CN105861402A - 将异源蛋白呈递于大肠杆菌外膜囊泡表面的新型疫苗形式 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说，本发明提供了一种大肠杆菌外膜囊泡（OMVs）作为疫苗载体的构建及应用方法。运用基因工程手段，可以利用膜蛋白（如SEQ ID NO1所示）作为牵引将异源蛋白呈递至大肠杆菌OMVs表面，以此重组OMVs免疫动物时，该OMVs作为疫苗载体可以诱发针对异源蛋白的免疫应答。

Description

将异源蛋白呈递于大肠杆菌外膜囊泡表面的新型疫苗形式

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，通过膜定位的牵引分子与外源蛋白的融合表达，实现将外源蛋白呈递在OMVs表面，并应用于疫苗领域。

背景技术

细菌与宿主细胞的联系主要是通过细菌向胞外释放效应因子来完成信息的传递，细菌通过释放刺激因子激发宿主的免疫防御功能并产生免疫应答。

细菌的蛋白分泌系统大多由单一蛋白或小蛋白的复合体形式通过膜转运途径进行分泌。

细菌外膜囊泡（OMVs）是一种主要的信息传递载体，OMVs将多种蛋白分子及脂类物质向外分泌并传递至宿主哺乳动物细胞。

OMVs是一种很小的蛋白脂质体，平均直径为50-200nm，由致病及非致病的革兰氏阴性菌在生长过程中由外膜释放然后分泌到胞外。

OMVs的成分主要是外膜蛋白（OMP）、脂多糖（LPS）、磷脂及可溶性的周质蛋白，但没有在OMVs中发现内膜或细胞质成分。

天然的OMVs作为细菌的主要分泌系统，主要负责向胞外释放脂类蛋白、膜蛋白、疏水分子，并保护释放的可溶性蛋白不受环境中蛋白酶的水解，以保护运载蛋白的完整性。

OMVs能包裹高浓度的效应分子（DNA、RNA），并利用OMVs的表面配体准确的识别目标细胞，将效应分子准确无误的递送至目标地点。

天然免疫系统能快速识别并清除入侵机体的病原微生物，是人体免疫防御的第一道防线，在天然免疫应答中，免疫细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRRs)识别被称为病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs)的微生物保守结构，进而启动有效的免疫应答。

Toll样受体是PAMPs的结合受体，不同的PAMPs可以被不同的Toll样受体所识别或组合识别，然后通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子NF-κB和Jun/Fos等，从而有效地活化天然免疫系统。

对于OMVs的免疫学特性，OMVs含有的脂多糖（LPS）、外膜孔道蛋白（Porin）以及脂蛋白（Lipoprotein）能激发宿主产生较强的免疫反应，OMVs通过PAMPs被Toll样受体（TLR）识别，启动下游免疫反应，进而增强免疫反应。

OMVs被认为能有效刺激DCs细胞成熟并促进抗原加工，从而有效的增强免疫应答。

发明内容

通过PCR扩增的方法，获得天然细菌的膜锚定蛋白编码基因序列，通过基因工程手段，以限制性内切酶酶切后连接入原核表达载体，构建成含重组膜锚定蛋白的原核表达质粒。

在该重组质粒的膜锚定序列的3’端以基因工程手段插入外源蛋白的基因序列，以此形成“膜锚定蛋白-外源蛋白”融合表达的重组质粒。

将此重组质粒转化进大肠杆菌后，在低温诱导的条件下使外源蛋白正确折叠为可溶性融合蛋白，随膜牵引蛋白将外源蛋白牵引至细菌外膜。

在经过重组表达后的大肠杆菌形成的OMVs中检测到了外源蛋白的存在，并证明存在于OMVs表面，而非内腔中。

多种外源蛋白通过此方法进行表达，都可以获得在大肠杆菌OMVs表面的有效呈递，证明该方法具有普遍适用性。

在诱导表达过夜后的大肠杆菌培养基上清中制备重组OMVs，OMVs的制备方法如下：

（1）将诱导后的细菌培养液离心，收获培养液上清；

（2）将培养液上清进行过滤（0.45μm或0.22μm滤膜）；

（3）过滤液用超滤模块（50-100kDa）进行浓缩，浓缩液再次过滤；

（4）滤过液进行超速离心；

（5）超速离心后沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次后再次超速离心；

（6）离心后沉淀用PBS重悬并再次过滤；

（7）滤过液经碘克沙醇或蔗糖密度梯度离心，获得OMVs所在成分。

作为实例，我们将一种鲍曼不动杆菌的外膜蛋白p22或HPV16型E7蛋白分别成功的呈递到了OMVs表面。并通过呈递了鲍曼不动杆菌的p22蛋白的重组p22-OMVs为例，检测了重组OMVs引起的针对所呈递外源蛋白的免疫反应。

