CN110183520A - 一种猪丹毒SpaA蛋白及其在制备疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种猪丹毒SpaA蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的猪丹毒杆菌SpaA蛋白用于制备疫苗或诊断试剂。本发明的猪丹毒杆菌SpaA蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产猪丹毒亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

一种猪丹毒SpaA蛋白及其在制备疫苗中的应用

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪丹毒SpaA蛋白及其在制备疫苗中的应用。

背景技术

猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种人畜共患传染病，其临诊特征主要为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。目前，该病在世界上大多数国家都有分布，呈散发或流行性发生，给养猪业造成了很大的经济损失，也给人体健康带来威胁。猪丹毒与猪瘟、猪肺疫并称为中国养猪业的三大传染病，造成严重的经济损失。

目前，免疫接种仍是预防猪丹毒最有效的方法，主要使用传统疫苗，即猪丹毒灭活菌苗和弱毒活菌苗。由于灭活过程可造成细菌抗原表位缺失或抗原性减弱，灭活苗不能产生足够的保护力；弱毒苗的效力很容易受母源抗体和抗生素的干扰，且弱毒菌株存在毒力返强以及诱导隐性感染的可能性。而且猪丹毒的隐性感染可能会发展成慢性型，现有的疫苗不能对慢性猪丹毒产生足够的保护力。因此，针对猪丹毒丝菌免疫保护性抗原研制亚单位疫苗，是猪丹毒新型亚疫苗研究的主要方向。

发明内容

本发明目的是提供一种猪丹毒SpaA蛋白以及使用SpaA蛋白制备的亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种猪丹毒杆菌SpaA蛋白，包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白；

2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1) 中蛋白功能的蛋白；

编码上述猪丹毒杆菌SpaA蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:3；

本发明的猪丹毒杆菌SpaA蛋白用于制备疫苗或诊断试剂。

本发明再一个方面提供一种亚单位疫苗，是使用上述的SpaA蛋白作为抗原制备的。

本发明的猪丹毒杆菌SpaA蛋白制备的亚单位疫苗具有抗原稳定性高，纯度高，特异性强，不产生其他不相关抗体，检测方法方便准确的特点，为工业化生产猪丹毒亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

具体实施方式

本发明的目的是提供一种猪丹毒杆菌抗原蛋白(SpaA蛋白)，其在大肠杆菌中获得可溶性的表达，制备亚单位疫苗，从而弥补现有技术的不足，有利于相关疾病的防制。

下面结合具体实施例对本发明进行详细的说明。

实施例1：SpaA基因的扩增及序列分析

2019年湖北省某规模养猪场疑似发生猪丹毒，多头育肥猪出现急性病死情况，临床表现主要为发病突然，病猪体温升高达42℃，全身皮肤发红，尤以四肢内侧、胸腹部、颈部和耳部等处发红明显，且在四肢末端和腹下等处出现紫色斑块。经临床调查和实验室检测，初步诊断为发生猪丹毒。经调查，确信上述的养猪场之前已经免疫过猪丹毒灭活疫苗和弱毒活菌苗，并且中和抗体的检测确定免疫效果达到标准。因此怀疑有猪丹毒杆菌在疫苗的选择压力下发生了突变，无菌采集病死猪肺脏进行常规分离、鉴定，确定致病菌为猪丹毒杆菌。

1、扩增猪丹毒杆菌SpaA基因

根据NCBI中发表的猪丹毒杆菌SpaA基因序列，设计并合成了引物, 引物的序列信息如下：

primer1：5′-ATGAAAAAGAAAAAACACCTAT-3′；

primer2：5′-CTATTTTAAACTTCCATCGTT-3′。

提取分离的猪丹毒杆菌核酸作为模板，用引物primer1和primer2 进行PCR扩增目的片段，经序列测定，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，根据测序结果推导其氨基酸序列为SEQID NO:1。与NCBI中已公布的猪丹毒杆菌SpaA蛋白进行比对分析，结果氨基酸同源性约为93％～98％，多个位点发生了变异。结果表明，分离的菌株为新的猪丹毒杆菌(YBfl 株)，含有新的SpaA基因。

