CN114903986B

CN114903986B - 一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法

Info

Publication number: CN114903986B
Application number: CN202210656141.3A
Authority: CN
Inventors: 汤细彪; 黄超; 李倩倩; 龙云志; 杨柳; 宋文博; 黄英; 梁巩; 余道兵; 周明光; 徐高原
Original assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Current assignee: Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date: 2022-06-11
Filing date: 2022-06-11
Publication date: 2023-12-01
Anticipated expiration: 2042-06-11
Also published as: CN114903986A

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法，该疫苗含抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918和佐剂，抗原HP0526的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，抗原HP1130的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，抗原HP0918的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。该疫苗的制备方法为：利用基因克隆、蛋白表达和纯化技术获得抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918，将抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918与佐剂混合，制备猪链球菌三组分亚单位疫苗。该三组分亚单位疫苗可用于保护猪对抗猪链球菌血清2、3、7和9型的感染，且比市售猪链球菌亚单位疫苗和灭活疫苗的效果更佳。

Description

一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法

技术领域

本发明涉及生物疫苗技术领域，具体涉及一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种人畜共患病原菌，部分高致病性菌株不仅引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、肺炎或急性死亡等，且危害与养殖业密切相关的人群健康，引起人类脑膜炎、肺炎、感染性休克和死亡。根据菌体荚膜多糖抗原性的区别，猪链球菌可分为35种血清型(1～34型和1/2型)，其中血清2型在猪群和患病人群中的分离率最高，血清9、3和7型分离率次之。

疫苗是动物疫病防控的重要且有效的手段之一，目前猪链球菌疫苗主要分为灭活疫苗、弱毒活疫苗和亚单位疫苗。灭活苗制作周期短、使用安全、易于存放，但接种后不能在体内繁殖，因此所需接种剂量大、免疫周期短，需要加入佐剂增强其免疫效果；弱毒苗虽然毒力致弱，但仍能在体内繁殖且运输、储存都不方便、研究周期长，存在毒力返强的风险；此外，由于猪链球菌血清型众多，灭活疫苗和弱毒活疫苗对多个血清型的保护能力有限，使得保护效果不理想。相比于传统疫苗，基因工程亚单位疫苗主要是利用病原的免疫保护成分，能够有效地避免由于灭活苗或弱毒苗所导致的热原副反应发生，而且机体只产生针对基因工程亚单位疫苗所使用的抗原的高水平特异性抗体，安全性相对较高。因此，细菌的基因工程亚单位疫苗逐渐成为了研究热点。

发明内容

基于上述现有技术，本发明提供了一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法，可用于保护猪对抗猪链球菌血清2、3、7和9型的感染。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种猪链球菌三组分亚单位疫苗，其特征在于：该三组分亚单位疫苗含抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918和佐剂，抗原HP0526的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，抗原HP1130的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，抗原HP0918的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述的佐剂为IMS 1313VGN佐剂。

进一步，所述的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918三种抗原混合后与佐剂按质量比为1：1混合。

一种猪链球菌三组分亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

步骤1、以保藏号为CCTCC NO：M2011282的猪链球菌血清2型SS2LT菌株基因为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ IDNO.9所示的引物对分别对HP0526、HP1130、HP0918基因进行PCR扩增，得到HP0526基因目的片段、HP1130基因目的片段和HP0918基因目的片段；

步骤2、将pET28a载体用BamHI+XhoI或EcoRI+HindIII进行双酶切，得到表达载体；

步骤3、将表达载体分别与HP0526基因目的片段、HP1130基因目的片段、HP0918基因目的片段进行同源重组，分别获得三种重组表达载体；

步骤4、将三种重组表达载体分别转化大肠杆菌DH5α感受态，接着分别提取三种重组质粒，将三种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21感受态，分别进行诱导表达、培养和纯化，分别得到纯化的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918；

步骤5、将纯化的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918与佐剂混合均匀，抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918三种抗原混合后和佐剂的质量比为1：1，得到所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗。

