细胞裂解液均匀涂布于含0.5％葡萄糖的L-Elliker培养基平板上，37度培养24小时，进行细菌计数。

(7)比较重组乳酸菌株r-L.lactis-RCK-VP2、重组乳酸菌株r-L.lactis-VP2以及对照菌株Wt-L.Lactis对HT29细胞的粘附特性差异，结果如图6所示，从图6结果可以看出：重组乳酸菌株r-L.lactis-RCK-VP2对HT29细胞的粘附能力极显著高于重组乳酸菌株r-L.lactis-VP2以及对照菌株Wt-L.Lactis(P＜0.001)。

2、重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2内化上皮细胞的庆大霉素验证实验

(1)首先将上皮细胞系Caco-2在24孔板内用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液培养，当达到80％细胞融合度时，将部分细胞孔细胞消化并吹下，用细胞计数仪进行细胞计数，确保每孔细胞总数大约含有4-5×10⁵个细胞。

(2)分别将重组乳酸菌株r-L.lactis-RCK-VP2、重组乳酸菌株r-L.lactis-VP2和对照菌株Wt-L.Lactis进行诱导表达后，测定OD值，根据事前监测OD值和平板菌落计数建立的OD值-菌数标准曲线，计算重组菌含量，吸取一定体积的菌液，离心收集菌体，再用细胞培养液DMEM重悬细菌，使感染复数MOI＝1:1000(multiplicity of infection)感染Caco-2细胞，温度为37℃，5％的CO2条件下共孵育2h。

(3)用不含任何抗生素和血清的细胞培养液DMEM洗涤细胞4-5次，弃上清，以清除未能和MA04细胞结合的菌体。在细胞培养液中加入终浓度150μg/mL的庆大霉素，温度为37℃，5％的CO2条件下共孵育2h，以杀灭游离于细胞外和黏附于细胞表面的菌体。

(6)用冰冷的灭菌超纯水(含0.2％triton-X 100)重悬并裂解Caco-2细胞，将细胞裂解液均匀涂布于含0.5％葡萄糖的L-Elliker培养基平板上，37度培养24小时，进行细菌计数。

(7)比较重组乳酸菌株r-L.lactis-RCK-VP2、重组乳酸菌株r-L.lactis-VP2和对照菌株Wt-L.Lactis对含0.2％triton-X 100细胞的内化特性差异，结果如图7所示，从图7结果可以看出：重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2对MA04细胞的内化能力极显著高于重组乳酸菌株r-L.lactis-VP2以及对照菌株Wt-L.Lactis(P＜0.001)。

实施例3本发明重组乳酸菌r-L.lactis-RCK-VP2的免疫原性的测定

取出保存于-80℃的实施例1所制备的重组乳酸乳球菌菌株r-L.lactis-RCK-VP2以及仅表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的重组乳酸菌r-L.lactis-VP2(制备方法与r-L.lactis-RCK-VP2的制备相同，区别仅在于不含有RCK表达序列)，分别在固体的L-Elliker培养基上进行划线，30℃培养，10h-12h长出单菌落之后，用灭菌的枪头挑菌，液体的L-Elliker培养基至对数期；按1:100比例进行转接30℃静置培养12h-14h后，再次按照1:50比例转接到液体L-Elliker培养基30℃静置培养约2h-3h，待OD600＝0.4～0.5，加入终浓度为5ng/mL的Nisin，30℃静止诱导培养4h-5h，8000g离心2min，用PBS按照1:10比例浓缩重悬，菌体浓度约为1×10¹⁰CFU/mL，用于后续的口服和皮下注射免疫。

将1日龄SPF雏鸡随机分6组，每组10只，r-L.lactis-RCK-VP2免疫组分别为口服免疫1×10¹⁰CFU/mL重组乳酸乳球菌r-L.lactis-RCK-VP2(500μL)，颈部皮下注射免疫1×10¹⁰CFU/mL重组乳酸乳球菌r-L.lactis-RCK-VP2(200μL)；r-L.lactis-VP2免疫组分别为口服免疫1×10¹⁰CFU/mL重组乳酸乳球菌r-L.lactis-VP2(500μL)，颈部皮下注射免疫1×10¹⁰CFU/mL重组乳酸乳球菌r-L.lactis-VP2(200μL)；空载体菌株Wt-L.Lactis免疫组采用颈部皮下注射免疫1×10¹⁰CFU/mL含有空载体的乳酸乳球菌Wt-L.Lactis(200μL)，颈部皮下注射PBS(200μL)组作为对照实验组。各组在7日龄时进行首次免疫；14日龄进行二次免疫；同时在首免后和二免后一周采集血清，口服免疫组采集口咽拭子和泄殖腔拭子；30日龄时，用1000个ELD₅₀的HLJ0504超强毒株进行攻毒保护试验，攻毒后观察10天左右，记录各组SPF鸡的发病情况及存活率。

