CN117625505B - 用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 - Google Patents
用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117625505B CN117625505B CN202311594151.XA CN202311594151A CN117625505B CN 117625505 B CN117625505 B CN 117625505B CN 202311594151 A CN202311594151 A CN 202311594151A CN 117625505 B CN117625505 B CN 117625505B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactococcus lactis
- vaccine
- usp45
- acm
- escherichia coli
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000194035 Lactococcus lactis Species 0.000 title claims abstract description 42
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 title claims abstract description 42
- 229940126578 oral vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 19
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 title abstract description 9
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 title abstract description 9
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 title abstract description 9
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 17
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 8
- 241001478240 Coccus Species 0.000 claims description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 22
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 19
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 19
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 17
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 17
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 abstract description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 abstract description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 3
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 4
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 101150051545 faeG gene Proteins 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000003903 intestinal lesions Effects 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 208000026775 severe diarrhea Diseases 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101000891880 Escherichia coli K88 fimbrial protein AB Proteins 0.000 description 1
- 101000891878 Escherichia coli K88 fimbrial protein AC Proteins 0.000 description 1
- 101000891876 Escherichia coli K88 fimbrial protein AD Proteins 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053775 Nisin Proteins 0.000 description 1
- NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N Nisin Chemical compound N1C(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@@H]([C@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)[C@H](N)[C@H](C)CC)CSC[C@@H]1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(NCC(=O)N[C@H](C)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@H](CS[C@@H]2C)C(=O)N[C@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](CCSC)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]2C(N[C@H](C)C(=O)N[C@@H]3C(=O)N[C@@H](C(N[C@H](CC=4NC=NC=4)C(=O)N[C@H](CS[C@@H]3C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H]([C@H](C)CC)C(=O)N[C@H](CC=3NC=NC=3)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(O)=O)=O)CS[C@@H]2C)=O)=O)CS[C@@H]1C NVNLLIYOARQCIX-MSHCCFNRSA-N 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001536563 Panus Species 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 229940087586 escherichia coli antigen Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000004309 nisin Substances 0.000 description 1
- 235000010297 nisin Nutrition 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004180 plasmocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，公开了用于产肠毒素大肠杆菌K88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用。本发明制备了3个乳酸乳球菌抗原表面展示株，混合后进行口服免疫。口服免疫方式操作方便，避免了注射免疫对动物造成的应激反应，同时免疫效果得到了极大的提升，可以有效预防产肠毒素大肠杆菌对仔猪造成的腹泻。本发明是一款口服的大肠杆菌疫苗，小鼠免疫攻毒实验表明，可以在LD50的攻毒剂量下保持全部存活，仔猪免疫攻毒实验表明，可以100%保护仔猪的腹泻情况，表明免疫组产生了有效的黏膜免疫保护能力。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及用于产肠毒素大肠杆菌K88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用。
背景技术
产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种能够引起人和多种动物腹泻的致病性大肠杆菌。本病多发于幼龄动物，在猪群中主要导致7日龄以内仔猪发生剧烈腹泻和脱水，传播迅速，发病率和死亡率均较高，称为仔猪黄痢；10-30日龄仔猪多发白痢，病死率不高，但导致仔猪发育不良，逐渐消瘦，甚至造成僵猪的情况，给养殖场造成巨大经济损失，因此，研究和创制针对该病的疫苗具有重要意义(张凡庆2022)。
活载体疫苗是将目的抗原编码基因通过分子生物学手段导入活载体(无或弱毒的细菌或病毒)，构建重组菌(毒)株，使目的基因随着重组菌(毒)株在宿主体内的增殖而大量表达,从而诱发相应的免疫保护应答。乳酸乳球菌(Lactococcus lactic)是乳酸菌的典型菌种之一，具有生长迅速、易于操作及安全无毒等优点，目前已获得其全部基因组序列，逐渐成为表达外源蛋白和作为活载体疫苗载体的理想选择(王琛2019)。然而，乳酸菌具有较高的生物学与遗传基因型多样性，不同外源基因的表达量差异较大甚至不表达，相同基因在不同宿主菌中表达水平也有所差异，刺激机体产生的细胞免疫和体液免疫水平也不同，抗原在重组菌株表面展示的量同样存在较大的差异，而蛋白表达量是载体疫苗发挥效果的关键因素，因而在实际使用过程中，免疫动物收获的效果也参差不齐，这也是乳酸菌载体疫苗发展的难点之一(刘琼等2019)。
目前养猪业对于ETEC的防控主要还是用抗生素进行治疗，而临床分离的大肠杆菌普遍耐药，应用抗生素有时不仅达不到治疗效果，反而使多重耐药菌株增加，加之世界各国限抗禁抗政策的不断落实，抗生素治疗的方案已经不满足当前本病的防控，因而接种疫苗是预防本病的最佳方法(杨德鸿等2019)。ETEC疫苗的研究距今已逾30年，从单纯的物理化学手段到基因工程手段均取得了一系列的进展，但至今尚无一种疫苗能有效地适用于各个地区，大多数疫苗的研究都由于免疫原性不佳或是缺乏广泛保护力而停滞不前(张恒慧等2015)。全菌灭活疫苗是目前试验性及商品化ETEC疫苗的主要制备方法，但是由于ETEC血清型众多，且分布呈地域差异性，实际使用过程中地域局限性大，广谱保护效果差；同时存在有效成分占比不高，免疫剂量大，不具有疫苗的高效性、内毒素和无关成分含量较高，副反应严重等问题，导致疫苗在临床中使用效果并不理想。基因工程疫苗同样已有相关产品获批进入临床使用，但是由于蛋白的表达会相互影响，不能完全发挥抗原的全部效果、在临床应用中不能保护一些非菌毛黏附素毒株、试验效果较好而实际应用效果不佳等问题导致临床使用率并不高。
针对本病的亚单位疫苗一直以来是备受关注的疫苗类型，其具有广谱性强，免疫原性高，动物应激反应小等优点，但是由于细菌本身抗原蛋白制备较为困难，存在菌株表达量低、不易获得大量可溶性蛋白、提纯成本较高、免疫效果达不到预期等问题，目前为止还没有产品在临床使用。弱毒活疫苗存在毒力返强风险，并且往往只对同源菌株有效，加之全世界对细菌弱毒苗研究较少等，目前也没有疫苗可供使用(夏芃芃等2016；杨德鸿等2019；Bourgeois et al.2016)。因此，当前对于ETEC的防控，仍急需一种行之有效的疫苗方案。
