CN114957437B - 一种leap-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种LEAP‑2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用，属于分子生物学领域，本发明提供的LEAP‑2重组蛋白和重组乳酸乳球菌解决了现有技术中肥胖治疗效果较差的问题，本发明成功构建了LEAP‑2的乳酸乳球菌表达体系，通过特定浓度的Nisin诱导成功表达了LEAP‑2；并且得到的重组菌液通过在肠道中的定植，可源源不断诱导表达LEAP‑2，结果显示其能够对高糖高脂饲喂小鼠摄食量及体重起到调节作用。

Description

一种LEAP-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种LEAP-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用。

背景技术

肥胖以成为全球范围内普遍存在的一种疾病，降低人们生活质量，威胁人们生命健康。中度或严重肥胖症患者服用治疗药物主要包括二甲双胍、GLP-1相关的药物及氯卡色林等，副作用风险较大，选择手术治疗，其长远效果的反弹率、对人体有无潜在危害目前还不清楚。

Ⅱ型肝脏表达抗菌肽(Liver-expressedantimicrobialpeptide-2，LEAP-2)是在肝脏中特异性高表达的第二类抗菌肽，最初从人血超滤液中分离获得，对特定的细菌和真菌具有抑制效果。有研究发现，LEAP-2可作为胃饥饿素受体(Growthhormonesecretagoguereceptor1a，GHS-R1a)的反向激动剂和拮抗剂。当机体肥胖时，会激活LEAP-2的高表达，LEAP-2与胃饥饿素竞争性结合受体上的位点，抑制“刺鼠相关蛋白/神经肽Y”(Agouti-relatedprotein/NeuropeptideY，AgRP/NPY)神经元的激活，实现降低食欲，控制体重增长。但是由于LEAP-2的半衰期短以及无法耐受消化道蛋白酶的作用，目前的研究都是在动物模型体内通过注射的方式探索LEAP-2对食物摄入量的影响，如何将其制备为口服产品并没有相关报道。

NICE系统是基于L.lactis自动调节nisin生物合成机制的一种基因表达系统，也是乳酸菌中唯一的商业表达系统。常利用NICE系统调节各种蛋白质，但是采用NICE系统表达重组蛋白可能会出现菌株生长速度慢、达到最大蛋白质产量所需的时间较长、表达水平较低等问题，这使得该表达系统不能很好地对外源蛋白进行分泌；L.lactis拥有一种独特的的胞外管家蛋白酶htrA，它参与菌株的代谢过程，包括原肽的加工、天然蛋白的成熟和重组蛋白的降解等，容易造成L.lactis表达系统分泌的外源蛋白的降解。因此，NICE系统如何正确且高效表达LEAP-2，尚未见到相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种LEAP-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用，以克服现有技术中肥胖治疗效果较差的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种LEAP-2重组蛋白，所述LEAP-2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了编码上述LEAP-2重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种LEAP-2的重组表达载体，所述重组表达载体包括初始载体和上述的编码LEAP-2重组蛋白的基因。

优选的，所述初始载体为pNZ8149载体，所述编码LEAP-2重组蛋白的基因克隆至所述重组载体的NcoI与XbaI酶切位点之间。

本发明还提供了一种表达上述LEAP-2重组蛋白的重组乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌中转化有上述LEAP-2重组表达载体。

优选的，所述重组乳酸乳球菌通过Nisin进行诱导表达。

优选的，所述Nisin的浓度为0.5～1.5ng/mL。

本发明还提供了重组乳酸乳球菌在制备改善肥胖的产品中的应用。

优选的，所述改善肥胖的产品中重组乳酸乳球菌的浓度为3×10¹³～8×10¹³CFU/ml。

本发明的技术效果和优点：本发明成功构建了LEAP-2的乳酸乳球菌表达体系，通过特定浓度的Nisin诱导成功表达了LEAP-2；并且得到的重组菌液通过在肠道中的定植，可源源不断诱导表达LEAP-2，结果显示其能够对高糖高脂饲喂小鼠摄食量及体重起到调节作用。

附图说明

图1为PCR鉴定电泳结果；

图2为Westernblotting检测表达结果；

图3为小鼠体重增长率结果。

具体实施方式

本发明提供了一种LEAP-2重组蛋白，所述LEAP-2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了编码上述LEAP-2重组蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

本发明还提供了一种LEAP-2的重组表达载体，所述重组表达载体包括初始载体和上述的编码LEAP-2重组蛋白的基因，所述初始载体优选为pNZ8149载体，所述编码LEAP-2重组蛋白的基因优选克隆至所述重组载体的NcoI与XbaI酶切位点之间。

