CN104774270A - 一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 - Google Patents
一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104774270A CN104774270A CN201510227558.8A CN201510227558A CN104774270A CN 104774270 A CN104774270 A CN 104774270A CN 201510227558 A CN201510227558 A CN 201510227558A CN 104774270 A CN104774270 A CN 104774270A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- epcam
- csf
- hgm
- fusion rotein
- purifying
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 20
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 11
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title abstract description 11
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 20
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 64
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 claims description 57
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 claims description 57
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 52
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 41
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 30
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 28
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 27
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 24
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 22
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 21
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 19
- 238000012797 qualification Methods 0.000 claims description 19
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 18
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 18
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 14
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 claims description 13
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 11
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 9
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 9
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 9
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 7
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 claims description 7
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 6
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims description 6
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 5
- 108010064696 N,O-diacetylmuramidase Proteins 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 5
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 claims description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 3
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 claims description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 abstract description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 abstract description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 description 20
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 13
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 11
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 10
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 10
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 6
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 5
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 4
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 4
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 3
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 3
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229940051921 muramidase Drugs 0.000 description 2
- 238000001426 native polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 229960002203 tilactase Drugs 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 2
- 108010046845 tryptones Proteins 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N (2S,5R,10R,13R)-16-{[(2R,3S,4R,5R)-3-{[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy}-5-(ethylamino)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy}-5-(4-aminobutyl)-10-carbamoyl-2,13-dimethyl-4,7,12,15-tetraoxo-3,6,11,14-tetraazaheptadecan-1-oic acid Chemical compound NCCCC[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@@H](C)NC(=O)C(C)O[C@@H]1[C@@H](NCC)C(O)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DQJCDTNMLBYVAY-ZXXIYAEKSA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 101150038172 1.2 gene Proteins 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyadenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 102000006410 Apoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083590 Apoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 208000005443 Circulating Neoplastic Cells Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000148131 Colibacter Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 1