以p22-OMVs重组蛋白为例，两次皮下免疫小鼠后小鼠产生了针对鲍曼不动杆菌p22蛋白的抗体水平。

p22-OMVs免疫后的小鼠免受鲍曼不动杆菌的感染，表现为100%的成活率，未免疫组小鼠存活率仅为16.7%。显示了小鼠针对OMVs呈递的外源抗原产生的有效的免疫应答，并成功的抵抗了鲍曼不动杆菌的感染。

鲍曼不动杆菌感染小鼠后，p22-OMVs免疫后的小鼠较未免疫小鼠中鲍曼不动杆菌在各个组织中的细菌载量明显下降，反应了p22-OMVs免疫后小鼠产生了识别鲍曼不动杆菌外膜蛋白p22的抗体，该抗体起到了快速清除小鼠组织中细菌的作用。

以上实例证明了OMVs呈递外源蛋白后，免疫动物能产生针对外源蛋白的抗体水平，该抗体的产生不需要借助其他佐剂，并能有效的识别抗原，有效的防御病原菌入侵，是一种新型的疫苗形式。

附图说明

图1显示了OMVs-ClyA-p22质粒的构建图谱，融合表达大肠杆菌的膜牵引序列（E.coli ClyA）与鲍曼不动杆菌的外膜蛋白p22（Ab Omp22），NdeI、BamHI、SalI为限制性内切酶酶切位点。

图2 显示了OMVs-ClyA-p22诱导表达前后菌体及OMV的图谱，左图为菌体样品电泳，右图为OMVs样品电泳，泳道1为蛋白分子量标准，泳道2为诱导前菌体，泳道3为诱导后菌体，泳道4为未改造的大肠杆菌OMVs，泳道5为呈递了p22后的重组OMVs。

图3 显示了鲍曼不动杆菌外膜蛋白p22在OMVs外侧成功呈递的Western blot检测图片，泳道1为重组p22-OMVs未经处理，泳道2为重组p22-OMVs用蛋白酶K处理，泳道3为重组p22-OMV经EDTA处理，泳道4为非重组天然大肠杆菌OMVs，实验以抗鲍曼不动杆菌OMVs的抗体进行检测，目的是检测鲍曼不动杆菌的外膜条带，天然非重组的大肠杆菌OMVs用于检测是去除背景反应，非特异性反应用星号“*”表示。

图4 显示了HPV16型E7蛋白在OMVs外侧成功呈递的Western blot检测图片，泳道1为未经处理的重组E7-OMVs，泳道2为蛋白酶K处理后的重组E7-OMVs，泳道3为EDTA处理后的重组E7-OMVs，泳道4为蛋白酶K和EDTA同时处理的重组E7-OMVs，Western blot检测使用的抗体为抗HPV16型E7的商品化抗体，购自Santa公司。

图5 显示了重组OMVs-ClyA-p22的电镜图片。

图6 显示了重组OMVs-ClyA-p22（p22-OMV）、天然未改造OMVs（wtOMV）及PBS（对照）分别免疫小鼠后，第二次免疫后三周产生的针对鲍曼不动杆菌外膜蛋白p22的抗体应答水平。

图7 显示了分别经重组OMVs-ClyA-p22（p22-OMV）及PBS（对照）免疫后的小鼠，腹腔感染鲍曼不动杆菌后的存活率。

图8显示了分别经重组OMVs-ClyA-p22（p22-OMV）及PBS（对照）免疫后的小鼠，经鲍曼不动杆菌感染12小时后小鼠各器官中的鲍曼不动杆菌载量情况。

SEQ ID NO1为本发明中列举的耐药大肠杆菌ClyA基因序列。

SEQ ID NO2 为本发明中列举的鲍曼不动杆菌p22基因序列。

SEQ ID NO3 为本发明中列举的HPV16型E7基因序列。

具体实施方式

通过以下实施例详细描述本发明，以便本领域普通技术人员能够更好地理解本发明。下述实施例仅仅出于示范性目的，并非意在限制本发明的范围。已经努力确保有关数字的准确性，但应该考虑到会存在一些误差和偏差。

