CN106146626A - 一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用，本发明提供的亚单位疫苗包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，该序列不同于任何已公开的相关序列，将该蛋白对应的核苷酸序列克隆至大肠杆菌，获得了一株可表达spaA蛋白的基因工程菌：大肠杆菌（Escherichia coli） BL21/pET-28a-spaA，保藏编号为CCTCC NO：M2015076。该基因工程菌蛋白表达量高，操作简单，适于大规模的亚单位疫苗的生产。制备出的疫苗对机体产生的抗体水平高，持续性长，具备安全性和稳定性，是一种极具开发潜力的红斑丹毒丝菌亚单位疫苗。

Description

一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用

技术领域

本发明涉及家畜传染病疫苗制备技术领域。具体涉及一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及其制备方法及应用。本发明提供的红斑丹毒丝菌亚单位疫苗能够提高猪抵抗红斑丹毒丝菌的能力。

背景技术

猪丹毒主要引起猪的败血症、心内膜炎和多发性关节炎等，大多数发生于3-6月龄的猪和怀孕母猪，成年猪和老龄猪发病较少，其流行具有一定的季节性，以炎热多雨季节流行最盛，多呈散发性或地方流行性，偶尔也可爆发流行。丹毒丝菌属有4个种，其一为红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，有血清型1a、1b、2、4、5、6、8、11、12、15、16、17、19、21和N；其二为扁桃体丹毒丝菌(Erysipelothrix tonsillarum)有血清型3、7、10、14、20和23；其他2个丹毒丝菌属血清型分别为13和18。不同血清型的猪丹毒杆菌致病力不同，其中血清型1a、1b的致病力最强，我国感染流行的主要为1a和2型。

2010年以来，猪丹毒在我国部分省市发生流行。2012年，猪丹毒病例已逐渐增多。至2013年，在我国湖南、湖北、江西、广西、四川、广东、浙江等多个省份均出现了猪丹毒的大范围流行，给猪场造成了巨大的经济损失。目前已有足够的流行病学资料证实，红斑丹毒丝菌已经对我国的养殖业和人民健康构成了严重的威胁。

尽管对红斑丹毒丝菌的致病机理目前仍处在研究和发现阶段，影响了红斑丹毒丝菌疫苗研究的顺利进行，但该疫苗的研究仍取得了一定的进展。目前市场上红斑丹毒丝菌疫苗主要有灭活疫苗、活疫苗。1953年，美国使用全菌灭活苗预防猪丹毒。猪丹毒灭活苗主要是通过培养猪丹毒杆菌2型强毒菌，培养的菌液用甲醛溶液处理灭活细菌后，加入氢氧化铝胶浓缩制成的，所以也将其称为猪丹毒氢氧化铝甲醛菌苗。使用该疫苗可产生较强的免疫力，免疫持续期可达6个月。灭活疫苗对同源的红斑丹毒丝菌具有较好的免疫保护，但由于不同菌株的毒力基因表型存在较大差异，对于异源菌株的保护力不佳；活疫苗可使猪得到保护,但不能清除定居在扁桃体或关节里的红斑丹毒丝菌,也不能清除隐性感染猪扁桃体内的细菌。在我国，猪丹毒弱毒活菌苗使用的菌株主要是猪丹毒GC42和G4T10弱毒株，在适宜的培养基中培养后，加入保护剂真空冷冻干燥制成。不同培养基对疫苗质量有一定影响。猪丹毒弱毒苗用于3月龄以上的猪。免疫后7d产生免疫力，可持续6个月。虽然猪丹毒弱毒活菌苗能够对猪产生很好的免疫力，活疫苗也存在一些不足之处。母源抗体和药物很容易干扰疫苗的效力，如果弱毒活菌株返毒，其对易感猪群存在很大的风险。尽管许多弱毒活菌苗通过兔体、鸡胚、空气干燥或在含有吖啶染料的培养基中培养，但是毒力减弱的机理不清楚。Ho To和Nagai S对猪丹毒杆菌表面保护抗原的基因和抗原多样性进行了研究，他通过对所有血清型的猪丹毒杆菌基因进行克隆，发现Spa蛋白可以分为3个分子型，分别为SpaA、SpaB和SpaC，3个蛋白都具有很好的免疫原性，而SpaA存在于血清型1a、2、5、8、9、12、15、16、17和N，是很好的亚单位疫苗潜力候选者。亚位苗具有活菌苗的免疫效力高、及灭活菌苗的安全性好等优点，是防治红斑丹毒丝菌的希望。

