CN111333713B - 一种表达抗菌肽基因的植物乳杆菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表达抗菌肽基因的植物乳杆菌，属于基因工程技术领域。本发明通过优化CRAMP蛋白的核苷酸序列，并可结合Usp45信号肽促进CRAMP基因的分泌表达，使此乳酸菌表达系统成为一个食品级表达系统，可以连同菌体一起服用。本发明的重组植物乳杆菌可以作为一种具有良好产业前景的新型口服疫苗产品，对减轻肠道炎症起到积极的作用，对促进肠道健康发展具有重要的实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种表达抗菌肽基因的植物乳杆菌，属于基因工程技术领域。
背景技术
抗菌肽是植物、无脊椎动物和脊椎动物（包括人类）等多种宿主的先天免疫和防御的主要成分。Cathelicidins是一类主要的抗菌肽，其特征在于保守的阴离子N-末端前体序列，称为cathelin。cathelin序列的保守性表明该家族的各种成员是从共同祖先基因的复制和修饰进化而来的。CRAMP（Cathelicidin-Related AntiMicrobial Peptide）含有34个氨基酸（GLLRKGGEKIGEKLKKIGQKIKNFFQKLVPQPEQ），对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有强大的抗菌活性，但对人红细胞没有溶血活性。1mM的CRAMP能够直接导致大肠杆菌内膜的立即透化。抗CRAMP的抗血清在骨髓前体和中性粒细胞中显示出丰富的表达。与天蚕素A类似，50mM CRAMP未显示出对人红细胞的任何溶血活性。此外，研究发现CRAMP对一些致病真菌（例如Candia alicans和Aspergillus fumigatus）和肿瘤细胞具有强大的抗生素活性。体外研究证实CRAMP能显著抑制幽螺旋杆菌的增殖；而CRAMP缺失会导致小鼠肠胃病情加重，通过表达CRAMP的乳酸杆菌治疗患有肠胃病的CRAMP敲除小鼠则显著恢复肠胃病小鼠的抗菌效果和小鼠的生存率。
表达于肠道的CRAMP由于肠道屏障的破坏导致CRAMP水平显著下降，导致不能发挥其免疫效果，调节肠道菌群平衡，因此，选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达CRAMP的载体系统，使得CRAMP能够在肠道发挥作用，对调节肠道菌群平衡具有重要意义。
植物乳杆菌因其表面分子有高黏附性的特征，能使其成功地定植于动物机体的肠道内并成为在肠道内的优势菌群而发挥提高机体免疫力、促进营养物质吸收及维持肠道内菌群平衡等多种功能。所形成的生物学稳固屏障是维持肠道微生物平衡的重要保障。在表达外源基因方面上，植物乳杆菌表达系统作为一种原核表达系统，有以下优势：（1）作为食品级细菌，作为活载体疫苗安全性更高；（2）外源基因能被表达在细胞内，也能被表达展示在细胞表面或被分泌到细胞外；（3）安全、无内毒素，无需纯化表达的外源蛋白，直接同菌体服用；（4）能定植在机体黏膜表面（属于共同黏膜免疫系统），接种黏膜某一位点便可诱导全身的黏膜免疫反应；最后的也是最重要的，这种免疫方式能帮机体获得的更长久免疫记忆力，以便于长期抵御病原体的侵犯。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中口服CRAMP易被消化道酶降低、无法实现肠道靶向递送CRAMP、最大化实现其局部免疫调节效果的缺陷，提供一种分泌表达CRAMP蛋白重组植物乳杆菌及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种编码CRAMP蛋白的基因，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供携带所述基因的载体。
在一种实施方式中，所述载体为pMG36e或pNZ8148。
本发明的第三个目的是提供一种重组植物乳杆菌，其表达SEQ ID NO.1所示的基因。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌以植物乳杆菌FCQHC24L1为宿主。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌FCQHC24L1公开于2019年题为《不同生态位的植物乳杆菌的基因组及主要生理特性差异研究》的论文中，申请人承诺自申请日起20年内向合法途径下实施本发明的公众发放该菌株。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌以pMG36e或pNZ8148为载体表达所述编码CRAMP蛋白的基因。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌还引入了Usp45信号肽促进CRAMP蛋白的表达。
在一种实施方式中，所述Usp45通过linker与CRAMP基因连接，所述linker包含2个或更多个选自Gly和Ser的氨基酸残基。
在一种实施方式中，所述linker的氨基酸序列为GGGGS；编码所述linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，编码所述Usp45信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第四个目的是提供一种构建所述重组植物乳杆菌的方法，是将SEQ IDNO.2所示的编码CRAMP蛋白的基因与载体连接，再转化至植物乳杆菌细胞中；所述载体为pMG36e或pNZ8148。
在一种实施方式中，所述pMG36e或pNZ8148上连接有usp45信号肽。
在一种实施方式中，所述Usp45通过linker与CRAMP基因连接，所述linker的核苷酸序列为GGCGGTGGCGGCAGC。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
（1）合成SEQ ID NO.2所示的编码CRAMP蛋白的基因；