2、设计并合成猪丹毒杆菌SpaA基因

前期将克隆自猪丹毒杆菌SpaA基因(SEQ ID NO:2片段)，连入表达载体后进行蛋白的诱导表达，结果表达的SpaA蛋白以不可溶的包涵体形式存在。尝试经过表达条件优化、更换菌株等试验，结果SpaA蛋白在大肠杆菌中均以包涵体的形式存在，以其制备疫苗的免疫原性也较差，不能提供良好的保护力。因此，本发明对SEQ ID NO:2基因进行了序列分析改造，在分析猪丹毒杆菌SpaA基因的抗原特性基础上，定点突变后，设计筛选合成了SpaA蛋白可溶性表达的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，送生物公司合成后为模板，用引物primer3和primer4进行PCR 扩增，目的片段产物回收连接pMD18-T载体，转化和筛选阳性克隆 pMD18-T-SpaA。

引物primer3和primer4的序列信息如下：

primer3：5′-GGATCCATGAAAAAGAAAAAACAC-3′；

primer4:5′-GCGGCCGCCTATTTTAAACTTCCAT-3′。

实施例2：猪丹毒杆菌SpaA蛋白的重组表达

SpaA蛋白的制备方法包括以下步骤：a.构建表达载体；b.构建表达菌株；c.重组SpaA蛋白的诱导和提取纯化。

a.构建表达载体：

将阳性克隆质粒pMD18-T-SpaA和表达载体pET28a载体分别用 EcoRI和BamHI双酶切产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后,用DNA凝胶回收试剂盒回收,分别获得约5400bp和1900bp片段,在16℃定向连接构建 pET28a表达载体；测序验证序列和读码框无误后,将质粒线性化后，转化入BL21感受态细胞。

b.构建表达菌株、蛋白提取纯化：

转化后，37℃培养18h。挑取单菌落于LB液体培养基(含卡那霉素) 中，37℃摇床振荡培养16小时后，10000r/min离心5min，收集菌体后，用沸水浴煮5min，12000r/min离心2min离心取上清作为模板，进行PCR 鉴定,PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃1min，52℃1min，72℃2min，共进行32个循环；72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，可以扩增出约1900bp条带。检测结果表明，含SpaA基因的重组质粒成功转入BL21感受态细胞。将PCR检测阳性的菌株分别接种30mL LB培养基中，37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6,加入IPTG至终浓度1mmol/L，诱导 6h,培养物离心后用1/20体积的PBS重悬，进行SDS-PAGE检测。结果SpaA蛋白在大肠杆菌中获得了可溶性表达。

将诱导后的菌体破碎后取上清进行纯化，按照说明书进行Ni-NTA 纯化蛋白及透析；将蛋白表达量高的阳性的表达菌株命名为BL21-SpaA。

实施例3：亚单位疫苗的制备

一、亚单位疫苗制备

1、制苗用SpaA蛋白的制备：将BL21-SpaA菌株接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养18小时，定量分装，经纯粹检验后，作为一级种子。取一级种子接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养18 小时，经镜检后，置2～8℃保存。按发酵罐容积60％(V/V)加入LB液体培养基，同时按培养基0.1％(V/V)加入消泡剂，通入高温蒸汽灭菌 30分钟，待培养基温度降至37℃，接种SPAA蛋白生产用二级种子液，发酵罐参数设置分别为搅拌速度800r/min，温度37℃，维持DO值(溶氧量)在20％。培养4小时后的菌液补加乳糖,诱导表达培养6h；发酵培养菌液经管式离心机10000r/min离心30分钟，收获的菌体沉淀破碎后，取上清经Ni-NTA纯化蛋白。

2、灭活：将蛋白液置于灭活瓶内，计量加入10％甲醛溶液，随加随摇，使其充分混合，甲醛溶液的最终浓度为0.1％。加甲醛溶液后倒入另一灭活瓶中，以避免瓶口附近粘附的蛋白液未能接触灭活剂。37℃灭活 16小时后取出，置2～8℃保存。