实验结果显示：(1)注射免疫r-L.lactis-RCK-VP2的实验组攻毒保护率可达到100％，口服免疫r-L.lactis-RCK-VP2的实验组攻毒保护率可达到80％，见图9所示。(2)r-L.lactis-RCK-VP2口服免疫组和注射免疫组的血清ELISA抗体为阴性，但产生了较高的血清中和抗体(1:2⁶到1:2¹⁰)；重组乳酸乳球菌rL.Lactis-RCK-VP2经注射和口服免疫后均可以诱导机体产生特异性的免疫应答。r-L.lactis-RCK-VP2注射组试验鸡法氏囊组织全部保护，实验组攻毒观察10日后囊指数大于0.7，全部保护，结果见图8。(3)攻毒5天后，注射免疫或口服免疫r-L.lactis-VP2实验组攻毒保护率均为0；Wt-L.Lactis免疫组以及对照实验组攻毒保护率为0；结果如图9所示。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨研究所

<120> 融合表达IBDV VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株及其用途

<130> KLPI170347

<160> 8

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> OptiVP2-OptiRCK

<400> 1

atggctaatt tacaagatca aacacaacaa attgttcctt ttattcgttc acttttaatg 60

ccaacaactg gtcctgcttc tattccagat gatacacttg aaaaacatac tttgcgttca 120

gaaacatcta cttataattt gacagttgga gatactggat caggtttaat tgttttcttt 180

ccaggatttc ctggttctat tgttggtgct cattatacat tacaaagtaa tggaaattat 240

aaatttgatc aaatgttact tactgctcaa aatcttcctg catcatataa ttattgtcgt 300

ttggtttcaa gatctcttac agttcgttca tctactttgc caggaggtgt ttatgctttg 360

aatggtacaa ttaatgcagt tacttttcaa ggaagtcttt cagaattgac agatgtttct 420

tataatggtc ttatgagtgc tactgcaaat attaatgata aaattggaaa tgttttggtt 480

ggagaaggtg ttacagttct tagtttgcca acttcatatg atttgggata tgttcgttta 540

ggtgatccaa ttcctgcaat tggtcttgat cctaaaatgg ttgctacatg tgatagttca 600

gatcgtccaa gagtttatac aattactgct gcaaatgatt atcaattttc tagtcaatat 660

caagctggag gtgttacaat tactttattt tcagctaata ttgatgcaat tacttcttta 720

agtattggag gtgaacttgt ttttcaaaca tctgttcaag gattgattct tggtgctact 780

atttatttga ttggatttga tggtacagct gttattactc gtgcagttgc tgctgataat 840

ggacttacag ctggtactga taatttgatg ccttttaata ttgttattcc aacatcagaa 900

attactcaac ctattacatc tattaaattg gaaattgtta catcaaaatc tggaggtcaa 960

gctggtgatc aaatgagttg gtcagcttct ggaagtttag cagttacaat tcatggagga 1020

aattatcctg gtgcacttcg tccagttact ttggttgctt atgaaagagt tgcaacagga 1080

agtgttgtta ctgttgcagg tgtttcaaat tttgaattaa ttccaaatcc tgaattagct 1140

aaaaatctta ttacagaata tggacgtttt gatccaggtg caatgaatta tactaaattg 1200

attttgtcag aacgtgatag acttggaatt aaaactgttt ggcctacacg tgaatatact 1260

gattttagag aatattttat ggaagttgct gatttgaata gtccattgaa aattgctgga 1320

gcaggtaccg gacgtgcaga agttaaagaa agaattagta tgccaggtta taatggacgt 1380

tttacaggtt cagaacgtag aactggattt gcttggggtg caggagttca atttaatcct 1440

gttgaaaatg ttgttattga tttgggttat gaaggatcta aagttggtgc tgcaaaactt 1500

aatggagtta atgttggtgt tggatataga ttttaa 1536

<210> 2

<211> 511

<212> PRT

<213> OptiVP2-OptiRCK

<400> 2

1 MET Ala Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile

16 Arg Ser Leu Leu MET Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp

31 Asp Thr Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr

46 Asn Leu Thr Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe

61 Pro Gly Phe Pro Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln

76 Ser Asn Gly Asn Tyr Lys Phe Asp Gln MET Leu Leu Thr Ala Gln

91 Asn Leu Pro Ala Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser

106 Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu

121 Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu

136 Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu MET Ser Ala Thr Ala Asn