（2）将步骤（1）合成的基因连接至pMG36e中，获得重组质粒pMG36e-CRAMP；采用电转化法将pMG36e-CRAMP重组质粒导入植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1中，获得重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/ pMG36e- CRAMP。
在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
（1）合成SEQ ID NO.2所示的编码CRAMP蛋白的基因；
（2）将步骤（1）合成的基因连接至pMG36e中，获得重组质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP；采用电转化法将pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP重组质粒导入植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1中，获得重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/ pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP。
在一种实施方式中，所述电转化法的具体操作为：取L. plantarum FCQHC24L1的感受态细胞，加入重组质粒，混匀并转入电转化杯，电击后加入恢复培养基MRS培养基，冰浴后静置培养，平板筛选高拷贝转化子。
本发明的第五个目的是提供一种食用或药用组合物，含有前述任一所构建的植物乳杆菌。
在一种实施方式中，所述植物乳杆菌在组合物中的含量≥1×105CFU/mL或 1×105CFU/g。
在一种实施方式中，所述组合物为药物，含有药学上可接受的载体。
本发明的第六个目的是提供所述重组植物乳杆菌在制备疫苗中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是培养所述重组植物乳杆菌，再以植物乳杆菌的全培养物作为口服疫苗或口服疫苗的主要成分。
在一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：将重组植物乳杆菌/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP接种于MRS液体培养基静置培养过夜，以一定比例转接于含MRS液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，全培养物直接作为口服疫苗。
在一种实施方式中，所述静置培养的温度为28~30℃。
在一种实施方式中，所述转接是将L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP以体积比（1~10）:100的比例接种于MRS培养基。
在一种实施方式中，所述对数生长期的细菌培养液的OD值为0.4~0.6。
在一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：将L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP重组菌以（1~10）:100的体积比接种于含有MRS的培养基，继续培养2~3 h至细菌进入对数生长期（OD600=0.4~0.6）；培养至重组菌的浓度达1012CFU/mL数量级，收集诱导后的全培养物作为口服疫苗。
本发明的第七个目的是提供一种可预防急性结肠炎的口服疫苗。
在一种实施方式中，所述口服疫苗通过如下方法制备：培养所述重组植物乳杆菌，再以植物乳杆菌的全培养物作为口服疫苗或口服疫苗的主要成分。
在一种实施方式中，所述口服疫苗可采用灌胃或饲喂的方式使用。
本发明还要求保护所述植物乳杆菌在制备预防或治疗急性结肠炎的药物中的应用。
有益效果：（1）本发明提供了一段优化的编码CRAMP蛋白的基因，可以提高CRAMP蛋白在乳酸菌中的表达量；
（2）本发明提供了一种分泌表达小鼠抗菌肽CRAMP蛋白重组植物乳杆菌的制备方法，即采用植物乳杆菌和pMG36e及pNZ8148表达系统，并添加Usp45信号肽来进行CRAMP基因的分泌表达，使CRAMP蛋白的表达量可达20 ng/μL甚至更高；
（3）本发明将CRAMP蛋白在食品级表达系统中表达，加上植物乳杆菌作为益生菌的益生特性，使得此乳酸菌表达系统成为一个食品级表达系统，可以使重组菌菌体可直接用于口服疫苗的制备。
（4）本发明制备得到的含重组植物乳杆菌的疫苗可针对性调节肠道菌群紊乱，有助于肠道菌群的调节以及肠道免疫应答与维持，经动物实验证实，本发明制备的口服疫苗可刺激小鼠并引起较强的细胞免疫应答，可以作为一种具有良好产业前景的新型口服疫苗产品，对减轻肠道炎症起到积极的作用，对促进肠道健康发展具有重要的实践意义。
附图说明
图1为CRAMP和Usp45-Linker-CRAMP基因片段的PCR扩增结果；1为DL2000 DNAMarker；2-5为CRAMP基因片段的PCR扩增，6-9为Usp45-Linker-CRAMP基因片段的PCR扩增；
图2为重组大肠杆菌E.coli MC1061/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP的PCR鉴定结果，1为DL2000 DNA Marker，2-3为重组大肠杆菌E.coli MC1061/pMG36e-CRAMP的PCR鉴定，4-5为重组大肠杆菌E.coli MC1061/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP的PCR鉴定；
图3为重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ81848-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1 L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的PCR鉴定结果；1为DL2000 DNAMarker；2为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP中CRAMP的PCR鉴定；3为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP中CRAMP的PCR鉴定；4为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP中Usp45-Linker-CRAMP的PCR鉴定； 5为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的PCR鉴定；