针对上述问题，本发明提供了用于产肠毒素大肠杆菌K88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗，该疫苗通过口服免疫方式进行免疫，避免了疫苗注射带来的应激反应，同时极大的发挥了黏膜免疫的效果，抵抗大肠杆菌病的感染。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物为分别表达SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.6的乳酸乳球菌NZ3900。
本发明的另一个目的在于提供了上述乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达SEQ ID NO.2的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM，表达SEQ ID NO.的4重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM和表达SEQ ID NO.6的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM。
以上所述的方案，优选的，所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM，是将SEQ ID NO.1所示基因导入乳酸乳球菌NZ3900获得。
所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM是将SEQID NO.3所示基因导入乳酸乳球菌NZ3900获得。
所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM是将SEQID NO.5所示基因导入乳酸乳球菌NZ3900获得。
以上所述的方案，优选的，三种重组乳酸乳球菌的有效菌含量的比例为1～2：1～2：1～2。
本发明的保护范围还包括：上述乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用。
优选的，所述的产肠毒素大肠杆菌的血清型为K88。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明首次提供了可口服的产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichia coli,ETE C)，利用该疫苗小鼠免疫攻毒实验，7天日观察疫苗的保护率可以达到100％，仔猪免疫后攻毒发现能够全部保护不发生腹泻。
2.本发明专门针对乳酸乳球菌NZ3900，设计的产肠毒素大肠杆菌抗原展示序列，该序列可在乳酸乳球菌NZ3900这一展示载体上大量而稳定的表达，同时动物服用后达到良好的免疫效果。
3.本发明由于是口服疫苗，免疫方式简单，口服拌料容易规模化实施，避免注射引起的应激反应，可以有效的预防仔猪黄白痢的发生。
附图说明
图1为三株重组菌株蛋白表达WB图。
图2为小鼠攻毒后生存曲线示意图。
图3为小鼠实验病变及HE染色示意图。
图4为仔猪免疫期体重变化示意图。
图5为仔猪攻毒后7天各组体重示意图。
图6为仔猪实验实病变及HE染色示意图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
产肠毒素大肠杆菌K88基因型的表面展示蛋白的分析及合成：
根据GenBank上发表的ETEC不耐热肠毒素lt A、B两个亚基以及K88菌毛蛋白亚基faeG基因序列和蛋白序列，将不耐热肠毒素ltA亚基的第63位丝氨酸突变为赖氨酸、第72位的丙氨酸突变为精氨酸，降低其毒性。根据蛋白展示的需要，对密码子进行优化并进行蛋白的有效截短，获得了目的及基因片段。同时利用乳酸乳球菌第45号蛋白质的分泌跨膜肽基因Usp45作为外源蛋白的分泌信号肽，插入目的基因5’端；利用同样来源于乳酸乳球菌的三个重复Lysm基因序列编码的多肽片段ACM，插入目的基因3’端，通过非共价连接的方式将抗原锚定在乳酸乳球菌细胞壁表面，从而实现外源蛋白的表面展示。
其中最终设计的Usp45-ltA-ACM为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.2所示；Usp45-ltB-ACM为SEQ ID NO.3所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.4所示；Usp45-faeG-ACM为SEQ ID NO.5所示，编码的蛋白为SEQ ID NO.6所示。
通过南京金斯瑞公司进行三段基因的合成。
实施例2：
三种重组乳酸乳球菌的制备：
本实施例用到的引物如下表所示：
表一：目的基因扩增引物及载体通用鉴定引物
| 序号 | 引物名称 | 引物序列5’-3’ |
| ① | pNZ8149-F | ACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTT |
| ② | pNZ8149-R | GCTTTCATAATCTAACAGACAACATCT |
| ③ | KpnI-Usp45-F | CCGGGTACCATGAAAAAAAAGATTATCTCAGCTATTTTAATGTCT |
| ④ | SacI-ACM-R | CGCGAGCTCTTTTATTCGTAGATACTGACC |
1)三株分别表达ltA、ltB、faeG重组乳酸乳球菌的构建：
(1).分别以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5所示序列为模板，利用表一中③④引物分别进行扩增，得到三条片段。
(2)以KpnI/SacI双酶切载体pNZ8149及上述三条扩增产物，使用OMEGA公司的GelE xtraction Kit试剂盒对酶切产物进行胶回收；配制10ul连接反应体系，37℃连接1小时：