本发明还提供了一种表达上述LEAP-2重组蛋白的重组乳酸乳球菌，所述重组乳酸乳球菌中转化有上述LEAP-2重组表达载体，所述重组乳酸乳球菌优选通过Nisin进行诱导表达，所述Nisin的浓度优选为0.5～1.5ng/mL，进一步优选为0.8～1.2ng/mL。

本发明还提供了重组乳酸乳球菌在制备改善肥胖的产品中的应用，本发明对所述改善肥胖的产品的种类和剂型并无特殊要求，能够保留重组乳酸乳球菌活性即可；所述改善肥胖的产品中重组乳酸乳球菌的浓度优选为3×10¹³～8×10¹³CFU/ml，进一步优选为4×10¹³～6×10¹³CFU/ml。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1设计LEAP-2编码基因

选择人LEAP-2成熟肽基因序列进行截取，得到LEAP-2基因目的片段，(核苷酸序列：ATGGGTCATCATCATCATCACCATATGACACCGTTTTGGC GTGGCGTTAGCCTGCGTCCGATTGGCGCAAGCTGTCGCGATGATAGCG AATGTATTACCCGTCTGTGTCGCAAACGCCGCTGCTCACTGAGCGTTGCCCAGGAATAA，如SEQ ID NO.2所示)，此步由通用生物系统(安徽)有限公司完成。

实施例2构建重组表达载体

制备pNZ8149线性化载体，使用高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107，天根)提取pNZ8149质粒，提取过程如下：

①取过夜培养的pNZ8149菌液以1：100的比例接种于10mLElliker培养液中，30℃静置过夜培养。4℃12000r离心15min，弃去上清；使用0.9％生理盐水洗涤2次。

②加入500μLP1(0.03MTris+0.03MMgCl₂+0.05M蔗糖+20mg/mL溶菌酶+1％RNaseA，PH＝8)，37℃裂解60min；

③加入500μLP2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；

④加入500μLP3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时会出现絮状沉淀，室温放置10min，12000r离心10min；

⑤将上一步收集的上清液分次加入过滤柱CS，12000r离心2min，滤液收集在干净的2mL离心管中；

⑥向滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下颠倒混匀后转移到吸附柱CP4中；

⑦室温12000r离心1min，倒掉收集管中的废液；

⑧向CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000r离心1min，倒掉废液；

⑨向CP4中加入500μL漂洗液PW，室温静置4min，12000r离心1min，倒掉废液；

⑩将CP4，12000r离心2min，彻底去除漂洗液，在超净工作台中吹干残余的漂洗液(4min)；

将CP4置于一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中间滴加50μLTB，室温放置2min，12000r离心1min，-20℃保存备用。

采用限制性内切酶进行消化，条件如下：Quickbuffer：1μL、pNZ8149：3μL、NcoI：0.3μL、XbaI：0.3μL、ddH₂O：5.4μL、Totalvolume：10μL，于37℃消化30min，得到pNZ8149线性化载体。