图4为重组植物乳杆菌中CRAMP的免疫印迹结果；1为蛋白Marker；2为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP菌体中CRAMP的表达量；3为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP上清中CRAMP的表达量；4为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ81848-CRAMP菌体中CRAMP的表达量；5为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ81848-CRAMP上清中CRAMP的表达量；6为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP菌体中CRAMP的表达量；7为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP上清中CRAMP的表达量；8为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP菌体中CRAMP的表达量；9为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP上清中CRAMP的表达量；
图5为重组植物乳杆菌CRAMP的ELISA结果；
图6为现有技术用大肠杆菌表达CRAMP的表达情况；1为大肠杆菌裂解液；2为大肠杆菌裂解液上清；3为大肠杆菌裂解液沉淀；4为洗脱柱上的GST-CRAMP洗脱缓冲液；5为蛋白Marker；
图7为结肠炎模型建立期间各组小鼠体重的变化情况；
图8为各组小鼠结肠长度比较（A）及各组长度统计图（B）；
图9为结肠炎临床指标评分；
图10为结肠组织学病理学形态观察（A）及组织病理学评分（B）；
图11为qPCR测定肠道紧密连接蛋白（A）ZO-1、（B）ZO-2和（C）occludin的变化情况；
图12为qPCR测定炎症细胞因子（A）IL-6、（B）IL-1β、（C）TNF-α和（D）IL-10的表达情况；
图13为Western blot测定炎信号通路关键转录因子的磷酸化水平变化情况：（A）Western blot实验结果p-ERK、ERK、p-p38、p38、p-NF-kB和NF-kB条带图，（B）p-ERK/ERK灰度分析统计图，（C）p-p38/p38灰度分析统计图，（D）p-NF-kB/NF-kB灰度分析统计图，（E）CRAMP/β-actin灰度分析统计图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员熟悉的意义相同。
实施例1 重组质粒pMG36e-CRAMP的构建
（1）基因序列的密码子偏好性优化与合成：根据目的基因CRAMP基因的序列和表达载体pMG36e的特点，采用人工合成的方法将CRAMP基因的108bp的密码子优化序列送公司进行合成。Xbal-CRAMP-F为含有与pMG36e融合表达的酶切位点Xbal（TCTAGA）和信号肽CRAMP的5'端最初一段序列的上游引物，CRAMP-Sph1-R为带有酶切位点Sph1（GCATGC）的CRAMP基因反向引物。优化合成的CRAMP序列如SEQ ID NO：1所示；优化合成的Xbal-CRAMP-F，CRAMP-Sph1-R引物序列分别如SEQ ID NO：5~6所示。
（2）CRAMP基因片段的PCR扩增：以含优化合成的CRAMP基因为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/µL) 1µL, 0.3µM的引物Xbal-CRAMP-F、CRAMP-Sph1-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10× Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH2O补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR 反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约102bp的扩增条带，与预期结果一致（如图1)，回收的产物将作为连接模板用于获得添加Xbal-CRAMP-Sph1序列的完整片段。
（3）重组质粒pMG36e-CRAMP的构建：将步骤（2）中回收的PCR产物用Xbal、Sph1进行双酶切处理，胶回收大小约102bp的条带；以同样的方法对pMG36e空质粒进行双酶切，胶回收大小约3600bp的条带。分别取4µL双酶切后胶回收的CRAMP基因片段和1µL双酶切后胶回收的pMG36e空质粒，将CRAMP和pMG36e按照摩尔比6：1添加，并加入10×ligation buffer 2µL，T4 DNA Ligase (350 U/µL) 1µL，用ddH2O补至20µL，混匀后置于4℃条件下连接过夜，将连接产物转化E.coli MC1061感受态细胞，在含有5µg/mL红霉素 (Erythromycin, Er)的LB琼脂培养板中，37℃培养两天，然后挑取单个菌落进行PCR鉴定。PCR鉴定以待检菌落为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL， 0.3µM的引物Xbal-CRAMP-F， CRAMP-Sph1-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10x Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH20补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约102bp的扩增条带（图2），与预期结果一致，对检测阳性的菌液用质粒DNA抽提试剂盒进行质粒抽提，并进行双酶切鉴定和测序测定，即为获得了重组质粒pMG36e-CRAMP。