(3)连接产物电转化乳酸乳球菌感受态细胞
A.将10μL连接产物加入到100μL NZ3900感受态细胞中，轻轻弹管壁混合，冰浴20min。
B.将混合菌液转移至事先预冷的电转杯中，电击参数：电压2000V，电阻200Ω，电击时间5ms。
C.电击结束后，立即加入900μ预冷的电转恢复培养基，转移至1.5ml EP管，冰浴5min后转移至30℃温箱静置培养1h。
D.室温3000rpm离心5min，弃900μL上清，剩余100μL重悬菌体沉淀，涂布到筛选固体培养基上，30℃培养24h，观察菌落形态。
(4)阳性重组质粒的鉴定
从固体培养板上挑取阳性菌落，接种于10ml GM17液体培养基，30℃静置培养过夜，提取质粒。以上述提取的阳性重组质粒为模板，以表中①②为上下游引物，进行PCR鉴定，PCR扩增结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳并观察结果。将PCR鉴定鉴定正确的质粒送去擎科生物科技有限公司测序，并将比对序列正确的阳性质粒分别命名为pNZ8149-Usp45-eltA-ACM、pNZ8149-Usp45-eltB-ACM、pNZ8149-Usp45-faeG-ACM，得到三株表面展示重组乳酸乳球菌菌株r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM、r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM、r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM。
另外，申请人利用上述三个抗原本身的分泌肽及来源于植物乳杆菌的LPxTG基序作为表面展示肽，同样优化后对上述三个抗原在乳酸乳球菌NZ3900中进行表达，结果表明其蛋白表达量小于分泌肽Usp45与表面展示肽ACM的组合，表明本发明的表面展示方案能够较为高效的对三个抗原进行展示。
实施例3：
复合型乳酸乳球菌载体口服疫苗的制备：
将筛选得到的r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM、r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM、r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM重组乳酸菌及对照菌株r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149(将空载体pNZ8149转入NZ3900中获得)分别接种于GM17固体培养基、；然后各挑取一株单克隆到培养基中静置培养24h；然后再按照1:25的比例传代于液体培养基中，当OD值检测在0.4时，加入诱导剂Nisin，使其终浓度为10ng/mL，诱导培养6h。12000×g离心2min，用预冷的PBS洗涤沉淀反复3次，用PBS按照1:10的比例对菌体进行重悬。超声破碎菌体，破碎后的菌液于4℃，12000g，离心10min后，弃上清，沉淀用PBS重悬。将5×蛋白Loading与r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM、r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM、r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM重组菌株及对照菌株r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149的重悬沉淀样品混匀，于100℃金属浴加热10min。以蛋白Marker作为对照检测蛋白分子量大小，泳道1是对照菌株r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149，泳道2分别为诱导后的三个重组菌株，进行Western blot检测，检测结果如图1所示，所有重组菌株诱导后均检测到正确的蛋白表达。
对三株重组乳酸乳球菌扩大培养及诱导表达1L，通过平皿进行活菌数测定，按照有效菌浓度为3×109cfu/mL进行1：1：1的比例混合，混合后3000rpm离心10min，PBS洗涤菌体1次，利用PBS重悬并进行10倍浓缩，获得乳酸乳球菌口服疫苗组合物。组合物中乳酸乳球菌的总浓度为3×1010cfu/mL，其中每个重组菌在体系中的终浓度为1×1010cfu/mL。
实施例4：
复合型乳酸乳球菌载体口服疫苗的小鼠实验：
小鼠免疫攻毒评价：
试验分组如下：选取3-4周龄C57BL/6J小鼠进行免疫实验，免疫组每只小鼠每次给予0.3毫升实施例3制备的口服疫苗，空白对照组与攻毒对照组给予0.3毫升PBS，载体对照组给予0.3毫升空白载体菌液(即r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149，与口服疫苗菌量相同)。每周在第1、2、3天进行灌胃，免疫4周，第29天使用ETEC(K88+)标准菌株C83549进行灌胃攻毒，攻毒剂量为1个半数致死量LD50。攻毒后记录各组小鼠的死亡情况，并于攻毒后第7天将存活小鼠处死并进行病理解剖，观察病变情况并采取肠道样品送至武汉百仟度生物科技有限公司进行HE染色病理切片的制作。
结果如图2所示，攻毒对照组小鼠在攻毒后2天内出现了50％的死亡，载体对照组小鼠在攻毒后3天内出现了50％的死亡，证实载体本身的作并不能阻止攻毒导致的小鼠的死亡。免疫组小鼠完全存活，没有出现死亡，表明口服疫苗免疫能够保护小鼠免于攻毒带来的死亡伤害。解剖结果与HE染色如图3所示，解剖结果可以看出，攻毒对照组及载体对照组小鼠小肠段出现了肠壁变薄，充满黄色液性内容物，攻毒对照组小肠内容物发红，肠道存在一定的出血。HE染色结果与解剖结果相同，攻毒对照组及载体对照组均出现明显的肠绒毛断裂、萎缩、上皮内淋巴细胞浸润、杯状细胞及潘氏细胞减少，固有层内浆细胞缺失，肌肉层变薄，而免疫组与空白组无显著差异，证明口服疫苗具有较好的保护性作用。
实施例5：