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 1
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N dTMP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 GYOZYWVXFNDGLU-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N deoxyadenylic acid Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(O)=O)O1 KHWCHTKSEGGWEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 229940126583 recombinant protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012109 statistical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法，所述方法步骤如下：步骤1，引物的设计与合成；步骤2，基因扩增和测序；步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建；步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定；步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta；步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达；步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化；步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩。
Description
技术领域：
本发明涉及一种基因重组蛋白的制备，特别涉及一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白的制备方法
背景技术：
肿瘤的细胞免疫治疗已广泛应用于临床，目前在美国登记的治疗型DC(Dendritic cell,DC)疫苗的临床试验已有数十种。所采用的肿瘤抗原有多种，包括肿瘤细胞裂解物、肿瘤细胞融合体、肿瘤RNA、肿瘤DNA、肿瘤相关全抗原、蛋白多肽、蛋白单肽等，临床多以肿瘤细胞裂解物作为抗原制备DC疫苗，从而诱导抗原特异性细胞免疫杀伤。但由于肿瘤微环境的免疫抑制作用等原因，致使DC疫苗的客观有效率尚不满意。因而如何打破肿瘤免疫耐受，开发更高效的DC疫苗，成为目前主要的研究方向。
EpCAM是一种质量为40kDa的、单分子结构的细胞膜糖蛋白，表达在大多正常上皮细胞，但在大多肿瘤细胞过表达，因而成为上皮来源肿瘤的特征性标记物。EpCAM不仅发挥肿瘤细胞间的粘附作用，而且参与其迁移、增值、及分化等。研究发现，结直肠癌和乳腺癌的EpCAM过表达，且与肿瘤生长、转移及恶性程度密切相关，EpCAM过度表达的肿瘤病人，预后明显变差。研究还发现，应用抗EpCAM抗体，能够有效检测出循环血中游离的癌细胞(Circulating tumorcells,CTC)，并且对腹腔广泛转移和种植所致腹水，具有良好的疗效。因而，EpCAM可作为上皮来源肿瘤极好的靶标和抗原，应用于肿瘤检测及肿瘤特异性细胞免疫治疗。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulatingfactor,GM-CSF)在细胞免疫中承担重要的免疫调节功能，能够高效率的促进DC的富集、抗原吞噬、抗原加工、抗原提呈、以及T细胞的活化。在DC的扩增培养中，GM-CSF是不可或缺的辅助细胞因子，而在肿瘤微环境中提高GM-CSF的水平，能部分抵消肿瘤微环境中的免疫抑制作用，增强DC疫苗的抗原提成功能，从而促进抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxicity T lymphocytes,CTL)的产生及其特异性杀伤功能。已有很多应用基因转染技术促进GM-CSF大量分泌的治疗性疫苗进入临床II、III期临床试验。
本专利设计目的是，应用基因重组技术，将腺癌特异性EpCAM和GM-CSF重组偶联，制备成纯化程度高、表达稳定的EpCAM-GM-CSF融合蛋白，为细胞免疫治疗提供一种腺癌特异性，同时能促进DC抗原提成功能的重组蛋白抗原，从而显著提高细胞免疫治疗的临床疗效。
发明内容：
本发明提供一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白，两种蛋白的氨基酸序列均为已知序列，EpCAM的氨基酸序列和GM-CSF的氨基酸序列已有文献报道。
本发明还提供本发明腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白的制备方法，所述方法步骤如下：
步骤1，引物的设计与合成：
步骤2，基因扩增和测序，得到EpCAM-GM-CSF基因
步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建：
步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定：
步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta：
步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达：
步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化：
步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩。
优选的本发明的制备方法如下：
步骤1，引物的设计与合成：
EpCAM上游引物序列为：
5′CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT 3′；(见序列表1)
下游引物序列为：
5′ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC 3′；(见序列表2)
hGM-CSF上游引物序列为：
5′ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC 3′；(见序列表3)
下游引物序列为：5′CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC 3′；(见序列表4)
步骤2，基因扩增和测序：
从腺癌细胞株LS174-T中提取RNA，然后反转为cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增EpCAM基因，以pORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因；得到的EpCAM-GM-CSF基因；
步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建：
EpCAM片段；和hGM-CSF片段；载体pET-30a；用T4连接酶进行连接；步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定：
CaCl2法制备大肠杆菌感受态DH5α，然后将以上重组载体转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选阳性重组载体；
步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta：
将阳性重组载体加入到Rosetta感受态细胞中，加入培养基；
步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达：
挑取培养基上经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于卡那抗性的培养基中，培养，得到菌液，菌液在4℃，6000rpm，离心20min。弃上清，菌沉-80℃冷冻。
步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化：
将收集的菌沉取出，溶于溶液中；超声破碎，离心，收集上清。Ni SepharoseTM6Fast Flow上柱，用Wash buffer洗柱3次。用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。