将实施例1中得到的LEAP-2基因目的片段与pNZ8149线性化载体进行同源重组反应，连接条件：T4连接酶：0.5μL、T4buffer：1μL、线性化载体：100ng、目的片段与载体摩尔比5:1、加ddH₂O至终体积10μL，混匀，16℃反应过夜，得到重组表达载体(核苷酸序列：GGATCTAGTCTTAT AACTATACTGACAATAGAAACATTAACAAATCTAAAACAGTCTTAATTCTATCTTGAGAAAGTATTGGTAATAATATTATTGTCGATAACGCGAGCATAATAAACGGCTCTGATTAAATTCTGAAGTTTGTTAGATACAATGATTTCGTTCGAAGGAACTACAAAATAAATTATAAGGAGGCACTCACCATGGGTCATCATCATCATCACCATATGACACCGTTTTGGCGTGGCGTTAGCCTGCGTCCGATTGGCGCAAGCTGTCGCGATGATAGCGAATGTATTACCCGTCTGTGTCGCAAACGCCGCTGCTCACTGAGCGTTGCCCAGGAATAATCTAGAGAGCTCAAGCTTTCTTTGAACCAAAATTAGAAAACCAAGGCTTGAAACGTTCAATTGAAATGGCAATTAAACAAATTACAGCACGTGTTGCTTTGATTGATAGCCAAAAAGCAGCAGTTGATAAAGCAATTACTGATATTGCTGAAAAATTGTAATTTATAAATAAAAATCACCTTTTAGAGGTGGTTTTTTTATTTATAAATTATTCGTTTGATTTCGCTTTCGATAGAACAATCAAATCGTTTCTGAGACGTTTTAGCGTTTATTTCGTTTAGTTATCGGCATAATCGTTAAAACAGGCGTTATCGTAGCGTAAAAGCCCTTGAGCGTAGCGTGGCTTTGCAGCGAAGATGTTGTCTGTTAGATTATGAAAGCCGATGACTGAATGAAATAATAAGCGCAGCGTCCTTCTATTTCGGTTGGAGGAGGCTCAAGGGAGTTTGAGGGAATGAAATTCCCTCATGGGTTTGATTTTAAAAATTGCTTGCAATTTTGCCGAGCGGTAGCGCTGGAAAATTTTTGAAAAAAATTTGGAATTTGGAAAAAAATGGGGGGAAAGGAAGCGAATTTTGCTTCCGTACTACGACCCCCCATTAAGTGCCGAGTGCCAATTTTTGTGCCAAAAACGCTCTATCCCAACTGGCTCAAGGGTTTGAGGGGTTTTTCAATCGCCAACGAATCGCCAACGTTTTCGCCAACGTTTTTTATAAATCTATATTTAAGTAGCTTTATTTTTGTTTTTATGATTACAAAGTGATACACTAATTTTATAAAATTATTTGATTGGAGTTTTTTAAATGGTGATTTCAGAATCGAAAAAAAGAGTTATGATTTCTCTGACAAAAGAGCAAGATAAAAAATTAACAGATATGGCGAAACAAAAAGATTTTTCAAAATCTGCGGTTGCGGCGTTAGCTATAGAAGAATATGCAAGAAAGGAATCAGAACAAAAAAAATAAGCGAAAGCTCGCGTTTTTAGAAGGATACGAGTTTTCGCTACTTGTTTTTGATAAGGTAATTATATCATGGCTATTAAAAATACTAAAGCTAGAAATTTTGGATTTTTATTATATCCTGACTCAATTCCTAATGATTGGAAAGAAAAATTAGAGAGTTTGGGCGTATCTATGGCTGTCAGTCCTTTACACGATATGGACGAAAAAAAAGATAAAGATACATGGAATAGTAGTGATGTTATACGAAATGGAAAGCACTATAAAAAACCACACTATCACGTTATATATATTGCACGAAATCCTGTAACAATAGAAAGCGTTAGGAACAAGATTAAGCGAAAATTGGGGAATAGTTCAGTTGCTCATGTTGAGATACTTGATTATATCAAAGGTTCATATGAATATTTGACTCATGAATCAAAGGACGCTATTGCTAAGAATAAACATATATACGACAAAAAAGATATTTTGAACATTAATGATTTTGATATTGACCGCTATATAACACTTGATGAAAGCCAAAAAAGAGAATTGAAGAATTTACTTTTAGATATAGTGGATGACTATAATTTGGTAAATACAAAAGATTTAATGGCTTTTATTCGCCTTAGGGGAGCGGAGTTTGGAATTTTAAATACGAATGATGTAAAAGATATTGTTTCAACAAACTCTAGCGCCTTTAGATTATGGTTTGAGGGCAATTATCAGTGTGGATATAGAGCAAGTTATGCAAAGGTTCTTGATGCTGAAACGGGGGAAATAAAATGACAAACAAAGAAAAAGAGTTATTTGCTGAAAATGAGGAATTAAAAAAAGAAATTAAGGACTTAAAAGAGCGTATTGAAAGATACAGAGAAATGGAAGTTGAATTAAGTACAACAATAGATTTATTGAGAGGAGGGATTATTGAATAAATAAAAGCCCCCCTGACGAAAGTCGACATGGACTGATAAAGTATAGTAAAAACATAAAACGGAGGATATTGTTGTGAACAGAGAAGAGATGACTCTCTTAGGGTTTGAAATTGTTGCTTATGCTGGAGATGCTCGCTCTAAGCTTTTAGAAGCGCTTAAAGCGGCTGAAAATGGTGATTTCGCTAAGGCAGATAGTCTTGTAGTAGAAGCAGGAAGCTGTATTGCAGAGGCTCACAGTTCTCAGACAGGTATGTTGGCTCGAGAAGCTTCTGGGGAGGAACTTCCATACAGTGTTACTATGATGCATGGTCAGGATCACTTGATGACTACGATCTTATTAAAAGATGTGATTCATCACCTCATCGAACTTTATAAAAGAGGAGCAAAGTAATTAATGCATAAACTCATTGAACTTATTGAGAAAGGGAAACGACGGATCA，如SEQ ID NO.3所示)。

