CN108359682B

CN108359682B - 一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC

Info

Publication number: CN108359682B
Application number: CN201810132417.1A
Authority: CN
Inventors: 张志强; 高桂生; 吴同垒; 史秋梅; 苏硕青; 李巧玲
Original assignee: Hebei Normal University of Science and Technology
Current assignee: Hebei Normal University of Science and Technology
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: CN108359682A

Abstract

本发明公开了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在亚单位疫苗中的应用，利用原核表达方法制备得到该重组蛋白，具体包括，pMD18‑T‑pagC载体的构建，重组表达载体pET‑32a‑pagC的构建和重组蛋白原核表达；利用Western blot检测迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，以及使用动物实验评估其免疫保护力。通过本发明公开的具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。

Description

一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC。

背景技术

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)是水产养殖中十分常见的病原细菌，能够广泛引起多种海水和淡水鱼类感染发病，造成高死亡率和淘汰率，给水产养殖造成重大损失。此外，E.tarda也可以感染人，且病型复杂，严重可致败血症，危及生命，具有重要公共卫生学价值。

针对水产上日益严重的迟缓爱德华菌感染问题，传统的抗生素和化学药剂已难以满足生产的需要，设计开发用于水产使用的疫苗是当前研究的热点。目前针对迟缓爱德华菌病疫苗的研制已经开展并取得了一定的成果，寻求更高效、使用更便捷的疫苗的研究也一直没有停止。对于E.tarda而言，基于保护性抗原筛选研究的亚单位疫苗和活载体疫苗研究成为研究的热点。

其中，PagC是存在于迟缓爱德华菌外膜的孔道蛋白，最初发现于伤寒沙门菌，是Ail/OmpX/PagC外膜蛋白家族成员。PagC蛋白不仅仅是结构性的外膜蛋白，还参与多种生物学功能，有研究表明，该蛋白受控于phoP-phoQ--双组份调控系统，与细菌的胞内存活和毒力密切相关，此外该蛋白还被报道参与细菌对抗血清杀伤作用以及外膜小泡的形成。

但是，目前目前对迟缓爱德华菌PagC蛋白的研究较少，NCBI上登录的序列较少，对已登录的几种细菌pagC基因序列进行分析发现，该基因在同种属细菌间高度保守，但在不同种属细菌间差异极大，揭示该蛋白可作为诊断基因应用。

因此，纯化迟缓爱德华菌PagC蛋白，制备出具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，利用原核表达系统对其表达纯化，通过动物实验评估该迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的免疫保护力，为进一步研制迟缓爱德华菌亚单位疫苗和核酸疫苗靶点选择奠定基础。本发明利用外源表达的重组蛋白作为免疫原，更为安全，同时动物模型也确定了该蛋白的免疫保护效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在亚单位疫苗中的应用

进一步地，所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达方法制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)pMD18-T-pagC的构建：

根据E.tarda参考菌株ET-1基因组序列pagC基因设计引物，所述引物序列如下：

P1：5'-GGAATTCATGAAAAAACAGATCGCTGGAC-3'，带有EcoR Ⅰ酶切位点；SEQ ID NO：1

P2：5'-GCGTCGACAAAACGGTAGCCGAGACCGACG-3'，带有Sal Ⅰ酶切位点；SEQ ID NO：2

利用细菌基因组提取试剂盒提取E.tarda基因组，以其作为模板PCR扩增目的基因；

2)重组表达载体pET-32a-pagC的构建：

利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ对pMD18-T-pagC载体进行双酶切，回收的pagC基因片段，构建重组表达质粒pET-32a-pagC，转化感受态细胞后挑取克隆进行PCR和双酶切验证，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码；

3)迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达：

将重组载体pET-32a-pagC和空载体分别转化到宿主菌中，阳性克隆接种到液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD₆₀₀值为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h。

进一步地，步骤2)中所述感受态细胞为DH5α。本发明在使用重组表达质粒pET-32a-pagC转化时，DH5a可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于筛选鉴别重组菌株。

进一步地，步骤3)中所述宿主菌为BL21工程菌。

进一步地，步骤3)中所述液体LB培养基为含有氨苄青霉素的液体LB培养基，其中所述氨苄青霉素的浓度为25-50μg/L。

所述迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的鉴定方法为Western blot检测；步骤如下：

