CN116496416B - 一种法氏囊结构蛋白vp2多表位串联表达蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种法氏囊病毒多优势表位串联表达蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1，本发明所提供的多表位融合蛋白可用于制备传染性法氏囊病毒亚单位疫苗。本发明的抗原融合蛋白纯化后能够特异性识别传染性法氏囊病毒琼脂扩散阳性血清，琼扩效价可达1:32～1:64以上，能够满足制备疫苗的要求。用该融合蛋白制备的疫苗免疫适龄鸡后能够获得高水平的特异性抗体，获得攻毒保护作用。本发明通过多表位串联获得传染性法氏囊病毒多表位抗原亚单位疫苗，其分子量小，特异性高，能提供完全的免疫保护。
Description
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种鸡传染性法氏囊病毒结构蛋白VP2多优势抗原区域串联表达蛋白。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种急性、高度传染性的免疫抑制性疾病，全球范围内广泛流行，严重威胁人类食品安全，给养鸡业带来严重的经济损失。目前对于该病的治疗没有特效药，接种疫苗成为唯一的预防手段。
传染性法氏囊病毒是一种无囊膜双股双节段RNA病毒，属于Birnaviridae家族，其基因组编码5种蛋白，即VP1、VP2、VP3、VP4、VP5。其中VP2蛋白是病毒的主要结构蛋白，也是构成病毒核衣壳的主要成分，是主要宿主保护性抗原，能诱导宿主产生中和抗体、保护宿主免受IBDV的感染，是开发IBDV亚单位疫苗的重要靶蛋白。
为了实现蛋白的外源表达，目前已经建立了基于多种宿主生物(包括动物、昆虫、真菌、细菌)的重组蛋白表达系统。革兰氏阴性的大肠杆菌表达系统由于具有确定的遗传背景和短期内生长到高细胞密度的特性，得到广泛的应用，但仍具有产生内毒素、易产生包涵体和缺少有效的翻译后修饰过程的不足。尽管酵母表达系统具有不产生内毒素和翻译后修饰机制优势，仍存在表达的蛋白过度糖基化修饰和发酵周期长的缺点。虽然动物、昆虫表达系统具有不产生内毒素、蛋白没有过度糖基化修饰的特点，但蛋白表达周期长、生产成本高，不利于蛋白的大量生产及应用。
与以上表达系统相比，革兰氏阳性的短芽孢杆菌(Brevibacillus.Choshinensis，B.choshinensis)表达系统可以弥补以上表达系统的不足，其具有以下优势：(1)低细胞外蛋白酶活性；(2)高效的蛋白合成、分泌能力；(3)不产生内毒素；(4)发酵周期短、成本低。本发明中使用短芽孢杆菌表达了串联多表位法氏囊VP2蛋白，与短芽孢杆菌表达全长VP2蛋白相比，其琼扩效价更高、活性更强，将其应用在传染性法氏囊病亚单位疫苗领域，具有很高经济价值和社会效益。
发明内容
本发明的目的是提供一种法氏囊病毒多优势表位串联表达蛋白，即一种通过分析筛选传染性法氏囊病毒结构蛋白VP2氨基酸序列中免疫原性优势区域后，通过linker进行串联获得的抗原蛋白。琼脂免疫扩散试验(AGID)表明该多表位抗原具有良好的活性，对适龄鸡的免疫攻毒保护试验说明其能够提供较好的保护效果。
本发明首先提供一种特异性多表位融合蛋白，包含有：
1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多表位融合蛋白；
2)在SEQ ID NO:1的序列上通过取代、缺失、添加一个或几个氨基获得的衍生蛋白；
编码上述多表位融合蛋白的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；
更进一步的，对编码基因的序列进行优化，优化后核苷酸序列为SEQ ID NO:3；
本发明还提供一种重组表达载体，其中包含有上述的编码基因；
本发明还提供一种重组工程菌株，所述的重组工程菌株中携带有编码上述抗原融合蛋白的核酸片段；
作为实施例的一种具体记载，所述的重组工程菌株为短芽孢杆菌工程菌；
本发明所提供的多表位融合蛋白可用于制备传染性法氏囊病毒亚单位疫苗。