实施例2 重组质粒pNZ8148-CRAMP的构建
（1）基因序列的密码子偏好性优化与合成：根据目的基因CRAMP基因的序列和表达载体pMG36e的特点，采用人工合成的方法将CRAMP基因的108bp的密码子优化序列送公司进行合成。Sph1-CRAMP-F为含有与pMG36e融合表达的酶切位点Sph1（GCATGC）和信号肽CRAMP的5'端最初一段序列的上游引物，CRAMP-Xbal-R为带有酶切位点Xbal（TCTAGA）的CRAMP基因反向引物。优化合成的CRAMP序列如SEQ ID NO：1所示；优化合成的Sph1-CRAMP-F，CRAMP-Xbal-R引物序列分别如SEQ ID NO：7~8所示。
（2）CRAMP基因片段的PCR扩增：以含优化合成的CRAMP基因为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL, 0.3µM的引物Sph1-CRAMP-F、CRAMP-Xbal-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10× Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH2O补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR 反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约102bp的扩增条带，与预期结果一致（如图1)，回收的产物将作为连接模板用于获得添加Sph1-CRAMP-Xbal序列的完整片段。
（3）重组质粒pNZ8148-CRAMP的构建：将步骤（2）中回收的PCR产物用Xbal、Sph1进行双酶切处理，胶回收大小约102bp的条带；以同样的方法对pNZ8148空质粒进行双酶切，胶回收大小约3100bp的条带。分别取4µL双酶切后胶回收的CRAMP基因片段和1µL双酶切后胶回收的pMG36e空质粒，将CRAMP和pMG36e按照摩尔比6：1添加，并加入10×ligation buffer2µL，T4 DNA Ligase (350 U/µL) 1µL，用ddH2O补至20µL，混匀后置于4℃条件下连接过夜，将连接产物转化E.coli MC1061感受态细胞，在含有5µg/mL氯霉素 (Chloramphenicol,Ch)的LB琼脂培养板中，37℃培养两天，然后挑取单个菌落进行PCR鉴定。PCR鉴定以待检菌落为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL, 0.3µM的引物Xbal-CRAMP-F，CRAMP-Sph1-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10x Buffer for KOD-Plus- 5µL，用ddH20补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约102bp的扩增条带（图2），与预期结果一致，对检测阳性的菌液用质粒DNA抽提试剂盒进行质粒抽提，并进行双酶切鉴定和测序测定，即为获得了重组质粒pNZ8148-CRAMP。
实施例3重组质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP的构建
（1）基因序列的密码子偏好性优化与合成：根据目的基因CRAMP基因的序列和表达载体pMG36e的特点，以及为达到高效分泌表达的目的而增加的信号肽序列Usp45，采用人工合成的方法将Usp45-Linker-CRAMP基因的243bp的密码子优化序列送公司进行合成。Xbal-Usp45-Linker-CRAMP-F为含有与pMG36e融合表达的酶切位点Xbal和信号肽Usp45-Linker-CRAMP的5'端最初一段序列的上游引物，Usp45-Linker-CRAMP-Sph1-R为信号肽Usp45-Linker-CRAMP基因反向引物。同时还设计了用于重组质粒的PCR检测和测序的引物pNZ1及pNZ2，是以pMG36e空质粒的MCS上游和下游70~90bp左右的区域为依据设计的。优化合成的Usp45-Linker-CRAMP序列如SEQ ID NO：4所示；优化合成的Xbal-Usp45-Linker-CRAMP-F，Usp45-Linker-CRAMP-Sph1-R引物序列分别如SEQ ID NO：9~10所示。
（2）Usp45-Linker-CRAMP基因片段的PCR扩增：以含优化合成的Usp45-Linker-CRAMP基因为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL, 0.3µM的引物Xbal-Usp45-Linker-CRAMP-F、Usp45-Linker-CRAMP-Sph1-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10× Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH2O补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR 反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约243bp的扩增条带，与预期结果一致（如图1)，回收的产物将作为连接模板用于获得添加Usp45-Linker-CRAMP序列的完整片段。