鉴于此，本发明着手于红斑丹毒丝菌保护性抗原的研究，寻找能提供良好保护力的抗原成分，克隆到工程菌中进行高效表达，加入佐剂，保护猪抵抗流行毒株的侵袭。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种分离的蛋白SpaA，其序列为SEQ ID NO.2所示。其对应的核苷酸序列优选SEQ ID NO.1所示序列。

本发明的另一个目的在于提供了一株基因工程菌，该菌株已于2015年2月2日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名：Escherichia coli BL21/pET28a-spaA，保藏编号为CCTCC NO：M2015076。通过扩大培养，利用该菌可制备本发明所述的SpaA蛋白。

本发明最后一个目的在于提供了一种分离的SpaA蛋白在制备红斑丹毒丝菌亚单位疫苗中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一株基因工程菌，其构建过程如下：

本发明的目的是获得具有很好适用红斑丹毒丝菌的保护性抗原，将该基因的序列克隆、表达，进一步验证其功能，并制备一种能抵抗红斑丹毒丝菌的亚单位疫苗。

解决本发明的核心技术方案是：克隆报道的spaA基因；通过大肠杆菌表达，制备对红斑丹毒丝菌有免疫原性的抗原蛋白，进而制备一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗。另外，本发明还包括所述重组大肠杆菌及其分泌的抗原蛋白在制备红斑丹毒丝菌亚单位疫苗中的用途。

本发明将临床分离株JZ08的基因spaA截短转移到大肠杆菌BL21中,该菌株已于2015年2月2日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学，分类命名：Escherichia coli BL21/pET28a-spaA，保藏编号为CCTCC NO：M2015076。

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-spaA菌落大而厚，湿润，表面光滑，不透明，乳白色，边缘十分圆整，容易挑起，菌落质地均匀，正反面和边缘、中央部位的颜色都很均一。可在固态LA(LB加Agar)和液态LB卡那霉素培养基良好生长。大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-spaA具有噬菌体T7强启动子，在IPTG诱导下可以高量分泌表达spaA蛋白。

本发明通过克隆表达spaA基因，对该蛋白的特性进行实验分析，证明了该蛋白组合具有较好的免疫原性，免疫小鼠和仔猪后能诱导较高抗体水平。攻毒保护力实验表明该蛋白组合能够增强红斑丹毒丝菌的抵抗力，是一种有效的亚单位疫苗，该疫苗适用于我国猪丹毒病的防制。

更详细的技术方案参见《具体实施方式》所述。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1)spaA是血清型1a、2、5、8、9、12、15、16、17和N菌株共有的表面蛋白抗原，而我国猪丹毒的主要致病血清型是1型和2型，因此本研究制备的spaA亚单位疫苗可以为猪提供很好的保护力，避免红斑丹毒丝菌的侵袭。

2)现在市场上防控猪丹毒的疫苗有灭活苗和弱毒苗，弱毒苗存在毒力返强的危险，会对易感猪群造成巨大的威胁，而且毒力减弱的机理不是很清楚。灭活苗可以为同源红斑丹毒丝菌提供较好的保护效果，但不同菌株的毒力基因存在差异，其对异源菌株的保护效果很弱。而亚单位spaA不仅安全并且效果更好，克服了灭活苗和弱毒苗的弱点。

附图说明

图1为spaA部分截取基因序列进化树

图2为spaA部分截取蛋白质序列进化树

图3是本发明使用的原始pET-28a(+)质粒图谱。

图4重组抗原基因spaA PCR图。

图5重组质粒的双酶切鉴定图。

图6重组抗原纯化SDS-PAGE电泳:图6A；Western-blot分析：图6B。

图7重组抗原免疫小鼠后的抗体水平。

图8重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定。

图9抗原免疫小鼠后5LD₁₀₀攻毒保护力效果试验。

图10抗原免疫小鼠后10LD₁₀₀攻毒保护力效果试验。

图11是免疫小鼠血清特异性抗体的检测。

图12本发明制备的亚单位疫苗免疫仔猪后体温变化。

图13本发明制备的亚单位疫苗免疫仔猪后血清特异性抗体水平检测。

具体实施方式

本发明所述试剂如未特别说明，均购自商业渠道或为本领域的常规配制试剂。所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案。

实施例1：

spaA特异性基因蛋白质序列的获得

本实验室从临床病死猪分离获得一株JZ08菌株，经PCR鉴定为红斑丹毒丝菌。利用表1中的引物进行扩增，获得本发明截短蛋白spaA所对应的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

