CN104805091B - 重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用 - Google Patents
重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用。该表达方法能够将重组人胰岛素基因在食品级乳酸菌中诱导表达并在乳酸菌表面展示重组人胰岛素，本表达方法所利用到的工程菌，表达载体以及诱导剂都符合食品级要求，避免了因表达载体上抗性基因的存在以及非食品级诱导剂所造成的潜在危害等。本发明得到的含有胞壁展示胰岛素的乳酸菌工程菌能够刺激NOD小鼠产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细胞因子IL‑4水平显著上升，诱导免疫耐受产生，只需将诱导后的乳酸菌工程菌制成菌剂即可作为I型糖尿病的口服疫苗，不需要纯化等繁琐的后加工过程，具有广泛的应用前景。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体的是指一种重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用。
【背景技术】
糖尿病是一种由先天或后天因素引起的胰岛素缺乏或缺少所引起的慢性疾病。这种胰岛素的缺乏使得血糖浓度升高从而导致机体，特别是血管和神经的损伤。多饮、多尿、多食、消瘦是糖尿病的典型症状，严重的还会出现包括酮中毒和多种脏器的慢性病变等情况。
糖尿病主要分为两种类型：I型和II型。I型糖尿病(Type I diabetes mellitus,T1DM)是一种自身免疫性疾病，患者的胰腺被免疫系统破坏，造成胰岛素的绝对缺乏，多发于青少年，其治疗方法只能通过一日三次注射胰岛素来保持血糖稳定。II型糖尿病(TypeII diabetes mellitus,T2DM)，多发病于中老年，是一种胰岛素相对缺乏或胰岛素抵抗的疾病，通常与肥胖、饮食等多种因素有关，与免疫系统无关，主要通过健康的饮食和适当的锻炼，服用降血糖药物以及注射胰岛素来恢复和治疗。
针对I型糖尿病，有研究表明通过给T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obesediabetic，NOD)小鼠口服胰岛素能够减轻或延缓其发病过程，其机制是抗原通过黏膜Peyer’s区吸收，从而激活免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐受性，从而保护胰岛素不被损伤。但是如果直接口服抗原，因为抗原绝大多数都是蛋白质，蛋白质在口服过程中经过胃肠环境的影响，会发生明显的降解，因此严重影响抗原的有效作用效率。因此需要一种能够达到食品级要求的运输载体来降低或减轻抗原在经过肠胃环境时所受的损伤。
乳酸菌在自然界中分布广泛，且自古就被人类用于食品加工及制作，因此由于其在食品行业的广泛而长期的应用，通常被认为是安全的食品级的生物。同时乳酸菌作为益生菌的主要组成，具有抑制有害菌的增殖，降低胆固醇，降血压，维持生态系统平衡，抑癌和增强免疫力等重要的生物学功能。而且已有研究表明，将相应抗原经乳酸菌工程菌进行表面展示，进行动物学实验可以使该动物宿主获得相应的免疫反应，如Ke-Qin Xin等人的研究将HIV病毒Env基因的V2-V4环(V2-V4loop)通过乳酸菌表面蛋白进行表面展示，并经过小鼠口服实验发现能够刺激小鼠产生相应的免疫反应(Ke-Qin Xin.Immunogenicity andprotective efficacy of orally administered recombinant Lactococcus lactisexpressing surface-bound HIV Env.BLOOD,1JULY 2003VOLUME 102,NUMBER 1)。
为了完全符合真正意义上的食品级乳酸菌工程菌，除了宿主菌是食品级之外，其所用到的载体也要相应达到食品级要求，即不能够具有绝大部分表达载体所使用的筛选标记—抗性基因，因为由于抗性基因的存在，有可能对动物或人体肠道的正常菌群产生不利影响，打乱其正常的肠道微生态系统的平衡。因此有必要利用不含抗性基因的表达载体和乳酸菌来构建工程菌，从而符合完全食品级要求，达到能够口服利用的要求。