进一步，所述的三组分亚单位疫苗中，抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918的浓度分别为250ug/mL。

进一步，所述的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918的质量比为1:1:1。与现有技术相比，本发明的有益效果和优点在于：

本发明的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918由猪链球菌血清2型SS2LT菌株的HP0526基因、HP0918基因、HP1130基因编码，三种抗原蛋白均具有良好的免疫原性，将这三种蛋白与佐剂制成猪链球菌三组分亚单位疫苗，可用于保护猪对抗猪链球菌血清2、3、7和9型的感染，且比市售猪链球菌亚单位疫苗和灭活疫苗的效果更佳。

附图说明

图1为实施例1中用于筛选抗原蛋白的基因PCR扩增后的电泳结果图：

其中，图1(a)中，泳道1为SSU0253；泳道2为RopE；泳道3为Enolase；泳道4为dna；泳道5为EF；泳道6为SOR；泳道7为abc；泳道8为EF-TU；泳道9为5000DNA maker；泳道10为2000DNA maker；泳道11为CapA；泳道12为tk；泳道13为Lys；泳道14为hyp；泳道15为FA1；泳道16为FA3；泳道17为FA4；泳道18为Lmb；图1(b)中，泳道M为2000DNAmaker；泳道1～2为murA；泳道3为Vick；泳道4为pbp2A；泳道5为murB；泳道6为cpdB；泳道7为gcp；泳道8为murE；泳道9为pdgA；泳道10为SSU0186；泳道11为IBP；图1(c)中，泳道M为5000DNAmaker；泳道1为SSnA；泳道2为Abpb；泳道3为abc；泳道4为Htpsc；泳道5为Agas；泳道6为HP0526；泳道7为SSU0215；泳道8为HP0918；泳道9为SSU1355；图1(d)中，泳道M为2000DNA maker；泳道1为ESA；泳道2为Sly；泳道3为Sspepo；泳道4为Sbp；泳道5为FtsZ；泳道6为SSU0227；泳道7为Refa；图1(e)中，泳道M为2000DNA maker；泳道1为SSU1888；泳道2为HP0526；泳道3为HP1130；泳道4为ssp；泳道5为SSU1201；泳道6为SSU0425；

图2为实施例1中不同抗原蛋白制备的小鼠免疫疫苗第一轮筛选的免疫保护效力结果图；

图3为实施例1中不同抗原蛋白制备的小鼠免疫疫苗第一轮筛选的免疫保护效力结果图；

图4为实施例1中不同抗原蛋白制备的小鼠免疫疫苗第二轮筛选的免疫保护效力结果图；

图5为实施例1中初筛7种不同佐剂制备的小鼠免疫疫苗的抗体效价图；

图6为实施例1中复筛3种不同佐剂制备的猪免疫疫苗的抗体效价图；

图7为实施例1中3种重组蛋白纯化的电泳图：泳道M为蛋白maker；泳道1为纯化后的HP0526蛋白；泳道2为纯化后的HP1130蛋白；泳道3为纯化后的HP0918蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

1、抗原蛋白的筛选

1.1、引物设计

应用引物设计软件Primer 5.0，设计46对用于扩增编码抗原蛋白的基因的引物，引物由武汉擎科生物技术有限公司合成，扩增46对引物如表1所示：

表1用于扩增抗原蛋白的基因的引物

1.2、PCR扩增

以提取的猪链球菌血清2型SS2LT菌株的基因组作为PCR扩增的模板，使用表1所示的引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如表2所示：

表2 PCR扩增反应体系

PCR反应条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30～60sec/kb,35个循环，72℃彻底延伸5min。PCR扩增反应后，扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，并凝胶回收目的片段，51个编码抗原蛋白的基因扩增后的电泳图如图1(a-e)所示，

1.3、表达载体酶切

用BamHI+XhoI或EcoRI+HindIII对pET28a载体进行双酶切，酶切体系如表3：

表3 pET28a载体双酶切体系

在37℃反应3h，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳后进行琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA片段。