实施例3构建重组乳酸乳球菌

3.1感受态细胞的制备

取过夜培养的乳酸乳球菌NZ3900(购自MoBiTecGmbH，Germany)以1：100的比例接种于50mLGSGM17培养液中，30℃静置培养过夜后全部接种于400mLGSGM17培养液中，静置培养至OD600nm＝0.3，收集菌体沉淀；使用冰冷的400mL的洗液I(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬菌体，冰上静置15min；4℃6000×g离心20min，弃去上清；使用冰冷的200mL洗液II(0.5M蔗糖+10％甘油+50mMEDTA)重悬菌体，冰上静置15mi n；4℃6000×g离心20min，弃去上清；再次使用冰冷的洗液I(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬菌体，同样冰上静置15min；4℃6000×g离心20min，弃去上清；将残留液体彻底吸干后，加入4mL冰冷的洗液I(0.5M蔗糖+10％甘油)重悬沉淀，置于冰上，获得感受态细胞。

3.2电转化制备表达LEAP-2的重组乳酸乳球菌

取100μL感受态细胞置于冰水混合物上融化，加入实施例2中获得的重组表达载体10μL，冰上静置20min；小心吸入2mm电击杯，确保无气泡，冰上静置5min之后拿出电击杯并彻底擦干电击杯外部水分，在2500V，25μF，200Ω条件下进行电转，冰上静置5min后加入1mL恢复培养基，吹打混匀后吸入无菌1.5mLEP管中，30℃静置1h以恢复温度。最后取出产物4000×g离心5min，弃去部分上清，留100μL重悬沉淀，获得能够表达LEAP-2的重组乳酸乳球菌。

实验例1PCR鉴定重组表达质粒

将重组乳酸乳球菌的菌体沉淀重悬之后涂布于M17平板中，30℃培养过夜；挑取黄色菌落接种到含0.5％乳糖的M17培养基中，30℃静置培养至浑浊，提取质粒进行PCR鉴定，反应体系和反应程序如下：

反应体系：

2×PhantaMaxMasterMix：7.5μL

上游引物F(核苷酸序列：CGAAGGAACTACAAAATAAATTATAAG，如SEQ ID NO.4所示)：0.5μL

下游引物R(核苷酸序列：TAAAAAAACCACCTCTAAAAGGTG，如SEQ ID NO.5所示)：0.5μL

DNA(pNZ8149-LEAP-2)：1μL

ddH₂O：5.5μL

Totalvolume：15μL

反应程序：

95℃：5min

72℃：30s

72℃：10min

12℃：∞

PCR鉴定电泳结果图如图1所示，其中泳道1为DNAMarker(2000bp)；泳道1-11均为提取的重组表达质粒，由图1可知，重组表达质粒构建成功。

实验例2重组乳酸乳球菌的诱导表达

挑取构建成功的重组乳酸菌单菌落，接种于10mLM17培养液中，30℃静置培养；OD600nm＝0.4时加入诱导剂Nisin至终浓度为1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL和10ng/mL，30℃静置诱导3h。诱导结束后，将产物离心收集菌体沉淀，用PBS洗涤菌体2次，使用500μLPBS重悬菌体沉淀之后超声破碎，收集上清液，使用Westernblotting检测上清中LEAP-2的表达。

将配制的Tricine-SDS-PAGE凝胶连同其装置放入电泳槽内，在胶板中间加入阴极缓冲液，轻轻拔下梳子进行点样，电泳槽底部加入阳极缓冲液。直至溴酚蓝抵达分离胶底部后将凝胶取出，切割成所需要的尺寸用于转膜。按照3层滤纸-PVDF膜-凝胶-3层滤纸的顺序组成夹层组合，并使PVDF膜靠近阳极，100V稳压转膜1h。转膜结束后，将膜放入封闭液中4℃过夜。室温下敷抗体2h，用TBST溶液洗膜3次，每次10min。最后将其放入发光成像仪中，将化学发光溶液以1：1的比例混合均匀滴在膜上进行化学发光显影，结果如图2所示，其中泳道1为空载；泳道2为未诱导的胞内蛋白；泳道3为1ng/mLNisin诱导的胞内蛋白；泳道4为2ng/mLNisin诱导的胞内蛋白；泳道5为5ng/mLNisin诱导的胞内蛋白；泳道6为10ng/mLNisin诱导的胞内蛋白。