实施例

实施例 1 ： OMVs-ClyA 重组质粒的构建

以ClyA膜牵引蛋白为例，将临床获取的大肠杆菌过夜培养，待菌体生长至对数期(OD=0.4-0.6)，取菌液进行PCR扩增，PCR扩增引物为ClyA-S：5'-CATATGACTGAAATCGTTGCAGATA-3'；ClyA-A：5'- GGATCCGACTTCAGGTACCTCA-3’；PCR体系具体为：菌液：2μL；ClyA-A：2μL；ClyA-S：2μL；dNTP：2μL；Taq连接酶：0.25μL；10×Taq连接酶buffer：2.5μL；无酶水：14.25μL。PCR程序为：①94℃预变性5分钟；②变性94℃，30秒；退火56℃，30秒；延伸72℃，1分钟，循环35次；③最后延伸72℃，10分钟。将PCR产物进行胶回收（北京天根生物），回收产物以T-A连接至pMD19T-simple载体（Takara公司），连接体系为：pMD19T-simple载体：0.5μL；片段：4.4μL；T4连接酶：0.5μL；T4连接酶buffer：0.6μL。16℃连接过夜。将连接后的重组子转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆以T载体测序引物进行鉴定。将pThioHisA原核表达载体（Invitrogen公司）及阳性重组质粒以限制性内切酶（Takara公司）NdeI及BamHI进行双酶切，酶切体系为：载体/质粒：13μL；NdeI酶：2μL；BamHI：2μL；10×T buffer：3μL，37℃酶切3小时。胶回收酶切产物后加入DNA连接酶（Takara公司）进行连接，连接体系为：ClyA片段：4.7μL；pThioHisA载体：0.2μL；DNA连接酶：0.5μL；DNA连接酶buffer：0.6μL，16℃连接过夜。将DNA连接产物转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序鉴定。最终获得pThioHisA-ClyA重组质粒作为基础牵引质粒。

实施例 2 ： OMVs-ClyA-X 外源蛋白基因重组质粒的构建

外源蛋白基因X以鲍曼不动杆菌蛋白p22基因序列及HPV16型E7蛋白基因序列为例说明。收获鲍曼不动杆菌临床菌株，以PCR引物p22-S：5'-GGATCCATGCGTGCATTAGTTAT-3'及p22-A：5'- GTCGACTTATTGTTTAGCATAAATGCT-3'进行PCR扩增，获得鲍曼不动杆菌p22蛋白的基因序列；或以全基因合成的方式合成HPV16型E7基因并带有BamHI及SalI酶切位点。将外源基因序列及重组pThioHisA-ClyA质粒同时以BamHI及SalI进行双酶切，回收酶切目的片段，以DNA连接酶进行连接，转化进大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆后测序鉴定。最终获得pThioHisA-ClyA-p22或pThioHisA-ClyA-E7重组质粒，具体实验步骤同实施例1。

实施例 3 ： OMVs-ClyA-X 重组质粒的诱导表达条件

将成功转入了携带牵引序列及外源序列重组质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达，具体方法为，将100-200μL阳性重组克隆的甘油菌接种至已加入氨苄西林（100mg/mL）的LB培养基中，培养16小时后以1:5的比例转接菌液进入新的带氨苄西林的LB培养基中，待菌株生长至对数期时，加入IPTG（1mmol/L）进行诱导表达，控制诱导表达温度为20-30℃，低温诱导表达过夜。

实施例 4 ：重组 OMVs 的制备及纯化

将诱导表达过夜后的样品以室温14000g离心10分钟，收集培养基上清，将培养基上清通过0.45或0.22μm的滤膜去除菌体。滤过液以50kDa或100kDa的超滤模块进行超滤浓缩，浓缩液再次通过0.45或0.22μm的滤膜，滤过液以4℃、200000g超速离心4小时，收获离心后沉淀样品，将沉淀以PBS重悬，重悬液再次通过0.45或0.22μm的滤膜。将该滤过液进行体积比为27%、33%和39%的碘克沙醇密度梯度离心，收获OMVs所在成分即获得纯化的重组OMVs。