1.4、连接、转化及重组菌的筛选

利用ClonExpress II One Step Cloning Kit将步骤1.3中回收后的DNA片段和步骤1.2中的目的片段进行同源重组，配好连接体系后在37℃反应30min，连接后的重组表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态。连接体系如下表4：

表4表达载体和目的基因连接体系

转化后的单菌落进行PCR检测，鉴定正确后送武汉擎科生物股份有限公司进行测序，结果正确后进行提取质粒。将提取的质粒转化大肠杆菌BL21感受态，将获得的重组大肠杆菌在含50ug/mL的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀＝0.6时，取1mL菌液作为诱导前对照，向剩余的菌液中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，购自美国Invitrogen)至终浓度为0.5mM，在37℃摇床诱导表达8h。取1mL菌液按照如下方法进行下一步处理：在转速12000r/min下离心1min，弃上清，然后加入300μLPBS进行超声破碎，破碎后离心，分别取上清和沉淀，向上清中加入30μL上样缓冲液后在100℃沸水中煮沸10min，煮沸后用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定是否表达。结果在扩增的46个编码抗原蛋白的基因中，有22个蛋白基因成功克隆并在上清表达，分别为Agas、HP0526、SSU0215、SSU1888、ssp、HP0918、Abpb、dna、EF-TU、Enolase、FA4、FtsZ、gcp、abc、MurA、Sspepo、Rope、Sbp、Sly、HP1130、Tk、Vick。

1.5、抗原蛋白的诱导表达和纯化

将重组大肠杆菌的菌株接种于含相应抗生素的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养，从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含相应抗生素的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，当培养至OD₆₀₀达到0.6时，加IPTG至终浓度为0.5mmol/L(IPTG，购自美国Invitrogen)，在37℃摇床上继续培养8h后收集菌体。将收集的菌体使用Bindingbuffer重悬，超声波破碎，在4℃和转速12000r/min下离心15min，取上清向亲和层析柱中上样，分别使用Binding buffer和Washingbuffer洗柱直至OD值达到基线附近，换用Elutionbuffer洗脱结合的重组蛋白，收集波峰部分蛋白作为纯化的重组蛋白用于后续试验。

1.6、小鼠免疫保护效力实验(小鼠筛选)

将纯化后的24种重组蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂乳化制成免疫小鼠用疫苗，其中每种重组蛋白的浓度为450μg/mL，同时设置佐剂对照(即用PBS与等量弗氏佐剂乳化后制备)和空白对照(只注射PBS)。每组选取6～8周龄的雌性昆明小鼠10只，首免腿部肌肉注射弗氏完全佐剂乳化的小鼠免疫用疫苗0.4mL，2周后腿部肌肉注射弗氏不完全佐剂乳化的小鼠免疫用疫苗0.4mL进行加强免疫，对加强免疫2周后的小鼠进行攻毒试验，每组中的每只小鼠接种5LD₅₀剂量的猪链球菌2型SS2 LT菌株(保藏号为CCTCC NO：M2011282的猪链球菌2-LT)(LD₅₀为2.0×10⁸CFU)，连续观察1周，记录每组小鼠的临床特征及死亡情况；

结果如图2和图3所示，由图2和图3可知，除了基因Agas、dna、EF-TU、Enolase、FA4、FtsZ、gcp、MurA、Rope、Sbp、Sly和Tk编码的重组蛋白外，基因abc、HP0526、SSU0215、SSU1888、ssp、HP0918、Abpb、Sspepo、HP1130、Vick编码的重组蛋白均具有较高的保护力，保护率均在60％以上。

第二轮筛选：为筛选免疫原性最佳的保护性抗原，在以上试验的基础上将上述筛选出的10个保护力大于60％的重组蛋白进行二轮筛选，增加攻毒剂量，攻毒剂量为20LD₅₀剂量，结果如图4所示，由图4可知，基因HP0526、SSU0215、SSU1888、ssp、HP0918、Abpb、Sspepo、HP1130编码的重组蛋白均具有较高的保护力，保护率均在50％以上。