【发明内容】
有鉴于此，为克服现有技术的不足，本发明提供一种重组人胰岛素的表达方法及专用表达载体、工程菌和应用。
本发明第一个目的是提供一种编码重组人胰岛素的基因，其特征在于:所述基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
作为优选方案，所述专用表达载体是含有诱导型表达启动子、重组人胰岛素编码序列、乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导型表面展示表达载体；其中重组人胰岛素编码序列与乳酸菌细胞表面蛋白编码序列形成融合基因，重组人胰岛素编码序列位于乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的5’端，诱导型表达启动子位于所述融合基因的上游。
进一步地，所述细胞表面蛋白为细菌表面蛋白PgsA、SPA、PrtB、PrtP、AcmA、HtrA或SspA。
更进一步地，用于构建重组人胰岛素诱导型表达载体的出发载体为pMG36e、pVE5523、pIL253、pNZ8008、pNZ8048、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150或pNZ9530；以pNZ8149为出发载体，构建的重组人胰岛素乳酸菌不含抗性基因筛选标记的诱导型表达载体为pMRF5018。
本发明第二个目的是提供一种表达重组人胰岛素基因的工程菌，其特征在于：是将上述的专用表达载体转化导入乳酸菌中得到的重组菌。
进一步地，所述乳酸菌为乳酸乳球菌L.lactisNZ3900或L.lactis NZ3910。
更进一步地，所述重组乳酸菌为L.lactisNZ3900/pMRF5018。
本发明第三个目的是提供一种重组人胰岛素基因的表达方法，其特征在于：是发酵上述的工程菌，得到展示于乳酸菌表面的重组人胰岛素。
进一步地，所述发酵携带有诱导型胞内表达载体的重组乳酸菌胞面展示重组人胰岛素时需加入乳链菌肽Nis in，所加入Nis in的终浓度为30ng/ml，诱导温度为30℃，诱导时间为10小时。
本发明第四个目的是提供了种上述的工程菌在制备预防或治疗I型糖尿病口服疫苗中的应用。
本发明提供的重组人胰岛素编码基因序列，其为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，是经过乳酸菌密码子优化且在天然人胰岛素的A、B链基因序列之间引入一段额外基因序列，该基因序列经过转录、翻译成的连接肽能够形成β折叠，从而使本发明提供的重组人胰岛素具有与天然胰岛素非常相似的结构。
本发明所提供的用于表达重组人胰岛素的表达载体，是含有诱导型表达启动子，重组人胰岛素编码序列和乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导表面展示表达载体。其中重组人胰岛素编码序列与乳酸菌细胞表面蛋白编码序列形成融合基因，重组人胰岛素编码序列位于乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的5’端，诱导型表达启动子位于所述融合基因的上游。
所述乳酸菌诱导型胞内表达载体中细菌细胞表面蛋白的可选择范围非常广泛，比如细菌表面蛋白PgsA(GenBank号：KJ175232.1)、SPA(GenBank号：KJ794101.1)、PrtB(GenBank号：L48487.2)、PrtP(GenBank号：FM883700.1)、AcmA(GenBank号：U17696.1)、HtrA(GenBank号：AJ005672.1)、SspA(GenBank号：JN112240.1)等。
用于构建重组人胰岛素表达的乳酸菌诱导型表达载体的出发载体具有广泛的选择范围，比如常见的有pNZ8008、pNZ8048、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150或pNZ9530等。
以pNZ8149为出发载体构建的含有所述的重组人胰岛素编码序列及乳酸乳球菌自溶素AcmA编码序列的乳酸菌诱导型胞内表达载体为pMRF5018。
上述表达载体可按照基因工程领域的常规方法进行构建。