3、半成品检验

(1)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行无菌检验。

(2)蛋白含量测定按Bradford法检测蛋白含量。

(3)灭活检验观察无菌落生长，判灭活检验合格。

4、亚单位疫苗成品制备

经过检验合格后的半成品蛋白抗原进行疫苗制备(以下配制中各液体成分按体积比计)。

(1)佐剂制备201佐剂、氢氧化铝佐剂

(2)水相制备将SpaA蛋白使用生理盐水稀释成20μg/0.2ml, 配成制苗用抗原液。

(3)乳化取佐剂1份于高速剪切机内，开动电机慢速转动搅拌，同时徐徐加入水相1份，以10000r/min，乳化5分钟。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水不超过0.5ml，确定制备成功。

二、亚单位疫苗成品检验

(1)装量检查按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

(2)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，符合规定。

(3)安全检验用30日龄仔猪5只，每只肌肉注射疫苗2.0ml，同时设对照5只，在相同的条件下饲养，连续观察14日，记录试验猪采食、饮水及临床情况。检测结果表明制备的疫苗不出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应，满足安全性的要求。

(4)效力检验

4.1最小免疫剂量和使用剂量的测定用本实施例制备的猪丹毒杆菌SpaA亚单位疫苗以不同剂量分别肌肉注射30日龄仔猪，免疫剂量分别为0.3ml/只、0.1ml/只、0.03ml/只，同时设不免疫的对照组。免疫后28日攻毒猪丹毒杆菌临床分离株(YBfl株)，攻毒剂量为10^5.0LD50/ 只，连续观察14日，记录发病死亡情况。

结果表明，对照组10/10死亡；0.03ml/只～0.3ml/只免疫组猪均 10/10健活(表1)。因此将猪丹毒杆菌亚单位疫苗最小免疫剂量确定为 0.03ml/只。为保证疫苗质量，将疫苗的使用剂量确定为3.3倍最小免疫剂量即0.1ml/只。同时，结果表明，201佐剂和氢氧化铝佐剂制备的疫苗，免疫效果无差异。

表1：最小免疫剂量的攻毒保护结果

4.2对地方流行毒株的攻毒保护30日龄仔猪60只，每只肌肉注射猪丹毒杆菌亚单位疫苗0.1ml/只；另取60只同日龄仔猪作为不免疫作对照。于免疫后28日，免疫组和对照组均攻毒10株各地方分离株，攻毒剂量为10^5.0LD₅₀/只，攻毒后观察14日，记录发病死亡情况。

结果表明，SpaA蛋白制备的猪丹毒杆菌亚单位疫苗，能抵御各地方猪丹毒杆菌分离株的攻击(参见表2),本发明制备的SpaA蛋白亚单位疫苗具有良好的免疫效果，可以保护免疫猪抵抗猪丹毒杆菌的攻击。

而且，使用实施例1筛选的猪丹毒杆菌进行攻毒实验，结果表明本发明SpaA蛋白制备的亚单位疫苗的免疫效果最好。

表2：对地方流行毒株的攻毒保护

4.3与市售疫苗的比较试验

用目前市售猪丹毒杆菌疫苗和本发明制备的亚单位疫苗分别免疫4 周龄昆明小鼠，市售疫苗按0.2ml/只剂量免疫，本发明亚单位疫苗按 0.05ml/只剂量免疫，免疫后28日攻毒，攻毒剂量为10000LD50/只。表 3为免疫结果。

表3：本发明疫苗与市售疫苗的效果比较

结果表明本发明亚单位疫苗的免疫效果更好，攻毒保护率(10/10 均健活，均未分离到猪丹毒杆菌)远高于其它市售疫苗(3/10～5/10健活，猪丹毒杆菌分离率3/10～5/10)。

序列表

<110> 青岛易邦生物工程有限公司

<120> 一种猪丹毒SpaA蛋白及其在制备疫苗中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 626