步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩：
将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液去除纯化蛋白中含有的咪唑浓缩，离心，即得。
特别优选的，本发明的制备方法如下：
步骤1，引物的设计与合成：
EpCAM上游引物序列为：
5′CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT 3′；(见序列表1)
下游引物序列为：
5′ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC 3′；(见序列表2)
其上下游引物分别引入了限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ的酶切位点。
hGM-CSF上游引物序列为：
5′ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC 3′；(见序列表3)
下游引物序列为：5′CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC 3′；(见序列表4)
其上下游引物分别引入了限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ的酶切位点。
以上引物的合成方法根据现有技术，如教科书中的合成方法。
步骤2，基因扩增和测序：
从腺癌细胞株LS174-T中提取RNA，然后反转为cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增EpCAM基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化DH5α，PCR扩增鉴定阳性斑，提取阳性斑的质粒并测序。以pORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因。
得到的EpCAM-GM-CSF基因。
步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建：
用限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ酶切测序正确、连有EpCAM的T载体，切胶回收EpCAM片段；用限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ酶切测序正确、连有hGM-CSF的T载体，切胶回收hGM-CSF片段；载体pET-30a用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ，切胶回收载体；然后把回收的EpCAM片段，hGM-CSF片段以及载体用T4连接酶进行连接。
步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定：
CaCl2法制备大肠杆菌感受态DH5α，然后将以上连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选阳性重组载体，对阳性斑进行质粒提取，并进行酶切鉴定。
步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta：
取5μl鉴定正确的重组质粒加入到100μl Rosetta感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。42℃水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。加入900μl LB液体培养基(不含抗性)，混匀后37℃振荡培养1小时。4℃，3000rpm离心10min。弃上清，剩余的重悬菌体(约50μl)涂于含卡那抗性的LB固体培养基，37℃培养12-16h。
步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达：
挑取LB固体培养基上、经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，振摇培养过夜。次日培养菌液1:50接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD 600值达0.4-0.6(约2.5h)。培养菌液中，取出1ml做诱导阴性对照，将IPTG加入到余下的菌液中(终浓度0.1mM)，16℃振摇培养4-5h后收集菌体。诱导后的菌液中，取出1ml，与阴性对照均在4℃，1000rpm，离心5min。然后将菌沉分别重悬于100μl 1×SDS凝胶加样缓冲液中，煮沸10min，各取20μl，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。考马斯亮蓝染色，脱色，拍照记录，观察诱导情况。余下的菌液4℃，6000rpm，离心20min。弃上清，菌沉-80℃冷冻过夜。
步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化：
菌体破碎上清的制备：将收集的菌沉次日取出，冰上放置5min，每400ml诱导菌液溶于20ml buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，1mg/ml溶菌酶)；放置垂直混匀器上4℃混匀30min；超声破碎(共10min，每破碎3s暂停5s)；4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。Ni SepharoseTM 6Fast Flow纯化EpCAM-hGM-CSF融合蛋白：按照His Mag Sepharose(GE)说明书要求，在菌体超声破碎后得到的上清中加入相应量。放置垂直混匀器上4℃，混匀30-50min。1000rpm，4℃，离心2min，去除上清。Wash buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，40mM咪唑)重悬结合融合蛋白的beads，然后上柱，用Wash buffer洗柱3次。用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。对纯化前的蛋白以及洗脱后得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，以观察纯化情况。
步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩：
将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液(50mM PBS PH 8.0，0.15M NaCl)中4℃过夜，以去除纯化蛋白中含有的咪唑。次日，将透析后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4℃、4000rpm离心10min。
测量浓缩后的融合蛋白的浓度。
以下为本发明名称术语的解释：
1.T载体：聚合酶链反应产物的克隆运载体，线性化后两侧3′端各多出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单个脱氧腺苷酸(A)，与T载体之间的A-T互补性可提高PCR产物克隆的效率。
2.DH5α：拉丁名Escherichia coli,大肠杆菌属，DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。Rˉ是指DH5α菌株缺乏DNA修饰，即其自身DNA不会被修饰。Mˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。AMPˉ是指其对氨苄青霉素敏感。DH5α菌株可以用于制作基因库等，除此之外，因其特性，可用作基因工程的受体菌。
3.大肠杆菌感受态DH5α：细胞处于能够吸收DNA的状态称感受态，处于感受态的细胞称作感受态细胞。受体细胞DH5α经过一些特殊方法(如：CaCl2等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。
4.大肠杆菌Rosetta：是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率。
5.LB液体培养基(不含抗性)：是培养细菌的常用液体培养基，配方为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L。
6.LB固体培养基：是培养细菌的常用固体培养基，配制：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeast extract)5g/L、氯化钠(NaCl)5g/L、琼脂粉15g/L。
7.IPTG：中文品名:异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，分子式:C9H18O5S，分子量:238.30。IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性，当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ基因载体DNA)以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外，它还可以作为具有lac或tac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。