本发明的优点在于：本发明所构建的用于表达重组人胰岛素的表达载体，是含有诱导型表达启动子，重组人胰岛素编码序列和乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导胞内表达载体。将所构建成功的重组人胰岛素专用表达载体导入相应乳酸菌，即可得到重组人胰岛素表达的专用乳酸菌工程菌。培养和发酵该乳酸菌工程菌即可实现重组人胰岛素在乳酸菌表面展示表达。实验证明，本发明的重组人胰岛素专用表达工程菌能够正确的在其表面对重组人胰岛素进行展示表达，定位于乳酸菌工程菌表面的重组人胰岛素具有与天然胰岛素十分相似的空间结构，其可以与胰岛素多克隆抗体发生特异性结合。
通过对T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic，NOD)小鼠口服实验证明，本发明构建的乳酸菌工程菌能够在肠道内存活48小时以上，同时可以刺激NOD小鼠免疫系统产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细胞因子IL-4水平显著上升，诱导免疫耐受产生。实验结果表明，本发明的能够表面展示重组人胰岛素的乳酸菌工程菌能够有效的治疗或预防I型糖尿病。
本发明利用的表达载体，宿主工程菌，诱导剂Nisin等完全符合食品级要求，其中最主要的一点是表达载体是非抗性基因携带型质粒，口服之后不存在因抗性基因存在而产生的对人体肠道菌群微生态系统的破坏等潜在风险。只需将诱导后的乳酸菌工程菌制成菌剂即可作为I型糖尿病的口服疫苗，不需要纯化等繁琐的后加工过程，具有广泛的应用前景。
【附图说明】
图1为本发明人胰岛素基因(1)与重组人胰岛素基因(2)序列比对分析。
图2为本发明重组人胰岛素诱导型表面展示表达载体的pMRF5018构建过程的示意图。
图3为本发明工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018及相应阴性对照诱导表达后提取蛋白进行western blot实验检测结果图。
图4为本发明工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018及相应阴性对照诱导表达后对菌体进行荧光显微镜下拍照结果图。
图5为本发明取工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018诱导前后的细胞进行流式细胞仪分析结果图。
图6为本发明不同处理组NOD小鼠血清中重组人胰岛素特异性抗体检测分析图。
图7为本发明不同处理组NOD小鼠血清中IL-4水平检测结果。
【具体实施方式】
为了更好地理解本发明，以下将结合附图和具体实例对本发明进行详细的说明。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规实验方法，所有引物合成及测序工作均由武汉擎科完成，所有PCR过程均使用高保真酶KOD Dash(东洋坊生物科技有限公司)进行。
实施例一：重组人胰岛素编码基因的合成，为了确保最终编码序列的准确性以及后续实验的顺利开展，该重组人胰岛素编码基因(SEQ ID NO:1)委托上海生工生物公司合成，得到含有该重组基因的质粒pMD18T-INS。
实施例二：重组人胰岛素诱导型表面展示表达载体及工程菌的构建
参见图1构建重组人胰岛素诱导型表面展示表达载体，具体过程包括以下步骤：
1、构建含有重组人胰岛素编码序列的载体pMRF01
根据重组人胰岛素编码序列设计扩增引物，并在上下游引物分别引入NcoI和KpnI酶切位点，引物序列如下：
上游引物P1：5’-CATGCCATGGCATTTGTTAACCAACATTTATGTGGTTCAC-3’(下划线部分为NcoI识别位点，斜体部分为未避免阅读框的改变而引入的匹配碱基)
下游引物P2：5’-GGGGTACCGTTACAGTAGTTCTCAAGTTGATATAATGAACA-3’(下划线部分为KpnI识别位点)。
以含有重组人胰岛素编码序列的质粒pMD18T-INS为模板，在引物P1P2存在下进行PCR扩增，PCR扩增条件为：94℃ 5min，94℃ 10s，57℃ 5s，74℃ 10s，共30个循环。