151 Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val Gly Glu Gly Val Thr

166 Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr Val Arg Leu

181 Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys MET Val Ala

196 Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala

211 Ala Asn Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly Val

226 Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu

241 Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu

256 Ile Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala

271 Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly

286 Thr Asp Asn Leu MET Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu

301 Ile Thr Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser

316 Lys Ser Gly Gly Gln Ala Gly Asp Gln MET Ser Trp Ser Ala Ser

331 Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala

346 Leu Arg Pro Val Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly

361 Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro

376 Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Ile Thr Glu Tyr Gly Arg Phe

391 Asp Pro Gly Ala MET Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg

406 Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr

421 Asp Phe Arg Glu Tyr Phe MET Glu Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro

436 Leu Lys Ile Ala Gly Ala Gly Thr Gly Arg Ala Glu Val Lys Glu

451 Arg Ile Ser MET Pro Gly Tyr Asn Gly Arg Phe Thr Gly Ser Glu

466 Arg Arg Thr Gly Phe Ala Trp Gly Ala Gly Val Gln Phe Asn Pro

481 Val Glu Asn Val Val Ile Asp Leu Gly Tyr Glu Gly Ser Lys Val

496 Gly Ala Ala Lys Leu Asn Gly Val Asn Val Gly Val Gly Tyr Arg

511 Phe ***

<210> 3

<211> 1323

<212> DNA

<213> OptiVP2

<400> 3

atggctaatt tacaagatca aacacaacaa attgttcctt ttattcgttc acttttaatg 60

ccaacaactg gtcctgcttc tattccagat gatacacttg aaaaacatac tttgcgttca 120

gaaacatcta cttataattt gacagttgga gatactggat caggtttaat tgttttcttt 180

ccaggatttc ctggttctat tgttggtgct cattatacat tacaaagtaa tggaaattat 240

aaatttgatc aaatgttact tactgctcaa aatcttcctg catcatataa ttattgtcgt 300

ttggtttcaa gatctcttac agttcgttca tctactttgc caggaggtgt ttatgctttg 360

aatggtacaa ttaatgcagt tacttttcaa ggaagtcttt cagaattgac agatgtttct 420

tataatggtc ttatgagtgc tactgcaaat attaatgata aaattggaaa tgttttggtt 480

ggagaaggtg ttacagttct tagtttgcca acttcatatg atttgggata tgttcgttta 540

ggtgatccaa ttcctgcaat tggtcttgat cctaaaatgg ttgctacatg tgatagttca 600

gatcgtccaa gagtttatac aattactgct gcaaatgatt atcaattttc tagtcaatat 660

caagctggag gtgttacaat tactttattt tcagctaata ttgatgcaat tacttcttta 720

agtattggag gtgaacttgt ttttcaaaca tctgttcaag gattgattct tggtgctact 780

atttatttga ttggatttga tggtacagct gttattactc gtgcagttgc tgctgataat 840

ggacttacag ctggtactga taatttgatg ccttttaata ttgttattcc aacatcagaa 900

attactcaac ctattacatc tattaaattg gaaattgtta catcaaaatc tggaggtcaa 960

gctggtgatc aaatgagttg gtcagcttct ggaagtttag cagttacaat tcatggagga 1020

aattatcctg gtgcacttcg tccagttact ttggttgctt atgaaagagt tgcaacagga 1080

agtgttgtta ctgttgcagg tgtttcaaat tttgaattaa ttccaaatcc tgaattagct 1140

aaaaatctta ttacagaata tggacgtttt gatccaggtg caatgaatta tactaaattg 1200

attttgtcag aacgtgatag acttggaatt aaaactgttt ggcctacacg tgaatatact 1260

gattttagag aatattttat ggaagttgct gatttgaata gtccattgaa aattgctgga 1320

gca 1323

<210> 4

<211> 441

<212> PRT

<213> OptiVP2

<400> 4

1 MET Ala Asn Leu Gln Asp Gln Thr Gln Gln Ile Val Pro Phe Ile