8.1×SDS凝胶加样缓冲液：先配置2×SDS凝胶加样缓冲液，其组分参考《分子克隆》第三版如下：Tris-HCl pH6.8(100mM)；SDS(4％)；溴酚兰(0.2％)；甘油(20％)；β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(200mM)。再按照比例稀释成2×SDS凝胶加样缓冲液。
9.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：聚丙烯酰胺凝胶电泳(英语：polyacrylamide gelelectrophoresis，简称PAGE)作用：用于分离蛋白质和寡核苷酸。作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)及SDS-聚丙烯酰胺凝(SDS-PAGE)；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
10.溶菌酶：又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
11.Beads：试剂Ni SepharoseTM 6Fast Flow(GE公司)中的His Mag Sepharose。
在获得本发明EpCAM-hGM-CSF重组蛋白后，为鉴定其结果的准确性，进行了如下的鉴定实验：
Wstern blot对EpCAM-hGM-CSF重组蛋白进行鉴定：
分别取重组蛋白20μl，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液，煮沸10min，取20μl进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白样品。首先80V恒压电泳30min，目的使蛋白样品在浓缩胶中压成一条线，待蛋白样品跑出浓缩胶进入分离胶中，提高电压至150V，待溴酚蓝前沿完全跑出胶后，电泳完成。将PVDF膜在甲醇中活化20s，迅速转移到转移缓冲液(1L转移缓冲液中含Tris3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml)中，将上下滤纸和SDS-PAGE胶浸泡在转移缓冲液中。半干转移法转膜：在半干转移器上顺次放滤纸、PVDF膜、胶及另一张滤纸，22V转膜30-60min，转膜时间依蛋白大小和胶浓度而定。转膜结束后将膜取出并标记蛋白面，用1×TBST缓冲液(2L缓冲液中含Tris 4.84g，NaCl58.48g，1ml Tween-20)洗3-5min。将膜放入1×TBST缓冲液配制5％的脱脂奶粉溶液中，水平摇床上封闭2小时以上。5％的脱脂奶粉溶液稀释HIS抗体(稀释比例1:1500)，使膜与一抗在室温结合2hr，或4℃结合过夜。1×TBST缓冲液洗4次，每次10min。5％的脱脂奶粉溶液配制相应二抗(稀释比例1:10000)，室温结合1-2hr。1×TBST缓冲液洗4-5次，每次10min。将发光底物(SuperSignal WestFemto)的A液和B液等体积混匀后，适量加到PVDF膜上(一张膜100μl)，之后在暗室压X光片曝光，并洗片，然后拍照记录。
鉴定结果：
1、EpCAM和hGM-CSF基因的扩增：
以腺癌细胞株LS174-T的cDNA为模板，用EpCAM的上下游引物进行PCR扩增，扩增的PCR产物其大小为950bp左右；以pORFhGM-CSF质粒为模板，用hGM-CSF的上下游引物进行PCR扩增，扩增的PCR产物其大小为450bp左右。PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，产物片段大小与预期结果相符。
2、菌体PCR：
连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，分别用EpCAM和hGM-CSF的上下游引物进行PCR扩增，从而来鉴定阳性菌。从图2中可以看到2-6，8-10，以及11-16为阳性结果，其余泳道结果为阴性。
3、双酶切鉴定：
提取阳性菌落的质粒，然后进行酶切鉴定，用限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ酶切EpCAM，其大小为950bp左右；用限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ酶切hGM-CSF，其大小为450bp左右；用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ酶切EpCAM和hGM-CSF的融合基因，其大小为1400bp左右；脂糖凝胶电泳结果如图3所示，片段大小与预期结果相符。
4、重组EpCAM-GM-CSF融合蛋白的诱导表达：
将已经构建好的pET-EpCAM-hGM-CSF重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株，培养pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta，由IPTG诱导表达。经SDS-PAGE鉴定(图4a)，可见EpCAM-hGM-CSF融合蛋白表达。为了进一步确定融合蛋白的可溶性，诱导后的菌体超声破碎后，经SDS-PAGE鉴定，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在上清中和包涵体均表达(图4b)，上清表达的可溶性蛋白将用于融合蛋白的纯化实验。
5、重组EpCAM-GM-CSF融合蛋白的纯化、浓缩及鉴定：
为获得纯化的EPCAM-hGM-CSF融合蛋白，我们对pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta菌体破碎上清采用Ni SepharoseTM 6Fast Flow进行纯化。经SDS-PAGE鉴定，结果显示(图5)，经纯化后能够获得较纯的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白。为了便于储存和使用，将纯化后获得的EPCAM-hGM-CSF融合蛋白经浓缩柱浓缩，最终通过western blot进一步对融合蛋白进行鉴定(图6)。
应用：
本发明的EpCAM-GM-CSF基因重组蛋白,具备了EpCAM的抗原特征，同时具备了GM-CSF的免疫辅助功能，可应用于治疗型DC疫苗的制备，以及腺癌特异性CTL效应细胞的制备，因而，是细胞免疫治疗中绝好的肿瘤特异性抗原选择。应用该基因重组蛋白制备的治疗型DC疫苗，具有高效率的T细胞活化效应，能有效提高临床疗效。
以下通过实验数据说明本发明的治疗用途：
1、实验设计和方法：
⑴外周血单状核细胞的获取：应用血液成分分离机，或抽取结肠癌病人外周血100ml，经梯度密度离心获取单状核细胞。
⑵贴壁法获得DC细胞和T细胞，分别培养。
⑶DC疫苗的制备：DC细胞培养基中分别加入GM-CSF和IL-4扩增培养5天。第5天分别加入LST-174细胞裂解物、EpCAM、及EpCAM-GM-CSF重组蛋白，在TNF-α参与下培养2天，分别收获三种DC疫苗：①、lysate-DCVAC；②、EpCAM-DCVAC；③、EpCAM-GM-CSF-DCVAC。分别流式检测三种疫苗细胞表面CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达。
⑷抗原特异性CTL的制备：T细胞培养基中加入IL-2扩增培养至第7天，分别与上述三种DC疫苗共培养2-4天，收获三种抗原特异性CTL效应细胞：①、lysate-CTL；②、EpCAM-CTL；③、EpCAM-GM-CSF-CTL。
⑸in vitro细胞杀伤实验：应用MTT assay，取LST-174腺癌细胞株作为靶细胞，分为4组进行细胞杀伤实验。①、对照组：不加任何效应细胞；②、细胞裂解物组：加入lysate-CTL；③、EpCAM蛋白组：加入EpCAM-CTL；④、重组蛋白组：加入EpCAM-GM-CSF-CTL；观察杀伤效率。
⑹in vivo杀伤实验：取裸鼠，行人体免疫重建；皮下接种LST-174细胞株造模；肿瘤生长到0.5cm时，分别瘤旁注射生理盐水(对照)、lysate-CTL、EpCAM-CTL和EpCAM-GM-CSF-CTL；观察肿瘤消退情况。
⑺统计学处理。
2、结果：
⑴in vitro实验结果：效靶比为10：1时，裂解物负载DC诱导的CTL、EpCAM负载DC诱导的CTL、及EpCAM-GM-CSF负载DC诱导的CTL，对LST-74靶细胞的杀伤效率分别为34.1％、58.4％、68.1％(P<0.05respectively；图7)。效靶比为20：1时，裂解物负载DC诱导的CTL、EpCAM负载DC诱导的CTL、及EpCAM-GM-CSF负载DC诱导的CTL，对LST-74靶细胞的杀伤效率分别为68.5％、76.4％、87.4％(P<0.05respectively；图8)。EpCAM蛋白负载DC诱导的CTL，杀伤效率显著高于裂解物负载DC诱导的CTL(P<0.05)；而EpCAM-GM-CSF重组蛋白负载DC诱导的CTL，杀伤效率显著高于EpCAM蛋白负载DC诱导的CTL(P<0.05)及裂解物负载DC诱导的CTL(P<0.01)。
⑵in vivo实验结果：效应细胞杀伤实验：瘤周注射EpCAM-GM-CSF-CTL，肿瘤杀伤效率显著高于对照组(P<0.001)，明显高于EpCAM-DCVAC组和lysate-DCVAC组(P<0.05；respectively；图9)。本专利的技术创新在于：
1.首次提出应用EpCAM作为腺癌特异性抗原，诱导腺癌特异性细胞免疫治疗；
2.首次制备出EpCAM-GM-CSF基因重组蛋白；
3.该重组蛋白兼顾了EpCAM的特异性以及GM-CSF的免疫活化功能，使应用该重组蛋白诱导的细胞免疫杀伤更加高效。