下载NCBI的已发表的spaA全基因序列，构建进化树，进化树清晰的表明本研究使用的spaA序列不同于以往公布于NCBI上的序列，图1。

2)截短蛋白spaA的序列

本发明截短蛋白spaA序列为SEQ ID NO.2所示。

构建进化树

与网上已知的spaA蛋白质序列作进化树分析，发现本研究使用的蛋白质序列和网上已知序列AIB07912.1、AGR86047.1的位于同一进化支上，本发明用的spaA氨基酸序列和这俩个序列存在蛋白质序列上的差异。

实施例2：

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-spaA的构建：

本发明采用的质粒pET-28a(+)购自Noagen公司(该pET-28a(+)质粒图谱如图2所示)大肠埃希氏菌BL21(DE3)感受态购自中国湖北省武汉生命技术有限公司。

引物设计与合成

应用引物设计软件Primer 5.0，设计了用于扩增spaA的引物(表1)，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

表1：用于克隆本发明的抗原蛋白基因的引物设计

以提取的JZ08株菌的基因组作为PCR模板。使用表1所示的引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下：

反应程序为：94℃预变性5min；94℃1min；55℃30s；72℃1min；30个循环，延伸72℃10min。spaA基因PCR扩增结果见图4。

PCR产物回收。

重组表达质粒的构建

利用BamHI+XholI(购自宝生物(大连)有限公司产品)同时酶切PCR扩增的spaA基因片段和pET-28a(+),回收PCR片断以及表达载体质粒，将酶切后spaA基因片段与酶切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-spaA。上述酶切位点在本发明所用质粒pET-28a(+)中均为单一酶切位点。

连接产物的转化

取感受态细胞DH5α100μl加入到1.5mlEP管中，将连接后的重组质粒pET-28a-spaA加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90sec，冰浴3min-5min。加入600μl LB，于37℃200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4℃5000rpm离心10min，弃去400μl上清，用剩余的100μl重悬沉淀涂布于含25μg/ml Kan的LB琼脂平板。37℃增殖1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。

重组质粒的双酶切鉴定

利用BamHI+XholI酶切提取的质粒pET-28a-spaA,酶切后应出现预期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。重组质粒pET-28a-spaA的双酶切鉴定结果见图5，双酶切的条带符合spaA的大小1353bp。

重组表达菌株的构建

取感受态细胞BL-21(DE3)100μl加入到1.5mlEP管中，将重组质粒pET-28a-spaA加入并混匀。置冰上30min后，42℃热激90秒，冰浴3min-5min。将其涂布于含有25μg/mlKan的LB琼脂平板。37℃正置1h，再将平板翻过来，倒置37℃培养14h-16h至菌落出现。采用菌落PCR的方法，使用表1中的引物扩增得到阳性克隆，挑选阳性克隆扩大培养，提取质粒双酶切鉴定同时将质粒送上海生工生物公司测序，比对正确，即为spaA的表达菌株。

该菌株已于2015年2月2日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Escherichia coli BL21/pET28a-spaA，地址：中国武汉武汉大学；保藏编号为CCTCC NO：M2015076。

实施例3：

重组蛋白的制备方法：

1)将大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET28a-spaA接种于含有25μg/ml Kan的3mL LB液体培养基，于37℃摇床培养。从培养好的菌液中取100μL接种于10mL含有25μg/mlKan的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养约3h，至OD₆₀₀达到0.8时，加IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续培养3h后收集菌体。

2)表达产物的SDS-PAGE电泳分析

将诱导后的重组大肠杆菌8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mM Tris-cl(pH8.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，10000r/min，离心30min。分别取少量裂解后上清和沉淀，加入2×蛋白电泳上样缓冲液125μl，DTT 25μl及TE液100μl，震荡混匀，100℃煮沸10min，12000r/min离心5min，进行SDS-PAGE电泳分析。重组抗原蛋白spaA进行SDS-PAGE电泳分析及纯化结果见图6A，条带符合spaA蛋白的大小60KD。

重组蛋白的纯化

将诱导后的重组大肠杆菌1L(OD值是4.0)8000r/min离心15min。沉淀使用Binding buffer(20mMTris-HCl pH7.9，5mM Imidazole，0.5M NaCl)重悬，超声波破碎，4℃12,000g离心15min取上清上样。分别使用Binding buffer和Washing buffer(20mMTris-HCl pH7.9，15mM Imidazole，0.5MNaCl)洗柱直至OD值达到基线附近，换用Elution buffer(20mMTris-HCl pH7.9，40mM Imidazole，0.5MNaCl)洗脱结合的重组抗原蛋白，本实施例收集波峰部分蛋白作为纯化的重组蛋白，共获取40ml重组蛋白。表达的重组蛋白两端带有6个氨基酸的his标签，his标签不具有免疫原性，不能给猪和小鼠提供保护力。该重组蛋白包含本发明所述的红斑丹毒丝菌亚单位疫苗，疫苗序列为SEQ ID NO.2所示。