反应结束对PCR产物纯化并利用限制性内切酶NcoI和KpnI对其双酶切，再次纯化酶切产物。同时利用此相同的两种酶对载体pNZ8149进行双酶切并纯化其酶切产物，接下来将得到的两者利用t4DNA连接酶(Takara)在16℃条件下进行连接过夜。次日将连接产物经过纯化后，最后用无菌水溶解，取5ul纯化的连接产物与50ul NZ3900感受态细胞混匀，并转移至预冷的2mm的电转化杯中，放置于电转仪(Bio-Rad)中,设置电转参数为：2000V，25uf，200Ω进行电转，电转完毕后迅速加入恢复培养基SGM17，30℃静置恢复培养2小时，之后取100ul涂布于Elliker培养平板(胰蛋白胨2％，酵母粉0.5％，氯化钠0.4％，无水乙酸钠0.15％，L-抗坏血酸0.05％，琼脂15％，使用前添加终浓度1％(w/v)的乳糖及0.004％(w/v)的溴甲酚紫)，置于30度培养，次日挑取黄色菌落进行菌落PCR验证，并接种菌落PCR为阳性的菌落于LM17液体培养基(胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，牛肉浸膏0.5％，酵母提取物0.25％，乳糖0.5％，抗坏血酸0.05％，β-甘油磷酸二钠1.9％，硫酸镁1mmol/L)中30℃静置培养。次日提取质粒，并对质粒进行NcoI和KpnI双酶切鉴定，酶切获得197bp和2536bp片段的为阳性克隆，再对经鉴定正确的重组质粒利用引物P1和P2送测序验证，测序结果表明重组人胰岛素序列已插入pNZ8149载体中，且序列信息正确，将此含有重组人胰岛素编码片段的重组载体命名为pMRF01。
2、以载体pMRF01为基础，构建同时含有重组人胰岛素编码序列和乳酸乳球菌自溶素AcmA编码序列(只含有其N端和C端一个LysM区的碱基序列)的重组载体pMRF5018。
根据AcmA编码序列(GenBank号：U17696.1)设计引物，并在上下游引物分别添加限制性内切酶KpnI和XbaI的识别位点，引物设计如下：
上游引物P3：5’-GGGGTACCATGCCAGTATCACGTGTTAAAGTTAAAAATAGAC-3’(下划线部分为KpnI识别位点)
下游引物P4：5’-CTAGTCTAGATTACAGTACAAGTTTTTGACCAATGTAGATAATG-3’(下划线部分为XbaI识别位点，斜体部分为引入的终止密码子)。
以乳酸乳球菌MG1363的基因组为模板，以引物P3和P4进行PCR扩增，PCR扩增条件为94℃ 5min，94℃ 10s，58℃ 5s，74℃ 30s，共30个循环。反应结束后回收PCR产物，并利用KpnI和XbaI对其双酶切，同时对载体pMRF01进行相同酶切处理，将二者酶切产物纯化回收，并利用t4DNA连接酶16℃连接过夜，次日按照上述转化方法将连接产物转化至NZ3900感受态细胞，并挑取黄色菌落进行菌落PCR初筛，提质粒复筛，并对提取的质粒进行KpnI和XbaI双酶切鉴定，酶切获得878bp和2733bp(197bp+2536bp)片段的为阳性克隆，再对经酶切验证正确的重组质粒以引物P3和P4送测序，测序结果表明AcmA编码序列已正确插入pMRF01载体中，且序列信息正确，将此同时含有重组人胰岛素编码序列和AcmA编码序列的载体命名为pMRF5018。
为了进一步鉴定所构建载体的正确性，以pMRF5018载体为模板重新设计了一对分别位于NcoI和XbaI酶切位点上下游约100bp处的引物，引物设计如下：
上游引物P5(位于NcoI酶切位点上游):
5’-GTCGATAACGCGAGCATAATAAACG-3’
下游引物P6(位于XbaI酶切位点下游)：
5’-AGCAACACGTGCTGTAATTTGTTTAAT-3’
以提取的pMRF5018质粒为模板，利用引物P5和P6进行PCR扩增，扩增条件为94℃5min，94℃ 10s，55℃ 5s，74℃ 45s，共30个循环。PCR结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期(200bp+197bp+878bp＝1257bp)一致。并且直接将质粒以引物P5和P6送pMRF5018进行测序分析，最终测序结果显示，重组人胰岛素编码序列和乳酸乳球菌表面蛋白AcmA编码序列已成功连接到载体上，其中重组人胰岛素编码序列位于乳酸乳球菌表面蛋白AcmA编码序列的5’端，二者之间以KpnI酶切位点的序列(GGTACC)相间隔，起到融合蛋白之间的Linker作用，便于重组人胰岛素更灵活的展示于工程菌表面。因此由测序结果可见已成功的构建了诱导型表面展示重组人胰岛素表达载体pMRF5018。同时也获得了相应的表达工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018，因为构建过程中一直使用的是NZ3900细胞，而没有采用常规中间过渡大肠杆菌宿主细胞。