本发明的应用还在于：
①、EpCAM-GM-CSF重组蛋白疫苗的制备：应用本发明的融合蛋白，制备溶液，直接皮内、皮下接种，或静脉输注，或通过病毒、非病毒、纳米等载体转导入人体，通过体内DC摄取并激活T淋巴细胞，诱导EpCAM抗原特异性CTL，并对表达EpCAM抗原的肿瘤细胞产生特异性免疫杀伤。
②、腺癌特异性DC疫苗的制备：应用本发明的融合蛋白，负载肿瘤病人或健康人外周血、骨髓、组织或器官等所获得的自体或异体DC细胞，在相关细胞因子参与下，经过一定时间培养收获DC疫苗。其特征在于，该DC疫苗能激活自体或异体T细胞，诱导腺癌特异性CTL，并对表达EpCAM抗原的腺癌细胞产生特异性免疫杀伤。
③、EpCAM抗原特异性DC疫苗的制备：应用本发明的融合蛋白，负载肿瘤病人或健康人外周血、骨髓、组织或器官等所获得的自体或异体DC细胞，在相关细胞因子参与下，经过一定时间培养收获DC疫苗。其特征在于，该DC疫苗能激活自体或异体T细胞，诱导EpCAM抗原特异性CTL，并对表达EpCAM抗原的肿瘤细胞产生特异性免疫杀伤。
④、EpCAM抗原特异性肿瘤细胞疫苗的制备：应用本发明的融合蛋白，对各种化学或物理方法灭活的肿瘤细胞进行负载、融合或转染，制备成EpCAM高表达的肿瘤细胞疫苗。其特征在于，该肿瘤细胞疫苗能激活自体或异体T细胞，诱导EpCAM抗原特异性CTL，并对表达EpCAM抗原的肿瘤细胞产生特异性免疫杀伤。
⑤、腺癌特异性CTL效应细胞的制备：应用本发明的融合蛋白，负载自体或异体DC细胞，制备成DC疫苗，在相关细胞因子参与下，与各种来源的自体或异体T细胞共培养，制备成腺癌特异性CTL效应细胞制剂。其特征在于，该效应细胞制剂能特异性杀伤腺癌细胞。
⑥、EpCAM特异性CTL效应细胞的制备：应用本发明的融合蛋白，负载自体或异体DC细胞，制备成DC疫苗，在相关细胞因子参与下，与各种来源的自体或异体T细胞共培养，制备成EpCAM特异性CTL效应细胞制剂。其特征在于，该效应细胞制剂能特异性杀伤表达EpCAM抗原的肿瘤细胞。
附图说明：
图1PCR扩增获得的目的基因片段
Lane1:EpCAM
Lane2，3:hGM-CSF
图2菌体PCR结果。以菌落为模板同时扩增EpCAM和hGM-CSF；第一排为hGM-CSF的扩增电泳图；第二排为EpCAM的扩增电泳图
图3双酶切鉴定结果。Lane1-4用SalⅠ和XhoⅠ酶酶切；Lane7-12用NcoⅠ和SalⅠ酶酶切；Lane13-17用NcoⅠ和XhoⅠ酶酶切
图4SDS-PAGE鉴定EpCAM-hGM-CSF融合蛋白诱导表达
4a:Lane1:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta未诱导前；
Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后；
Lane3:蛋白Marker；
4b:Lane1:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后包涵体中表达；
Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中表达；
Lane3:蛋白Marker；
箭头位置指示诱导后表达的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白。
图5EpCAM-hGM-CSF融合蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定
Lane1Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中表达；
Lane3Lane4:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中的融合蛋白纯化后；Lane5:蛋白Marker；
图6Western blot鉴定EpCAM-hGM-CSF融合蛋白
Lane1:蛋白Marker；
Lane2:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta未诱导前；
Lane3:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后；
Lane4:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中表达；
Lane5:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后包涵体中表达；
Lane6Lane7:pET-EpCAM-hGM-CSF/Rosetta经IPTG诱导后上清中的融合蛋白纯化后表达。
图7效靶比为10:1时，EpCAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL的杀伤效率
EpCAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL杀伤，明显高于EpCAM蛋白(P<0.05)及细胞裂解物负载DC所诱导的CTL杀伤(P<0.01)。
图8效靶比为20:1时，EpCAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL的杀伤效率
EpCAM-GM-CSF融合蛋白负载DC诱导的CTL杀伤，明显高于EpCAM蛋白(P<0.05)及细胞裂解物负载DC所诱导的CTL杀伤(P<0.01)。效靶比为20:1时，杀伤效率显著高于10:1更佳。
图9EpCAM-GM-CSF-CTL的肿瘤杀伤效率
EpCAM-GM-CSF-CTL对肿瘤的杀伤效率，显著高于EpCAM-CTL和Lysate-CTL(P<0.05,respectively)
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1
1.实验材料
1.1质粒：
质粒pORFhGM-CSF购自Invivogen；质粒pET-30a购自Novagen。
1.2主要试剂：
质粒提取试剂盒以及胶回收试剂盒均购自上海生工；Ni SepharoseTM 6Fast Flow购自GE。
2.实验方法：
2.1构建重组EpCAM-GM-CSF融合蛋白表达质粒
2.1.1引物的设计与合成：
根据质粒pET-30a的酶切位点，以及NCBI所提供的EpCAM基因序列，及质粒pORFhGM-CSF所提供的基因序列，分别设计EpCAM和hGM-CSF基因的上下游引物：
EpCAM上游引物序列为：5′CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT3′；下游引物序列为：5′ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC 3′；其上下游引物分别引入了限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ的酶切位点。hGM-CSF上游引物序列为：5′ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC 3′；下游引物序列为：5′CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC 3′；其上下游引物分别引入了限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ的酶切位点。全部引物由上海生工合成。
2.1.2基因扩增和测序：
从腺癌细胞株LS174-T(购自南京凯基)中提取RNA，然后反转为cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增EpCAM基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化DH5α，PCR扩增鉴定阳性斑，提取阳性斑的质粒并测序。以pORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因，其余步骤同上。全部测序由上海生工完成。
2.1.3重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建：
测序完成后经比对(NCBI)，选取测序正确、连有目的基因片段的T载体进行终载体构建；用限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ酶切测序正确、连有EpCAM的T载体，切胶回收EpCAM片段；用限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ酶切测序正确、连有hGM-CSF的T载体，切胶回收hGM-CSF片段；载体pET-30a用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ，切胶回收载体；然后把回收的EpCAM片段，hGM-CSF片段以及载体用T4连接酶进行连接(具体操作步骤分别按说明书进行)。
2.1.4重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定：
CaCl2法制备大肠杆菌感受态DH5α，然后将以上连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选阳性重组载体，对阳性斑进行质粒提取，并进行酶切鉴定。
2.2重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta：
2.2.1取5μl鉴定正确的重组质粒加入到100μl Rosetta感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。