本发明的抗原融合蛋白纯化后能够特异性识别传染性法氏囊病毒琼脂扩散阳性血清，琼扩效价可达1:32～1:64以上，能够满足制备疫苗的要求。用该融合蛋白制备的疫苗免疫适龄鸡后能够获得高水平的特异性抗体，获得攻毒保护作用。本发明通过多表位串联获得传染性法氏囊病毒多表位抗原亚单位疫苗，其分子量小，特异性高，能提供完全的免疫保护。
附图说明
图1为本发明实施例1中pNC-HisT-IBDVP2M菌落PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道M为Marker DL2000；泳道1～4分别为菌液PCR结果；
图2为本发明实施例1中pNC-HisT-IBDVP2M质粒双酶切鉴定图，其中泳道M为Marker DL5000；泳道1～2为重组质粒双酶切结果；
图3为本发明实施例1中Western-blot验证pNC-HisT-IBDVP2M表达产物图，其中M为Marker；1为pNC-HisT-IBDVP2M重组多表位蛋白；2为pNC-HisT空载体；
图4为实施例2中pNC-HisT-IBDVP2M抗原琼扩效价检测图，其中A：VP2全长表达蛋白；B：VP2多表位表达蛋白；C：浓缩VP2多表位蛋白孔1～孔6：短芽孢杆菌表达重组VP2蛋白21～26稀释；N：阴性对照；P：阳性对照。
具体实施方案：
本发明通过短芽孢杆菌表达系统对IBDV-VP2多表位蛋白进行分泌表达，用表达的多表位VP2蛋白制成亚单位疫苗进行动物免疫保护试验，为传染性法氏囊病亚单位疫苗的研发、应用提供依据。
所选序列来自自青岛海华生物集团股份有限公司分离鉴定的传染性法氏囊病毒IBDV-V毒株序列，基因分析表明该病毒的核苷酸序列和氨基酸序列与BQ902、HK46、UK661、Gx、SD10LY01、SH95等超强毒株序列高度同源，其核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性分别在98.0％～99.8％和97.7％～99.5％之间；SPF鸡攻毒试验表明该毒株可引起鸡法氏囊高度损伤，并致鸡死亡。
经过对病毒结构蛋白的氨基酸序列分析与筛选，对其进行短芽孢杆菌偏好密码子优化后，将该病毒VP2蛋白的aa1M-52T，aa188G-227I，aa314T-420T三段氨基酸序列用linker进行串联，这样制备的多表位融合蛋白能够诱导机体产生特异性免疫应答，保护靶动物(SPF鸡)免受传染性法氏囊病毒的感染。
本发明实施例中提供的多表位融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的融合蛋白。编码上述融合蛋白的基因，其一种具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；根据短芽孢杆菌密码子偏好性优化后，具体的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
本领域技术人员可以针对用于表达融合蛋白的宿主情况对融合蛋白进行改造。
所述的调整，其一种方式是通过取代、缺失、添加一个或几个氨基获得的衍生蛋白；也可以是通过在3′或5′端连接有其它功能分子来增加表达效率或免疫效果。
本发明又一方面是提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有用于编码上述融合蛋白的基因核酸片段。
上述重组表达载体的一种制备方法如下：将筛选出的含多表位的三个片段的核苷酸序列用融合PCR方法以linker串联得到拼接核苷酸片段后，用串联目的基因上下游添加的BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶位点对串联好的目的基因和枯草芽孢杆菌穿梭表达质粒pNC-HisT进行双酶切进而连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α得到。
将构建好的pNC-HisT-IBDVP2M重组质粒由DH5α中提取出来后，将重组质粒pNC-HisT-VP2通过NTP转化方法转化到B.choshinensis HPD31-SP3感受态中，将转化后的菌体悬液涂于MTNm平板，37℃过夜培养。从转化平板上挑取单克隆，菌液PCR鉴定阳性克隆。提取阳性克隆中的重组质粒，进行双酶切鉴定和测序比对鉴定。