实施例三：重组人胰岛素在乳酸菌中的胞壁展示表达及表达产物的鉴定
一、重组人胰岛素在乳酸菌中的诱导表达
将实施例二中构建成功的相应表达工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018，接种于5mlLM17培养基中，30℃静置培养过夜，次日将培养物按1:50的比例接种于新鲜配制的LM17中，30℃静置培养至OD600约为0.2-0.5，然后向培养物中加入终浓度约为0.1-100ng/ml的乳酸链球菌素(Nisin)进行诱导，在30℃条件下，静置培养3-12小时。同时以L.lactisNZ3900空菌株，表达工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018不进行诱导作为两组对照组。
离心收集菌体沉淀，并用预冷的PBS缓冲液(NaCl 137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na2HPO410mmol/L，KH2PO42mmol/L)洗涤菌体，最后用PBS重新悬浮菌体沉淀，采用超声破碎法对菌体破壁处理(注意保持低温)，4℃离心10min，分别取上清和沉淀(溶于PBS缓冲液)进行western blot鉴定，具体方法如下：
1、SDS-PAGE
采用Tris-Gly电泳系统，分离胶浓度为12％，分别取收集到的上清和沉淀各40ul与10ul 5X的上样缓冲液(250mMTris-Hcl pH6.8、10％SDS、0.5％BPB、50％甘油、5％β-巯基乙醇)混匀，于沸水浴中保温10min，离心，取20ul进行点样并点入预染Marker，安装好电泳槽，80V恒压约40min，使样品积层于浓缩胶与分离胶之间，再调节电压至110V恒压约1.5h。
2、免疫杂交
SDS-PAGE电泳结束后，不对凝胶进行染色，而是进行western-blot分析，方法如下：
将剥离下的凝胶用蒸馏水冲洗，并于预冷的电转buffer中浸润，用湿转的方式将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上，转移时注意保持低温，转移条件为200mA恒流，约2h。转有蛋白的PVDF膜在含有5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl,pH7.4、100mM NaCl)封闭液中室温封闭2h，用TBS洗膜3次，每次10min；然后在4℃条件下与一抗(胰岛素多克隆抗体，购自武汉三鹰生物技术有限公司)溶液孵育过夜，用TBS洗膜3次，每次10min；再与二抗(羊抗兔IgG)室温孵育1.5h；用TBST(TBS+0.1％的Tween-20)洗膜3次，每次10min；将膜与化学发光增强剂室温孵育1-3min后封入保鲜膜，于暗室压入胶片并曝光显影。
Western blot检测结果如图2所示，泳道1、3、5为相应菌株破壁后上清，泳道2、4、6为破壁后沉淀，其中泳道1和2对应的是含有空载体L.lactisNZ3900/pNZ8149菌株发酵处理(阴性对照)，泳道3和4对应的是未经Nisin诱导的L.lactisNZ3900/pMRF5018菌株发酵处理(阴性对照)，泳道5和6对应的是经Nisin诱导的L.lactisNZ3900/pMRF5018菌株发酵处理。从检测结果图中，我们可以发现只有泳道5中在约34kDa出现了明显的杂交带，且其大小与预测的融合蛋白的大小(36kDa)相一致，表明在Nisin的诱导下，所构建的诱导性表面展示重组人胰岛素的工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018能够成功表达该融合蛋白。
二、融合蛋白在工程菌细胞表面的定位分析
由于western blot实验并不能证明所成功表达的融合蛋白是定植于细胞表面，因此需要进一步通过实验直接验证其是否成功的展示于该工程菌的表面，采用的实验方法有免疫荧光分析和流式细胞仪分析，主要过程如下：