（3）重组质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP的构建：将步骤（2）中回收的PCR产物用Sph1、Xbal进行双酶切处理，胶回收大小约243bp的条带；以同样的方法对pMG36e空质粒进行双酶切，胶回收大小约3600bp的条带。分别取4µL双酶切后胶回收的Usp45-Linker-CRAMP基因片段和1µL双酶切后胶回收的pMG36e空质粒，将Usp45-Linker-CRAMP和pMG36e按照摩尔比6：1添加，并加入10×ligation buffer 2µL，T4 DNA Ligase (350 U/µL) 1µL，用ddH2O补至20µL，混匀后置于4℃条件下连接过夜，将连接产物转化E.coli MC1061感受态细胞，在含有5µg/mL红霉素 (Erythromycin, Er)的LB琼脂培养板中，37℃培养两天，然后挑取单个菌落进行PCR鉴定。PCR鉴定以待检菌落为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL, 0.3µM的引物Xbal-Usp45-Linker-CRAMP-F，Usp45-Linker-CRAMP-Sph1-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10x Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH20补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约243bp的扩增条带（图2），与预期结果一致，对检测阳性的菌液用质粒DNA抽提试剂盒进行质粒抽提，并进行双酶切鉴定和测序测定，即为获得了重组质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP。
实施例4重组质粒pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的构建
（1）基因序列的密码子偏好性优化与合成：根据目的基因CRAMP基因的序列和表达载体pNZ8148的特点，以及为达到高效分泌表达的目的而增加的信号肽序列Usp45，采用人工合成的方法将Usp45-Linker-CRAMP基因的243bp的密码子优化序列送公司进行合成。Sph1-Usp45-Linker-CRAMP-F为含有与pNZ8148融合表达的酶切位点Xbal和信号肽Usp45-Linker-CRAMP的5'端最初一段序列的上游引物，Usp45-Linker-CRAMP-Xbal-R为信号肽Usp45-Linker-CRAMP基因反向引物。优化合成的Usp45-Linker-CRAMP序列如SEQ ID NO：2所示；优化合成的Sph1-Usp45-Linker-CRAMP-F，Usp45-Linker-CRAMP-Xbal-R引物序列分别如SEQ ID NO：11~12所示。
（2）Usp45-Linker-CRAMP基因片段的PCR扩增：以含优化合成的Usp45-Linker-CRAMP基因为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL, 0.3µM的引物Sph1-Usp45-Linker-CRAMP-F，Usp45-Linker-CRAMP-Xbal-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10× Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH2O补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR 反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约243bp的扩增条带，与预期结果一致（如图1)，回收的产物将作为连接模板用于获得添加Usp45-Linker-CRAMP序列的完整片段。
（3）重组质粒pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的构建：将步骤（2）中回收的PCR产物用Sph1、Xbal进行双酶切处理，胶回收大小约243bp的条带；以同样的方法对pNZ8148空质粒进行双酶切，胶回收大小约3100bp的条带。分别取4µL双酶切后胶回收的Usp45-Linker-CRAMP基因片段和1µL双酶切后胶回收的pMG36e空质粒，将Usp45-Linker-CRAMP和pMG36e按照摩尔比6：1添加，10×ligation buffer 2µL，T4 DNA Ligase (350 U/µL) 1µL，用ddH2O补至20µL，混匀后置于4℃条件下连接过夜，将连接产物转化E.coli MC1061感受态细胞，在含有5µg/mL氯霉素 (Chloramphenicol, Ch)的LB琼脂培养板中，37℃培养两天，然后挑取单个菌落进行PCR鉴定。PCR鉴定以待检菌落为模板，加入高保真DNA聚合酶KOD-Plus-(1.0U/ul) 1µL, 0.3µM的引物Sph1-Usp45-Linker-CRAMP-F，Usp45-Linker-CRAMP-Xbal-R各1.5µL，模板1.5µL，25mM MgSO4 2µL，2mM dNTPs 5µL，10x Buffer for KOD -Plus- 5µL，用ddH20补至50µL，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C后延伸10min。PCR反应完成，将产物进行1.0%琼脂糖凝胶观察与回收，可见大小约243bp的扩增条带（图2），与预期结果一致，对检测阳性的菌液用质粒DNA抽提试剂盒进行质粒抽提，并进行双酶切鉴定和测序测定，即为获得了重组质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP。
实施例5 含CRAMP基因的分泌型重组植物乳杆菌的构建