复合型乳酸乳球菌载体口服疫苗仔猪免疫攻毒评价：
实验分组如下：选取8日龄三元仔猪进行免疫实验，免疫组每只猪每次给予3毫升实施例3制备的口服疫苗，空白对照组与攻毒对照组给予3毫升PBS。从8日龄起连续3天进行灌胃，免疫3天，停3天为一个轮次，免疫3个轮次。免疫完成时仔猪为28日龄。仔猪29日龄时使用ETEC(K88+)标准菌株C83549进行灌胃攻毒，攻毒剂量为每头仔猪5×1010CFU(对于断奶阶段仔猪ETEC主要出现严重腹泻，但一般病死率不高，所以此处所选用5×1010CFU的剂量为前期验证全部仔猪腹泻剂量)。攻毒后记录各组仔猪的健康状况及腹泻情况，于攻毒后第7天将各组仔猪处死并进行病理解剖，观察病变情况并采取肠道样品送至武汉百仟度生物科技有限公司进行HE染色病理切片的制作。
结果如图4所示，免疫组仔猪在免疫期间体重增长速度显著高于对照组，4周免疫完成时仔猪体重与未免疫组仔猪相比提高29.7％，证明口服疫苗本身有一定的促进仔猪生长的作用。
图5为攻毒后第7天各组仔猪体重图，如图所示，免疫组仔猪体重显著高于对照组，证实免疫组仔猪对于攻毒产生了较好的保护性效果。
图6为攻毒后各组仔猪的临床症状及解剖图，如图所示，攻毒组仔猪出现了明显的腹泻情况，免疫组与空白对照组相同，均未出现水样黄色腹泻症状。肠道病变结果显示，攻毒组仔猪出现了明显的肠壁变薄，透明，充气，尤以小肠段最为严重，充满黄色液性及泡沫性内容物，免疫组与空白对照组肠道均未出现病变。肠系膜淋巴结结果显示，攻毒对照组出现了明显的肿胀、出血，免疫组及空白对照组均正常。综上所述，口服疫苗免疫能够保护仔猪免受产肠毒素型大肠杆菌K88型的侵害，表明口服疫苗有良好的保护效果。
申请人也尝试按照实施例1和2的抗原表面展示方法，采用另一株乳酸乳球菌MG1363及配套质粒pMG36e进行重组菌株的构建，成功得到了三株重组表面展示菌株，分别命名为r-L.Lactis--MG1363-pMG36e-Usp45-ltA-ACM、r-L.Lactis--MG1363-pMG36e-Usp45-ltB-ACM、r-L.Lactis--MG1363-pMG36e-Usp45-faeG-ACM，同样按照1：1：1的比例将三株重组菌株进行混合制成口服疫苗制剂，保持此口服疫苗复合物的浓度与本发明一致。将本发明制剂命名为口服疫苗A，将此制剂命名为口服疫苗B，同时进行了小鼠实验与仔猪免疫保护实验。结果表明，在小鼠免疫攻毒实验中，口服疫苗B不能抵抗ETEC(K88+)的LD50剂量攻毒，半数小鼠出现了死亡，与攻毒对照组没有差异；在仔猪免疫攻毒实验中，口服疫苗B免疫组仔猪与攻毒对照组没有差异，同样发生了仔猪黄白痢的典型症状，表明乳酸乳球菌MG1363作为本发明中三个抗原的载体，不能发挥出较好的免疫效果；同时乳酸乳球菌MG1363系统具有红霉素抗性基因，而本发明中的乳酸乳球菌NZ3900系统不存在抗性基因，为食品级表达系统，在应用中更安全。
Claims (3)
1. 一种乳酸菌混合物，所述的乳酸菌混合物包括表达SEQ ID NO.2的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM，表达SEQ ID NO. 4重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM和表达SEQ ID NO.6的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM；
所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltA-ACM，是将SEQ IDNO.1所示基因通过载体pNZ8149导入乳酸乳球菌NZ3900获得；
所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-ltB-ACM是将SEQ IDNO.3所示基因通过载体pNZ8149导入乳酸乳球菌NZ3900获得；
所述的重组乳酸乳球菌r-L.Lactis--NZ3900-pNZ8149-Usp45-faeG-ACM是将SEQ IDNO.5所示基因通过载体pNZ8149导入乳酸乳球菌NZ3900获得。
2.根据权利要求1所述的混合物，所述的三种重组乳酸乳球菌的有效菌含量的比例为1~2：1~2：1~2。
3.权利要求1所述的乳酸菌混合物在制备产肠毒素大肠杆菌口服疫苗中的应用，所述的产肠毒素大肠杆菌的血清型为K88。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311594151.XA CN117625505B (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | 用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311594151.XA CN117625505B (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | 用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117625505A CN117625505A (zh) | 2024-03-01 |
| CN117625505B true CN117625505B (zh) | 2024-05-03 |
Family
ID=90019316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311594151.XA Active CN117625505B (zh) | 2023-11-27 | 2023-11-27 | 用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117625505B (zh) |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560247A (zh) * | 2008-04-15 | 2009-10-21 | 上海市农业科学院 | 大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体作为疫苗黏膜免疫佐剂 |