实施例 5 ：外源蛋白在 OMVs 表面成功呈递的检测

由于OMVs本身由很多外膜蛋白组成，受到大量OMVs本身蛋白质的影响，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色不能通过分子量大小来清晰的分辨外源蛋白的递呈情况，因此，通过Western blot的方法以免疫学检测OMVs上外源蛋白的呈递情况是有效的手段。以鲍曼不动杆菌外膜蛋白p22呈递为例，将成功呈递了鲍曼不动杆菌p22蛋白的大肠杆菌OMVs（p22-OMVs）及未重组的大肠杆菌OMVs进行检测，为了分辨呈递的外源抗原是在OMVs内腔还是在OMVs的表面，以工作浓度为100μg/mL的蛋白酶K（PK）37℃过夜消化来处理OMVs，消化OMVs表面蛋白；也以工作浓度为0.1mol/L的EDTA处理打开OMVs的结构，使内腔的蛋白得以释放，检测OMVs内腔是否有外源蛋白。结果显示鲍曼不动杆菌的p22蛋白被呈递于大肠杆菌OMVs表面，而非内腔。同样我们以呈递HPV16型E7蛋白在大肠杆菌OMVs为例，也证明了E7蛋白成功的呈递在OMVs的表面，而非内腔。

实施例 6 ：重组 OMVs 的动物免疫

以呈递鲍曼不动杆菌蛋白p22为例证明以重组的p22-OMVs免疫能够产生针对p22的抗体水平。将重组的p22-OMVs以50μg总蛋白剂量(Bradford染色测定法)进行免疫ICR小鼠，分别在0天、14天进行两次皮下免疫，不加入佐剂。小鼠饲养在SPF级别的环境中。最后一次免疫后3周采血进行抗体水平的ELISA检测，ELISA检测时抗原包被为10ug鲍曼不动杆菌外膜蛋白p22或鲍曼不动杆菌OMVs。结果证明经p22-OMVs免疫后，小鼠产生了针对鲍曼不动杆菌OMVs以及鲍曼不动杆菌p22蛋白的抗体水平。

实施例 7 ：重组 OMVs 呈递蛋白的活性验证

为了验证重组OMVs呈递外源蛋白的活性，我们进行了p22-OMVs免疫小鼠后的细菌感染实验。p22-OMVs免疫两次后的小鼠，在最后一次免疫后三周进行鲍曼不动杆菌的腹腔感染，以1×10⁶CFU浓度的鲍曼不动杆菌混合10%的猪粘液素（Sigma公司）通过腹腔感染小鼠，感染后的7天对小鼠进行连续观察，并记录小鼠存活率，结果显示经p22-OMVs免疫后的小鼠免受鲍曼不动杆菌感染，存活率为100%。将小鼠的肺、脾、肝、肾取出称重，研磨并梯度稀释后涂布于氨苄抗生物素的LB平板，检查各器官中的细菌数（CFU），结果显示p22-OMVs免疫后的小鼠在多器官中的鲍曼不动杆菌菌体载量明显下降，证明了呈递于大肠杆菌OMVs表面的鲍曼不动杆菌p22蛋白免疫后产生了针对鲍曼不动杆菌的抗体，并清除鲍曼不动杆菌感染。

SEQ ID NO1 ： ClyA 基因序列

ATGACTGAAATCGTTGCAGATAAAACGGTAGAGGTAGTTAAAAACGCAATCGAAACCGCAGATGGAGCATTAGATCTTTATAATAAATATCTCGATCAGGTCATCCCCTGGCAGACCTTCGATGAAACCATAAAAGAGTTAAGTCGCTTTAAACAGGAGTATTCACAGGCAGCCTCCGTTTTAGTTGGCGATATTAAAACCTTACTTATGGATAGCCAGGATAAGTATTTTGAAGCAACC