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Lys Lys Lys His Leu Phe Pro Lys Val Ser Leu Met Ser Cys

1 5 10 15

Leu Leu Leu Thr Ala Met Pro Leu Gln Thr Ala Phe Ala Asp Ser Thr

20 25 30

Asp Ile Ser Val Ile Pro Leu Ile Ala Glu Gln Val Gly Leu Leu Pro

35 40 45

Val Arg Pro Gly Thr Gly Val His Ala Gln Glu Tyr Asn Lys Met Thr

50 55 60

Asp Ala Tyr Ile Glu Lys Leu Val Ser Leu Ile Asn Arg Lys Val Lys

65 70 75 80

Pro Phe Leu Ile Asn Glu Pro Lys Gly Tyr Gln Ser Phe Glu Ala Val

85 90 95

Asn Glu Glu Ile Asn Ser Ile Val Ser Glu Leu Lys Asn Glu Gly Met

100 105 110

Ser Leu Gln Asn Ile His His Met Phe Lys Gln Ser Ile Gln Asn Leu

115 120 125

Ala Thr Arg Ile Gly Tyr Arg Ser Phe Met Gln Asp Ala Met Tyr Leu

130 135 140

Ala Asn Phe Glu Arg Leu Thr Ile Pro Glu Leu Asp Glu Ala Tyr Val

145 150 155 160

Asp Leu Leu Val Asn Tyr Glu Val Lys His Arg Ile Leu Val Lys Tyr

165 170 175

Glu Gly Lys Val Lys Gly Arg Ala Pro Leu Glu Ala Phe Ile Val Pro

180 185 190

Leu Arg Asp Arg Ile Phe Ser Met Asn Glu Met Ala Ala Glu Val Asn

195 200 205

Tyr Leu Pro Glu Ala His Glu Asp Phe Leu Val Ser Asp Ser Ser Glu

210 215 220

Tyr Asn Asp Lys Leu Asn Asn Ile Asn Phe Ala Leu Gly Leu Gly Val

225 230 235 240

Ser Glu Phe Ile Asp Tyr Asn Arg Leu Glu Asn Met Met Glu Lys Glu

245 250 255

Ile His Pro Leu Tyr Leu Glu Leu Tyr Ala Met Arg Arg Asn Arg Gln

260 265 270

Ile Gln Val Val Arg Asp Val Tyr Pro Asn Leu Glu Arg Ala Asn Ala

275 280 285

Val Val Glu Ser Leu Lys Thr Ile Lys Asp Ile Lys Gln Arg Gly Lys

290 295 300

Lys Leu Gln Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Ile Gln Arg Ser Gly Asp Val

305 310 315 320

Arg Lys Pro Asp Val Leu Gln Arg Phe Ile Gly Lys Tyr Gln Ser Val

325 330 335

Val Asp Glu Glu Lys Asn Lys Leu Gln Asp Tyr Leu Glu Ser Asp Ile

340 345 350

Phe Asp Ser Tyr Ser Val Asp Gly Glu Lys Ile Arg Asn Lys Glu Ile

355 360 365

Thr Leu Ile Asn Arg Asp Ala Tyr Leu Ser Met Ile Tyr Arg Ala Gln

370 375 380

Ser Ile Ser Glu Ile Lys Thr Ile Arg Ala Asp Leu Glu Ser Leu Val

385 390 395 400

Lys Ser Phe Gln Asn Glu Glu Ser Asp Ser Lys Val Glu Pro Glu Ser

405 410 415

Pro Val Lys Val Glu Lys Pro Val Asp Glu Glu Lys Pro Lys Asp Gln

420 425 430

Lys Lys Leu Val Asp Gln Ser Lys Pro Glu Ser Asn Ser Lys Glu Gly

435 440 445

Trp Ile Lys Lys Asp Asn Lys Trp Phe Tyr Ile Glu Lys Ser Gly Gly

450 455 460

Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asp Lys Trp Tyr Tyr Leu Tyr

465 470 475 480

Asn Thr Gly Ala Ile Val Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asn Lys Trp