确定重组质粒中目的片段序列正确后，活化含pNC-HisT-IBDVP2M的B.choshinensis HPD31-SP3感受态细胞进行发酵诱导培养，得到含多表位融合抗原的蛋白液；
对上述融合抗原蛋白液进行免疫原性验证，利用Western-blot方法确认融合蛋白的表达情况与分子量大小。
上述Western-blot方法参照梁国栋主编的《最新分子生物学实验技术》中蛋白印记实验操作技术完成。
进一步，对融合抗原蛋白液进行纯化浓缩得到融合抗原；
本发明中利用得到的抗原蛋白制备传染性法氏囊病毒多表位疫苗的方法包括如下步骤：
(1)油相制备：取白油、硬脂酸铝，按比例80℃加热混匀后加入适量司本-80，130℃加热混匀，待各成分充分溶解并冷却后得到油相；
(2)水相制备：将传染性法氏囊结构蛋白VP2多表位融合抗原与适量灭菌的吐温-80充分混匀；
(3)乳化制备：将水相和油相按1∶2～1∶3的比例乳化后得到多表位疫苗。
本实施例中基因合成、所有PCR引物片段均由生工生物工程上海(股份)有限公司提供；所有PCR试剂、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ，连接酶T4 DNA ligase购自TaKaRa-宝生物工程(大连)有限公司；传染性法氏囊VP2单克隆抗体购自绿都生物；法氏囊琼扩阳性血清和琼扩抗原购自中国兽医药品监察所；显色底物DAB购自天根的增强型HRP-DAB底物显色试剂盒。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：传染性法氏囊病毒多表位抗原重组载体构建和表达
设计引物M1F、M1R从分离得到的法氏囊强毒株IBDV-V中扩增结构蛋白VP2的aa1M-52T片段，引物M2F、M2R扩增aa188G-227I片段，引物M3F、M3R扩增aa314T-420T所对应的核苷酸序列。三个片段之间用引物上添加的连接肽linker核苷酸序列进行串联。
串联的多表位蛋白氨基酸序列如下所示：
MTNLQDQTQQIVPFIRSLLMPTTGPASIPDDTLEKHTLRSETSTYNLTVGDTGGGSGLDPKMVATCDSSDRPRVYTITAADDYQFSSQYQAGGVTIGGGSTSKSGGQAGDQMSWSASGSLAVTIHGGNYPGALRPVTLVAYERVATGSVVTVAGVSNFELIPNPELAKNLVTEYGRFDPGAMNYTKLILSERDRLGIKTVWPTREYT(SEQ ID NO:1)
上述带下划线部分：GGGS为linker氨基酸序列；
编码上述融合蛋白的基因IBDVP2M，其序列如下：
ATGACAAACCTGCAAGATCAAACCCAACAGATTGTTCCGTTCATACGGAGCCTTCTGATGCCAACAACCGGACCGGCGTCCATTCCGGACGACACCCTAGAGAAGCACACTCTCAGGTCAGAGACCTCGACCTACAATTTGACTGTGGGGGACACAGGTGGAGGTTCGGGGCTCGACCCAAAAATGGTAGCAACATGTGACAGCAGTGACAGGCCCAGAGTCTACACCATAACTGCAGCCGACGATTACCAATTCTCATCACAGTACCAAGCAGGTGGGGTAACAATCGGTGGAGGTTCGACCTCCAAAAGTGGTGGTCAGGCGGGGGATCAGATGTCATGGTCAGCAAGTGGGAGCCTAGCAGTGACGATCCACGGTGGCAACTATCCAGGGGCCCTCCGTCCCGTCACACTAGTAGCCTACGAAAGAGTGGCAACAGGATCTGTCGTTACGGTCGCCGGGGTGAGCAACTTCGAGCTGATCCCAAATCCTGAACTAGCAAAGAACCTGGTCACAGAATACGGCCGATTTGACCCAGGAGCCATGAACTACACAAAATTGATACTGAGTGAGAGGGACCGTCTTGGCATCAAGACCGTATGGCCAACAAGGGAGTACACTGACTTTCGCGAGTACTTCATGGAGGTGGCCGACCTCAACTCTCCCCTGAAG(SEQID NO:2)