（1）植物乳杆菌电转化感受态细胞的制备：将冻存的L. plantarum FCQHC24L1植物乳杆菌划MRS平板复苏，挑取单个菌落在MRS液体培养辈中30℃培养过夜，以1：100的比例接入50 mL新的MRS液体培养基30℃培养，监测OD500至0.3-0.4，迅速置冰上冷却，4℃ 6000×g离心20 min，弃上清；用50 mL预冷的0.5M蔗糖、10%甘油溶液重悬菌体，4℃ 6000×g离心20min，弃上清；用25mL预冷的0.5M蔗糖、10%甘油、50mM EDTA溶液重悬菌体，4℃ 6000×g离心15min，弃上清；再用15 mL预冷的0.5M蔗糖、10%甘油溶液重悬菌体，4℃ 6000X g离心15 min，弃上清；最后用500 µL预冷的0.5M蔗糖、10%甘油溶液重悬菌体，即为植物乳杆菌感受态细胞，50µL每管分装，-80℃保存备用。
（2）植物乳杆菌的电击转化及转化子的PCR鉴定：各取50µL L. plantarum FCQHC24L1感受态细胞，冰浴上融解，分别加入1µL实施例1构建的重组质粒pMG36e-CRAMP、实施例2构建的重组质粒pNZ8148-CRAMP、实施例3构建的重组质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP和实施例4构建的重组质粒pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP，轻轻混匀；分别将以上混合物转入冰预冷的2mm电激杯，迅速给予一个单脉冲，参数设置为2kV，25 F，200Q，电击后立即轻柔加入1mL冰预冷的恢复培养基MRS培养基，再分别将菌液全部吸入一灭菌离心管，盖紧管盖，冰浴5min后30℃静置培养2h；分别将含质粒pMG36e-CRAMP或质粒pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP的菌液分为10µL、l00µL、900µL均匀涂布于含有5ug/mL红霉素的MRS平板，分别将含质粒pNZ8148-CRAMP或质粒pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的菌液分为10µL、l00µL、900µL均匀涂布于含有 5ug/mL氯霉素的M17平板，30℃静置培养1-2天。挑取单个菌落，取菌落进行PCR鉴定，PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，可见约243bp的扩增条带（图3），阳性重组表达菌分别命名为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP和L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP。
实施例6 含CRAMP基因的分泌型重组植物乳杆菌体外诱导表达
将重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP和重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP分别以1:100的比例接种于含有5ug/mL红霉素的MRS液体培养基，将重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP和重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP分别以1:100的比例分别接种于含有5ug/mL氯霉素的MRS液体培养基，30℃静置培养过夜；分别将过夜培养物以1:50的比例接种于10mL 含有对应抗生素的液体培养基，继续培养约2.5h至细菌进入对数生长期(OD500=0.4~0.6)，分别向重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP和重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的培养体系中加入40ng/mL的乳酸链球菌素（nisin）诱导4h，4℃ 10000rpm离心5min，收集培养上清，经SDS-PAGE电泳并进行WesternBlot分析，结果显示，L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e -CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148 -CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP和L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP培养上清中检测到17KDa的目的条带（如图4)，表明目的基因已经得到分泌表达。
实施例8植物乳杆菌制备疫苗中的应用
L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e -CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148 -CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP和L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP重组植物乳杆菌口服疫苗的制备：将重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e -CRAMP和重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP以1：100的体积比分别接种于MRS液体培养基，将重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148 -CRAMP和重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP以1：100的体积比分别接种于的MRS液体培养基，30℃静置培养过夜，将过夜培养物以1:100的比例接种于10mL 含有相应抗生素的MRS液体培养基，继续培养约2.5h至细菌进入对数生长期（采用梯度稀释涂板测定重组菌的浓度达1012CFU/mL数量级），此时的全培养物直接作为口服疫苗使用，或离心收集菌体，将菌体作为口服疫苗的主要成分。
实施例9 植物乳杆菌在预防急性结肠炎中的应用