16 Arg Ser Leu Leu MET Pro Thr Thr Gly Pro Ala Ser Ile Pro Asp

31 Asp Thr Leu Glu Lys His Thr Leu Arg Ser Glu Thr Ser Thr Tyr

46 Asn Leu Thr Val Gly Asp Thr Gly Ser Gly Leu Ile Val Phe Phe

61 Pro Gly Phe Pro Gly Ser Ile Val Gly Ala His Tyr Thr Leu Gln

76 Ser Asn Gly Asn Tyr Lys Phe Asp Gln MET Leu Leu Thr Ala Gln

91 Asn Leu Pro Ala Ser Tyr Asn Tyr Cys Arg Leu Val Ser Arg Ser

106 Leu Thr Val Arg Ser Ser Thr Leu Pro Gly Gly Val Tyr Ala Leu

121 Asn Gly Thr Ile Asn Ala Val Thr Phe Gln Gly Ser Leu Ser Glu

136 Leu Thr Asp Val Ser Tyr Asn Gly Leu MET Ser Ala Thr Ala Asn

151 Ile Asn Asp Lys Ile Gly Asn Val Leu Val Gly Glu Gly Val Thr

166 Val Leu Ser Leu Pro Thr Ser Tyr Asp Leu Gly Tyr Val Arg Leu

181 Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys MET Val Ala

196 Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile Thr Ala

211 Ala Asn Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly Val

226 Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu

241 Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu

256 Ile Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala

271 Val Ile Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly

286 Thr Asp Asn Leu MET Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu

301 Ile Thr Gln Pro Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser

316 Lys Ser Gly Gly Gln Ala Gly Asp Gln MET Ser Trp Ser Ala Ser

331 Gly Ser Leu Ala Val Thr Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala

346 Leu Arg Pro Val Thr Leu Val Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly

361 Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro

376 Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Ile Thr Glu Tyr Gly Arg Phe

391 Asp Pro Gly Ala MET Asn Tyr Thr Lys Leu Ile Leu Ser Glu Arg

406 Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr Arg Glu Tyr Thr

421 Asp Phe Arg Glu Tyr Phe MET Glu Val Ala Asp Leu Asn Ser Pro

436 Leu Lys Ile Ala Gly Ala

<210> 5

<211> 213

<212> DNA

<213> OptiRCK

<400> 5

ggtaccggac gtgcagaagt taaagaaaga attagtatgc caggttataa tggacgtttt 60

acaggttcag aacgtagaac tggatttgct tggggtgcag gagttcaatt taatcctgtt 120

gaaaatgttg ttattgattt gggttatgaa ggatctaaag ttggtgctgc aaaacttaat 180

ggagttaatg ttggtgttgg atatagattt taa 213

<210> 6

<211> 70

<212> PRT

<213> OptiRCK

<400> 6

1 Gly Thr Gly Arg Ala Glu Val Lys Glu Arg Ile Ser MET Pro Gly

16 Tyr Asn Gly Arg Phe Thr Gly Ser Glu Arg Arg Thr Gly Phe Ala

31 Trp Gly Ala Gly Val Gln Phe Asn Pro Val Glu Asn Val Val Ile

46 Asp Leu Gly Tyr Glu Gly Ser Lys Val Gly Ala Ala Lys Leu Asn

61 Gly Val Asn Val Gly Val Gly Tyr Arg Phe ***

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 引物序列

<400> 7

caccatggct aatttacaag agctaattaa ttagg 35

<210> 8

<211> 36

<212> PRT

<213> 引物序列

<400> 8

tggggtacct gctccagcaa ttttcaatgg actatt 36

Claims

1.一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白RCK的重组乳酸菌菌株，其特征在于：所述重组乳酸菌菌株含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白以及沙门菌属外膜蛋白RCK融合蛋白的基因序列；所述的经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白以及沙门菌属外膜蛋白RCK融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的重组乳酸菌菌株命名为r-L.lactis-RCK-VP2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCC NO.13739。

2.权利要求1所述的重组乳酸菌菌株在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的药物为疫苗。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的药物为口服疫苗或注射疫苗。

5.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的鸡传染性法氏囊病毒为鸡传染性法氏囊病毒超强毒。