优化后编码上述融合蛋白的基因IBDVP2M，其序列如下：
ATGACAAATCTTCAGGATCAAACACAGCAAATTGTTCCATTTATCAGAAGTTTGTTAATGCCGACAACAGGGCCTGCATCAATACCTGATGACACACTCGAAAAACATACATTGCGCTCTGAAACAAGCACGTATAATTTAACTGTCGGAGATACGGGTGGAGGTTCGGGTCTTGATCCAAAAATGGTAGCAACGTGCGACTCTTCTGACCGGCCTCGAGTGTACACGATTACAGCTGCGGATGATTATCAGTTCTCAAGCCAATATCAAGCGGGTGGTGTGACGATCGGTGGAGG TTCGACTTCGAAATCCGGGGGGCAGGCAGGAGACCAAATGTCATGGAGCGCCTCGGGCTCCCTGGCTGTCACCATTCACGGCGGAAACTATCCGGGCGCGCTGAGGCCTGTTACGCTTGTCGCTTATGAAAGAGTAGCCACCGGAAGTGTCGTAACCGTTGCCGGTGTTTCAAACTTTGAATTGATTCCGAATCCCGAGCTTGCAAAAAATCTGGTGACTGAGTACGGCCGTTTTGATCCGGGAGCGATGAACTATACAAAGCTGATTTTATCTGAGCGGGACCGCCTCGGCATCAAAACAGTTTGGCCGACTCGTGAATACACAGATTTCAGAGAATATTTTATGGAAGTGGCTGATCTAAACAGCCCGCTGAAG(SEQID NO:3)
上述带下划线部分：GGTGGAGGTTCG为linker位置；
制备氨基酸序列为SEQ ID NO:1的多表位抗原融合蛋白的具体步骤如下：
1、目的基因扩增
以如下所示引物进行PCR扩增，添加BamHI酶切位点、HindⅢ酶切位点及同源序列，依靠重叠延伸PCR技术进行串联。
重组所用设计引物(下划线表示酶切位点，斜体为终止密码子)如下：
M1F：CGGGATCCATGACCAATCTGCAGGATCA；
M1R：CGAACCTCCACCGGTATCGCCAACGGTCAG；
M2F：GGTGGAGGTTCGGGCCTGGACCCTAAAATG；
M2R：CGAACCTCCACCAATGGTAACGCCGCCG；
M3F：GGTGGAGGTTCGACCAGTAAAAGCGGTGG；
M3R：CCAAGCTTTCAGGTATATTCACGGGTCGGCCAC。
2、重组表达载体构建和鉴定
采用限制性内切酶BamHI和HindⅢ对目的基因IBDVP2M和质粒pNC-HisT进行双酶切(37℃，3h)，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并用胶回收试剂盒回收目的DNA片段。在无菌离心管中加入6μl双酶切的IBDVP2M、2μl双酶切的质粒、1μl T4连接酶、1μl T4连接缓冲液，4℃过夜连接；将10μl连接产物加入到50μl的DH5α感受态中，42℃热激90s，加入700μl LB液体培养基，37℃震荡培养40min，将菌液涂布在含氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃过夜培养。从转化平板上挑取单克隆接种到含氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃过夜培养。菌液PCR鉴定(图1)阳性克隆，利用质粒小提试剂盒提取阳性克隆质粒，用BamHI和HindⅢ内切酶对重组质粒进一步酶切(图2)和测序鉴定，鉴定阳性的重组质粒命名为pNC-HisT-IBDVP2M。
菌落PCR引物如下：
M1F：CGGGATCCATGACCAATCTGCAGGATCA，
M3R：CCAAGCTTTCAGGTATATTCACGGGTCGGCCAC；
测序引物如下：