2.2.242℃水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。
2.2.3加入900μl LB液体培养基(不含抗性)，混匀后37℃振荡培养1小时。4℃，3000rpm离心10min。
2.2.4弃上清，剩余的重悬菌体(约50μl)涂于含卡那抗性的LB固体培养基，37℃培养12-16h。
2.3重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达：
2.3.1挑取LB固体培养基上、经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，振摇培养过夜。
2.3.2次日培养菌液1:50接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD 600值达0.4-0.6(约2.5h)。
2.3.3培养菌液中，取出1ml做诱导阴性对照，将IPTG加入到余下的菌液中(终浓度0.1mM)，16℃振摇培养4-5h后收集菌体。
2.3.4诱导后的菌液中，取出1ml，与阴性对照均在4℃，1000rpm，离心5min。然后将菌沉分别重悬于100μl 1×SDS凝胶加样缓冲液中，煮沸10min，各取20μl，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。考马斯亮蓝染色，脱色，拍照记录，观察诱导情况。
2.3.5余下的菌液4℃，6000rpm，离心20min。弃上清，菌沉-80℃冷冻过夜。
2.4EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化：
2.4.1菌体破碎上清的制备：
将收集的菌沉次日取出，冰上放置5min，每400ml诱导菌液溶于20ml buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，1mg/ml溶菌酶)；放置垂直混匀器上4℃混匀30min；超声破碎(共10min，每破碎3s暂停5s)；4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。
2.4.2Ni SepharoseTM 6Fast Flow纯化EpCAM-hGM-CSF融合蛋白：
2.4.2.1按照His Mag Sepharose(GE)说明书要求，在菌体超声破碎后得到的上清中加入相应量。
2.4.2.2放置垂直混匀器上4℃，混匀30-50min。
2.4.2.31000rpm，4℃，离心2min，去除上清。
2.4.2.4Wash buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，40mM咪唑)重悬结合融合蛋白的beads，然后上柱，用Wash buffer洗柱3次。
2.4.2.5用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。
2.4.2.6对纯化前的蛋白以及洗脱后得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，以观察纯化情况。
2.4.3纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩：
2.4.3.1将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液(50mM PBS PH 8.0，0.15M NaCl)中4℃过夜，以去除纯化蛋白中含有的咪唑。
2.4.3.2次日，将透析后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4℃、4000rpm离心10min。
2.4.3.3测量浓缩后的融合蛋白的浓度。
Claims (6)
1.一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白，其氨基酸序列见序列表1，其中，所述的融合蛋白，包括EpCAM的整个编码区翻译的全长氨基酸，还包括所述全长氨基酸序列中任何一个或几个氨基酸被删除、被添加和/或取代后的其他氨基酸序列。
2.权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，其特征在于，经过步骤如下：
步骤1，引物的设计与合成；
步骤2，基因扩增和测序；
步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建；
步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定；
步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta；
步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达；
步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化；
步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，经过步骤如下：
步骤1，引物的设计与合成：
EpCAM上游引物序列为：
5′CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT 3′；
下游引物序列为：
5′ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC 3′；
hGM-CSF上游引物序列为：
5′ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC 3′；
下游引物序列为：
5′CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC 3′；
以上所述的上下游引物，还包括根据不同的蛋白表达载体，选择不同的酶切位点，
其5′端相对应的酶切位点碱基序列以及保护性碱基序列。
步骤2，基因扩增和测序：
从腺癌细胞株LS174-T中提取RNA，然后反转为cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增EpCAM基因，以pORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因；
得到的EpCAM-GM-CSF基因，
步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建：
EpCAM片段；和hGM-CSF片段；载体pET-30a；用T4连接酶进行连接；
以上所述的载体构建，将得到的核酸扩增产物用限制酶处理及插入在蛋白表达载体上，所使用载体包括蛋白原核及真核表达载体。
步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定：
CaCl2法制备大肠杆菌感受态DH5α，然后将以上重组载体转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选阳性重组载体；
步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta：
将阳性重组载体加入到Rosetta感受态细胞中，加入培养基；
步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达：
挑取培养基上经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于卡那抗性的培养基中，培养，得到菌液，菌液在4℃，6000rpm，离心20min。弃上清，菌沉-80℃冷冻。步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化：
将收集的菌沉取出，溶于溶液中；超声破碎，离心，收集上清。Ni SepharoseTM 6Fast Flow上柱，用Wash buffer洗柱3次。用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。
步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩：
将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液去除纯化蛋白中含有的咪唑浓缩，离心，即得。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，经过步骤如下：
步骤1，引物的设计与合成：
EpCAM上游引物序列为：
5′CATGCCATGGgcATGGCGCCCCCGCAGGT 3′；
下游引物序列为：
5′ACGCGTCGACTGCATTGAGTTCCCTATGCATC 3′；
其上下游引物分别引入了限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ的酶切位点。
hGM-CSF上游引物序列为：
5′ACGCGTCGACATGTGGCTGCAGAGCC 3′；
下游引物序列为：5′CCGCTCGAGTCACTCCTGGACTGGC 3′；
其上下游引物分别引入了限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ的酶切位点。
以上引物的合成方法根据现有技术，如教科书中的合成方法。
步骤2，基因扩增和测序：