重组蛋白浓度的测定

根据Brandford法进行蛋白质定量，首先根据BSA标准品进行蛋白定量标准曲线绘制，根据测量结果绘制蛋白定量曲线，然后根据测定的OD值和蛋白稀释倍数计算重组蛋白浓度。公式为y＝4.4959x-2.2451R²＝0.9974，换算出蛋白浓度为1.6033mg/ml。

实施例4：亚单位疫苗成分及制备方法

1.疫苗用抗原蛋白

抗原组分：spaA蛋白溶液(为本发明表达的截短蛋白spaA。蛋白的表达、鉴定、纯化及定量如实施例3所述)。

剂型：油包水型(W/O)

佐剂组成：白矿油(Marcol52)

吐温80(CRILLET4)

司盘80(CRILL4)

油相：白矿油加热至透明后与司盘80按体积比94：6配制。

水相：spaA蛋白溶液与吐温80组成，吐温80占水相的0.4％，体积比。

疫苗乳化：spaA蛋白加入吐温80混匀制成水相，水相与油相按1：1.5体积混合乳化。使抗原蛋白的终浓度为1mg/ml。

疫苗性状检测：乳化后疫苗滴入清水中,第一滴散开，第二滴油珠状，晃动液面油珠不破乳。

无菌检测：取少许疫苗涂布TSA平皿，37℃温箱培养18小时无菌落长出。

稳定性检验：3000rpm/min离心15分钟，根据分离情况判定乳化是否稳定，离心后乳化疫苗未分层；

免疫程序：免疫两次，首次免疫颈部肌肉分点注射，每头1ml。两周后加强免疫一次，免疫剂量及部位与首免一致。

实施例5：

重组抗原蛋白的特性分析

重组蛋白疫苗的制备：按实施例4制备重组抗原疫苗，使疫苗中抗原蛋白终浓度为1mg/ml用于首次免疫，第二次免疫与首免相同。

4周龄雌性BALB/c小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。

免疫方法：小鼠皮下接种重组蛋白疫苗(接种量为100μl/只)；2周后皮下接种重组蛋白疫苗(接种量为100μl/只)；间隔10天后于眼眶放血，收集血清。

用Western-blot方法(见《分子克隆手册》)分析重组抗原蛋白spaA的免疫原性，结果如图6B所示，spaA蛋白可以和spaA免疫鼠阳性血清发生特异性反应，是一个十分重要的保护性抗原。

实施例6：重组抗原蛋白免疫保护力试验

4周龄雌性BALB/c小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。

1)重组抗原疫苗的制备

按实施例4制备重组抗原疫苗，使疫苗中抗原蛋白终浓度为1mg/ml用于首次免疫，第二次免疫与首免相同。

攻毒菌株：红斑丹毒丝菌SE38株是本实验室临床分离获取(以下简称SE38，李敬涛，湖北部分地区红斑丹毒丝菌分离株耐药性分析，养殖与饲料[J].2015.2，11-14)。

2)免疫方法

将本发明制备的疫苗按100μl/只剂量皮下免疫试验小鼠；2周后用相同方法制备的疫苗加强免疫1次(免疫剂量为100μl/只)。

3)绝对致死量(LD100)的测定

设立4个剂量组3CFU/只、5CFU/只、20CFU/只、100CFU/只，每组10只BALB/c小鼠，皮下注射，连续观察14天。

至第11天，5CFU/只、20CFU/只、100CFU/只3个剂量组的小鼠全部死亡，而3CFU/只剂量组剩下3只健康小鼠，直至观察结束一直存活，最终确认SE38的致死剂量值为5CFU。

4)试验分组及免疫

取4周龄，体重18±2g雌性BALB/c小白鼠120只，平均分为3组:疫苗I组(spaA)、佐剂对照组和PBS对照组，每组20只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂量为0.1ml/只，期间每周断尾取血，用于血清特异性抗体的监测。

5)血清特异性抗体的检测

使用纯化的重组抗原spaA100ng/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA(牛血清白蛋白)37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。将加强免疫2周后的小鼠采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设佐剂对照和空白对照。37℃反应30min。洗板3次后加入体积比1:5,000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)–HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液(见上所述)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度。

6)重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定

将加强免疫2周后的小鼠采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，37℃反应30min。洗板3次后每个稀释度的血清分别加入体积比1:5,000稀释的羊抗鼠IgG1–HRP、IgG2a–HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液(见上所述)，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为该IgG亚类的滴度。