由图2可知，在5kDa附近有单一蛋白条带，表明利用上述方法构建的重组乳酸乳球菌可以成功表达LEAP-2重组蛋白(氨基酸序列：MGHHHHH HMTPFWRGVSLRPIGASCRDDSECITRLCRKRRCSLSVAQE，如SEQ IDNO.1所示)，而且获得的蛋白为单一组分。由实验结果还可知，1ng/mLNi sin诱导效果最好。

实验例3重组乳酸乳球菌对高脂高糖饲喂小鼠体重调节作用

按照实验例2的方法进行诱导表达，获得的菌液经生理盐水洗涤3次。

将体重相近的3月龄昆明小鼠(购自西安交通大学实验管理中心)分组，6只/组，分为正常饲喂组、高糖高脂饲喂组、高糖高脂饲喂+NZ3900灌胃组和高糖高脂饲喂+NZ3900/pNZ8149-LEAP-2灌胃组。除空白组小鼠饲喂普通饲料外，其余组的小鼠均使用高糖高脂饲料饲喂1周，5g/只，正常饮水采食。

饲喂1周后，将培养好的重组菌以灭菌水重悬，NZ3900菌液组和NZ3900/pNZ8149-LEAP-2菌液组小鼠每只隔天定时定量灌胃菌液200μL(10¹³CFU)，连续灌胃3周，期间隔天记录小鼠体重情况，体重变化表如表1所示，计算并统计小鼠的体重增长率，如图3所示。

表1不同时期不同处理后小鼠的体重变化(x,g)

由表1和图3可知，高糖高脂组小鼠的体重增长率显著高于正常饲喂组，在饲喂25天后，体重增长率增加了4倍，表明经高糖高脂饲喂后，小鼠体重明显增加，模型建立成功。与仅高糖高脂组相比，在高糖高脂饲喂条件下，NZ3900灌胃组和NZ3900/pNZ8149-LEAP-2灌胃组小鼠的体重增长率在饲喂25天后分别降低了12.1％和34.6％，表明本发明的重组乳酸乳球菌实现了高效表达LEAP-2，对高脂高糖饲喂小鼠的体重有显著调节作用。

由以上实施例可知，本发明提供的LEAP-2编码基因能够用于构建重组表达载体，所得重组表达载体能够用于构建重组乳酸乳球菌，所得重组乳酸乳球菌能够正确高效表达LEAP-2重组蛋白，对高脂高糖饲喂小鼠的体重有显著调节作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 陕西理工大学

<120> 一种LEAP-2重组蛋白和一种重组乳酸乳球菌及其应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly His His His His His His Met Thr Pro Phe Trp Arg Gly Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Pro Ile Gly Ala Ser Cys Arg Asp Asp Ser Glu Cys Ile

20 25 30

Thr Arg Leu Cys Arg Lys Arg Arg Cys Ser Leu Ser Val Ala Gln Glu

35 40 45

<210> 2

<211> 143

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcatcatca tcatcaccat atgacaccgt tttggcgtgg cgttagcctg cgtccgattg 60

gcgcaagctg tcgcgatgat agcgaatgta ttacccgtct gtgtcgcaaa cgccgctgct 120

cactgagcgt tgcccaggaa taa 143

<210> 3

<211> 2666

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatctagtc ttataactat actgacaata gaaacattaa caaatctaaa acagtcttaa 60