将权利要求1步骤3)中所述菌悬液离心收集菌体，超声裂解后收集沉淀和上清，利用SDS-PAGE分析蛋白表达，以His-Mab为一抗、山羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Western blot检测。

进一步地，所述一抗浓度为1:600～1000；所述一抗浓度为1:2000～5000。

所述迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC通过动物实验评估其免疫保护力；

所述动物实验评估方法为：在动物免疫前后不同时间点，以眶下窦采取动物血液并分离血清，以超声破碎的所述迟缓爱德华菌全菌蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测动物血清中抗体的效价，以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准。

本发明公开提供了一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，至少有以下优点：

(1)表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC能够被E.tarda阳性血清所识别，且在E.tarda自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即本发明中原核表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC对E.tarda感染具有较好的免疫保护力。

(2)迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC能够使机体产生较高水平特异性抗体，且在加强免疫后达到最高水平，本发明中的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC可在血清学诊断上进行应用。

(3)本发明公开的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC免疫小鼠后能够使95％的免疫小鼠得到保护，即本发明中的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在E.tarda疫苗研究中具有广阔的前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明提供的不同菌株pagC基因同源性分析；

图2附图为本发明提供的PCR扩增E.tarda pagC基因的琼脂糖凝胶电泳图；

其中，泳道M为Marker；泳道1为E.tarda pagC基因；

图3附图为本发明提供的SDS-PAGE分析迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在大肠杆菌中的表达；

其中，泳道M为Marker；泳道1和泳道2为pET-32a-pagC/BL21；泳道3为pET-32a/BL21；

图4附图为本发明提供的本发明提供的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的纯化效果电泳图；

其中，泳道M为Marker；泳道1为纯化过的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC；

图5附图为本发明提供的Western blot鉴定迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在大肠杆菌中的表达；

其中，泳道1为pET-32a-pagC/BL21；泳道2为pET-32a/BL21；

图6附图为本发明提供的Western blot分析阳性血清对迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的识别；

其中，泳道1为迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC；2为阴性对照；

图7附图为本发明提供的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC对小鼠的免疫保护效果；

图8附图为本发明提供的免疫小鼠血清的抗体水平变化。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

载体pMD18-T-pagC的构建

根据GenBank上登录的E.tarda参考菌株ET-1基因组序列(CP001135.1)pagC基因设计引物，引物序列如下：

P1：5'-GGAATTCATGAAAAAACAGATCGCTGGAC-3'，带有EcoR Ⅰ酶切位点；SEQ ID NO：1；

P2：5'-GCGTCGACAAAACGGTAGCCGAGACCGACG-3'，带有Sal Ⅰ酶切位点；SEQ ID NO：2；

利用细菌基因组提取试剂盒提取E.tarda基因组，以其作为模板PCR扩增目的基因。利用PCR方法扩增出完整的E.tarda pagC基因，将E.tarda pagC基因测序后与参照GenBank中E.tarda参考菌株及其它肠杆菌科细菌pagC基因序列对测序结果进行比对分析；比对结果如图1，分析结果显示，爱德华菌属成员间pagC基因高度保守，但与其他细菌缺少序列同源性；并以pMD18-T质粒为载体，连接目的基因，构建pMD18-T-pagC载体。

实施例2

重组表达载体pET-32a-pagC的构建

以pMD18-T-pagC为模板，用PCR扩增目的基因，表达的目的基因Ni离子琼脂糖凝胶如图2，其大小为558bp；利用质粒pET-32a连接回收的pagC基因片段，构建重组表达质粒pET-32a-pagC，将构建重组表达质粒pET-32a-pagC转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，即利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-pagC载体进行双酶切，回收的pagC基因片段，进行琼脂糖凝胶鉴定pagC基因，出现大小与PCR扩增结果一致的条带；将阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码。

实施例3

迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达及Western blot检测

将重组载体pET-32a-pagC和空载体pET-32a分别转化BL21工程菌中，将阳性克隆接种含有氨苄青霉素的液体LB培养基中，其中氨苄青霉素的浓度为50μg/L，37℃震摇培养至OD₆₀₀值为0.7，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养5h，离心收集菌体，超声裂解后收集沉淀和上清，利用SDS-PAGE分析蛋白表达，结果如图3，结果显示在40ku处出现目的蛋白。进一步对菌体裂解物进行纯化，纯化后的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的SDS-PAGE电泳如图4，并测定迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的浓度为0.24mg/mL。进一步以His-Mab为一抗、HRP-IgG为二抗，其中一抗浓度为1:1000，二抗浓度为1:5000，利用Western blot进一步验证迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的正确表达，结果如图5。