7)免疫鼠攻毒后保护情况

对加强免疫两周后的小鼠进行攻毒试验。从每个免疫组随机挑选16只小鼠进行攻毒保护力试验。攻毒试验分为两批进行，每组8只，每个蛋白免疫的小鼠分别接种5LD₁₀₀和10LD₁₀₀剂量的SE38。连续观察一周，记录小鼠的临床特征及死亡情况。

结果如下：

SE38株的致死量为5CFU；对重组表达的抗原spaA进行血清特异性抗体的检测，结果表明保护性抗原spaA能诱导很高的抗体水平，阳性血清的平均抗体效价可以达到2¹⁵，见图7；重组抗原诱导小鼠抗体IgG亚类测定表明，spaA能诱导机体产生更高水平的lgG抗体，结果如图8所示；抗原蛋白免疫小鼠后5LD₁₀₀攻毒保护力效果情况表明spaA抗原可以保护小鼠抵抗5LD₁₀₀的感染，小鼠存活率是100％，而佐剂组和空白组小鼠全部死亡，存活率是0，如图9所示。spaA抗原蛋白免疫小鼠后10LD₁₀₀攻毒保护力效果情况表明：spaA可以保护小鼠抵抗红斑丹毒丝菌10LD₁₀₀的感染侵袭，保护效果为100％，而佐剂组和空白组的保护效果是0，如图10所示；免疫后对小鼠的抗体水平进行监测发现：免疫后第一周就可以诱导小鼠产生较高的抗体水平，有2⁸，后续几周的抗体水平高达2¹⁵，如图11所示。

实施例7：

重组亚单位疫苗仔猪免疫保护力试验

4周龄猪链球菌血清阴性断奶仔猪，购自武汉市黄陂区青草湖天种猪场。

1.疫苗制备

按实施例4制备重组抗原疫苗，使疫苗中抗原蛋白终浓度为1mg/ml，用于首次免疫，第二次免疫与首免相同。

2.疫苗无菌检验

将制备好的疫苗无菌吸取20μl涂布TSA平皿，37℃培养过夜。

3.免疫及攻毒

1)动物分组及免疫

4周龄断奶仔猪分为4组，疫苗1组(spaA)、免疫2组(spaA)、佐剂组和空白组，每组6头，免疫1组、佐剂组和空白组用于攻毒，免疫2组用于检测抗体水平，连续检测8个月。颈部和臀部多点注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂量为2ml/头，免疫1组、佐剂组和空白组每周耳静脉取血，用于血清特异性抗体的监测；免疫2组每个月采血一次，用于血清特异性抗体的监测。

2)血清特异性抗体的检测

使用纯化的重组抗原spaA100ng/100μl于4℃过夜包被酶联板，1％BSA 37℃封闭1h，洗涤液洗板1次后封装于-20℃保存。将免疫后的猪采血分离血清，倍比稀释后取100μl加入酶联板，同时设佐剂对照和空白对照。37℃反应30min。洗板3次后加入体积比1:5,000稀释的羊抗猪IgG(H+L)–HRP，37℃反应30min。洗板5次后加入100μl底物液，避光显色10min后加入0.25％HF终止反应，于OD630nm读数。取OD值大于0.3的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度。

3)免疫后仔猪临床症状

首次免疫后每天监测体温、采食及精神情况。

4)免疫猪攻毒后保护情况

对加强免疫两周后的仔猪进行攻毒试验。每组6头进行攻毒保护力试验。每组分别接种5×10⁹cfu剂量的SE38株菌。连续观察14天，记录临床特征及死亡情况。

本实施例中疫苗检测为无菌；免疫后仔猪没有发病临床症状，免疫1组、佐剂组和空白组免疫后第二天体温会上升，随后几天下降回复正常，期间对猪生长的影响很弱，体温变化见图12；

对本发明的保护性抗原spaA进行免疫后抗体水平检测，结果表明：第一周诱导的抗体水平较弱，平均有2⁴，随后几周诱导的抗体水平逐渐升高，在第四周可高达2⁹，即可为仔猪提供保护力；免疫后，spaA免疫仔猪全部健康，无发病症状，注射部位没有红色斑块；对健康仔猪处以安乐死进行剖检分菌，肾、脾、肝、心都没有分离到SE38菌株。佐剂组和空白组仔猪全部发病，精神萎靡，行动迟缓，皮肤的疹块呈“打火印”状，陆续有仔猪死亡，可见本发明制备的spaA亚单位疫苗可以为仔猪提供很好的保护效果。