从腺癌细胞株LS174-T中提取RNA，然后反转为cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增EpCAM基因，切胶回收目的片段，将该片段连接至T载体，转化DH5α，PCR扩增鉴定阳性斑，提取阳性斑的质粒并测序。以pORFhGM-CSF质粒为模板，PCR扩增hGM-CSF基因。
得到的EpCAM-GM-CSF基因
步骤3，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的构建：
用限制性内切酶NcoⅠ和SalⅠ酶切测序正确、连有EpCAM的T载体，切胶回收EpCAM片段；用限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ酶切测序正确、连有hGM-CSF的T载体，切胶回收hGM-CSF片段；载体pET-30a用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ，切胶回收载体；然后把回收的EpCAM片段，hGM-CSF片段以及载体用T4连接酶进行连接。
步骤4，重组载体pET-EpCAM-hGM-CSF的筛选、鉴定：
CaCl2法制备大肠杆菌感受态DH5α，然后将以上连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，PCR扩增筛选阳性重组载体，对阳性斑进行质粒提取，并进行酶切鉴定。步骤5，重组质粒pET-EpCAM-hGM-CSF转化大肠杆菌Rosetta：
取5μl鉴定正确的重组质粒加入到100μl Rosetta感受态细胞中，混匀，冰上放置30min。42℃水浴中热激90秒，热激后迅速置于冰上冷却3-5分钟。加入900μl LB液体培养基(不含抗性)，混匀后37℃振荡培养1小时。4℃，3000rpm离心10min。弃上清，剩余的重悬菌体(约50μl)涂于含卡那抗性的LB固体培养基，37℃培养12-16h。
步骤6，重组EpCAM-hGM-CSF融合蛋白在大肠杆菌Rosetta中诱导表达：
挑取LB固体培养基上、经重组质粒转化的Rosetta单菌落，接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃，振摇培养过夜。次日培养菌液1:50接种于含有卡那抗性的LB液体培养基中，37℃振摇培养至OD 600值达0.4-0.6(约2.5h)。
培养菌液中，取出1ml做诱导阴性对照，将IPTG加入到余下的菌液中(终浓度0.1mM)，16℃振摇培养4-5h后收集菌体。诱导后的菌液中，取出1ml，与阴性对照均在4℃，1000rpm，离心5min。然后将菌沉分别重悬于100μl 1×SDS凝胶加样缓冲液中，煮沸10min，各取20μl，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。考马斯亮蓝染色，脱色，拍照记录，观察诱导情况。余下的菌液4℃，6000rpm，离心20min。弃上清，菌沉-80℃冷冻过夜。
步骤7，EpCAM-hGM-CSF融合蛋白的纯化：
菌体破碎上清的制备：将收集的菌沉次日取出，冰上放置5min，每400ml诱导菌液溶于20ml buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，1mg/ml溶菌酶)；放置垂直混匀器上4℃混匀30min；超声破碎(共10min，每破碎3s暂停5s)；4℃，12000rpm，离心20min，收集上清。Ni SepharoseTM 6Fast Flow纯化EpCAM-hGM-CSF融合蛋白：按照His Mag Sepharose(GE)说明书要求，在菌体超声破碎后得到的上清中加入相应量。放置垂直混匀器上4℃，混匀30-50min。1000rpm，4℃，离心2min，去除上清。Wash buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，40mM咪唑)重悬结合融合蛋白的beads，然后上柱，用Wash buffer洗柱3次。用Elution buffer(50mM PBS PH 8.0，0.3M NaCl，250mM咪唑)洗脱目的蛋白。对纯化前的蛋白以及洗脱后得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳，以观察纯化情况。
步骤8，纯化的EpCAM-hGM-CSF融合蛋白渗透浓缩：
将洗脱下的、纯化的融合蛋白溶液装入已经处理好的透析袋，放入透析缓冲液(50mM PBS PH 8.0，0.15M NaCl)中4℃过夜，以去除纯化蛋白中含有的咪唑。次日，将透析后的蛋白过浓缩柱进行浓缩，4℃、4000rpm离心10min。
测量浓缩后的融合蛋白的浓度。
5.权利要求1所述的融合蛋白在制备肿瘤的特异性细胞免疫治疗的药物或疫苗中的应用。
6.编码权利要求1所述融合蛋白的基因序列，其序列见序列表2。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510227558.8A CN104774270B (zh) | 2015-05-06 | 2015-05-06 | 一种腺癌特异性EpCAM‑GM‑CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510227558.8A CN104774270B (zh) | 2015-05-06 | 2015-05-06 | 一种腺癌特异性EpCAM‑GM‑CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104774270A true CN104774270A (zh) | 2015-07-15 |
| CN104774270B CN104774270B (zh) | 2017-08-08 |
Family
ID=53616060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510227558.8A Active CN104774270B (zh) | 2015-05-06 | 2015-05-06 | 一种腺癌特异性EpCAM‑GM‑CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104774270B (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106967157A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-07-21 | 南昌大学 | 一种pBpp蛋白及其功能验证方法 |
| CN106967156A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-07-21 | 南昌大学 | 一种针对pBpp蛋白的纯化方法 |
| CN107090425A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-25 | 中国药科大学 | 一种重组mGM－CSF与GRP6融合蛋白的基因工程菌的构建 |
| CN107236762A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-10-10 | 河北浓孚雨生物科技有限公司 | 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法 |
| WO2019062790A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Lan Keng Li | NEW CONJUGATES AND ASSOCIATED USES |
| CN109942719A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-06-28 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种金黄色葡萄球菌融合蛋白及其蛋白表达载体和纯化方法 |
| CN111394359A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-07-10 | 西南大学 | 朱砂叶螨钙调蛋白基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103755812A (zh) * | 2012-12-14 | 2014-04-30 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种gm-csf-her2重组蛋白及其方法和应用 |
| CN103788213A (zh) * | 2012-12-14 | 2014-05-14 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种gm-csf-tat-cea重组蛋白及其方法和应用 |
-
2015
- 2015-05-06 CN CN201510227558.8A patent/CN104774270B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103755812A (zh) * | 2012-12-14 | 2014-04-30 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种gm-csf-her2重组蛋白及其方法和应用 |