1.7、仔猪免疫保护效力实验(仔猪筛选)

1.7.1、将纯化的基因HP0526、SSU0215、SSU1888、ssp、HP0918、Abpb、Sspepo、HP1130编码的重组蛋白分别与弗氏完全佐剂制成仔猪免疫用疫苗，其中每种重组蛋白的浓度为750μg/mL，同时设置空白对照(只注射PBS)。选取4周龄的健康易感仔猪45头，分为9组，每组5头，首免颈部肌肉注射2mL/头，首免后3周加强免疫一次，免疫剂量和途径与首免相同，对加强免疫后2周的仔猪进行攻毒试验，每组中的每头仔猪接种猪链球菌2型SS2 LT菌株攻毒剂量为2.0×10⁶CFU，攻毒途径为耳缘静脉注射，攻毒后连续观察14天，记录每组仔猪临床特征及死亡情况；

结果见表5所示：

表5不同重组蛋白亚单位疫苗对猪链球菌SS2攻毒保护效果

由表5可知，除了基因Abpb、Sspepo编码的重组蛋白外，基因HP0526、SSU0215、SSU1888、SSP、HP1130、HP0918编码的重组蛋白制备的亚单位疫苗均具有较好的免疫保护效果，保护率均在60％以上；

1.7.1、增加攻毒剂量至(1.0×10⁷CFU)，攻毒后连续观察14天，记录每组仔猪临床特征及死亡情况；

结果见表6所示：

表6不同重组蛋白亚单位疫苗对猪链球菌SS2攻毒保护效果

由表6可知，只有基因HP0526、HP1130、HP0918编码的重组蛋白制备的亚单位疫苗具有较好的免疫保护效果，保护率均在60％以上；

综上所述，选用筛选出的三个重组蛋白(即HP0526、HP1130、HP0918、编码的重组蛋白)用于制备亚单位疫苗的抗原，将三个重组蛋白分别命名为抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918。

2、佐剂的筛选

2.1、小鼠初筛实验

2.1.1、选取市售的Summit Poly Solution(Sps，水佐剂)、ISA 201VG(双相油乳佐剂)、GEL02 PR(水溶性聚合佐剂)、IMS 1313VGN(水溶性纳米佐剂)、IMS 251C VG(水相液态纳米颗粒佐剂)、氢氧化铝佐剂(胶铝佐剂)和ISA 15AVG佐剂(矿物油佐剂)作为7种备选佐剂，将纯化的抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918与每种备选佐剂乳化制成小鼠免疫用疫苗，其中抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918的浓度分别为150ug/mL；

2.1.2、将80只体重为18-22g的Babl/C小鼠饲喂适应一周，随即分成8组，即7个备选佐剂组和1个对照组，7组备选佐剂组分别注射7种小鼠免疫用疫苗，对每个备选佐剂组中每只小鼠肌肉注射0.2mL小鼠免疫用疫苗，对照组注射同等剂量的PBS溶液，2周后，按照同等方法进行二次免疫，剂量为0.2mL，二次免疫14d后，将7组备选佐剂组和对照组中的小鼠进行眼眶后静脉丛采血，采用后离心，离心后将离心管中的血置于37℃恒温箱中1小时，再置于4℃下过夜，待血液凝固血块收缩后，在4000rpm下离心10分钟，取上清于洁净的离心管中，即为待测血清，将待测血清保存于-20℃；

2.1.3、采用间接Elisa法检测血清效价，分别用抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918包板，抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918包被量为50ng，将待测血清进行2倍倍比稀释，稀释完成后加样，接着加入酶标二抗(羊抗鼠)，最后加入TMB显色，测定450nm处的吸光值；