对免疫2组进行8个月的抗体水平检测，免疫后2周开始检测到ELISA抗体，28天全部为ELISA抗体阳性，在28～90天为抗体高峰，以后逐渐下降，至180天，抗体水平仍然较高，210天虽能检测到抗体，但抗体水平较低，说明抗体水平至少可维持6个月(表2)。

表2：ELISA检测免疫后仔猪spaA的抗体水平

注：每孔测定值OD_630nm≥0.39，判定为阳性；每孔测定值OD_630nm＜0.39，判定为阴性。

实施例8：

安全性检验

1试验方案

实验动物：28～35日龄健康断奶仔猪；健康妊娠70日龄母猪。按实施例4的方法制备3批次疫苗。。

1.1对断奶仔猪一次单剂量接种的安全性试验

为了保证试验数据的准确性和避免试验疫苗制品有质量问题，将制备的3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种28～35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头以1次单剂量2ml接种，观察14日，并测定体温。

1.2对断奶仔猪单剂量重复接种的安全性试验

将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种28～35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，间隔21日每头单剂量重复接种2ml，观察14日，并测定体温。

1.3对断奶仔猪一次超剂量接种的安全性

将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种28～35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头超剂量接种4ml，观察14日。

1.4对妊娠母猪一次单剂量接种的安全性试验

将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种妊娠70日的健康母猪，每批疫苗注射5头，每头以1次单剂量2ml接种，观察其临床表现和产仔情况。

1.5对妊娠母猪单剂量重复接种的安全性试验

将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种妊娠70日的健康母猪，每批疫苗注射5头，间隔21日每头单剂量重复接种2ml，再过14日进行第2次重复接种，观察其临床表现和产仔情况。

1.6对妊娠母猪一次超剂量接种的安全性试验

将3批本发明的亚单位疫苗分别经臀部肌肉接种5头妊娠70日的健康母猪，每头猪接种两倍免疫剂量(4ml)，观察其临床表现和产仔情况。

2.试验结果

2.1本发明的亚单位疫苗对断奶仔猪1次单剂量接种的安全性

将3批本发明的亚单位疫苗以2ml分别接种28～35日龄健康断奶仔猪后，每批疫苗注射5头，仔猪体温、呼吸情况、精神状况、食欲等均正常，未见异常变化。说明该灭活疫苗对断奶仔猪安全性很好(表3)。

表3本发明的3批亚单位疫苗单剂量接种28～35日龄断奶仔猪后的平均体温

2.2l疫苗对断奶仔猪单剂量重复接种的安全性2

将3批疫苗分别通过臀部肌肉接种28～35日龄健康断奶仔猪，每批疫苗注射5头，每头接种2ml，21日后进行第2次重复接种，2ml/头，观察靶动物的临床表现，每次接种后共观察14日，并测定体温。结果在整个观察期间体温、呼吸、食欲、精神状态都正常(表4)。

表4本发明的3批灭活疫苗对28～35日龄健康断奶仔猪单剂量重复接种的安全性

2.3本发明的亚单位疫苗疫苗对断奶仔猪1次超剂量接种的安全性试验

取3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉以4ml剂量接种28～35日龄健康断奶仔猪，所有猪在整个观察期间体温无明显升高，呼吸、食欲、精神状态都正常(表5)，表明本发明的灭活疫苗疫苗对断奶仔猪1次超剂量接种是安全的。

表5本发明的亚单位疫苗超剂量接种28～35日龄健康断奶仔猪后的平均体温变化

2.4本发明的亚单位疫苗对怀孕动物(妊娠母猪)一次单剂量接种的安全性(产子情况)

将3批本发明的亚单位疫苗疫苗分别通过臀部肌肉接种健康妊娠70日母猪，每批亚单位疫苗注射5头，每头接种2ml，观察临床表现，并测定体温。结果3批本发明的亚单位疫苗接种的健康妊娠70日母猪在整个观察期间体温、呼吸、食欲、精神状态都正常(表6)，产仔正常，没有出现流产、死胎等情况(表7)。

表6 3批本发明的亚单位疫苗一次单剂量接种健康妊娠母猪后的平均体温变化

表7健康妊娠母猪一次单剂量接种本发明的亚单位疫苗后的产仔情况

2.5本发明的亚单位疫苗对怀孕动物(妊娠母猪)单剂量重复接种的安全性

将3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉接种健康妊娠母猪，每批亚单位疫苗注射5头猪，每头接种2ml，21日后进行第1次重复接种，2ml/头，再过14日进行第2次重复接种，观察妊娠母猪的临床表现，每次接种后共观察14日，并测定体温。结果3批本发明的亚单位疫苗分别通过臀部肌肉以2ml剂量接种2次的健康妊娠母猪，在整个观察期间体温、呼吸、食欲、精神状态都正常(表8)，所产仔猪也全部健活(表9)。