| CN103788213A (zh) * | 2012-12-14 | 2014-05-14 | 上海柯莱逊生物技术有限公司 | 一种gm-csf-tat-cea重组蛋白及其方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 孔娟: "EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备"", <中国生物工程杂志> * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106967157A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-07-21 | 南昌大学 | 一种pBpp蛋白及其功能验证方法 |
| CN106967156A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-07-21 | 南昌大学 | 一种针对pBpp蛋白的纯化方法 |
| CN107090425A (zh) * | 2017-04-25 | 2017-08-25 | 中国药科大学 | 一种重组mGM－CSF与GRP6融合蛋白的基因工程菌的构建 |
| CN107236762A (zh) * | 2017-06-19 | 2017-10-10 | 河北浓孚雨生物科技有限公司 | 一种微环dna转染t细胞制备临床级car‑t细胞制剂的方法 |
| WO2019062790A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Lan Keng Li | NEW CONJUGATES AND ASSOCIATED USES |
| CN111406072A (zh) * | 2017-09-29 | 2020-07-10 | 蓝耿立 | 新缀合物及其用途 |
| CN109942719A (zh) * | 2019-05-07 | 2019-06-28 | 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院 | 一种金黄色葡萄球菌融合蛋白及其蛋白表达载体和纯化方法 |
| CN111394359A (zh) * | 2020-03-23 | 2020-07-10 | 西南大学 | 朱砂叶螨钙调蛋白基因的克隆、原核表达和蛋白纯化方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104774270B (zh) | 2017-08-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104774270A (zh) | 一种腺癌特异性EpCAM-GM-CSF基因重组融合蛋白及其制备方法 | |
| ES2264563T3 (es) | Particulas semejantes al virus del papiloma, proteinas de fusion y procedimiento para su preparacion. | |
| CN104725515B (zh) | 一种类弹性蛋白多肽与柯萨奇腺病毒受体融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN110684120B (zh) | 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN107847577A (zh) | 包含编码类M蛋白质的mRNA的癌症疫苗 | |
| CN111606999B (zh) | 兼具激活免疫共刺激信号通路和阻断免疫检查点的复制型溶瘤腺病毒及其应用 | |
| WO2020103651A1 (zh) | 间充质干细胞在制备治疗类风湿性关节炎的产品中的应用 | |
| CN101063142B (zh) | 人乳头瘤病毒16型dna疫苗和基因佐剂及其应用 | |
| CN104371025B (zh) | 一种针对宫颈癌具有免疫原性的蛋白及其应用 | |
| CN108048483A (zh) | 复制型重组腺病毒HAdV-5载体系统及其应用 | |
| CN103570836A (zh) | 一种重组猪干扰素β1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
| CN105861402A (zh) | 将异源蛋白呈递于大肠杆菌外膜囊泡表面的新型疫苗形式 | |
| CN102816246A (zh) | 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途 | |
| CN104152480A (zh) | 布鲁氏菌L7/L12、Omp31、Rsα、sodC免疫蛋白共表达载体构建和表达方法 | |
| CN105420174A (zh) | 一种表达重组vegf融合蛋白的基因工程菌的构建 | |
| CN105647970A (zh) | 前列腺癌特异性pap-gm-csf-il-6基因重组融合蛋白及其制备方法 | |
| CN103360497A (zh) | 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN103232544B (zh) | 一种重组猪干扰素γ-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法 | |
| CN103695327A (zh) | 一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用 | |
| CN103864939A (zh) | mGM-CSF/βhCG融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN110257314B (zh) | 一种产抗菌肽Cecropin B的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及其应用 | |
| CN107827986B (zh) | 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗 | |
| CN107090425A (zh) | 一种重组mGM－CSF与GRP6融合蛋白的基因工程菌的构建 | |
| CN106085932A (zh) | 一种重组VEGF与GnRH融合蛋白的基因工程菌的构建 | |
| CN105176897A (zh) | 一种表达GnRH/M2融合多肽的重组工程菌株及其构建和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Cai Jianhui Inventor after: Du Pingping Inventor after: Shang Yuanyuan Inventor after: He Huijuan Inventor after: Fu Zexian Inventor before: Cai Jianhui |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 050000 Floor 1, Building 238 Changjiang Avenue, Shijiazhuang High-tech Zone, Hebei Province Patentee after: HEBEI NONGFOYU BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 050035 Hongchang Industrial Park Building No. 1, Changjiang Avenue and Hengshan Street, Shijiazhuang High-tech Zone, Hebei Province Patentee before: HEBEI LITONGKANG BIOTECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211208 Address after: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 floor 1, building 1, 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province Patentee before: HEBEI NONGFOYU BIOLOGY TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee after: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20231012 Address after: Room 2024, Hebei Publishing Media Creative Center, No. 19 Yuanboyuan Street, Zhengding District, China (Hebei) Free Trade Pilot Zone, Shijiazhuang City, Hebei Province, 050899 Patentee after: Yuetenong biotechnology Hebei Co.,Ltd. Address before: 050000 1st floor, building 1, Hongchang Industrial Park, No. 238 Changjiang Avenue, high tech Zone, Shijiazhuang, Hebei Patentee before: Nongfuyu pharmaceutical Hebei Co.,Ltd. |