将实施例7制备的分别含重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP、L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP和L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP全培养物的口服疫苗用于预防急性结肠炎。
将84只6~8周龄周龄的雄性Balb/c小鼠随机分为10组饲养，每组10只，第1组为生理盐水对照组，第2组为急性结肠炎模型组，第3组为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e组，第4组为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148组，第5组为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP组，第6组为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP组，第7组为L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP组，第8组为L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP组。预饲一周后，采用灌胃的方式在3%DSS饮水7天后用含不同重组菌全培养物的口服疫苗进行口服免疫，连续免疫4天，剂量为160µL/只。然后连续10天处死小鼠，对肠道屏障及菌群变化进场测定，结果显示（图7~13）：
（1）各组小鼠第10天的小鼠比第7天平均体重相比：第1组增重1.084g，第2组下降2.85688g，第3组下降1.89644g，第4组下降1.73336g，第5组下降0.61004g，第6组下降0.36816g，第7组增重0.52568g，第8组增重1.23516g；
（2）各组第10天的平均结肠长度为：第1组为9.66厘米，第2组为5.32厘米，第3组为6.32厘米，第4组为6.36厘米，第5组为7.18厘米，第6组为7.44厘米，第7组为8.2厘米，第8组为8.32厘米；
（3）各组在第10天时DAI评分结果为：第1组0.2，第2组为7.2，第3组为6.6，第4组为6.0，第5组为4.6，第6组4.8，第7组为3.6，第8组为3.6；
（4）各组结肠形态学评分结果为：第1组0.2，第2组为3.8，第3组为3.2，第4组为3.2，第5组为2.6，第6组2.6，第7组为2.0，第8组为2.0；
（5）各组结肠紧密连接蛋白变化情况为：第2组与第1组相比：ZO-1(p<0.01)、ZO-2(p<0.0001)和occludin(p<0.0001)表达量显著下降；第5~6组与第2组相比：ZO-1(p<0.05)和occludin(p<0.05)表达量显著增加，ZO-2无显著差异；第7~8组与第2组相比：ZO-1(p<0.01) 、ZO-2(p<0.01)和occludin(p<0.05)表达量显著增加；
（6）各组结肠炎症因子变化情况为：第2组与第1组相比：IL-6(p<0.0001)、IL-1β(p<0.0001)、TNF-α(p<0.0001)显著上升，IL-10(p<0.0001)显著下降；第5~8组与第2组相比：IL-6(p<0.05)、IL-1β(p<0.05)、TNF-α(p<0.05)显著下降，IL-10(p<0.05)显著上升；
（7）各组结肠关键转录因子蛋白水平变化为：第2组与第1组相比：p-ERK/ERK(p<0.0001)、p-p38/p38(p<0.0001)和p-NF-kB/NF-kB(p<0.0001)显著增加；第5组和第2组相比：p-ERK/ERK(p<0.05) 显著降低，p-p38/p38(p>0.05和p-NF-kB/NF-kB(p>0.05)无显著差异性；第6组和第2组相比：p-ERK/ERK(p<0.01)、p-p38/p38(p<0.05)和p-NF-kB/NF-kB(p<0.05)显著降低；第7~8组和第2组相比：p-ERK/ERK(p<0.01)、p-p38/p38(p<0.05)和p-NF-kB/NF-kB(p<0.05)显著降低；
（8）各组结肠CRAMP蛋白表达情况：第2组和第1组相比CRAMP蛋白表达显著下降(p<0.0001)，第5~8组和第2组相比CRAMP蛋白表达显著增加(p<0.05)；
以上结果表明，口服重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP全培养物的第5组，口服重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP全培养物的第6组，口服重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP全培养物的第7组，口服重组菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP全培养物的第8组均具有很好的恢复结肠炎小鼠的体重，恢复结肠长度，减轻结肠炎症，抑制炎症细胞因子分泌，抑制炎症信号通路的激活，恢复肠道屏障，从而治疗结肠炎，且第7组L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP组，第8组L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP组有更好的治疗效果。
对比例1 含CRAMP基因的分泌型重组植物乳杆菌的构建
对现有技术中含CRAMP基因的分泌型重组乳酸乳球菌作为对照，其表达的CRAMP基因未经过密码子优化(GGACTTCTCCGCAAAGGTGGGGAGAAGATTGGTGAAAAGCTTAAGAAAATTGGCCAGAAAATTAAGAATTTTTTTCAGAAACTTGTACCTCAGCCAGAG)，且无Usp45信号肽促进CRAMP在细胞外分泌，以及不能促进Usp45信号肽和CRAMP基因在胞内自剪切作用，上清中分泌的CRAMP蛋白含量低，表达产物约为1.5 ng/µL。