| CN102796757A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体及其制备方法和应用 |
| CN102796756A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用 |
| CN102796755A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用 |
| CN103074291A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-05-01 | 大连大学 | 一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用 |
| CN105349565A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-02-24 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统及其构建方法和应用 |
| WO2019217967A1 (en) * | 2018-05-11 | 2019-11-14 | Kansas State University Research Foundation | Multiepitope fusion antigens for vaccination and methods of making and using such antigens |
| CN112522172A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-19 | 中南民族大学 | 大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG及应用 |
| CN112625989A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-09 | 中南民族大学 | 一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株及其应用 |
| CN116676246A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-01 | 华中农业大学 | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 |
-
2023
- 2023-11-27 CN CN202311594151.XA patent/CN117625505B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101560247A (zh) * | 2008-04-15 | 2009-10-21 | 上海市农业科学院 | 大肠杆菌热敏性肠毒素双突变体作为疫苗黏膜免疫佐剂 |
| CN102796757A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 在乳酸乳球菌表面展示表达幽门螺杆菌蛋白的载体及其制备方法和应用 |
| CN102796756A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用 |
| CN102796755A (zh) * | 2012-06-28 | 2012-11-28 | 郑州大学 | 一种乳酸乳球菌表达载体及其制备方法与应用 |
| CN103074291A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-05-01 | 大连大学 | 一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用 |
| CN105349565A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-02-24 | 中国人民解放军第三军医大学 | 一种外源基因敲入乳酸乳球菌快速筛选系统及其构建方法和应用 |
| WO2019217967A1 (en) * | 2018-05-11 | 2019-11-14 | Kansas State University Research Foundation | Multiepitope fusion antigens for vaccination and methods of making and using such antigens |
| CN112522172A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-03-19 | 中南民族大学 | 大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311-faeG及应用 |
| CN112625989A (zh) * | 2020-12-21 | 2021-04-09 | 中南民族大学 | 一种大肠杆菌Escherichia coli ETEC BE-311菌株及其应用 |
| CN116676246A (zh) * | 2023-06-16 | 2023-09-01 | 华中农业大学 | 重组乳酸乳球菌、益生菌制剂、构建方法、cECF表达方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Immunogenicity of recombinant Lactobacillus caseiexpressing F4 (K88) fimbrial adhesin FaeG in conjunction with a heat-labile enterotoxin A (LTAK63) and heat-labile enterotoxin B (LTB) of enterotoxigenic Escherichia coli as an oral adjuvant in mice;Meiling Yu 等;《Journal of Applied Microbiology》;20161117;第122卷;摘要，第506-515页 * |