表8 3批本发明的亚单位疫苗对健康妊娠母猪单剂量重复接种的安全性

表9健康妊娠母猪单剂量重复接种本发明的亚单位疫苗后的产仔情况

2.6本发明的亚单位疫苗对怀孕动物(妊娠母猪)一次超剂量接种的安全性

妊娠母猪1次超剂量接种(4ml)后没有出现体温方面的异常变化(表10)，在整个观察期内均没有出现不良反应，且最后的产仔成绩也无显著差异，没有出现流产、死胎和木乃伊胎。上述结果说明3批本发明的亚单位疫苗对母猪的繁殖性能无影响，对妊娠母猪是安全的(表11)。

表10 3批本发明的亚单位疫苗一次超剂量接种健康妊娠70日母猪后的平均体温变化

表11健康妊娠母猪一次超剂量接种本发明的亚单位疫苗后的产仔情况

本亚单位疫苗对红斑丹毒丝菌能够提供90％的保护率，该抗原组分在常见的红斑丹毒丝菌的11种血清型中广泛存在，具有抵抗其它型红斑丹毒丝菌的潜力，经过适当佐剂添加有望获得更好的效果，可以用于我国猪丹毒病的防制。

实施例9：保存期试验

1.亚单位疫苗的制备

按实施例4的方法制备3批次疫苗，4℃保存，至试验时分别保存30天、180天、360天。

2.试验猪的免疫和攻毒

将25只28日龄仔猪随机分为30d、180d、360d、佐剂组、空白组5组，每组5只。30d、180d、360d三组分别免疫30d、180d、360d制备的亚单位疫苗制品2ml，隔14天再次免疫同剂量的疫苗制品。佐剂组免疫佐剂俩次，间隔14天。空白组不做免疫。二免7天后进行耳静脉攻毒试验，攻毒剂量为5×10⁹cfu/只，连续观察14天，记录实验结果。

3.试验结果

仔猪分别免疫30d、180d、360d的实验室spaA疫苗制品后进行攻毒试验。30d、180d、360d三个免疫组免疫180d疫苗制品的仔猪攻毒后发病，但一周后恢复健康；免疫360d生物制品有一头仔猪死亡，其余均健康，如表13所示。结果表明spaA亚单位疫苗经长期保存后仍然能给仔猪提供足够的保护力，保护效果可以达到90％以上。

表12 spaA亚单位疫苗保护期试验结果

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉科缘生物发展有限责任公司

<120> 一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用

<130> 一种红斑丹毒丝菌亚单位疫苗及制备方法及应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1353

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggattcga cagatatttc tgtgattcca ctaatcggtg aacaagttgg attgctccca 60

gttttacctg ggacaggggt acatgctcag gaatacaaca aaatgactga tgcttatatt 120

gaaaaattgg tatctctaat taatcaaaaa gtgaagccgt ttcttataaa tgaaccaaag 180

gggtaccaaa gtttcgaagc agtgaatgaa gagattaact cgattgtaag tgaacttaaa 240

aatgaaggaa tgagtcttca aaacattcac catatgttta aacaaagcat ccaaaaccta 300

gcaactagaa tcggctacag aagttttatg caggatgcta tgtatcttga aaattttgaa 360

agattaacga ttcctgaact tgatgaagca tacgttgatt tactcgtgaa ttacgaggtg 420

aaacaccgta ttttagtaaa atatgaaggt aaagttaaag gtagagctcc cttagaagca 480

tttatagttc ctctaagaga tagaattcgt agtatgaatg aaatggctgc agaagtaaat 540

ggtttacctg aagcgcatga ggatttctta gtttcagatt caagcgagta taatgacaaa 600

ctaaataata tcaactttgc tttgggtcta ggggtcagcg agtttattga ctataaccgg 660

ctcgaaaata tgatggaaaa agaaattcat ccactgtatc ttgaacttta tgctatgcgg 720

agaaatcgcc aaattcaagt tgtaagagat gtatatccaa acttggaacg tgcgaacgcg 780

gttgttgaat ccttaaagac aattaaagat ataaaacaaa gagggaagaa actacaggaa 840

cttcttgaaa tttatatcca aagaagtgga gatgttcgaa aaccagatgt actccaacga 900

tttattggaa aatatcaatc agtagttgat gaagaaaaaa ataaacttca agattattta 960

gaatcagata tttttgattc atatagtgtg gatggcgaga aaataagaaa taaagaaatt 1020

acactcatca atagagatgc atacttatct atgatttaca gagctcaatc gatttcggaa 1080

attaagacga ttcgtgcaga tttagaatca cttgtcaaat cattccaaaa tgaagaaagt 1140

gactctaaag tagagcctga aagtcccgtt aaagtagaaa aaccagttga tgaagaaaaa 1200

cctaaagatc aaaagaagct agttgatcaa tcaaaacccg aatcgaattc aaaagaaggg 1260

tggattaaga aagataataa gtggttctat attgagaaat caggtggaat ggcaacaggt 1320

tggaagaagg tagcagacaa atggtactac tag 1353

<210> 2

<211> 450

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Asp Ser Thr Asp Ile Ser Val Ile Pro Leu Ile Gly Glu Gln Val