将实施例5构建的重组菌与对比例1的重组菌表达CRAMP的能力进行比较，经ELISA检测发现（图5），无Usp45诱导分泌的重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-CRAMP和L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-CRAMP胞外CRAMP蛋白表达量约为10 ng/µL，比对比例1的重组菌胞外蛋白分泌量高6~8倍；重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/pNZ8148-Usp45-Linker-CRAMP的CRAMP蛋白表达量约为20ng/µL，比对比例1的表达量（1.5ng/µL）高13倍；重组植物乳杆菌L. plantarum FCQHC24L1/pMG36e-Usp45-Linker-CRAMP的CRAMP蛋白胞外分泌量高于50 ng/µL，比对比例1在相同条件下的表达量（1.5ng/µL）高30倍。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种表达小鼠抗菌肽基因的植物乳杆菌
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
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ggtctgctgc gtaaaggcgg cgagaagatc ggcgagaagc tgaagaagat cggccagaag 60
atcaagaact tcttccagaa actggtgccg cagccggaat aa 102
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgaaaaaaa aaatcatcag cgcgattctg atgagcaccg ttattctgag tgccgccgcc 60
ccactgagtg gcgtttatgc cgacaccaac agcgatatcg ccaaacaaga tgcc 114
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<213> 人工序列
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ggcggtggcg gcagc 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gcatgcatga aaaaaaaaat catcagcgcg attctgatga gcaccgttat tctgagtgcc 60
gccgccccac tgagtggcgt ttatgccgac accaacagcg atatcgccaa acaagatgcc 120
ggtggtggtg gtagcggtct gctgcgtaaa ggcggcgaga agatcggcga gaagctgaag 180
aagatcggcc agaagatcaa gaacttcttc cagaaactgg tgccgcagcc ggaataatct 240
aga 243
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Claims (17)
1.一种编码CRAMP蛋白的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.携带权利要求1所述基因的载体。
3.一种植物乳杆菌，其特征在于，表达权利要求1所述编码CRAMP蛋白的基因。
4.根据权利要求3所述植物乳杆菌，其特征在于，以植物乳杆菌FCQHC24L1为宿主，以pMG36e或pNZ8148为载体。
5.根据权利要求3或4所述的植物乳杆菌，其特征在于，以Usp45信号肽促进CRAMP蛋白的表达。
6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌，其特征在于，所述Usp45通过linker与CRAMP基因连接，所述linker包含2个或更多个选自Gly和Ser的氨基酸残基。
7.一种构建权利要求3~5任一所述植物乳杆菌的方法，其特征在于，将SEQ ID NO.1所示的编码CRAMP蛋白的基因与载体连接，再转化至植物乳杆菌细胞中；所述载体为pMG36e或pNZ8148。
8.含有权利要求3~6任一所述植物乳杆菌的食用或药用组合物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述植物乳杆菌在组合物中的含量≥1×105CFU/mL或 1×105CFU/g。
10.根据权利要求8所述的药用组合物，其特征在于，还含有药学上可接受的载体。
11.一种疫苗，其特征在于，含有权利要求3~6任一所述的植物乳杆菌或所述植物乳杆菌的纯培养物。
12.根据权利要求11所述的疫苗，其特征在于，以植物乳杆菌的全培养物作为口服疫苗，或口服疫苗的主要成分。
13.根据权利要求12所述的疫苗，其特征在于，所述口服疫苗按如下方法制备：将权利要求3~6任一所述的植物乳杆菌接种于MRS液体培养基静置培养过夜，以一定比例转接于含MRS液体培养基，继续培养至细菌进入对数生长期，全培养物直接作为口服疫苗。
14.根据权利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述静置培养的温度为28~30℃。
15.根据权利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述转接是将所述植物乳杆菌以体积比（1~10）:100的比例接种于MRS培养基。
16.根据权利要求13所述的疫苗，其特征在于，所述对数生长期的细菌培养液的OD值为0.4~0.6。
17.权利要求3~6任一所述的植物乳杆菌在制备可引入肠道的产品中的应用，其特征在于，所述产品具有如下至少一种功能：
（a）抑制肠道炎症；
（b）重塑肠黏膜屏障；
（c）改善肠黏膜通透性；
（d）降低炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。
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