结果如图5所示，由图5可以看出，对于基因HP0526编码的抗原HP0526的抗体水平从高到低的佐剂依次为IMS 1313VGN、ISA 15AVG、IMS 251C VG、Sps、GEL02 PR、ISA 201VG、氢氧化铝佐剂，对于基因HP0918编码的抗原HP1130的抗体水平从高到低的佐剂依次为ISA15A VG、IMS 1313VGN、IMS 251C VG、ISA 201VG、Sps、GEL02 PR、氢氧化铝，对于基因HP1130编码的抗原HP0918的抗体水平从高到低的佐剂依次为IMS 1313VGN、ISA 15A VG、Sps、IMS251C VG、GEL02 PR、ISA 201VG、氢氧化铝佐剂。

2.1.4、二次免疫14d后，对每组小鼠进行猪链球菌2型SS2 LT菌株攻毒试验，攻毒剂量为5LD₅₀，连续7d观察小鼠的存活情况并统计存活率；

结果如表7所示：

表7不同佐剂组对猪链球菌SS2攻毒保护效果

由表7可知，佐剂IMS 1313VGN对猪链球菌2型SS2 LT菌株攻毒效果保护效价最好，达到80％，其次是佐剂ISA 15AVG和IMS 251C VG。

2.2、仔猪复筛实验

2.2.1、选取初筛得到的IMS 251C VG佐剂、IMS 1313VG N佐剂和ISA 15A VG佐剂作为3种备选佐剂，将纯化的抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918与每种备选佐剂乳化制成仔猪免疫用疫苗，其中抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918的浓度分别为250ug/mL；

2.2.2、筛选4周龄健康易感仔猪20头，随即分成4组，即3个备选佐剂组(每组5头)和1个对照组(5头)，对每个组备选佐剂组中的每头仔猪颈部肌肉注射2mL仔猪免疫用疫苗，对照组注射同等剂量的PBS溶液，按照同等方法进行二次免疫，剂量为2mL，二次免疫14d后，将3组备选佐剂组和对照组中的仔猪进行前腔静脉采血，采血后采用间接Elisa法检测血清效价，评价3种抗原蛋白对应的抗体水平，结果如图6所示，由图6可以看出，对于基因HP0526编码的抗原HP0526、基因HP0918编码的抗原HP1130和基因HP1130编码的抗原HP0918的抗体水平而言，IMS 1313VG N佐剂要优于ISA 15AVG佐剂和IMS 251C VG佐剂；

2.2.3、二次免疫14d后，对每组仔猪进行猪链球菌2型SS2 LT菌株攻毒试验，攻毒剂量为1×10⁷CFU/头，连续14d观察的存活情况并统计存活率；

结果如表8所示：

表8不同佐剂组对猪链球菌SS2攻毒保护效果

由表8可知，佐剂IMS 1313VG N对猪链球菌SS2LT株攻毒保护效价最佳，免疫保护为100％。

综合上述的抗体水平和攻毒保护效果，选定佐剂IMS 1313VG N作为配制多价亚单位疫苗的佐剂。

3、制备三组分亚单位疫苗

3.1、按照步骤1.1-1.5的方法进行基因克隆及蛋白表达，将获得的上清进行纯化，具体纯化步骤如下：

1)向亲和层析柱中加入1mLNi-NTA金属螯合His蛋白纯化介质填料(购GE公司)；

2)向亲和层析柱中加入20mLddH₂O洗涤；

3)加入20mL的Bindingbuffer(20mMNa₃PO₄，0.5MNaCl，20mM咪唑，pH＝7.4)平衡柱子；

4)加入经过0.45μm孔径滤器过滤的上清；

5)加入50mLBindingbuffer缓冲液平衡柱子；

6)加入50mLWashingbuffer缓冲液(20mMNa₃PO₄，0.5MNaCl，60mM咪唑，pH＝7.4)洗去杂蛋白；

7)加入12mLElutebuffer缓冲液(20mMNa₃PO₄，0.5MnaCl，1M咪唑，pH＝7.4)洗脱目的蛋白；

8)取纯化后的蛋白液体，并加入50μL上样缓冲液煮沸10min；

7)配置SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶，将处理好的样品加入孔中(20胺凝胶每孔)，电泳(浓缩胶电泳条件为直流电压为80伏特，分离胶电泳条件为直流电压为120伏特)，电泳完成后，取下凝胶用考马斯亮蓝染色过夜，然后脱色，确定得到纯化的目的蛋白。结果显示经过层析柱纯化后出现条带，如图7所示，分子量分别为52KDa、73KDa和43KDa左右，分别对应为抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918的条带。