CAAACGGTGTATGAATGGTGTGGTGTTGCGACGCAATTGCTCGCAGCATATATTTTGCTATTTGATGAGTACAATGAGAAGAAAGCATCCGCCCAGAAAGACATTCTCATTAAGGTACTGGATGACGGCATCACGAAGCTGAATGAAGCGCAAAAATCTCTGCTGGTAAGCTCACAAAGTTTCAACAACGCTTCCGGAAAACTGCTGGCGTTAGATAGCCAGTTAACCAATGATTTTTCAGAAAAAAGCAGCTATTTCCAGTCACAGGTAGATAAAATCAGGAGGGAAGCGTATGCCGGTGCCGCAGCCGGTGTCGTCGCCGGTCCATTTGGATTAATCATTTCCTATTCTATTGCTGCGGCCGTAGTTGAAGGGAAACTGATTCCAGAATTGAAGAACAAGTTAAAATCTGTGCAGAATTTCTTTACCACCCTGTCTAACACGGTTAAACAAGCGAATAAAGATATCGATGCCGCCAAATTGAAATTAACCACCGAAATAGCCGCCATCGGTGAGATAAAAACGGAAACTGAAACAACCAGATTCTACGTTGATTATGATGATTTAATGCTTTCTTTGCTAAAAGAAGCGGCCAAAAAAATGATTAACACCTGTAATGAGTATCAGAAAAGACACGGTA

AGAAGACACTCTTTGAGGTACCTGAAGTC

SEQ ID NO2 ：鲍曼不动杆菌 p22 基因序列

ATGCGTGCATTAGTTATTTCAACAGTGGTAGGGGCAGCAGTAGTACTTTCTGGTTGTCAAACAACAGGTAATAACCTTGGTGGCGTTGAATACGATAAAGCCGCATTAGGTACTTTGATCGGCGCAGCAGCTGGCTACGGTATTTCTAAATCAAATGCAAACTCTAGCCGTCAAAACAACCGTGCTGCGGCAATTGGTGCAGTTCTTGGTGCAGCTGGCGGTTTATATCTTGACCAAAAAGAGAAAAAATTACGCGAACAAATGGCTGGTACTGGTGTAGAAGTAGGCCGTAACCCAGATGGTTCTGTTCAATTGATCATGCCTGGTAGCATTACTTTTGATACTAACAAATCAAACATCAAGCCAAACTTCTATGCAACTTTGGACAAAGTAGCTCAAACATTGGCTGAAGATAACAAGAGCGCGATTTTAGTTACTGGTTATACAGATAACACTGGTAATGACTCTATTAACATCCCATTATCTCAAGCGCGTGCTCAGTCAGTTAAAAACTATTTAGCTGGTAAAGGTGTTCCATCTAGCCGTATCGATGCACAAGGTTATGGTTCTTCTAACCCAATCGCAGACAACTCAACTGCTTCTGGTCGTGAACAAAACCGCCGTGTAGAAATCAGCATTTATGCTAAACAATAA

SEQ ID NO3 ： HPV16 型 E7 基因序列

ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA

Claims (9)

1.来自于大肠杆菌生长状态下分泌的外膜囊泡（OMVs），其特征在于，可以通过基因工程手段以一种外膜锚定蛋白将异源蛋白牵引至OMVs表面，以此重组OMV免疫动物时，动物能产生针对表面呈递蛋白的免疫应答。

2.权利要求1中所述异源蛋白，其特征为，可以作为疫苗靶点的单独蛋白，包括本发明中显示的鲍曼不动杆菌外膜蛋白p22及HPV16型E7蛋白。

3.权利要求1中所指的基因工程手段，其特征为，在大肠杆菌中导入原核表达质粒，该质粒能在大肠杆菌内表达一种细菌外膜锚定蛋白-外源蛋白复合物，经表达该融合蛋白后，就可以将该外源蛋白呈递于OMVs表面，而非内腔。

4.权利要求3中所述细菌外膜锚定蛋白，其特征为，该蛋白具有定位于细菌外膜的特性，包括一些天然的外膜蛋白分子，如OmpA、OmpW、ClyA等。

5.权利要求4中所述ClyA蛋白，其特征为，其基因序列由临床大肠杆菌中分离获得，该基因全长表达后将定位于大肠杆菌外膜。

6.权利要求3中所述融合的膜锚定蛋白-外源蛋白复合物，其特征为融合表达后正确折叠为可溶性蛋白。

7.权利要求1中所述的免疫动物，其特征为，在免疫过程中，不需要额外添加任何佐剂。

8.权利要求1中所述免疫反应，其特征为，针对呈递在OMVs表面上的外源蛋白的体液免疫应答。

9.如前述权利要求中任意一项所述重组OMVs其应用为新型疫苗载体。