实施例4

动物免疫试验

随机将40只健康昆明鼠随机分成两组，即迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC免疫组和阴性对照组，每组20只。迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC免疫组，每只昆明鼠注射30μg迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC(白油乳化)，背部皮下多点初次免疫昆明鼠，2周后和30d后分别使用上述方法加强免疫；同时，阴性对照组，每只昆明鼠注射等体积PBS(白油乳化)。在昆明鼠免疫前后，以眶下窦分别采取小鼠血液并分离血清，以超声破碎的迟缓爱德华菌全菌蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗体的效价，以阴性血清OD₄₅₀平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准，结果如图8。由如图8可知，迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC免疫小鼠能够产生较高水平特异性抗体，在加强免疫后达到最高水平。第48天后分别对两组昆明鼠腹腔接种5LD50(2.0×10⁷cfu)迟缓爱德华菌ET-13菌液，感染后观察4d，统计死亡数量，结果如图7，由图7可知，迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC免疫小鼠后具有较好的保护力，保护率为95％。

制备E.tarda感染小鼠阳性血清，利用Western blot方法检测迟缓爱德华菌外膜蛋白的免疫原性，结果如图6，由图6可知E.tarda感染小鼠阳性血清可以特异性识别迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC。

综上所述，本发明中的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC，能够被E.tarda阳性血清所识别，且在E.tarda自然感染过程中，该蛋白可诱导机体产生抗体，即本发明中原核表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC对E.tarda感染具有较好的免疫保护力，且在加强免疫后达到最高水平，能够使95％的免疫小鼠得到保护，本发明公开的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在E.tarda疫苗研究中具有广阔的前景。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 河北科技师范学院

<120> 一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggaattcatg aaaaaacaga tcgctggac 29

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gcgtcgacaa aacggtagcc gagaccgacg 30

Claims

1.一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在制备亚单位疫苗中的应用；

其中，具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达制备方法的具体步骤如下：

1)pMD18-T-pagC载体的构建

P1：5'-GGAATTCATGAAAAAACAGATCGCTGGAC-3'，带有EcoRⅠ酶切位点；SEQ ID NO：1

P2：5'-GCGTCGACAAAACGGTAGCCGAGACCGACG-3'，带有SalⅠ酶切位点；SEQ ID NO：2

利用细菌基因组提取试剂盒提取E.tarda基因组，以其作为模板PCR扩增目的基因，以pMD18-T作为质粒，构建pMD18-T-pagC载体；

2)重组表达载体pET-32a-pagC的构建

利用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ对pMD18-T-pagC载体进行双酶切，回收的pagC基因片段，构建重组表达质粒pET-32a-pagC，转化感受态细胞后挑取克隆进行PCR和双酶切验证，阳性克隆提取质粒进行序列测定，确保无突变和移码；

3)迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的原核表达

将重组载体pET-32a-pagC和空载体分别转化到宿主菌中，阳性克隆接种到液体LB培养基中，37℃震摇培养至OD 600 值为0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导培养4h～6h；

将表达的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC白油乳化；

步骤2)中，所述感受态细胞为DH5α；

步骤3)中，所述宿主菌为BL21工程菌；

步骤3)中，所述液体LB培养基为含有氨苄青霉素的液体LB培养基，其中所述氨苄青霉素的浓度为25-50μg/L。

2.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC的鉴定方法为Westernblot检测；步骤如下：

将权利要求1所述步骤3)中的菌悬液离心收集菌体，超声裂解后收集沉淀和上清，利用SDS-PAGE分析蛋白表达，以His-Mab为一抗、山羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Western blot检测。

3.根据权利要求2所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述一抗浓度为1:600～1000；所述二抗浓度为1:2000～5000。

4.根据权利要求1所述的一种具有免疫保护作用的迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC在制备亚单位疫苗中的应用，其特征在于，所述迟缓爱德华菌外膜蛋白PagC通过动物实验评估其免疫保护力；

所述动物实验评估方法为：在动物免疫前后，分别以眶下窦采取动物血液并分离血清，以超声破碎的所述迟缓爱德华菌全菌蛋白作为包被抗原，利用间接ELISA方法检测动物血清中抗体的效价，以阴性血清OD 450 平均值加3倍标准差作为阴阳性判定标准。