3.2、将纯化后抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918按照质量比1：1：1混合，作为水相抗原，将水相抗原与MONTANIDE^TMIMS 1313VG N佐剂按1：1的质量比混合，接着在室温和转速为2000r/min下搅拌30分钟，制成猪链球菌三组分亚单位疫苗，疫苗中抗原HP0526、抗原HP1130和抗原HP0918的浓度分别为250ug/mL。

试验一、猪链球菌三组分亚单位疫苗安全性评估试验

试验方法：

选取4周龄健康仔猪10头，分为2组，分别三组分亚单位疫苗组和PBS对照组；疫苗组猪仔颈部肌肉注射4mL疫苗，对照组颈部肌肉注射4mL PBS。测定动物体温，观察临床表现，共2周。

试验结果：

通过观察发现，疫苗组和对照组的仔猪在整个观察期间呼吸、食欲和精神状态均正常，平均体温升高不超过1℃，说明猪链球菌三组分亚单位疫苗的安全性较好。

试验二、猪链球菌三组分亚单位疫苗免疫攻毒评估试验

试验方法：

选取4周龄的健康易感仔猪80头，分为4组，分别猪链球菌三组分亚单位疫苗组、猪链球菌病灭活疫苗(链力康(由国药集团动物保健股份有限公司提供的灭活疫苗)、猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗(链富康(由武汉科前生物股份有限公司))和PBS对照组。免疫程序：猪链球菌三组分亚单位疫苗组首免颈部肌肉注射2mL疫苗，首免3周后加强免疫一次，免疫剂量和途径与首免相同；商用链球菌灭活苗组和链富康二联亚单位疫苗按说明书的免疫程序和免疫剂量进行免疫；对照PBS组注射PBS，注射程序、剂量与猪链球菌三组分亚单位疫苗组保持一致；

二免后21d，分别进行猪链球菌SS2LT株(2×10⁶CFU)、猪链球菌SSKQ3-1株(6×10⁹CFU)、SS7 YZ株(2×10⁹CFU)(保藏号为CCTCC NO：M2011160)、猪链球菌SS9YT株(1×10⁹CFU)(保藏号为CCTCC NO：M2022010的猪链球菌9-YT)攻毒，攻毒连续14d后观察仔猪情况，并统计发病数；

SS2LT株攻毒结果：

通过观察发现，猪链球菌SS2LT株攻毒后第一天，对照组猪仔开始出现体温升高、精神沉郁、食欲不振、卧倒等症状，24h开始出现死亡，最终于攻毒后3d全部死亡；各疫苗组均无明显症状；

最终的发病数如表9所示：

表9不同疫苗对猪链球菌SS2LT株攻毒保护效果

由表9可知，猪链球菌三组分亚单位疫苗对猪链球菌SS2LT株的保护率为100％，与市售的猪链球菌灭活苗和链富康二联亚单位疫苗的保护效果相当；

SSKQ3-1株攻毒结果：

通过观察发现，猪链球菌SSKQ3-1株攻毒后，对照组的猪仔出现体温升高、精神沉郁、食欲不振、卧倒等症状，24h开始出现死亡，最终于攻毒后4头死亡；攻毒后两天猪链球菌灭活苗组出现3头猪仔跛行、喜卧，分别于第3d和4d死亡；猪链球菌三组分亚单位疫苗和链富康二联亚单位疫苗组于攻毒后均出现1头跛行、喜卧，于第5d死亡；