485 490 495

Tyr Tyr Leu Glu Lys Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val

500 505 510

Ser Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala Met Ala Thr Gly

515 520 525

Trp Lys Lys Val Ser Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala

530 535 540

Leu Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ala Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Glu

545 550 555 560

Asn Gly Gly Ala Met Ala Thr Gly Trp Lys Lys Val Ser Asn Lys Trp

565 570 575

Tyr Tyr Leu Glu Asn Ser Gly Ala Met Ala Ala Gly Trp Lys Lys Val

580 585 590

Ala Asn Lys Trp Tyr Tyr Leu Asp Lys Ser Gly Met Met Val Thr Gly

595 600 605

Ser Lys Ser Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Ala Phe Lys Asn Asp Gly Ser

610 615 620

Leu Lys

625

<210> 2

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaaaga aaaaacacct atttccgaaa gtaagtctta tgtcgtgctt acttttaaca 60

gcaatgccac tacaaacagc ttttgctgat tcgacagata tttctgtgat tccactaatc 120

gccgaacaag ttggattgct cccagttcga cctgggacag gggtacatgc tcaggaatac 180

aacaaaatga ctgatgctta tattgaaaaa ttggtatctc taattaatcg aaaagtgaag 240

ccgtttctta taaatgaacc aaaggggtac caaagtttcg aagcagtgaa tgaagagatt 300

aactcgattg taagtgaact taaaaatgaa ggaatgagtc ttcaaaacat tcaccatatg 360

tttaaacaaa gcatccaaaa cctagcaact agaatcggct acagaagttt tatgcaggat 420

gctatgtatc ttgccaattt tgaaagatta acgattcctg aacttgatga agcatacgtt 480

gatttactcg tgaattacga ggtgaaacac cgtattttag taaaatatga aggtaaagtt 540

aaaggtagag ctcccttaga agcatttata gttcctctaa gagatagaat ttttagtatg 600

aatgaaatgg ctgcagaagt aaattattta cctgaagcgc atgaggattt cttagtttca 660

gattcaagcg agtataatga caaactaaat aatatcaact ttgctttggg tctaggggtc 720

agcgagttta ttgactataa ccggctcgaa aatatgatgg aaaaagaaat tcatccactg 780

tatcttgaac tttatgctat gcggagaaat cgccaaattc aagttgtaag agatgtatat 840

ccaaacttgg aacgtgcgaa cgcggttgtt gaatccttaa agacaattaa agatataaaa 900

caaagaggga agaaactaca ggaacttctt gaaaagtata tccaaagaag tggagatgtt 960

cgaaaaccag atgtactcca acgatttatt ggaaaatatc aatcagtagt tgatgaagaa 1020

aaaaataaac ttcaagatta tttagaatca gatatttttg attcatatag tgtggatggc 1080

gagaaaataa gaaataaaga aattacactc atcaatagag atgcatactt atctatgatt 1140

tacagagctc aatcgatttc ggaaattaag acgattcgtg cagatttaga atcacttgtc 1200

aaatcattcc aaaatgaaga aagtgactct aaagtagagc ctgaaagtcc cgttaaagta 1260

gaaaaaccag ttgatgaaga aaaacctaaa gatcaaaaga agctagttga tcaatcaaaa 1320

cccgaatcga attcaaaaga agggtggatt aagaaagata ataagtggtt ctatattgag 1380

aaatcaggtg gaatggcaac aggttggaag aaggtagcag acaaatggta ctacctttat 1440

aatacgggtg ctatagttac gggttggaag aaggtagcaa acaaatggta ctatcttgaa 1500

aaatcaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1560

aactcaggtg caatggcaac aggatggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1620

aattcaggcg cactggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgaa 1680

aacggaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcga acaagtggta ctaccttgaa 1740

aactcaggcg caatggcggc aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgat 1800

aaatcaggaa tgatggttac aggttcaaaa tctattgatg gtaaaaagta tgcatttaag 1860

aacgatggaa gtttaaaata g 1881

<210> 3

<211> 1881

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgaaaaaga aaaaacacct atttccgaaa gtaagtctta tgtcgcgttt acttttaaca 60