ttctatcttg agaaagtatt ggtaataata ttattgtcga taacgcgagc ataataaacg 120

gctctgatta aattctgaag tttgttagat acaatgattt cgttcgaagg aactacaaaa 180

taaattataa ggaggcactc accatgggtc atcatcatca tcaccatatg acaccgtttt 240

ggcgtggcgt tagcctgcgt ccgattggcg caagctgtcg cgatgatagc gaatgtatta 300

cccgtctgtg tcgcaaacgc cgctgctcac tgagcgttgc ccaggaataa tctagagagc 360

tcaagctttc tttgaaccaa aattagaaaa ccaaggcttg aaacgttcaa ttgaaatggc 420

aattaaacaa attacagcac gtgttgcttt gattgatagc caaaaagcag cagttgataa 480

agcaattact gatattgctg aaaaattgta atttataaat aaaaatcacc ttttagaggt 540

ggttttttta tttataaatt attcgtttga tttcgctttc gatagaacaa tcaaatcgtt 600

tctgagacgt tttagcgttt atttcgttta gttatcggca taatcgttaa aacaggcgtt 660

atcgtagcgt aaaagccctt gagcgtagcg tggctttgca gcgaagatgt tgtctgttag 720

attatgaaag ccgatgactg aatgaaataa taagcgcagc gtccttctat ttcggttgga 780

ggaggctcaa gggagtttga gggaatgaaa ttccctcatg ggtttgattt taaaaattgc 840

ttgcaatttt gccgagcggt agcgctggaa aatttttgaa aaaaatttgg aatttggaaa 900

aaaatggggg gaaaggaagc gaattttgct tccgtactac gaccccccat taagtgccga 960

gtgccaattt ttgtgccaaa aacgctctat cccaactggc tcaagggttt gaggggtttt 1020

tcaatcgcca acgaatcgcc aacgttttcg ccaacgtttt ttataaatct atatttaagt 1080

agctttattt ttgtttttat gattacaaag tgatacacta attttataaa attatttgat 1140

tggagttttt taaatggtga tttcagaatc gaaaaaaaga gttatgattt ctctgacaaa 1200

agagcaagat aaaaaattaa cagatatggc gaaacaaaaa gatttttcaa aatctgcggt 1260

tgcggcgtta gctatagaag aatatgcaag aaaggaatca gaacaaaaaa aataagcgaa 1320

agctcgcgtt tttagaagga tacgagtttt cgctacttgt ttttgataag gtaattatat 1380

catggctatt aaaaatacta aagctagaaa ttttggattt ttattatatc ctgactcaat 1440

tcctaatgat tggaaagaaa aattagagag tttgggcgta tctatggctg tcagtccttt 1500

acacgatatg gacgaaaaaa aagataaaga tacatggaat agtagtgatg ttatacgaaa 1560

tggaaagcac tataaaaaac cacactatca cgttatatat attgcacgaa atcctgtaac 1620

aatagaaagc gttaggaaca agattaagcg aaaattgggg aatagttcag ttgctcatgt 1680

tgagatactt gattatatca aaggttcata tgaatatttg actcatgaat caaaggacgc 1740

tattgctaag aataaacata tatacgacaa aaaagatatt ttgaacatta atgattttga 1800

tattgaccgc tatataacac ttgatgaaag ccaaaaaaga gaattgaaga atttactttt 1860

agatatagtg gatgactata atttggtaaa tacaaaagat ttaatggctt ttattcgcct 1920

taggggagcg gagtttggaa ttttaaatac gaatgatgta aaagatattg tttcaacaaa 1980

ctctagcgcc tttagattat ggtttgaggg caattatcag tgtggatata gagcaagtta 2040

tgcaaaggtt cttgatgctg aaacggggga aataaaatga caaacaaaga aaaagagtta 2100

tttgctgaaa atgaggaatt aaaaaaagaa attaaggact taaaagagcg tattgaaaga 2160

tacagagaaa tggaagttga attaagtaca acaatagatt tattgagagg agggattatt 2220

gaataaataa aagcccccct gacgaaagtc gacatggact gataaagtat agtaaaaaca 2280

taaaacggag gatattgttg tgaacagaga agagatgact ctcttagggt ttgaaattgt 2340

tgcttatgct ggagatgctc gctctaagct tttagaagcg cttaaagcgg ctgaaaatgg 2400

tgatttcgct aaggcagata gtcttgtagt agaagcagga agctgtattg cagaggctca 2460

cagttctcag acaggtatgt tggctcgaga agcttctggg gaggaacttc catacagtgt 2520

tactatgatg catggtcagg atcacttgat gactacgatc ttattaaaag atgtgattca 2580

tcacctcatc gaactttata aaagaggagc aaagtaatta atgcataaac tcattgaact 2640

tattgagaaa gggaaacgac ggatca 2666

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgaaggaact acaaaataaa ttataag 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

taaaaaaacc acctctaaaa ggtg 24

Claims (2)

1.一种重组乳酸乳球菌在制备改善肥胖的产品中的应用，其特征在于，所述重组乳酸乳球菌表达LEAP-2重组蛋白；

所述LEAP-2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述改善肥胖的产品为改善肥胖的药品。

2.根据权利要求1所述的重组乳酸乳球菌在制备改善肥胖的产品中的应用，其特征在于，所述改善肥胖的产品中重组乳酸乳球菌的浓度为3×10¹³~8×10¹³CFU/ml。

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