最终的发病数如表10所示：

表10不同疫苗对猪链球菌SSKQ3-1株攻毒保护效果

由表10可知，猪链球菌三组分亚单位疫苗对猪链球菌SSKQ3-1株的保护率为80％，与市售链富康二联亚单位疫苗的保护效果相当，而市售的猪链球菌灭活苗对猪链球菌SSKQ3-1株的保护率为40％，对猪链球菌SSKQ3-1株保护效果要远差于猪链球菌三组分亚单位疫苗；

SS7YZ株攻毒结果：

通过观察发现，猪链球菌SS7YZ株攻毒后，对照组的4头猪仔于24h后开始出现体温升高、精神沉郁、关节肿大、跛行、喜卧、倒地等症状，随后症状加重，最终4头死亡；猪链球菌三组分亚单位疫苗组、链富康二联亚单位疫苗组和猪链球菌灭活苗组均未出现明显的临床症状；

最终的发病数如表11所示：

表11不同疫苗对猪链球菌SS7 YZ株攻毒保护效果

由表11可知，猪链球菌三组分亚单位疫苗组对猪链球菌SS7YZ株的保护率为100％，与猪链球菌灭活苗和链富康二联亚单位疫苗组的保护效果相当(保护率为100％)；

SS9YT株攻毒结果：

通过观察发现，猪链球菌SS9YT株攻毒后，空白对照组的5头猪仔均出现体温升高、精神沉郁、食欲不振、卧倒等症状，24h开始出现死亡，最终于攻毒后4d全部死亡；攻毒后1d，链富康二联亚单位疫苗组1头猪仔出现体温升高、关节肿大、喜卧等，随后症状加重倒地，于第3d死亡；猪链球菌灭活苗组攻毒后1天，2头猪仔出现体温升高、精神沉郁、关节肿大、跛行、倒地等临床症状，攻毒后2d后1头猪仔出现临床症状，随后症状加重，于第5d时3头猪仔全部死亡；猪链球菌三组分亚单位疫苗组5头猪仔均未出现临床症状；

最终的发病数如表12所示：

表12不同疫苗对猪链球菌SS9YT株攻毒保护效果

由表12可知，猪链球菌三组分亚单位疫苗组对猪链球菌SS9YT株的保护率为100％，优于猪链球菌灭活苗(保护率为40％)和链富康二联亚单位疫苗(保护率为80％)；

综上所述，本发明的猪链球菌三组分亚单位疫苗可以一定程度上抵御猪链球菌血清型2、3、7和9的感染。

序列表

<110> 武汉科前生物股份有限公司

<120> 一种猪链球菌三组分亚单位疫苗其制备方法

<141> 2022-06-11

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 398

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Claims

1.一种猪链球菌三组分亚单位疫苗，其特征在于：该三组分亚单位疫苗含抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918和佐剂，抗原HP0526的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，抗原HP1130的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，抗原HP0918的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗，其特征在于：所述的佐剂为IMS1313VG N佐剂。

3.根据权利要求1所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗，其特征在于：所述的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918三种抗原混合后与佐剂按质量比为1：1混合。

4.一种权利要求1所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1、以保藏号为CCTCC NO：M2011282的猪链球菌血清2型SS2LT菌株基因为模板，利用SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对分别对HP0526、HP1130、HP0918基因进行PCR扩增，得到HP0526基因目的片段、HP1130基因目的片段和HP0918基因目的片段；

步骤4、将三种重组表达载体分别转化大肠杆菌DH5α感受态，接着分别提取三种重组质粒，将三种重组质粒分别转化大肠杆菌BL21感受态，然后分别进行诱导表达、培养和纯化，分别得到纯化的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918；

步骤5、将纯化的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918与佐剂混合均匀，抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918三种抗原混合后和佐剂的质量为1：1，得到所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗。

5.根据权利要求4所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述的三组分亚单位疫苗中，抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918的浓度分别为250ug/mL。

6.根据权利要求4所述的猪链球菌三组分亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：所述的抗原HP0526、抗原HP1130、抗原HP0918的质量比为1:1:1。