MrevF：CGCTTGCAGGATTCGG，
MfwdR：CAATGTATTCCTACCTGC。
菌落PCR扩增按照如下程序进行：98℃预变性3min；30个Cycle(98℃变性10s；65℃退火5s；72℃延伸20min)；72℃延伸5min。
3转化短芽孢杆菌
将重组质粒pNC-HisT-IBDVP2M通过NTP转化方法转化到B.choshinensis HPD31-SP3感受态中，将转化后的菌体悬液涂于MTNm平板，37℃过夜培养。从转化平板上挑取单克隆，菌液PCR鉴定阳性克隆。具体方法如下：
将5μl重组质粒pNC-HisT-IBDVP2M与50μl溶液a(随上述芽孢杆菌感受态细胞附赠)混匀后加入芽孢杆菌感受态细胞中混匀，室温静置5min。之后加入150μl溶液b(随上述芽孢杆菌感受态细胞附赠)混匀，离心去掉上清液后加入1ml MT液体培养基重悬，并置于37℃摇床120rpm孵育2h。孵育完成后将菌液涂布于含50μg/ml新霉素的MTNm平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落于含50μg/ml新霉素的MT液体培养基中培养并进行菌液PCR和测序鉴定。鉴定阳性的单菌落命名为pNC-HisT-IBDVP2M(SP3)。
主要试剂配置：
MT液体培养基：葡萄糖10.0g，蛋白胨10.0g，35％Ehrlich鲣鱼提取物5.75g，酵母提取物2.0g，FeSO4·7H2O 10mg，MnSO4·4H2O 10mg，ZnSO4·7H2O 1mg，MgCl2·6H2O 4.1g，加双蒸水定容至1L，用5mol/L NaOH调节pH至7.0后高压蒸汽灭菌。
MTNm固体培养基：在1L MT液体培养基中加入15g琼脂或琼脂糖，高压蒸汽灭菌，待冷却至50℃左右时，超净工作台中，加入新霉素溶液至终浓度为50μg/ml，之后倒入培养皿中，室温凝固，封口膜封严置4℃冰箱保存备用。
4重组载体小量诱导表达
将重组菌株菌种pNC-HisT-IBDVP2M(SP3)接种于MT液体培养液(含新霉素50μg/mL)中，次日按照1％的接种量接种入新鲜的MT培养液(含新霉素50μg/mL)中，37℃震荡培养，当菌液OD600＝0.6～0.8时，加入终浓度为1m mol/L IPTG，30℃震荡培养60h。7000r/min离心取上清，SDS-PAGE电泳分析表达上清。
5重组多表位融合蛋白表达鉴定
收集的发酵液离心收集菌体，并对发酵液上清经10％ SDS-PAGE结束后，将未染色的聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白经半干转膜2h(1-2mA/cm2)转移到NC膜上，5％脱脂奶粉封闭，以鼠源抗法氏囊VP2蛋白单抗作为一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，依次与之反应，最后用显色底物DAB显色；实验结果显示重组蛋白能被鼠源抗法氏囊VP2蛋白单抗识别，在大小约为25kD左右出现目的蛋白(图3)，表达的蛋白的大小符合理论值。
6重组多表位融合蛋白纯化
将发酵液离心收集菌体，将发酵上清液装入排阻20kD透析袋中进行PEG5000浓缩，将浓缩蛋白液用镍柱进行纯化，PEG2000浓缩得到融合抗原，得到抗原蛋白浓度约为1mg/ml。
7重组多表位融合蛋白纯化后琼扩滴度测定
制备1％的琼脂平板，用直径3mm的梅花打孔器打孔，将孔中琼脂挑出后置于火焰上封底待用。中心孔加入传染性法氏囊病毒阳性血清，周围孔加入2倍比稀释至23～26的纯化多表位抗原蛋白(1mg/ml)，37℃孵育，经24h～48h观察记录结果，以中心孔与待检孔之间出现免疫沉淀线的最高稀释倍数确定多表位抗原的琼扩滴度，经观察，中心孔与周围孔之间出现沉淀线。短芽孢杆菌表达全长VP2蛋白AGID滴度为1∶4，与之相比，多表位蛋白AGID滴度为1∶8，即多表位蛋白具有更强的免疫原性，另外纯化多表位抗原蛋白(1mg/ml)AGID滴度为1∶32以上(图4)。
实施例2：法氏囊病毒多表位基因工程亚单位疫苗的制备
1制备疫苗
将上述实施例1中得到的重组多表位抗原样品经灭活及无菌检验后以水相：油相为1:2体积比例混合后充分乳化，制成传染性法氏囊病毒结构蛋白VP2多表位疫苗。