1 5 10 15

Gly Leu Leu Pro Val Leu Pro Gly Thr Gly Val His Ala Gln Glu Tyr

20 25 30

Asn Lys Met Thr Asp Ala Tyr Ile Glu Lys Leu Val Ser Leu Ile Asn

35 40 45

Gln Lys Val Lys Pro Phe Leu Ile Asn Glu Pro Lys Gly Tyr Gln Ser

50 55 60

Phe Glu Ala Val Asn Glu Glu Ile Asn Ser Ile Val Ser Glu Leu Lys

65 70 75 80

Asn Glu Gly Met Ser Leu Gln Asn Ile His His Met Phe Lys Gln Ser

85 90 95

Ile Gln Asn Leu Ala Thr Arg Ile Gly Tyr Arg Ser Phe Met Gln Asp

100 105 110

Ala Met Tyr Leu Glu Asn Phe Glu Arg Leu Thr Ile Pro Glu Leu Asp

115 120 125

Glu Ala Tyr Val Asp Leu Leu Val Asn Tyr Glu Val Lys His Arg Ile

130 135 140

Leu Val Lys Tyr Glu Gly Lys Val Lys Gly Arg Ala Pro Leu Glu Ala

145 150 155 160

Phe Ile Val Pro Leu Arg Asp Arg Ile Arg Ser Met Asn Glu Met Ala

165 170 175

Ala Glu Val Asn Gly Leu Pro Glu Ala His Glu Asp Phe Leu Val Ser

180 185 190

Asp Ser Ser Glu Tyr Asn Asp Lys Leu Asn Asn Ile Asn Phe Ala Leu

195 200 205

Gly Leu Gly Val Ser Glu Phe Ile Asp Tyr Asn Arg Leu Glu Asn Met

210 215 220

Met Glu Lys Glu Ile His Pro Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ala Met Arg

225 230 235 240

Arg Asn Arg Gln Ile Gln Val Val Arg Asp Val Tyr Pro Asn Leu Glu

245 250 255

Arg Ala Asn Ala Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ile Lys Asp Ile Lys

260 265 270

Gln Arg Gly Lys Lys Leu Gln Glu Leu Leu Glu Ile Tyr Ile Gln Arg

275 280 285

Ser Gly Asp Val Arg Lys Pro Asp Val Leu Gln Arg Phe Ile Gly Lys

290 295 300

Tyr Gln Ser Val Val Asp Glu Glu Lys Asn Lys Leu Gln Asp Tyr Leu

305 310 315 320

Glu Ser Asp Ile Phe Asp Ser Tyr Ser Val Asp Gly Glu Lys Ile Arg

325 330 335

Asn Lys Glu Ile Thr Leu Ile Asn Arg Asp Ala Tyr Leu Ser Met Ile

340 345 350

Tyr Arg Ala Gln Ser Ile Ser Glu Ile Lys Thr Ile Arg Ala Asp Leu

355 360 365

Glu Ser Leu Val Lys Ser Phe Gln Asn Glu Glu Ser Asp Ser Lys Val

370 375 380

Glu Pro Glu Ser Pro Val Lys Val Glu Lys Pro Val Asp Glu Glu Lys

385 390 395 400

Pro Lys Asp Gln Lys Lys Leu Val Asp Gln Ser Lys Pro Glu Ser Asn

405 410 415

Ser Lys Glu Gly Trp Ile Lys Lys Asp Asn Lys Trp Phe Tyr Ile Glu

420 425 430

Lys Ser Gly Gly Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asp Lys Trp

435 440 445

Pro Tyr

450

Claims (4)

1.一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述蛋白对应的核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

3.表达包含权利要求1所述蛋白的基因工程菌，其特征在于：Escherichia coli BL21/pET28a-spaA，保藏编号为CCTCC NO：M2015076。

4.权利要求1所述蛋白或权利要求2所述核苷酸序列或权利要求3所述的基因工程菌在制备红斑丹毒丝菌亚单位疫苗中的应用。