1、免疫荧光分析
分别收集相同培养条件下含有空载体L.lactisNZ3900/pNZ8149菌株和诱导前、后的L.lactis NZ3900/pMRF5018工程菌细胞，于4℃，4000rpm离心10min，无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，无菌PBS重悬，加入3％BSA室温封闭30min，无菌PBS洗涤3次，加入200ul无菌PBS稀释的胰岛素多克隆抗体(1:100稀释)，室温下避光温育1h，无菌PBS洗涤3次，以洗去未结合的一抗，然后细胞重悬于200ul无菌PBS稀释的FITC标记的羊抗兔IgG，室温温育1h，无菌PBS洗涤3次，菌体细胞重悬于200ul无菌PBS中，取适量菌悬液涂于载玻片，盖上盖玻片，吸去多余水分，置于荧光显微镜下观察。
免疫荧光结果如图3所示，其中A为含有空载体L.lactisNZ3900/pNZ8149菌株(阴性对照)荧光分析，B为未进行诱导的L.lactis NZ3900/pMRF5018工程菌细胞(阴性对照)荧光分析，C为诱导的L.lactis NZ3900/pMRF5018工程菌细胞的荧光分析。由荧光显微下清晰可见只有诱导的L.lactis NZ3900/pMRF5018工程菌细胞表面发出荧光，可见该工程菌已成功表面展示重组人胰岛素。
2、流式细胞仪分析
分别收集相同培养条件下诱导前、后的L.lactis NZ3900/pMRF5018工程菌细胞，于4℃，4000rpm离心10min，无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，无菌PBS重悬，加入3％BSA室温封闭30min，无菌PBS洗涤3次，加入200ul无菌PBS稀释的胰岛素多克隆抗体(1:100稀释)，室温下避光温育1h，无菌PBS洗涤3次，以洗去未结合的一抗，然后细胞重悬于200ul无菌PBS稀释的生物素标记的羊抗兔IgG，室温温育1h，无菌PBS洗涤3次，菌体细胞重悬于500ul无菌PBS中，进行流式细胞仪分析。
流式细胞仪分析结果如图4所示，经过诱导的L.lactis NZ3900/pMRF5018工程菌细胞表面的相对荧光强度(101-102)要明显强于未经诱导的L.lactisNZ3900/pMRF5018工程菌细胞表面的相对荧光强度(<101)，从而进一步证明了经过诱导之后，所构建的工程菌能够成功的将该融合蛋白展示于细胞表面。
实施例四：工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018作为口服疫苗进行动物实验
1、工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018活细胞的培养与收集
根据实施例三步骤一中优选的诱导方法，将工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018接种于5ml LM17培养基中，30℃静置培养过夜，次日将培养物按1:50的比例接种于新鲜配制的LM17中，30℃静置培养至OD600约为0.3，然后向培养物中加入终浓度约为30ng/ml的乳酸链球菌素(Nisin)进行诱导，在30℃条件下，继续静置培养10小时。5000rpm，4℃离心10min，收集菌体，并用无菌PBS(pH7.4)洗涤3次，最后溶于无菌PBS(pH7.4)。同时以相同方法收集未诱导的工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018活细胞作为对照组。
2、工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018活细胞对非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的口服效果实验