| Qiang FENG 等.LT(K63/R72), a New Mutant of Escherichia coli Heat-labile Enterotoxin,Exhibits Characteristics More Similar to LT(K63) than LT(R72).《Acta Biochimica et Biophysica Sinica》.2005,第37卷(第2期),摘要，讨论部分. * |
| 表达大肠杆菌LTAK63与LTB蛋白重组干酪乳杆菌系统的构建及其黏膜佐剂活性的评价;陈超阳;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》;20131015(第10期);摘要，第2.1-2.2节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117625505A (zh) | 2024-03-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4989490B2 (ja) | 腸内細菌による生物活性物質の制御された産生および送達 | |
| CN107099496B (zh) | 融合表达鸡传染性法氏囊病毒vp2蛋白和沙门菌属外膜蛋白的重组乳酸菌菌株及其用途 | |
| CN114908029B (zh) | 一种ii型草鱼呼肠孤病毒vp6重组乳酸菌的构建和应用 | |
| Barrow et al. | Functional homology of virulence plasmids in Salmonella gallinarum, S. pullorum, and S. typhimurium | |
| CN111333713B (zh) | 一种表达抗菌肽基因的植物乳杆菌 | |
| CN111411054B (zh) | 一种表达抗菌肽基因的乳酸乳球菌 | |
| Marchart et al. | Protective immunity against pasteurellosis in cattle, induced by Pasteurella haemolytica ghosts | |
| EP2597151A2 (en) | Recombinant microorganisms, methods for preparing vaccine strains, antigens, and vector vaccine compositions of same, uses thereof, and related antibodies, diagnostic kit, and treatment and/or prophylactic methods | |
| KR101151004B1 (ko) | 소의 병원성 대장균의 부착인자가 형질전환된 약독화 살모넬라균 변이주 및 이를 포함하는 소의 대장균증 및 살모넬라균증의 예방 및 치료용 백신조성물 | |
| AU743654B2 (en) | LKTA deletion mutant of P. haemolytica | |
| CN117625505B (zh) | 用于产肠毒素大肠杆菌k88基因型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 | |
| CN110172433B (zh) | 一种产猪表皮生长因子的重组枯草芽孢杆菌工程菌及应用 | |
| CN117586935B (zh) | 用于产肠毒素大肠杆菌k99菌毛型的乳酸乳球菌载体口服疫苗及应用 | |
| CN109468256B (zh) | 整合四拷贝f18菌毛操纵子基因和双拷贝f4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法 | |
| CN109468255B (zh) | 整合单拷贝功能性f4菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用 | |
| CN110669710A (zh) | 重组乳酸乳球菌和罗非鱼无乳链球菌病疫苗 | |
| Fuller et al. | Genetic manipulation of gut microorganisms | |
| JP4716542B2 (ja) | ワクチンに使用するための生きた弱毒細菌 | |
| CN107312736B (zh) | 融合表达ibdv vp2蛋白和沙门菌属外膜蛋白rck的重组乳酸菌菌株及其用途 | |
| CN109504643B (zh) | 整合四拷贝功能性f18菌毛操纵子基因的益生菌克隆株、构建方法及应用 | |
| CN113046384A (zh) | 一种广谱抗病毒的重组沙门氏菌的构建方法 | |
| Jiao et al. | Immunization effect of recombinant Lactobacillus casei displaying Aeromonas veronii Aha1 with an LTB adjuvant in carp | |
| US20220064239A1 (en) | Cathelicidin-expressing lactic acid bacteria | |
| CN110760472A (zh) | 一株犬种粗糙型布鲁氏菌疫苗株 | |
| CN116731203B (zh) | 一种融合表达gcrv vp4和ltb的重组乳酸菌及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |