CN101412984A - 一种猪链球菌2型三组分亚单位疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于家畜传染病疫苗制备技术领域。具体涉及一种猪链球菌2型三组分亚单位疫苗及其制备方法。涉及本发明的核心技术是制备了能够分泌猪链球菌2型抗原蛋白1036N，0197和enolase，表达上述抗原蛋白的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET－28a－1036N，Escherichia coli BL21/pET－28a－0197和Escherichia coli BL21/pET－28a－enolase，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号分别为CCTCC NO：M208147；CCTCC NO：M208146和CCTCC NO：M208148。本发明还公开了适用于猪链球菌2型的三组分亚单位疫苗的制备方法及用途。

Description

一种猪链球菌2型三组分亚单位疫苗及应用

技术领域

本发明涉及家畜传染病疫苗制备技术领域。具体涉及一种猪链球菌2型三组分亚单位疫苗及其制备方法及应用。本发明涉及基于猪链球菌2型的三种抗原蛋白基因的克隆、表达及功能验证和应用。所述的基因表达的抗原蛋白能够提高猪抵抗猪链球菌2型的能力。

背景技术

猪链球菌(Streptococcus suis，S.suis)是引起猪链球菌病的主要病原，依据细菌表面的荚膜多糖(CPS)可以将S.suis分为35个血清型，分别为1/2型和1～34型，但最近也有人提出32型和34型应该归于streptococcus orisratti，而不应该归于猪链球菌，其中猪链球菌2型是毒力最强、其中猪链球菌2型(SS2)致病性强、流行广，该型亦是临床分离频率最高的血清型。SS2是一种重要的人畜共患病病原体，能引起猪脑膜炎(meningitis)、心内膜炎(endocarditi)、败血症(septicemia)、关节炎(arthritis)、浆膜炎(polyserositis)、肺炎(pneumonia)等，常引起断奶仔猪或育肥猪突然死亡；人类感染该菌，可导致脑膜炎，引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡。1991年首次报道在广东省发现猪2型链球菌疑似病例，1998-1999年江苏省部分地区连续2年在盛夏季节暴发该病。目前已有足够的流行病学资料证实，SS2已经对我国的养殖业和人民健康构成了严重的威胁。

由于缺乏猪链球菌病的流行病学资料，致病机理不清，无有效的疫苗和敏感的诊断方法，在很多国家猪链球菌病一直未能得到有效地控制。

尽管对猪链球菌2型的致病机理目前仍处在研究和发现阶段，影响了猪链球菌2型疫苗研究的顺利进行，但该疫苗的研究仍取得了一定的进展。目前研究的猪链球菌2型疫苗主要有灭活疫苗、活疫苗、基因工程活载体疫苗和亚单位苗，但在实际应用中各有不足之处。灭活疫苗对同源的猪链球菌具有较好的免疫保护，但由于不同菌株的毒力基因表性存在较大差异，对于异源菌株的保护力不佳；活疫苗可使猪得到保护，但不能清除定居在扁桃体或关节里的2型猪链球菌，也不能清除隐性感染猪扁桃体内的细菌；活载体疫苗主要是当今与未来疫苗研制与开发的主要方向之一，疫苗兼有常规活菌苗和灭活菌苗的优点，但是按照美国食品与药物管理局(Food and drug administ ration，FDA)的规定，活疫苗中不能存在抗药质粒，并且在人和动物体内，无法用抗生素来维持重组质粒的稳定性；亚单位苗具有活菌苗的免疫效力高、及灭活菌苗的安全性好等优点，但是，亚单位苗的抗原成分单一，对其他血清型的保护作用有限。范红结等研制的链球菌重组亚单位疫苗能对马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型提供较好的保护，但目前国内猪链球菌病病原以猪链球菌2型为主，其它型猪链球菌也占了一定比例，而马链球菌兽疫亚种比例则越来越小。因此，预防猪链球菌2型和其它型猪链球菌越来越重要。

鉴于此，本发明着手于猪链球菌2型新型免疫保护性抗原的研究，寻找几种免疫保护效果好，并且在猪链球菌2型以外的其它猪链球菌血清型中广泛存在的免疫原性蛋白，进而组合成有效的猪链球菌亚单位疫苗。

发明内容

本发明的目的是获得具有很好适用于猪链球菌2型的免疫原性蛋白，通过对编码该基因的序列的克隆、表达，进一步验证其功能，并制备一种能抵抗猪链球菌2型的三组分亚单位疫苗。

解决本发明的核心技术方案是：克隆报道的HP0197、HP1036和Enolase基因；通过大肠杆菌表达，制备对猪链球菌2型有免疫原性的抗原蛋白，进而制备一种猪链球菌2型亚单位疫苗。另外，本发明还包括所述重组大肠杆菌及其分泌的抗原蛋白在制备猪链球菌2型亚单位疫苗中的用途。

本发明将报道的HP0197、HP1036和Enolase基因转移到大肠杆菌BL21中，分泌该抗原蛋白的大肠杆菌已于2008年10月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏。具体保藏信息如下：

1、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-0197，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208146。

2、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-1036N，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208147。

3、大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-enolase，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208148。

本发明通过克隆表达HP0197、HP1036、Enolase基因，对该蛋白的特性进行实验分析，证明了该蛋白组合具有较好的免疫原性，免疫小鼠和仔猪后能诱导较高抗体水平。攻毒保护力实验表明该蛋白组合能够增强小鼠和猪对猪链球菌2型的抵抗力，是一种有效的三组分亚单位疫苗，该疫苗适用于我国猪链球菌2型病的防制。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

附图说明

图1：本发明使用的三个报道的基因序列的登录号及其在链球菌98HAH33中所处的位置(括号内显示为有下划线的为所述的三个抗原基因序列在Genebank的登录号，其后的冒号后的数字为该登录号所示基因序列在链球菌98HAH33基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜体字为所述的链球菌的菌株号)。

图2：是本发明使用的原始pET-28a(+)质粒图谱。

图3：重组抗原基因PCR图；图中：A为HP0197基因片段，B为HP1036基因片段，C为Enolase基因片段。

图4：重组质粒的双酶切鉴定图：泳道3(Enolase)泳道4(HP0197)泳道5(HP1036)。

图5：重组抗原纯化SDS-PAGE电泳：图中：图5A1为enolase蛋白；A2为1036N蛋白、A3为0197蛋白。

Western-blot分析：图中：图B1为enolase蛋白、图B2为1036N蛋白、图B3为0197蛋白。

图6：重组抗原免疫小鼠后的抗体水平。

图7：重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定。

图8：三种抗原分别免疫小鼠后5LD₅₀攻毒保护力效果试验。

图9：三种抗原分别免疫小鼠后20LD₅₀攻毒保护力效果试验。

图10：是免疫小鼠血清特异性抗体的检测，图中：图10A为enolase抗体；图10B为0197抗体；图10C为1036N抗体。

图11：重组抗原免疫小鼠后的攻毒(10LD₅₀)保护力效果。

图12：本发明制备的三组分亚单位疫苗免疫仔猪后体温变化。

图13：本发明制备的三组分亚单位疫苗免疫小猪后各抗原蛋白血清特异性抗体水平检测，其中图13A为1036N抗体；图13B为enolase抗体；图13C为0197抗体。

图14：本发明制备的三组分亚单位疫苗免疫仔猪后攻毒保护效果。

具体实施方式

实施例1：三种猪链球菌2型抗原蛋白的克隆及表达

一 材料

1)质粒与菌株

本发明采用的质粒pET-28a(+)购自Noagen公司(该pET-28a(+)质粒图谱如图1所示)大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态购自中国湖北省武汉生命技术有限公司。

本发明所用菌株为猪链球菌2型CVCC606菌株购自中国北京中国兽医药品监察所，属于一个商业菌株。

2)猪链球菌2型来源基因登录号，其基因序列在链球菌菌株基因组中位置参见说明书附图1所述。

3)主要试剂及缓冲液(Buffer)

氯化钠、EDTA二钠盐、乙醇、甲醇、丽春红S、三氯乙酸(TCA)是上海国药公司产品；Tris碱(Tris-HCl)、二硫苏糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸钠、乙酸钠(购自上海生工生物工程技术有限公司)。甘氨酸、考马斯亮蓝R-250购自AMRESCO公司。牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制剂(PMSF)、甲醛均为Sigma公司产品。蛋白酶K(贮存液浓度为20mg/ml，使用液浓度为1mg/ml)购自上海华舜生物工程有限公司；氨苄青霉素(Ampcillin)、卡那霉素(Kanamycin)、胎牛血清、诱导剂IPTG(异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)均为Invitrogen公司产品；吸头与离心管是AxyGen公司产品。Taq酶及10×Taq酶Buffer、BamH I、Xhol I等核酸内切酶及相关Buffer、T4连接酶及10×T4连接酶Buffer、Rnase、UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒、DNA marker(DL-2000、DL-15000)均为宝生物(大连)有限公司产品。

辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、羊抗猪IgG购自Sigma公司。底物液配制：底物液A：0.006％H₂O₂缓冲液；底物液B：取Na₂HPO₄·12H₂O 14.2g，柠檬酸10.5g，用双蒸水定容至500mL配成0.1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。

大肠杆菌培养基：LB液体培养液及固体培养基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，用10mol/L NaOH调pH至7.5，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用。在每100毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，121℃高压灭菌20min，4℃保存备用)。

链球菌培养基TSB、TSA培养基、RPMI-1640培养基及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。

纯化三个猪链球菌2型抗原蛋白采用Ni Sepharose 6 Fast FloW纯化柱(GEHealthcare公司产品)。

美国艾克森美孚白油：购自东莞市行兴行石化有限公司(埃克森美孚总代理)PBS缓冲液配制：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.24g，Na₂HPO₄×12H₂O 3.628g，溶于800ml蒸馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml，121℃高压灭菌20min，室温保存。Western-blotting缓冲液配制：

电转缓冲液：39mmol/L甘氨酸，48mmol/L Tris碱，0.037％ SDS(电泳级)，20％甲醇。

配制1000mL转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸，5.8g Tris碱，0.37g SDS，加200mL甲醇，加ddH₂O至总量为1000mL。

TBS(pH8.0)缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl。

TBST缓冲液：在上述TBS中加入终浓度为0.05％ Tween-20即可。

丽春红S(10×)贮存液：2g丽春红S，30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加ddH₂O至100mL。

质粒抽提相关溶液配制：

溶液I：含0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris HCl(pH8.0)，0.01mol/L EDTA，121℃高压灭菌20min后置室温备用。

溶液II：含0.2mol/L NaOH，1％SDS，现配现用。

溶液III：取5mol/L 乙酸钠60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5mL，调pH至5.0。2mol/L NaOH：8g NaOH加入100mL ddH₂O。

10％SDS：10g SDS加入80mL ddH₂O中，加热搅拌溶解，定容至100mL。

5mol/L NH₄Ac：327.7g NH₄AC加入ddH₂O中溶解，定容至500mL。

10mol/L NH₄Ac：655.4g NH₄AC溶于ddH₂O，定容至500mL。

13％ PEG8000(1.6mol/L NaCl)：13g PEG8000，9.35g NaCl，溶于ddH₂O，定100mL，121℃高压灭菌20min。

3mol/LNaAc：80mL ddH₂O中加入40.81g醋酸钠，定容至100mL，121℃高压灭菌20min。

酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1)：取饱和酚25mL、氯仿24mL、异戊醇1mL，充分混匀后，用TE(pH8.0)覆盖，于棕色瓶中保存。

氯仿:异戊醇(体积比24:1)：取氯仿48mL、异戊醇2mL，充分混匀后，TE(pH8.0)覆盖，棕色瓶中保存。

TE溶液：1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-Cl pH值为8.0。

4)引物设计与合成

应用引物设计软件Primer 5.0，设计了用于扩增HP0197、HP1036、Enolase的引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

表1：用于克隆本发明的抗原蛋白基因的引物设计

5)试验动物选择

7周龄雌性BALB/c小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。

4周龄猪链球菌血清阴性断奶仔猪，购自武汉市黄陂区青草湖天种猪场。

二 制备方法举例

1)猪链球菌2型(SS2)基因组DNA的提取

猪链球菌2型(SS2)菌培养

将CVCC606株菌种接种于含有10％灭活新生牛血清的TSA培养基上，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，置于摇床中(150r/min)，37℃震荡培养过夜。

SS2基因组DNA的提取

取1.0ml SS2菌液于1.5ml的离心管中，8000r/min离心5min，弃上清。沉淀悬于500μl TE(PH8.0)中，加10％的SDS，使其终浓度为1％，然后加3μl蛋白酶K(20mg/ml)，37℃作用2h。离心取上清，用等体积的酚/氯仿抽提1次，上清用二倍体积的无水乙醇在-20℃沉淀10min，12000r/min离心20min，沉淀用70％的乙醇洗两次，室温放置20min，让酒精挥发干净。沉淀用20μl灭菌的去离子水溶解，-20℃保存。

目的基因的扩增

以上述方法提取的CVCC606株菌的基因组作为PCR模板。使用表1所示的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

ddH₂O                                  37.5μl

10×Taq Buffer                         5.0μl

dNTP(2.5mM each)                       4.0μl

正义引物                               1.0μl

反义引物                               1.0μl

DNA模板                                1μl

Taq酶(5U/μl)                           0.5μl

反应程序为：94℃预变性5min；94℃ 1min；55℃ 1min；72℃ 5min；30个循环，延伸72℃ 10min。

PCR产物回收：

采用上海生工生物工程技术有限公司生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作如下：

1)用0.8％的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下，用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5ml灭菌离心管中。

2)按每100mg琼脂糖胶加入400μl Binding Buffer，置50-60℃水浴中10min，使琼脂糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。

3)将UNIQ-10柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温静置2min，室温8000rpm离心1min。

4)取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入500μl Wash Solution，室温8000rpm离心1min。

5)重复步骤4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，室温12000rpm离心15sec。

6)将UNIQ-10柱放入一个灭菌的1.5ml离心管中，根据PCR产物量的相对多少，在柱子底部的膜中央加10～20μl Elution Buffer或ddH₂O，室温或37℃放置2min。

室温12000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于-20℃备用。

重组表达质粒的构建

利用EcoRI+XholI(购自宝生物(大连)有限公司产品)同时酶切PCR扩增的HP0197基因片段和pET-28a(+)，利用BamHI+XholI同时酶切PCR扩增的HP1036、Enolase基因片段和pET-28a(+)，回收PCR片断以及表达载体质粒，将酶切后HP0197、HP1036和Enolase基因片段与酶切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase质粒。上述酶切位点在本发明所用质粒pET-28a(+)中均为单一酶切位点。

连接产物的转化

取感受态细胞DH5a 100μl加入到1.5mlEP管中，将连接后的三种重组质粒pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase各5～10μl加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3min-5min。加入400μl LB，于37℃200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃5000rpm离心10min，弃去400μl上清，用剩余的100μl重悬沉淀涂布于含25μg/ml Kna的LB琼脂平板。37℃增殖1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。

重组质粒的酶切鉴定

质粒的提取

使用碱裂解法(参照《分子克隆实验指南》第三版.黄培唐等译，北京，科学出版社，2002版介绍的方法)进行，具体操作如下：

1)用灭菌牙签在LB平板上随机挑取数个单菌落，分别接种于3ml 25μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

2)将菌液转入1.5ml离心管内，于4℃8000rpm离心3min，弃上清，再将剩余的1.5ml菌液重复离心，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。

3)加入100μl冰预冷的溶液I，涡旋使菌体充分悬浮，再加入200μl新配制的溶液II，反复颠倒离心管数次，冰浴5min，最后加入150.0μl冰预冷的溶液III，温和颠倒离心管数次，冰浴10min。

4)于4℃以12000rpm离心10min，吸取上清至另一支1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混和均匀，室温静置5min。

5)室温12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥或自然干燥。

6)沉淀用200μl含20μl Rnase(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解，56℃水浴30min或37℃水浴1h以除去RNA。

7)加7.5mol/L NH4Ac 100μl，室温静置5min，再于室温12000rpm离心5min。

8)吸取上清到另一1.5ml的EP管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，冰浴置10min。

9)于4℃12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75％冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20μl ddH₂O或TE(pH8.0)，置-20℃冰箱保存备用。

重组质粒的双酶切鉴定

利用EcoRI+XholI酶切pET-28a-0197，利用BamHI+XholI酶切pET-28a-1036N、pET-28a-enolase表达质粒，酶切后应出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。

重组表达菌株的构建

取感受态细胞BL-21(DE3)100μl加入到1.5mlEP管中，将三种重组质粒pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase各0.5μl加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3min-5min。将其涂布于含有25μg/ml Kna的LB琼脂平板。37℃正置1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。

目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的基因的诱导表达

将三种含重组抗原的表达菌株分别接种于含有25μg/ml Kna的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含有25μg/ml Kna的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续培养3h后收集菌体。

表达产物的SDS-PAGE电泳分析

SDS-PAGE电泳样品的制备

将三种诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mMTris-cl(pH8.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，离心30min。分别取少量裂解后上清和沉淀，加入2×蛋白电泳上样缓冲液125μl，DTT 25μl及TE液100μl，震荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，进行SDS-PAGE电泳分析。

SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制及电泳

12％的分离胶配制：纯化水1.6ml，30％丙烯酰胺溶液2.0ml，1.5mol/L Tris-Base溶液(pH8.8)1.3ml，10％SDS 0.05ml，10％过硫酸铵0.05ml，TEMED 0.003ml；各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。5％积层胶配制：纯化水2.1ml，30％丙烯酰胺溶液0.5ml，1.0mol/L Tris-Base溶液(pH6.8)0.38ml，10％SDS 0.03ml，10％过硫酸铵0.03ml，TEMED 0.003ml；各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面，灌满后插入加样梳。待积层胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品；电泳电压200V，电流在20mA-40mA范围内，电泳1h，至溴酚蓝泳出胶底面，终止电泳。

聚丙烯酰胺凝胶染色与脱色

卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(45％甲醇，45％纯化水，10％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)染色30min，再用脱色液(45％甲醇，45％纯化水，10％冰乙酸)进行脱色1min，观察结果。

重组蛋白的纯化

将收集的重组蛋白表达菌使用Binding buffer(20mMTris-HCl pH7.9，5mMlmidazole，0.5MNaCl)重悬，超声波破碎，4℃ 12,000g离心15min取上清上样。分别使用Binding buffer和Washing buffer(20mMTris-HCl pH7.9，15mM lmidazole，0.5MNaCl)洗柱直至OD值达到基线附近，换用Elution buffer(20mMTris-HCl pH7.9，40mM lmidazole，0.5MNaCl)洗脱结合的重组抗原蛋白，本实施例收集波峰部分蛋白作为纯化的重组蛋白用于进一步分析。

本发明制备的重组抗原蛋白0197、1036N、enolase基因PCR扩增结果见图3；重组质粒pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase的双酶切鉴定结果见图4；重组抗原蛋白0197、1036N、enolase进行SDS-PAGE电泳分析及纯化结果见图5。

实施例2：重组抗原蛋白的特性分析

1.Western-blot分析重组蛋白的抗原性

将上述纯化的重组抗原蛋白0197、1036N、enolase分别进行SDS-PAGE电泳。步骤如下：

1)转移：切出6张Whatman 3M滤纸和1张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，用铅笔在滤膜一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；将硝酸纤维膜在纯化水中浸泡5min；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液，将6张Whatman 3M滤纸浸泡于其中。然后按照如下方法安装转移电泳槽：平放石墨电极的底座(阳极)，依次放3层3M滤纸、硝酸纤维膜、聚丙烯酰胺凝胶和3层3M滤纸。彻底排除各层间的气泡；将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极—转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm2～1.0mA/cm2的参数接通电流，电泳转移0.5h～2h。

2)丽春红染色：转移结束后，取下NC膜，于去离子水中漂洗2次-3次后，转移至丽春红染色液中染色5min～10min，观察转印效果，并用铅笔标出蛋白Marker位置；室温下用去离子水漂洗硝酸纤维膜直至颜色褪去；

3)将NC膜置于5％的脱脂奶粉中，室温封闭2h；

4)洗膜：弃封闭液，用1×TBST洗涤NC膜3遍，每次5min；

5)一抗孵育：将NC膜放入用5％的脱脂奶粉稀释的兔抗SS2型菌阳性血清(体积比1:50)，37℃孵育2h；

6)洗膜：取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

7)二抗孵育：将膜转入5％的脱脂奶粉稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(体积比1:5000)，37℃孵育2h；

8)洗膜取出NC膜，用1×TBST洗膜3次，每次10min；

9)显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，置暗处显色，待蛋白带的颜色深度达到要求后，用1×TBST冲洗以终止反应。

2.重组蛋白抗血清的制备

1)重组蛋白浓度的测定

参照《分子克隆实验指南》第三版.黄培唐等译，北京，科学出版社，2002版介绍的方法，将蛋白样品牛血清白蛋白用PBS缓冲液溶解，然后按体积进行倍比稀释。分别取每个浓度的蛋白标准液100μl，加入到5ml的考马斯亮兰染料液中，反应10min后，在波长595nm处测吸光度，根据测得的OD值与相应浓度的关系，绘制标准曲线，并推导出换算公式。

2)疫苗的制备及免疫

重组蛋白疫苗的制备：将重组链球菌2型抗原蛋白0197、1036N和enolase按体积比为1：1分别与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中每种抗原蛋白的终浓度为500μg/ml。第二次免疫用的疫苗采用弗氏不完全佐剂。

免疫方法：给所述的试验小鼠腹腔接种弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为100μl/只)；2周后腹腔接种弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为100μl/只)；间隔10天后于眼眶放血，收集血清。

用Western-blot方法(见上述《分子克隆手册》)分析重组抗原蛋白0197、1036N和enolase的免疫原性，结果如图5所示。

实施例3：重组抗原蛋白免疫保护力试验

重组抗原的表达及纯化

将含pET-28a-0197、pET-28a-1036N、pET-28a-enolase质粒的表达菌株分别接种于含0.25μg/ml的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含2.5μg卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续培养3h后收集菌体。

将以上收集的重组抗原表达菌体用Binding buffer(20mMTris-HCl pH7.9，5mMlmidazole，0.5MNaCl)重悬，超声波破碎，4℃ 12,000g离心15min取上清上样。分别使用Binding buffer和Washing buffer(20mMTris-HCl pH7.9，15mM lmidazole，0.5MNaCl)洗柱直至OD值达到基线附近，换用Elution buffer(20mMTris-HCl pH7.9，40mMlmidazole，0.5MNaCl)洗脱结合的重组抗原蛋白，收集波峰部分蛋白作为纯化的重组抗原蛋白。

重组抗原蛋白浓度的测定

将蛋白样品牛血清白蛋白用PBS缓冲液溶解，然后进行倍比稀释。分别取每个浓度的蛋白标准液100μl，加入到5ml的染料液中，反应10min后，在波长595nm处测吸光度，根据测得的OD值与相应浓度的关系，绘制标准曲线，并推导出换算公式。

重组抗原蛋白疫苗制备及免疫方法

1)重组抗原疫苗的制备

分别将重组抗原蛋白0197、1036N和enolase与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中每种抗原蛋白终浓度为500μg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐剂，其余组分与首免相同。

灭活疫苗制备：将猪链球菌2型CVCC606株菌纯培养后，挑取单个菌落8～10个，涂于TSA平板上(含10％灭活牛血清)。37℃培养16h～18h后，用灭菌的0.01mol/L PBS将平板上的菌苔洗下，稀释至7.5×10⁹cfu/ml，用甲醛灭活(3‰)24h～48h，然后与弗氏佐剂按1：1体积混合乳化，使终浓度达到3.0×10⁹cfu/ml。

2)免疫方法

将本发明制备的由弗氏完全佐剂乳化的疫苗按100μl/只剂量腹腔免疫试验小鼠；2周后改用弗氏不完全佐剂乳化的疫苗加强免疫1次(免疫剂量为100μl/只)。

3)半数致死量(LD₅₀)的测定

(1)预试验：在预试中求得8周龄雌性BALB/c小鼠全死亡或90％以上死亡的剂量和动物不死亡或10％以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高与最低剂量。

(2)注射方式：腹腔注射

(3)动物：设立4个剂量组，每组6只BALB/c小鼠。

(4)剂量：将由预试验得出的最高、最低剂量均换算为常用对数，然后将最高、最低剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。

(5)试验结果的计算与统计

I 列试验数据及其计算表

II 包括各组剂量(CFU)，剂量对数(X)、动物数(n)、动物死亡数(r)、动物死亡百分比(P，以小数表示)，以及统计公式中要求的其它计算数据项目。

III LD₅₀的计算公式logLD₅₀＝∑1/2×(X_i+X_i+1)(P_i+1-P_i)。

X_i与X_i+1及P_i+1与P_i分别为相邻两组的剂量对数以及动物死亡百分比。

4)试验分组及免疫

取7周龄，体重18±2g雌性BALB/c小白鼠120只，平均分为6组、疫苗I组(0197)、疫苗II组(1036N)、疫苗IIIV组(enolase)、疫苗IV组(灭活疫苗)、佐剂对照组和PBS对照组，每组20只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂量为0.1ml/只，期间每周断尾取血，用于血清特异性抗体的监测。

5)血清特异性抗体的检测

分别使用纯化的重组抗原0197、1036N和enolase 250ng/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。将加强免疫2周后的小鼠采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设弗氏佐剂对照和空白对照。37℃反应30min。洗板3次后加入体积比1:5,000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液(见上所述)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度。

6)重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定

将加强免疫2周后的小鼠采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，37℃反应30min。洗板3次后每个稀释度的血清分别加入体积比1:5,000稀释的羊抗鼠IgG1-HRP、IgG2a-HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液(见上所述)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为该IgG亚类的滴度。

7)免疫鼠攻毒后保护情况

对加强免疫两周后的小鼠进行攻毒试验。从每个免疫组随机挑选16只小鼠进行攻毒保护力试验。攻毒试验分为两批进行，每组8只，每个蛋白免疫的小鼠分别接种5LD₅₀和20LD₅₀剂量的SS2。连续观察一周，记录小鼠的临床特征及死亡情况。

本实施例中重组抗原的表达、纯化同实施例2所述；CVCC606株菌半数致死量(LD50)为4×10⁸CFU；对重组表达的抗原HP0197、HP1036、Enolase进行血清特异性抗体的检测，结果表明所有的保护性抗原都能诱导很高的抗体水平，见图6；重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定结果如图7所示；三种抗原蛋白分别免疫小鼠后5LD₅₀攻毒保护力效果情况如图8所示；三种抗原蛋白分别免疫小鼠后20LD₅₀攻毒保护力效果情况如图9所示。

实施例4：重组亚单位疫苗免疫保护力试验

一重组亚单位疫苗小鼠保护力试验

1.重组蛋白的克隆、表达及纯化。

重组蛋白的克隆、表达及纯化如实施例2所述。

2.重组蛋白浓度的测定(Bradford法)

蛋白质浓度测定方法如实施例2所述。

3.重组亚单位疫苗制备及免疫方法

疫苗制备：重组抗原HP0197、HP1036、Enolase等质量均匀混合后与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中每种蛋白终浓度500μg/ml，用于首免，二次免疫使用弗氏不完全佐剂，其它成分不变。

免疫方法：腹腔免疫弗氏完全佐剂乳化的抗原100μl/只；2周后腹腔免疫弗氏不完全佐剂乳化的抗原100μl/只。

4.半数致死量(LD₅₀)的测定

测定步骤参见实施例3。

5.试验分组及免疫

取7周龄，18±2g雌性BALB/c小白鼠40只，平均分为4组、疫苗I组(HP0197+HP1036+Enolase)、疫苗II组(灭活疫苗)、佐剂对照组和PBS对照组，每组10只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂量为0.1ml/只，期间每周断尾取血，用于血清特异性抗体的监测。

6.血清特异性抗体的检测

同实施例3所述。

7.免疫鼠攻毒后保护情况

对加强免疫两周后的小鼠进行攻毒试验。从每个免疫组随机挑选8只小鼠进行攻毒保护力试验。每组小鼠分别接种10LD₅₀剂量的SS2。连续观察一周，记录小鼠的临床特征及死亡情况。

本实施例中对保护性抗原Enolase、HP0197、HP1036组合进行免疫后抗体水平检测结果如图10；本发明的亚单位疫苗免疫鼠后攻毒保护效果如图11所示。

二重组亚单位疫苗仔猪保护力试验

1.疫苗制备

多组份重组亚单位疫苗的制备将3种重组抗原Enolase、HP0197、HP1036按质量比1：1：1混合后与美国艾克森美孚白油佐剂按1：1.5体积混合无菌乳化，使疫苗中每种蛋白终浓度1mg/ml。对照组则用PBS代替抗原组份与美国艾克森美孚白油佐剂按1：1.5体积混合无菌乳化。

2.疫苗无菌检验

将制备好的疫苗无菌吸取20μl涂布TSA平皿，37℃培养过夜。

3.免疫及攻毒

1)动物分组及免疫

4周龄断奶仔猪分为3组，疫苗组(HP1036+HP0197+enolase)、艾克森美孚白油佐剂对照组和空白对照组(PBS)，每组6头。颈部和臀部多点注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂量为2ml/头，期间每周耳静脉取血，用于血清特异性抗体的监测。

2)血清特异性抗体的检测

使用纯化的重组抗原250ng/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA 37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。将免疫后的猪采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设佐剂对照和空白对照。37℃反应30min。洗板3次后加入体积比1:5,000稀释的羊抗猪IgG(H+L)-HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于OD630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度。

3)免疫后仔猪临床症状

首次免疫后每天监测体温、采食及精神情况。

4)免疫猪攻毒后保护情况

对加强免疫两周后的仔猪进行攻毒试验。每组6头进行攻毒保护力试验。每组分别接种6.0×105cfu剂量的CVCC606株菌。连续观察8天，记录临床特征及死亡情况。

本实施例中疫苗检测为无菌；免疫后仔猪没有明显临床症状，体温变化见图12；对本发明的保护性抗原enolase、0197、1036N组合进行免疫后抗体水平检测，结果如图13；免疫后仔猪攻毒保护情况见图14。

实施例5：亚单位疫苗成分及制备方法

1.疫苗用抗原蛋白

抗原组分：疫苗组分蛋白有三种，分别为0197、1036N和enolase。这三种蛋白的表达、鉴定、纯化及定量如实施例3所述。

剂型：油包水型(W/O)

佐剂：疫苗用佐剂采用美国艾克森美孚白油。

组成：白矿油(Marcol52)

吐温80(CRILLET4)

司盘80(CRILL4)

油相：白矿油加热至透明后与司盘80按体积比94：6配制。

水相：蛋白与吐温80组成，吐温80占水相的0.4％。

疫苗乳化：三种抗原蛋白0197、1036N和enolase按质量比为1：1：1混合，加入吐温80混匀制成水相，水相与油相按1：1.5体积混合乳化。使每种抗原蛋白的终浓度为2mg/ml。

疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中，第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。

无菌检测：取少许疫苗涂布TSA平皿，37℃温箱培养18小时无菌落长出。

免疫程序：免疫两次，首次免疫颈部肌肉分点注射，每头1ml。两周后加强免疫一次，免疫剂量及部位与首免一致。

本亚单位疫苗对猪链球菌2型能够提供83％的保护率，该抗原组分在其它型猪链球菌中广泛存在，具有抵抗其它型链球菌的潜力，经过适当佐剂添加有望获得更好的效果，可以用于我国猪链球菌2型病的防制。

Claims (7)

1、一种能够分泌猪链球菌2型抗原蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-1036N，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208147。

2、一种能够分泌猪链球菌2型抗原蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-0197，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208146。

3、一种能够分泌猪链球菌2型抗原蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-enolase，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M208148。

4、包含权利要求4、5和6所述大肠杆菌分泌猪链球菌2型抗原蛋白的疫苗。

5、权利要求7所述的疫苗是预防和/或防治猪链球菌2型的亚单位疫苗。

6、权利要求1-3任一项所述的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型免疫保护性抗原蛋白中的应用。

7、权利要求1-3任一项所述的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型亚单位疫苗中的应用。

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