取4周龄NOD小鼠(购自上海史莱克公司)24只，将其随机分为PBS组、对照组和实验组，每组8只。PBS组用0.5ml无菌PBS灌胃，对照组用步骤1中收集的未诱导的工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018活细胞按1011个细胞/只小鼠的量(悬浮于0.5ml无菌PBS中)灌胃，实验组用步骤1中收集的经过诱导的工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018活细胞按1011个细胞/只小鼠的量(悬浮于0.5ml无菌PBS中)灌胃，第一周每天灌胃一次，此后每周一次。
(1)NOD小鼠血清中重组人胰岛素特异性抗体的分析：
将步骤1中收集的经过诱导的工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018活细胞按照实施例三步骤一中的方法，提取蛋白并经过SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜上。
对12周龄的PBS组、对照组和实验组的小鼠各取3只小鼠的血清，并利用封闭液(含有5％脱脂奶粉的TBS溶液)按照1:20的比例稀释作为一抗，二抗为1:500稀释的抗小鼠IgG(购自武汉三鹰生物技术有限公司)，经过施例三步骤一中的方法进行western blot检测。
检测结果如图5所示，结果发现只有实验组小鼠体内产生了重组人胰岛素特异性抗体，而PBS组和对照组均未检测到特异性抗体的存在。表明只有经过诱导的工程菌L.lactis NZ3900/pMRF5018活细胞可成功刺激NOD小鼠免疫系统产生特异性抗体。
(2)NOD小鼠血清中IL-4水平分析
取按实施例四步骤2中喂养方法养至12周龄的PBS组、对照组和实验组，每组取4只，每只取血500ul，制备血清，利用小鼠IL-4ELISA检测试剂盒(上海岚派生物科技有限公司)检测各组小鼠血清中IL-4的含量。通过SPSS软件进行均数t检验统计结果如下：PBS组血清中IL-4水平为29.029±0.927pg/ml，对照组血清中IL-4水平为30.846±1.039pg/ml，实验组血清中IL-4水平为39.648±1.746pg/ml。分析可得实验组较PBS组、对照组中IL-4水平含量明显升高(P<0.05)(图7)。因此从作为免疫耐受相关的典型细胞因子IL-4水平的升高，表明诱导后的工程菌L.lactisNZ3900/pMRF5018活细胞可以促进NOD小鼠免疫耐受的形成。
Claims (5)
1.一种编码重组人胰岛素的基因，其特征在于:所述基因为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述重组人胰岛素基因的专用表达载体，其特征在于：所述专用表达载体是含有诱导型表达启动子、重组人胰岛素编码序列、乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的乳酸菌诱导型表面展示表达载体；其中重组人胰岛素编码序列与乳酸菌细胞表面蛋白编码序列形成融合基因，重组人胰岛素编码序列位于乳酸菌细胞表面蛋白编码序列的5’端，诱导型表达启动子位于所述融合基因的上游；
所述细胞表面蛋白为细菌表面蛋白PgsA、SPA、PrtB、PrtP、AcmA、HtrA或SspA；
用于构建重组人胰岛素诱导型表达载体的出发载体为pMG36e、pVE5523、pIL253、pNZ8008、pNZ8048、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150或pNZ9530；以pNZ8149为出发载体，构建的重组人胰岛素乳酸菌不含抗性基因筛选标记的诱导型表达载体为pMRF5018；
3.表达重组人胰岛素基因的工程菌，其特征在于：是将权利要求2所述的专用表达载体转化导入乳酸菌中得到的重组乳酸菌；
所述乳酸菌为乳酸乳球菌L.lactisNZ3900或L.lactis NZ3910；
所述重组乳酸菌为L.lactisNZ3900/pMRF5018。
4.一种重组人胰岛素基因的表达方法，其特征在于：是发酵权利要求3所述的工程菌，得到展示于乳酸菌表面的重组人胰岛素；
所述发酵携带有诱导型胞内表达载体的重组乳酸菌胞面展示重组人胰岛素时需加入乳链菌肽Nisin，所加入Nisin的终浓度为30ng/ml，诱导温度为30℃，诱导时间为10小时。
5.权利要求3中所述的工程菌在制备预防或治疗I型糖尿病口服疫苗中的应用。
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