2免疫
取21日龄SPF鸡30只，分为3组，每组10只，第1组颈部皮下注射疫苗0.3ml，第2组胸部肌肉注射疫苗0.3ml，第3组不免疫作为空白对照。免疫后21天每只鸡采血1ml，分离血清，进行琼脂扩散试验和鸡胚病毒中和试验测定血清中抗体效价。
2.1琼脂免疫扩散试验(AGID)方法测定血清中抗体效价
按上述实施例1中7的方法制备1％琼脂板并打孔，中心孔加入购买的传染性法氏囊琼扩抗原，周围孔加入2倍比稀释至210的不同稀释度的免疫鸡血清，37℃孵育，以中心孔与待检孔之间出现免疫沉淀线的最高稀释倍数确定待检血清的抗体效价，经24h～48h观察记录结果，免疫组的鸡至少8只琼扩抗体效价不低于25，对照组鸡全部阴性。
2.2鸡胚病毒中和试验
2.2.1根据传染性法氏囊病毒BC6/85毒株对鸡胚半数致死量(ELD50)用灭菌生理盐水将病毒稀释成100个ELD50/0.1ml；从上述2个免疫组中选取抗体AGID效价最高的血清进行4倍比稀释，取4-1～4-5 5个梯度进行病毒中和试验。
将稀释好的病毒分别与各稀释度血清等量混合后37℃孵育1小时后，每个梯度接种5枚11日龄SPF鸡胚，每枚0.2ml；病毒对照组接种100个ELD50/0.1ml病毒液5枚，每枚0.2ml；空白对照组接种生理盐水5枚，每枚0.2ml。接种后将此35枚鸡胚置于37℃孵化箱，每日观察记录鸡胚死亡情况，及时将死亡鸡胚取出，弃去24h内死亡鸡胚，至144h时将鸡胚全部取出。最后按Reed-Muench氏法计算中和指数。
2.3免疫攻毒
取21日龄SPF鸡30只，分为3组，每组10只，第1组颈部皮下注射疫苗0.3ml，第2组胸部肌肉注射疫苗0.3ml，第3组不免疫疫苗作为空白对照。免疫后21天3组均通过点眼滴鼻方法接种鸡传染性法氏囊病毒强毒BC6/85株病毒液0.1ml(含毒量≥100个BID)。攻毒后每日观察攻毒鸡的临床表现，记录发病和死亡情况，连续观察96h后扑杀所有存活鸡，逐只解剖，观察有无法氏囊病变，以法氏囊肿大或萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等特征性病变作为发病判断标准。免疫组至少8只无死亡或特征性病变，对照组至少8只出现特征性病变。
表1：免疫21天鸡血清抗体(AGID)效价表
免疫后试验鸡血清抗体(AGID)效价结果如表1所示，免疫后21天，传染性法氏囊多表位疫苗免疫血清琼扩抗体效价在1∶32～1∶64左右，对照组鸡抗体效价均为阴性。
表2：鸡胚病毒中和试验-血清抗体中和指数表
鸡胚病毒中和试验结果(见表2)显示，该血清在1∶39.8稀释时可保护50％的11日龄SPF鸡胚；
表3：实验鸡攻毒检验结果表
实验鸡攻毒检验结果见表3，表明免疫组鸡全部保护，说明该法氏囊多表位抗原制成的疫苗能够诱导机体产生免疫反应，且对机体产生良好的保护作用。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的融合蛋白。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。
5.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体中插入有权利要求2所述的基因。
6.一种重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株中包含有权利要求5所述的重组表达载体。
7.如权利要求6所述的重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株为短芽孢杆菌工程菌。
8.权利要求6所述的重组工程菌株在发酵制备权利要求1所述的融合蛋白中的应用。
9.权利要求1所述的融合蛋白在制备传染性法氏囊病毒亚单位疫苗中的应用。
10.一种传染性法氏囊病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗的抗原包含有权利要求1所述的融合蛋白。
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