gcaatgccac tacaaacagc ttttgctgat tcgacagata tttctgtgat tccactaatc 120

gccgaacaag ttgggttgct cccagttcga cctgggacag gggtacatgc tcaggaatac 180

aacaaaatga ctgatgctta tattgaaaaa ttggtatctc taattaatcg aaaagtgaag 240

ccgtttctta taaatgaacc aaaggggtac caaagtttcg aagcagtgaa tgaagagatt 300

aactcgattg taagtgaact taaaaatgaa ggaatgagtc ttcaaaacat tcaccatatg 360

tttaaacaaa gcatccaaaa cctagcaact agaatcggct acagaagttt tatgcaggat 420

gctatgtatc ttgccaattt tgaaagatta acgattcctg aacttgatga agcatacgtt 480

gatttactcg tgaattacga ggtgaaacac cgtattttag taaaatatga agggaaagtt 540

aaaggtagag ctcccttaga agcatttata gttcctctaa gagatagaat ttttagtatg 600

aatgaaatgg ctgcagaagt aaattattta cctgaagcgc atgaggattt cttagtttca 660

gattcaagcg agtataatga caaactaaat aatatcaact ttgctttggg tctaggggtc 720

agcgagttta ttgactataa ccggctcgaa aatatgatgg aaaaagaaat tcatccactg 780

tatcttgaac tttatgctat gcggagaaat cgccaaattc aagttgtaag agatgtatat 840

ccaaacttgg aacgtgcgaa cgcggttgtt gaatccttaa agacaattaa agatataaaa 900

caaagaggga agaaactaca ggaacttctt gaaaagtata tccaaagaag tggggatgtt 960

cgaaaaccag atgtactcca acgatttatt ggaaaatatc aatcagtagt tgatgaagaa 1020

aaaaataaac ttcaagatta tttagaatca gatatttttg attcatatag tgtggatggc 1080

gagaaaataa gaaataaaga aattacactc atcaatagag atgcatactt atctatgatt 1140

tacagagctc aatcgatttc ggaaattaag acgattcgtg cagatttaga atcacttgtc 1200

aaatcattcc aaaatgaaga aagtgactct aaagtagagc ctgaaagtcc cgttaaagta 1260

gaaaaaccag ttgatgaaga aaaacctaaa gatcaaaaga agctagttga tcaatcaaaa 1320

cccgaatcga attcaaaaga agggtggatt aagaaagata ataagtggtt ctatattgag 1380

aaatcagggg ggatggcaac agggtggaag aaggtagcag acaaatggta ctacctttat 1440

aatacggggg ctatagttac ggggtggaag aaggtagcaa acaaatggta ctatcttgaa 1500

aaatcaggtg cgatggcaac agggtggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1560

aactcagggg caatggcaac agggtggaag aaagtatcaa acaagtggta ctaccttgaa 1620

aattcaggcg cactggctac aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgaa 1680

aacggaggtg cgatggcaac aggatggaag aaagtatcga acaagtggta ctaccttgaa 1740

aactcaggcg caatggcggc aggatggaaa aaggtagcaa acaaatggta ctaccttgat 1800

aaatcaggaa tgatggttac aggttcaaaa tctattgatg gtaaaaagta tgcatttaag 1860

aacgatggaa gtttaaaata g 1881

Claims (6)

1.一种猪丹毒杆菌SpaA蛋白，其特征在于，所述的SpaA蛋白包含有：

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的蛋白；

2)在1)的蛋白上取代、缺失、添加一个或几个氨基酸，且具有1)中蛋白功能的蛋白。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的猪丹毒杆菌SpaA蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

5.权利要求1所述的猪丹毒杆菌SpaA蛋白在制备疫苗或诊断试剂中的应用。

6.一种亚单位疫苗，其特征在于，所述的亚单位疫苗是使用权利要求1所述的猪丹毒杆菌SpaA蛋白作为抗原制备的。